CN101031647B

CN101031647B - 在大肠杆菌中制备猪丹毒杆菌表面保护性抗原变体的方法

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Publication number: CN101031647B
Application number: CN2005800135953A
Authority: CN
Inventors: 牛岛稔大; 坂口正士; 德永英治
Original assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Current assignee: Meiji Animal Health Co ltd
Priority date: 2004-02-27
Filing date: 2005-02-08
Publication date: 2010-12-29
Anticipated expiration: 2025-02-08
Also published as: US8361749B2; ES2367128T3; ATE513909T1; EP1724342A4; US8277820B2; JPWO2005083072A1; US20080286309A1; EP1724342B1; EP1724342A1; US20110059021A1; DK1724342T3; JP4755977B2; WO2005083072A1; CN101031647A

Abstract

提供了一种防止猪丹毒杆菌感染的猪丹毒杆菌表面保护性抗原SpaA蛋白或其中SpaA蛋白被除去一部分后得到的缩短型SpaA蛋白(ΔSpaA)的变体及其制备方法。在SpaA蛋白或SpaA蛋白的氨基酸序列的特定位点上引入氨基酸取代得到具有免疫原性，以包涵体形式在大肠杆菌中表达的SpaA蛋白或SpaA蛋白变体。由于本发明SpaA蛋白或SpaA蛋白变体以包涵体形式在大肠杆菌中表达，可容易地回收和纯化。

Description

在大肠杆菌中制备猪丹毒杆菌表面保护性抗原变体的方法

技术领域

本发明涉及一种以大肠杆菌(Escherichia coli)为宿主，制备猪丹毒杆菌表面保护性抗原(以下也称为“SpaA”)变体的方法。更具体地，本发明涉及一种通过引入氨基酸取代制备SpaA变体或SpaA去除一部分后得到的缩短型SpaA(以下也称为“ΔSpaA”)变体的方法，其中所述变体在大肠杆菌细胞内表达时，可以不溶性包涵体形式表达；以及涉及用该方法得到的重组SpaA或ΔSpaA蛋白的变体。

背景技术

猪丹毒是由感染猪丹毒杆菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)引起的猪病，被感染的猪呈现急性败血症、亚急性荨麻疹或慢性心内膜炎和关节炎等症状。据报道，每年约有3,000头猪患病，给畜牧业者造成巨大损失。除了猪以外，猪丹毒杆菌对野猪、鲸、鸡和火鸡等食用动物具有致病性，是家畜疾病预防法指定的监控性传染病之一。猪丹毒也是导致人类丹毒的动物传染病，是肉类卫生学重视的疾病。猪丹毒杆菌有多种血清型，大多数猪丹毒由其中的血清型1和2引起。

为防止猪丹毒传染，到目前为止已采用减毒活疫苗(即，由小金井菌株制备的冻干活疫苗，小金井菌株是猪丹毒杆菌减毒株，由猪丹毒杆菌强毒株在添加了吖啶黄素的培养基中长期继代培养制得)；灭活疫苗(即，用福尔马林处理猪丹毒杆菌强毒株的培养菌液，用氢氧化铝凝胶吸收全细胞和胞外产物所制备的菌苗)和成分疫苗(即，含有少许用碱的水溶液从全细胞中萃取得到的非纯化细胞表面蛋白的成分疫苗)。由于只需一次性少量接种就能起效，因此减毒活疫苗被认为是十分经济的。但是，它们也存在问题，因为它们是诱发小鼠关节炎的病原；对猪存在严重的副作用，产生抗体水平低的猪或无特定病原猪；从患有猪丹毒的猪的病灶中分离到疫苗株。

作为一种新型疫苗，人们正在利用基因重组技术对重组疫苗进行研究与开发。Galan和Timony用表达猪丹毒杆菌基因组的一部分基因的重组噬菌体转染大肠杆菌，用其裂解物对小鼠进行免疫，并用猪丹毒杆菌进行攻击试验，观察到免疫小鼠中有14-17％逃脱了感染后死亡。另外，他们指出，根据与抗裂解物的免疫血清的反应性，被这些基因编码的蛋白质是分子量为66、64和43Kda的蛋白质，并指出这些蛋白质可以成为抗猪丹毒杆菌感染的保护性抗原(例如，见非专利文献1)。

Makino等使编码分子量为64Kda的来自2型猪丹毒杆菌多摩96菌株的表面蛋白(称为“SpaA”)的基因在大肠杆菌中表达，用所得到的重组大肠杆菌的活细胞对小鼠进行免疫，并用猪丹毒杆菌进行攻击试验以说明SpaA蛋白具有抗感染的保护活性。他们还揭示SpaA蛋白具有606个氨基酸残基的序列，其中N末端为由29个氨基酸组成的信号肽，C末端为8个重复同源序列，除第8个重复序列由19个氨基酸组成外，每个重复序列由20氨基酸组成(例如，见非专利文献2)。

Imada等对与上述SpaA蛋白相当的来自1型菌藤泽菌株的SpaA蛋白以及编码该蛋白质的基因进行了研究，发现来自1型菌藤泽菌株的SpaA蛋白的分子量为69Kda，具有626个氨基酸残基的序列，与2型菌的SpaA蛋白相比，该序列C末端的重复同源序列多一个，即为9个，其中第9个重复序列由19个氨基酸组成。他们指出，由全长SpaA、除去C末端的重复同源序列的SpaA或除去N末端的一部分和C末端的重复同源序列的SpaA与组氨酸六聚体形成的融合蛋白呈现抵御感染的效果(例如，见非专利文献3和4)。

Watanabe等也报道了通过除去猪丹毒杆菌的SpaA蛋白C末端的重复同源序列和N末端的分泌信号序列制得的46.5kDa的多肽是抗感染的保护性抗原(46.5kDa保护性抗原；称为“46.5KPA”)(例如，见专利文献1)。

另一方面，对于提高疫苗候选蛋白质生产率方面，已开展研究。例如，有报道称以短芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)为宿主细胞，能成功地分泌表达46.5KPA到菌胞外(例如，见专利文献2)。在这种表达系统下，表达的蛋白质中约有50％因在培养液中凝集而呈不溶性。根据该报道，该不溶性46.5KPA的纯化操作为：用超滤膜过滤培养液，将膜上回收的不可溶物质悬浮于碱溶液中，回收溶解的46.5KPA。这样，该纯化操作至少需要三个步骤：(1)在中性至弱碱性条件下(pH7-9.5)，通过超滤进行浓缩；(2)在强碱性条件下(pH10.0-12.0)，通过超滤回收过滤级份(filteration fraction)；和(3)用离子交换层析纯化超滤分数。

当SpaA基因在大肠杆菌中表达时，大部分蛋白质以可溶性蛋白的形式表达，因此可能不适用上述不溶性物质的纯化方法。除了目标SpaA蛋白以外，培养液中可能还含有各种污染物，如大肠杆菌的细胞碎屑、培养基的成分、培养过程中产生的代谢产物等。不容易从这种含多种污染物的混合物中有效地回收和纯化所要的可溶性SpaA蛋白。一般地，动物用疫苗不同于人用疫苗，除非价廉质优且高纯度，很难被畜牧业者接受。因此，常常要求动物用疫苗的生产商改进大规模处理的生产方法和回收及纯化方法，降低生产成本。

专利文献1：日本公开专利No.2000-279179

专利文献2：日本公开专利No.2002-34568

非专利文献1：Garan，J.E.et al.，(1990)Infect.Immun.，58.p.3116-3121

非专利文献2：Makino，S.et al.，(1998)Microb.Pathog.25，p.101-109

非专利文献3：Imada，Y.et al.(1999)Proc.Jpn.Pig.Vet.Soc.34，p.12-

非专利文献4：Imada，Y.et al.(1999)Infect.Immun.67(9)，p.4376-4382

发明内容

(本发明要解决的技术问题)

如上所述，当来自猪丹毒杆菌的SpaA基因在大肠杆菌或短芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)宿主中表达时，蛋白质以可溶性SpaA蛋白或可溶性蛋白与不溶性蛋白的混合物的形式表达，这使得其制备方法麻烦，无法预期高产率。

鉴于上述技术或工业背景的必要性，实现本发明。因此本发明的一个目的是提供一种制备SpaA或SpaA除去一部分后得到的缩短型SpaA(ΔSpaA)的方法，它包括在SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的氨基酸序列中引入氨基酸取代，从而使本身可溶的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白可以包涵体的形式在大肠杆菌细胞中表达，以及回收和纯化包涵体。

本发明的另一个目的是提供一种由所述方法得到的高纯度的重组SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白。

(解决问题的手段)

