CN105120892B - 包含艰难梭菌cdtb和/或cdta蛋白的元件的免疫原性组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含分离的艰难梭菌CDTb和/或CDTa蛋白的免疫原性组合物。具体而言,分离的艰难梭菌CDTb蛋白合适地是包含受体结合结构域的截短的CDTb蛋白或无法结合CDTa的突变的CDTb蛋白,并且分离的艰难梭菌CDTa蛋白合适地是不包含C末端结构域的截短的CDTa蛋白。具体而言,本发明还涉及包含CDTa蛋白和CDTb蛋白的融合蛋白以及分离的艰难梭菌毒素A蛋白和/或融合至CDTb蛋白的分离的艰难梭菌毒素B蛋白之间的融合蛋白。本发明进一步涉及包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:45的片段或变体的组合物。
Description
背景
艰难梭菌(C.difficile)是医院肠道感染的最重要原因并且是人中假膜性结肠炎的主要原因(Bartlett等 Am. J. Clin.Nutr.11 suppl:2521-6 (1980))。感染艰难梭菌的个体的总体相关死亡率在诊断的3个月内计算为5.99%,并且更高的死亡率与高龄相关,在超过80岁的患者中为13.5% (Karas 等 Journal of Infection 561:1-9 (2010))。目前对艰难梭菌感染的治疗是施用抗生素(甲硝唑和万古霉素),然而,已经存在对这些抗生素具有抗性的菌株的证据 (Shah等, Expert Rev. Anti Infect.Ther.8(5), 555–564(2010))。因此,存在对能够诱导针对艰难梭菌的抗体和/或保护性免疫应答的免疫原性组合物的需求。
艰难梭菌的肠毒性主要由于毒素A和毒素B两种毒素的作用。这些都是有效的细胞毒素(Lyerly等 Current Microbiology 21:29-32 (1990)。
已经表明毒素A的片段具体为C末端结构域的片段能够导致在仓鼠中的保护性免疫应答(Lyerly 等 Current Microbiology 21:29-32 (1990))、WO96/12802和WO00/61762。然而,本发明人已证明针对单独的毒素A和毒素B的抗体无法足以预防由某些菌株尤其是血清群(serogroup)078和027菌株引起的疾病。为此原因,仍需要能够针对这些菌株提供保护的疫苗。
一些但不是所有菌株还表达二元毒素(CDT)。与许多其他二元毒素类似,CDT由两种组分-酶活性组分(CDTa)和催化惰性的转运组分(CDTb)构成。催化惰性的组分有利于CDTa易位进入靶细胞。
CDTa具有ADP-核糖基化活性,其转移NAD/NADPH的ADP-核糖部分至靶细胞中的单体肌动蛋白(G-肌动蛋白)并因此防止其多聚化为F-肌动蛋白,并导致细胞骨架的瓦解和最终细胞死亡(Sundriyal 等, Protein expression and Purification 74 (2010) 42-48)。
WO2013/112867 (Merck)描述了针对艰难梭菌的包含重组艰难梭菌毒素A和毒素B和二元毒素A(CDTa)蛋白并组合有二元毒素B(CDTb)的疫苗,所述二元毒素A(CDTa)蛋白包含相对于描述为实质上降低或消除毒性的天然毒素序列明确确定的突变。
本发明人已发现二元毒素可用于提供针对艰难梭菌改进的疫苗,所述疫苗尤其针对最关注的艰难梭菌菌株的几个(诸如027和078菌株)提供保护。此外,本发明人已第一次证明需要仅CDTa或CDTb(而非两者)以生成能够中和表达二元毒素的菌株的抗体。此外,本发明人已第一次证明包含降低CDTa的ADP-核糖基化活性的突变的CDTa蛋白仍能够提高免疫应答。此外,本发明人已证明截短的CDTa蛋白能够提高免疫应答。类似地,本发明人已证明截短的CDTb蛋白能够提高免疫应答,CDTb能够提高免疫应答(当其为单体或聚合形式时),以及包含CDTa和CDTb或融合至分离的毒素A和/或分离的毒素B的CDTb的融合蛋白能够提高免疫应答。最后,本发明人已证明包含二元毒素的免疫原性组合物能够通过添加佐剂尤其是包含存在于脂质体或水包油乳状液形式中的免疫活性皂苷的佐剂而得到改进。
发明概述
在本发明的第一方面,提供包含分离的艰难梭菌CDTb蛋白的免疫原性组合物,其中所述组合物不进一步包含与SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31或SEQ ID NO: 32具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%相似性的分离的蛋白。
在本发明的第二方面,提供包含分离的艰难梭菌CDTb蛋白的免疫原性组合物,其中分离的艰难梭菌CDTb蛋白是包含受体结合结构域的截短的CDTb蛋白。
在本发明的第三方面,提供包含分离的艰难梭菌CDTb蛋白的免疫原性组合物,其中分离的艰难梭菌CDTb蛋白是能够结合CDTa的突变的CDTb蛋白。
在本发明的第四方面,提供包含分离的艰难梭菌CDTa蛋白的免疫原性组合物,其中分离的艰难梭菌CDTa蛋白是不包含C末端结构域的截短的CDTa蛋白。
在第五方面,本发明提供包含含有CDTa和CDTb蛋白的融合蛋白的免疫原性组合物。
在第六方面,本发明提供包含分离的艰难梭菌毒素A蛋白和/或融合至CDTb蛋白的分离的艰难梭菌毒素B蛋白之间的融合蛋白的免疫原性组合物。
在第七方面,本发明提供包含前五个方面中任一方面的免疫原性组合物和药学上可接受的赋形剂的疫苗。
在第八方面,本发明提供前五个方面中任一方面的免疫原性组合物或第六方面的疫苗,其用于治疗或预防疾病例如艰难梭菌疾病。
在第九方面,本发明提供前五个方面中任一方面的免疫原性组合物或第六方面的疫苗在制备用于预防或治疗疾病例如艰难梭菌疾病的药物中的用途。
在第十方面,本发明提供预防或治疗艰难梭菌疾病的方法,其包括向哺乳动物主体施用前六个方面中任一方面的免疫原性组合物或第七方面的疫苗。
在本发明的进一步的方面,提供包含分离的艰难梭菌CDTb蛋白的免疫原性组合物。
在本发明的进一步的方面,提供包含分离的艰难梭菌CDTb蛋白或分离的CDTa蛋白但不包含分离的CDTb蛋白和分离的CDTa蛋白的免疫原性组合物。
如本文定义的新颖的多肽和核苷酸也形成本发明的进一步的方面。
附图简述
图1(包含图1a-1h)-描述如由沉降速度分析超速离心所测定的不同的CdtA、CdtB和CdtA-CdtB融合构建体的大小分布的图:
图1a:C67 (CdtA (aa44-463) mut E428Q-E430Q的AUC
图1b:CC69 CdtA (aa44-463) mut. R345A-Q350A-N385A-R402A-S388F-E428Q-E430Q的AUC
图1c:C50 (CdtA N-末端无接头(aa44-260)的AUC
图1d:C61 (融合体CdtA N末端具有接头-CdtB短)的AUC
图1e:C62 (融合体CdtA N末端无接头-CdtB长)的AUC
图1f:C52 (CdtB长)的AUC
图1g:C53 (CdtB短)的AUC
图1h:AC55 CdtB ∆ 前域(prodomain) (aa. 212-876)的AUC
图2(包含图2a-2c)-纯化后CdtA、CdtB和CdtA-CdtB融合构建体的SDS-PAGE概况:
图2a:纯化的CdtA-CdtB融合构建体的SDS-PAGE。1泳道:预染色的分子量标志物Novex sharp。2泳道:5µg的C61 CdtA N-末端连接(aa. 44-268)-CdtB RBD短(aa. 636-876)。3泳道:5µg的C62 CdtA N-末端(aa. 44-260)-CdtB RBD长(aa. 621-876)。
图2b:纯化的CdtA构建体的SDS-PAGE。1泳道:预染色的分子量标志物Novexsharp。2泳道:5µg的C50 CdtA WO 接头 (44-260)。3泳道:5µg的C67 CdtA全长 (aa44-463)mut.E428Q-E430Q。4泳道:5µg的C69 CdtA全长 (aa44-463) mut.R345A-Q350A-N385A-R402A-S388F-E428Q-E430Q。
图2c:纯化的CdtB构建体的SDS-PAGE。1泳道:预染色的分子量标志物Novexsharp。2泳道:5µg的去除N末端GST并通过用糜蛋白酶前域切割活化后C37 CdtB’ ∆信号序列 ( aa43-876) + GST N-末端。3泳道:5µg的C55 CdtB ∆ 前域 (aa. 212-876)。4泳道:5µg的C52 CdtB受体结合结构域长(aa. 621-876)。5泳道:分子量标志物。6泳道:5µg的C38CdtB’ ∆信号序列 ( aa43-876)。
图3-显示用艰难梭菌二元毒素组分A或艰难梭菌二元毒素组分B(在两种情况下均用佐剂配制)免疫的小鼠中的抗CDTb免疫原性的图。
图4-显示用艰难梭菌二元毒素组分A或艰难梭菌二元毒素组分B(在两种情况下均用佐剂配制)免疫的小鼠中的抗CDTa免疫原性的图。
图5-来自用艰难梭菌二元毒素组分A或艰难梭菌二元毒素组分B(在两种情况下均用佐剂配制)免疫的小鼠的HCT116细胞中的细胞毒性抑制效价。
图6-来自用艰难梭菌二元毒素组分A或艰难梭菌二元毒素组分B(在两种情况下均用佐剂配制)免疫的小鼠的HT29细胞中的细胞毒性抑制效价。
图7-显示在用佐剂配制的艰难梭菌Cdtb(活化的或未活化的,具有或不具有包含来自毒素A和毒素B的片段的F2融合体)免疫的小鼠中的抗CDTb免疫原性的图。
图8-显示在用佐剂配制的艰难梭菌Cdtb(活化的或未活化的,具有或不具有包含来自毒素A和毒素B的片段的F2融合体)免疫的小鼠中的抗Tox A免疫原性的图。
图9-显示在用佐剂配制的艰难梭菌Cdtb(活化的或未活化的,具有或不具有包含来自毒素A和毒素B的片段的F2融合体)免疫的小鼠中的抗Tox B免疫原性的图。
图10-在用佐剂配制的艰难梭菌Cdtb(活化的或未活化的,具有或不具有包含来自毒素A和毒素B的片段的F2融合体)免疫的小鼠中的HT29细胞中的Tox A细胞毒性抑制效价。
图11-在用佐剂配制的艰难梭菌Cdtb(活化的或未活化的,具有或不具有包含来自毒素A和毒素B的片段的F2融合体)免疫的小鼠中的HCT116细胞中的Tox B细胞毒性抑制效价。
图12-来自用艰难梭菌二元毒素组分A或艰难梭菌二元毒素组分B(在两种情况下均用佐剂配制)免疫的小鼠的HT29细胞中的二元毒素细胞毒性抑制效价。
图13-显示用在佐剂制剂中以6µg/剂量与F2组合的不同二元毒素疫苗候选(CdtA/CdtB)免疫的小鼠中的抗CDTb免疫原性的图。
图14-显示用在佐剂制剂中以6µg/剂量与F2组合的不同二元毒素疫苗候选(CdtA/CdtB)免疫的小鼠中的抗CDTa免疫原性的图。
图15-显示用在佐剂制剂中以6µg/剂量与F2组合的不同二元毒素疫苗候选(CdtA/CdtB)免疫的小鼠中的抗Tox B免疫原性的图。
图16-显示用在佐剂制剂中以6µg/剂量与F2组合的不同二元毒素疫苗候选(CdtA/CdtB)免疫的小鼠中的抗Tox A免疫原性的图。
图17-在来自用佐剂制剂中以6µg/剂量与F2组合的不同二元毒素疫苗候选(CdtA/CdtB)免疫的小鼠的HCT116细胞中的二元毒素细胞毒性抑制效价。
图18-在来自用佐剂制剂中以6µg/剂量与F2组合的不同二元毒素疫苗候选(CdtA/CdtB)免疫的小鼠的HT29细胞中的二元毒素细胞毒性抑制效价。
图19-在来自用佐剂制剂中以6µg/剂量与F2组合的不同二元毒素疫苗候选(CdtA/CdtB)免疫的小鼠的HT29细胞中的Tox A细胞毒性抑制效价。
图20-在来自用佐剂制剂中以6µg/剂量与F2组合的不同二元毒素疫苗候选(CdtA/CdtB)免疫的小鼠的HCT116细胞中的Tox B细胞毒性抑制效价。
图21-显示用在佐剂制剂中以2µg/剂量与F2组合的不同二元毒素疫苗候选(CdtA/CdtB)免疫的小鼠中的抗CDTb免疫原性的图。
图22-显示用在佐剂制剂中以2µg/剂量与F2组合的不同二元毒素疫苗候选(CdtA/CdtB)免疫的小鼠中的抗CDTa免疫原性的图。
图23-显示用在佐剂制剂中以2µg/剂量与F2组合的不同二元毒素疫苗候选(CdtA/CdtB)免疫的小鼠中的抗Tox B免疫原性的图。
图24-显示用在佐剂制剂中以2µg/剂量与F2组合的不同二元毒素疫苗候选(CdtA/CdtB)免疫的小鼠中的抗Tox A免疫原性的图。
图25-在来自用佐剂制剂中以2µg/剂量与F2组合的不同二元毒素疫苗候选(CdtA/CdtB)免疫的小鼠的HCT116细胞中的二元毒素细胞毒性抑制效价。
图26-在来自用佐剂制剂中以2µg/剂量与F2组合的不同二元毒素疫苗候选(CdtA/CdtB)免疫的小鼠的HT29细胞中的二元毒素细胞毒性抑制效价。
图27-在来自用佐剂制剂中以2µg/剂量与F2组合的不同二元毒素疫苗候选(CdtA/CdtB)免疫的小鼠的HT29细胞中的Tox A细胞毒性抑制效价。
图28-在来自用佐剂制剂中以2µg/剂量与F2组合的不同二元毒素疫苗候选(CdtA/CdtB)免疫的小鼠的HCT116细胞中的Tox B细胞毒性抑制效价。
图29-显示用在非佐剂化制剂中以10µg/剂量与F2组合的不同二元毒素疫苗候选(CdtA/CdtB)免疫的小鼠中的抗CDTb免疫原性的图。
图30-显示用在非佐剂化制剂中以10µg/剂量与F2组合的不同二元毒素疫苗候选(CdtA/CdtB)免疫的小鼠中的抗CDTa免疫原性的图。
图31-显示用在非佐剂化制剂中以10µg/剂量与F2组合的不同二元毒素疫苗候选(CdtA/CdtB)免疫的小鼠中的抗Tox B免疫原性的图。
图32-显示用在非佐剂化制剂中以10µg/剂量与F2组合的不同二元毒素疫苗候选(CdtA/CdtB)免疫的小鼠中的抗Tox A免疫原性的图。
图33-在来自用非佐剂化制剂中以10µg/剂量与F2组合的不同二元毒素疫苗候选(CdtA/CdtB)免疫的小鼠的HCT116细胞中的二元毒素细胞毒性抑制效价。
图34-在来自用非佐剂化制剂中以10µg/剂量与F2组合的不同二元毒素疫苗候选(CdtA/CdtB)免疫的小鼠的HT29细胞中的二元毒素细胞毒性抑制效价。
图35-在来自用非佐剂化制剂中以10µg/剂量与F2组合的不同二元毒素疫苗候选(CdtA/CdtB)免疫的小鼠的HT29细胞中的Tox A细胞毒性抑制效价。
图36-在来自用非佐剂化制剂中以10µg/剂量与F2组合的不同二元毒素疫苗候选(CdtA/CdtB)免疫的小鼠的HCT116细胞中的Tox B细胞毒性抑制效价。
详述
二元毒素
艰难梭菌二元毒素包含两种不同蛋白CDTa和CDTb。在感染过程中,CDTb通过由糜蛋白酶样蛋白酶的蛋白酶剪切而活化以产生缺少前域的CDTb(也称为CDTb”)。注意CDTb”也缺少CDTb信号序列,缺少信号序列但不缺少前域的CDTb蛋白也称为CDTb’。蛋白水解活化后,CDTb寡聚化并结合CDTa以形成完整的‘二元毒素’。二元毒素结合细胞受体导致受体介导的胞吞作用。由于内体酸化,CDTb结合结构域经历允许CDTb寡聚物形成孔的构象变化,所述孔形成引起ADP-核糖基转移酶结构域(CDTa)易位入靶细胞内。
CDTb
本发明提供包含分离的艰难梭菌CDTb蛋白的免疫原性组合物。本发明还提供包含作为单独的艰难梭菌抗原的分离的艰难梭菌CDTb蛋白的免疫原性组合物。如本文所用,术语“作为单独的艰难梭菌抗原”意指包含作为单独的艰难梭菌抗原的分离的艰难梭菌CDTb蛋白的免疫原性组合物不再包含另一种来自艰难梭菌的抗原,例如免疫原性组合物不再包含毒素A、毒素B或CDTa蛋白。
本发明提供包含分离的艰难梭菌CDTb蛋白的免疫原性组合物,其中所述组合物不进一步包含与SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31或SEQ ID NO: 32具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%相似性的分离的蛋白。根据本发明,如本文所述的术语‘CDTb蛋白’涵盖SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:3的片段或变体。
在本发明的第一方面的一个实施方案中,组合物不包含分离的艰难梭菌CDTa蛋白。
在该方面的一个实施方案中,分离的艰难梭菌CDTb蛋白是或者包含
(i) SEQ ID NO:3;或
(ii) 具有与SEQ ID NO:3至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、98%、99%、100%序列同一性的CDTb的变体;或
(iii) 具有SEQ ID NO:3的至少30、50、80、100、120、150、200、250或300个邻接氨基酸的CDTb的片段。
在一个此类方面中,提供免疫原性组合物,其中分离的艰难梭菌CDTb蛋白是具有与SEQ ID NO:3至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、98%、99%、100%序列同一性的CDTb的变体。
在另一方面中,提供免疫原性组合物,其中分离的艰难梭菌CDTb蛋白是具有SEQID NO:3的至少30、50、80、100、120、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800或850个邻接氨基酸的CDTb的片段。
CDTb包含多个结构域,具体而言,CDTb包含信号肽和前域,这两者均如上文标题为“二元毒素”的部分中所解释的被切割。
在一个实施方案中,分离的艰难梭菌CDTb蛋白是信号肽去除的截短的CDTb蛋白。术语“信号肽去除的截短的CDTb蛋白”指基本上全部信号肽均去除(因此其不包含对应于基本上全部信号肽的氨基酸)的SEQ ID NO: 3的片段或变体,可以保留信号肽的几个氨基酸,例如信号肽的2、5、10、15或20个氨基酸可以保留。信号肽对应于SEQ ID NO: 3的氨基酸1-48(涵盖氨基酸1-42)或其在分离自艰难梭菌的不同菌株的二元毒素蛋白中的等同物,例如来自菌株CD196的CDTb的氨基酸序列的氨基酸1-42 (Perelle, M. 等 Infect. Immun.,65 (1997), pp. 1402–1407)。
合适地,在该实施方案中,分离的艰难梭菌CDTb蛋白是或者包含
(i) SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:16;或
(ii) 具有与SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO:16至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、98%、99%、100%序列同一性的CDTb的变体;或
(iii) 具有SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO:16的至少30、50、80、100、120、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750或800个邻接氨基酸的CDTb的片段。在一个实施方案中,信号肽去除的截短的CDTb蛋白是或者包含具有与SEQ ID NO: 7或SEQ IDNO:16至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、98%、99%、100%序列同一性的CDTb的变体。在进一步的实施方案中,信号肽去除的分离的截短的CDTb蛋白是或者包含具有SEQ ID NO: 7或SEQID NO:16的至少30、50、80、100、120、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750或800个邻接氨基酸的CDTb的片段。
在一个实施方案中,分离的艰难梭菌CDTb蛋白是前域去除的截短的CDTb蛋白。术语‘前域去除的截短的CDTb蛋白’指基本上全部前域均去除(因此其不包含对应于基本上全部前域的氨基酸)的SEQ ID NO: 3的片段或变体,可以保留前域的几个氨基酸,例如前域的2、5、10、15或20个氨基酸可以保留。前域对应于SEQ ID NO:3的氨基酸48-211(涵盖氨基酸48-166)或其在分离自不同的艰难梭菌菌株的二元毒素蛋白中的等同物。任选地,前域去除的截短的CDTb蛋白还缺少CDTb信号序列,CDTb信号序列对应于SEQ ID NO:3的氨基酸1-48(涵盖氨基酸1-42)或其在不同菌株中的等同物。术语‘前域去除的截短的CDTb蛋白’还可以指SEQ ID NO:3的片段或变体,其能够寡聚化并结合CDTa。在本发明的该实施方案中,分离的艰难梭菌CDTb蛋白合适地是或者包含
(i) SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:51;或
(ii) 具有与SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO:51至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、98%、99%、100%序列同一性的CDTb的变体;或
(iii) 具有SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO:51的至少30、50、80、100、120、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600或650个邻接氨基酸的CDTb的片段。
在一个实施方案中,前域去除的截短的CDTb蛋白是或者包含具有与SEQ ID NO:9至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、98%、99%、100%序列同一性的CDTb的变体。在进一步的实施方案中,信号肽去除的分离的截短CDTb蛋白是或者包含具有SEQ ID NO:9的至少30、50、80、100、120、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750或800个邻接氨基酸的CDTb的片段。
CDTb还包含受体结合结构域。在一个实施方案中,分离的艰难梭菌CDTb蛋白是包含受体结合结构域的截短的CDTb蛋白。术语‘包含受体结合结构域的截短的CDTb蛋白’指基本上全部(但除去受体结合结构域之外)去除(因此其不包含对应于除去受体结合结构域之外的基本上全部蛋白的氨基酸)的SEQ ID NO: 3的片段或变体,除了受体结合结构域以外还可以保留几个氨基酸,例如除去受体结合结构域之外的2、5、10、15或20个氨基酸/除了受体结合结构域以外另外的2、5、10、15或20个氨基酸。在一个版本中,受体结合结构域对应于SEQ ID NO:3的氨基酸620-876或其在分离自不同的艰难梭菌菌株的二元毒素蛋白中的等同物。在另一个版本中,受体结合结构域对应于SEQ ID NO:3的氨基酸636-876或其在分离自不同的艰难梭菌菌株的二元毒素蛋白中的等同物。
在该实施方案中,分离的艰难梭菌CDTb蛋白合适地是或者包含
(i) SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36;或
(i) 具有与SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO:36至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、98%、99%、100%序列同一性的CDTb的变体;或
(iii) 具有SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO:36的至少30、50、80、100、120、150或200个邻接氨基酸的CDTb的片段。
在本发明的该方面的另一实施方案中,分离的艰难梭菌CDTb蛋白是能够结合CDTa的突变的CDTb蛋白。
在该实施方案中,分离的艰难梭菌CDTb蛋白合适地是或者包含
