JP3532510B2 - 組換え豚丹毒菌防御抗原の回収精製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ブレビバチルス・
チョウシネンシス（Brevibacillus choshinensis）を宿
主菌とする遺伝子組換え体を培養することによって生産
された豚丹毒菌防御抗原蛋白質４６．５ＫＰＡ（46.5kD
A protective antigen；以下４６．５ＫＰＡということ
もある）の回収精製法に関するものである。更に、詳細
には、本発明は豚丹毒菌抗原活性を有する４６．５ＫＰ
Ａをコードする遺伝子で形質転換したプレビバチルス・
チョウシネンシスを培養し、その培養物から４６．５Ｋ
ＰＡを回収精製する方法に関するものであって、特に工
業的大量精製法に適した簡便且つ効率的な蛋白質の回収
精製方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】豚丹毒菌（Erysipe1othrix rhusiopath
iae）は豚、イノシシ、鯨類、鶏、七面鳥などの食用動
物に病原性を持ち、畜産の生産性に大きな被害を与えて
きた。家畜伝染病予防法において豚丹毒は監視伝染病の
一つに指定され豚において年間３，０００頭前後の発生
報告がある。また本菌は人にも病原性をもつこと、食肉
処理場での多数の豚丹毒症例が摘発されることから、豚
肉やその内臓を含む食品の安全性にも脅威となってい
る。

【０００３】わが国では、強毒株をアクリフラビン添加
培地で長期継代培養して作製された豚丹毒菌弱毒株Ｋｏ
ｇａｎｅｉ株から製造された凍結乾燥生ワクチンがひろ
く豚丹毒菌感染の防御のために使用されてきたが、問題
点として、マウスに関節炎発症の病原性をもつこと、抗
体の低い豚やＳＰＦ豚において重篤な副作用を示すこ
と、また慢性豚丹毒症例豚の病変からワクチン株が分離
されることが指摘されている。

【０００４】一方、不活化ワクチンとしては、豚丹毒菌
強毒株の培養菌液をホルマリンで殺菌処理し、その全菌
体及び菌体外生産物を水酸化アルミニウムゲルに吸着さ
せて製造したバクテリアワクチン及び全菌体からアルカ
リ水溶液で抽出した菌体表層非精製蛋白質画分から成る
成分ワクチンが豚丹毒の予防用ワクチンとして用いられ
ている。アルカリ抽出蛋白質画分中の有効成分として
は、６４〜６６ｋＤａの蛋白質抗原がマウスで感染防御
活性を示すとされる（Groschup，M．H．et al．（199
1） Epidemio. Infect., 107，637-649）

【０００５】他方、本菌の防御抗原の遺伝子組換え体と
しては、Ｇａ１ａｎとＴｉｍｏｎｙが豚丹毒菌の５．４
ｋｂの遺伝子断片で組換えたファージを感染させた宿主
大腸菌の溶解物上清で免疫したマウス群では１４〜１７
％が感染死に対する防御活性を示すこと、また、同溶解
物上清に対する免疫血清は６６、５４、４３ｋＤａの蛋
白質と反応することを示した（Garan，J．E．et al．
（1990）Infect. Immun., 58，3116-3121）。

【０００６】最近、豚丹毒菌に対して感染防御活性を有
するモノクローナル抗体が、血清型２型豚丹毒菌Ｔａｍ
ａ９６株の６４ｋＤａの表面蛋白質を認識すること、ま
たその表面蛋白質の遺伝子がクローニングされ、塩基配
列と６０６アミノ酸の配列が決定され、Ｃ末に８個の相
似な繰り返し配列（１９個のアミノ酸からなる８番目の
配列以外は２０個のアミノ酸からなる。）をもつことが
報告された（Makino，S．et al．（1998）Microb. Path
og． 25，101-109）。

【０００７】この６４ｋＤａ蛋白質はＳＰＡと命名され
ている。

【０００８】ＳＰＡをコードする遺伝子で組換えた大腸
菌の生菌を接種したマウスは、豚丹毒菌の攻撃に対し防
御が成立する。またＳＰＡのうち、菌細胞膜に固着する
側のＣ末繰り返し配列部分が防御活性に必須であること
が報告された（Makino, S. et al. (1998) Microb. Pat
hog. 25, 101-109）。

【０００９】更に、血清型１型のＦｕｊｉｓａｗａ株の
感染防御抗原の遺伝子も同様の配列をとるが、Ｃ末の操
り返し配列が１個多く、６２６個のアミノ酸からなり、
Ｃ未には９個の相似な繰り返し配列（１９個のアミノ酸
からなる９番目の配列以外は２０個のアミノ酸からな
る。）をもつこと、その遺伝子がコードする蛋白質は６
９ｋＤａの蛋白質であることが示された（Imada，Y．
（1999）Proc. Jpn. Pig.Vet. Soc. 34, 12-15）。ここ
で得られた遺伝子全長または遺伝子全長からＣ未の繰り
返し塩基配列を除いた遺伝子または全長のＮ末側の一部
とＣ末の繰り返し塩基配列を除いた１０２９ｂｐの塩基
配列で組換えた大腸菌からヒスチジンヘキサマー融合蛋
白質として得られた組換え蛋白質は、フロイントコンプ
リートアジュバント（実用ワクチン用には使用不可）の
存在下で感染防御効果を示したと報告されている（今
田、上記）。