为达到上述目的，本发明人进行了勤勉的研究，结果发现在表达SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的大肠杆菌细胞内存在着可形成不溶性包涵体的克隆；在形成包涵体的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的氨基酸序列的特定位置上发生了氨基酸取代；人为引入该氨基酸取代可使可溶性SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白以包涵体的形式在菌胞内蓄积。此外，本发明人发现可溶性SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白即使在形成包涵体后仍保持免疫原性，从而完成本发明。例如，当来自SE-9菌株的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的第69位氨基酸被甘氨酸取代；第214位氨基酸被谷氨酰胺取代；第278位氨基酸被甘氨酸取代；第531位氨基酸被甘氨酸取代；第154位和第203位氨基酸分别被甘氨酸和苏氨酸取代；第214位和第253位氨基酸分别被谷氨酰胺和苏氨酸取代；或第69位、第154位和第203位氨基酸分别被甘氨酸、甘氨酸和苏氨酸取代时可形成包涵体。

一般地，本发明提供一种制备猪丹毒杆菌表面保护性抗原SpaA蛋白或其中SpaA蛋白被除去一部分后得到的缩短型SpaA(ΔSpaA)的变体的方法，该变体具有免疫原性，以包涵体形式在大肠杆菌中表达，该方法包括使编码该SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的基因发生突变，以便在该SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的氨基酸序列中引入氨基酸取代；让所得到的突变基因在大肠杆菌中表达；从所表达的变体中挑选形成包涵体的变体。因此本发明方法的特征在于，通过氨基酸取代制备能以不溶性包涵体形式表达的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白变体，使因本身的可溶性质而难以回收和纯化的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白能以不溶性包涵体的形式在大肠杆菌中表达，从而使该蛋白质的回收和纯化容易化。

一种实施方式下，本发明方法包括下列(A)到(D)步骤：

(A)在编码可溶性猪丹毒杆菌表面保护性抗原SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的基因中引入突变，以便引入氨基酸取代；

(B)用含有所得到的突变基因的表达载体转化大肠杆菌细胞；

(C)从上述转化的大肠杆菌细胞中挑选形成不溶性包涵体的大肠杆菌细胞；和

(D)培养所挑选的大肠杆菌细胞，回收细胞内的包涵体。

为了证实用本发明方法得到的重组SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的变体保留抗猪丹毒杆菌感染的保护活性(免疫原性)，可进一步对变体进行下列(E)-(F)步骤：

(E)给猪丹毒杆菌易感动物施用包涵体或用增溶剂处理的包涵体，然后用猪丹毒杆菌的强毒株攻击该动物；和

(F)观察该猪丹毒杆菌易感动物的存活率或死亡率，从而评判是否具有抗猪丹毒杆菌感染的保护活性(免疫原性)。

本发明方法的特征在于本来可溶性的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白转变成能以不溶性包涵体形式在大肠杆菌中表达的变体，从而使该蛋白质的回收和纯化容易化。根据本发明方法，为使SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白表达为不溶性包涵体，使编码SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的基因发生突变从而可在该SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的氨基酸序列中引入氨基酸取代。在这种用引入氨基酸取代制备的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的变体中包含那些可以通过形成包涵体得到表达的变体，然后将它们挑选出来。因此，只要能产生以形成包涵体进行表达的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的变体，编码SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的基因所发生的突变或该SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的氨基酸序列发生的氨基酸取代可以是任何突变或氨基酸取代。

一个这种氨基酸取代的例子包括选自下述(1)-(7)中的一种或多于一种的组合：

(1)含有信号序列的N末端起第69位氨基酸被甘氨酸取代；

(2)含有信号序列的N末端起第154位氨基酸被甘氨酸取代；

(3)含有信号序列的N末端起第203位氨基酸被苏氨酸取代；

(4)含有信号序列的N末端起第214位氨基酸被谷氨酰胺取代；

(5)含有信号序列的N末端起第253位氨基酸被苏氨酸取代；

(6)含有信号序列的N末端起第278位氨基酸被甘氨酸取代；和

(7)含有信号序列的N末端起第531位氨基酸被甘氨酸取代；

这种氨基酸取代的另一位例子包括：含有信号序列的N末端起第154位和第203位氨基酸分别被甘氨酸和苏氨酸取代；含有信号序列的N末端起第214位和第253位氨基酸分别被谷氨酰胺和苏氨酸取代；含有信号序列的N末端起第69位、第154位和第203位氨基酸分别被甘氨酸、甘氨酸和苏氨酸取代。

SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的氨基酸序列可以为SEQ ID NO：2所述序列或除去C末端的SEQ ID NO：2所述序列，该序列中可引入所需要的氨基酸取代，尤其是引入上述氨基酸取代。

另一个实施方式中，本发明提供了一种具有免疫原性，以包涵体形式在大肠杆菌中表达的猪丹毒杆菌表面保护性抗原SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的变体。本发明SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的变体优选由本文记载的方法制备。术语“猪丹毒杆菌表面保护性抗原SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的变体”在这里指通过特定的氨基酸取代，由可溶性猪丹毒杆菌表面保护性抗原SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白突变得到的不溶性蛋白质。术语“免疫原性”或“免疫原性的”指诱导产生保护性抗体的能力或防止感染猪丹毒杆菌的能力。

又一个实施方式中，本发明提供一种含有本发明猪丹毒杆菌表面保护性抗原SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的变体作为活性成分的组合物。所述组合物中含有的本发明SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的变体优选用本文描述的方法制备。

再一个实施方式中，本发明提供一种编码具有免疫原性，以包涵体形式在大肠杆菌中表达的猪丹毒杆菌表面保护性抗原SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的变体的基因。本发明编码SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的变体的基因优选用本文描述的方法制备。与编码SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的基因相比，本发明编码SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的变体的基因包括至少一个核苷酸取代。然而，所述至少一个核苷酸取代不应该为沉默突变，而必须在SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白中引起至少一个氨基酸取代(点突变)。

本发明编码SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的变体的基因的一个例子包括一种核苷酸序列或除去一部分3’末端的核苷酸序列，它包括在SEQID NO：1中发生选自下述(1)-(7)中的一种或多于一种的组合的核苷酸取代：

(1)SEQ ID NO：1所述核苷酸序列中第206位核苷酸为G；

(2)SEQ ID NO：1所述核苷酸序列中第461位核苷酸为G；

(3)SEQ ID NO：1所述核苷酸序列中第608位核苷酸为C；

(4)SEQ ID NO：1所述核苷酸序列中第642位核苷酸为G；

(5)SEQ ID NO：1所述核苷酸序列中第758位核苷酸为C；

(6)SEQ ID NO：1所述核苷酸序列中第833位核苷酸为G；和

(7)SEQ ID NO：1所述核苷酸序列中第1591位核苷酸为G。

本发明编码SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的变体的基因的另一个例子包括一种核苷酸序列或除去一部分3’末端的核苷酸序列，它包括在SEQ ID NO：1中发生选自下述(a)-(h)中的任何一种核苷酸取代：

(a)SEQ ID NO：1所述核苷酸序列中第206位核苷酸为G；

(b)SEQ ID NO：1所述核苷酸序列中第608位核苷酸为C；

(c)SEQ ID NO：1所述核苷酸序列中第642位核苷酸为G；

(d)SEQ ID NO：1所述核苷酸序列中第833位核苷酸为G；

(e)SEQ ID NO：1所述核苷酸序列中第1591位核苷酸为G；

(f)SEQ ID NO：1所述核苷酸序列中第461位和第608位核苷酸分别为G和C；

(g)SEQ ID NO：1所述核苷酸序列中第642位和第758位核苷酸分别为G和C；以及

(h)SEQ ID NO：1所述核苷酸序列中第206位、第461位和第608位核苷酸分别为G、G和C。

另一个实施方式中，本发明提供一种用本发明猪丹毒杆菌表面保护性抗原SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的变体作为猪丹毒疫苗的方法。该方法所用的本发明SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的变体优选用本文描述的方法制备。

制备本发明猪丹毒杆菌表面保护性抗原SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的变体所使用的猪丹毒杆菌的例子包括藤泽菌株、小金井菌株等1型菌，多摩96菌株、SE-9菌株或静冈63菌株等2型菌，但来自猪丹毒杆菌的任何菌株的SpaA基因都可用于本发明。

(有益效果)

本发明提供了一种将可溶性SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白以不溶性包涵体的形式在大肠杆菌中表达的方法。以包涵体形式在大肠杆菌中表达使得仅仅通过离心和洗涤操作就可以简单地纯化得到高纯度的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白。这样得到的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的包涵体在溶解后，具有足够的纯度和免疫原性，只要经过稀释就能用作疫苗。因此提供了一种简单而有效的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白疫苗的制备方法。与以猪丹毒杆菌为起始材料制备灭活疫苗或成分疫苗的方法相比，用本方法得到的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白能降低人感染猪丹毒杆菌的机会。本发明还避免了猪丹毒杆菌恢复病原性以及出现抗体滴度低的猪或无特定病原猪等严重副作用问题。