(i) SEQ ID NO:50;或
(ii) 具有与SEQ ID NO:50至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、98%、99%、100%序列同一性的CDTb的变体;或
(iii) 具有SEQ ID NO:50的至少30、50、80、100、120、150、200、250或300个邻接氨基酸的CDTb的片段。
CDTb蛋白在不同菌株之间在氨基酸序列上不同,由于这一原因,菌株之间的氨基酸编号可能不同。由于这一原因,术语‘不同菌株中的等同物’指这样的氨基酸,其对应于参考菌株(例如艰难梭菌R20291,SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3来自其中)的那些,但其发现于来自不同菌株的毒素中并且可能因此而编号不同。可以通过比对来自不同菌株的毒素的序列来确定‘等同物’氨基酸的区域。艰难梭菌的二元毒素产生菌株的实例包括CD196、CCUG20309、R8637、IS81、IS93、IS51、IS58、R6786、R7605、R10456和R5989。全文中提供的氨基酸编号指参考菌株R20291的编号。
在一个实施方案中,分离的艰难梭菌CDTb蛋白是CDTb的单体。在进一步的实施方案中,分离的艰难梭菌CDTb蛋白是CDTb的多聚体。在进一步的实施方案中,分离的艰难梭菌CDTb蛋白是CDTb的七聚体。
在第二方面,本发明提供包含分离的艰难梭菌CDTb蛋白的免疫原性组合物,其中分离的艰难梭菌CDTb蛋白是包含受体结合结构域的截短的CDTb蛋白。在该方面的一个实施方案中,分离的艰难梭菌CDTb蛋白合适地是或者包含
(i) SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36;或
(i) 具有与SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO:36至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、98%、99%、100%序列同一性的CDTb的变体;或
(iii) 具有SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO:36的至少30、50、80、100、120、150或200个邻接氨基酸的CDTb的片段。
在第三方面,本发明提供包含分离的艰难梭菌CDTb蛋白的免疫原性组合物,其中分离的艰难梭菌CDTb蛋白是能够结合CDTa的突变的CDTb蛋白。在该方面的一个实施方案中,分离的艰难梭菌CDTb蛋白合适地是或者包含
(i) SEQ ID NO:50;或
(ii) 具有与SEQ ID NO:50至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、98%、99%、100%序列同一性的CDTb的变体;或
(iii) 具有SEQ ID NO:50的至少30、50、80、100、120、150、200、250或300个邻接氨基酸的CDTb的片段。
在本发明的第二和第三方面的一个实施方案中,免疫原性组合物包含/进一步包含含有以下的分离的艰难梭菌CDTa蛋白
(i) SEQ ID NO:1;或
(ii) 具有与SEQ ID NO:1至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、98%、99%、100%序列同一性的CDTa的变体;或
(iii) 具有SEQ ID NO:1的至少至少30、50、80、100、120、150、200、250、300、350或400个邻接氨基酸的CDTa的片段。
CDTa
本发明还提供包含分离的艰难梭菌CDTa蛋白的免疫原性组合物。本发明还提供包含作为单独的艰难梭菌抗原的分离的艰难梭菌CDTa蛋白的免疫原性组合物。如本文所用,术语“作为单独的艰难梭菌抗原”意指包含作为单独的艰难梭菌抗原的分离的艰难梭菌CDTa蛋白的免疫原性组合物不再包含另一种来自艰难梭菌的抗原,例如免疫原性组合物不再包含毒素A、毒素B或CDTb蛋白。根据本发明,如本文所述的术语‘CDTa蛋白’涵盖SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:1的片段或变体。在一个实施方案中,分离的艰难梭菌CDTa蛋白包含具有与SEQ ID NO:1至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、98%、99%、100%序列同一性的CDTa的变体。在进一步的实施方案中,分离的艰难梭菌CDTa蛋白包含具有SEQ ID NO:1的至少至少30、50、80、100、120、150、200、250、300、350或400个邻接氨基酸的CDTa的片段。
CDTa包含两个结构域,C末端结构域负责ADP核糖基转移酶活性而N末端结构域负责与CDTb相互作用。
在本发明的前三个方面的一个实施方案中,免疫原性组合物包含/进一步包含分离的艰难梭菌CDTa蛋白。合适地,分离的艰难梭菌CDTa蛋白是截短的CDTa蛋白。如本文所用的“截短的CDTa蛋白”意指这样的CDTa蛋白,其未达到其全长或其合适形式,并因此缺失存在于SEQ ID NO: 1的全长CDTa中的一些氨基酸 残基,并且其不能行使其旨在的功能,因此其结构无法这么做,例如ADP核糖基转移酶活性和/或与CDTb相互作用。
合适地,分离的艰难梭菌CDTa蛋白是不包含C末端结构域的截短的CDTa蛋白。术语‘不包含C末端结构域的截短的CDTa蛋白’指不包含C末端结构域的实质部分的SEQ ID NO:1的片段或变体,可以保留C末端结构域的几个氨基酸,例如C末端结构域的2、5、10、15、20、25、30、35或50个氨基酸可以保留。C末端结构域对应于SEQ ID NO:1的氨基酸267-463或其在分离自不同的艰难梭菌菌株的CDTa蛋白中的等同物。在该实施方案中,截短的艰难梭菌CDTa蛋白合适地是或者包含
(i) SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15
(i) 具有与SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO:15至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、98%、99%、100%序列同一性的CDTa的变体;或
(iii) 具有SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO:15的至少30、50、80、100、120、150或190个邻接氨基酸的CDTa的片段。
在一个实施方案中,不包含C末端结构域的截短的CDTa蛋白是与SEQ ID NO:13具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、98%、99%、100%序列同一性的CDTa的变体。在进一步的实施方案中,不包含C末端结构域的截短的CDTa蛋白是具有SEQ ID NO:13的至少30、50、80、100、120、150、或190个邻接氨基酸的CDTa的变体。
在本发明的第四方面,提供包含分离的艰难梭菌CDTa蛋白的免疫原性组合物,其中分离的艰难梭菌CDTa蛋白是不包含C末端结构域的截短的CDTa蛋白。在该方面的一个实施方案中,分离的艰难梭菌CDTa蛋白合适地是或者包含
(i) SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15;或
(ii) 具有与SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO:15至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、98%、99%、100%序列同一性的CDTa的变体;或
(iii) 具有SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO:15的至少30、50、80、100、120、150或190个邻接氨基酸的CDTa的片段。
在本发明的任一方面的进一步的实施方案中,分离的艰难梭菌CDTa蛋白合适地含有降低其ADP核糖基转移酶活性的突变。例如,分离的艰难梭菌CDTa蛋白具有在位置428处从谷氨酸至另一氨基酸的突变。术语‘具有在位置428处的突变’指在该准确位置处具有突变的CDTa蛋白,但也指从不同菌株中分离并且在等同位置具有突变的CDTa蛋白。CDTa蛋白在不同菌株之间在氨基酸序列上有所不同,由于该原因,氨基酸编号在菌株间可以不同,因而来自不同菌株的CDTa蛋白可以具有不是序列中的第428位的相应谷氨酸。在一个实施方案中,分离的艰难梭菌CDTa蛋白具有在位置428处从谷氨酸至谷氨酰胺的突变。
在本发明的任一方面的进一步的实施方案中,分离的艰难梭菌CDTa蛋白合适地具有在位置430处从谷氨酸至不同的氨基酸的突变,术语‘具有在位置430处的突变’指具有该准确位置的蛋白但也指分离自不同菌株并且具有等同位置的突变的CDTa蛋白。在一个实施方案中,分离的艰难梭菌CDTa蛋白具有在位置430处从谷氨酸至谷氨酰胺的突变。
在本发明的任一方面的进一步的实施方案中,分离的艰难梭菌CDTa蛋白合适地是或者包含
(i) SEQ ID NO:46; SEQ ID NO:48; SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:54;或
(ii) 具有与SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 52;或SEQ ID NO:54至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、98%、99%、100%序列同一性的CDTa的变体;或
(iii) 具有SEQ ID ID NO: 46; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 52; 或SEQ IDNO: 54的至少30、50、80、100、120、150、200、250、300、350或400个邻接氨基酸的CDTa的片段。
在本发明的任一方面的进一步的实施方案中,分离的艰难梭菌CDTa蛋白合适地是或者包含
(i) SEQ ID NO:48;或
(ii) 具有与SEQ ID NO:48至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、98%、99%、100%序列同一性的CDTa的变体;或
(iii) 具有SEQ ID NO:48的至少30、50、80、100、120、150、200、250、300、350或400个邻接氨基酸的CDTa的片段。
具有CDTa和/或CDTb的免疫原性组合物
在进一步的实施方案中,提供包含CDTb蛋白但不包含CDTa蛋白的免疫原性组合物,例如免疫原性组合物不包含与SEQ ID NO:1具有至少95%、98%、99%或100%序列同一性的CDTa的变体或具有SEQ ID NO:1的至少至少250、400或450个邻接氨基酸的CDTa的片段。
在进一步的实施方案中,提供包含CDTa蛋白但不包含CDTb蛋白的免疫原性组合物,例如免疫原性组合物不包含与SEQ ID NO:3具有至少95%、98%、99%或100%序列同一性的CDTb的变体或具有CDTb的至少700、750或800个邻接氨基酸的CDTb的片段。
在进一步的实施方案中,提供包含分离的艰难梭菌CDTb蛋白或分离的CDTa蛋白但不包含分离的CDTb蛋白和分离的CDTa蛋白两者的免疫原性组合物。
在进一步的实施方案中,提供包含CDTa蛋白和CDTb蛋白的融合蛋白。在进一步的实施方案中,提供包含CDTa蛋白和CDTb蛋白的融合蛋白的免疫原性组合物。
包含CDTa蛋白和CDTb蛋白的融合蛋白
在第五方面,本发明提供包含含有CDTa和CDTb蛋白的融合蛋白的免疫原性组合物。在该方面的一个实施方案中,CDTa蛋白合适地是截短的。例如,CDTa蛋白合适地不包含C末端结构域。在该方面,CDTb蛋白合适地是截短的。在该实施方案中,CDTb蛋白合适地包含受体结合结构域。
在本发明的该方面的一个实施方案中,融合蛋白合适地是或者包含
(i) SEQ ID NO:40; SEQ ID NO:41; SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:43;或
(ii) 具有与SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 42;或SEQ ID NO:43至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、98%、99%、100%序列同一性的变体;或
(iii) 具有SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 42; 或SEQ ID NO:43的至少30、50、80、100、120、150、200、250、300、350或400个邻接氨基酸的片段。
“融合多肽”或“融合蛋白”指具有直接或经氨基酸接头共价连接的至少两个异源多肽(例如至少两个分枝杆菌属种(Mycobacterium sp.)多肽)的蛋白。其还可以指具有非共价连接的至少两个异源多肽的蛋白。形成融合蛋白的多肽通常连接C末端至N末端,尽管它们还可以连接C末端至C末端、N末端至N末端、或N末端至C末端。融合蛋白的多肽可以以任何顺序。该术语还指保守修饰的变体、多态变体(polymorphic variant)、等位基因、突变体、免疫原性片段和构成融合蛋白的抗原的种间同源物。
术语“融合的”指融合蛋白中的两个多肽之间的键例如共价键。多肽通常经肽键彼此直接或经氨基酸接头连接。任选地,肽可以经本领域技术人员已知的非肽共价键连接。
可以使用肽接头序列来通过足以确保每一肽折叠成其二级和三级结构的距离分隔开第一和第二多肽组分。使用本领域熟知的标准技术将这样的肽接头序列整合入融合蛋白中。可以根据以下因素选择合适的肽接头序列:(1)它们采用柔性延伸构象的能力;(2)它们采用能够与第一和第二多肽上的功能性表位相互作用的二级结构的能力;和(3)缺少可以与多肽功能性表位反应的疏水性或带电残基。优选的肽接头序列包含Gly、Asn和Ser残基。其他的近中性氨基酸诸如Thr和Ala也可以用于接头序列中。可以有用地用作接头的氨基酸序列包括以下中公开的那些:Maratea 等, Gene 40:39-46 (1985); Murphy 等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:8258-8262 (1986); 美国专利号4,935,233和美国专利号4,751,180。接头序列可以通常长度为1至约50个氨基酸,例如长度为1、5、10、15、20、25、30、35或40个氨基酸。当第一和第二多肽具有可用于分隔功能结构域并阻止立体干扰(stericinterference)的非必需N末端氨基酸区时,不需要接头序列。
在本发明的任一方面的一个实施方案中,免疫原性组合物引发中和CDTa或CDTb或两者的抗体。在进一步的实施方案中,组合物引发中和二元毒素的抗体。可以通过用免疫原性组合物免疫小鼠、收集血清并通过使用ELISA分析血清的抗毒素效价来测定组合物是否引发针对毒素的抗体。应该将血清与获取自未进行免疫的小鼠的参考样品进行比较。如果针对多肽的血清产生了高于参考样品超过10%、20%、30%、50%、70%、80%、90%或100%的ELISA读出,则本发明的组合物引发了中和CDTa的抗体。
在进一步的实施方案中,本发明的免疫原性组合物引发了在哺乳动物宿主中针对艰难梭菌菌株的保护性免疫应答。在一个实施方案中,哺乳动物宿主选自小鼠、兔、豚鼠、非人灵长类动物、猴和人。在一个实施方案中,哺乳动物宿主是小鼠。在进一步的实施方案中,哺乳动物宿主是人。
可以使用攻击测定来确定免疫原性组合物是否引发了在哺乳动物宿主中针对艰难梭菌菌株的保护性免疫应答。在此类测定中,将哺乳动物宿主用免疫原性组合物接种并通过暴露于艰难梭菌进行攻击,将哺乳动物在攻击后存活的时间与未用免疫原性组合物免疫的参考哺乳动物存活的时间进行比较。如果在用艰难梭菌攻击后,用免疫原性组合物免疫的哺乳动物存活长于未免疫的参考哺乳动物至少10%、20%、30%、50%、80%、80%、90%或100%,则免疫原性组合物引发了保护性免疫应答。
毒素A和毒素B
在本发明任一方面的一个实施方案中,本发明的免疫原性组合物进一步包含分离的艰难梭菌毒素A和/或分离的艰难梭菌毒素B蛋白。
术语“分离的艰难梭菌毒素A蛋白”指SEQ ID NO: 31的片段或变体。在一个实施方案中,分离的艰难梭菌毒素A蛋白是包含具有SEQ ID NO:31的50、100、150、200、250、300、500、750、1000、1250、1500、1750、2000或2500个邻接氨基酸的片段。在一个实施方案中,分离的艰难梭菌毒素A蛋白是包含与SEQ ID NO:31 80%、85%、90%、92%、95%、98%、99%或100%同一性的变体。
术语“分离的艰难梭菌毒素B蛋白”指SEQ ID NO: 32的片段或变体。在一个实施方案中,分离的艰难梭菌毒素B蛋白是包含SEQ ID NO:32的50、100、150、200、250、300、500、750、1000、1250、1500、1750或2000的片段。在一个实施方案中,分离的艰难梭菌毒素B蛋白是包含与SEQ ID NO:32 80%、85%、90%、92%、95%、98%、99%或100%同一性的变体。
在一个实施方案中,分离的艰难梭菌毒素A蛋白包含重复结构域片段。术语‘毒素A重复结构域’指来自艰难梭菌的毒素A蛋白的C末端结构域,其包含重复序列。毒素A重复结构域指来自菌株VPI10463 (ATCC43255)的毒素A的氨基酸1832-2710以及它们在不同菌株中的等同物,来自菌株VPI10463 (ATCC43255)的氨基酸1832-2710的序列对应于SEQ IDNO:31的氨基酸1832-2710。在进一步的实施方案中,分离的艰难梭菌毒素A蛋白包含毒素AN末端结构域的片段。毒素A N末端结构域指来自菌株VPI10463 (ATCC43255)的毒素A的氨基酸1-1831以及它们在不同菌株中的等同物,SEQ ID NO:31的氨基酸序列1-1831。
在一个实施方案中,分离的艰难梭菌毒素B蛋白包含毒素B重复结构域片段。术语‘毒素B重复结构域’指来自艰难梭菌的毒素B蛋白的C末端结构域。该结构域指来自菌株VPI10463 (ATCC43255)的氨基酸1834-2366以及它们在不同菌株中的等同物,来自菌株VPI10463 (ATCC43255)的氨基酸1834-2366的序列对应于SEQ ID NO:32的氨基酸1834-2366。在进一步的实施方案中,分离的艰难梭菌毒素B蛋白包含毒素B N末端结构域的片段。毒素B N末端结构域指来自菌株VPI10463 (ATCC43255)的毒素B的氨基酸1-1833以及它们在不同菌株中的等同物,SEQ ID NO:32的氨基酸序列1-1833。
艰难梭菌毒素A和B是保守蛋白,然而,序列在菌株间有少量差别,此外,不同菌株中的毒素A和B的氨基酸序列可能在氨基酸编号上有所不同。
因此,术语毒素A重复结构域和/或毒素B重复结构域指这样的序列,其是与SEQ IDNO:31的氨基酸1832-2710具有90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的变体或与SEQ ID NO:32的氨基酸1834-2366具有90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的变体。类似地,术语毒素AN末端结构域和/或毒素B N末端结构域指这样的序列,其是与SEQ ID NO:31的氨基酸1-1831具有90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的变体或与SEQ ID NO:32的氨基酸1-1833具有90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的变体。
此外,氨基酸编号可以在来自一种菌株的毒素A(或毒素B)与来自另一种菌株的毒素A(或毒素B)的C末端结构域之间有所不同。由于这一原因,术语‘不同菌株中的等同物’指这样的氨基酸,其对应于参考菌株(例如艰难梭菌VPI10463)的那些,但发现于来自不同菌株的毒素中并且可能因此而编号不同。可以通过比对来自不同菌株的毒素的序列来确定‘等同物’氨基酸的区域。全文中提供的氨基酸编号指菌株VPI10463的编号。
在本发明任一方面的进一步的实施方案中,分离的艰难梭菌毒素A蛋白和分离的艰难梭菌毒素B蛋白形成融合蛋白。在一个实施方案中,融合蛋白与选自SEQ ID NO: 18、19、20、21、22、24、26、28和30的序列80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%相同。在进一步的实施方案中,融合蛋白是选自SEQ ID NO: 18、19、20、21、22、24、26、28和30的序列至少800、850、900、或950个邻接氨基酸的片段。
在本发明任一方面的进一步的实施方案中,免疫原性组合物包含/进一步包含分离的艰难梭菌毒素A蛋白和/或分离的艰难梭菌毒素B蛋白(其融合至CDTb蛋白或融合至截短的CDTb蛋白)之间的融合蛋白。在一个实施方案中,提供包含毒素A的片段、毒素B的片段和CDTb蛋白的融合蛋白,例如融合蛋白可以包含融合至CDTb蛋白的SEQ ID NO:18、19、20、21、22、24、26、28或30的片段或变体。例如,融合蛋白可以包含融合至截短的CDTb蛋白的SEQID NO:18、19、20、21、22、24、26、28或30的片段或变体。
在一个实施方案中,融合蛋白合适地是或者包含
(i) SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:45;或
(ii) 具有与SEQ ID NO: 44或SEQ ID NO:45至少80%、85%、90%、95%、98%、99%、或100%序列同一性的变体;或
(iii) 选自SEQ ID NO: 44或SEQ ID NO: 45的序列至少800、850、900、或950个邻接氨基酸的片段。
片段
如本文定义的术语“片段”可以指包含T细胞表位的片段。T细胞表位是可以由T细胞(例如CD4+ 或CD8+ T 细胞)识别的短的邻接氨基酸序列。T细胞表位的鉴定可以经本领域技术人员熟知的表位作图实验来实现(参见例如Paul, Fundamental Immunology, 3rded., 243-247 (1993); Beiβbarth 等 Bioinformatics 2005 21(Suppl. 1):i29-i37)。
合适地,本发明的片段是免疫原性片段。根据本发明的“免疫原性片段”将通常包含来自全长多肽序列的至少9个邻接氨基酸(例如至少10个),诸如至少12个邻接氨基酸(例如至少15个或至少20个邻接氨基酸),尤其是至少50个邻接氨基酸,诸如至少100个邻接氨基酸(例如至少200个邻接氨基酸)。合适地,免疫原性片段将为全长多肽序列的长度的至少20%、诸如至少50%、至少70%或至少80%。
将理解在不同的远交种群(out-bred population)中,诸如人中,不同的HLA型意指特定表位可以由种群的所有成员识别。因此,为了最大化识别水平和对多肽免疫应答的规模,通常期望免疫原性片段包含来自全长序列的多个表位(合适地所有表位)。
变体
“变体”或“保守修饰的变体”应用于氨基酸和核酸序列两者。关于具体核酸序列,保守修饰的变体指编码相同或基本上相同的氨基酸序列或其中核酸不编码氨基酸序列至基本上相同的序列的那些核酸序列。