【００１０】しかし、今まで報告された豚丹毒菌の感染
防御抗原の組換え体は、ヒスチジンヘキサマーなどとの
融合ポリペプチドとして、しかも大腸菌体内に生産させ
たものであり、宿主菌菌体外の外分泌系として生産する
方法はこれまで知られていない。また組換え体で生産さ
れた豚丹毒菌の感染防御抗原を、防御免疫誘導のための
実用ワクチンとして利用する免疫方法も知られていな
い。更に、粘膜経路（経鼻、経口、経直腸）でのワクチ
ン投与の開発が、動物へのストレス軽減、省力化、粘膜
局所での免疫誘導を目的として要望されているが、豚用
の組換え抗原に対する経粘膜免疫方法による防御免疫付
与方法は知られていない。さらにまた、マウスでは大腸
菌変異易熱性腸管毒素（ｍＬＴ）が粘膜アジュバントと
して、粘膜投与蛋白質抗原の免疫原性を増強するが（Ts
uji，T．et al．（1997）Immunology, 90，176-182）、
豚などの家畜ではｍＬＴの粘膜アジュバント活性は知ら
れていない。

【００１１】このように豚丹毒菌の感染防御について種
々の研究が進められているなかで、渡辺らは、豚丹毒菌
の感染防御抗原遺伝子のうち、従来必要とされていたＣ
末の繰り返し配列からなる断片をコードするＤＮＡ配列
とＮ末の分泌シグナルをコードするＤＮＡ配列を削除し
たポリヌクレオチドで組換えたブレビバチルス・チョウ
シネンシスの大量培養液の除菌液から夾雑物を除去し、
防御免疫誘導活性をもつ高純度の４６．５ｋＤａ防御抗
原（46.5kDa protective antigen；４６．５ＫＰＡ）を
製造できる方法を見出した（特願平１１−９４００
４）。渡辺らの発明によりブレビバチルス・チョウシネ
ンシスで発現して得られた４６．５ＫＰＡは、豚丹毒菌
の副作用に関係する菌体成分を全く含まないため、ワク
チンの安全性の改善に貢献すると考えられた。

【００１２】更に、渡辺らは４６．５ＫＰＡを家畜用ア
ジュバントの併用をもって注射することにより、あるい
はマウスで粘膜アジュバント活性が知られる大腸菌の変
異無毒組換え易熱性腸管毒素（ｍＬＴ）とともに経鼻免
疫することにより、豚丹毒菌に対する感染・発病防御免
疫能を誘導する技術を確立した。以上の知見から、４
６．５ＫＰＡは動物の豚丹毒菌感染予防用のサブユニッ
トワクチンとしての利用価値を有することが判明した。

【００１３】遺伝子組換え技術を適用し培養物中に分泌
生産された４６．５ＫＰＡをサブユニットワクチンなど
に開発するには、培養物中に混在している菌体、培地由
来の成分や同時に分泌生産される夾雑蛋白質やその他の
代謝産物などの夾雑物を除去し、目的とする４６．５Ｋ
ＰＡのみを効率的に回収精製する必要がある。この精製
工程は簡便でかつ工程数も少ない方がよく、特に精製を
工業規模で行う場合には精製工程が複雑であると多大な
設備投資が必要であり、そのため、生産コストも高くな
ってしまうという問題が生じる。

【００１４】一方、菌体外に著量の蛋白質を生産すると
いう卓越した特徴を有する微生物として、本発明者らに
よってブレビバチルス・チョウシネンシスが発見されて
いる。しかしながら、このすぐれた特徴を利用して、ブ
レビバチルス・チョウシネンシスを宿主菌とし組換え蛋
白質として４６．５ＫＰＡを菌体外に分泌生産させた場
合、この４６．５ＫＰＡは、培養物中で５０％以上が凝
集して不溶性の沈殿を形成してしまい、菌体との分離回
収が困難であった。そのため、４６．５ＫＰＡの回収率
は低く、精製に要する労力も大きく、精製効率の高い製
造方法の開発が必要となっていた。

【００１５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
技術上ないし工業上の必要性に鑑みてなされたものであ
って、ブレビバチルス・チョウシネンシスを宿主菌とす
る異種遺伝子産物の生産において、菌体を含む培養物中
からの効率的な回収精製技術を提供することにある。即
ち、本発明は、ブレビバチルス・チョウシネンシスを宿
主菌とする形質転換体を培養しその培養物中に分泌生産
された４６．５ＫＰＡを共存する菌体及び夾雑物から分
離し、簡便かつ高収率に回収精製する方法を提供するも
のであって、特に工業的な見地から、本発明は、４６．
５ＫＰＡの回収精製に特に適した簡便且つ効率的な大量
精製法を新たに開発し、これを提供する目的でなされた
ものである。

