ES2298128T3 - Composiciones de vacuna neisseriana y metodos. - Google Patents
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Abstract
Una composición de vacuna que comprende una Neisseria comensal o una de sus preparaciones de la membrana externa, en la que dicha Neisseria comensal se selecciona del grupo consistente en N. lactamica, N. cinerea, N. elongata, N. flavescens, N. polysaccharea, N. sicca y N. subflava.
Description
Composiciones de vacuna Neisseriana y
métodos.
La presente invención se refiere a vacunas y a
métodos para preparar vacunas que estimulan una respuesta
inmunitaria. En particular, la presente invención se refiere a
vacunas que proporcionan inmunidad protectora de amplio espectro
contra la infección microbiana.
La infección por organismos patógenos es una de
las principales causas de enfermedad crónica y aguda. En particular,
la infección resultante de fuentes microbianas, tales como
bacterias, virus y protozoos, continúa reivindicando millones de
vidas en todo el mundo. Con especies microbianas en aumento que se
vuelven resistentes a los antibióticos convencionales, sería
deseable proporcionar medios de protección y lucha alternativos y
preferentemente profilácticos contra la infección microbiana.
La meningitis meningocócica es de particular
importancia como problema sanitario mundial y en muchos países la
incidencia de la infección está creciendo. Neisseria
meningitidis (meningococo) es el organismo que produce la
enfermedad y es también responsable de la septicemia meningocócica,
que está asociada con el comienzo rápido y gran mortalidad, con
alrededor del 22% de casos mortales.
Actualmente, las vacunas dirigidas a
proporcionar inmunidad protectora contra la enfermedad meningocócica
proporcionan sólo protección limitada a causa de las muchas cepas
diferentes de N. meningitidis. Las vacunas basadas en
antígenos del serogrupo, los polisacáridos capsulares, ofrecen
solamente una breve protección de vida contra la infección y no
protegen contra muchas cepas encontradas frecuentemente en
Norteamérica y Europa. Un inconveniente adicional de estas vacunas
es que proporcionan bajos niveles de protección a los niños con
edad inferior a 2 años, uno de los grupos más vulnerables que son
normalmente sensibles a la infección. Las vacunas conjugadas más
recientes actualmente en utilización en el Reino Unido solucionarán
algunos de estos problemas pero solamente serán eficaces contra el
serogrupo C del meningococo.
Gold et al. (Journal of Infectious
Diseases, volumen 137, nº 2, febrero de 1978, páginas
112-121) han descrito que el transporte de N.
lactamica puede ayudar al desarrollo de inmunidad natural de
N. meningitidis por inducción de anticuerpos con reacción
cruzada. Esta conclusión se basó en la observación de anticuerpos
con reacción cruzada que tienen actividad bactericida dependiente
del complemento producida en respuesta a la infección por N.
lactamica. Sin embargo, Cann y Rogers (J. Med.
Microbiol., volumen 30, 1989, páginas 23-30)
detectaron anticuerpos contra antígenos comunes de especies de
neisseria patógena y comensal, pero observaron también que el
anticuerpo contra los mismos antígenos estaba presente tanto en los
sueros bactericidas como en los no bactericidas. Así, no fue posible
identificar ningún anticuerpo bactericida con reacción cruzada.
Las vacunas de microbios vivos atenuadas para la
enfermedad meningocócica han sido sugeridas por Tang et al.
(Vaccine 17, 1999, páginas 114-117) en las
que una cepa viva atenuada de N. meningitidis podría
administrarse a través de las mucosas. Tang también comentó la
utilización de bacterias comensales para proteger contra la
infección por bacterias patógenas, concluyendo que los epítopos con
reacción cruzada que inducen protección contra la infección
meningocócica no han sido definidos y por consiguiente sería
preferible la utilización de cepas genéticamente modificadas de
N. meningitidis.
Es deseable proporcionar una vacuna adicional
que proporcione inmunidad protectora contra la infección de N.
meningitidis. Además es deseable proporcionar una vacuna que
proporcione inmunidad protectora a lactantes así como a adultos y
cuya protección sea de larga duración. También puede presentar
ventajas proporcionar una vacuna que proteja contra la infección
subclínica, es decir en la que los síntomas de la infección
meningocócica no sean inmediatamente evidentes y el individuo
infectado pueda actuar como vehículo del patógeno. Sería además
ventajoso proteger contra todas o una amplia gama de cepas de N.
meningitidis.
El documento
WO-A-96/29412 describe el
aislamiento de un antígeno de superficie de 22 kDa de N.
meningitidis que es inmunológicamente accesible. Se demuestra
que el antígeno de 22 kDa se conserva en otras especies neisserianas
incluyendo la N. lactamica comensal.
Aoun et al. (Annals de l'Institut Pasteur
Microbiol. vol. 139, págs. 203-212 (1988)) se
refiere a la identificación de anticuerpos en pacientes humanos
para un antígeno de superficie meningocócico de 70 kDa y su valor
como componente de la vacuna. Se demostró que los sueros de
convalecencia de portadores humanos se unen también a la proteína
de 70 kDa de N. gonorrhoeae. Sin embargo, las especies de
Neisseria no patógenas aunque poseen el antígeno de 70 kDa
produjeron menos frecuentemente una respuesta del anticuerpo en
niños.
Gómez et al. (Vaccine, vol. 14, págs.
1340-1346 (1996)) describe la purificación de la
proteína (Fbp) de 37 kDa reprimible por hierro de N.
meningitidis. Se demuestra que los anticuerpos de ratón
producidos contra Fbp de Neisseria patógena se unen a Fbps
de N. lactamica y N. sicca comensales.
