CN116438193A - OmpA突变增强百日咳博德特氏菌中OMV产生 - Google Patents

Abstract

本发明涉及突变博德特氏菌(Bordetella)OmpA多肽。包含所述突变多肽的博德特氏菌具有高起泡表型。因此，本发明进一步涉及一种产生OMV的方法，其中所述方法包括在有利于产生OMV的条件下培养包含修饰的OmpA多肽的博德特氏菌属细菌群的步骤。此外，本发明涉及由包含突变OmpA多肽的博德特氏菌产生的OMV，以及此类OMV治疗和预防博德特氏菌感染的用途。

Description

OmpA突变增强百日咳博德特氏菌中OMV产生

发明领域

本发明属于疫苗学领域，特别是博德特氏菌(Bordetella)感染的预防或治疗领域。

本发明涉及具有增加的OMV产生的修饰的博德特氏菌属细菌，以及可从所述修饰的OMV细菌获得的OMV。本发明进一步涉及包含修饰的博德特氏菌和/或OMV的组合物以及所述组合物在预防和/或治疗博德特氏菌感染中的用途。

发明背景

百日咳，也称作顿咳(whooping cough)，是由百日咳博德特氏菌(Bordetella(B.)pertussis)引起的高度传染性呼吸道疾病。百日咳的特征是剧烈咳嗽发作，随后用力吸入并伴有特有的百日咳声。症状可因个人的年龄和/或免疫接种水平而异。婴儿尤其有可能进入危及生命状况的风险，这可能导致呼吸衰竭，从而导致死亡。除了危及婴儿生命的情况外，这种疾病在成年人中还造成社会和经济障碍。如今，百日咳在年龄较大的儿童和成人中比在新生儿和婴儿中更常诊断出。

百日咳博德特氏菌于1906年首次被确定为百日咳的病原体。百日咳博德特氏菌是一种专门感染人类的革兰氏阴性菌。细菌通过吸入呼吸道飞沫在人与人之间传播。大多数发达国家在1940-1950年间实施了百日咳疫苗接种。这种疫苗由灭活的百日咳博德特氏菌组合白喉和破伤风类毒素组成。通过引入婴儿疫苗接种计划，包括在生命的前半年注射三针，百日咳的发病率显著降低。这种降低表明这些所谓的全细胞百日咳(wP)疫苗的有效性。尽管有效并降低了发病率，但在1990年代后期，wP疫苗被无细胞(aP)疫苗所替代。替代的主要原因是与使用wP疫苗的一些严重并发症有关。aP疫苗含有一些最重要的百日咳博德特氏菌毒力因子的组合，例如百日咳毒素、丝状血凝素、百日咳杆菌粘附素和菌毛蛋白2和3。这些毒力因子引入了针对百日咳博德特氏菌的有效免疫应答。

由于对新生儿缺乏保护，研究了对这些年幼婴儿的不同保护策略。首先，aP疫苗接种计划应该可以防止百日咳感染，但在几项研究中已经描述了免疫性的衰减。此外，据报道百日咳博德特氏菌感染病例有所增加。除了初级疫苗接种计划外，还探索并建议了其它几种策略。自2006年以来，美国疾病控制与预防中心(CDC)推荐采用包覆策略(Cocoonstrategy)。通过这种策略，通过为家庭成员以及所有与新生儿定期接触的亲密人士施用aP加强疫苗来保护新生儿免受百日咳博德特氏菌感染。通过这种策略，在新生儿周围形成包覆。然而，仅形成包覆很可能不足以防止新生儿感染百日咳。资金也是包覆新生儿的一个限制因素，即使医院进行额外投资也是如此。研究的第二种策略是在妊娠期间接种疫苗，通过胎盘转移母体抗体是有效的。然而，母体抗体水平迅速降低，无法为超过6至8周的婴儿提供保护，并可能干扰初级疫苗接种方案诱导的主动免疫。刚出生后，新生儿可以通过接种DTaP(白喉、百日咳和破伤风的疫苗)或aP疫苗以及随后的常规疫苗接种计划来获得保护。这种方法受到婴儿后期针对重要的百日咳博德特氏菌毒素抗体水平降低的质疑。相比之下，其它研究观察到在婴儿后期对百日咳博德特氏菌的抗体应答增加，但对乙型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza B)和乙型肝炎的抗体水平降低。基于例如可持续性、财政和后勤因素，开发新疫苗被认为是长期最佳解决方案。

为了防止百日咳在世界范围内爆发并阻止其卷土重来，因此本领域迫切需要一种更有效的疫苗。在过去的几年里，越来越多的人开始关注使用外膜囊泡(OMV)作为潜在疫苗，因为获得了关于其对免疫调节的作用的更多了解(Ellis,T.N.and M.J.Kuehn,MMBR,2010.74(1):p.81-94)。OMV作为疫苗平台的一个优势是在OMV表面的天然构象中其广泛的抗原，可以诱导保护性免疫应答。此外，这些OMV配备了自身佐剂，很容易被免疫细胞摄取。所有这些性质共同使OMV对疫苗开发具有吸引力(van der Pol,L.,et al,BiotechnologyJournal,2015.10(11):p.1689-1706)。最近，成功开发并使用了由OMV组成的疫苗，例如基于OMV的脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)疫苗(Ellis,T.N.,如上；Fernández,S.,et al.,BMC Immunology,2013.14(Suppl 1):p.S8-S8)。除了注射源自脑膜炎奈瑟菌的OMV外，鼻内施用的OMV还诱导了高保护性抗体应答。此外，一些研究已经显示基于OMV的百日咳博德特氏菌疫苗针对百日咳的有前景的结果(Roberts,R.,etal.,Vaccine,2008.26(36):p.4639-4646；Acevedo,R.,et al.,Frontiers in Immunology,2014.5:p.121；Asensio,C.J.A.,et al.,Vaccine,2011.29(8):p.1649-1656)。