附图的简单说明

图1表示SpaA蛋白及ΔSpaA蛋白的表达载体。a：插入了编码来自猪丹毒杆菌SE-9菌株的SpaA蛋白的基因的质粒pET11d/SpaA。b：插入了编码ΔSpaA蛋白的基因的质粒pET11d/ΔSpaA。

图2A表示来自猪丹毒杆菌SE-9菌株的SpaA蛋白和ΔSpaA蛋白的SDS-PAGE电泳结果。M：标记；电泳泳道1：不表达外源蛋白的大肠杆菌培养菌液；电泳泳道2：表达SpaA蛋白的大肠杆菌培养菌液；电泳泳道3：表达ΔSpaA蛋白的大肠杆菌培养菌液。

图2B表示来自猪丹毒杆菌的ΔSpaA蛋白的SDS-PAGE电泳结果。M：标记；电泳泳道1：不表达外源蛋白的大肠杆菌培养菌液；电泳泳道2：表达来自藤泽菌株的ΔSpaA蛋白的大肠杆菌培养菌液；电泳泳道3：表达来自多摩96菌株的ΔSpaA蛋白的大肠杆菌培养菌液；电泳泳道4：表达来自小金井菌株的ΔSpaA蛋白的大肠杆菌培养菌液；电泳泳道5：表达来自SE-9菌株的ΔSpaA蛋白的大肠杆菌培养菌液。

图3表示来自猪丹毒杆菌SE-9菌株的可溶性及不溶性(包涵体)ΔSpaA蛋白的SDS-PAGE电泳结果。M：标记；电泳泳道1：超声处理的表达可溶性ΔSpaA蛋白的大肠杆菌培养菌液的离心上清液；电泳泳道2：超声处理的表达可溶性ΔSpaA蛋白的大肠杆菌培养菌液的离心沉淀物；电泳泳道3：超声处理的表达不溶性ΔSpaA蛋白的大肠杆菌培养菌液的离心上清液；电泳泳道4：超声处理的表达不溶性ΔSpaA蛋白的大肠杆菌培养菌液的离心沉淀物。

图4A表示与SEQ ID NO：7相比，从表达不溶性(包涵体)ΔSpaA蛋白的大肠杆菌转化细胞(三个克隆，No.1、No.2和No.3)中提取的质粒中SpaA基因中发现的突变位点和限制性酶切位点。

图4B表示与SEQ ID NO：7相比，从表达不溶性(包涵体)SpaA蛋白的大肠杆菌转化细胞(一个克隆，No.4)中提取的质粒中SpaA基因中发现的突变位点和限制性酶切位点。

图5表示来自猪丹毒杆菌SE-9菌株的可溶性及不溶性(包涵体)SpaA蛋白的SDS-PAGE电泳结果。M：标记；电泳泳道1：超声处理的表达可溶性SpaA蛋白的大肠杆菌培养菌液的离心上清液；电泳泳道2：超声处理的表达可溶性SpaA蛋白的大肠杆菌培养菌液的离心沉淀物；电泳泳道3：超声处理的表达不溶性SpaA蛋白的大肠杆菌培养菌液的离心上清液；电泳泳道4：超声处理的表达不溶性SpaA蛋白的大肠杆菌培养菌液的离心沉淀物。

图6表示经纯化的来自猪丹毒杆菌SE-9菌株的不溶性(包涵体)SpaA蛋白和ΔSpaA蛋白的SDS-PAGE电泳结果。M：标记；电泳泳道1：SpaA蛋白；电泳泳道2：ΔSpaA蛋白。

本发明的最佳实施方式

本发明的特征在于一种用特定的氨基酸取代SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的氨基酸序列中特定位点的氨基酸残基使该蛋白以包涵体的形式在大肠杆菌中表达的方法，以及一种结合本方法制备SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的方法。

(1)克隆编码paA蛋白或ΔSpaA蛋白的基因

对于猪丹毒杆菌，主要有两种血清型对猪呈现强致病性，它们被分类为1型菌和2型菌。1型菌包括藤泽菌株和小金井菌株，而2型菌包括多摩96菌株、SE-9菌株和静冈63菌株。然而来自猪丹毒杆菌任何菌株的SpaA基因都可以用于本发明。可以用市售培养基，按照所附带的说明书增殖这些菌体细胞。例如，将一定量的细胞悬浮于添加了0.1％吐温80的脑心浸液肉汤中，在37℃下培养悬浮液16-48小时。

可以通过PCR方法得到编码SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的基因，PCR的模板为从上述菌胞提取的DNA，引物设计自Imada，Y等(1999)Infect.Immun.67(9)，p.4376-4382描述的序列(SEQ IDNO：1)。SEQ ID NO：1记载了来自藤泽菌株的SpaA基因的全长核苷酸序列，而SEQ ID NO：2记载了来自藤泽菌株的含有信号肽的全长SpaA蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO：7记载了来自SE-9菌株的SpaA基因的全长核苷酸序列的一部分，相当于SEQ ID NO：1中第107位-第1854位核苷酸残基的序列。模板DNA可以用市售的DNA提取试剂盒(例如Isoplant(日本基因有限公司))，按照其附带的说明书进行制备。通过DNA合成承包商(如QIAGEN)的服务，很容易得到PCR引物，根据需要，优选在5’末端附加合适的限制性酶切位点的序列。具体地，可以使用在SEQ ID NO：2中附加NcoI位点或在SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5中附加BamHI位点的合成DNA。SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5所述引物可用于编码SpaA蛋白的DNA片段的扩增，而SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所述引物可用于编码ΔSpaA蛋白的DNA片段的扩增。所得到的编码SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的DNA片段将附加十二个核苷酸，这些核苷酸编码来自限制酶NcoI的Met和C末端的三个氨基酸(Ala-Phe-Ala)。编码ΔSpaA蛋白的DNA片段具有直至第1260位核苷酸的部分SpaA基因，编码除去了C末端207个氨基酸残基的缩短型SpaA蛋白。可以根据实际需要，通过变化引物序列的位置来任意设定SpaA蛋白除去一部分得到的ΔSpaA蛋白的大小和位点。可用市售的LA-Taq试剂盒(宝酒造公司)、Advantage HF-2 PCR试剂盒(BC Bioscience)等，参照所附带的说明进行PCR反应。在用TA克隆试剂盒(Invitrogen)克隆后可以用ABI PRISM310基因分析仪(PEBiosystems)等DNA测序仪确定PCR得到的DNA片段的核苷酸序列。

克隆这样得到的编码SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的基因。具体地，用限制酶NcoI和BamHI消化上述PCR产物，将切下的片段插入预先经相同限制酶消化的合适的质粒(如pET11d(Novagen))中，将所得到的质粒导入大肠杆菌中。在大肠杆菌菌落中挑选具有编码目标蛋白质的DNA的克隆。HB101、JM109、LE392、TB1、BL21等可用作大肠杆菌宿主，优选JM109。基因的导入方法包括电穿孔法、原生质体法、PEG法等，这些技术中任何一种都可以用。目标基因的克隆可以通过质粒纯化和核苷酸序列的确定来证实。基因重组的一系列程序可以按照Sambrook等描述的基因重组的一般技术(分子克隆，实验室手册(第二版)，Cold Spring Harbor Laoratory出版社N.Y.，1989)进行操作。实际上，可以用市售试剂盒，按照其附带的说明书进行操作。

(2)不溶性SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的表达和纯化

通过使编码SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的克隆基因在特定位点上发生点突变将所得到的突变基因导入大肠杆菌，本来可溶性的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白可以不溶性包涵体的形式进行表达。

可用定点诱变法来实施点突变。实际上可以用Takara的定点诱变系统(Mutan-Super Express Km、Mutan-Express Km、Mutan-K等)、Stratagene的QuickChange Multi定点诱变试剂盒或QuickChange XL定点诱变试剂盒或Invitrogen的GeneTailor定点诱变系统等市售试剂盒，按照其附带的说明书进行操作。也可以通过在引入点突变的位置上对适当大小的核酸片段进行取代来产生点突变。

或者，由于在进行正常的PCR时，在扩增的基因中可能会以一定的速度在不特定的位点上发生不特定数目的核苷酸取代，该方法可用于导入核苷酸取代。若取代的核苷酸影响氨基酸密码子，则可能发生氨基酸突变，这样就有可能出现形成包涵体的克隆。挑选这些克隆就可以得到包涵体。