Es deseable además proporcionar una vacuna
contra otra infección neisseriana, principalmente la gonorrea.
\newpage
Un objetivo de la presente invención consiste en
proporcionar composiciones que contienen componentes
inmunoestimulantes, y vacunas basadas en los mismos, que cumplen o
por lo menos mejoran los inconvenientes en la técnica.
La presente invención se basa en la utilización
de una Neisseria comensal en una vacuna contra la enfermedad.
Por consiguiente, una especie comensal de Neisseria tal como
N. lactamica puede utilizarse como vacuna atenuada o vacuna
de células completas destruidas o en una vacuna que contiene
fracciones de N. lactamica. Se ha demostrado
sorprendentemente que los ratones inmunizados según la presente
invención con células completas destruidas de N. lactamica y
preparaciones de la membrana externa son protegidos de la prueba de
provocación meningocócica intraperitoneal letal, y estas vacunas
compuestas de un extracto en detergente de células de N.
lactamica o fracciones de ésta, separadas por electroforesis de
preparación, también protegen a los ratones de la prueba de
provocación meningocócica letal. Estos resultados se han obtenido
utilizando ratones y el modelo de ratón utilizado es considerado
como pronóstico de los correspondientes efectos inmunógenos y de
vacunación en seres humanos.
Por consiguiente, un primer aspecto de la
presente invención proporciona una composición de vacuna que
comprende una Neisseria comensal o una de sus preparaciones
de la membrana externa. Las Neisseria comensales se
seleccionan del grupo consistente en N. lactamica, N. cinerea, N.
elongata, N. flavescens, N. polysaccharea, N. sicca y N.
subflava. También se da a conocer una composición inmunógena,
que comprende una Neisseria comensal o un componente,
extracto o derivado inmunógeno de ésta y un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
La composición de la invención es
particularmente adecuada para la vacunación contra la infección de
un animal. El término "infección" tal como se utiliza en la
presente memoria debe entenderse que incluye la proliferación de un
organismo patógeno dentro y/o en los tejidos de un organismo
hospedador. Dichos organismos patógenos incluyen por lo general
bacterias, virus, hongos y protozoos, aunque el crecimiento de
cualquier microbio dentro y/o en los tejidos de un organismo se
considera que están incluidos dentro del término
"infección".
Los microorganismos comensales son aquellos que
pueden colonizar un organismo hospedador sin señales de enfermedad.
Numerosas Neisseria comensales diferentes son adecuadas para
su utilización en la invención, y estas Neisseria comensales
se seleccionan del grupo consistente en N. lactamica, N. cinerea,
N. elongata, N. flavescens, N. polysaccharea, N. sicca y N.
subflava. Diferentes especies de estos organismos comensales se
sabe que colonizan las zonas bucal o nasal u otras superficies de
mucosas y por consiguiente cada especie puede administrarse según
el área conocida del cuerpo que coloniza normalmente. Por
consiguiente también, la utilización de una composición de la
invención puede producir estimulación de la producción de
anticuerpos protectores de novo o si el individuo ha sido ya
colonizado en una cierta medida puede producir un aumento de
anticuerpos existentes en la naturaleza.
El "extracto" o "componente" es un
extracto o componente que es inmunógeno tal como los anticuerpos
producidos contra el extracto o componente de una Neisseria
comensal con reacción cruzada con una Neisseria patógena, en
particular N. meningitidis.
El término "derivado" se utiliza para
describir tipos de cepas de Neisseria comensal que son
modificadas o atenuadas de alguna manera a fin de diferenciarse de
las especies naturales; por ejemplo, una composición de vacuna que
comprende una Neisseria comensal recombinante que presenta
resistencia a determinados tipos de compuestos antibióticos, que
puede utilizarse con ventaja en combinación con dichos antibióticos
en el tratamiento de la infección.
Una ventaja de la invención consiste en que esta
vacunación contra las enfermedades neisserianas puede conseguirse
de este modo utilizando una especie no patógena de Neisseria,
que hace que la vacunación sea un procedimiento más seguro. Además,
la protección proporcionada sorprendentemente puede no estar
limitada a un serotipo, subgrupo o serogrupo específicos del
meningococo pero es de eficacia protectora general.
Una ventaja más de la invención consiste en que
la Neisseria comensal que es el asunto de la invención
pueden no revertir en tipos virulentos. En el campo de la vacunación
se sabe utilizar patógenos vivos y atenuados y esta utilización
conlleva el riesgo de que el organismo atenuado puede revertir en
virulencia. La presente invención evita el riesgo. Además, N.
meningitidis posee muchos factores de virulencia, cuyas
funciones exactas en patogénesis son desconocidas y puede poseer
factores de virulencia no reconocidos hasta ahora. Por
consiguiente, una ventaja adicional de la invención consiste en que
una composición de la invención puede utilizarse con confianza en
su nivel de
seguridad.
seguridad.
El procedimiento de la invención es de
aplicación a la vacunación contra varias infecciones,
preferentemente pero no solamente infecciones neisserianas. En una
realización específica de la invención, se ha demostrado la
protección contra la enfermedad meningocócica. La invención es
también de aplicación en vacunación generalmente contra la
infección neisseriana, incluyendo la infección por gonorrea y
también en la infección procedente de otros organismos microbianos
patógenos. La invención proporciona además la vacunación que se
aspira para estimular o desensibilizar el sistema inmunitario.