OMV可由革兰氏阴性菌产生，直径为约20至250纳米(nm)。OMV是通过出芽过程形成的，获得位于其表面暴露侧具有外膜(OM)的囊泡，但确切的机制仍知之甚少。被认为在出芽机制中起作用的事件是OM和肽聚糖(PG)层之间的联系较弱或缺失及在周质空间中的积累(蛋白质/分子)(van der Pol,L.,如上)。此外，OMV的生产率因物种、菌株甚至生长期而异。生产率会受到环境因素和压力的影响。OMV被认为是细菌的“样品包”，其含有大量原始生物学内容物的所有组成部分，但以非复制形式存在(Kaparakis-Liaskos,M.andR.L.Ferrero,Nat Rev Immunol,2015.15(6):p.375-387)。生物学内容物可包含核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、LPS、PG、酶和蛋白质，包括毒力因子和病原体相关分子模式(PAMP)。OMV在长距离递送、生物膜形成、促进发病机制、细菌存活和细菌群落内相互作用的调节中发挥作用。百日咳毒素、菌毛蛋白3和百日咳杆菌粘附素的存在先前在源自灭活百日咳博德特氏菌的蛋白脂质体中已经得到证实。这三种毒力因子被认为对百日咳博德特氏菌的毒力是重要的。OMV是由OM磷脂和其它蛋白质组成的蛋白脂质体。OMV有一个优势，因为其与实际细菌有更多共同点，因此与现在使用的aP疫苗相比更接近于模拟自然感染。除了模拟自然感染外，OMV还有另一个优势，因为其可以容易地被免疫细胞摄取，从而增强其免疫原性性质。OMV含有LPS，剂量过高可能会导致毒性作用。然而，其也可以作为天然佐剂发挥作用(Raeven,R.H.M.,et al.,Journal of Proteome Research,2015.14(7):p.2929-2942)。

百日咳博德特氏菌不分泌高水平的OMV。对于基于OMV的百日咳疫苗的可持续性，应优化自发形成的OMV的分泌率。已经设计了各种方案来增强革兰氏阴性细菌的囊泡产生，包括用洗涤剂或超声处理。然而，与自发产生的外膜囊泡(sOMV)相比，这些处理可能会改变OMV的组成和性质。在某些情况下，因此可以优选无洗涤剂和/或超声的方法。

因此，本领域需要增加博德特氏菌中OMV产生，特别是增加OMV疫苗产生。此外，仍然需要具有增加的起泡表型的修饰的博德特氏菌。此外，本领域需要具有增加的免疫原性、优选与增加的起泡表型组合的博德特氏菌。

发明概述

本发明可以总结为以下实施方案：

在一个实施方案中，本发明涉及包含与SEQ ID NO:1具有至少50％序列相同性的序列并且包含OmpA样结构域中的突变的多肽。

优选地，所述突变位于对应于SEQ ID NO:1的位置110-140中任一位置的位置。

优选地，与不包含所述突变而其它方面相同的多肽相比，包含所述突变的多肽当在博德特氏菌中表达时增加OMV产生。

在一个实施方案中，所述多肽中的突变是单个氨基酸残基的突变。

在一个实施方案中，所述多肽中的突变是氨基酸残基的取代，优选在对应于SEQID NO:1的位置124的位置处的取代，优选D124N取代。

在一个实施方案中，本发明涉及编码本发明的多肽的多核苷酸，优选其中所述多核苷酸与SEQ ID NO:4具有至少50％的序列相同性。

在一个实施方案中，本发明涉及一种博德特氏菌属细菌，其在编码与SEQ ID NO:1具有至少50％序列相同性的多肽的基因中包含基因组修饰，其中优选所述突变位于该基因的开放阅读框中。

在一个实施方案中，与不包含所述突变的相同细菌相比，所述突变增加博德特氏菌的OMV(外膜囊泡)产生。

在一个实施方案中，所述基因组修饰导致本发明多肽的表达。

在一个实施方案中，所述突变在包含与SEQ ID NO:2具有至少50％序列相同性的序列的基因中。

在一个实施方案中，所述博德特氏菌是百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌和支气管败血性博德特氏菌中的至少一种。

在一个实施方案中，所述博德特氏菌进一步包含在编码LpxA的内源基因中的突变。

在一个实施方案中，所述细菌还包含在编码百日咳杆菌粘附素(Pertactin)的内源基因中的突变。

在一个实施方案中，所述细菌还包含以下至少一个中的突变：

i)编码Ptx的内源基因；和

ii)编码DNT的内源基因。

在一个实施方案中，本发明涉及可从如本文定义的博德特氏菌获得的博德特氏菌OMV。

在一个实施方案中，本发明的博德特氏菌OMV包含如本文定义的多肽。

在一个实施方案中，本发明涉及一种产生OMV的方法，其中所述方法包括以下步骤：

i)在有利于产生OMV的条件下培养本发明的博德特氏菌属细菌群；和

ii)任选地，回收所述OMV。

在一个实施方案中，本发明涉及包含以下至少一项的组合物：

i)如本文定义的博德特氏菌，其中优选所述细菌是灭活的细菌；和

ii)如本文定义的OMV。

优选地，所述组合物是药物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及用作药物的如本文定义的组合物。

在一个实施方案中，所述组合物用于治疗或预防博德特氏菌感染。

优选地，所述感染是百日咳博德特氏菌感染。

在一个实施方案中，如本文定义的组合物或用于如本文定义用途的组合物是无细胞疫苗或细胞疫苗。

如本文定义的组合物或用于如本文定义用途的组合物优选进一步包含至少一种非博德特氏菌抗原。

定义

在整个说明书和权利要求书中使用了与本发明的方法、组合物、用途和其它方面有关的各种术语。除非另有说明，否则这些术语将被赋予其在本发明所属领域中的普通含义。其它具体定义的术语将以与本文提供的定义一致的方式解释。尽管与本文所述那些相似或等价的任何方法和材料可用于实践以测试本发明，但本文描述了优选的材料和方法。