【００１６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、４６．５
ＫＰＡをプレビバチルス・チョウシネンシスの培養物中
から効率よく回収精製する方法について鋭意研究を重ね
た結果、培養物中の菌体及び４６．５ＫＰＡを濾過膜で
回収した後、回収画分のｐＨをアルカリ域に調整し、ア
ルカリ緩衝液で回収画分を洗浄することにより、４６．
５ＫＰＡが可溶化され、濾過液画分に高回収率で溶出し
てくることを見いだした。これによりプレビバチルス・
チョウシネンシスの培養物中に含まれる不溶性の４６．
５ＫＰＡの殆どが可溶化され、菌体、夾雑蛋白質及びそ
の他の夾雑物を効率よく除くことが可能であることによ
り非常に簡便かつ効率よく４６．５ＫＰＡを回収精製す
ることが可能になった。本発明は、この有用新知見に基
づきなされたものである。

【００１７】すなわち本発明は、豚丹毒菌防御抗原蛋白
質を含有するブレビバチルス・チョウシネンシスの培養
物をｐＨ調整及び濾過膜処理によって該培養物中に共存
する菌体及び他の夾雑物から分離回収することを特徴と
する４６．５ＫＰＡ（そのアミノ酸配列を配列表の配列
番号１に示す）の回収精製法に関するものである。

【００１８】

【発明の実施の形態】本発明に用いた組換え豚丹毒菌防
御抗原（４６．５ｋＤａ防御抗原）のポリペプチドは、
分泌形態または非分泌形態のいずれで生産されてもよい
が、分離精製の容易さから分泌形態が好ましい。分泌形
態の場合、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの上流に
任意のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を連結
させる。

【００１９】発現ベクターとしては、バチルス属細菌に
おいて自律複製可能であって、目的ＤＮＡの転写が可能
な位置にプロモーターを含有している物を選択できる。
または、染色体中へ直接組込み、発現させることでもよ
い。

【００２０】宿主細胞としては、バチルス属細菌やブレ
ビバチルス属細菌、特にブレビバチルス・チョウシネン
シス（Brevibacillus choshinensis）が良好に使用でき
る。

【００２１】形質転換法としては、エレクトロポレーシ
ョン法、プロトプラスト法、ＰＥＧ法などを用いること
ができる。

【００２２】形質転換された宿主菌を培地中に培養し、
発現べクターに組込まれた目的ＤＮＡや染色体に組込ま
れた目的ＤＮＡを発現させ、組換え豚丹毒菌防御抗原
（４６．５ｋＤａ防御抗原）を分離精製することができ
る。本発明は、その効率的な分離精製法に関するもので
ある。

【００２３】すなわち本発明は、豚丹毒菌防御抗原活性
を有する蛋白質（４６．５ＫＰＡ）がアルカリ処理によ
って選択特異的に可溶化するという新知見に基づき、こ
の新知見を利用して、ｐＨ調整、濾過膜処理、イオン交
換樹脂処理をそれぞれ選択しただけでよく、その処理順
序の決定、処理回数の決定等各種の検討を行って、これ
らの処理を有機的に結合することにより、４６．５ＫＰ
Ａの回収精製について、工業化、効率化が図られ、画期
的な回収精製法の創製にはじめて成功したものである。

【００２４】本発明に係る豚丹毒菌防御抗原の回収精製
法の骨子は、４６．５ＫＰＡ分泌生産性微生物の培養物
（菌体、培養液ないし培地成分、４６．５ＫＰＡその他
微生物の分泌ないし代謝物などの混合物）について、
（１）精密濾過膜で濾過処理し、中性〜弱アルカリ性緩
衝液で洗浄し、４６．５ＫＰＡと菌体とを濃縮する工程
（濃縮工程）、（２）アルカリ液を用いて濃縮画分のｐ
Ｈを１０〜１２に調整し、４６．５ＫＰＡのみを可溶化
するとともに、必要あれば、精密濾過膜上に残留してい
る濃縮画分をアルカリ緩衝液で洗浄することにより、残
留している少量の４６．５ＫＰＡを可溶化し、４６．５
ＫＰＡを濾過画分に集める工程（濾過可溶化工程）、
（３）所望するのであれば、濾過画分（４６．５ＫＰＡ
含有液）をイオン交換樹脂処理することにより、夾雑蛋
白質を除去して目的蛋白質（４６．５ＫＰＡ）を精製分
離回収する工程（分離回収工程）、よりなるものであ
る。