La composición puede comprender específicamente
Neisseria comensal destruida, que por ejemplo puede obtenerse
calentando o poniendo en suspensión Neisseria comensal en
una mezcla de agentes bactericidas tales como tiomersal y
formaldehído.
La composición puede comprender también
Neisseria comensal atenuada. Como se menciona, es opcional
pero no se requiere normalmente utilizar Neisseria comensal
atenuada ya que estos organismos no son virulentos.
En una realización de la invención, un
componente o extracto inmunógeno de una Neisseria comensal se
selecciona de una preparación vesicular de la membrana externa, una
preparación de la membrana externa, lipooligosacáridos y una
fracción proteica.
La preparación de la membrana externa y la
fracción proteica de N. lactamica, por ejemplo, puede
obtenerse a partir de N. lactamica cultivada en presencia o
ausencia de hierro. La fracción proteica de N. lactamica
dada a conocer en la presente memoria se obtiene de manera
conveniente poniendo en suspensión células o membranas de N.
lactamica en presencia de detergente e incubando la suspensión a
fin de extraer las proteínas de N. lactamica.
Alternativamente, se conocen otras numerosas
técnicas para la extracción de los componentes de la membrana
externa, tales como las fracciones proteicas, lipooligosacáridos y
lipopolisacáridos, procedentes de preparaciones celulares y son
adecuadas para obtener los componentes o extractos inmunógenos de
Neisseria comensal. Ejemplos de técnicas convencionales para
este fin incluyen la utilización de la variación en la concentración
de sales, agentes caótropos, variación de pH (alto o bajo),
digestión enzimática y disgregación mecánica.
Numerosas fracciones diferentes dadas a conocer
en la presente memoria son adecuadas para su utilización en
vacunación contra la enfermedad meningocócica. Particularmente las
fracciones adecuadas son aquellas de peso molecular inferior a 50
kDa, de peso molecular superior a 40 kDa
\hbox{e inferior a 70
kDa y de peso molecular superior a 60 kDa.}
Como se da a conocer en la presente memoria, se
proporciona una composición para provocar una respuesta inmunitaria
y adecuada para utilizar en la vacunación de un individuo contra la
infección neisseriana, más específicamente la enfermedad
meningocócica, que comprende un componente antigénico o componentes
antigénicos que tienen las propiedades siguientes:
(a) peso molecular 50 kDa o inferior;
(b) que puede obtenerse a partir de N.
lactamica; y
(c) anticuerpos contra el/los
componente(s) obtenido(s) a partir de N.
lactamica con reacción cruzada con N. meningitidis.
En la utilización de una composición que
contiene dicho componente, extraido utilizando detergente, todos
los ratones tratados con este componente sobrevivieron a una dosis
de la prueba de provocación de 2 \times 10^{7} CFU de N.
meningitidis y tres de cada cinco ratones sobrevivieron a una
dosis de la prueba de provocación mayor de 6 \times 10^{8}
CFU.
Asimismo se da a conocer una composición para
provocar una respuesta inmunitaria y adecuada para su utilización
en la vacunación de un individuo contra la infección neisseriana,
más específicamente la enfermedad meningocócica, que comprende un
componente antigénico o componentes antigénicos que tienen las
propiedades siguientes:
(a) peso molecular de al menos 40 kDa y hasta 70
kDa;
(b) que puede obtenerse a partir de N.
lactamica; y
(c) anticuerpos contra el/los
componente(s) obtenido(s) a partir de N.
lactamica con reacción cruzada con N. meningitidis.
En la utilización de dicho componente, obtenido
utilizando detergente extracto de N. lactamica, cuatro de
cada cinco ratones tratados con el componente sobrevivieron a una
dosis de provocación de 2 \times 10^{7} CFU de N.
meningitidis y los ratones que recibieron una dosis de
provocación superior de 6 \times 10^{8} CFU sobrevivieron más
tiempo que un grupo de referencia.
Asimismo se da a conocer una composición para
provocar una respuesta inmunitaria y adecuada para su utilización
en la vacunación de un individuo contra la infección neisseriana,
más específicamente la enfermedad meningocócica, que comprende un
componente antigénico o componentes antigénicos que tienen las
propiedades siguientes:
(a) peso molecular de al menos 60 kDa;
(b) que puede obtenerse a partir de N.
lactamica; y
(c) anticuerpos contra el/los
componente(s) obtenido(s) a partir de N.
lactamica con reacción cruzada con N. meningitidis.
En la utilización de dicho componente, obtenido
utilizando un extracto de detergente, uno de cada cinco ratones
sobrevivieron a una dosis de provocación de 2 x 10^{7} de CFU, de
N. meningitidis y, mientras que todos los ratones
sucumbieron a una dosis de provocación mayor de 6 \times 10^{8}
CFU, su tiempo de supervivencia fue mayor que el de un grupo de
referencia que no recibió el componente.
En un ejemplo de las composiciones dadas a
conocer en utilización, descrito con más detalle a continuación,
las proteínas en los intervalos de tamaño de 25 a 35 kDa y de
35 a 43 kDa, extraídas de una Neisseria comensal,
proporcionaron un nivel significativo de protección inmunitaria
cuando se administraban a ratones como composición de vacuna.
A modo de ejemplo de un método de extracción de
un componente antigénico descrito en la presente memoria, un método
de extracción comprende:
- (i)
- poner en suspensión células de N. lactamica en una solución acuosa de detergente;
- (ii)
- incubar la suspensión a fin de extraer el componente antigénico de la N. lactamica;
- (iii)
- centrifugar la suspensión para separar la suspensión en un sobrenadante y un sedimento; y
- (iv)
- fraccionar el componente antigénico del sobrenadante.