实施本发明方法中使用的常规技术的方法对技术人员来说是明显的。分子生物学、生物化学、计算化学、细胞培养、重组DNA、生物信息学、基因组学、测序和相关领域中的常规技术的实践为本领域技术人员所熟知并且例如在以下文献中讨论：Sambrook etal.Molecular Cloning.A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989；Ausubel et al..CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,1987和定期更新；以及系列的Methods in Enzymology,Academic Press,San Diego。

“a”、“an”和“the”：这些单数形式术语包括复数指代，除非内容另有明确规定。因此，例如提及“a cell”包括两个或更多个细胞的组合等。

如本文所用，术语“约”用于描述和解释小变化。例如，该术语可以指小于等于±10％，例如小于等于±5％、小于等于±4％、小于等于±3％、小于等于±2％，小于等于±1％，小于等于±0.5％，小于等于±0.1％，或小于等于±0.05％。此外，数量、比率和其它数值有时在本文中以范围格式呈现。应当理解，这样的范围格式是为了方便和简洁而使用的，并且应当被灵活地理解为包括明确指定为限制范围的数值，而且还包括包含在该范围内的所有单个数值或子范围，就好像每个数值和子范围都是明确指定的。例如，在约1至约200范围内的比率应理解为包括明确列举的约1和约200的限制值，而且还包括单独的比率，例如约2、约3和约4，以及子范围如约10至约50、约20至约100等。

“和/或”：术语“和/或”是指其中一种或多种指定情况可能单独发生或与至少一种所述指定情况组合发生，直至所有所述指定情况。

“包含”：这个术语被解释为包括端点和开放式的，而不是排他性的。具体而言，该术语及其变化用语表示包括指定的特征、步骤或组分。这些术语不应解释为排除其它特征、步骤或组分的存在。

术语“同源性”、“序列相同性”等在本文中可互换使用。序列相同性在本文中定义为两个或更多个氨基酸(多肽或蛋白质)序列或两个或更多个核酸(多核苷酸)序列之间的关系，如通过比较序列所确定的。在本领域中，“相同性”还指氨基酸或核酸序列之间的序列相关性程度，这是通过由此类序列串之间的匹配确定。两个氨基酸序列之间的“相似性”通过将一种多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸取代与第二种多肽的序列进行比较来确定。“相同性”和“相似性”可以很容易地通过已知方法计算。

“序列相同性”和“序列相似性”可以通过使用全局或局部比对算法比对两个肽或两个核苷酸序列来确定，这取决于这两个序列的长度。相似长度的序列优选使用全局比对算法(例如Needleman Wunsch)比对，该算法在整个长度上最佳比对序列，而长度明显不同的序列优选使用局部比对算法(例如Smith Waterman)比对。当序列(当使用默认参数通过例如程序GAP或BESTFIT进行最佳比对时)共享至少一定最小百分比的序列相同性(如下定义)时，所述序列可被称为“基本相同”或“基本相似”。GAP使用Needleman和Wunsch全局比对算法在整个长度(全长)上比对两个序列，最大化匹配数并最小化空位数。当两个序列具有相似长度时，全局比对适用于确定序列相同性。通常，使用GAP默认参数，空位创建罚分＝50(核苷酸)/8(蛋白质)和空位延伸罚分＝3(核苷酸)/2(蛋白质)。对于核苷酸，使用的默认评分矩阵是nwsgapdna，对于蛋白质，默认评分矩阵是Blosum62(Henikoff&Henikoff,1992,PNAS 89,915-919)。可以使用计算机程序确定序列比对和序列相同性百分比分数，例如GCGWisconsin Package，版本10.3，可得自Accelrys Inc.,9685Scranton Road,San Diego,CA92121-3752USA，或使用开源软件，例如程序“needle”(使用全局Needleman Wunsch算法)或“water”(使用局部Smith Waterman算法)，EmbossWIN版本2.10.0，使用与上述GAP相同的参数，或使用默认设置(对于“needle”和“water’”二者以及对于蛋白质和对于DNA比对，默认Gap开放罚分是10.0，默认空位延伸罚分是0.5；蛋白质的默认评分矩阵是Blosum62，DNA的默认评分矩阵是DNAFull)。当序列具有显著不同的总长度时，优选局部比对，例如使用Smith Waterman算法的那些。

或者，可以通过使用诸如FASTA、BLAST等算法对公共数据库进行搜索来确定相似性或相同性百分比。因此，本发明的核酸和蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”以针对公共数据库进行搜索，以例如鉴定其它家族成员或相关序列。可以使用Altschul,etal.(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的BLASTn和BLASTx程序(2.0版)执行此类搜索。可以用NBLAST程序进行BLAST核苷酸搜索，得分＝100，字长＝12，以获得与本发明的ompA核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以用BLASTx程序进行，得分＝50，字长＝3，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以使用Gapped BLAST，如Altschul et al.,(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402所述。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用相应程序(例如BLASTx和BLASTn)的默认参数。参见National Center for Biotechnology Information的主页，网址为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/。