【００２５】本発明に係る回収精製法は、４６．５ＫＰ
Ａを含有する微生物の培養物に対して広く適用すること
ができる。微生物としては、ブレビバチルス・チョウシ
ネンシスが挙げられ、例えば、ブレビバチルス・チョウ
シネンシスＨＰＤ３１は４６．５ＫＰＡを菌体外に分泌
生産するので、本発明の回収精製法が特に有効に適用で
きる。

【００２６】具体的には、ブレビバチルス・チョウシネ
ンシスＨＰＤ３１−Ｓ５（ＦＥＲＭＢＰ−６６２３）を
例示することができる。本菌は、従来はバチルス・ブレ
ビス（Bacillus brevis）に分類されていたのである
が、現在はブレビバチルス・チョウシネンシス（Brevib
acillus choshinensis）に分類されている（工業技術院
生命工学工業技術研究所証明に係る「科学的性質及び分
類学上の位置の表示等の証明書」）。

【００２７】４６．５ＫＰＡ遺伝子は、公知の方法でブ
レビバチルス・チョウシネンシスに組み込めばよく、例
えばモレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー
マニュアル第２版、コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー（Molecular Cloning 2nd ed. A Laborato
ry Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989）に
記載の方法で行えばよい。このように４６．５ＫＰＡを
コードする遺伝子で形質転換したブレビバチルス・チョ
ウシネンシスを通気撹拌培養することによって、４６．
５ＫＰＡを含有するブレビバチルス・チョウシネンシス
の培養物を得ることが出来る。

【００２８】上記したところを骨子とする豚丹毒菌抗原
タンパク質の回収精製法であるが、更に詳しくは、豚丹
毒菌抗原活性を有するタンパク質を含有するブレビバチ
ルス・チョウシネンシスの培養物を、下記工程（１）〜
（３）の工程を経ることにより共存する菌体、夾雑蛋白
質及びその他の夾雑物を除去し、豚丹毒菌抗原タンパク
質を回収精製する方法に関するものである。

【００２９】以下、本発明の精製工程を詳しく説明す
る。先ず、４６．５ＫＰＡを含有するブレビバチルス・
チョウシネンシスの培養物を以下の工程にしたがって精
製する。 （１）４６．５ＫＰＡ及び菌体と培地由来の成分などの
夾雑物を含む培養物を、先ず、必要ある場合には、ｐＨ
を４６．５ＫＰＡが濾過膜を通過しない中性域〜弱アル
カリ域の範囲に調整する。次に、ｐＨ調整した培養物を
精密濾過膜を用いて濾過し、４６．５ＫＰＡ及び菌体を
膜上に濃縮する。４６．５ＫＰＡ及び菌体を膜上に残
し、培地成分などの夾雑物質及び濾過画分として除去
し、緩衝液、例えば中性域〜弱アルカリ域（１０〜１０
０ｍＭ）のトリス緩衝液（ｐＨ７〜９．５）で良く洗浄
し、残った夾雑物を洗い流す。濾過に用いる膜は、培地
成分などの夾雑物が濾液画分に移行し、４６．５ＫＰＡ
及び菌体が濃縮されるポアサイズを有する濾過膜であれ
ばすべての濾過膜を使用することができ、例えば、ポア
サイズ０．８μｍ以下、好ましくは０．５μｍ以下の精
密濾過膜を使用することができる。

【００３０】（２）（１）の工程で濃縮した４６．５Ｋ
ＰＡ及び菌体のｐＨを水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム等アルカリによって、ｐＨ１０．０〜１２．０（好適
には１１．０）に調整し、（１）工程で使用した精密濾
過膜の膜上に残っている該蛋白質を濾過画分として回収
するためにｐＨ１０．０〜１２．０（好適には１１．
０）のアルカリ緩衝液を徐々に加えて濃縮液を濾過させ
ることにより、４６．５ＫＰＡを濾過画分として回収す
る。このとき用いるアルカリ緩衝液としては（１０〜１
００ｍＭ）グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１
０〜１２）等を用いると良い。

【００３１】（３）更に精製する為に、（２）の工程で
可溶化し、濾過されてきた濾過画分を陰イオン交換クロ
マトグラフィーにより分離回収することが出来る。陰イ
オン交換樹脂としては、ＤＥＡＥ、ＤＥＡＡ、ＴＥＡ
Ｅ、ＥＣＴＥＯＬＡその他、精製のために常用される陰
イオン交換樹脂が適宜使用される。

【００３２】本発明は、上記したところにしたがって実
施すればよいが、更に具体的には、例えば、本発明を実
施するには、該培養物について、下記工程（１）〜
（３）にしたがって処理すれば良く、非限定的に例示し
たこれらの処理により豚丹毒菌抗原タンパク質を効率的
に回収精製することができる。