Este método específico puede modificarse según
el protocolo de extracción seleccionado por el usuario, por ejemplo
utilizando concentración salina elevada en la etapa inicial (i). En
otras formas de realización de la invención el componente
antigénico se obtiene utilizando tecnología recombinante mediante la
expresión de una secuencia de N. lactamica en un hospedador
adecuado tal como E. coli.
En un segundo aspecto, la invención se refiere a
una composición para la vacunación contra la infección neisseriana
que comprende una Neisseria comensal o uno de sus
componentes, extractos o derivados inmunógenos y un vehículo
farmacéuticamente aceptable, en la que la Neisseria comensal
comprende y expresa un gen de una Neisseria patógena.
Este aspecto de la invención ofrece la ventaja
de la utilización de un organismo comensal para administrar y/o
presentar al receptor un antígeno procedente de una Neisseria
patógena. El gen opcionalmente codifica un antígeno de superficie o
una proteína que es segregada, por ejemplo, por N.
meningitidis o N. gonorrhoeae y puede codificar un
antígeno procedente de éstas. La Neisseria comensal puede
estar viva o muerta.
En una realización del segundo aspecto de la
invención se proporciona una composición para la vacunación contra
la enfermedad meningocócica que comprende una Neisseria
comensal y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que la
Neisseria comensal comprende y expresa un gen de N.
meningitidis.
El gen de N. meningitidis puede codificar
por ejemplo una proteína que se fija a la transferrina, una
superóxido dismutasa (SOD) por ejemplo una Cu, Zn SOD, proteína A
neisseriana de superficie ("NspA"), una porina u otra proteína
de la membrana externa. Las secuencias génicas para la mayoría de
estos antígenos son conocidas en la bibliografía. Kroll et
al. en Microbiology 141 (pt 9), 2271-2279
(1995) describen la secuencia de Cu, Zn-SOD. Martin
et al., en J. Exp. Med., 7 de abril de 1997,
185(7), págs. 1173-1183 describen la
secuencia de NspA de N. meningitidis.
La invención proporciona también una composición
farmacéutica que comprende una composición según el primer o
segundo aspecto de la invención más un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
En un tercer aspecto, la invención proporciona
la utilización de una composición según el primer y segundo
aspectos de la invención para la preparación de un medicamento
destinado a la vacunación contra la infección neisseriana.
En la utilización de una realización de la
invención descrita en un ejemplo a continuación, el medicamento
está destinado a la vacunación contra la enfermedad meningocócica y
comprende una composición según el primer y segundo aspectos de la
invención.
La invención se refiere asimismo a una cepa de
una Neisseria comensal, tal como N. lactamica,
modificada genéticamente a fin de expresar un gen procedente de una
Neisseria patógena. El gen de N. meningitidis puede
codificar, por ejemplo, una proteína seleccionada de una proteína de
unión a la transferrina, una SOD, por ejemplo, una
Cu,Zn-SOD, NspA, una porina u otra proteína de la
membrana externa.
Asimismo se da a conocer un método de extracción
de una proteína para la incorporación en una composición adecuada
para vacunación contra la enfermedad meningocócica, que
comprende:
- (i)
- poner en suspensión la Neisseria comensal, por ejemplo N. lactamica, células en presencia de detergente; y
- (ii)
- incubar la suspensión a fin de extraer una fracción proteica de las células.
La fracción proteica puede ser en consecuencia
de peso molecular 50 kDa o inferior, por lo menos 40 kDa y hasta 90
kDa o al menos 80 kDa.
La composición puede combinarse con un vehículo
farmacéuticamente aceptable, por ejemplo el adyuvante alúmina,
aunque cualquier vehículo adecuado para administración por vía oral,
intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular,
intradérmica o cualquier otra vía de administración es adecuado para
producir una composición para el tratamiento de la enfermedad
meningocócica. Las Neisseria comensales que son colonizadores
bucales se pueden administrar en un colutorio y los colonizadores
nasales en un pulverizador nasal.
Las proteínas que se unen a la transferrina son
conocidas porque están localizadas en las membranas externas de
numerosas bacterias Gram negativas tal como N. meningitidis.
Las formulaciones de la composición de la presente invención con
vehículos o adyuvantes convencionales y opcionalmente además
enriquecidas con uno o más antígenos de la especie
Neisseria, opcionalmente producida de manera recombinante,
por ejemplo, Cu-Zn SOD, la NspA de 22 kD, porinas,
antígenos de gonorrea o proteínas que se fijan a la transferrina
proporcionan una composición para el tratamiento de la infección
por estas bacterias.
En la presente invención, la terminología
"proteína que se fija a la transferrina" o "Tbp" se
refiere a una proteína que se una sola a la transferrina o puede
formar parte de un complejo de proteínas que se unen a la
tranferrina.
Una vacuna atenuada según la presente invención
puede administrarse por vía parenteral o a las mucosas, por
ejemplo, por vía intranasal o inoculación oral. Una bacteria muerta
o una vacuna subunitaria puede administrarse también por esta vía,
o formularse para la administración oral. Una vacuna subunitaria se
administra de manera conveniente por vía parenteral.
Un aspecto adicional de la invención se refiere
a una composición que comprende una Neisseria comensal o uno
de sus componentes, extractos o derivados inmunógenos, en la que
dicha Neisseria comprende un producto génico heterólogo.