任选地，在确定氨基酸相似性程度时，技术人员还可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代，这对技术人员而言是清楚的。保守氨基酸取代是指具有相似侧链的残基的可互换性。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸，天冬氨酸-谷氨酸及天冬酰胺-谷氨酰胺。本文所公开的氨基酸序列的取代变体是其中所公开序列中的至少一个残基已被移除并在其位置插入不同残基的那些变体。优选地，氨基酸改变是保守的。每个天然存在的氨基酸的优选保守取代如下：Ala取代为ser；arg取代为lys；asn取代为gln或his；asp取代为glu；cys取代为ser或ala；gln取代为asn；glu取代为asp；gly取代为pro；his取代为asn或gln；ile取代为leu或val；leu取代为ile或val；lys取代为arg；gln或glu；met取代为leu或ile；phe取代为met,leu或tyr；ser取代为thr；thr取代为ser；trp取代为tyr；tyr取代为trp或phe；及val取代为ile或leu。

如本文所用，术语“选择性杂交”、“选择性地杂交”和类似术语旨在描述杂交和洗涤的条件，在该条件下，通常彼此至少66％、至少70％、至少75％、至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、优选至少95％、更优选至少98％或更优选至少99％同源的核苷酸序列保持彼此杂交。也就是说，这种杂交序列可共享至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少98％或更优选至少99％的序列相同性。

这种杂交条件的一个优选的、非限制性的实例是在约45℃在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后在约50℃、优选在约55℃、优选在约60℃、甚至更优选在约65℃在1×SSC、0.1％ SDS中洗涤一次或多次。

高严格条件包括例如在约68℃在5×SSC/5×Denhardt溶液/1.0％ SDS中杂交并在室温在0.2×SSC/0.1％ SDS中洗涤。或者，洗涤可在42℃进行。

本领域技术人员将知道哪些条件适用于严格和高严格的杂交条件。关于这种条件的其它指导在本领域中也容易获得，例如得自Sambrook et al.,1989,MolecularCloning,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,N.Y.；和Ausubel et al.(eds.),Sambrook and Russell(2001)"Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3rdedition),Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York 1995,Current Protocols in Molecular Biology,(John Wiley&Sons,N.Y.)。

当然，仅与polyA序列(例如mRNA的3’末端poly(A)序列)或与T(或U)残基的互补序列杂交的多核苷酸不包括在本发明的用于与本发明核酸的一部分特异性杂交的多核苷酸中，因为这样的多核苷酸会与任何含有poly(A)序列或其互补序列的核酸分子杂交(例如，几乎任何双链cDNA克隆)。

“核酸构建体”或“核酸载体”在本文中被理解为是指使用重组DNA技术产生的人工核酸分子。因此，术语“核酸构建体”不包括天然存在的核酸分子，尽管核酸构建体可以包含(部分)天然存在的核酸分子。术语“表达载体”或“表达构建体”是指能够实现基因在与此类序列相容的宿主细胞或宿主生物体中表达的核苷酸序列。这些表达载体通常至少包括合适的转录调节序列，和任选包括3’转录终止信号。也可以存在实现表达所必需或有帮助的其它因素，例如表达增强子元件。所述表达载体将被引入合适的宿主细胞并能够实现编码序列在宿主细胞的体外细胞培养物中表达。所述表达载体适合于在本发明的宿主细胞或生物体中复制。

如本文所用，术语“启动子”或“转录调节序列”是指一种核酸片段，其功能是控制一个或多个编码序列的转录，并且位于相对于编码序列的转录起始位点的转录方向的上游，并且通过DNA依赖性RNA聚合酶的结合位点、转录起始位点和任何其它DNA序列包括但不限于转录因子结合位点、阻遏蛋白和激活蛋白结合位点以及本领域技术人员已知的直接或间接调节启动子转录量的任何其它核苷酸序列的存在在结构上被鉴定。“组成型”启动子是在大多数生理和发育条件下在大多数细胞、优选细菌细胞中具有活性的启动子。“诱导型”启动子是例如通过应用化学诱导剂受生理或发育调节的启动子。

术语“选择标记”是本领域技术人员熟知的术语，在本文中用于描述任何遗传实体，当其表达时，可用于选择含有所述选择标记的一种或多种细胞。术语“报告基因”可与标记互换使用，尽管它主要用于指代可见标记，例如绿色荧光蛋白(GFP)。选择标记可以是显性的或隐性的或双向的。

如本文所用，术语“可操纵地连接”是指多核苷酸元件以功能关系的连接。当核酸被置于与另一个核酸序列的功能关系中时，该核酸被“可操纵地连接”。例如，如果转录调节序列影响编码序列的转录，则其可操纵地连接到编码序列。可操纵地连接是指被连接的DNA序列通常是连续的，并且在连接两个蛋白质编码区的情况中需要是连续且在阅读框中。

本文所用的术语“肽”定义为氨基酸残基链，通常具有确定的序列。如本文所用，术语肽可与术语“多肽”和“蛋白质”互换使用。在本发明的上下文中，术语“肽”定义为包含通过修饰或未修饰的肽键连接的至少两个氨基酸的任何肽或蛋白质。术语“肽”是指短链分子如寡肽或寡聚体或长链分子如蛋白质。蛋白质/肽可以是线性的、支链的或环状的。所述肽可包括D氨基酸、L氨基酸或其组合。根据本发明的肽可以包含修饰的氨基酸。因此，本发明的肽也可以通过自然过程如转录后修饰或通过化学过程进行修饰。这些修饰的一些实例是：乙酰化，酰化，ADP-核糖基化，酰胺化和去酰胺化，与黄素的共价键合，与血红素的共价键合，与核苷酸或核苷酸衍生物的共价键合，与修饰的或未修饰的碳水化合物部分的共价键合，与脂质或脂质衍生物的键合，与磷脂酰肌醇的共价键合，交联，环化，二硫键形成，去甲基化，半胱氨酸分子形成，焦谷氨酸形成，甲酰化，γ-羧化，羟基化，碘化，甲基化，氧化，磷酸化，外消旋化等。因此，不具有消除肽免疫原性作用的任何肽修饰均涵盖在本发明的范围内。