关于蛋白序列的变体,技术人员将认识到对多肽单独的取代、缺失或添加(其改变、添加或缺失单个氨基酸或小百分比的氨基酸)是“保守修饰的变体”,其中改变导致氨基酸被功能相似氨基酸取代或实质上不影响变体的生物功能的残基的取代/缺失/添加。
提供功能相似氨基酸的保守取代表是本领域众所周知的。此类保守修饰的变体除了且不排除本发明的多态变体、种间同源物和等位基因。
当相比于参考序列时,本发明的多肽(诸如CDTa蛋白或CDTb蛋白)可以含有多个保守取代(例如,1-50个,诸如1-25个,尤其是1-10个且特别是1个氨基酸残基可以改变)。通常,此类保守取代将落入下文说明的氨基酸分组之一中,尽管在一些情况下其他取代也是可以的且不会实质上影响抗原的免疫原性特性。以下八组各自含有通常彼此保守取代的氨基酸:
1)丙氨酸 (A), 甘氨酸 (G);
2)天冬氨酸 (D), 谷氨酸 (E);
3)天冬酰胺 (N), 谷氨酰胺 (Q);
4)精氨酸 (R), 赖氨酸 (K);
5)异亮氨酸 (I), 亮氨酸 (L), 甲硫氨酸 (M), 缬氨酸 (V);
6)苯丙氨酸 (F), 酪氨酸 (Y), 色氨酸 (W);
7)丝氨酸 (S), 苏氨酸 (T); 和
8)半胱氨酸 (C), 甲硫氨酸 (M)
(参见例如, Creighton, Proteins 1984)。
合适地,此类取代不在表位的区域中发生,并且因此不对抗原的免疫原性特性具有显著影响。
多肽变体还可以包括其中相比于参考序列插入额外的氨基酸的那些,例如,此类插入可以在1-10个位置(诸如1-5个位置、合适地1或2个位置,尤其是1个位置)发生,并且例如可以涉及在每一位置处添加50个或更少氨基酸(诸如20个或更少,尤其是10个或更少,特别是5个或更少)。合适地,此类插入不在表位的区域中发生,并且因此不对抗原的免疫原性特性具有显著影响。插入的一个实例包括组氨酸残基的短片段(例如2-6个残基)以帮助目标抗原的表达和/或纯化。
多肽变体包括其中相比于参考序列已缺失氨基酸的那些,例如,此类缺失可以在1-10个位置(诸如1-5个位置、合适地1或2个位置,尤其是1个位置)发生,并且例如可以涉及在每一位置处缺失50个或更少氨基酸(诸如20个或更少,尤其是10个或更少,特别是5个或更少)。合适地,此类缺失不在表位的区域中发生,并且因此不对抗原的免疫原性特性具有显著影响。
技术人员将认识到具体多肽变体可以包含取代、缺失和添加(或其任何组合)。
变体优选展示与相关的参考序列至少约70%同一性,更优选至少约80%同一性且最优选至少约90%同一性(诸如至少约95%,至少约98%或至少约99%)。
术语“相同”或百分比“同一性”在两个或多个核酸或多肽序列的上下文中指两个或多个序列或子序列,当如使用例如以下序列比较算法之一或通过手动比对和目测来测量的在比较窗口或指定区域上比较并比对最大对应时,其是相同的或具有相同的氨基酸残基或核苷酸的特定百分比(即,对于特定区域为70%同一性,任选75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%同一性)。此类序列随后被称为“实质上相同的”。该定义还指测试序列的致意(compliment)。任选地,同一性在长度为至少约25至约50个氨基酸或核苷酸的区域上存在,或任选在长度为75-100个氨基酸或核苷酸的区域上存在。合适地,在对应于参考序列的整个长度的窗口上进行比较。
对于序列比较,通常一个序列作为参考序列,测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时,将测试和参考序列登入计算机中,指定子序列坐标,如需要,指定序列算法程序参数。可以使用缺省程序参数,或者可以指定可选参数。序列比较算法随后基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。
如本文所用“比较窗口”指这样的区段,其中在两条序列最优对齐后,序列可以与相同数目的邻接位置的参考序列进行比较。用于比较的序列比对的方法是本领域所熟知的。用于比较的序列最优比对可以如下进行,例如通过Smith & Waterman, Adv. Appl.Math. 2:482 (1981)的局部同源性算法,通过Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)的同一性比对算法,通过Pearson & Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA85:2444 (1988)的搜索相似性方法,通过这些算法的计算机化实现(GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA,于 Wisconsin Genetics Software Package中, Genetics Computer Group,575 Science Dr., Madison, WI),或通过手动比对和目检(例如参见, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 等, 编辑 1995 supplement))。
可用的算法的一个实例是PILEUP。PILEUP使用渐进式两两比对(pairwisealignment)从一组相关序列中产生多序列比对来显示相关性和百分比序列同一性。它还绘制显示用于产生比对的成簇关系的树或系统树图(tree or dendogram)。PILEUP使用Feng& Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360 (1987)的渐进式比对方法的简化方式。所用的方法与Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989)所述的方法相似。程序可以比对多至300个序列,其各自最大长度为5,000核苷酸或氨基酸。多比对程序用两个最相似序列的两两比对开始,产生两个比对的序列的簇。该簇随后比对至所比对序列的下一最相关序列或簇。将两簇序列通过两个单独序列的两两比对的简单延伸(simple extension)来比对。最终比对通过一系列渐进式两两比对来实现。程序通过指定具体序列及其对于序列比对区域的氨基酸或核苷酸坐标并通过指定程序参数来运行。使用PILEUP,使用以下参数将参考序列与其他测试序列比较来确定百分比序列同一性关系:缺省缺口权重(gap weight)(3.00)、缺省缺口长度权重(0.10)和加权的末端缺口(weighted end gaps)。PILEUP可以获自GCG序列分析软件包,例如7.0版本(Devereaux 等, Nuc.Acids Res.12:387-395(1984)。
适合于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的另一实例是BLAST和BLAST2.0算法,其分别描述于Altschul 等, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977)和Altschul 等, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)。进行BLAST分析的软件从NationalCenter for Biotechnology Information (网址为www.ncbi.nlm.nih.gov/)上是公众可获得的。该算法首先涉及通过鉴定查询序列中长度W的短字符来鉴定高评分序列对(HSPs),当与数据库序列中相同长度的字符比对时,其匹配或满足某些正值的阈值分值T。T称为邻近字符分值阈值(Altschul等, 见上文)。这些初始的邻近字符匹配作为种子用于开始检索以发现包含它们的更长HSPs。字符匹配沿每一序列在两个方向上延伸,远至累积比对分值能够增加。对于核苷酸序列,使用参数M(对匹配残基对的奖励分值;始终>0)和N(对错配残基的惩罚分值;始终<0)计算累积分值。对于氨基酸序列,使用评分矩阵计算累积分值。当出现以下情况时,在每一方向上字符匹配的延伸停止:累积比对分值以数量X从它的最大实现值中掉落;由于积累了一个或多个负评分残基比对,累积分值变为零或低于零;或到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用字符长(W)为11、期望值(E)为10、M=5、N=-4和两条链的比较作为缺省值。对于氨基酸序列,BLASTP程序使用字符长为3、和期望值(E)为10、和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989))比对值(B)为50、期望值(E)为10、M=5、N=-4和比较两条链作为缺省值。
BLAST算法还进行两条序列之间的相似性的统计分析(参见例如, Karlin &Altschul, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993))。由BLAST算法提供的相似性的一种量度是最小和概率(P(N)),其提供概率的指示,通过所述概率指示两个核苷酸或氨基酸序列之间的匹配将偶然发生。例如,如果测试核酸与参考核酸的比较中的最小和概率小于约0.2,更优选小于约0.01且最优选小于约0.001,则认为核酸与参考序列相似。
多核苷酸鉴定和表征
本发明的编码艰难梭菌CDTa、CDTb、毒素A和毒素B蛋白的多核苷酸可以使用多种良好建立的技术的任一种来鉴定、制备和/或操作。例如,可以如下文更详尽所述通过筛选cDNA的微阵列来鉴定多核苷酸。此列筛选例如可以根据制造商说明书(且基本上如Schena等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619 (1996)和Heller等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150-2155 (1997)所述)使用Synteni微阵列 (Palo Alto, CA)来进行。可选地,多核苷酸可以从表达本文所述蛋白的细胞例如结核分枝杆菌细胞制备的cDNA来扩增。此类多核苷酸可以经聚合酶链反应(PCR)进行扩增。对于该方法,序列特异性引物可以基于本文提供的序列进行设计,并可以购买或合成。
多核苷酸的扩增部分可以用于使用众所周知的技术从合适文库(例如结核分枝杆菌cDNA文库)分离全长基因。在此类技术中,使用适合用于扩增的一个或多个多核苷酸探针或引物筛选文库(cDNA或基因组文库)。优选地,将文库大小选择以包括更大的分子。随机引发的文库还可以优选用于鉴定基因的5'和上游区。基因组文库优选用于获得内含子和延伸5'序列。
对于杂交技术,部分序列可以使用熟知的技术进行标记(例如,通过缺口平移或用32P末端标记)。细菌或噬菌体文库随后通常通过用标记的探针杂交含有变性细菌菌落的滤器(或含有噬菌斑的菌苔)进行筛选(参见Sambrook 等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2000))。选择并展开杂交菌落或噬菌斑,并分离DNA用于进一步分析。分析cDNA克隆来例如使用来自部分序列的引物和来自载体的引物通过PCR来确定额外序列的量。限制性图谱和部分序列可以生成以鉴定一个或多个重叠克隆。完整序列可以随后使用标准技术(其可以涉及生成一系列缺失克隆)来确定。所得的重叠序列可以随后装配入单一邻接序列中。全长cDNA分子可以通过连接合适片段使用熟知的技术来生成。
可选地,存在大量用于从部分cDNA序列获得全长编码序列的扩增技术。在此类技术内,通常经PCR进行扩增。多种商购试剂盒的任一种均可用于进行扩增步骤。可以使用例如本领域中熟知的软件来设计引物。引物优选长度为22-30个核苷酸,具有至少50%的GC含量,并在约68℃-72℃的温度下退火至靶序列。扩增的区域可以如上所述测序并且重叠序列装配入邻接序列中。
一种此类扩增技术为反向PCR(参见Triglia 等, Nucl.Acids Res.16:8186(1988)),其使用限制酶来生成基因已知区域中的片段。片段随后通过分子内连接环化并用作模板用于使用来源于已知区域的不同引物的PCR。在可选的方法中,邻近部分序列的序列可以用接头序列的引物和对已知区域特异性的引物通过扩增来获得。扩增后的序列通常进行第二轮扩增,使用相同的接头引物和对已知区域特异性的第二引物。该程序的变化描述于WO 96/38591中,其利用从已知序列在相对方向上起始延伸的两条引物。另一种此类技术已知为“cDNA末端快速扩增”或RACE。该技术涉及使用内部引物和外部引物,其杂交至聚腺苷酸(polyA)区域或载体序列,以鉴定已知序列的5'和3'的序列。额外的技术包括捕获PCR(Lagerstrom 等, PCR Methods Applic.1:111-19 (1991))和步行PCR (Parker 等, Nucl.Acids.Res.19:3055-60 (1991))。采用扩增的其他方法也可以采用以获得全长cDNA序列。
在某些情况中,可以获得全长cDNA序列,其通过分析在表达序列标签(EST)数据库中提供的序列,诸如可来自GenBank的序列。搜索重叠EST可以通常使用熟知程序进行(例如NCBI BLAST搜索),并且此类EST可以使用来生成邻接的全长序列。全长DNA序列还可以通过分析基因组片段获得。
宿主细胞中的多核苷酸表达
编码艰难梭菌CDTa、CDTb、毒素A或毒素B蛋白、或其融合蛋白或功能等同物的多核苷酸序列或其片段可以用于重组DNA分子以在合适宿主细胞中直接表达多肽。由于遗传编码的内在简并性,编码实质上相同或功能等同的氨基酸序列的其他DNA序列可以产生并且这些序列可以用于克隆并表达给定多肽。
如本领域技术人员将理解的,在一些情况下有利的是产生具有非天然存在密码子的编码多肽的核苷酸序列。例如,可以选择由具体原核或真核宿主优选的密码子以增加蛋白表达速率或产生具有期望特性(诸如比由天然存在序列生成的转录物的半衰期更长的半衰期)的重组RNA转录物。
此外,多核苷酸序列可以为了多种原因使用本领域通常已知的方法来工程化以改变多肽编码序列,包括但不限于修饰基因产物的克隆、加工和/或表达的改变。例如,可以使用通过随机断裂的DNA改组和基因片段和合成寡核苷酸的PCR重装配来工程化核苷酸序列。此外,可以使用基因定点诱变来插入新的限制位点、变更糖基化模式、改变密码子偏好、产生剪接变体或引入突变等。
天然的、修饰的或重组核酸序列可以连接至异源序列以编码融合蛋白。例如,为了筛选用于多肽活性的抑制剂的肽文库,编码可以由商购抗体识别的嵌合蛋白可能是有用的。融合蛋白还可以进行工程化以包含位于编码多肽的序列和异源蛋白序列之间的切割位点,从而使得多肽可以被切割并与异源部分分离而纯化。
可以使用本领域中熟知的化学方法全部或部分合成编码期望的多肽的序列(见Caruthers, M. H. 等, Nucl.Acids Res.Symp.Ser. pp. 215-223 (1980), Horn 等, Nucl.Acids Res.Symp.Ser. pp. 225-232 (1980))。或者,蛋白本身可以使用合成多肽或其部分的氨基酸序列的化学方法来产生。例如,肽合成可以使用多种固相技术(Roberge等, Science 269:202-204 (1995))进行并且自动合成可以例如使用ABI 431A PeptideSynthesizer (Perkin Elmer, Palo Alto, CA)来实现。
新合成的肽可以通过制备型高效液相层析(例如, Creighton, Proteins, Structures and Molecular Principles (1983))或本领域可用的其他相当的技术来实质上纯化。合成肽的组合物可以通过氨基酸分析或测序(例如,Edman降解程序)来确认。此外,多肽的氨基酸序列或其任何部分可以在直接合成过程中改变和/或使用化学方法与来自其他蛋白或其任何部分的序列组合以产生变体多肽。
为了表达期望的多肽,可以将编码多肽或功能等同物的核苷酸序列插入合适的表达载体,即含有所插入的编码序列的转录和翻译的必要元件的载体。本领域技术人员熟知的方法可用于构建含有编码目标多肽的序列和合适的转录和翻译控制元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。此类技术描述于Sambrook 等, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2000),和Ausubel 等, Current Protocols in Molecular Biology (每年更新)。
多种表达载体/宿主系统可用于包含并表达多核苷酸序列。这些包括但不限于微生物诸如用重组噬菌体、质粒或黏粒DNA表达载体转化的细菌;用酵母表达载体转化的酵母;用病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统;用病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒,CaMV;烟草花叶病毒,TMV)或用细菌表达载体(例如Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统;或动物细胞系统。
存在于表达载体中的“控制元件”或“调控序列”是载体的那些非翻译区域——增强子、启动子、5'和3'非翻译区域——其与宿主细胞蛋白相互作用以进行转录和翻译。此类元件可以在其强度和特异性中不同。取决于所用的载体系统和宿主,可以使用任何数目的合适的转录和翻译元件,包括组成型和诱导型启动子。例如,当克隆在细菌系统中时,可以使用诱导型启动子诸如PBLUESCRIPT 噬菌粒 (Stratagene, La Jolla, Calif.) 或PSPORT1 质粒 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD)等的杂合lacZ启动子。在哺乳动物细胞系统中,通常优选来自哺乳动物基因或来自哺乳动物病毒的启动子。如果需要生成含有编码多肽的序列的多个拷贝的细胞系,可以有利地使用基于SV40或EBV的载体与合适的可选择标记物。
在细菌系统中,根据旨在用于表达的多肽的用途,可以选择多种表达载体。例如,当需要大量时,例如用于诱导抗体,可以使用指导容易纯化的融合蛋白的高水平表达的载体。此类载体包括但不限于多功能大肠杆菌克隆和表达载体诸如BLUESCRIPT(Stratagene),其中编码目标多肽的序列可以框内(in frame)连接入具有氨基末端Met和随后的β-半乳糖苷酶的7个残基的序列的载体中使得产生杂合蛋白;pIN载体 (Van Heeke&Schuster, J. Biol. Chem. 264:5503-5509 (1989));等等。pGEX载体(Promega,Madison, Wis; GE Healthcare.)也可以用于表达作为与谷胱甘肽S转移酶(GST)的融合蛋白的融合多肽。通常,此类融合蛋白是可溶的并且可以容易地通过吸附至谷胱甘肽-琼脂糖珠随后在游离谷胱甘肽存在的情况下洗脱而从裂解的细胞中纯化。在此类系统中制备的蛋白可以设计以包括肝素、凝血酶或因子XA蛋白酶切割位点,使得克隆的目标多肽可以随意从GST部分释放。
在酵母中,例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或毕赤酵母属(Pichia)诸如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris),多种含有组成型或诱导型启动子诸如α因子、醇氧化酶和PGH的载体可以使用。其他含有组成型或诱导型启动子的载体包括GAP、PGK、GAL和ADH。综述见于Ausubel等(上文) 和 Grant 等, Methods Enzymol.153:516-544 (1987)和 Romas 等Yeast 8 423-88 (1992)。
在其中使用植物表达载体的情况下,编码多肽的序列的表达可以由多种启动子的任一种驱动。例如,病毒启动子诸如CaMV的35S和19S启动子可以单独使用或与来自TMV的ω前导序列(Takamatsu, EMBO J. 6:307-311 (1987))组合使用。可选地,植物启动子诸如RUBISCO的小亚基或热休克启动子可以使用(Coruzzi 等, EMBO J. 3:1671-1680 (1984);Broglie 等, Science 224:838-843 (1984); 和Winter 等, Results Probl.Cell Differ.17:85-105 (1991))。这些构建体可以通过直接DNA转化或病原体介导的转染引入植物细胞。此类技术描述于许多通常可获的综述中(参见例如, Hobbs于McGraw Hill Yearbook of Science and Technology pp. 191-196 (1992))。
还可以使用昆虫系统来表达目标多肽。例如,在一个此类系统中,使用苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)作为载体来在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞或在粉夜蛾幼虫(Trichoplusia larvae)中表达外源基因。编码多肽的这些序列可以克隆入病毒的非必要区域,诸如多角体蛋白基因,并置于多角体蛋白启动子的控制下。编码多肽序列的成功插入将使得多角体蛋白基因失活并产生缺少外壳蛋白的重组病毒。重组病毒可以随后用于感染例如草地贪夜蛾细胞或粉夜蛾幼虫,其中目标多肽可以表达(Engelhard 等, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91 :3224-3227(1994))。
在哺乳动物宿主细胞中,多种基于病毒的表达系统通常可用。例如,在其中腺病毒用作表达载体的情况中,编码目标多肽的序列可以连接入由后期启动子和三联前导序列组成的腺病毒转录/翻译复合体中。在病毒基因组的非必需E1或E3区域中插入可以用于获得能够在经感染的宿主细胞中表达多肽的活病毒(Logan & Shenk, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:3655-3659 (1984))。此外,转录增强子诸如劳斯肉瘤病毒(RSV)增强子可用于增加哺乳动物宿主细胞中的表达。用于操作腺病毒载体的方法和方案综述于Wold, Adenovirus Methods and Protocols, 1998。关于使用腺病毒载体的额外参考可见于Adenovirus:A Medical Dictionary, Bibliography, and Annotated Research Guide to Internet References, 2004。
特异性起始信号还可用于实现编码目标多肽的序列的更有效翻译。此类信号包括ATG起始密码子和邻近序列。在其中编码多肽的序列、其起始密码子和上游序列插入合适的表达载体的情况中,可以不需要额外的转录和翻译控制信号。然而,在其中仅插入编码序列或其部分的情况中,应该提供包括ATG起始密码子的外源翻译控制信号。此外,起始密码子应该在正确的读码框内以确保整个插入序列的翻译。外源翻译元件和起始密码子可以是多种来源,天然的和合成的两者。表达效率可以通过包括对于所用的具体细胞系统合适的增强子而得到增强,诸如文献中描述的那些(Scharf.等, Results Probl.Cell Differ.20:125-162 (1994))。
此外,宿主细胞菌株可以对其调节插入的序列的表达或以期望方式处理所表达的蛋白的能力进行选择。多肽的此类修饰包括但不限于乙酰化、羧基化、糖基化、磷酸化、脂化、和酰化。切割蛋白的“前原(prepro)”形式的翻译后加工也可以用于促进正确插入、折叠和/或行使功能。可以选择不同的宿主细胞诸如CHO、HeLa、MDCK、HEK293和WI38(其对于此类翻译后活性具有特定的细胞机器和特征机制)以确保外源蛋白的正确修饰和加工。