Los productos génicos heterólogos de la
invención por lo general incluyen péptidos, proteínas y secuencias
complementarias que están codificadas por una secuencia génica que
no es natural para la Neisseria comensal. Los producto
génicos heterólogos de la invención incluyen, por ejemplo, proteínas
bacterianas, proteínas víricas o péptidos de superficie, antígenos
y anticuerpos y fragmentos de los mismos. El producto génico
heterólogo de la invención puede ser también cualquier antígeno
hallado en un organismo patógeno.
En una realización de la invención, la
composición comprende una Neisseria comensal en la que se ha
transformado un vector de expresión que contiene una secuencia
génica que codifica un producto génico heterólogo. Las proteínas
específicas adecuadas para su utilización en la invención por lo
general incluyen:
- Proteínas
víricas, tales como el antígeno de superficie del virus de la
hepatitis B; la glucoproteína G del virus de la rabia; la
glucoproteína D del virus del herpes simple; la glucoproteína del
virus de Epstein-Barr; la glucoproteína del virus
de la gripe; la nucleoproteína del virus de la estomatitis
vesicular; la glucoproteína G del virus del sincitio respiratorio
humano; la envoltura del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH);
las subunidades de rotavirus; las subunidades
\hbox{del virus del sarampión y las subunidades del virus de la vacuna.}
- Proteínas bacterianas, tales como las subunidades segmentadas de Bordetella pertussis; las proteínas de superficie de Bordetella pertussis; las subunidades del Bacillus anthracis; las subunidades de Escherichia coli y las subunidades de Yersinia pestis.
- Proteínas protozoarias, tales como proteínas de Plasmodium falciparum; proteínas del tripanosoma; y proteínas de Cryptosporidium.
En un ejemplo adicional de la invención en uso,
descrito con más detalle a continuación, el vector de expresión
pJSK422 se utiliza para expresar la proteína verde fluorescente,
bajo el control del activador groES/EL, en la N. cinerea
comensal.
La invención proporciona además una
Neisseria comensal que se transforma con un vector de
expresión que comprende una secuencia señal que dirige el producto
génico heterólogo a la membrana externa de una célula neisseriana.
Otras secuencias señal son también adecuadas para su utilización en
la invención, tal como las señales de secreción o las señales de
localización del subcompartimento celular, p. ej. señales de
localización periplásmica.
Los aspectos adicionales de la invención
proporcionan métodos para preparar composiciones. Dichos métodos
son adecuados para preparar composiciones de vacuna que producen
inmunidad protectora contra la infección microbiana cuando se
administran a un animal.
Un ejemplo de la invención en uso, descrito con
más detalle más adelante, proporciona un método de preparar una
composición que comprende las etapas siguientes:
- a)
- insertar un gen que codifica un producto génico heterólogo en un vector de expresión;
- b)
- transformar dicho vector de expresión en una Neisseria comensal de modo que dicho producto génico heterólogo se expresa en dicha Neisseria; y
- c)
- combinar la Neisseria de (b) con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Asimismo se da a conocer un método de
preparación de una composición que comprende las etapas
siguientes:
- a)
- insertar un gen que codifica un producto génico heterólogo en un vector de expresión;
- b)
- transformar dicho vector de expresión en una Neisseria comensal de modo que dicho producto génico heterólogo se expresa en dicha Neisseria; y
- c)
- obtener un componente o extracto inmunógeno a partir de la Neisseria de (b); y
- d)
- combinar el componente o extracto inmunógeno de (c) un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Se da a conocer también un método de preparación
de una composición que comprende las etapas siguientes:
- a)
- obtener un componente o extracto inmunógeno a partir de una Neisseria comensal; y
- b)
- combinar el componente inmunógeno o extracto de (a) con un producto génico heterólogo y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Asimismo se dan a conocer (a) métodos y
composiciones en las que un extracto es extraído de una
Neisseria comensal que expresa un producto génico
heterólogo, y (b) procedimientos y composiciones en los que un
extracto se obtiene de una Neisseria comensal y el producto
génico heterólogo expresado en otra parte (en otro organismo) se
combina con este último extracto.
La invención se refiere asimismo a la
utilización de Neisseria comensal en la preparación de un
medicamento para el tratamiento de la infección neisseriana y para
la utilización de una Neisseria comensal, o un componente,
extracto o derivado inmunógeno de la misma, en la que dicha
Neisseria comprende un producto génico heterólogo, en la
preparación de un medicamento para el tratamiento de la infección o
para la inmunoestimulación en un
animal.
animal.
Las realizaciones específicas de la invención se
exponen con más detalle mediante los ejemplos descritos más
adelante. Los resultados citados en los ejemplos están ilustrados
mediante los dibujos adjuntos, en los que:
La Fig. 1 presenta la protección de ratones
contra la infección intraperitoneal ("IP") con la cepa K454 de
N. meningitidis mediante la utilización de células completas
de N. lactamica y fracciones de la membrana externa;
la Figura 2A presenta la protección de ratones
contra la infección por IP con la cepa K454 de N.
meningitidis mediante la utilización de detergente y extractos
de peso molecular alto, medio y bajo de células de N.
lactamica (panel superior = prueba de provocación con 2 \times
10^{7} CFU, panel inferior = prueba de provocación con 6 \times
10^{8} CFU);
la Fig. 2B presenta los componentes de las
fracciones de peso molecular alto, medio y bajo de la fig. 2A;
la Fig. 3 presenta una
inmunoelectrotransferencia que ilustra la reacción cruzada de
anticuerpos en el suero de pacientes con enfermedad meningocócica
con proteínas de N. lactamica.