当可溶性SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白发生例如含有信号序列的N末端起第69位氨基酸被甘氨酸取代；第154位氨基酸被甘氨酸取代；第203位氨基酸被苏氨酸取代；第214位氨基酸被谷氨酰胺取代；第253位氨基酸被苏氨酸取代；第278位氨基酸被甘氨酸取代；和/或第531位氨基酸被甘氨酸取代时在大肠杆菌中以包涵体的形式表达。这样SpaA基因发生点突变以便可以发生这些氨基酸取代。通过在上述位点中的至少一个位点上引入氨基酸突变来形成包涵体，但在所得到的突变体保持免疫原性的限度内，有可能在所有这些位点上引入氨基酸突变。优选地，SpaA基因发生点突变，从而SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的第69位氨基酸被甘氨酸取代；第214位氨基酸被谷氨酰胺取代；第278位氨基酸被甘氨酸取代；第531位氨基酸被甘氨酸取代；第154位和第203位氨基酸分别被甘氨酸和苏氨酸取代；第214位和第253位氨基酸分别被谷氨酰胺和苏氨酸取代；或第69位、第154位和第203位氨基酸分别被甘氨酸、甘氨酸和苏氨酸取代。

只要ΔSpaA蛋白保持免疫原性并在引入氨基酸取代时能形成包涵体，并不限制SpaA蛋白除去一部分后得到的ΔSpaA蛋白的区域和大小。本发明可使用除去至少约三分之一SpaA蛋白C末端得到的ΔSpaA蛋白。优选的ΔSpaA蛋白，从具有信号序列的N末端起含有420个氨基酸残基，在C末端除去了207个氨基酸。

或者，采用与上述方法相反的方式进行氨基酸取代有可能使不溶性SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白逆转化成可溶性SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白。因此，利用本发明方法，可以根据实际需要自由地获得可溶性的或不溶性的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白。

可以用上述基因克隆的方法实现编码发生点突变的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的基因表达。表达载体可用市售商品，选择合适的大肠杆菌作为载体。例如BL21(DE3)或DH5α(DE3)可用作具有T7启动子的载体；HB101、DH5α或JM109可用作具有色氨酸启动子的载体。优选将能进行伴随克隆和表达目标蛋白质的pET11d(Novagen)和大肠杆菌BL21菌株结合使用。

可用下述方法筛选表达SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的重组大肠杆菌。在表达诱导剂(对于本发明所用的表达系统，使用IPTG)的存在下，低速离心收集所培养和增殖的细胞，使之悬浮于一定量的蒸馏水中。用超声处理方法或用弗氏细胞压碎器、Manton Galling等匀浆器破碎细胞，高速离心(15,000rpm，15分钟)，从沉淀物中回收包涵体。蒸馏水中可适当添加表面活性剂(如Triton X100)、螯合剂(如EDTA)、溶菌酶等。再次将沉淀物悬浮于适量蒸馏水中，对一定量的悬浮液进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。用考马斯亮兰染色后，通过分子大小和染色影像来证实SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的表达。通过比较上述离心后的上清液和沉淀物中SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的量来确定包涵体的形成量。根据本发明，沉淀物中约能检出90％或以上的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白。除了基于分子大小的方法，诸如ELISA、蛋白质印迹、点印迹等基于抗原-抗体反应的方法也可用于证实(或检测)SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白。这些方法通常用于检测在大肠杆菌中表达的外源蛋白，根据实际需要选择任何一种合适的方法。

可采用日本公开专利No.2002-34568记载的方法或蛋白质化学常用的方法，(如离心、盐析、超滤、等电沉淀、电泳、离子交换层析、亲和层析、疏水层析、羟磷灰石层析或它们的组合方法)纯化来自如此得到的表达SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的大肠杆菌细胞的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白。根据本发明方法，用酶(如溶菌酶)和/或超声波(如声波照射型细胞匀浆器(sound beam type cell homogenizer))处理表达SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的大肠杆菌细胞培养菌液，然后重复离心(如15,000rpm，15分钟)和悬浮于洗涤缓冲液(如20mM Tris-HclpH7.5，10mMEDTA，1％Triton X-100)能得到90％或以上纯度的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白。

(3)SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的免疫原性

可用这样得到的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白对感染了猪丹毒杆菌的小鼠或其它动物进行免疫并用猪丹毒杆菌强毒株对该动物进行攻击试验的方法来确定这些蛋白质的免疫原性。免疫方法(如皮下、肌肉或腹膜内等给药途径、免疫期等)用疫苗免疫原性调查的常用方法来确定。更具体地，用5倍的添加了25％(vol/vol)氢氧化铝凝胶的盐水连续稀释抗原蛋白制成连续稀释液，每一稀释液皮下给予5-10只小鼠(ddy，5周龄，雌性)进行免疫。免疫3周后给小鼠皮内注射红斑丹毒丝菌强毒株藤泽菌株的活细胞，观察10日内小鼠的存活或死亡情况。用半数保护量(PD50)来评判抗原蛋白的免疫效果。

本发明SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白以不溶性形式纯化后可以用尿素、盐酸胍、精氨酸盐酸盐等增溶剂溶解，用膜滤器等无菌过滤，作为原料，制备疫苗以防止野猪、鲸、鸡、火鸡等敏感动物和人感染猪丹毒杆菌或其它病原体。这样制备的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白适当与氢氧化铝、磷酸铝、矿物油或非矿物油等免疫佐剂、聚山梨醇酯80等稳定剂、氨基酸、乳糖或蔗糖等糖、福尔马林、硫柳汞(thimerosal)、2-苯氧基乙醇、苯甲醇、苯索氯铵或苯扎氯铵等防腐剂混合配制成药物组合物。当添加糖(如乳糖或蔗糖)作为有效赋形剂时，还可以配制成冻干制剂。

以下实施例对本发明做更详细说明，但不应理解为限制本发明。在下述实施例中，除非另有说明，采用和光纯药公司、宝酒造公司或Difco公司生产的试剂。

实施例1

(1)编码SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的基因的克隆

在37℃下，用添加了0.1％吐温80的脑心浸液肉汤(Difo)培养猪丹毒杆菌的1型菌藤泽菌株和小金井菌株以及2型菌多摩96菌株和SE-9菌株16-48小时。离心培养菌液(约1.5-3.0mL)，用DNA提取试剂盒(Isoplant，日本基因公司.)从所得到的沉淀物(约0.03g或以上)中提取全基因组DNA。

以该全基因组DNA为模板，使用基于核苷酸序列SEQ ID NO：1制备的合成引物(SEQ ID NO：3和4序列对，SEQ ID NO：3和5序列对)和LAPCR试剂盒(宝酒)进行PCR。反应液在94℃下保持3分钟后，然后以94℃-60秒、56℃-30秒和72℃-60秒进行循环，重复30循环。引物SEQ ID NO：3被设计用于扩增SpaA基因的第79位核苷酸起的下游区域，其5’末端附加了NcoI位点。引物SEQ ID NO：4和5分别被设计用于扩增SpaA基因中直至第1260位核苷酸和直至1881位核苷酸(SpaA基因的终止密码子)的区域，其5’末端附加了BamHI位点。PCR提供了具有第79位到第1881位的核苷酸序列的SpaA基因和具有第79位-第1260位的核苷酸序列的ΔSpaA基因。

用NcoI和BamHI双重消化PCR扩增的DNA片段，用T4DNA连接酶将所得到的消化产物与预先经NcoI和BamHI双重消化的质粒pET11d(novagen)连接。该反应液与大肠杆菌JM109混合。混合物在冰上放置数十秒后涂布在添加了50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂(1.0％胰蛋白冻、0.5％酵母提取物、1.0％NaCl、1.5％琼脂，pH7.0)上，37℃放置过夜。在1-5mL添加了50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中接种单个菌落，在30-37℃下振荡培养基后用常规方法从菌胞中提取含有编码SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的基因的质粒(图1-a和1-b)。

(2)SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的表达

如实施例1-(1)所述方法，将来自各不同菌株的质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)以获得转化体的单个菌落。在1-5mL添加了50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中接种单个菌落，在30-37℃下振荡培养直至培养菌液的OD600nm达到0.6-1.0。在培养菌液中加入1/100(体积)IPTG(100mM)溶液，继续在37℃下振荡培养2-3小时。将培养液与等体积的2xSDS样品缓冲液混合，100℃加热2分钟后，对混合物进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)并用考马斯亮兰(nacalai tesque)染色。所有的菌株均检测到70-45KD附近的电泳带，其染色影像证实了SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的表达。图2A显示了来自SE-9菌株的SpaA蛋白和ΔSpaA蛋白的SDS-PAGE结果；图2B显示了来自藤泽菌株、多摩96菌株、小金井菌株和SE-9菌株的SpaA蛋白和ΔSpaA蛋白的SDS-PAGE结果。