对于长期、高产率生产重组蛋白,通常优选稳定表达。例如,稳定表达目标多核苷酸的细胞系可以使用可在相同的或在分开的载体上含有病毒复制起点和/或内源表达元件和可选择标记物基因的表达载体进行转化。引入载体后,细胞可以允许在富集培养基中生长1-2天,随后将它们转换至选择培养基中。可选择标记物的目的在于赋予抗性进行选择,并且其存在允许成功表达引入的序列的细胞的生长和回收。稳定转染的细胞的抗性克隆可以使用对于细胞类型合适的组织培养技术来增殖。
可以使用任何数目的选择系统来回收转化的细胞系。这些包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler 等, Cell 11:223-32 (1977))和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy等, Cell 22:817-23 (1990))基因,其可以分别用于tk.sup.-或aprt.sup.-细胞中。此外,可以将抗代谢物、抗生素或除草剂抗性用作选择基础;例如,赋予对甲氨蝶呤抗性的dhfr(Wigler 等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77:3567-70 (1980));npt,其赋予对氨基糖甙类的抗性,新霉素和G-418 (Colbere-Garapin 等, J. Mol. Biol. 150:1-14(1981));和als或pat,其分别赋予对于氯磺隆和草丁膦乙酰转移酶(phosphinotricinacetyltransferase)的抗性(Murry,上文)。已描述额外的可选择基因,例如,trpB,其允许细胞利用吲哚代替色氨酸,或hisD,其允许细胞利用组氨醇(histinol)代替组氨酸(Hartman & Mulligan, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:8047-51 (1988))。近来,使用可见标记物已得到普及,其中此类标记物如花色素苷、β-葡糖醛酸酶及其底物GUS,和萤光素酶及其底物萤光素广泛地不仅用于鉴定转化子而且还定量归因于特定表达系统的瞬时或稳定蛋白表达的量(Rhodes 等, Methods Mol.Biol.55:121-131 (1995))。
尽管标记物基因表达的存在/不存在暗示目标基因也存在,但目标基因的存在和表达可能需要确证。例如,如果编码多肽的序列插入标记物基因序列中,则含有序列的重组细胞可以通过缺乏标记物基因功能而鉴定。可选地,标记物基因可以与编码多肽的序列串联置于单个启动子的控制下。响应于诱导或选择的标记物基因的表达通常表示串联基因也表达。
可选地,含有且表达期望的多核苷酸序列的宿主细胞可以通过多种本领域技术人员已知的程序来鉴定。这些程序包括但不限于DNA-DNA或DNA-RNA杂交和蛋白生物测定或免疫测定技术,其包括用于检测和/或定量核酸或蛋白的基于膜、溶液或芯片的技术。
用于检测和测量多核苷酸编码的产物的表达的多种方案(其使用对产物特异性的多克隆或单克隆抗体)是本领域已知的。实例包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)和荧光激活细胞分选(FACS)。利用与给定多肽上的两个非干扰表位反应性的单克隆抗体的基于两位点、单克隆的免疫测定可以优选用于一些应用,但也可以采用竞争性结合测定。这些和其他测定除此以外描述于Hampton 等, Serological Methods, a Laboratory Manual (1990)和Maddox 等, J. Exp.Med.158:1211-1216 (1983)。
许多种标记和缀合技术是本领域技术人员已知的并可以用于多种核酸和氨基酸测定中。用于产生检测与多核苷酸相关的序列的标记的杂交或PCR探针的方法包括使用标记的核苷酸的寡标记、缺口平移、末端标记或PCR扩增。可选地,序列或其任何部分可以克隆入用于产生mRNA探针的载体内。此类载体是本领域已知的,可商购且可以用于通过添加合适的RNA聚合酶诸如T7、T3或SP6和标记的核苷酸来体外合成RNA探针。这些程序可以使用多种可商购试剂盒来进行。可以使用的合适的报道分子或标记包括放射性核素、酶、荧光剂、化学发光剂或生色剂以及底物、辅因子、抑制剂、磁性颗粒等。
用目标多核苷酸序列转化的宿主细胞可以在适合于表达和从细胞培养物中回收蛋白的条件下进行培养。由重组细胞产生的蛋白可以分泌或包含在胞内,其取决于所用的序列和/或载体。如本领域技术人员将理解的,含有多核苷酸的表达载体可以设计以含有指导所编码的多肽经原核或真核细胞膜分泌的信号序列。其他重组构建可用于将编码目标多肽的序列与编码将利于可溶性蛋白纯化的多肽结构域的核苷酸序列连接。此类利于纯化的结构域包括但不限于金属螯合肽诸如组氨酸-色氨酸模块(其允许在固定的金属上纯化),蛋白A结构域(其允许在固定的免疫球蛋白上纯化),和用于FLAGS延伸/亲和纯化系统(Immunex Corp., Seattle, Wash.)中的结构域。在纯化结构域和编码的多肽之间包括可切割接头序列诸如对于因子XA或肠激酶特异性的那些(Invitrogen. San Diego, Calif.)可用于利于纯化。一种此类表达载体提供含有目标多肽和编码在硫氧还蛋白或肠激酶切割位点前的6个组氨酸残基的核酸的融合蛋白的表达。组氨酸残基促进在IMIAC(固定金属离子亲和层析)上的纯化,如描述于Porath 等, Prot. Exp. Purif. 3:263-281 (1992),而肠激酶切割位点提供从融合蛋白纯化期望的多肽的方法。含有融合蛋白的载体的讨论提供于Kroll 等, DNA Cell Biol.12:441-453 (1993))。
多肽组合物
通常,本发明使用的多肽(例如艰难梭菌CDTa、CDTb、毒素A和毒素B蛋白)将是分离的多肽(即,分离自所述多肽在天然情况下通常发现伴随的那些组分)。
例如,如果天然存在的蛋白分离自天然系统中共存物质的一些或所有中,则其被分离。优选地,此类多肽为至少约90%纯,更优选至少约95%纯,且最优选至少约99%纯。如果例如将多核苷酸克隆入不是天然环境的一部分的载体内,则认为将其分离。
多肽可以使用多种众所周知的技术的任一种来制备。由上文所述的DNA序列编码的重组多肽可以容易地使用本领域普通技术人员已知的多种表达载体的任一种从DNA序列中制备。表达可以在任何已转化有或转染有包含编码重组多肽的DNA分子的表达载体的合适宿主细胞中实现。合适的宿主细胞包括原核生物、酵母、和高等真核细胞,诸如哺乳动物细胞和植物细胞。优选地,采用的宿主细胞是大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞系诸如COS或CHO。来自分泌重组蛋白或多肽至培养基中的合适宿主/载体系统的上清液可使用可商购滤器首先浓缩。浓缩后,浓缩物可以应用到合适的纯化基质诸如亲和基质或离子交换树脂。最后,可以采用一种或多种反向HPLC步骤来进一步纯化重组多肽。
用于本发明的多肽、其免疫原性片段和具有小于约100个氨基酸且通常小于约50个氨基酸的其他变体也可以通过合成方法使用本领域普通技术人员熟知的技术来生成。例如,此类多肽可以使用任何可商购的固相技术诸如Merrifield固相合成方法(其中氨基酸顺序地添加至生长中的氨基酸链)来合成。参见Merrifield, J. Am. Chem.Soc.85:2149-2146 (1963)。自动合成多肽的设备可从供应商诸如Perkin Elmer/Applied BioSystemsDivision (Foster City, CA)进行商购,并可以根据制造商说明书进行操作。
在某些特定的实施方案中,多肽可以是融合蛋白,其包含如本文描述的多个多肽,或者包含至少一个如本文所述的多肽和不相关序列,此类蛋白的实例包括破伤风、结核病和肝炎蛋白(参见例如, Stoute 等,New Engl. J. Med.336:86-91 (1997))。融合配偶体例如可以有助于提供T辅助细胞表位(免疫融合配偶体),优选由人识别的T辅助细胞表位,或者可以有助于以高于天然重组蛋白的产量表达蛋白(表达增强子)。某些优选的融合配偶体是免疫和表达增强的融合配偶体。其他融合配偶体可以选择以增加蛋白的溶解性或使得蛋白靶向期望的胞内区室。还进一步的融合配偶体包括亲和标签,其促进蛋白纯化。
融合蛋白可以通常使用标准技术包括化学缀合来制备。优选地,融合蛋白表达为重组蛋白,其允许在表达系统中相对于未融合的蛋白,以提高的水平生产。简言之,编码多肽组分的DNA序列可以分开装配,并连接入合适的表达载体中。用或不用肽接头将编码一种多肽组分的DNA序列的3'末端连接至编码第二多肽组分的DNA序列的5'末端,使得序列的读码框是同相的(in phase)。这允许翻译为单一融合蛋白,其保留了两种组分多肽的生物活性。
可以使用肽接头序列来通过足以确保每一肽折叠成其二级和三级结构的距离分隔开第一和第二多肽组分。使用本领域熟知的标准技术将这样的肽接头序列整合入融合蛋白中。可以根据以下因素选择合适的肽接头序列:(1)它们采用柔性延伸构象的能力;(2)它们采用能够与第一和第二多肽上的功能性表位相互作用的二级结构的能力;和(3)缺少可以与多肽功能性表位反应的疏水性或带电残基。优选的肽接头序列包含Gly、Asn和Ser残基。其他的近中性氨基酸诸如Thr和Ala也可以用于接头序列中。可以有用地用作接头的氨基酸序列包括以下中公开的那些:Maratea 等, Gene 40:39-46 (1985); Murphy 等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:8258-8262 (1986); 美国专利号4,935,233和美国专利号4,751,180。接头序列的长度通常可以为1-约50个氨基酸。当第一和第二多肽具有可用于分隔功能结构域并阻止立体干扰(steric interference)的非必需N末端氨基酸区时,不需要接头序列。
佐剂
在本发明任一方面的进一步的实施方案中,免疫原性组合物进一步包含佐剂。在一个实施方案中,佐剂包括氢氧化铝或磷酸铝。可选地,本发明的免疫原性组合物可以包含无铝佐剂,将免疫原性组合物与不含铝或铝盐的佐剂(即无铝佐剂或佐剂系统)配制。
在某些实施方案中,免疫原性组合物与以脂质体形式存在的包含免疫活性皂苷级分的佐剂配制。佐剂可以进一步包含脂多糖。佐剂可以包含QS21。例如,在一个实施方案中,佐剂包含在脂质体制剂中的QS21。在一个实施方案中,佐剂系统包括3D-MPL和QS21。例如,在一个实施方案中,佐剂包含在脂质体制剂中的3D-MPL和QS21。任选地,佐剂系统还包含胆固醇。在一个特定的实施方案中,佐剂包括QS21和胆固醇。任选地,佐剂系统包含1, 2-二油酰基-锡(sn)-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)。例如,在一个特定的佐剂系统中,包含胆固醇、DOPC、3D-MPL和QS21。
在一个特定实例中,免疫原性组合物包括以包括以下的剂量配制的佐剂:约0.1至约0.5 mg胆固醇;约0.25至约2 mg DOPC;约10 µg至约100 µg 3D-MPL;和约10 µg至约100µg QS21。在另一个特定实例中,免疫原性组合物包括以包括以下的剂量配制的佐剂:约0.1至约0.5 mg胆固醇;约0.25至约2 mg DOPC;约10 µg至约70 µg 3D-MPL;和约10 µg至约70µg QS21。在一种特定的制剂中,佐剂以单一剂量配制,其包含:约0.25 mg胆固醇;约1.0 mgDOPC;约 µg 3D-MPL;和约50 µg QS21。在其他实施方案中,免疫原性组合物以分次剂量(它是这样的剂量,其为之前单一剂量制剂的一部分,诸如二分之一的之前量的组分(胆固醇、DOPC、3D-MPL和QS21)、1/4的之前量的组分或另一分次剂量(例如1/3、1/6等)的之前量的组分)配制。
在一个实施方案中,根据本发明的免疫原性组合物包含含有脂多糖和皂树皂甙(Quillaja saponin)的组合的佐剂(其已之前公开于例如EP0671948中)。本专利证明当脂多糖(3D-MPL)与皂树皂苷(QS21)组合时的强协同作用。
佐剂可以进一步包含免疫刺激性寡核苷酸(例如CpG)或载体。
用于本发明的尤其合适的皂苷是Quil A及其衍生物。Quil A是分离自南美树皂皮树(Quillaja Saponaria Molina)的皂苷制剂,并首次由Dalsgaard等于1974年(“Saponinadjuvants”, Archiv. für die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag,Berlin, p243-254)描述具有佐剂活性。Quil A的纯化片段已通过HPLC分离,所述纯化片段保留佐剂活性而不具有伴随Quil A的毒性(EP 0 362 278),例如QS7和QS21(也称为QA7和QA21)。QS21是来源于皂皮树的树皮的天然皂苷,其诱导CD8+细胞毒性T细胞(CTLs)、Th1细胞和主要的IgG2a抗体应答,并且是本发明上下文中优选的皂苷。
当佐剂包含以脂质体形式存在的免疫活性皂苷级分时,佐剂可以进一步包含固醇。合适地,固醇以1:1-1:100 w/w、诸如1:1-1:10w/w或1:1-1:5 w/w的皂苷:固醇的比例提供。
在特定的实施方案中,QS21以其更低的反应原性组合物提供,其中其用外源固醇诸如胆固醇猝灭(quenched)。存在几种具体的更低反应原性组合物的形式,其中QS21用外源胆固醇猝灭。在一个特定的实施方案中,皂苷/固醇呈脂质体结构的形式(WO 96/33739,实施例1)。在该实施方案中,脂质体合适地包含中性脂质,例如磷脂酰胆碱,其合适地在室温下是非结晶的,例如卵黄磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)或二月桂基磷脂酰胆碱。该脂质体还可以包含带电荷的脂质,其增加脂质体-QS21结构对由饱和的脂质构成的脂质体的稳定性。在这些情况中,带电荷的脂质的量合适地为1-20% w/w,优选5-10%。固醇与磷脂的比例为1-50% (mol/mol),合适地为20-25%。
合适的固醇包括β-谷甾醇、豆甾醇、麦角甾醇、麦角钙化醇和胆固醇。在一个具体的实施方案中,佐剂组合物包含胆固醇作为固醇。这些甾醇是本领域熟知的,例如胆固醇公开于Merck Index,第11版,第341页,作为动物脂肪中发现的天然存在的甾醇。
当活性皂苷级分为QS21时,QS21:固醇的比例将通常在1:100-1:1 (w/w)、合适地在1:10-1:1 (w/w)、且优选地在1:5-1:1 (w/w)的级别(order)中。合适地,过量固醇存在,QS21:固醇的比例为至少1:2 (w/w)。在一个实施方案中,QS21:固醇的比例为1:5 (w/w)。固醇合适地为胆固醇。
在一个实施方案中,本发明提供一剂量的免疫原性组合物,其包含免疫活性的皂苷,优选QS21,以约1-约70 μg/剂量的水平,例如以约50 μg的量。
在一个实施方案中,本发明提供一剂量的免疫原性组合物,其包含免疫活性的皂苷,优选QS21,以约60 μg或更低的水平,例如1-60 μg。在一个实施方案中,所述剂量的免疫原性组合物包含以约50 µg的水平的QS21,例如45-55 µg,合适地46-54 µg或47-53 µg或48-52 µg或49-51 µg或50 µg。
在另一个实施方案中,所述剂量的免疫原性组合物包含以约25 µg的水平的QS21,例如20-30 µg,合适地21-29 µg或22-28 µg或23-27 µg或24-26 µg或25 µg。
在另一个实施方案中,所述剂量的免疫原性组合物包含以每约10 µg的水平的QS21,例如5-15 µg,合适地6-14 µg,例如7-13 µg或8-12 µg或9-11 µg或10µg。
具体而言,0.5 ml疫苗剂量体积包含每剂量25 µg或50 µg的QS21。具体而言,0.5ml疫苗剂量体积包含每剂量50 µg的QS21。
在包含脂多糖的组合物中,脂多糖可以以约1-约70 µg/剂量的量存在,例如以约50 µg的量。
脂多糖可以是脂质A的无毒衍生物,尤其是单磷酰脂质A或更尤其是3-脱酰单磷酰脂质A (3D – MPL)。
3D-MPL以名称MPL由GlaxoSmithKline Biologicals S.A.销售并且在整个本文件中称为MPL或3D-MPL。例如,参见美国专利号4,436,727; 4,877,611; 4,866,034和4,912,094。3D-MPL主要促进具有IFN-γ (Th1)表型的CD4+ T细胞应答。3D-MPL可以根据GB 2 220211 A中描述的方法产生。在化学上,它是具有3、4、5或6个酰化链的3-脱酰单磷酰脂质A的混合物。优选地,在本发明的组合物中,使用小颗粒3D-MPL。小颗粒3D-MPL具有可以使它经0.22µm滤器无菌过滤的颗粒大小。此类制剂描述于WO 94/21292中。
因此,本发明提供一剂量的免疫原性组合物,其包含脂多糖,优选3D-MPL,以75 μg或更低的水平,例如1-60 μg。
在一个实施方案中,所述剂量的免疫原性组合物包含以约50 µg的水平的3D-MPL,例如45-55 µg,合适地46-54 µg或47-53 µg或48-52 µg或49-51 µg或50 µg。
在一个实施方案中,所述剂量的免疫原性组合物包含以约25 µg的水平的3D-MPL,例如20-30 µg,合适地21-29 µg或22-28 µg或23-27 µg或24-26 µg或25 µg。
在另一个实施方案中,所述剂量的免疫原性组合物包含以约10 µg的水平的3D-MPL,例如5-15 µg,合适地6-14 µg,例如7-13 µg或8-12 µg或9-11 µg或10µg。
在一个实施方案中,剂量体积为0.5 ml。在进一步的实施方案中,免疫原性组合物以适合于体积大于0.5 ml例如0.6、0.7、0.8、0.9或1 ml的剂量的体积。在进一步的实施方案中,人剂量为1 ml-1.5 ml。
具体而言,0.5 ml疫苗剂量体积包含每剂量25 µg或50 µg的3D-MPL。具体而言,0.5 ml疫苗剂量体积包含每剂量50 µg的3D-MPL。
根据本发明的任一方面的免疫原性组合物的剂量合适地指人剂量。术语“人剂量”表示在适合于人使用的体积中的剂量。通常,这为0.3-1.5 ml。在一个实施方案中,人剂量为0.5 ml。在进一步的实施方案中,人剂量高于0.5 ml,例如0.6、0.7、0.8、0.9或1 ml。在进一步的实施方案中,人剂量为1 ml-1.5 ml。
合适的本发明的组合物是那些组合物,其中最初在无MPL的情况下制备脂质体(如WO 96/33739中所描述),并且随后加入MPL,适合地为小于100 nm颗粒的小颗粒或容易经0.22 µm膜无菌过滤的颗粒。因此MPL不包含在小泡膜内(已知为MPL在外)。其中MPL包含在小泡膜内(已知为MPL在内)的组合物也形成本发明的方面。包含艰难梭菌毒素A片段和/或艰难梭菌毒素B片段的多肽可以包含在小泡膜(vesicle membrane)内或包含在小泡膜外。
在特定的实施方案中,QS21和3D-MPL以相同的每剂量免疫原性组合物最终浓度存在,即QS21:3D-MPL的比率为1:1。在该实施方案中的一个方面中,一剂量的免疫原性组合物包含25 µg的3D-MPL和25 µg的QS21或50 µg的3D-MPL和50 µg的QS21的终水平。
在一个实施方案中,佐剂包括水包油乳状液。在一个实施方案中,佐剂包含水包油乳状液,其中水包油乳状液包含可代谢油、母育酚(tocol)和乳化剂。例如,水包油乳状液可以包含油相,其掺合可代谢油和额外的油相组分诸如母育酚。水包油乳状液还可以包含含水组分,诸如缓冲的盐溶液(例如,磷酸缓冲盐溶液)。此外,水包油乳状液通常包含乳化剂。在一个实施方案中,可代谢油是角鲨烯。在一个实施方案中,母育酚是α生育酚。在一个实施方案中,乳化剂是非离子表面活性剂乳化剂(诸如聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯(polyoxyethethylene sorbitan monooleate)、Polysorbate® 80、TWEEN80™)。在示例性实施方案中,水包油乳状液包含角鲨烯和α生育酚,其以等于或小于1 (w/w)的比率。
水包油乳状液中的可代谢油可以以0.5-10mg的量存在。水包油乳状液中的母育酚可以以0.5-11 mg的量存在。乳化剂可以以0.4-4 mg的量存在。
为了任何水包油组合物适合于人施用,乳状液系统的油相必须包含可代谢油。术语可代谢油的含义是本领域熟知的。可代谢的可以定义为‘能够通过新陈代谢来转化’(Dorland’s Illustrated Medical Dictionary, W.B.Sanders Company, 25th edition(1974))。油可以是任何植物油、鱼油、动物油或合成油,其对于受体是无毒的并且能够通过新陈代谢来转化。坚果、种子和谷物是植物油的常见来源。合成油也是本发明的部分,并且可以包括可商购的油诸如NEOBEE®(使用甘油从植物油来源制备的辛酸甘油三酯/癸酸甘油三酯和从椰子油或棕榈仁油制备的中链脂肪酸(MCT))及其他。特别合适的可代谢油是角鲨烯。角鲨烯(2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯)是不饱和油,其大量发现于鲨鱼肝油中,以较低量于橄榄油、麦胚芽油、米糠油和酵母中,并且是用于本发明的尤其优选的油。角鲨烯是借助于以下的事实的可代谢油,即其是胆固醇的生物合成的中间体(Merck index, 10th Edition, 登录号8619)。
合适地,可代谢油以0.5-10 mg的量存在于佐剂组合物中,优选1-10、2-10、3-9、4-8、5-7、或5-6 mg (例如 2-3、5-6、或9-10mg),尤其是约5.35 mg或约2.14 mg/剂量。
母育酚是本领域中众所周知的并描述于EP0382271。合适地,母育酚是α生育酚或其衍生物,诸如α生育酚琥珀酸酯(也称为维生素E琥珀酸酯)。所述母育酚合适地以0.5-11mg的量存在,优选1-11、2-10、3-9、4-8、5-7、或5-6 mg (例如 10-11、5-6、2.5-3.5或1-3mg)。在特定的实施方案中,母育酚以约5.94 mg或约2.38 mg/剂量的量存在。
水包油乳状液进一步包含乳化剂。乳化剂可以合适地为聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯。在具体的实施方案中,乳化剂可以为Polysorbate® 80 (聚氧乙烯(20)山梨聚糖单油酸酯)或Tween® 80。
所述乳化剂合适地以0.1-5、0.2-5、0.3-4、0.4-3或2-3 mg (例如0.4-1.2、2-3或4-5 mg)乳化剂的量存在于佐剂组合物中。在特定的实施方案中,乳化剂以约0.97 mg或约2.425 mg的量存在。
在一个实施方案中,组合物中存在的具体组分的量为存在于0.5 ml人剂量中的量。在进一步的实施方案中,免疫原性组合物以适合于体积大于0.5 ml例如0.6、0.7、0.8、0.9或1 ml的人剂量的体积。在进一步的实施方案中,人剂量为1 ml-1.5 ml。
当佐剂为液体形式并与多肽组合物的液体形式组合时,以人剂量的佐剂组合物将是人剂量的预期终体积的一部分,例如约一半的人剂量的预期终体积,例如对于0.7 ml的预期人剂量为350 µl体积,或对于0.5 ml的预期人剂量为250 µl体积。当与多肽抗原组合物组合时,将佐剂组合物稀释以提供疫苗的最终人剂量。此类剂量的终体积将当然根据佐剂组合物的初始体积和添加至佐剂组合物的多肽抗原组合物的体积而不同。在可选的实施方案中,使用液体佐剂来重构冷冻干燥的多肽组合物。在该实施方案中,佐剂组合物的人剂量约等于人剂量的终体积。将液体佐剂组合物添加至含有冷冻干燥的多肽组合物的小瓶中。终人剂量可以在0.5-1.5 ml之间变化。