La Fig. 4 presenta una fotografía de un gel en
el que se han introducido subfracciones del extracto de la proteína
de la membrana externa de bajo peso molecular; y
la Fig. 5 presenta la protección de ratones
contra la infección por IP con la cepa K454 de N.
meningitidis cuando se inmunizan con subfracciones de peso
molecular bajo (panel superior = prueba de provocación con 5
\times 10^{6} CFU, panel inferior = prueba de provocación con 1
\times 10^{8} CFU).
La Fig. 6 presenta un histograma que compara la
fluorescencia de la NRL 32165 de N. cinerea que contiene
pJSK411 (GFP sin activador) con pJSK422 (pJSK411 con activador
groEL/ES).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se cultivó la cepa Y92-1009 de
Neisseria lactamica en caldo de cultivo Mueller Hinton (MHB)
que contenía 5 \mugml^{-1} de
etilendiamin-di(ácido
o-hidroxifenil-acético) (EDDHA), se
incuba a 37ºC con agitación (140 rpm) durante aproximadamente 6
h.
Se recogieron a continuación las bacterias por
centrifugación y se volvieron a poner en suspensión en solución
salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía formaldehído al 1%
(v/v) y tiomersal al 0,1% (p/v) y se dejó reposar durante la noche
entre 2 y 8ºC. Las células muertas se volvieron a poner en
suspensión a continuación en PBS hasta una D.O._{650} de 1,0
(equivalente a 2 \times 10^{9} CFUml^{-1}) y se añadió
alhidrogel hasta el 25% (V/V), proporcionando un producto adecuado
para la administración subcutánea.
Este método es adecuado también para N.
cinerea, N. elongata, N. flavescens, N. polysaccharea, N. sicca
y N. subflava.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
La cepa Y92-1009 de N.
lactamica se cultivó en MHB con y sin la adición de 5
\mugml^{-1} de EDDHA durante la noche a 37ºC con agitación. Las
células limitadas en hierro (con EDDHA) y repletas de hierro se
trataron a continuación por separado. Se recogieron bacterias de 1,5
litros por centrifugación y se volvieron a poner en suspensión en
20 ml de acetato de litio 200 mM, EDTA 5 mM, pH 6,0 y se incubó
durante 3 h a 37ºC con agitación. Las bacterias se atenuaron a
continuación 7 veces mediante una aguja de calibre 21 y se
centrifugaron a 8.000 g durante 10 min.
Se recuperó el sobrenadante y se sedimentaron
las membranas por centrifugación a 100.000 g durante 1 h a 4ºC. Se
volvieron a poner en suspensión a continuación las membranas en
HEPES 10 mM, pH 7,4, que contenía PMSF 10 mM al 0,1% (v/v),
proporcionando preparaciones para vacunación que contienen OM. Se
determinó el contenido en proteínas de las preparaciones de vacuna
OM utilizando el ensayo del ácido bicinconínico (Sigma, R.U.). Se
diluyeron las OM en agua desionizada estéril para dar una
concentración proteica de 100 \mugml^{-1}. Esto se mezcló a
continuación con un volumen igual de adyuvante de Freund, para dar
una concentración en proteína final de 50 \mugml^{-1} y se
emulsionó intensamente. Se utilizó adyuvante completo de Freund para
la dosis primaria e incompleto de Freund para los refuerzos
posteriores.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se llevó a cabo la purificación de LOS de la
cepa Y92-1009 de N. lactamica utilizando el
método de Gu, X-X y Tsai, C.M. (1991) Anal.
Biochem. 196; 311-318. Se preparó la
vacuna utilizando adyuvante de Freund como anteriormente con LOS a
una concentración final de 10 \mugml^{-1}.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se vacunaron grupos de 5 ratones con una
preparación como la siguiente:
- Cebador:-
- Día 0
- Primer refuerzo:-
- Día 21
- Segundo refuerzo:-
- Día 28
Los ratones vacunados con células muertas del
Ejemplo 1 recibieron 0,5 ml por vía subcutánea, equivalente a 1
\times 10^{9} CFU. Los ratones vacunados con OM del Ejemplo 2 y
LOS del Ejemplo 3 recibieron 0,2 ml por vía subcutánea; equivalente
a 10 \mug de proteína y 2 \mug de LOS.
El día 35, los ratones se sometieron a la prueba
de provocación mediante inyección intraperitoneal con
aproximadamente 10^{8} CFU de K454 de N. meningitidis
preparada en MHB que contenía transferrina a una concentración
final de 20 mg/ml. Se examinaron a continuación los ratones y se
anotaron el número de supervivientes y los resultados se presentan
en la fig. 1. Después de 4 días los 5 ratones sobrevivieron en los
grupos vacunados con células completas y las OMP (sin hierro) y 3
sobre-vivieron en el grupo vacunado con las OMP (con
hierro). Después de 5 días todos los miembros del grupo de
referencia y del grupo vacunado con LOS (LPS marcada en la figura)
habían muerto.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Se inocularon placas de
agar-agar con infusión
cerebro-corazón con 50 \mul de cepa
Y92-1009 de N. lactamica y se incubaron
durante la noche a 37ºC, con 5% de CO_{2}. Esto se utilizó para
inocular un cultivo de partida de 100 ml de MHB que se incubó en
agitación a 37ºC durante 6 h. El cultivo de partida (15 ml) se
añadió a cada uno de los volúmenes de 6\times500 ml de MHB. Éstos
se incubaron a continuación en agitación durante la noche a 37ºC y
se pusieron las condiciones de hierro limitado mediante la adición
de 5 \mugml^{-1} de EDDHA. Se recogieron las células por
centrifugación y se descartó el sobrenadante. Se lavaron las células
con 100 ml de PBS y a continuación se sedimentaron por
centrifugación. Los sedimentos celulares se volvieron a poner en
suspensión en PBS + 0,3% (v/v) de Elugent (Calbiochem, 2 ml por g de
peso en húmedo) y se incubaron en agitación a 37ºC durante 20 min.