(3)SpaA蛋白和ΔSpaA蛋白的形状

按下述方法调查是否形成了SpaA蛋白和ΔSpaA蛋白的包涵体。将实施例1-(2)的培养菌液以10,000rpm离心5分钟，在所得到的沉淀物中加入培养菌液体积的1/5-1/10的洗涤缓冲液(20mM Tris-HClpH7.5，10mM EDTA，1％Triton X-100)或蒸馏水，悬浮细胞至均匀。悬浮液中加入1/100体积量的溶菌酶溶液(10mg/ml)，30℃下反应15分钟。冰冷条件下，用轻便超声处理器(生产商：Tomy；型号：UR-20P；输出：5；时间：15秒，2-4次)超声处理混合物，以15,000rpm离心15分钟。回收上清液后，在沉淀物中加入与离心前的超声处理混合物相同体积的洗涤缓冲液，再次悬浮菌胞至均匀。在回收的上清液和沉淀物中各加入等体积的2xSDS样品缓冲液。加热后，对各混合物进行SDS-PAGE并用考马斯亮兰染色。如果在沉淀物悬浮液中发现ΔSpaA蛋白，则判定该ΔSpaA蛋白形成了包涵体(图3)。结果在数个SE-9菌株的克隆中检测到包涵体的形成(表1)。表1表示形成包涵体的克隆数占调查克隆数的比例。ND表示“没有检测”

表1

	形成包涵体的克隆数/表达ΔSpaA蛋白的克隆数	形成包涵体的克隆数/表达SpaA蛋白的克隆数
			藤泽菌株(1型菌)	0/3	ND
SE-9菌株(2型菌)	3/30	1/15
			多摩96菌株(2型菌)	0/3	ND
小金井菌株(1型菌)	0/3	ND

(4)形成包涵体的克隆的核苷酸序列测定

然后，从表1中形成包涵体的SE-9菌株的4个克隆(No.1，No.2，No.3和No.4)中提取质粒，委托TAKARA BIO INC.客服中心分析编码ΔSpaA蛋白的基因的核苷酸序列。与SEQ ID NO：7相比，观察到核苷酸突变引起的氨基酸取代，如表2所示。

表2

核苷酸位置	核苷酸取代(对应的氨基酸取代)	克隆
			第206位	G取代A(第69位谷氨酸被甘氨酸取代)	No.2
第461位	G取代A(第154位谷氨酸被甘氨酸取代)	No.2
			第608位	C取代T(第203位异亮氨酸被苏氨酸取代)	No.2
第642位	T取代G(第214位组氨酸被谷氨酰胺取代)	No.1
			第758位	C取代T(第2053位蛋氨酸被苏氨酸取代)	No.1
第833位	G取代A(第278位天冬氨酸被甘氨酸取代)	No.3
			第1591位	G取代A(第531位精氨酸被甘氨酸取代)	No.4

实施例2

(1)ΔSpaA蛋白的氨基酸取代引起的包涵体形式表达蛋白质

质粒构建方法为：用适当的限制酶切割来自实施例1-(4)中形成包涵体的克隆的质粒，将所得到的含表2所述核苷酸取代的DNA片段插入编码从表达可溶性ΔSpaA蛋白的克隆(SE-9菌株)中提取的质粒中ΔSpaA蛋白的基因中的相应区域。

具体地，

(a)来自克隆No.1的质粒经限制酶EcoI和ClaI双重消化后，进行琼脂糖电泳以分离EcoI-ClaI片段(图4A-1)，该片段含有编码ΔSpaA蛋白的基因中第587位-第1152位核苷酸的序列。将所得到的片段插入来自预先用EcoI和ClaI处理的表达可溶性ΔSpaA蛋白的克隆(SE-9菌株)的质粒，从而构建含有第642位-第758位核苷酸发生取代的编码ΔSpaA蛋白的基因的质粒。

同样的方法下，构建

(b)插入了来自克隆No.3的EcoI-ClaI片段(图4A-b)的质粒(第833位核苷酸发生取代)，该片段含有编码ΔSpaA蛋白的基因中第587位-第1152位核苷酸；

(c)插入了来自克隆No.2的KpnI-ClaI片段(图4A-c)的质粒(第461位-第608位核苷酸发生取代)，该片段含有编码ΔSpaA蛋白的基因中第266位-第1152位核苷酸；和

(d)插入了来自克隆No.2的EcoI-ClaI片段(图4A-d)的质粒(第608位核苷酸发生取代)，该片段含有编码ΔSpaA蛋白的基因中第587位-第1152位核苷酸。

(e)将含有编码可溶性ΔSpaA蛋白的基因中第266位-第1152位核苷酸的KpnI-ClaI片段(图4A-e)插入来自经KpnI和ClaI处理的No.2克隆的质粒中构建含有第206位核苷酸发生取代的编码ΔSpaA蛋白的基因的质粒。

(f)用定点诱变构建含有第642位核苷酸发生取代的编码ΔSpaA蛋白的基因的质粒(Takara，Mutan-Super Express Km)。具体地，来自表达可溶性ΔSpaA蛋白的克隆(SE-9菌株)的质粒经限制酶EcoRI和HindIII双重消化，将所得到的含有编码ΔSpaA蛋白的基因中第587位-第1260位核苷酸和质粒pET11d的一部分的EcoRI-HindIII片段(967bp)克隆至载体质粒pKF18k(Takara)。按照实施例1-(1)所述方法进行PCR，以该质粒作为模板，使用SEQ IDNNO：6突变用的合成寡核苷酸(含有编码ΔSpaA蛋白的基因中第632位-第657位核苷酸的序列，其中第642位核苷酸T被G取)、宝酒生产的Mutan-Super Express Km试剂盒所附带的5pmol选择引物、5μl 10xLAPCR缓冲液(+Mg²⁺)、8μldNTP混合液、0.5μl LA-Taq聚合酶溶液以及无菌蒸馏水，使总体积为50μl。所得到的PCR反应液经乙醇沉淀/洗涤后克隆至大肠杆菌MV1184菌株(宝酒).所得到的导入突变的质粒经EcoRI和BamHI双重消化以分离出EcoRI-BamHI片段，该片段含有编码ΔSpaA蛋白基因中的第587位-第1260位核苷酸。将该片段作为起始材料插入来自表达可溶性ΔSpaA蛋白的克隆(SE-9菌株)的质粒的相应区域，以得到目标质粒。同样地，用同样的方法构建含有来自藤泽菌株和多摩96菌株的第642位核苷酸T被G取代的编码ΔSpaA蛋白的基因的质粒。

这样得到的质粒用于转化大肠杆菌BL21(DE3)，调查所表达的ΔSpaA蛋白的形状。结果发现每一种来自任何质粒的转化体的ΔSpaA蛋白均形成包涵体。

(2)全长SpaA蛋白的氨基酸取代引起的包涵体形式蛋白质表达

质粒构建方法为：用适当的限制酶切割来自实施例1-(4)中形成包涵体的克隆的质粒，将所得到的含表2所述核苷酸取代的DNA片段插入从表达可溶性ΔSpaA蛋白的克隆(SE-9菌株)中提取的质粒中编码SpaA蛋白的基因中的相应区域。

具体地，

(a)来自克隆No.4的质粒经限制酶ClaI和BamHI双重消化后，进行琼脂糖电泳以分离ClaI-BamHI片段(图4B-a)，该片段含有编码SpaA蛋白的基因中第1152位-第1881位核苷酸(编码SpaA蛋白的基因的终止密码子)的序列。将所得到的片段插入预先用ClaI和BamHI处理的来自克隆(SE-9菌株)的表达可溶性全长SpaA蛋白的质粒，从而构建含有第1591位核苷酸发生取代的编码SpaA蛋白的基因的质粒。

(b)实施例2-(1)-(a)制备的质粒经PstI和ClaI双重消化后，进行琼脂糖电泳以分离PstI-ClaI片段(图4A-f)，该片段含有编码ΔSpaA蛋白基因中第611位-第1152位核苷酸的序列。将所得到的片段插入预先用PstI和ClaI处理的来自克隆(SE-9菌株)的表达可溶性全长SpaA蛋白的质粒，从而构建含有第642位和第758位核苷酸发生取代的编码SpaA蛋白的基因的质粒。