【００３３】豚丹毒菌抗原活性を有する４６．５ＫＰＡ
をコードする遺伝子で形質転換したブレビバチルス・チ
ョウシネンシスを培養し、その培養物を、（１）精密濾
過膜で濾過処理し、更に５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ
８．５）で洗浄することによって培養物中に含まれる培
地由来の成分などの夾雑物を濾過画分に除き、豚丹毒菌
防御抗原タンパク質と菌体を濃縮する工程、（２）豚丹
毒菌防御抗原タンパク質と菌体の濃縮画分を精密濾過膜
を用いて５０ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液
（ｐＨ１０〜１１）で洗浄することにより豚丹毒菌防御
抗原タンパク質を濾過画分に集める工程、（３）濾過画
分を陰イオン交換クロマトグラフィーにより分離回収す
る工程、よりなる豚丹毒菌防御抗原の回収精製法であ
る。

【００３４】本発明の回収精製法により、非常に簡便
に、ブレビバチルス・チョウシネンシスの培養物から４
６．５ＫＰＡを９０％以上の回収率で菌体や夾雑物から
分離できる。

【００３５】以下、本発明の実施例により更に詳しく説
明するが、これは例示的なものであり、本発明はこれに
限定されるものではない。

【００３６】

【実施例１】豚丹毒菌の感染防御抗原遺伝子のクローン
化 （１）大腸菌へのクローニング 感染防御抗原遺伝子のクローニングには、豚に敗血症を
起こし最も強毒である血清型ｌａのFujisawa株の染色体
ＤＮＡを使用した。染色体ＤＮＡはリゾチームとアセチ
ルムラミダーゼ（ムタノリシン、シグマ社製）で前処理
した菌体を、プロテイナーゼＫ（フナコシ社製）とＳＤ
Ｓ処理により溶菌し、フェノール・クロロホルム・イソ
アミルアルコールで除蛋白質後、エタノール沈殿して精
製した。

【００３７】染色体ＤＮＡをテンプレートにして（特願
平１１−９４００４）をもとに合成した２種類のプライ
マーＥＲＭ１（図２上段、配列番号２）ＥＲＲＶ１（図
２下段、配列番号３）を用いて豚丹毒菌の感染防御抗原
蛋白質遺伝子（図１）の一部（ｅｎ２）遺伝子（ｅｎ
２：図１の８８〜１，２９３番目までのポリヌクレオチ
ド：１，２０６ｂｐ）をＰＣＲ法で増幅した（図３、図
４）。

【００３８】ｅｎ２遺伝子の取得には、プライマーＥＲ
Ｍ１とプライマーＥＲＲＶ１を各々１００ｐｍｏｌ、Ｔ
ａｑポリメラーゼ（宝酒造製）２．５単位、ｄＮＴＰ
（宝酒造製）２００μＭ、ｐＳＫＷ２鋳型ＤＮＡ １ｎ
ｇ、１００μｌ Ｔａｑ緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸
（ｐＨ８．５）、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５０ｍＭ塩
化カリウム、１００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン）を
混合し、９６℃で３０秒保持した後、ＤＮＡの熱変性
（９４℃、６０秒）、プライマーのアニーリング（５４
℃、６０秒）、プライマーの伸長（７０℃、６０秒）を
２５サイクルさせることによって増幅させた。

【００３９】遺伝子ｅｎ２（１２０６ｂｐ）を、０．８
％アガロースゲル電気泳動に供し、断片を回収した。プ
ラスミドｐＴ Ｂｌｕｅ（Novagen社製）と先に得たｅ
ｎ２遺伝子断片をＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造製）を用
いて連結した。連結ＤＮＡを大腸菌ＪＭ１０９に形質転
換し、アンピシリン５０ｍｇ／ｍｌ含有ＬＢ寒天培地
（１．０％Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．５％Ｙｅａｓｔ Ｅ
ｘｔｒａｃｔ、１．０％ＮａＣｌ、１．５％寒天、ｐＨ
７．０）に塗布して、アンピシリン耐性を持つ株を選択
した。選択株よりプラスミドを抽出してｅｎ２遺伝子を
保持するプラスミドｐＴ Ｂｌｕｅ ｅｎを得た。ま
た、ここで得た株をＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴ７
Ｂｌｕｅ ｅｎ２とした。

【００４０】（２）ブレビバチルス・チョウシネンシス
へのクローニング Bacillus brevis HPD31-S5/pNH300TP17(FERM BP-5641)
をＮｃｏ Ｉ（宝酒造製）とＢａｍ ＨＩ（宝酒造製）
で処理した後、０．８％アガロースゲル電気泳動に供し
て４．０ｋｂの断片を回収した。さらに、ｐＴ７ Ｂｌ
ｕｅ ｅｎをＮｃｏ ＩとＢａｍ ＨＩで処理した後、
０．８％アガロースゲル電気泳動に供して１２０６ｂｐ
のｅｎ２遺伝子断片を回収し、先に得た４．０ｋｂの遺
伝子断片とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。