Se separaron a continuación las células por centrifugación y se
descartó el sedimento. Se añadieron a continuación EDTA y
N-lauroíl sarcosina al sobrenadante hata 10 mM y
0,5% (p/v) respectivamente.
Se utilizó a continuación la Prep Cell de BioRad
(marca comercial registrada), modelo 491, para separar las
proteínas contenidas en el extracto en detergente. Se fundieron 4 cm
de acrilamida natural al 7% que se redisuelve en gel con 2 cm de
gel pegajoso. Se sometieron a electroforesis 12 mg de proteína en
una muestra de tampón natural utilizando tampón corriente que
contenía 0,1% (p/v) de SDS, Tris 0,025 M y glicina 0,192 M a 40
mA y 400 V hasta que el frente colorante alcanzó el fondo del gel.
Se recogieron a continuación 3 ml de fracciones de las proteínas
eluidas. Una vez recogidas las fracciones se agruparon en grupos
consistentes en proteínas de peso molecular aproximadamente
inferior a 40 kDa, entre 40 y 67 kDa y más de 67 kDa. Se
concentraron las proteínas agrupadas por precipitación en sulfato
amónico y se dializaron frente a PBS. Éstas se diluyeron en PBS a
una concentración de proteína de 100 \mug/ml y se añadio adyuvante
completo de Freund en una proporción de 1:1 (v/v) de adyuvante
incompleto de Freund para dosis de refuerzo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Se vacunaron grupos de 5 ratones con cada
preparación de la forma siguiente:
- Cebador:-
- Día 0
- Primer cebador:-
- Día 21
- Segundo cebador:-
- Día 28
Se vacunaron los ratones con pseudovacuna (es
decir, grupo de referencia), extracto de Elugent ("marca comercial
registrada") o una fracción de peso molecular alto, medio y
bajo. Los ratones que recibieron los grupos de fracción proteica
recibieron 0,2 ml por vía subcutánea; equivalente a 10 \mug de
proteína.
El día 35, los ratones se sometieron a la prueba
de provocación por inyección intraperitoneal con aproximadamente 2
\times 10^{7} ó 6 \times 10^{8} CFU de K454 de N.
meningitidis preparada en MHB que contiene transferrina a una
concentración final de 20 mg/ml. Se examinaron a continuación los
ratones durante cuatro días, se anotó el número de supervivientes y
los resultados se presentan en la fig. 2A (panel superior prueba de
provocación con 2 \times 10^{7} y panel inferior prueba de
provocación con 6 \times 10^{8}). Los componentes
de las fracciones de peso molecular alto, medio y bajo se presentan
en la fig. 2B, después de administrar un gel de
SDS-PAGE.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Se investigaron muestras de sueros humano
después de enfermedad meningocócica y éstas demostraron que se
producían anticuerpos que reaccionan con una gama de proteínas de
N. lactamica. En la fig. 3 se presentan los resultados de la
inmunoelectrotransferencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
Debido al nivel de protección ofrecido por el
grupo de bajo peso molecular en el Ejemplo 6 (véase Fig. 2A), la
separación adicional de estas proteínas se llevó a cabo, según el
método del Ejemplo 5, para caracterizar más los componentes
responsables de la protección. Se agruparon las proteínas en tres
grupos consistentes en <25 kDa (g1), 25-35 kDa
(g2) y 35-43 kDa (g3) (mostrado en la Fig. 4). La
determinación de las concentraciones de lipopolisacárido (LPS)
pusieron de manifiesto grandes concentraciones de LPS en la fracción
g1 [26.580 unidades de endotoxina por ml (UE ml^{-1})] y
concentraciones considerablemente menores en las restantes
fracciones (9.149 UE ml^{-1} en g2 y 9.348 UE ml^{-1} en
g3).
Como en los ejemplos anteriores, se inmunizaron
los grupos de cinco ratones, utilizando un programa de tres dosis
con uno de los tres grupos de proteínas descritos anteriormente,
proteína >43 kDa y extracto de detergente de células de N.
lactamica completas muertas y de N. lactamica completas
muertas. Los animales se sometieron a la prueba de provocación con
el serogrupo B de N. meningitidis, cepa K454, a una dosis de
5 \times 10^{6} o 1 \times 10^{8} CFU, junto con las
referencias no inmunizadas. En la Fig. 5 se presenta el número de
supervivientes en cada día después de la prueba de provocación.
\newpage
Todos los ratones aparte de los del grupo de
referencia y un ratón en el grupo g3, sobrevivieron a la dosis
inferior de la prueba de provocación; sin embargo, a la dosis de la
prueba de provocación mayor los grupos de proteína g2 y g3
(25-35 kDa y 35-43 kDa
respectivamente), ofrecieron mejor protección.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
El gen que codifica la proteína de la
nucleocápside del virus del sarampión se clonó en el vector
lanzadera pMGC18.1 (Webb et al., 1998, circular en la
11^{th} International Pathogenic Neisseria Conference, Niza) y se
transformó en DH5alfa de E. coli. La expresión de la proteína
de la nucleocápside del virus del sarampión se confirmó por
transferencia Western probada con antisuero específico. Este montaje
se utilizó a continuación para transformar N. lactamica por
conjugación. La expresión de la proteína de la nucleocápside del
virus del sarampión se colocó bajo el control del activador
frpC neisseriano y se observó la expresión a altas
concentraciones cuando las bacterias se cultivaron en condiciones de
crecimiento con hierro limitado.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
Se insertó el gen de la proteína verde
fluorescente (GFP) de Aequorea victoria en el plásmido
pJSK422 utilizando técnicas de clonación habituales. La GFP estaba
bajo el control del activador groES/EL. Como referencia negativa el
gen de GFP se insertó también en el plásmido pJSK411 que carece del
activador groES/EL del plásmido pJSK422.