这样得到的质粒用于转化大肠杆菌BL21(DE3)，调查所表达的SpaA蛋白的形状。结果发现每一种来自任何质粒的转化体的SpaA蛋白均形成包涵体。

实施例3

(1)形成包涵体的SpaA蛋白和ΔSpaA蛋白的纯化

对每一个实施例2-(1)得到的以包涵体形式表达ΔSpaA蛋白的大肠杆菌细胞和实施例2-(2)得到的以包涵体形式表达SpaA蛋白的大肠杆菌细胞进行培养。各取培养菌液100ml，以10,000rpm离心5分钟，在所得到的沉淀物中加入培养菌液的1/5-1/10体积量的洗涤缓冲液(20mM Tris-Hcl pH7.5，10mMEDTA，1％Triton X-100)，悬浮菌胞至均匀。在悬浮液中加入1/100体积量的溶菌酶溶液(10mg/ml)，30℃下反应15分钟。冰冷条件下，用声波照射型细胞匀浆器(生产商：Barnson Sonic Power公司；型号：350；输出：4；Duty cycle：30％；时间：5-15分钟)超声处理混合物，以15,000rpm离心15分钟。回收上清液后，在沉淀物中加入与离心前的超声处理混合物相同体积的洗涤缓冲液(或无菌蒸馏水)，再次悬浮菌胞至均匀。悬浮液以15,000rpm离心15分钟。回收上清液后，在沉淀物中加入洗涤缓冲液(或无菌蒸馏水)。重复这种离心/洗涤操作3-5次。最后的洗涤操作中，将离心后的沉淀物悬浮于无菌蒸馏水中，悬浮液再次以15,000rpm离心15分钟。回收上清液后，沉淀物悬浮于10ml的8M尿素中。室温下轻轻振荡2小时，然后在5℃下轻轻振荡18小时。包涵体蛋白质得到溶解，得到纯化的SpaA蛋白和ΔSpaA蛋白。SDS-PAGE之后用考马斯亮兰对凝胶进行染色。光密度计检测表明这样得到的SpaA蛋白和ΔSpaA蛋白的纯度为90％或以上(图6)。

(2)SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的免疫原性

按下述方法确定SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的免疫原性。在4ml实施例3-(1)纯化的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白溶液中加入11ml生理盐水和5ml氢氧化铝凝胶佐剂(ALHYDROGEL“85”，SuperfosBiosector)，室温下搅拌混合物2小时，得到疫苗溶液。用5倍量添加了25％(vol/vol)氢氧化铝凝胶的生理盐水连续稀释该疫苗溶液，制成连续稀释液，对10只小鼠(ddy，5周龄，雌性)进行免疫，每一稀释度皮下给予0.5ml。免疫3周后给小鼠皮内注射约1,000个红斑丹毒丝菌强毒株藤泽菌株活细胞，进行攻击。观察10日内小鼠的存活或死亡情况，确定纯化的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的半数保护量(PD50)。如表3所示，纯化的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白表现出极高的免疫原性，即半数保护量(PD50)为0.0621-0.1885μg。按Behrens-Karber法(Karber G：Beitrag zur kollektiven Behandlungpharmakologischer Reihenversuche.Arch.Exp.Path.Pharm.，162：480，1931；“Saikingaku Jisshu Teiyo”[Summary Practice inBacteriology]，5th ed.，Ed. by“alumni association ofIkagakukenkyusho”[Medical Science Laboratory]，Maruzen，p.564-565)，根据下列方程式计算小鼠的半数保护量(50％有效量)

小鼠的半数保护量(μg)＝10^m，m＝X₄-[(h₀+h₁)(X₁-X₀)×1/2+(h₁+h₂)(X₂-X₁)×1/2+(h₂+h₃)(X₃-X₂)×1/2+(h₄+h₃)(X₄-X₃)×1/2]

其中，X₀、X₁、…X₄各代表各接种量的对数，h₀、h₁、…h₄各代表相应的实测有效率(存活数/攻击数)。各接种量的对数(X)可由方程式：X＝Log10[样品的蛋白质浓度(μg/ml)×小鼠的注射量(ml)÷稀释倍数]。

表3

工业应用性

本发明提供了一种在大肠杆菌中将可溶性SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白制成不溶性包涵体的方法。本发明方法应用于可溶性蛋白的制备中，可建立一种实用的制备SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的方法，该方法确保了SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白在商业市场上的稳定供应。本发明方法得到的重组SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白保留了与原始可溶性蛋白等同的免疫原性，可单独或与稳定剂、保护剂、防腐剂等多种添加剂混合用作抗猪丹毒杆菌感染的疫苗的制备材料。它还可以用作制备单克隆抗体/多克隆抗体的抗原，或用作调查抗SpaA蛋白抗体或抗ΔSpaA蛋白抗体与猪丹毒杆菌的结合性的研究材料。同样地，用本发明方法得到的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白将为医疗及研究领域做出巨大贡献。