术语“基因”是指包含在细胞中被转录成RNA分子(例如mRNA)的区域(转录区)的DNA片段，可操纵地连接到合适的调节区(例如启动子)。基因通常包含几个可操纵连接的片段，例如启动子、5’前导序列、编码区和包含聚腺苷酸化位点的3’-非翻译序列(3’-末端)。“基因的表达”是指其中可操纵地连接到合适的调节区、特别是启动子的DNA区域被转录成具有生物活性的RNA即其能够被翻译成具有生物活性的蛋白质或肽的过程。当用于表示给定(重组)核酸或多肽分子与给定宿主生物体或宿主细胞之间的关系时，术语“同源”应理解为意指所述核酸或多肽分子在自然界中由相同物种的宿主细胞或生物体产生，优选相同品种或品系。如果与宿主细胞同源，则编码多肽的核酸序列通常(但不必需)可操纵地连接到其自然环境之外的另一个(异源)启动子序列，并且如果适用还可操纵地连接到另一个(异源)分泌信号序列和/或终止子序列。应当理解所述调节序列、信号序列、终止子序列等也可以与宿主细胞同源。

当与核酸(DNA或RNA)或蛋白质相关时，术语“异源”和“外源”是指不作为其存在于之中的生物体、细胞、基因组或DNA或RNA序列的一部分天然存在的核酸或蛋白质，或者在与其自然界中发现不同的细胞中或基因组或DNA或RNA序列中的一个或多个位置中发现。异源和外源核酸或蛋白质对于其被引入之中的细胞而言不是内源的，但是例如已从另一细胞获得或合成或重组产生。通常但不必需，此类核酸编码蛋白质即外源蛋白质，所述蛋白质通常不由转录或表达所述DNA的细胞产生。类似地，外源RNA可以编码在存在所述外源RNA的细胞中通常不表达的蛋白质。异源/外源核酸和蛋白质也可称为外源核酸或蛋白质。本领域技术人员认为对于表达其的细胞而言是外来的任何核酸或蛋白质在本文中包括在术语异源或外源核酸或蛋白质中。术语异源和外源也适用于核酸或氨基酸序列的非天然组合，即组合中至少两个被组合的序列相对于彼此是外来的。

本文所用的术语“免疫应答”是指产生抗体和/或免疫细胞(如T淋巴细胞)，其针对特定抗原性实体和/或协助特定抗原性实体的分解和/或抑制，所述抗原性实体表面携带和/或表达或呈递抗原和/或抗原性表位。出于本发明的目的，短语“有效免疫保护应答”、“免疫保护”等术语是指针对病原体、病原体感染的细胞或癌细胞的一个或多个抗原性表位的免疫应答，以便在接种受试者中针对病原体感染或癌症起保护作用。出于本发明的目的，针对病原体感染的保护或针对癌症的保护不仅包括绝对预防感染或癌症，而且还包括例如与未接种的感染的受试者相比，任何可检测的病原体感染或癌症程度或速度的降低，或接种的受试者中由病原体感染或癌症引起的疾病或任何症状或病症的严重程度的可检测的降低。在癌症的情况下，有效免疫保护应答还包括清除癌细胞，从而缩小癌症的大小或甚至消除癌症。为了实现这一点而进行的疫苗接种也称为治疗性疫苗接种。或者，可以在接种疫苗时在先前未感染病原体和/或未感染病原体或尚未患癌症的受试者中诱导有效免疫保护应答，这种疫苗接种可称为预防性接种疫苗。

根据本发明，术语“抗原”在本文中的一般使用是指特异性结合抗体的任何分子。该术语还指可以被MHC分子结合并呈递给T细胞受体的任何分子或分子片段。抗原可以是例如蛋白质样分子，即聚氨基酸序列，任选包含非蛋白质基团例如碳水化合物部分和/或脂质部分，或者抗原可以是例如不是蛋白质的分子，例如碳水化合物。抗原可以是例如蛋白质的任何部分(肽、部分蛋白质、全长蛋白质)，其中蛋白质是天然存在的或合成衍生的、细胞组合物(全细胞、细胞裂解物或破碎的细胞)、生物体(整个生物体、裂解物或破碎的细胞)或碳水化合物或其它分子，或其部分，其能在特定受试者中引发抗原特异性免疫应答(体液和/或细胞免疫应答)，所述免疫应答优选可通过某测定或方法测量。

术语“抗原”在本文中被理解为充当适应性免疫应答的受体的靶的结构物质。因此，抗原充当TCR(T细胞受体)或BCR(B细胞受体)或BCR的分泌形式(即抗体)的靶。因此，抗原可以是蛋白质、肽、碳水化合物或通常是较大结构例如细胞或病毒体的一部分的其它半抗原。抗原可以源自体内(“自身抗原”)或外部环境(“非自身抗原”)。由于胸腺中T细胞的负选择，免疫系统在正常情况下通常不会对“自身”抗原产生反应，并且应该仅识别和攻击来自外界的“非自身”入侵者或在例如疾病状况下机体存在的修饰/有害物质。作为细胞免疫应答靶的抗原结构由抗原呈递细胞(APC)以加工过的抗原性肽的形式通过组织相容性分子呈递给适应性免疫系统的T细胞。根据呈递的抗原和组织相容性分子的类型，可以激活几种类型的T细胞。对于T细胞受体(TCR)识别，抗原在细胞内被加工成小肽片段并通过主要组织相容性复合体(MHC)呈递给T细胞受体。