生产水包油乳状液的方法是本领域技术人员熟知的。通常,所述方法包括混合含有母育酚的油相与表面活性剂诸如PBS/聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯溶液,随后使用匀浆器均化。对于本领域技术人员将清楚的是包括将混合物通过注射器针两次的方法将适合于均化小体积的液体。同样,微射流器(microfluidiser)(M110S Microfluidics机, 最大50次通过, 以最大6 bar的压力输入持续2分钟的时期(约850 bar的输出压力))中的乳化过程可以由本领域技术人员适配来产生较小或较大的乳状液体积。适配可以通过例行实验来实现,其包括测量所得的乳状液直至实现具有所需直径的油滴的制剂。
在水包油乳状液中,油和乳化剂应在含水载体中。含水载体可以例如是磷酸缓冲盐溶液。
优选地,本发明的水包油乳状液系统具有亚微米范围的小油滴大小。合适地,微滴大小将在120-750 nm范围中,更优选大小为直径120-600 nm。最优选地,水包油乳状液包含其中以强度(intensity)计至少70%为直径小于500 nm,更优选以强度计至少80%直径小于300 nm,更优选以强度计至少90%直径范围在120-200 nm的油滴。
在一个实施方案中,免疫原性组合物不是组合有佐剂的3μg或10 µg的SEQ IDNos. 1-7中任一种,所述佐剂包含具有0.125 mL SB62乳状液(总体积)、5.35 mg角鲨烯、5.94 mg DL-α-生育酚和2.425 mg聚山梨酯80/0.5 ml剂量的水包油乳状液。在一个实施方案中,免疫原性组合物不是组合有佐剂的3μg或10 µg的SEQ ID Nos. 1-7中任一种,所述佐剂包含5.35 mg角鲨烯、5.94 mg DL-α-生育酚和2.425 mg聚山梨酯80/0.5 ml剂量的水包油乳状液。在一个实施方案中,免疫原性组合物不包含佐剂,所述佐剂含有具有角鲨烯、DL-α-生育酚和聚山梨酯80的水包油乳状液。
本发明的免疫原性组合物和疫苗
在一个实施方案中,免疫原性组合物具有0.5-1.5 ml的体积。
在一个实施方案中,免疫原性组合物还包含额外的抗原。在一个实施方案中,额外抗原是来源于选自以下的细菌的抗原:肺炎链球菌(S.pneumoniae)、流感嗜血杆菌(H.influenzae)、脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)、大肠杆菌(E.coli)、粘膜炎莫拉菌(M.catarrhalis)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)(破伤风)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)(白喉)、百日咳杆菌(Bordetella pertussis)(百日咳)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、肠球菌(enterococci)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。在进一步的实施方案中,本发明的免疫原性组合物可以包含来自艰难梭菌的进一步的抗原,例如S层蛋白(WO01/73030)。任选地,免疫原性组合物还包含来自艰难梭菌的糖。
还提供包含本发明免疫原性组合物和药学上可接受的赋形剂的疫苗。
可以通过经全身或黏膜途径施用包含本发明的免疫原性组合物的疫苗制剂,使用所述疫苗来保护对艰难梭菌感染易感的哺乳动物或治疗患有艰难梭菌感染的哺乳动物。这些施用可以包括经肌内、腹膜内、皮内或皮下途径注射;或经向口腔/消化道、呼吸道、生殖泌尿道的黏膜施用。尽管本发明的疫苗可以作为单一剂量施用,但其组分也可以在同一时间或以不同次数一同共施用(例如,肺炎球菌糖缀合物可以单独、在疫苗的任何细菌蛋白组分施用的同一时间或其后1-2周施用,以协调彼此相关的免疫应答)。除了施用的单一途径之外,可以使用2种不同的施用途径。例如,糖或糖缀合物可以肌内(IM)或皮内(ID)施用,并且细菌蛋白可以鼻内(IN)或皮内(ID)施用。此外,本发明的疫苗可以肌内施用为致敏剂量并且鼻内施用为加强剂量。
疫苗中毒素的含量通常将在1-250μg的范围内,任选5-50μg,最常见在5 - 25μg的范围内。初始接种后,受试者可以接受一次或适当分隔开的几次加强免疫。疫苗制剂通常描述于Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (Powell M. F.和NewmanM.J.编辑)(1995) Plenum Press New York)中。在脂质体内封装由Fullerton, 美国专利4,235,877描述。
在本发明的一个方面,提供疫苗试剂盒,其包括含有本发明的免疫原性组合物的小瓶,任选以冷冻干燥形式,并且还包括含有如本文描述的佐剂的小瓶。预想在本发明的该方面中,将使用佐剂来重构冷冻干燥的免疫原性组合物。
本发明的进一步的方面是预防或治疗艰难梭菌感染的方法,其包括向宿主施用免疫保护性剂量的本发明的免疫原性组合物或疫苗或试剂盒。在一个实施方案中,提供预防或治疗艰难梭菌感染的原发性和/或复发事件的方法,其包括向宿主施用免疫保护性剂量的本发明的免疫原性组合物或疫苗或试剂盒。
在本发明的一个实施方案中,提供用于治疗或预防艰难梭菌(C.difficile)疾病的本发明的免疫原性组合物或疫苗。在本发明的进一步的实施方案中,提供本发明的免疫原性组合物或疫苗,其用于治疗或预防由选自以下的艰难梭菌的菌株引起的疾病:078、019、023、027、033、034、036、045、058、059、063、066、075、078、080、111、112、203、250和571。优选地,菌株是菌株078。
在本发明的进一步的方面中,提供本发明的免疫原性组合物或疫苗在制备用于预防或治疗艰难梭菌疾病的药物中的用途。在进一步的实施方案中,疾病是由选自以下的艰难梭菌的菌株引起的疾病:078、019、023、027、033、034、036、045、058、059、063、066、075、078、080、111、112、203、250和571。优选地,菌株是菌株078。
在本发明的进一步的方面中,提供预防或治疗艰难梭菌疾病的方法,其包括向哺乳动物主体诸如人主体施用本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗。在进一步的实施方案中,疾病是由选自以下的艰难梭菌的菌株引起的疾病:078、019、023、027、033、034、036、045、058、059、063、066、075、078、080、111、112、203、250和571。优选地,菌株是菌株078。
通用
将“左右”或“大约”定义为在用于本发明的目的的给定数值的10%或多或少之内。
在每一种情况下,发明人意在本文的术语“包含(comprising)”、“包含(comprise)”和“包含(comprises)”可以任选地分别由术语“由……组成(consistingof)”、“由……组成(consist of)”和“由……组成(consists of)”所替换。术语“包含(comprises)”表示“包括(includes)”。因此,除非上下文另外需要,将理解词语“包含(comprises)”及变化诸如“包含(comprise)”和“包含(comprising)”意指包括陈述的化合物或组合物(例如核酸、多肽、抗原)或步骤,或化合物或步骤的组,但不排除任何其他的化合物、组合物、步骤、或其的组。缩写“例如(e.g.)”来源于拉丁文例如(exempli gratia),并用于本文以表示非限定性实例。因此,缩写“例如(e.g.)”与术语“例如(for example)”同义。
本文使用的氨基酸编号来源于本文呈现为SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ IDNO: 31和SEQ ID NO: 32(其被认为是这些蛋白的参考序列)的CDTa、CDTb、毒素A和毒素B的序列。
本文中涉及本发明的“疫苗组合物”的实施方案也适用于涉及本发明的“免疫原性组合物”的实施方案,并且反之亦然。
除非另有解释,本文使用的所有技术和科学术语具有如本公开内容所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。分子生物学中普通术语的定义可以见于BenjaminLewin, Genes V, 由Oxford University Press出版, 1994 (ISBN 0-19-854287-9);Kendrew等(编辑), The Encyclopedia of Molecular Biology, 由Blackwell ScienceLtd.出版, 1994 (ISBN 0-632-02182-9); 和Robert A. Meyers (编辑), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, 由VCH Publishers,Inc.出版, 1995 (ISBN 1-56081-569-8)。
除非上下文明确另有说明,单数术语“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指示物。类似地,除非上下文明确另有说明,词语“或”旨在包括“和”。术语“复数”指两个或更多。还应理解对核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小、和所有分子量(molecular weight)或分子量(molecular mass)值均是近似的,并且提供用于说明。此外,关于物质诸如抗原的浓度或水平给出的数值界限可以是近似的。
本专利说明书中引用的所有参考文献或专利申请以其整体通过引用并入本文。
为了本发明可以更好地理解,描述以下实施例。这些实施例仅为说明目的,而不应以任何方式解释为限定本发明的范围。
实施例
所指的AS01B佐剂是具有50 µg呈脂质体形式的QS21、50 µg 3D-MPL、0.25 mg胆固醇和1.0 mg DOPC/0.5 ml剂量的佐剂。适合于免疫小鼠的50 µl剂量包含5 µg QS21、 5 µg3D-MPL、0.025 mg胆固醇和0.1 mg DOPC。
实施例1:二元毒素抗原的设计
二元毒素(其他名称:ADP-核糖基转移酶毒素)由两种组分构成:酶组分即CDTa和转运和结合组分即CDTb。
基于CDTa的文献数据和已知的3D结构(J. Biol.Chem.2009, vol. 284:28713-28719),该蛋白可以分为两个结构域。N末端结构域结合CDTb并且C末端结构域包含酶活性。两个结构域由柔性肽连接。
基于其他细菌二元毒素的其他B组分可获得的文献数据和信息,CDTb可以分为五个结构域。第一个结构域是前域,其由具有糜蛋白酶活性的酶的切割允许成熟蛋白的七聚化(heptamerization)。第二个结构域允许结合CDTa。第三个和第四个结构域参与寡聚化和膜插入。最后,最后一个结构域是宿主细胞受体结合结构域。
实施例1a:设计CDTa抗原
为了允许CDTa和CDTb一同工作,CDTa必须失活。失活的两种可能性进行评价。第一种是设计CDTa突变体,其消除了酶活性,并且第二种是使用单独的CDTa的N末端结构域。该后一结构域允许结合CDTb并不包含参与酶活性的残基。
基于文献信息设计第一组突变体(Infection & Immunity, 2001, vol. 69 :6004-6011)。作者表明CDTa突变体蛋白E428Q、E430Q、S388A和R345K具有显著降低的活性。基于出版物中显示的数据,在四种中优选两种突变:CDTa突变体E428Q和E430Q。在出版物中,这些突变体完全消除了CDTa酶活性。为了将这些突变体排位,对这些残基进行一些结构分析:残基谷氨酸428(E428)和谷氨酸430(E430)的表面可及性、它们的突变对周围的3D结构的影响。基于这些分析,选择CDTa突变体E428Q作为优选突变并且选择CDTa突变体E430Q作为第二选择。还生成了双突变体E428Q、E430Q以确保酶活性被消除。
因为用第一组突变体获得的第一细胞毒性结果不令人信服,所以设计第二组突变体。
在第二组中,设计包含7个突变(包括已描述的两种突变)的CDTa突变体。所有这些突变体均基于文献信息(对CDTa或其产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)同源物Ia可获得的)和3D结构分析。所有突变的残基均位于CDTa的催化部位周围。这些残基已修饰以避免配体或水分子结合。该CDTa“超突变体”包含突变R345A、Q350A、N385A、R402A、S388F、E428Q和E430Q。
基于该“超突变的”CDTa,评价两个其他CDTa突变的变体以消除E428Q和E430Q突变(构建体C108包含E430Q突变而不是突变E428Q,构建体C107不包含两种突变)。
单独的CDTa N末端结构域
在文献(Infection & Immunity, 2001, vol. 69 :6004-6011)中描述了CDTa1-240是仍允许结合Ib(产气荚膜梭菌的二元毒素的B组分)的最小CDTa片段。该片段在实验室中但基于已知3D结构进行测试,表明该结构域可能在CDTa的该结构域的正确折叠中将不是最优的。
基于已知的3D结构(Protein Data Bank 检索号: 2WN4, J. Biol. Chem.,2009, vol. 284 : 28713-28719)进行抗原设计以改善分离的CDTa N末端结构域的表达和折叠。在3D结构上,八个氨基酸的接头肽允许CDTa的N末端和C末端结构域之间分开。设计两个分离的CDTa N末端结构域,第一个包含该柔性肽,且第二个不包含该柔性肽。
CDTa:序列概述
所有CDTa序列的概述呈现在表1中。
表1
名称 | 长度(aa)* | 位置 | 注释 |
CDTa | 463 | 1-463 | 来自菌株R20291的全长CDTa |
CDTa’ | 421 | 44-463 | 无信号肽的CDTa (C34) |
CDTa_E428Q | 421 | 44-463 | 具有Glu<sup>428</sup>至Gln的突变的CDTa’ (C44) |
CDTa_E430Q | 421 | 44-463 | 具有Glu<sup>430</sup>至Gln的突变的CDTa’ (C54) |
CDTa_E428 430Q | 421 | 44-463 | 具有Glu<sup>428</sup>至Gln和Glu<sup>430</sup>至Gln两个突变的CDTa’ (C67) |
CDTa_7突变 | 421 | 44-463 | 包含7个突变的氨基酸的CDTa’ (C69) |
CDTa_N_litt | 198 | 44-240 | 仍允许结合Ib的最小CDTa N末端结构域 (C51) |
CDTa_NAD连接 | 226 | 44-268 | 基于抗原设计工作的CDTa N末端结构域 (C49) |
CDTa_NAD | 218 | 44-260 | 基于抗原设计工作的CDTa N末端结构域 (C50) |
*长度包含额外的N末端甲硫氨酸但不包含His标签。
实施例1b:设计CDTb抗原
CDTb成熟
为了避免在CDTb加工中的糜蛋白酶活化步骤,尝试仅表达成熟CDTb蛋白(无其信号肽和前域)。
在文献(Protein Expression and Purification, 2010, vol. 74 :42-48)中,成熟CDTb描述为在亮氨酸210处开始。该成熟的CDTb命名为CDTb"。
内部(in house)实验数据后,似乎活化的CDTb在丝氨酸212处开始。该结果被CDTb的3D模型结构的分析支持。该模型使用SwissModel建立(Bioinformatics,2006, vol.22:195-201)。用于同源建模的模板是炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)的B组分,即保护性抗原或PA (Protein Data Bank检索号:3TEW)。
单独的CDTb受体结合结构域
由于仅含有毒素A和B的受体结合结构域的融合体足以诱导中和抗体这一事实,因此决定产生并评价单独的CDTb受体结合结构域。
对CDTb获得的3D结构模型对于CDTb的四个第一结构域而非受体结合结构域(CDTb和PA的这些结构域非常不同)是准确的。为了设计表达单独的该结构域的构建体,第四个结构域的C末端部分在3D结构模型上分析以决定最后一个结构域将在哪里开始。
设计了两个版本的CDTb受体结合结构域。在第一个版本中,该结构域刚好在第四个结构域的模型化的3D结构之后开始。在该版本中,CDTb受体结合结构域将可能在其N末端部分具有长的柔性肽。第二个版本开始于在CDTb的C末端部分上进行的2D预测结构(使用Psipred程序完成预测,Bioinformatics, 2000, vol. 16 : 404-405)在缺少预测的二级结构后变得更紧密处。这能够说明新的结构域的开始。在该第二个版本中,在分离的CDTb受体结合结构域的N末端部分处不存在柔性肽。
CDTb Ca2+ 结合基序突变
按照文献信息,在产气荚膜梭菌的ι毒素的B组分(Ib)的Ca2+结合结构域中的突变消除与该二元毒素的A组分(Ia)的结合。这些突变在疫苗组合物包含成熟CDTb蛋白和野生型CDTa蛋白的混合物的情况下可以是非常有趣的。
使用多蛋白序列比对,这些突变位于CDTb序列上并被突变。它涉及残基Asp220、Asp222 和Asp224。它们被突变为Ala残基。
CDTb前域
为了尝试降低在凝胶中用C55观察到的降解问题,评价了一些共表达测试。进行此事的工作假设将改进成熟CDTb的折叠。
提出了前域的两个边界。第一个开始于CDTb(在信号肽切割后)的残基43处,且终止于残基Met211(给定成熟CDTb的实验确定的第一个残基是Ser212)。第二个前域基于CDTb的预测的3D结构进行设计。成熟CDTb蛋白的前域和第一结构域之间存在的接头在该构建体中去除。
CDTb:序列概述
所有CDTb序列的概述呈现在表2中。
表2
名称 | 长度(aa)* | 位置 | 注释 |
CDTb | 876 | 1-876 | 来自菌株R20291的全长CDTb |
CDTb’ | 835 | 43-876 | 无信号肽的CDTb (C38) |
CDTb” | 668 | 210-876 | 无如文献中定义的信号肽和前域的CDTb |
CDTb”_xp 数据 | 666 | 212-876 | 无信号肽和前域的CDTb,如由内部实验结果所证明的 (C55) |
CDTbClg | 258 | 620-876 | 基于抗原设计工作,在其N末端部分包含天然柔性肽的CDTb受体结合结构域(C52) |
CDTbCsh | 242 | 636-876 | 基于抗原设计工作的CDTb受体结合结构域 (C53) |
CDTb Ca2+ 突变的 | 666 | 212-876 | 包含3个突变D220A、D222A和D224A的成熟CDTb(无信号肽且无前域)(C97) |
CDTb前域Lg | 170 | 43-211 | CDTb 前域(C58) |
CDTb前域Sh | 145 | 43-186 | 不具有在成熟的CDTb的前域和第一结构域之间存在的接头的CDTb前域(C59) |
*长度包含额外的N末端甲硫氨酸但不包含His标签。
实施例1c:设计CDTa – CDTb融合体
背景信息
这些构建体的目标是获得二元毒素的两个组分至一个过程中。
许多不同种类的融合体可以设计,但作为概念验证,评价的第一个融合体是CDTaN末端结构域(即CDTaNAD连接和CDTaNAD)和CDTb受体结合结构域(即CDTbCsh和CDTbClg)的组合。
融合体CDTaNterm - CDTb单独的受体结合结构域
在没有融合体的每一配偶体的额外实验数据的情况下,开始所有可能的组合,但始终将CDTa结构域作为融合体的第一个配偶体。
在这些融合体中,CDTaNAD连接和CDTaNAD结构域具有分别少于设计的分离的结构域的两个和一个残基。这些CDTa额外氨基酸保持分开设计,以避免在表达过程中潜在的问题。
所有CDTa-CDTb融合体序列的概述呈现在表3中。
表3
*长度包含额外的N末端甲硫氨酸但不包含His标签。
实施例1d:设计ToxA-ToxB- CDTb受体结合结构域融合体
该融合体的目标是组合艰难梭菌的三个主要毒素的受体结合结构域至一个构建体中。
由于F2和CDTb受体结合结构域不支持采用相同折叠这一事实,接头/间隔基必须在融合体的两个配偶体之间使用以允许它们的正确独立折叠。设计两个融合体。
在第一个融合体(即F2_CDTbClg)中,受体结合结构域的长的设计版本在F2的C末端部分融合。在该版本中,CDTb受体结合结构域的长的柔性N末端肽将作为间隔基行使功能。
在第二个融合体(即F2_GG_NVCDTbCsh)中,受体结合结构域的短的设计版本在F2的C末端部分融合。为了允许两个配偶体的正确折叠,在该融合体中产生的接头的长度必须增加。为了这么做,将CDTb受体结合结构域延伸两个天然残基,此外在CDTbCsh的F2和更长版本中添加两个外源甘氨酸。
所有F2-CDTb融合体序列的概述呈现在表4中。
表4
*长度包含额外的N末端甲硫氨酸但不包含His标签。
实施例2:CdtA蛋白的克隆、表达和纯化
表达质粒和重组菌株:CdtA全长
使用NdeI/XhoI限制位点用标准方法将编码不具有CdtA的信号肽具有和不具有突变(参见下表)和C末端的His标签的全长蛋白的基因克隆入pET24b(+)表达载体(Novagen)中。按照标准方法用CaCl2处理的细胞分别用每一重组表达载体通过转化大肠杆菌菌株HMS174 (DE3)或BLR (DE3) pLysS (C34)来生成最终的构建体(Hanahan D. « Plasmidtransformation by Simanis. » In Glover, D. M. (Ed), DNA cloning. IRL PressLondon. (1985): p. 109-135.)。
宿主菌株:
HMS 174 (DE3).HMS174菌株提供在K-12背景中的recA突变。具有命名(DE3)的菌株对于包含IPTG诱导型T7 RNA聚合酶的λ原噬菌体是溶原的。λ DE3溶原体设计用于从pET载体的蛋白表达
基因型:F- recA1 hsdR(rK12 - mK12 +) (Rif R)。
BLR(DE3) pLysS。BLR是BL21的recA衍生物。具有命名(DE3)的菌株对于包含IPTG诱导型T7 RNA聚合酶的λ原噬菌体是溶原的。λ DE3溶原体设计用于从pET载体的蛋白表达。该菌株也缺乏lon和ompT 蛋白酶,pLysS菌株表达T7溶菌酶,其进一步抑制诱导前T7 RNA聚合酶的本底表达。
基因型:大肠杆菌BLR::DE3菌株, F- ompT hsdS B(rB - mB -) gal dcm (DE3) Δ(srl-recA)306::Tn10 pLysS (CamR, TetR)。
重组蛋白的表达:
从琼脂板上刮下大肠杆菌转化子并用于接种200 ml的LBT培养基± 1% (w/v)葡萄糖+卡那霉素(50 µg/ml),以获得0.1 -0.2之间的O.D.600nm。在37℃, 250 RPM下过夜孵育培养物。
在500 ml的含有卡那霉素(50 µg/ml)的LBT培养基中将每一过夜培养物稀释至1:20,并且在37℃下以250 rpm的转速生长直到O.D.620达到0.5/0.6。
在O.D.600nm为0.6左右时,在加入1 mM异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG; EMDChemicals Inc., 目录号: 5815)诱导重组蛋白的表达之前将培养物冷却下来,并且随后在23℃, 250 RPM下过夜孵育。
过夜诱导后(16个小时左右),评估诱导后的O.D.600nm,并且以14 000 RPM将培养物离心15分钟,并将沉淀分别冷冻于-20℃。