序列表

<110>财团法人化学及血清疗法研究所

<120>一种在大肠杆菌中制备猪丹毒杆菌表面保护性抗原的方法

<130>664968

<140>JP 2004-53882

<141>2004-02-27

<160>7

<170>PatentIn 3.1版

<210>1

<211>1881

<212>DNA

<213>猪丹毒杆菌

<400>1

atgaaaaaga aaaaacacct atttccgaaa gtaagtctta tgtcgtgctt acttttaaca 60

gcaatgccac tacaaacagc ttttgctgat tcgacagata tttctgtgat tccactaatc 120

ggtgaacaag ttggattgct cccagtttta cctgggacag gggtacatgc tcaggaatac 180

aacaaaatga ctgatgctta tattgaaaaa ttggtatctc taattaatca aaaagtgaag 240

ccgtttctta taaatgagcc aaaggggtac caaagtttcg aagcagtgaa tgaagagatt 300

aactcgattg taagtgaact taaaaatgaa ggaatgagtc ttcaaaacat tcaccatatg 360

tttaaacaaa gcatccaaaa cctagcaact agaatcggct acagaagttt tatgcaggat 420

gctatgtatc ttgaaaattt tgaaagatta acgattcctg aacttgatga agcatacgtt 480

gatttactcg tgaattacga ggtgaaacac cgtattttag taaaatatga aggtaaagtt 540

aaaggtagag ctcccttaga agcatttata gttcctctaa gagatagaat tcgtagtatg 600

aatgaaattg ctgcagaagt aaattattta cctgaagcgc atgaggattt cttagtttca 660

gattcaagcg agtataatga caaactaaat aatatcaact ttgctttggg tctaggggtc 720

agcgagttta ttgactataa ccggctcgaa aatatgatgg aaaaagaact tcatccactg 780

tatcttgaac tttatgctat gcggagaaat cgccaaattc aagttgtaag agatgtatat 840

ccaaacttgg aacgtgcgaa cgcggttgtt gaatccttaa agacaattaa agatataaaa 900

caaagaggga agaaactaca ggaacttctt gaaatttata tccaaagaag tggagatgtt 960

cgaaaaccag atgtactcca acgatttatt ggaaaatatc aatcagtagt tgatgaagaa 1020

aaaaataaac ttcaagatta tttagaatca gatatttttg attcatatag tgtggatggc 1080

gagaaaataa gaaataaaga aattacactc atcaatagag atgcatactt atctatgatt 1140

tacagagctc aatcgatttc ggaaattaag acgattcgtg cagatttaga atcacttgtc 1200

aaatcattcc aaaatgaaga aagtgactct aaagtagagc ctgaaagtcc cgttaaagta 1260

gaaaaaccag ttgatgaaga aaaacctaaa gatcaaaaga agctagttga tcaatcaaaa 1320

cccgaatcga attcaaaaga agggtggatt aagaaagata ataagtggtt ctatattgag 1380

aaatcaggtg gaatggcaac aggttggaag aaggtagcag acaaatggta ctacctcgat 1440

aatacgggtg ctatagttac gggttggaag aaggtagcaa acaaatggta ctatcttgaa 1500

aaatcaggtg cgatggcaac aggatggaag aaagtatcaa acaagtggta ctaccttgaa 1560

aactcaggtg caatggcaac aggatggaag aaagtatcaa acaagtggta ctaccttgaa 1620

aattcaggcg caatggctac aggatggaaa aaggtagcaa acaaatggta ctaccttgaa 1680

aactcaggtg cgatggcaac aggatggaag aaagtatcga acaagtggta ctaccttgaa 1740

aactcaggcg caatggctac aggatggaaa aaggtagcaa acaaatggta ctaccttgat 1800

aaatcaggaa tgatggttac aggttcaaaa tctattgatg gtaaaaagta tgcatttaag 1860

aacgatggaa gtttaaaata g 1881

<210>2

<211>626

<212>PRT

<213>猪丹毒杆菌

<400>2

Met Lys Lys Lys Lys His Leu Phe Pro Lys Val Ser Leu Met Ser Cys

1 5 10 15

Leu Leu Leu Thr Ala Met Pro Leu Gln Thr Ala Phe Ala Asp Ser Thr

20 25 30

Asp Ile Ser Val Ile Pro Leu Ile Gly Glu Gln Val Gly Leu Leu Pro

35 40 45

Val Leu Pro Gly Thr Gly Val His Ala Gln Glu Tyr Asn Lys Met Thr

50 55 60

Asp Ala Tyr Ile Glu Lys Leu Val Ser Leu Ile Asn Gln Lys Val Lys

65 70 75 80

Pro Phe Leu Ile Asn Glu Pro Lys Gly Tyr Gln Ser Phe Glu Ala Val

85 90 95

Asn Glu Glu Ile Asn Ser Ile Val Ser Glu Leu Lys Asn Glu Gly Met

100 105 110

Ser Leu Gln Asn Ile His His Met Phe Lys Gln Ser Ile Gln Asn Leu

115 120 125

Ala Thr Arg Ile Gly Tyr Arg Ser Phe Met Gln Asp Ala Met Tyr Leu

130 135 140

Glu Asn Phe Glu Arg Leu Thr Ile Pro Glu Leu Asp Glu Ala Tyr Val

145 150 155 160

Asp Leu Leu Val Asn Tyr Glu Val Lys His Arg Ile Leu Val Lys Tyr

165 170 175

Glu Gly Lys Val Lys Gly Arg Ala Pro Leu Glu Ala Phe Ile Val Pro

180 185 190

Leu Arg Asp Arg Ile Arg Ser Met Asn Glu Ile Ala Ala Glu Val Asn

195 200 205

Tyr Leu Pro Glu Ala His Glu Asp Phe Leu Val Ser Asp Ser Ser Glu

210 215 220

Tyr Asn Asp Lys Leu Asn Asn Ile Asn Phe Ala Leu Gly Leu Gly Val

225 230 235 240

Ser Glu Phe Ile Asp Tyr Asn Arg Leu Glu Asn Met Met Glu Lys Glu

245 250 255

Leu His Pro Leu Tyr Leu Glu Leu Tyr Ala Met Arg Arg Asn Arg Gln

260 265 270

Ile Gln Val Val Arg Asp Val Tyr Pro Asn Leu Glu Arg Ala Asn Ala

275 280 285

Val Val Glu Ser Leu Lys Thr Ile Lys Asp Ile Lys Gln Arg Gly Lys

290 295 300

Lys Leu Gln Glu Leu Leu Glu Ile Tyr Ile Gln Arg Ser Gly Asp Val

305 310 315 320

Arg Lys Pro Asp Val Leu Gln Arg Phe Ile Gly Lys Tyr Gln Ser Val

325 330 335

Val Asp Glu Glu Lys Asn Lys Leu Gln Asp Tyr Leu Glu Ser Asp Ile

340 345 350

Phe Asp Ser Tyr Ser Val Asp Gly Glu Lys Ile Arg Asn Lys Glu Ile

355 360 365

Thr Leu Ile Asn Arg Asp Ala Tyr Leu Ser Met Ile Tyr Arg Ala Gln

370 375 380

Ser Ile Ser Glu Ile Lys Thr Ile Arg Ala Asp Leu Glu Ser Leu Val

385 390 395 400

Lys Ser Phe Gln Asn Glu Glu Ser Asp Ser Lys Val Glu Pro Glu Ser

405 410 415

Pro Val Lys Val Glu Lys Pro Val Asp Glu Glu Lys Pro Lys Asp Gln

420 425 430

Lys Lys Leu Val Asp Gln Ser Lys Pro Glu Ser Asn Ser Lys Glu Gly

435 440 445

Trp Ile Lys Lys Asp Asn Lys Trp Phe Tyr Ile Glu Lys Ser Gly Gly

450 455 460

Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys Val Ala Asp Lys Trp Tyr Tyr Leu Asp

465 470 475 480

Asn Thr Gly Ala Ile Val Thr Gly Trp Lys Lys Val Ala Asn Lys Trp

485 490 495

Tyr Tyr Leu Glu Lys Ser Gly Ala Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys Val

500 505 510

Ser Asn Lys Trp Tyr Tyr Leu Glu Asn Ser Gly Ala Met Ala Thr Gly

515 520 525

Trp Lys Lys Val Ser Asn Lys Trp Tyr Tyr Leu Glu Asn Ser Gly Ala

530 535 540

Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys Val Ala Asn Lys Trp Tyr Tyr Leu Glu

545 550 555 560

Asn Ser Gly Ala Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys Val Ser Asn Lys Trp

565 570 575

Tyr Tyr Leu Glu Asn Ser Gly Ala Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys Val

580 585 590

Ala Asn Lys Trp Tyr Tyr Leu Asp Lys Ser Gly Met Met Val Thr Gly

595 600 605

Ser Lys Ser Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Ala Phe Lys Asn Asp Gly Ser

610 615 620

Leu Lys

625

<210>3

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>为PCR扩增制备SpaA蛋白和ΔSpaA蛋白设计的正义引物

<400>3

catgccatgg ctttcgctga ttcgacagat atttctg 37

<210>4

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>为PCR扩增制备ΔSpaA蛋白设计的反义引物

<400>4

cgcggatcct tatactttaa cgggactttc agg 33

<210>5

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>为PCR扩增制备SpaA蛋白设计的反义引物

<400>5

cgcggatccg tctattttaa acttccatcg ttcttaaa 38

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>为定点诱变法制备点突变SpaA蛋白设计的寡核苷酸

<400>6

ctgaagcgca ggaggatttc ttag 24

<210>7

<211>1748

<212>DNA

<213>猪丹毒杆菌

<400>7

tgattccact aatcggtgaa caagttggat tgctcccagt tttacctggg acagggatac 60

atgctcagga atacaacaaa atgactgatg cttatattga aaatttggta tctctaatta 120

atcaaaaagt gaagccgttt cttataaatg aaccaaaggg gtaccaaagt ttcgaagcag 180

tgaatgaaga gattaactcg attgtaagtg aacttaaaca tgaaggaatg agtcttcaaa 240

acattcacca tatgtttaaa caaagcatcc aaaacctagc aactagaatc ggctacagaa 300

gttttatgca ggatgctatg tatcttgaaa attttgaaag attaacgatt cctgaacttg 360

atgaagcata cgttgattta ctcgtgaatt acgaggtgaa acaccgtatt ttagtaaaat 420

atgaagataa agttaaaggt agagctccat tagaagcatt tatagttcct ctaagaaata 480

gaattcgtag tatgaatgaa attgctgcag aagtaaatta tttacctgaa gcgcatgagg 540

atttcttagt ttcagattca agcgagtata atgacaaact aaataatatc aactttgctt 600

tgggtctagg ggtcagcgag tttattgact ataaccggct cgaaaatatg atggaaaaag 660

aaattcatcc attgtatctt gaactttatg ctatgcggag aaatcgccaa attcaagttg 720

taagagatgt atatccaaac ttggaacgtg cgaacgcggt tgttgaatcc ttaaagacaa 780

ttaaagatat aaaacaaaga gagaagaaac tacaggaact tcttgaaatt tatatccaaa 840

gaagtggaga tgttcgaaaa ccagatgtac tccaacgatt tattggaaaa tatcaatcag 900

tagttgatga agaaaaaaat aaacttcaag attatttaga atcagatatt tttgattcat 960

atagtgtgga tggcgagaaa ataagaaata aagaaattac actcatcaat agagatgcat 1020

acttatctat gatttacaga gctcaatcga tttcggaaat taagacgatt cgtgcagatt 1080

tagaatcact tgtcaaatca ttccaaaatg aagaaagtga ttctaaagta gagcctgaaa 1140

gtcccgttaa agtagaaaaa ccagttgata aagaaaaacc taaagatcaa aagaagccag 1200

ttgatcaatc aaaacccgaa tcgaattcaa aagaagggtg gattaagaaa gataataagt 1260

ggttctatat tgagaaatca ggtggaatgg caacaggatg gaagaaggta ggagacaaat 1320

ggtactacct cgataatacg ggtgctatgg ttacgggttg gaagaaggta gcaaacaaat 1380

ggtactacct tgaaaactca ggtgcgatgg caacaggatg gaagaaagta tcaaacaagt 1440

ggtactacct tgaaaactca ggtgcgatgg caacaggatg gaagagagta tcaaacaagt 1500

ggtactacct tgaaaattca ggcgcaatgg ctacaggatg gaaaaaggta gcaaacaaat 1560

ggtactacct tgaaaactca ggtgcgatgg caacaggatg gaagaaagta tcgaacaagt 1620

ggtactacct tgaaaactca ggcgcaatgg caacgggttg gaagaaaata gcaaataaat 1680

ggtactacct tgataaatca ggaatgatgg ttacaggttc aaaatctatt gatggtaaaa 1740

agtatgca 1748

Claims

1.一种制备猪丹毒杆菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)表面保护性抗原SpaA蛋白的变体或其中SpaA蛋白C末端的207个氨基酸残基被除去后得到的缩短型ΔSpaA蛋白的变体的方法，所述变体具有免疫原性，以包涵体形式在大肠杆菌中表达，该方法包括使编码所述SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的基因发生突变，以便在所述SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的氨基酸序列中引入氨基酸取代，使突变了的基因在大肠杆菌中表达，在所表达的变体中挑选形成包涵体的变体，其中所述氨基酸取代是选自下述(a)-(j)中的一种：