术语“免疫原”在本文中用于描述包含或编码抗原的至少一个表位的实体，由此当优选与适当的佐剂一起施用于受试者时，在受试者中引发针对所述表位和包含该表位的抗原的特异性体液和/或细胞免疫应答。免疫原可以与抗原相同或至少包含抗原的一部分，例如包含抗原的表位的部分。因此，在一个实施方案中，针对特定抗原对受试者进行疫苗接种意味着，作为施用包含抗原的至少一个表位的免疫原的结果，引发针对所述抗原或其免疫原性部分的免疫应答。疫苗接种优选产生保护性或治疗性效果，其中随后暴露于抗原(或抗原来源)引发针对所述抗原(或来源)的免疫应答，从而减少或预防受试者的疾病或病症。疫苗接种的概念是本领域众所周知的。与不施用所述疫苗相比，通过施用本发明的预防性或治疗性组合物的引发的免疫应答可以是免疫状态的任何方面的任何可检测变化(例如细胞应答、体液应答、细胞因子产生)。

“表位”在本文中定义为给定抗原内足以在受试者中引发免疫应答的单一免疫原性位点。本领域技术人员将认识到T细胞表位在大小和组成上与B细胞表位不同，并且通过I类MHC途径呈递的T细胞表位不同于通过II类MHC途径呈递的表位。根据免疫应答的类型，表位可以是线性序列或构象表位(保守结合区)。抗原可以小到单个表位，也可以更大，并且可以包括多个表位。因此，抗原的大小可以小如约5至12个氨基酸(例如肽)，也可以大至如：全长蛋白质，包括多聚体蛋白质、蛋白质复合物、病毒体、颗粒、全细胞、整个微生物，或其部分(例如全细胞的裂解物或微生物的提取物)。

佐剂在本文中被理解为这样一种实体，当其与抗原联合施用于人或动物受试者以在受试者中产生针对抗原的免疫应答时，其刺激免疫系统，从而激发、增强或促进针对所述抗原的免疫应答，优选不必需产生针对佐剂本身的特异性免疫应答。与在相同条件下但没有佐剂的情况下针对抗原产生的免疫应答相比，优选的佐剂将针对给定抗原的免疫应答增强至少1.5、2、2.5、5、10或20倍。用于确定由佐剂在一组动物或人受试者中相对于相应的对照组产生的针对给定抗原的免疫应答的统计学平均增强的测试在本领域中是可利用的。所述佐剂优选能够增强针对至少两种不同抗原的免疫应答。

OMV(也称为“小泡(bleb)”)是双层膜结构，通常为球形，直径在20-250nm(有时为10-500nm)范围内，其是从革兰氏阴性菌的外膜上夹断的。OMV膜内部含有磷脂(PL)，外部含有脂多糖(LPS)和PL，并在不同位置与膜蛋白混合，很大程度上反映了其从中夹断的细菌外膜的结构。OMV的内腔可含有来自周质或胞质的各种化合物，例如蛋白质、RNA/DNA和肽聚糖(PG)，但是与细菌细胞不同，OMV缺乏自我复制的能力。在本发明的上下文中，根据其产生方法可以区分三种类型的OMV。sOMV是自发的或天然的OMV，通过将完整的细胞与已经形成的OMV分离而从培养物上清液中纯化和浓缩。洗涤剂OMV，dOMV，是用如去氧胆酸盐等洗涤剂从细胞中提取的，所述洗涤剂也可以降低反应原性LPS的含量。在经洗涤剂提取后，使dOMV与细胞和细胞碎片分离，并进一步纯化和浓缩。最后，术语天然nOMV在本文中用于描述使用非洗涤剂细胞破碎技术从浓缩的死细胞中产生的OMV，或者使用其它(非破坏性)无洗涤剂方法(例如使用螯合剂如EDTA)从细胞中提取的OMV，以便能够将其与野生型自发OMV和洗涤剂提取的dOMV区分开来。一种特定类型的nOMV是“eOMV”，其在本文中用于描述使用螯合剂EDTA从细胞中提取的OMV。

本文对公共序列数据库中可访问的核苷酸或氨基酸序列的任何引用指的是在本文件的申请日可获得的序列条目的版本。

发明详述

多肽

本发明涉及令人惊讶的发现：博德特氏菌(Bordetella)ompA基因中的突变增加了OMV产生。换句话说，在内源性ompA基因中具有突变的博德特氏菌具有所谓的高起泡表型。博德特氏菌OmpA多肽可具有如SEQ ID NO:1注释的序列。

OmpA包含N末端结构域，该结构域横穿具有八个反平行β链的OM。C末端结构域保留在周质中并提示与PG层相互作用(Confer,A.W.and S.Ayalew,Veterinary Microbiology,2013.163(3–4):p.207-222；Mittal,R.,et al.,The Journal of Biological Chemistry,2011.286(3):p.2183-2193)。缺乏OmpA的大肠杆菌(E.coli)、沙门氏菌属(Salmonellaspp.)和鲍曼不动杆菌(A.baumannii)显示出增加的OMV产生(Schwechheimer C.andM.J.Kuehn,Nat Rev Micro,2015.13(10):p.605-619)。此外，奈瑟氏菌属(Neisseria)中周质蛋白RmpM的缺失导致OMV产量增加(Maharjan,S.,et al.,Microbiology,2016.162(2):p.364-375；van de Waterbeemd et al,Vaccine 2010,28(30):4810-4516)。RmpM与大肠杆菌(Klugman K.P.et al,Infect Immun,1989,57(7):2066-71)、百日咳博德特氏菌(B.pertussis)和各种其它革兰氏阴性菌种的外膜蛋白A(OmpA)具有有限同源性。

博德特氏菌中OmpA(BP0943)或任何OmpA同系物BP2019和BP3342的缺失已示出不利于存活力(未发表的结果)。因此，OmpA及其同系物似乎是博德特氏菌存活所必需的蛋白质。令人惊讶的是，博德特氏菌OmpA中的特定突变提供了具有高起泡表型的活细菌。