【００４１】連結ＤＮＡを用いてバチルス・ブレビスＨ
ＰＤ３１−Ｓ５（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６２３）（現在
は、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ
５（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６２３））をエレクトロポレー
ション法（Agric. Biol. Chem., 53, 3099-3100 (198
9)）で形質転換し、ネオマイシン５０ｍｇ／ｍｌ含有Ｔ
Ｍ寒天培地（１％ペプトン、０．２％酵母エキス、０．
５％肉エキス、１％グルコース、０．００１％ＦｅＳＯ
₄・７Ｈ₂Ｏ、０．００１％ＭｎＳＯ₄・４Ｈ₂Ｏ、０．０
００１％ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、１．５％寒天、ｐＨ７．
０）に塗布して、ネオマイシン耐性を持つ株を選択し
た。選択株よりプラスミドを抽出してｅｎ２遺伝子を保
持するプラスミドｐＮＨ３００ ｅｎ２を得た（図
５）。また、ここで得た株をバチルス・ブレビス（ブレ
ビバチルス・チョウシネンシス）ＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐ
ＮＨ３００ ｅｎ２とした。

【００４２】

【実施例２】形質転換体の培養 ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／
ｐＮＨ３００ ｅｎ２（FERM P−１７６９８）を中試験
管を用いてネオマイシン５０μｇ／ｍｌ含有ＴＭ液体培
地３ｍｌで３０℃で２日間振とう培養を行い、その培養
上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析を行った。ブレビバ
チルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＨ３
００ ｅｎ２培養から得られた感染防御抗原の推定分子
量は４６５５６４Ｄａであり、相当の分子量の位置に染
色バンドを示した。以後、４６．５ＫＰＡと呼ぶ。

【００４３】

【実施例３】４６．５ＫＰＡの生産と精製 ４６．５ＫＰＡを分泌生産する、得られた形質転換体
（ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５
／ｐＮＨ３００ ｅｎ２）をペプトン１％、酵母エキス
１％、ＭｇＳＯ₄５ｍＭ、ＭｎＳＯ₄１ｍＭ、ＦｅＳＯ₄
３６μＭ、グルコース２％、寒天１．５％、ｐＨ７．２
の寒天培地にて３０℃で一昼夜培養した。これを前記と
同じ組成の液体培地１００ｍＬを５００ｍｌ三角フラス
コに分注し、１２０℃、１５分間滅菌し、冷却後に接種
して３０℃で一晩振とう培養を行ったものを前培養液と
した。

【００４４】２Ｌジャーファーメンターに前培養と同じ
組成の生産培地１Ｌを分注した後、１２０℃で１５分間
滅菌し、冷却後、前培養液１０ｍｌを接種し、撹拌数４
５０ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍ、３０℃で３日間培養を行
った。

【００４５】培養物中の４６．５ＫＰＡ量をＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ及びデンシトメトリー装置で分析し、精製４６．
５ＫＰＡを標準品として同条件で比較して生産量を求め
た結果、培養物中に１．０ｇ／Ｌの４６．５ＫＰＡが生
産されていた（図６）。

【００４６】培養物１Ｌを０．２２μｍの精密濾過膜
（ペリコンカセットシステム（ミリポア社製）を用いて
菌体と４６．５ＫＰＡを５００ｍｌ程度まで濃縮後、５
０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．５）５Ｌを徐々に加えな
がら濾過し、培地由来の成分などの夾雑物を含む液を濾
過画分として除去した。

【００４７】次に、濃縮液のｐＨを、５Ｎ水酸化ナトリ
ウム水溶液を用いてｐＨ１１．０に調整し、前記と同じ
濾過膜を用いて濾過を行って菌体を濾過膜上にトラップ
し、４６．５ＫＰＡを濾過画分に回収した。また、濃縮
液に５０ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム液（ｐＨ１
１．０）１０Ｌを徐々に加えながら再度洗浄、濾過し、
濃縮液中に残っていた少量の４６．５ＫＰＡを濾過画分
に回収した。

【００４８】この４６．５ＫＰＡ含有液を、クロマトグ
ラフィー装置（Ｐ＆Ｐクロマトグラフィーシステム、東
ソー製）、ＤＥＡＥトヨパール６５０Ｍ（東ソー製）を
用い、陰イオン交換クロマトグラフィーに供し、夾雑蛋
白質を除去し目的蛋白質を分離精製を行った。最終的に
回収した４６．５ＫＰＡの回収率及び純度を求めた結
果、培養物からの４６．５ＫＰＡの回収率は６０％でそ
の純度は８０％であった（表１）。

【００４９】 （表１） 豚丹毒菌４６．５ＫＰＡ及び精製段階における濃度と回収率 ────────────────────────────────── 精製段階 容 積 濃 度 ４６．５ＫＰＡ量 回収率 (Ｌ) (g/L) （ｇ） （％） ────────────────────────────────── 培養液 ３ １．０ ３．０ １００ ０．２２μｍ ＭＦ膜処理 ３０ ０．０９ ２．７ ９０ ＤＥＡＥカラムクロマト ０．８ ２．２ １．８ ６０ ──────────────────────────────────