表达质粒和重组菌株:CdtA- N-term
使用NdeI/XhoI限制位点用标准方法将编码不具有CdtA的信号肽(参见下表)和C末端的His标签的N末端蛋白的基因克隆入pET24b(+)表达载体(Novagen)中。按照标准方法用CaCl2处理的细胞分别用每一重组表达载体通过转化大肠杆菌菌株HMS174 (DE3)来生成最终的构建体(Hanahan D. « Plasmid transformation by Simanis. » In Glover, D.M. (Ed), DNA cloning. IRL Press London. (1985): p. 109-135.)。
宿主菌株:
HMS 174 (DE3)。HMS174菌株提供在K-12背景中的recA突变。具有命名(DE3)的菌株对于包含IPTG诱导型T7 RNA聚合酶的λ原噬菌体是溶原的。λ DE3溶原体设计用于从pET载体的蛋白表达
基因型:F- recA1 hsdR(rK12 - mK12 +) (Rif R)。
重组蛋白的表达:
从琼脂板上刮下大肠杆菌转化子并用于接种200 ml的LBT培养基± 1% (w/v)葡萄糖+卡那霉素(50 µg/ml),以获得0.1 -0.2之间的O.D.600nm。在37℃, 250 RPM下过夜孵育培养物。
在500 ml的含有卡那霉素(50 µg/ml)的LBT培养基中将该过夜培养物稀释至1:20,并且在37℃下以250 rpm的转速生长直到O.D.620达到0.5/0.6。
在O.D.600nm为0.6左右时,在加入1 mM异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG; EMDChemicals Inc., 目录号: 5815)诱导重组蛋白的表达之前将培养物冷却下来,并且随后在23℃, 250 RPM下过夜孵育。
过夜诱导后(16个小时左右),评估诱导后的O.D.600nm,并且以14 000 RPM将培养物离心15分钟,并将沉淀分别冷冻于-20℃。
纯化
以下程序用于纯化构建体C34、C44、C49、C50、C54、C67、C69、C107和C110。
将细菌沉淀重悬于20mM或50mM N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液(pH 7.5或pH 8.0),所述缓冲液含有500mM NaCl、0mM或5mM TCEP (Thermo Scientific Pierce, (2-羧乙基)盐酸膦(phosphine hydrochloride)) 和蛋白酶抑制剂的混合物 (Complete, Roche, 无EDTA)。使用French Press系统3 X 20 000 PSI裂解细菌。通过离心例如在4℃下以20 000g持续30分钟分离可溶(上清液)和不可溶(沉淀)组分。
在IMAC上在非变性条件下纯化6-His标签化的蛋白。将可溶组分装载到用用于细菌重悬的相同缓冲液预平衡的5ml GE Histrap柱(GE)上。在柱上装载后,将柱用20mM或50mM N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液(pH7.5或pH8.0)洗涤, 所述缓冲液含有500mM NaCl、10mM咪唑、5mM TCEP。洗脱使用50mM N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液pH7.6、500mM NaCl、1mMTCEP和咪唑(250mM或500mM)进行。
脱盐( BIORAD Bio-Gel P6 Desalting)和浓缩(Amicon Ultra 10kDa)步骤后,将产物装载在SEC层析 (SUPERDEX TM 75或200)上,于20mM或50mM N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液( pH7.5或pH8.0)、150mM NaCl、1mM TCEP中,用于进一步的纯化步骤。
包含Cdta抗原的级分通过SDS-PAGE基于纯度进行选择。使用BioRad的Lowry RC/DC蛋白测定来测定蛋白浓度。纯化的批次(bulk)在0.22 µm上无菌过滤并存储在-80℃。
实施例4-艰难梭菌CdtB蛋白的克隆、表达和纯化
表达质粒和重组菌株:CdtB全长。
使用BamHI/XhoI限制位点用标准方法将编码不具有信号肽(Pro-CdtB`)和C末端的His标签的CdtB截短蛋白的基因克隆入pGEX-6p1表达载体(GE Healthcare)中。该载体包括在任一 CdtB`( GST-Pro-Cdtb’)的N末端中的GST(谷胱甘肽-S-转移酶)作为融合配偶体。按照标准方法用CaCl2处理的细胞用重组表达载体通过转化大肠杆菌菌株BL21 (DE3)来生成最终的构建体(Hanahan D. « Plasmid transformation by Simanis. » InGlover, D. M. (Ed), DNA cloning. IRL Press London. (1985): p. 109-135.)。
使用NdeI/XhoI限制位点用标准方法将编码不具有信号肽(Pro-CdtB`: C38)和不具有信号肽和前域(CdtB``: C40或C55)和C末端的His标签的CdtB截短蛋白的基因克隆入pET24b(+)表达载体(Novagen)中。按照标准方法用CaCl2处理的细胞用合适的重组表达载体通过转化大肠杆菌B834 (DE3)修饰的菌株(对于C55)和BL21(DE3)(对于C38和C40)来生成最终的构建体(Hanahan D. « Plasmid transformation by Simanis. » In Glover,D. M. (Ed), DNA cloning. IRL Press London. (1985): p. 109-135.)。
宿主菌株
BL21(DE3)。BL21(DE3)是B834的无甲硫氨酸营养缺陷型衍生物。具有命名(DE3)的菌株对于包含IPTG诱导型T7 RNA聚合酶的λ原噬菌体是溶原的。设计λ DE3溶原体用于来自pET载体的蛋白表达。该菌株也缺乏lon和ompT蛋白酶。
基因型:大肠杆菌BL21::DE3菌株, F- ompT hsdS B(rB - mB -) gal dcm (DE3)。
B834是BL21的亲本菌株。这些蛋白酶缺乏宿主是甲硫氨酸营养缺陷型。设计λ DE3溶原体用于来自pET载体的蛋白表达。该菌株也缺乏lon和ompT蛋白酶。
修饰:包括PGL基因以避免生物素基因座中的磷酸葡糖酰化(phosphogluconoylation)(菌株是生物素营养缺陷型)。
基因型:B834 ::DE3菌株, F– ompT hsdSB(rB – mB–) gal dcm met (DE3)
修饰:Δ(bioA-bioD)::PGL
重组蛋白的表达:
从琼脂板上刮下大肠杆菌转化子并用于接种200 ml的LBT培养基± 1% (w/v)葡萄糖+/-卡那霉素(50 µg/ml)或氨苄青霉素(100 µg/ml),以获得0.1 -0.2之间的O.D.600nm。在37℃, 250 RPM下过夜孵育培养物。
在500 ml的含有+/-卡那霉素(50 µg/ml)或氨苄青霉素(100 µg/ml)的LBT培养基中将过夜培养物稀释至1:20,并且在37℃下以250 rpm的转速生长直到O.D.620达到0.5/0.6。
在600nm处的O.D.为0.6左右时,在加入1 mM异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG;EMD Chemicals Inc., 目录号: 5815)诱导重组蛋白的表达之前将培养物冷却下来,并且在23℃, 250 RPM下过夜孵育。
过夜诱导(16个小时左右)后,评估诱导后的600nm处的O.D.,并且以14 000 RPM将培养物离心15分钟,并将沉淀分别冷冻于-20℃。
表达质粒和重组菌株。
使用NdeI/XhoI限制位点用标准方法将编码不具有前域CdtB成熟的、敲除的Ca++结合位点(抑制CdtA与CdtB的结合)和C末端的His标签的CdtB截短蛋白的基因克隆入pET24b(+)表达载体(Novagen)中。按照标准方法用CaCl2处理的细胞用重组表达载体通过转化大肠杆菌B834 (DE3)修饰的菌株来生成最终的构建体(Hanahan D. « Plasmidtransformation by Simanis. » In Glover, D. M. (Ed), DNA cloning. IRL PressLondon. (1985): p. 109-135.)。
宿主菌株
B834是BL21的亲本菌株。这些蛋白酶缺乏宿主是甲硫氨酸营养缺陷型。设计λ DE3溶原体用于来自pET载体的蛋白表达。该菌株也缺乏lon和ompT蛋白酶。
修饰:包括PGL基因以避免生物素基因座中的磷酸葡糖酰化(phosphogluconoylation)(菌株是生物素营养缺陷型)。
基因型:B834 ::DE3菌株, F– ompT hsdSB(rB – mB–) gal dcm met (DE3)
修饰:Δ(bioA-bioD)::PGL
重组蛋白的表达:
从琼脂板上刮下大肠杆菌转化子并用于接种200 ml的LBT培养基± 1% (w/v)葡萄糖+卡那霉素(50 µg/ml),以获得0.1 -0.2之间的O.D.600nm。在37℃, 250 RPM下过夜孵育培养物。
在500 ml的含有卡那霉素(50 µg/ml)的LBT培养基中将该过夜培养物稀释至1:20,并且在37℃下以250 rpm的转速生长直到O.D.620达到0.5/0.6。
在600nm处的O.D.为0.6左右时,在加入1 mM异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG;EMD Chemicals Inc., 目录号: 5815)诱导重组蛋白的表达之前将培养物冷却下来,并且随后在23℃, 250 RPM下过夜孵育。
过夜诱导后(16个小时左右),评估诱导后的600nm处的O.D.,并且以14 000 RPM将培养物离心15分钟,并将沉淀分别冷冻于-20℃。
纯化
C37
将细菌沉淀重悬于50mM N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液(pH 8.0),所述缓冲液含有500mM NaCl、5mM TCEP (Thermo Scientific Pierce, (2-羧乙基)盐酸膦(phosphinehydrochloride)) 和蛋白酶抑制剂的混合物 (Complete, Roche)。使用French Press系统3 X 20 000 PSI裂解细菌。通过离心在4℃下以20 000g持续30分钟分离可溶(上清液)和不可溶(沉淀)组分。
在IMAC上在非变性条件下纯化6-His标签化的蛋白。将可溶组分装载到用用于细菌重悬的相同缓冲液预平衡的5ml GE Histrap柱(GE)上。在柱上装载后,将柱用50mM N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液pH8.0洗涤, 所述缓冲液含有150mM NaCl、25mM咪唑、1mM TCEP。使用含有150mM NaCl、250mM咪唑、1mM TCEP的50mMN-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液pH8.0进行洗脱。
在含有150mM NaCl和1mM TCEP的50mM N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液pH8.0中脱盐步骤(BIORAD Bio-Gel P6 Desalting)后,将产物用PreScission蛋白酶(GE-Healthcare)处理(在4℃下过夜)以切割GST标签。过夜处理后,将0.2% Tween 20加入到消化混合物中。
随后将蛋白经过用包含150mM NaCl、1mM TCEP、0.2% tween20和20mM还原的谷胱甘肽(glutation)的50mM N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液pH8.0预平衡的GST亲和柱( GEGSTrap FF),以去除切割的标签、未切割的融合蛋白和PreScission蛋白酶。
在流通物(flow through)中收集无GST的蛋白,并再次装载至用包含150mM NaCl、1mM TCEP、0.2% tween20的50mM N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液pH8.0预平衡的5ml GEHistrap柱(GE)上。在柱上装载后,将柱用50mM N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液pH8.0洗涤, 所述缓冲液含有150mM NaCl、0.2% tween20、1mM TCEP和10mM咪唑。使用含有150mM NaCl、0.2% tween20、1mM TCEP和500mM咪唑的50mM N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液pH8.0进行洗脱。
在包含150 mM NaCl、1mM TCEP和0.2% tween 20的50mM N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液pH8.0中的脱盐步骤(BIORAD Bio-Gel P6 Desalting)后,将产物用α-糜蛋白酶 (来自牛胰- Sigma)处理,随后用胰蛋白酶抑制剂处理(来自蛋白- Sigma)。Cdtb由糜蛋白酶的完全活化通过SDS-PAGE监测。
将完全活化的产物装载至SEC层析(SUPERDEX TM 75)上,于含有300mM NaCl、1mMTCEP的50mM N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液pH8.0中。包含CdtB抗原的级分通过SDS-PAGE基于纯度进行选择。使用BioRad的Lowry RC/DC蛋白测定来测定蛋白浓度。纯化的批次(bulk)在0.22 µm上无菌过滤并存储在-80℃。
C38
将细菌沉淀重悬于50mM N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液(pH 8.0),所述缓冲液含有150mM NaCl、5mM TCEP (Thermo Scientific Pierce, (2-羧乙基)盐酸膦(phosphinehydrochloride))、0.4% empigen和蛋白酶抑制剂的混合物 (Complete, Roche)。使用French Press系统3 X 20 000 PSI裂解细菌。通过离心在4℃下以20 000g持续30分钟分离可溶(上清液)和不可溶(沉淀)组分。
在IMAC上在非变性条件下纯化6-His标签化的蛋白。将可溶性组分装载至用含有150mM NaCl、1mM TCEP (Thermo Scientific Pierce, (2-羧乙基)盐酸膦(phosphinehydrochloride))和0.15% empigen的50mM N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液(pH 8.0)预平衡的5ml GE Histrap柱(GE)上。在柱上装载后,将柱用50mM N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液pH8.0洗涤, 所述缓冲液含有150mM NaCl、20mM咪唑、1mM TCEP和0.2% tween20。使用含有150mMNaCl、500mM咪唑、1mM TCEP和0.2% tween20的50mM N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液pH8.0进行洗脱。
在包含150 mM NaCl、1mM TCEP和0.2% tween 20的50mM N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液pH8.0中的脱盐步骤(BIORAD Bio-Gel P6 Desalting)后,将产物用α-糜蛋白酶 (来自牛胰- Sigma)处理,随后用胰蛋白酶抑制剂处理(来自蛋白- Sigma)。Cdb由糜蛋白酶的完全活化通过SDS-PAGE监测。
将完全活化的产物装载至SEC层析(SUPERDEX TM 75)上,于50mM N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液pH8.0、300mM NaCl、1mM TCEP中。通过SDS-PAGE基于纯度选择包含Cdtb蛋白的级分,并装载至用含有300mM NaCl、1mM TCEP的 50mM N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液(pH8.0)预平衡的5ml GE Histrap 柱 (GE)上。在柱上装载后,将柱用50mM N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液pH8.0洗涤, 所述缓冲液含有300mM NaCl、10mM咪唑、1mM TCEP。使用含有300mMNaCl、500mM咪唑、1mM TCEP的50mM N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液pH8.0进行洗脱。
在含有300mM NaCl、1mM TCEP的50 mM N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液pH8.0的中的脱盐步骤(BIORAD Bio-Gel P6 Desalting)后,使用BioRad的Lowry RC/DC蛋白测定来测定蛋白浓度。纯化的批次(bulk)在0.22 µm上无菌过滤并存储在-80℃。
C40
在包含500 mM NaCl、5mMCaCl2和蛋白酶抑制剂的混合物(Complete, Roche)的20mM N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液(pH 8.0)中重悬细菌沉淀。使用French Press系统3 X 20000 PSI裂解细菌。通过离心在4℃下以20 000g持续30分钟分离可溶(上清液)和不可溶(沉淀)组分。
在IMAC上在非变性条件下纯化6-His标签化的蛋白。将可溶性组分装载至用含有500mM NaCl、5mMCaCl2 的 20mM N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液(pH 8.0)预平衡的1ml GEHistrap柱(GE)上。在柱上装载后,将柱用20mM N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液pH8.0洗涤, 所述缓冲液含有500mM NaCl、5mM CaCl2和5mM咪唑。使用含有150mM NaCl、5mM CaCl2和250mM咪唑的20mM N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液pH8.0进行洗脱。
在含有150mM NaCl、1mM TCEP的20mM N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液pH8.0中脱盐步骤(BIORAD Bio-Gel P6 Desalting)后,将产物装载至相同缓冲液中的SEC层析(SUPERDEXTM 75)上。包含Cdtb抗原的级分通过SDS-PAGE基于纯度进行选择。使用BioRad的Lowry RC/DC蛋白测定来测定蛋白浓度。纯化的批次(bulk)在0.22 µm上无菌过滤并存储在-80℃。
C55
将细菌沉淀重悬于包含150 mM NaCl、5mM TCEP (Thermo Scientific Pierce,(2-羧乙基)盐酸膦(phosphine hydrochloride))、0.4% empigen和蛋白酶抑制剂的混合物(Complete, Roche)的50mM N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液(pH8.0)中。使用French Press系统3 X 20 000 PSI裂解细菌。通过离心在4℃下以20 000g持续30分钟分离可溶(上清液)和不可溶(沉淀)组分。
在IMAC上在非变性条件下纯化6-His标签化的蛋白。将可溶性组分装载至用含有150mM NaCl、0.15% empigen、1mM TCEP的 50mM N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液(pH 8.0)预平衡的5ml GE Histrap柱(GE)上。在柱上装载后,将柱用50mM N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液pH8.0洗涤, 所述缓冲液含有150mM NaCl、0.2% tween20、20mM咪唑和1mM TCEP。使用含有150mM NaCl、0.2% tween20、500mM咪唑和1mM TCEP的50mM N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液pH8.0进行洗脱。
在含有300mM NaCl、1mM TCEP的50mM N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液pH8.0中脱盐步骤(BIORAD Bio-Gel P6 Desalting)后,将产物装载至相同缓冲液中的SEC层析(SUPERDEXTM 75)上。包含Cdtb抗原的级分通过SDS-PAGE基于纯度进行选择。使用BioRad的Lowry RC/DC蛋白测定来测定蛋白浓度。纯化的批次(bulk)在0.22 µm上无菌过滤并存储在-80℃。
重组蛋白的表达:CdtB受体结合结构域:
表达质粒和重组菌株。
使用NdeI/XhoI限制位点用标准方法将编码仅受体结合结构域(C52-C53)和C末端的His标签的CdtB截短蛋白的基因克隆入 pET24b(+)表达载体(Novagen)中。按照标准方法用CaCl2处理的细胞用重组表达载体通过转化大肠杆菌B834 (DE3)修饰的菌株来生成最终的构建体(Hanahan D. « Plasmid transformation by Simanis. » In Glover, D. M.(Ed), DNA cloning. IRL Press London. (1985): p. 109-135.)。
宿主菌株
B834是BL21的亲本菌株。这些蛋白酶缺乏宿主是甲硫氨酸营养缺陷型。设计λ DE3溶原体用于来自pET载体的蛋白表达。该菌株也缺乏lon和ompT蛋白酶。
修饰:包括PGL基因以避免生物素基因座中的磷酸葡糖酰化(phosphogluconoylation)(菌株是生物素营养缺陷型)。
基因型:B834 ::DE3菌株, F– ompT hsdSB(rB – mB–) gal dcm met (DE3)
修饰:Δ(bioA-bioD)::PGL
重组蛋白的表达:
从琼脂板上刮下大肠杆菌转化子并用于接种200 ml的LBT培养基± 1% (w/v)葡萄糖+卡那霉素(50 µg/ml),以获得0.1 -0.2之间的O.D.600nm。在37℃, 250 RPM下过夜孵育培养物。
在500 ml的含有卡那霉素(50 µg/ml)的LBT培养基中将这些过夜培养物稀释至1:20,并且在37℃下以250 rpm的转速生长直到O.D.620达到0.5/0.6。