第一方面，本发明涉及突变OmpA多肽，即具有突变的OmpA多肽。优选地，本发明涉及包含与SEQ ID NO:1具有至少约50％序列相同性的序列的多肽，并且其中所述多肽包含突变。

优选地，与不包含所述突变而其它方面相同的多肽相比，包含所述突变的多肽当在博德特氏菌中表达时增加OMV产生。优选地，与表达内源性OmpA多肽、其它方面相同的博德特氏菌相比，表达包含如本文定义的突变的OmpA多肽的博德特氏菌具有增加的OMV产生。优选地，除了内源性多肽不包含所述突变之外，所述内源性OmpA多肽与包含所述突变的多肽相同。

包含所述突变的突变多肽可包含与SEQ ID NO:1具有至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或至少约100％的序列相同性的序列。优选地，所述多肽可包含具有SEQ ID NO:1的序列，除了如本文定义的突变之外。

包含所述突变的突变多肽可包含与具有NCBI参考序列NP879744.1的序列具有至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或至少约100％序列相同性的序列。优选地，所述多肽可以包含具有NCBI参考序列NP879744.1的序列，除了如本文定义的突变之外。

突变多肽可以是具有SEQ ID NO:1的OmpA多肽的直系同源物的突变体或旁系同源物的突变体，优选所述突变多肽可以是OmpA多肽的直系同源物的突变体。优选地，所述直系同源物是副百日咳博德特氏菌(B.parapertussis)OmpA或支气管败血性博德特氏菌(B.bronchiseptica)OmpA。优选地，副百日咳博德特氏菌OmpA与SEQ ID NO:8具有至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或至少约100％的序列相同性，除了如本文定义的突变之外。优选地，所述突变位于对应于SEQ ID NO:1中D124位置的位置。优选地，支气管败血性博德特氏菌OmpA与SEQ ID NO:9具有至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或至少约100％序列相同性，除了如本文定义的突变之外。优选地，所述突变发生在对应于SEQ ID NO:1中D124位置的位置。

所述突变多肽可包含与SEQ ID NO:3具有至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或至少约100％序列相同性的序列。

优选地，所述突变位于所述多肽的OmpA样结构域中。优选地，OmpA样结构域与SEQID NO:1的75-191位置具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％序列相同性。因此，所述多肽优选在对应于SEQ ID NO:1的位置75-191任一位置的位置具有突变。

所述突变可位于对应于SEQ ID NO:1中位置110-140任一位置的位置。优选地，所述突变可位于对应于SEQ ID NO:1的位置80-180、85-170、90-160、95-150、100-140、110-140、110-130、115-130、120-128或122-126任一位置的位置。所述突变可位于对应于SEQ IDNO:1的位置120、121、122、123、124、125、126、127、128、129和130的任一位置、优选SEQ IDNO:1的位置122、123、124、125、126的任一位置的位置。优选地，所述突变位于对应于SEQ IDNO:1的位置124的位置。

优选地，包含所述突变的OmpA多肽是内源性蛋白质，除了如本文定义的突变之外。因此，优选地，所述OmpA多肽可衍生自博德特氏菌属细菌，并且其中所述OmpA多肽还包含如本文定义的突变。

在一个实施方案中，所述突变是在与SEQ ID NO:1具有至少50％序列相同性的序列中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基的突变。优选地，所述突变是在与SEQ IDNO:1具有至少约50％序列相同性的序列中的1、2、3、4或5个氨基酸残基的突变。优选地，所述突变是在与SEQ ID NO:1具有至少50％序列相同性的序列中的单个氨基酸残基的突变。

所述突变可以是一个或多个氨基酸残基的缺失、添加和取代中的任一种。优选地，所述突变是单个氨基酸残基的缺失、添加和取代中的至少一种。优选地，所述突变是单个氨基酸残基的取代。优选地，所述突变是对应于SEQ ID NO:1中位置124的氨基酸残基的取代。优选地，所述突变是对应于SEQ ID NO:1中位置124的位置处的天冬氨酸氨基酸残基的取代。

氨基酸残基取代可以是保守或非保守氨基酸残基取代。保守氨基酸残基取代在本文中被定义为将氨基酸残基用具有相似生化性质的不同氨基酸残基取代，例如具有相似电荷、疏水性和大小中的至少一种。

优选地，酸性残基可以被不同酸性残基取代。优选地，酸性残基选自天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。

优选地，碱性残基可以被不同碱性残基取代。优选地，碱性残基选自组氨酸、赖氨酸和精氨酸。

优选地，脂肪族残基可以被不同脂肪族残基取代。优选地，脂肪族残基选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。

优选地，含羟基或硫/硒的残基可以取代为不同的含羟基或硫/硒的残基。优选地，含羟基或硫/硒的残基选自丝氨酸、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸。

优选地，芳族残基可以被不同芳族残基取代。优选地，芳族残基选自苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。

在本发明的突变多肽中，优选天冬氨酸、优选在对应于SEQ ID NO:1中位置124的位置的天冬氨酸可以被取代为谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺中的至少一种。优选地，天冬氨酸、优选对应于SEQ ID NO:1中位置124的位置的天冬氨酸可以被取代为天冬酰胺(即D至N的取代)。

优选地，本发明的突变多肽与SEQ ID NO:3具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或至少约100％的序列相同性。

优选地，所述多肽从其自然环境中分离。所述多肽可以是重组、合成或人工多肽。

多核苷酸

在第二方面，本发明涉及编码如本文定义的多肽的多核苷酸。优选地，所述多核苷酸编码与SEQ ID NO:1具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多肽，除了如本文定义的突变之外。可以优化部分或全部密码子以在细菌中表达，优选在博德特氏菌中表达，优选在如本文定义的博德特氏菌中表达。所述密码子可以与内源性博德特氏菌ompA编码序列的密码子相同，除了如本文定义的突变之外。所述多核苷酸之前可以是内源启动子，优选驱动OmpA在博德特氏菌中表达的内源启动子。优选地，将所述多核苷酸与其天然环境分离。所述多肽可以是重组、合成或人工多核苷酸。所述多核苷酸可包含一种或多种在天然存在的博德特氏菌OmpA编码多核苷酸中不存在的核苷酸。