N. cinerea se transformó por conjugación
(véase el Ejemplo 9) con los plásmidos que contienen GFP pJSK422 o
pJSK411 (referencia negativa). Las células transformadas se
cultivaron en condiciones apropiadas. Se compararon la
fluorescencia de los cultivos transformados por pJSK422 de N.
cinerea con la de los cultivos transformados por pJSK411. Los
resultados de la comparación se presentan en la Fig. 6. El
histograma presenta la intensidad de la fluorescencia de GFP en el
eje X y el número de células fluorescentes en el eje Y. Es evidente
que el nivel de fluorescencia es mayor en la N. cinerea
transformada con pJSK422 que la transformada con pJSK411, indicado
por el desplazamiento del pico a la derecha. Esto demuestra la
expresión heteróloga del gen GFP en la N. cinerea
comensal.
Claims (22)
1. Una composición de vacuna que comprende una
Neisseria comensal o una de sus preparaciones de la membrana
externa,en la que dicha Neisseria comensal se selecciona del
grupo consistente en N. lactamica, N. cinerea, N. elongata, N.
flavescens, N. polysaccharea, N. sicca y N. subflava.
2. Una composición de vacuna según la
reivindicación 1 que comprende Neisseria muerta.
3. Una composición de vacuna según la
reivindicación 2,en la que la N. lactamica muerta se
obtiene poniendo en suspensión N. lactamica en una mezcla de
agentes bactericidas.
4. Una composición de vacuna según la
reivindicación 1 que comprende N. lactamica viva.
5. Una composición de vacuna según la
reivindicación 1, en la que Neisseria es N.
lactamica.
6. Una composición de vacuna según la
reivindicación 1, en la que dicha preparación de la membrana externa
comprende vesículas de la membrana externa.
7. Un método de preparación de una composición
de vacuna que comprende:
- a)
- obtener una Neisseria comensal o una de sus preparaciones de la membrana externa; y
- b)
- combinar dicha Neisseria comensal o una preparación de la membrana externa con un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que dicha Neisseria comensal se selecciona del grupo consistente en N. lactamica, N. cinerea, N. elongata, N. flavescens, N. polysaccharea, N. sicca y N. subflava.
8. Un método según la reivindicación 7, en el
que dicha preparación de la membrana externa comprende vesículas de
la membrana externa.
9. Un método según la reivindicación 7, en el
que Neisseria es N. lactamica.
10. Una composición de vacuna según las
reivindicaciones 1 a 6 o un método según cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 9, en los que dicha Neisseria o una
preparación de la membrana externa de la misma comprende un producto
génico heterólogo.
11. Una composición de vacuna o un método según
la reivindicación 10, en los que la Neisseria comensal
expresa un gen de una Neisseria patógena.
12. Una composición de vacuna o un método según
la reivindicación 11, en los que dicha Neisseria patógena es
N. meningitidis.
13. Una composición de vacuna o un método según
la reivindicación 12, en los que la Neisseria comensal
expresa un gen que codifica una proteína de N. meningitidis
seleccionada del grupo consistente en una proteína de fijación a la
transferrina; una Cu, Zn-SOD; un NspA; una porina y
una proteína de la membrana externa.
14. Una composición de vacuna según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 6 o 10 a 13 o un método según cualquiera
de las reivindicaciones 7 a 9, en los que dicha Neisseria
comensal está modificada o atenuada a fin de diferenciarse de la
especie natural.
15. Una composición de vacuna que comprende una
composición según cualquier de las reivindicaciones 1 a 6 o 10 a 14
más un vehículo farmacéuticamente aceptable.
16. Una composición de vacuna según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 6 o 10 a 15, que comprende además un
producto génico heterólogo a dicha Neisseria.
17. Una composición de vacuna según la
reivindicación 16, en la que el producto génico heterólogo se
combina físicamente con dicha Neisseria comensal.
18. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 9, que comprende:
- a)
- insertar un gen que codifica un producto génico heterólogo en un vector de expresión;
- b)
- transformar dicho vector de expresión en una Neisseria comensal de modo que dicho producto génico heterólogo se expresa en dicha Neisseria; y
- c)
- combinar la Neisseria de (b) o una preparación de la membrana externa con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
19. Utilización de una composición según
cualquier de las reivindicaciones 6 o 10 a 17 para la preparación
de un medicamento destinado a la vacunación contra la infección por
Neisseria.
20. Utilización según la reivindicación 19, en
la que dicha infección por Neisseria es una infección
meningocócica.
21. Utilización según la reivindicación 19 o 20,
en la que dicha composición comprende una Neisseria que
comprende un producto génico heterólogo.
22. Utilización según la cualquiera de las
reivindicaciones 19 a 21, en la que el medicamento es para
administración por vía oral, intravenosa, subcutánea,
intraperitoneal, intramuscular o intradérmica.
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