在600nm处的O.D.为0.6左右时,在加入1 mM异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG;EMD Chemicals Inc., 目录号: 5815)诱导重组蛋白的表达之前将培养物冷却下来,并且随后在23℃, 250 RPM下过夜孵育。
过夜诱导(16个小时左右)后,评估诱导后的600nm处的O.D.,并且以14 000 RPM将培养物离心15分钟,并将沉淀分别冷冻于-20℃。
纯化
C52和C53
在包含500 mM NaCl和蛋白酶抑制剂的混合物(Complete, Roche,无EDTA)的50mM N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液pH 8.0中重悬细菌沉淀。使用French Press系统3 X 20000 PSI裂解细菌。通过离心例如在4℃下以20 000g持续30分钟分离可溶(上清液)和不可溶(沉淀)组分。
在IMAC上在非变性条件下纯化6-His标签化的蛋白。将可溶组分装载到用用于细菌重悬的相同缓冲液预平衡的5ml GE Histrap柱(GE)上。在柱上装载后,将柱用含有500mMNaCl、25mM咪唑的20mM N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液pH 7.5洗涤。使用50mM N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液pH 7.5、500mM NaCl和250mM咪唑进行洗脱。
脱盐( BIORAD Bio-Gel P6 Desalting)和浓缩(Amicon Ultra 10kDa)步骤后,将产物装载至SEC层析(SUPERDEX TM 75 )上,于20mM缓冲液pH7.5、150mM NaCl中。
包含Cdtb抗原的级分通过SDS-PAGE基于纯度进行选择。使用BioRad的Lowry RC/DC蛋白测定来测定蛋白浓度。纯化的批次(bulk)在0.22 µm上无菌过滤并存储在-80℃。
实施例6-艰难梭菌CdtA N末端和CdtB受体结合结构域融合蛋白的克隆、表达和纯化
表达质粒和重组菌株。
使用NdeI/XhoI限制位点用标准方法将编码具有CdtB受体结合结构域蛋白长或短版本(C61或C62)和C末端的His标签的CdtA N末端(C49或C50)融合蛋白的基因克隆入pET24b(+)表达载体(Novagen)中。按照标准方法用CaCl2处理的细胞用合适的重组表达载体通过转化大肠杆菌B834 (DE3)修饰的菌株来生成最终的构建体(Hanahan D. « Plasmidtransformation by Simanis. » In Glover, D. M. (Ed), DNA cloning. IRL PressLondon. (1985): p. 109-135.)。
宿主菌株
基因型:大肠杆菌BL21::DE3菌株, F- ompT hsdS B(rB - mB -) gal dcm (DE3)。
B834是BL21的亲本菌株。这些蛋白酶缺乏宿主是甲硫氨酸营养缺陷型。设计λ DE3溶原体用于来自pET载体的蛋白表达。该菌株也缺乏lon和ompT蛋白酶。
修饰:包括PGL基因以避免生物素基因座中的磷酸葡糖酰化(phosphogluconoylation)(菌株是生物素营养缺陷型)。
[016] 基因型:B834 ::DE3菌株, F– ompT hsdSB(rB – mB–) gal dcm met (DE3)
修饰:Δ(bioA-bioD)::PGL
重组蛋白的表达:
从琼脂板上刮下大肠杆菌转化子并用于接种200 ml的LBT培养基± 1% (w/v)葡萄糖+卡那霉素(50 µg/ml),以获得0.1 -0.2之间的O.D.600nm。在37℃, 250 RPM下过夜孵育培养物。
在500 ml的含有卡那霉素(50 µg/ml)的LBT培养基中将这些过夜培养物稀释至1:20,并且在37℃下以250 rpm的转速生长直到O.D.620达到0.5/0.6。
在600nm处的O.D.为0.6左右时,在加入1 mM异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG;EMD Chemicals Inc., 目录号: 5815)诱导重组蛋白的表达之前将培养物冷却下来,并且在23℃, 250 RPM下过夜孵育。
过夜诱导后(16个小时左右),评估诱导后的600nm处的O.D.,并且以14 000 RPM将培养物离心15分钟,并将沉淀分别冷冻于-20℃。
纯化
C61
将细菌沉淀重悬于50mM N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液(pH 8.0),所述缓冲液含有300mM NaCl、5mM TCEP (Thermo Scientific Pierce, (2-羧乙基)盐酸膦(phosphinehydrochloride))、0.4% empigen和蛋白酶抑制剂的混合物 (Complete, Roche)。使用French Press系统3 X 20 000 PSI裂解细菌。通过离心在4℃下以20 000g持续30分钟分离可溶(上清液)和不可溶(沉淀)组分。
在IMAC上在非变性条件下纯化6-His标签化的蛋白。将可溶性组分装载至用含有300mM NaCl、0.15% empigen、1mM TCEP的 50mM N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液(pH 8.0)预平衡的5ml GE Histrap柱(GE)上。在柱上装载后,将柱用50mM N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液pH8.0洗涤, 所述缓冲液含有300mM NaCl、0.2% tween20、25mM咪唑和1mM TCEP。使用含有150mM NaCl、0.2% tween20、500mM咪唑和1mM TCEP的50mM N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液pH8.0进行洗脱。
在含有300mM NaCl、1mM TCEP的50mM N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液pH8.0中脱盐步骤(BIORAD Bio-Gel P6 Desalting)后,将产物装载至相同缓冲液中的SEC层析(SUPERDEXTM 200)上。包含重组抗原的级分通过SDS-PAGE基于纯度进行选择。使用BioRad的Lowry RC/DC蛋白测定来测定蛋白浓度。纯化的批次(bulk)在0.22 µm上无菌过滤并存储在-80℃。
实施例7-具有CdtB前域 C58的艰难梭菌CdtB成熟共表达的(C55)的克隆和表达
表达质粒和重组菌株。
使用NdeI/XhoI限制性位点使用标准方法将编码蛋白CdtB的前域而无His标签的基因克隆入pET21b(+)表达载体(Novagen)中。按照标准方法用CaCl2处理的细胞用前域CdtB和CdtB成熟蛋白C55(关于C55的克隆信息参见实施例3)的重组表达载体通过转化大肠杆菌B834 (DE3)修饰的菌株来生成最终的构建体(Hanahan D. « Plasmidtransformation by Simanis. » In Glover, D. M. (Ed), DNA cloning. IRL PressLondon. (1985): p. 109-135.)。
宿主菌株
B834是BL21的亲本菌株。这些蛋白酶缺乏宿主是甲硫氨酸营养缺陷型。设计λ DE3溶原体用于来自pET载体的蛋白表达。该菌株也缺乏lon和ompT蛋白酶。
修饰:包括PGL基因以避免生物素基因座中的磷酸葡糖酰化(phosphogluconoylation)(菌株是生物素营养缺陷型)。
[016] 基因型:B834 ::DE3菌株, F– ompT hsdSB(rB – mB–) gal dcm met (DE3)
修饰:Δ(bioA-bioD)::PGL
重组蛋白的表达:
从琼脂板上刮下大肠杆菌转化子并用于接种200 ml的LBT培养基± 1% (w/v)葡萄糖+卡那霉素(50 µg/ml)和氨苄青霉素(100µg/ ml),以获得0.1 -0.2之间的O.D.600nm。在37℃, 250 RPM下过夜孵育培养物。
在500 ml的含有卡那霉素(50 µg/ml)和氨苄青霉素(100µg/ ml)的LBT培养基中将该过夜培养物稀释至1:20,并且在37℃下以250 rpm的转速生长直到O.D.620达到0.5/0.6。
在600nm处的O.D.为0.6左右时,在加入1 mM异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG;EMD Chemicals Inc., 目录号: 5815)诱导重组蛋白的表达之前将培养物冷却下来,并且在23℃, 250 RPM下过夜孵育。
过夜诱导后(16个小时左右),评估诱导后的600nm处的O.D.,并且以14 000 RPM将培养物离心15分钟,并将沉淀分别冷冻于-20℃。
纯化
与单独产生的C55相同
实施例8:CdtA、CdtB和CdtA-CdtB融合构建体的分子量评价
使用分析超速离心,通过测定分子响应离心力而移动的速率来确定蛋白样品中不同种类在溶液中的同质性和大小分布。这基于通过沉降速度实验获得的不同种类的沉降系数的计算结果,其依赖于它们的分子形状和质量。
1. AN-60Ti转子已经被平衡至15℃后,将蛋白样品在Beckman-CoulterProteomeLab XL-1分析超速离心机中以8000RPM、25000RPM或42000RPM(取决于目标蛋白大小)离心。
2. 对于数据采集,在280nm处每5分钟记录扫描。
3. 使用程序SEDFIT进行数据分析来测定C(S)分布。用SEDNTERP软件从它们的氨基酸序列进行蛋白的微分比容的测定。Sednterp也用于测定缓冲液的粘度和密度。
4. 考虑到原始数据比C(M)分布(浓度相比于分子量)是表征混合物的大小分布的更好代表,所以从C(S)分布曲线(浓度相比于沉降系数)中已测定不同种类的分子量的测定。
图1a-1h描述不同CdtA的大小分布。CdtB和CdtA-CdtB融合构建体如通过沉降速度分析超速离心测定。
C67和C69突变的全长CdtA蛋白的主要种类的计算分子量可以与单体符合,而C50截短的CdtA N末端构建体在溶液中作为单体和二聚体的混合物存在(图1a、1b和1c)。
CdtA-CdtB的C61和C62融合体主要是二聚的,具有较小比例的单体(图1d和1e)。
CdtB受体结合结构域C52和C52的构建体主要是二聚的,存在少量的单体(图1f和1g)。
无前域C55的全长CdtB纯化后高度聚集,通过AUC呈现非均质的大小分布(图1h)。
实施例9:纯化后CdtA、CdtB和CdtA-CdtB融合构建体的SDS-PAGE概况
从各构建体纯化的蛋白在变性和还原性SDS PAGE上分离,以评估序列完整性。
图2a显示CdtA-CdtB融合构建体C61和C62大部分存在于预期的分子量处。在图2b上对CdtA构建体进行相同的观察。
在图2c上显示C37 CdtB(aa. 43-876)构建体的糜蛋白酶活化导致蛋白的获得(obtention)的前域截短(泳道2),在与泳道3由C55 (aa. 212-876)代表的成熟CdtB相当的分子量处。C55的SDS PAGE概况包含显著量的无法与完整蛋白分离的次级产物,其与在图1h上通过AUC观察的高度聚集概况一致。
与前域C38表达的CdtB (aa. 43-876)纯化为异质制剂,其主要由含有显著量的次级产物的预期分子量的双联体(doublet)构成。
实施例9:用AS01B制剂中的艰难梭菌CdtA和CdtB亚基蛋白免疫小鼠。
小鼠免疫
25只雌性Balb/C小鼠的组用5 µg的完全CdtA和CdtB二元毒素纯化的亚基在第0、14和28天IM免疫。这些抗原在AS01B制剂中注射。
在第42天(第III次免疫后第14天)收集的单独血清中测定抗CdtA和抗CdtB ELISA效价。结果显示于图3-4中。
还在合并的第III次免疫后血清(第42天)上进行二元毒素细胞毒性抑制。结果显示于图5-6中。
抗CdtA和抗CdtB ELISA应答:方案
完整CdtA (C34)或完整CdtB (C37)亚基以1µg/ml (对于CdtA)或2µg/ml (对于CdtB)在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中包被在高结合微量滴定板上(Nunc MAXISORPTM),在4℃过夜。将板用PBS-BSA 1%在RT下摇动封闭30分钟。小鼠抗血清1/500 在PBS-BSA0.2%-TWEENTM0.05%中预稀释,随后,在微量板中进行进一步的两倍稀释并在RT下孵育30分钟。洗涤后,将结合的小鼠抗体使用在PBS-BSA0.2%-tween 0.05%中1:5000稀释的JacksonImmunoLaboratories Inc.过氧化酶缀合的抗小鼠(ref: 110-035-003)检测。将检测抗体在室温(RT)下摇动孵育30分钟。在室温下黑暗中使用4 mg O-苯二胺 (OPD) + 5 µl H2O2/10 ml pH4.5 0.1M柠檬酸盐缓冲液显出颜色15分钟。用50 µl HCl终止反应,并在490 nm处读取相对于620 nm的光密度(OD)。
抗CdtA或CdtB抗体的水平表示为中点效价。在每一处理组中计算25 个样品的GMT。
二元毒素细胞毒性抑制测定
将人结肠上皮细胞(colonic eptithelial cells)(HT29或HCT-116 细胞)在37℃与5%CO2下在DMEM +10%胎牛血清 + 1% 谷氨酰胺 +1% 抗生素(青霉素-链霉素-两性霉素)中培养,并以4.104细胞/孔(对于HT29)和1.104细胞/孔(对于HCT116)的密度接种在96孔黑色组织培养板(Greiner Bio-one, Ref : 655090)中。
24小时后,从孔中去除细胞培养基。
将小鼠抗血清在细胞培养基中1:50预稀释,并随后在微量板(NUNC, Ref :163320)中进行进一步的三倍稀释。将50µl系列稀释的小鼠合并的抗血清加入到黑色板中。随后将50µl的CdtA (25ng/ml)和糜蛋白酶活化的CdtB (75 ng/ml)的混合物加入并将黑色板在37℃与5% CO2下孵育6天。
6天后,将抗血清和毒素的混合物从孔中去除,并将100µl在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中1:500稀释的Hoescht 染色剂(BD Pharmingen, Ref : 561908)加入每孔中室温下于黑暗中2小时。
显色后,将Hoescht染色剂从孔中去除并使用Axiovision显微镜测量细胞荧光细胞。
在每孔中测定由荧光染色覆盖的表面,并将细胞毒性抑制效价定义为诱导荧光信号的50%抑制的稀释度倒数(reciprocal dilution)。
实施例10:用配制于AS01B中与F2混合或未混合的、糜蛋白酶活化或未活化的艰难
梭菌CdtB免疫小鼠。
小鼠免疫
将25只雌性Balb/C小鼠的组用5 µg的糜蛋白酶活化或未活化的、与5µg的F2混合或未混合的CdtB二元毒素纯化的亚基在第0、14和28天IM免疫。这些抗原在AS01B制剂中注射。
在第42天(第III次免疫后第14天)收集的单独血清中测定抗CdtB、抗ToxA和抗ToxB ELISA效价。结果显示于图7-9中。
还在合并的第III次免疫后血清(第42天)上进行二元毒素ToxA和ToxB细胞毒性抑制测定。结果显示于图10-12中。
抗CdtB、抗ToxA和抗ToxB ELISA应答:方案
完整CdtB (C37)亚基、F2 Cter ToxA和F2 Cter ToxB以0.5µg/ml (对于CdtB)、2µg/ml (对于ToxA F2 Cter)和1µg/ml (对于ToxB F2 Cter)在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中包被在高结合微量滴定板上(Nunc MAXISORPTM),在4℃过夜。将板用PBS-BSA 1%在RT下摇动封闭30分钟。小鼠抗血清1/500 在PBS-BSA0.2%-TWEENTM 0.05%中预稀释,随后,在微量板中进行进一步的两倍稀释并在RT下孵育30分钟。洗涤后,将结合的小鼠抗体使用在PBS-BSA0.2%-tween 0.05%中1:5000稀释的Jackson ImmunoLaboratories Inc.过氧化酶缀合的抗小鼠(ref: 110-035-003)检测。将检测抗体在室温(RT)下摇动孵育30分钟。在室温下黑暗中使用4 mg O-苯二胺 (OPD) + 5 µl H2O2/10 ml pH4.5 0.1M柠檬酸盐缓冲液显出颜色15分钟。用50 µl HCl终止反应,并在490 nm处读取相对于620 nm的光密度(OD)。
抗CdtB抗体的水平表示为中点效价。
每一单独血清中存在的抗F2Cter ToxA和F2Cter ToxB抗体的水平通过与加入在每一板中的参考血清比较来测定并且以µg/ml表示。
在每一处理组中计算25 个样品的GMT。
二元毒素、ToxA和ToxB细胞毒性抑制测定
将人结肠上皮细胞(colonic eptithelial cells)(HT29或HCT-116 细胞)在37℃与5%CO2下在DMEM +10%胎牛血清 + 1% 谷氨酰胺 +1% 抗生素(青霉素-链霉素-两性霉素)中培养,并以4.104细胞/孔(对于HT29)和1.104细胞/孔(对于HCT116)的密度接种在96孔黑色组织培养板(Greiner Bio-one, Ref : 655090)中。
24小时后,从孔中去除细胞培养基。
对于ToxA抑制细胞毒性测定,将小鼠抗血清在细胞培养基中1:5(对于g1 (CdtB未活化的)和g2 (CdtB活化的))和1:20(对于g3 (CdtB 未活化的 + F2) 和 g4 (Cdtb 活化的 + F2))预稀释,对于ToxB抑制细胞毒性测定为1:10,并且对于二元毒素抑制测定为1:50。随后,进一步的三倍稀释在微量板(NUNC, Ref : 163320)中进行。将50µl系列稀释的小鼠合并的抗血清加入到黑色板中。随后将50μl的ToxA (0.01µg/ml)(对于HT29)、ToxB(0.022µg/ml)(对于HCT116)和CdtA (25ng/ml)与糜蛋白酶活化的CdtB (75 ng/ml)的混合物(对于HT29和HCT116)加入到黑色板中,并在37℃和5% CO2下孵育6天。
6天后,将抗血清和毒素的混合物从孔中去除,并将100µl在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中1:500稀释的Hoescht 染色剂(BD Pharmingen, Ref : 561908)加入每孔中室温下于黑暗中2小时。
显色后,将Hoescht染色剂从孔中去除并使用Axiovision显微镜测量细胞荧光细胞。
在每孔中测定由荧光染色覆盖的表面,并将细胞毒性抑制效价定义为诱导荧光信号的50%抑制的稀释度倒数(reciprocal dilution)。
实施例11:用在AS01B制剂中以6µg/剂量与F2组合的不同二元毒素疫苗候选
(CdtA/CdtB)免疫小鼠
小鼠免疫
将20只雌性Balb/C小鼠的组用6µg的CdtA-CdtB融合体(C61和C62)或3µg的CdtA(C34、C50或C67)和/或3µg的CdtB (C37、C52、C55或C55/C58)(混合有或不混合有6µg的F2)在第0、14和28天IM免疫。这些抗原在AS01B制剂中注射。
在第42天(第III次免疫后(Post III)第14天)收集的单独血清中测定抗CdtA、抗CdtB、抗ToxA和抗ToxB ELISA效价。结果显示于图13-16中。
还在合并的第III次免疫后血清(第42天)上进行二元毒素ToxA和ToxB细胞毒性抑制测定。结果显示于图17-20中。
抗CdtA、抗CdtB、抗ToxA F2Cter和抗ToxB F2 Cter ELISA应答:方案
CdtA mut E428Q (C44)、完整CdtB (C37)亚基、F2 Cter ToxA和F2 Cter ToxB以1µg/ml (对于CdtA)、0.5µg/ml (对于CdtB)、2µg/ml (对于ToxA F2 Cter)和1µg/ml (对于ToxB F2 Cter)在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中包被在高结合微量滴定板上(Nunc MAXISORPTM),在4℃过夜。将板用PBS-BSA 1%在RT下摇动封闭30分钟。对于第II次免疫后(Post II),将小鼠抗血清在PBS-BSA0.2%-TWEENTM 0.05%中1:100 (对于CdtA、CdtB、ToxB)或1:200 (对于ToxA)预稀释,和对于第III次免疫后(Post III),1:500 (对于CdtA和ToxA)、1:500或1:2000 (对于CdtB)和1:250 (对于ToxB)在PBS-BSA0.2%-TWEENTM 0.05%中预稀释。随后,在微量板中进行进一步的两倍稀释并在RT下孵育30分钟。洗涤后,将结合的小鼠抗体使用在PBS-BSA0.2%-tween 0.05%中1:5000稀释的Jackson ImmunoLaboratories Inc.过氧化酶缀合的抗小鼠(ref: 110-035-003)检测。将检测抗体在室温(RT)下摇动孵育30分钟。在室温下黑暗中使用4 mg O-苯二胺 (OPD) + 5 µl H2O2/10 ml pH4.5 0.1M柠檬酸盐缓冲液显出颜色15分钟。用50 µl HCl终止反应,并在490 nm处读取相对于620 nm的光密度(OD)。
每一单独血清中存在的抗CdtA、抗CdtB、抗F2Cter ToxA和F2Cter ToxB抗体的水平通过与加入在每一板中的参考血清比较来测定并且以µg/ml表示。在每一处理组中计算20 个样品的GMT。
二元毒素、ToxA和ToxB细胞毒性抑制测定
将人结肠上皮细胞(colonic eptithelial cells)(HT29或HCT-116 细胞)在37℃与5%CO2下在DMEM +10%胎牛血清 + 1% 谷氨酰胺 +1% 抗生素(青霉素-链霉素-两性霉素)中培养,并以4.104细胞/孔(对于HT29)和1.104细胞/孔(对于HCT116)的密度接种在96孔黑色组织培养板(Greiner Bio-one, Ref : 655090)中。
24小时后,从孔中去除细胞培养基。
将小鼠抗血清在细胞培养基中预稀释,对于ToxA抑制细胞毒性测定为1:50,对于ToxB抑制细胞毒性测定为1:10,对于在HT29上的二元毒素抑制测定为1:50,和对于在HCT116上的二元毒素抑制测定为1:30 (对于第II次免疫后)和1:30或1:100 (对于第III次免疫后)。 随后,进一步的三倍稀释在微量板(NUNC, Ref : 163320)中进行。将50µl系列稀释的小鼠合并的抗血清加入到黑色板中。随后将50μl的ToxA (0.025µg/ml)(对于HT29)、ToxB (0.6µg/ml)(对于HCT116)和CdtA (25ng/ml)与糜蛋白酶活化的CdtB (75 ng/ml)的混合物(对于HT29和HCT116)加入到黑色板中,并在37℃和5% CO2下孵育6天。
6天后,将抗血清和毒素的混合物从孔中去除,并将100µl在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中1:500稀释的Hoescht 染色剂(BD Pharmingen, Ref : 561908)加入每孔中室温下于黑暗中2小时。