【００５０】

【発明の効果】本発明は、培養物から４６．５ＫＰＡを
非常に簡便且つ効率的に回収精製する方法を提供するも
のであって、特に工業的規模で該タンパク質を回収精製
するのに有効である。４６．５ＫＰＡ（そのアミノ酸配
列は、配列表の配列番号１に示される）は、豚丹毒菌抗
原活性を有するタンパク質であって、豚丹毒成分ワクチ
ン等豚丹毒菌の感染防御に使用できる抗原（豚丹毒菌防
御抗原）として移用できるものであり、特に本発明によ
って高純度の精製４６．５ＫＰＡを効率的に生産するこ
とがはじめて可能となったので、安全性が高くすぐれた
豚丹毒に対するワクチンを製造することが可能となっ
た。

【００５１】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Higeta Shoyu Co., Ltd. <120> Recovering and Purifying Method of Recombinant Protective Antigen against Erysipelothrix rhusiopathiae <130> 6250 <141> 2000-7-21 <160> 3 <210> 1 <211> 402 <212> PRT <213> Erysipelothrix rhusiopathiae <400> 1 Asp Ser Thr Asp Ile Ser Val Ile Pro Leu Ile Gly Glu Gln Val 5 10 15 Gly Leu Leu Pro Val Leu Pro Gly Thr Gly Val Bis Ala Gln Glu 20 25 30 Tyr Asn Lys Met Thr Asp Ala Tyr Ile Glu Lys Leu Val Ser Leu 35 40 45 Ile Asn Gln Lys Val Lys Pro Phe Leu Ile Asn Glu Pro Lys Gly 50 55 60 Tyr Gln Ser Phe Glu Ala Val Asn Glu Glu Ile Asn Ser Ile Val 65 70 75 Ser Glu Leu Lys Asn Glu Gly Met Ser Leu Gln Asn Ile His His 80 85 90 Met Phe Lys Gln Ser Ile Gln Asn Leu Ala Thr Arg Ile Gly Tyr 95 100 105 Arg Ser Phe Met Gln Asp Ala Met Tyr Leu Glu Asn Phe Glu Arg 110 115 120 Leu Thr Ile Pro Glu Leu Asp Glu Ala Tyr Val Asp Leu Leu Val 125 130 135 Asn Tyr Glu Val Lys His Arg Ile Leu Val Lys Tyr Glu Gly Lys 140 145 150 Val Lys Gly Arg Ala Pro Leu Glu Ala Phe Ile Val Pro Leu Arg 155 160 165 Asp Arg Ile Arg Ser Met Asn Glu Ile Ala Ala Glu Val Asn Tyr 170 175 180 Leu Pro Glu Ala His Glu Asp Phe Leu Val Ser Asp Ser Ser Glu 185 190 195 Tyr Asn Asp Lys Leu Asn Asn Ile Asn Phe Ala Leu Gly Leu Gly 200 205 210 Val Ser Glu Phe Ile Asp Tyr Asn Arg Leu Glu Asn Met Met Glu 215 220 225 Lys Glu Leu His Pro Leu Tyr Leu Glu Leu Tyr Ala Met Arg Arg 230 235 240 Asn Arg Gln Ile Gln Val Val Arg Asp Val Tyr Pro Asn Leu Glu 245 250 255 Arg Ala Asn Ala Val Val Glu Ser Leu Lys Thr Ile Lys Asp Ile 260 265 270 Lys Gln Arg Gly Lys Lys Leu Gln Glu Leu Leu Glu Ile Tyr Ile 275 280 285 Gln Arg Ser Gly Asp Val Arg Lys Pro Asp Val Leu Gln Arg Phe 290 295 300 Ile Gly Lys Tyr Gln Ser Val Val Asp Glu Glu Lys Asn Lys Leu 305 310 315 Gln Asp Tyr Leu Glu Ser Asp Ile Phe Asp Ser Tyr Ser Val Asp 320 325 330 Gly Glu Lys Ile Arg Asn Lys Glu Ile Thr Leu Ile Asn Arg Asp 335 340 345 Ala Tyr Leu Ser Met Ile Tyr Arg Ala Gln Ser Ile Ser Glu Ile 350 355 360 Lys Thr Ile Arg Ala Asp Leu Glu Ser Leu Val Lys Ser Phe Gln 365 370 375 Asn Glu Glu Ser Asp Ser Lys Val Glu Pro Glu Ser Pro Val Lys 380 385 390 Val Glu Lys Pro Val Asp Glu Glu Lys Pro Lys Asp 395 400 402 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 2 ggatccttaa tctttaggtt tttcttcatc 30 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 3 ccatggcttt cgctgattcg acagatattt ctg 33 ｃ