(a)含有信号序列的N末端起第69位氨基酸被甘氨酸取代；

(b)含有信号序列的N末端起第154位氨基酸被甘氨酸取代；

(c)含有信号序列的N末端起第203位氨基酸被苏氨酸取代；

(d)含有信号序列的N末端起第214位氨基酸被谷氨酰胺取代；

(e)含有信号序列的N末端起第253位氨基酸被苏氨酸取代；

(f)含有信号序列的N末端起第278位氨基酸被甘氨酸取代；和

(g)含有信号序列的N末端起第531位氨基酸被甘氨酸取代；

(h)含有信号序列的N末端起第154位和203位氨基酸分别被甘氨酸和苏氨酸取代；

(i)含有信号序列的N末端起第214位和253位氨基酸分别被谷氨酰胺和苏氨酸取代；

(j)含有信号序列的N末端起第69位、154位和203位氨基酸分别被甘氨酸，甘氨酸和苏氨酸取代。

2.权利要求1所述的方法，包括下列(A)-(D)步骤：

(B)用含有所得到的突变基因的表达载体转化大肠杆菌细胞；

(D)培养所挑选的大肠杆菌细胞，回收细胞内的包涵体。

3.权利要求1或2所述的方法，其中所述猪丹毒杆菌选自藤泽菌株、小金井菌株、多摩96菌株、SE-9菌株和静冈63菌株。

4.权利要求1或2所述的方法，其中在引入所述氨基酸取代之前，SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白分别具有SEQ ID NO：2所述氨基酸序列或除去C末端的207个氨基酸残基的SEQ ID NO：2所述序列。

5.一种猪丹毒杆菌表面保护性抗原SpaA蛋白的变体或其中SpaA蛋白C末端的207个氨基酸残基被除去后得到的缩短型ΔSpaA蛋白的变体，它具有免疫原性，以包涵体形式在大肠杆菌中表达，其中在所述SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的氨基酸序列中引入选自下述(a)-(j)的氨基酸取代：

(a)含有信号序列的N末端起第69位氨基酸被甘氨酸取代；

(b)含有信号序列的N末端起第154位氨基酸被甘氨酸取代；

(c)含有信号序列的N末端起第203位氨基酸被苏氨酸取代；

(d)含有信号序列的N末端起第214位氨基酸被谷氨酰胺取代；

(e)含有信号序列的N末端起第253位氨基酸被苏氨酸取代；

(f)含有信号序列的N末端起第278位氨基酸被甘氨酸取代；和

(g)含有信号序列的N末端起第531位氨基酸被甘氨酸取代；

6.权利要求5所述的变体，它具有在SEQID NO：2所述氨基酸序列或除去C末端的207个氨基酸残基的SEQ ID NO：2所述序列中引入了氨基酸取代的氨基酸序列。

7.权利要求5或6所述的变体，其中所述SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白来自选自藤泽菌株、小金井菌株、多摩96菌株、SE-9菌株和静冈63菌株中的一种菌株。

8.一种组合物，它包含具有免疫原性，以包涵体形式在大肠杆菌中表达的猪丹毒杆菌表面保护性抗原SpaA蛋白的变体或其中SpaA蛋白C末端的207个氨基酸残基被除去后得到的缩短型ΔSpaA蛋白的变体作为活性成分，其中在所述SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的氨基酸序列中引入选自下述(a)-(j)的氨基酸取代：

(a)含有信号序列的N末端起第69位氨基酸被甘氨酸取代；

(b)含有信号序列的N末端起第154位氨基酸被甘氨酸取代；

(c)含有信号序列的N末端起第203位氨基酸被苏氨酸取代；

(d)含有信号序列的N末端起第214位氨基酸被谷氨酰胺取代；

(e)含有信号序列的N末端起第253位氨基酸被苏氨酸取代；

(f)含有信号序列的N末端起第278位氨基酸被甘氨酸取代；和

(g)含有信号序列的N末端起第531位氨基酸被甘氨酸取代；

9.权利要求8所述的组合物，其中所述变体具有在SEQ ID NO：2所述氨基酸序列或除去C末端的207个氨基酸残基的SEQ ID NO：2所述序列中引入了氨基酸取代的氨基酸序列。

10.权利要求8或9所述的组合物，其中所述变体来源于选自藤泽菌株、小金井菌株、多摩96菌株、SE-9菌株和静冈63菌株中的一种菌株。

11.一种基因，它编码具有免疫原性，以包涵体形式在大肠杆菌中表达的猪丹毒杆菌表面保护性抗原SpaA蛋白的变体或其中SpaA蛋白C末端的207个氨基酸残基被除去后得到的缩短型ΔSpaA蛋白的变体，其中在所述SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的氨基酸序列中引入选自下述(a)-(j)的氨基酸取代：

(a)含有信号序列的N末端起第69位氨基酸被甘氨酸取代；

(b)含有信号序列的N末端起第154位氨基酸被甘氨酸取代；

(c)含有信号序列的N末端起第203位氨基酸被苏氨酸取代；

(d)含有信号序列的N末端起第214位氨基酸被谷氨酰胺取代；

(e)含有信号序列的N末端起第253位氨基酸被苏氨酸取代；

(f)含有信号序列的N末端起第278位氨基酸被甘氨酸取代；和

(g)含有信号序列的N末端起第531位氨基酸被甘氨酸取代；

12.权利要求11所述的基因，它编码在SEQ ID NO：2所述氨基酸序列或除去C末端的207个氨基酸残基的SEQ ID NO：2所述序列中引入了氨基酸取代的氨基酸序列。

13.权利要求11所述的基因，它来源于选自藤泽菌株、小金井菌株、多摩96菌株、SE-9菌株和静冈63菌株中的一种菌株。

14.权利要求12所述的基因，它来源于选自藤泽菌株、小金井菌株、多摩96菌株、SE-9菌株和静冈63菌株中的一种菌株。

15.权利要求12-14中任何一项所述的基因，其编码在SEQ IDNO：2所述的氨基酸序列或除去C末端的207个氨基酸残基的SEQ IDNO：2所述的氨基酸序列，其中，包括下述(1)-(10)中的一种：

(1)SEQ ID NO：1所述核苷酸序列中第206位核苷酸为G；

(2)SEQ ID NO：1所述核苷酸序列中第461位核苷酸为G；

(3)SEQ ID NO：1所述核苷酸序列中第608位核苷酸为C；

(4)SEQ ID NO：1所述核苷酸序列中第642位核苷酸为G；

(5)SEQ ID NO：1所述核苷酸序列中第758位核苷酸为C；

(6)SEQ ID NO：1所述核苷酸序列中第833位核苷酸为G；和

(7)SEQ ID NO：1所述核苷酸序列中第1591位核苷酸为G；

(8)SEQ ID NO：1所述核苷酸序列中第461位和第608位核苷酸分别为G和C；

(9)SEQ ID NO：1所述核苷酸序列中第642位和第758位核苷酸分别为G和C；以及

(10)SEQ ID NO：1所述核苷酸序列中第206位、第461位和第608位核苷酸分别为G、G和C。

16.具有免疫原性，以包涵体形式在大肠杆菌中表达的猪丹毒杆菌表面保护性抗原SpaA蛋白的变体或其中SpaA蛋白C末端的207个氨基酸被除去后得到的缩短型ΔSpaA蛋白的变体在制备抗猪丹毒杆菌感染的疫苗中的用途，其中在所述SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的氨基酸序列中引入选自下述(a)-(j)的氨基酸取代：

(a)含有信号序列的N末端起第69位氨基酸被甘氨酸取代；

(b)含有信号序列的N末端起第154位氨基酸被甘氨酸取代；

(c)含有信号序列的N末端起第203位氨基酸被苏氨酸取代；

(d)含有信号序列的N末端起第214位氨基酸被谷氨酰胺取代；

(e)含有信号序列的N末端起第253位氨基酸被苏氨酸取代；

(f)含有信号序列的N末端起第278位氨基酸被甘氨酸取代；和

(g)含有信号序列的N末端起第531位氨基酸被甘氨酸取代；

17.权利要求16所述的用途，其中所述变体具有在SEQ ID NO：2所述氨基酸序列或除去C末端的207个氨基酸的SEQ ID NO：2所述序列中引入了氨基酸取代的氨基酸序列。

18.权利要求16或17所述的用途，其中所述变体来源于选自藤泽菌株、小金井菌株、多摩96菌株、SE-9菌株和静冈63菌株中的一种菌株。