显色后,将Hoescht染色剂从孔中去除并使用Axiovision显微镜测量细胞荧光细胞。
在每孔中测定由荧光染色覆盖的表面,并将细胞毒性抑制效价定义为诱导荧光信号的50%抑制的稀释度倒数(reciprocal dilution)。
实施例12:用在AS01B制剂中以2µg/剂量与F2组合的不同二元毒素疫苗候选
(CdtA/CdtB)免疫小鼠
小鼠免疫
将20只雌性Balb/C小鼠的组用2µg的CdtA-CdtB融合体(C61和C62)或1µg的CdtA(C34、C50或C67)和/或1µg的CdtB (C37、C52、C55或C55/C58)(混合有或不混合有2µg的F2)在第0、14和28天IM免疫。这些抗原在AS01B制剂中注射。
在第42天(第III次免疫后第14天)收集的单独血清中测定抗CdtA、抗CdtB、抗ToxA和抗ToxB ELISA效价。结果显示于图21-24中。
还在合并的第III次免疫后血清(第42天)上进行二元毒素ToxA和ToxB细胞毒性抑制。结果显示于图25-28中。
抗CdtA、抗CdtB、抗ToxA和抗ToxB ELISA应答:方案
CdtA mut E428Q (C44)、完整CdtB (C37)亚基、F2 Cter ToxA和F2 Cter ToxB以1µg/ml (对于CdtA)、0.5µg/ml (对于CdtB)、2µg/ml (对于ToxA F2 Cter)和1µg/ml (对于ToxB F2 Cter)在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中包被在高结合微量滴定板上(Nunc MAXISORPTM),在4℃过夜。将板用PBS-BSA 1%在RT下摇动封闭30分钟。对于第II次免疫后将小鼠抗血清在PBS-BSA0.2%-TWEENTM 0.05%中1:100 (对于CdtB、ToxA、ToxB)和1:100或1:250 (对于CdtA)预稀释,并且对于第III次免疫后为1:500于PBS-BSA0.2%-TWEENTM 0.05%中预稀释。随后,在微量板中进行进一步的两倍稀释并在RT下孵育30分钟。洗涤后,将结合的小鼠抗体使用在PBS-BSA0.2%-tween 0.05%中1:5000稀释的Jackson ImmunoLaboratories Inc.过氧化酶缀合的抗小鼠(ref: 110-035-003)检测。将检测抗体在室温(RT)下摇动孵育30分钟。显色。
实施例13:用在无佐剂的制剂中以10µg/剂量与F2组合的不同二元毒素疫苗候选
(CdtA/CdtB)免疫小鼠
小鼠免疫
将20只雌性Balb/C小鼠的组用10µg的CdtA-CdtB融合体(C61和C62)或5µg的CdtA(C34、C50或C67)和/或5µg的CdtB (C37、C52、C55或C55/C58)(混合有或不混合有10µg的F2)在第0、14和28天IM免疫。这些抗原在无佐剂的制剂中注射。
在第42天(第III次免疫后第14天)收集的单独血清中测定抗CdtA、抗CdtB、抗ToxA和抗ToxB ELISA效价。结果显示于图29-32中。
还在合并的第III次免疫后血清(第42天)上进行二元毒素ToxA和ToxB细胞毒性抑制测定。结果显示于图33-36中。
抗CdtA、抗CdtB、抗ToxA和抗ToxB ELISA应答:方案
CdtA mut E428Q (C44)、完整CdtB (C37)亚基、F2 Cter ToxA和F2 Cter ToxB以1µg/ml (对于CdtA)、0.5µg/ml (对于CdtB)、2µg/ml (对于F2 Cter ToxA)和1µg/ml (对于F2 Cter ToxB)在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中包被在高结合微量滴定板上(Nunc MAXISORPTM),在4℃过夜。将板用PBS-BSA 1%在RT下摇动封闭30分钟。对于第II次免疫后(Post II),将小鼠抗血清在PBS-BSA0.2%-TWEENTM 0.05%中1:100 (对于CdtA、CdtB、ToxA、ToxB)预稀释,和对于第III次免疫后(Post III),1:100 (对于CdtA、ToxA、ToxB)、1:100或1:200 (对于CdtB)于PBS-BSA0.2%-TWEENTM 0.05%中预稀释。随后,在微量板中进行进一步的两倍稀释并在RT下孵育30分钟。洗涤后,将结合的小鼠抗体使用在PBS-BSA0.2%-tween 0.05%中1:5000稀释的Jackson ImmunoLaboratories Inc.过氧化酶缀合的抗小鼠(ref: 110-035-003)检测。将检测抗体在室温(RT)下摇动孵育30分钟。在室温下黑暗中使用4 mg O-苯二胺 (OPD)+ 5 µl H2O2/10 ml pH4.5 0.1M柠檬酸盐缓冲液显出颜色15分钟。用50 µl HCl终止反应,并在490 nm处读取相对于620 nm的光密度(OD)。
在每一处理组中计算20 个样品的GMT。
二元毒素、ToxA和ToxB细胞毒性抑制测定:方案
将人结肠上皮细胞(colonic eptithelial cells)(HT29或HCT-116 细胞)在37℃与5%CO2下在DMEM +10%胎牛血清 + 1% 谷氨酰胺 +1% 抗生素(青霉素-链霉素-两性霉素)中培养,并以4.104细胞/孔(对于HT29)和1.104细胞/孔(对于HCT116)的密度接种在96孔黑色组织培养板(Greiner Bio-one, Ref : 655090)中。
24小时后,从孔中去除细胞培养基。
将小鼠抗血清在细胞培养基中预稀释,对于ToxA抑制细胞毒性测定为1:50,对于ToxB抑制细胞毒性测定为1:10,对于在HT29上的二元毒素抑制测定为1:50,和对于在HCT116上的二元毒素抑制测定为1:30 (对于第II次免疫后)和1:30或1:100 (对于第III次免疫后)。随后,进一步的三倍稀释在微量板(NUNC, Ref : 163320)中进行。将50µl系列稀释的小鼠合并的抗血清加入到黑色板中。随后将50μl的ToxA (0.025µg/ml)(对于HT29)、ToxB (0.6µg/ml)(对于HCT116)和CdtA (25ng/ml)与糜蛋白酶活化的CdtB (75 ng/ml)的混合物(对于HT29和HCT116)加入到黑色板中,并在37℃和5% CO2下孵育6天。
6天后,将抗血清和毒素的混合物从孔中去除,并将100µl在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中1:500稀释的Hoescht 染色剂(BD Pharmingen, Ref : 561908)加入每孔中室温下于黑暗中2小时。
显色后,将Hoescht染色剂从孔中去除并使用Axiovision显微镜测量细胞荧光细胞。
在每孔中测定由荧光染色覆盖的表面,并将细胞毒性抑制效价定义为诱导荧光信号的50%抑制的稀释度倒数(reciprocal dilution)。
实施例14:艰难梭菌F2和CdtB受体结合结构域融合蛋白的克隆和表达
表达质粒和重组菌株。
使用NdeI/XhoI限制位点用标准方法将编码具有CdtB受体结合结构域蛋白长或短版本(C64和C65)和C末端的His标签的F2蛋白的融合蛋白的基因克隆入pET24b(+)表达载体(Novagen)中。
序列概述(表 A)
描述 | 构建体参考 | 氨基酸序列 | 多核苷酸序列 |
CDTa全长(菌株R20291) | N/A | SEQ.I.D.NO:1 | SEQ.I.D.NO:2 |
CDTb全长(菌株R20291) | N/A | SEQ.I.D.NO:3 | SEQ.I.D.NO:4 |
无信号肽的CDTa | C34 | SEQ.I.D.NO:5 | SEQ.I.D.NO:6 |
连接至谷胱甘肽-S-转移酶蛋白的CDTb'(减去信号肽(minus signal peptide))(GST下划线)。 | C37 | SEQ.I.D.NO:7 | SEQ.I.D.NO:8 |
CDTb"(减去前域和信号肽) | C40 | SEQ.I.D.NO:9 | N/A |
CDTa突变E428Q | C44 | SEQ.I.D.NO:10 | SEQ.I.D.NO:11 |
CDTa突变E430Q | C54 | SEQ.I.D.NO:12 | N/A |
CDTa N末端结构域(残基44至残基240) | Gülke 等2001 | SEQ.I.D.NO:13 | N/A |
不具有信号肽在N末端结构域和C末端结构域之间具有接头的CDTa(含有酶活性)。该构建体覆盖氨基酸44至aa 268的片段。 | C49 | SEQ.I.D.NO:14 | N/A |
无信号肽或接头的CDTa。该构建体覆盖aa 44至aa 260的片段。 | C50 | SEQ.I.D.NO:15 | |
减去信号肽的CDTb (CDTb’) | C38 | SEQ ID NO:16 | SEQ ID NO:17 |
融合体1 | F1 | SEQ ID NO:18 | |
融合体2 | F2 | SEQ ID NO:19 | |
融合体3 | F3 | SEQ ID NO:20 | |
融合体4 | F4 | SEQ ID NO:21 | |
融合体5 | F5 | SEQ ID NO:22 | |
融合体F54 Gly | N/A | SEQ ID NO:24 | SEQ ID NO:23 |
融合体F54 New | N/A | SEQ ID NO:26 | SEQ ID NO:25 |
融合体F5 ToxB | N/A | SEQ ID NO:28 | SEQ ID NO:27 |
融合体F52 New | N/A | SEQ ID NO:30 | SEQ ID NO:29 |
毒素A | N/A | SEQ ID NO:31 | |
毒素B | N/A | SEQ ID NO:32 | |
连接至谷胱甘肽-S-转移酶蛋白的CDTb" (减去前域和信号肽)。 | C39 | SEQ ID NO:33 | N/A |
在序列的N末端具有接头的CdtB受体结合结构域,从aa 620-876 | C52 | SEQ ID NO:34 | SEQ ID NO:35 |
在序列的N末端不具有接头的CdtB受体结合结构域,从aa 636-876 | C53 | SEQ ID NO:36 | SEQ ID NO:37 |
去除前域的CDTb (CDTb", aa212-876) | C55 | SEQ ID NO:51 | |
CDTb前域序列 (长, aa43-211) | C58 | SEQ ID NO:38 | N/A |
CDTb前域序列 (短, aa43-186) | C59 | SEQ ID NO:39 | N/A |
具有接头的CDTa N末端(aa44-268)与在序列的N末端具有接头的CDTb受体结合结构域(aa621-876)的融合体 | C60 | SEQ ID NO:40 | N/A |
具有接头的CDTa N末端(aa44-268)与在序列的N末端不具有接头的CDTb受体结合结构域(aa636-876)的融合体 | C61 | SEQ ID NO:41 | N/A |
不具有接头的CDTa N末端(aa44-260)与在序列的N末端具有接头的CDTb受体结合结构域(aa621-876)的融合体 | C62 | SEQ ID NO:42 | N/A |
不具有接头的CDTa N末端(aa44-260)与在序列的N末端不具有接头的CDTb受体结合结构域(aa636-876)的融合体 | C63 | SEQ ID NO:43 | N/A |
F2-在序列的N末端具有接头的CDTb受体结合结构域(aa621-876)的融合体 | C64 | SEQ ID NO:44 | N/A |
F2与在序列的N末端不具有接头的CDTb受体结合结构域(aa636-876)的融合体,在F2和CTDb序列之间具有2个异质(heterogeneous)Gly残基 | C65 | SEQ ID NO:45 | N/A |
无信号肽的CDTa,具有两个突变(E428Q、E430Q, aa 44-463) | C67 | SEQ ID NO:46 | SEQ ID NO:47 |
无信号肽的CDTa,具有七个突变(R345A、Q350A、N385A、R402A、S388F、E428Q、E430Q,aa 44-463) | C69 | SEQ ID NO:48 | SEQ ID NO:49 |
不具有信号序列和前域的CDTb(基于MS数据的成熟片段),其具有Ca2+结合基序突变(aa212-876, mut Asp-9-11-13 Ala) | C97 | SEQ ID NO:50 | N/A |
无信号肽的CDTa,具有五个突变(R345A、Q350A、N385A、R402A、S388F,aa 44-463) | C107 | SEQ ID NO:52 | SEQ ID NO:53 |
无信号肽的CDTa,具有六个突变(R345A、Q350A、N385A、R402A、S388F、E430Q,aa 44-463) | C108 | SEQ ID NO:54 | SEQ ID NO:55 |
无信号肽的CdtA,具有六个突变(R345A-Q350A-N385A-R402A-S388F-E428Q, aa44-463)。 | C110 | SEQ ID NO:56 | N/A |
序列表
SEQ ID 1 – CDTa全长多肽序列
SEQ ID 2 – CDTa全长多核苷酸序列
SEQ ID 3 – CDTb全长多肽序列
SEQ ID 4 – CDTb全长多核苷酸序列
SEQ ID 5 – CDTa C34构建体多肽序列
SEQ ID 6 – CDTb C34构建体多核苷酸序列
SEQ ID 7 – CDTb C37构建体。连接至谷胱甘肽-S-转移酶蛋白的CDTb'(减去信号肽(minus signal peptide))(GST下划线)多肽序列。
SEQ ID 8 – CDTb C37构建体。连接至谷胱甘肽-S-转移酶蛋白的CDTb'(减去前域)(GST下划线)多核苷酸序列。
SEQ ID 9 – CDTb C40构建体。CDTb"(减去前域和信号肽)多肽序列。
SEQ ID 10 – C44构建体。CDTa突变E428Q多肽序列。
SEQ ID 11 – CDTa突变E428Q多核苷酸序列。
SEQ ID 12 – C54构建体。CDTa突变E430Q多肽序列。
SEQ ID 13 – CDTa N末端结构域(残基44至残基240)多肽序列。
SEQ ID 14 – C49构建体。不具有信号肽的CDTa N末端结构域,在N末端结构域和C末端结构域之间存在接头(含有酶活性)。该构建体覆盖氨基酸44至aa 268多肽序列的片段。
SEQ ID 15 – C50构建体。不具有信号肽和在CDTa的N末端和C末端结构域之间存在的接头的CDTa。该构建体覆盖aa 44至aa 260多肽序列的片段。
SEQ ID NO:16 – 去除前域的CDTb的多肽序列 (CDTb’)
SEQ ID NO:17 – 去除前域的CDTb的多肽序列 (CDTb’)
SEQ ID NO:18 – 融合体1的序列 (F1)
SEQ ID NO:19 – 融合体2的序列 (F2)
SEQ ID NO:20 – 融合体3的序列 (F3)
SEQ ID NO:21 – 融合体4的序列 (F4)
SEQ ID NO:22 – 融合体5的序列 (F5)
SEQ ID NO:23 – F54 Gly的核苷酸序列
SEQ ID NO:24 – F54Gly的氨基酸
SEQ ID NO:25 – F54 New的核苷酸序列
SEQ ID NO:26 F54 New的氨基酸序列
SEQ ID NO:27 F5 ToxB的核苷酸序列
SEQ ID NO:28 F5 ToxB的氨基酸序列
SEQ ID NO:29 – F52 New的核苷酸序列
SEQ ID NO:30- F52 New的氨基酸序列
SEQ ID NO:31 – 毒素A的氨基酸序列
SEQ ID NO:32 – 毒素B的氨基酸序列
SEQ ID NO:33 – 当与GST融合表达时的CDTb” C39的氨基酸序列。
备注:
· 细胞毒性测定中测试的蛋白在通过PreScission蛋白酶切割GST后获得。
· 根据实验结果,表明成熟CDTb(无SP和前域)开始于Ser212(序列中红色且下划线显示)。
SEQ ID NO:34 – 在序列的N末端具有接头的CdtB受体结合结构域的氨基酸序列,从aa 620-876 (C52)
SEQ ID NO:35 – C52的核苷酸序列
SEQ ID NO:36 – 在序列的N末端不具有接头的CdtB受体结合结构域的氨基酸序列,从aa 636-876 (C55)
SEQ ID NO:37 – C55的核苷酸序列
SEQ ID NO:38 – CDTb前域序列的氨基酸序列(长, aa43-211) (C58)
SEQ ID NO:39 – CDTb前域序列的氨基酸序列(短, aa43-186) (C59)
SEQ ID NO:40 – 具有接头的CDTa N末端(aa44-268)与在序列的N末端具有接头的CDTb受体结合结构域(aa621-876)的融合体的氨基酸序列 (C60)
融合体的CDTa部分下划线表示。
SEQ ID NO:41 – 具有接头的CDTa N末端(aa44-268)与在序列的N末端不具有接头的CDTb受体结合结构域(aa636-876)的融合体的氨基酸序列 (C61)
融合体的CDTa部分下划线表示。
SEQ ID NO:42 – 不具有接头的CDTa N末端(aa44-260)与在序列的N末端具有接头的CDTb受体结合结构域(aa621-876)的融合体的氨基酸序列 (C62)
融合体的CDTa部分下划线表示。
SEQ ID NO:43 – 不具有接头的CDTa N末端(aa44-260)与在序列的N末端不具有接头的CDTb受体结合结构域(aa636-876)的融合体的氨基酸序列 (C63)
融合体的CDTa部分下划线表示。
SEQ ID NO:44 – F2-在序列的N末端具有接头的CDTb受体结合结构域(aa621-876)的融合体的氨基酸序列 (C64)
F2序列下划线显示。
SEQ ID NO:45 – F2与在序列的N末端不具有接头的CDTb受体结合结构域(aa636-876)的融合体(在F2和CTDb序列之间具有2个异质(heterogeneous)Gly残基)的氨基酸序列(C65)
F2序列下划线显示。
SEQ ID NO:46 – 不具有信号肽具有两个突变(E428Q、E430Q, aa 44-463)的CDTa的氨基酸序列 (C67)
SEQ ID NO:47 – C67的核苷酸序列
SEQ ID NO:48 – 不具有信号肽具有七个突变(R345A、Q350A、N385A、R402A、S388F、E428Q、E430Q,aa 44-463)的CDTa的氨基酸序列 (C69)
SEQ ID NO:49 – C69的核苷酸序列
SEQ ID NO:50 – 不具有信号序列和前域(基于MS数据的成熟片段)具有Ca2+结合基序突变(aa212-876, mut Asp-9-11-13 Ala)的CDTb的氨基酸序列 (C97)
该序列中的3个突变的残基。三个Asp残基突变为Ala。它们以粗体和下划线突出显示。
SEQ ID NO:51 – 去除前域的CDTb的氨基酸序列 (CDTb", aa212-876) (C55)
SEQ ID NO:52 – 不具有信号肽具有五个突变(R345A、Q350A、N385A、R402A、S388F,aa 44-463)的CDTa的氨基酸序列 (C107)
SEQ ID NO:53 – 不具有信号肽具有五个突变(R345A、Q350A、N385A、R402A、S388F,aa 44-463)的CDTa的多核苷酸序列 (C107)
SEQ ID NO:54 - 不具有信号肽具有六个突变(R345A、Q350A、N385A、R402A、S388F、E430Q, aa 44-463) 的CDTa的氨基酸序列 (C108)
SEQ ID NO:55 - 不具有信号肽具有六个突变(R345A、Q350A、N385A、R402A、S388F、E430Q, aa 44-463) 的CDTa的多核苷酸序列 (C108)
SEQ ID NO:56 - 不具有信号肽具有六个突变(R345A、Q350A、N385A、R402A、S388F、E430Q, aa 44-463) 的CDTa的氨基酸序列 (C110
Claims (10)
1.免疫原性组合物,其包含分离的艰难梭菌CDTb蛋白,其中所述分离的艰难梭菌CDTb蛋白是包含受体结合结构域的截短的CDTb蛋白,其中所述分离的艰难梭菌CDTb蛋白由以下组成:
(i) SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:51;或
(ii) SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:51的变体,其中已缺失6个组氨酸残基的短片段,所述组氨酸残基的短片段能够帮助纯化所述截短的CDTb蛋白。
2.权利要求1的免疫原性组合物,其中所述分离的艰难梭菌CDTb蛋白由以下组成:
(i) SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:51;或
(ii) SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:51的变体,其中已缺失6个组氨酸残基的短片段,所述组氨酸残基的短片段能够帮助纯化所述截短的CDTb蛋白。
3.权利要求1-2中任一项的免疫原性组合物,其包含由以下组成的分离的艰难梭菌CDTa蛋白
(i) SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:46;SEQ ID NO:48;SEQ ID NO:52;或SEQ ID NO:54;或
(ii) SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:54的变体,其中已缺失6个组氨酸残基的短片段,所述组氨酸残基的短片段能够帮助纯化所述CDTa蛋白。
4.权利要求3的免疫原性组合物,其包含含有降低其ADP核糖基转移酶活性的在氨基酸428和430处的突变的分离的艰难梭菌CDTa蛋白,其中所述分离的艰难梭菌CDTa蛋白具有在位置428处从谷氨酸至谷氨酰胺的突变和在位置430处从谷氨酸至谷氨酰胺的突变。
5.免疫原性组合物,其包含含有CDTa蛋白和CDTb蛋白的融合蛋白,其中CDTb蛋白是包含受体结合结构域的截短的CDTb蛋白,其中所述融合蛋白是
(i) SEQ ID NO:40;SEQ ID NO:41;SEQ ID NO:42;或SEQ ID NO:43;或
(ii) SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:43的变体,其中已缺失6个组氨酸残基的短片段,所述组氨酸残基的短片段能够帮助纯化所述融合蛋白。
6.权利要求1-2和4-5中任一项的免疫原性组合物,其中所述免疫原性组合物进一步包含分离的艰难梭菌毒素A蛋白和/或分离的艰难梭菌毒素B蛋白。
7.权利要求6的免疫原性组合物,其中所述免疫原性组合物包含分离的艰难梭菌毒素A蛋白和分离的艰难梭菌毒素B蛋白,其中所述分离的艰难梭菌毒素A蛋白和分离的艰难梭菌毒素B蛋白形成融合蛋白。
8.疫苗,其包含前述权利要求中任一项的免疫原性组合物和药学上可接受的赋形剂。
9.权利要求1-2、4-5和7中任一项的免疫原性组合物或权利要求8的疫苗,其用于治疗或预防艰难梭菌疾病。
10.权利要求1-7中任一项的免疫原性组合物在制备用于预防或治疗艰难梭菌疾病的药物中的用途。
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