【図面の簡単な説明】

【図１】豚丹毒菌Ｆｕｊｉｓａｗａ株の１８８１ｂｐ感
染防御抗原遺伝子のヌクレオチド配列を示す。

【図２】豚丹毒菌４６．５ＫＰＡをコードする１２０６
ｂｐのポリヌクレオチドのＰＣＲクローニング用プライ
マー（配列番号２及び３）を示す。

【図３】豚丹毒菌Ｆｕｊｉｓａｗａ株の感染防御能を持
つ４６．５ＫＰＡをコードする１２０６ｂｐのポリヌク
レオチドのヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。

【図４】豚丹毒菌Ｆｕｊｉｓａｗａ株の感染防御能を持
つ４６．５ＫＰＡをコードする１２０６ｂｐのポリヌク
レオチドのヌクレオチド配列とアミノ酸配列のつづきを
示す。

【図５】豚丹毒菌の１２０６ｂｐの発現用プラスミドの
構造を示す。

【図６】豚丹毒菌の１２０６ｂｐで組換えたブレビバチ
ルス・チョウシネンシスにより生産された精製工程と電
気泳動像及びウエスタンブロッティング像を示す図面代
用写真である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:01 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 宮内 明 千葉県銚子市高田町３−850 (72)発明者 村橋 保昭 千葉県銚子市三軒町８−９ (72)発明者 横溝 祐一 茨城県つくば市並木４丁目11 919−103 (72)発明者 今田 由美子 茨城県つくば市吾妻18−１ 405−404 (72)発明者 辻 孝雄 愛知県豊明市沓掛町田楽ヶ窪１−98 学 校法人藤田学園 内 (56)参考文献 特許3072345（ＪＰ，Ｂ２) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A12N 15/00 - 15/90 A61K 31/00 - 48/00 A61P 1/00 - 43/00 C07K 14/00 - 16/46 C12N 1/00 - 9/99 C12P 1/00 - 41/00 ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤ Ｓ（ＳＴＮ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 豚丹毒菌防御抗原活性を有する蛋白質
   （４６．５ＫＰＡ）をコードする遺伝子で形質転換した
   ブレビバチルス・チョウシネンシスを培養し、その培養
   物を、 （１）精密濾過膜で濾過処理し、更に中性域〜弱アルカ
   リ域の緩衝液で洗浄して、菌体と共存する豚丹毒菌防御
   抗原蛋白質の不溶性沈殿を菌体を共存したまま濃縮する
   工程、 （２）菌体と共存する豚丹毒菌防御抗原蛋白質の不溶性
   沈殿と菌体の濃縮画分を精密濾過膜を用いてアルカリ緩
   衝液で洗浄することにより、豚丹毒菌防御抗原蛋白質を
   濾過画分に集める工程、 （３）濾過画分を陰イオン交換クロマトグラフィーによ
   り分離回収する工程、からなることを特徴とする豚丹毒
   菌防御抗原の回収精製法。
2. 【請求項２】 精密濾過膜としてポアサイズ０．８μｍ
   以下、好ましくは０．５μｍ以下の精製濾過膜を使用
   し、中性城〜弱アルカリ域の緩衝液として１０〜１００
   ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７〜９．５）を使用し、アルカ
   リ緩衝液として１０〜１００ｍＭグリシン−水酸化ナト
   リウム緩衝液（９〜１２）を使用し、イオン交換体とし
   て、ＤＥＡＥ、ＤＥＡＡ、ＴＥＡＥ、ＥＣＴＥＯＬＡか
   ら選ばれる少なくともひとつを用いて陰イオン交換クロ
   マトグラフィーを行うこと、を特徴とする、請求項１に
   記載の回収精製法。
3. 【請求項３】 豚丹毒菌防御抗原活性を有する蛋白質
   （４６．５ＫＰＡ）をコードする遺伝子で形質転換した
   ブレビバチルス・チョウシネンシスを培養し、その培養
   物を、 （１）０．２２μｍの精密濾過膜で濾過処理し、更に５
   ０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．５）で洗浄することによ
   って培養物中に含まれる培地由来の成分などの夾雑物を
   濾過画分に除き、菌体と共存する豚丹毒菌防御抗原蛋白
   質の不溶性沈殿を菌体を共存したまま濃縮する工程、 （２）菌体と共存する豚丹毒菌防御抗原蛋白質の不溶性
   沈殿と菌体の濃縮画分を０．２２μｍの精密濾過膜を用
   いて５０ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ
   １０〜１１）で洗浄することにより豚丹毒菌防御抗原蛋
   白質を可溶化せしめて、これを濾過画分に集める工程、 （３）濾過画分をＤＥＡＥによる陰イオン交換クロマト
   グラフィーにより分離回収する工程、 からなることを特徴とする豚丹毒菌防御抗原の回収精製
   法。
4. 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか１項に記載の回
   収精製法によって得られた高純度に精製された豚丹毒菌
   防御抗原を利用すること、を特徴とする豚丹毒予防用ワ
   クチンの製造方法。