优选地，所述多核苷酸具有一种或多种在天然存在的博德特氏菌OmpA编码多核苷酸中不存在的核苷酸。

优选地，所述多核苷酸与SEQ ID NO:4具有至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或至少约100％的序列相同性。

优选地，所述多核苷酸与SEQ ID NO:2具有至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或至少约100％的序列相同性，除了如上文定义的突变之外。优选地，所述多核苷酸与SEQ ID NO:2具有至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或至少约100％的序列相同性，除了在位置370、371和/或372的突变之外，即对应于SEQ ID NO:1的位置124的密码子。

在第三方面，本发明涉及编码如第一方面定义的多肽的基因。优选地，所述基因包含如第二方面定义的多核苷酸。所述基因可包含调节OmpA多肽表达的元件。优选地，所述基因包含控制如本文定义的突变的(OmpA)多肽表达的启动子。所述启动子可以是组成型活性启动子或诱导型启动子。所述启动子可以是驱动博德特氏菌中OmpA表达的内源性启动子。

在第四方面，本发明涉及包含第二方面的多核苷酸和第三方面的基因中至少之一的载体。所述载体优选适合于转化入细菌，优选适合于转化入博德特氏菌。优选地，所述载体是DNA质粒，优选裸DNA质粒。

博德特氏菌

在第五方面，本发明涉及遗传修饰的博德特氏菌。优选地，与不包含所述突变而其它方面相同的博德特氏菌相比，优选地当在相同条件下生长时，所述遗传修饰的博德特氏菌具有增加的OMV产生。优选地，所述遗传修饰的博德特氏菌包含和/或表达如本文定义的修饰的多肽。优选地，所述遗传修饰的博德特氏菌不包含内源性OmpA多肽。

在一个实施方案中，本发明的博德特氏菌包含修饰，优选基因组修饰，其中所述修饰导致如本文定义的突变OmpA多肽的表达。优选地，所述修饰的博德特氏菌不表达内源性OmpA多肽。

所述修饰可以是如本文定义的载体的插入。所述载体可以保持附加型或可以插入细菌基因组中。所述修饰可以是将如本文定义的多核苷酸和基因至少之一插入博德特氏菌基因组中。修饰的博德特氏菌可进一步包含减少或消除内源性OmpA多肽表达的修饰。优选地，遗传修饰的博德特氏菌可包含减少或消除内源性OmpA多肽表达的基因组修饰，优选OmpA基因中的基因组修饰。优选地，OmpA基因中的突变是在控制内源性OmpA多肽表达的调节元件中的基因组修饰或OmpA多肽编码序列中的突变。

所述修饰可以是自杀载体的插入，优选自杀载体pSS1129(Stibitz，S.，Use ofconditionally counterselectable suicide vectors for allelic exchange.MethodsEnzymol，1994.235：p.458-65)。自杀载体的插入导致突变OmpA多肽的表达，以及内源性OmpA多肽的表达缺失。

所述修饰可以是博德特氏菌基因组的修饰，其中所述修饰修饰内源性OmpA多肽的编码序列，导致如本文定义的突变OmpA多肽的表达。可以使用本领域技术人员已知的任何合适手段来修饰基因组编码的OmpA多肽。优选地，所述突变位于编码序列中和/或优选所述突变导致如本文定义的突变OmpA多肽的表达。

优选地，本发明的遗传修饰的博德特氏菌细菌在编码多肽的序列中包含基因组修饰，所述多肽与SEQ ID NO:1具有至少约35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或至少约100％的序列相同性，其中所述突变导致增加OMV产生的突变多肽的表达。优选地，所述突变导致如本文定义的突变多肽的表达。

优选地，本发明的遗传修饰的博德特氏菌细菌在编码序列中包含基因组修饰，所述编码序列与SEQ ID NO:2具有至少约35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或至少约100％的序列相同性，其中所述突变导致增加OMV产生的突变多肽的表达。优选地，所述突变导致如本文定义的突变多肽的表达。

优选地，本发明的遗传修饰的博德特氏菌细菌包含在编码多肽的基因中的基因组修饰，所述多肽与SEQ ID NO:8具有至少约35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或至少约100％的序列相同性，其中所述突变增加OMV产生。

优选地，本发明的遗传修饰的博德特氏菌包含在编码多肽的基因中的基因组修饰，所述多肽与SEQ ID NO:9具有至少约35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或至少约100％的序列相同性，其中所述突变增加OMV产生。

优选地，与不包含如本文定义的突变而其它方面相同或基本相同的博德特氏菌相比，OMV产生增加。OMV产生在本文中理解为是sOMV(自发或天然OMV)产生、dOMV(洗涤剂OMV)产生和nOMV(天然OMV)产生中至少之一。优选地，如本文定义的OMV产生是指sOMV和dOMV产生中至少之一。

优选地，OMV产生增加至少约1.5倍，或至少增加2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或至少约100倍。OMV产生的增加可取决于包含如本文定义的所述突变的博德特氏菌菌株。

优选地，自发或上清液(sOMV)产生或产量增加至少约1.5倍，或至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或至少约100倍。此外或或者，洗涤剂OMV(dOMV)产生或产量增加至少约1.5倍，或至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或至少约100倍。此外或或者，天然OMV(nOMV)产生或产量增加至少约1.5倍，或至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或至少约100倍。另外或或者，EDTA-提取的(eOMV)产生或产量增加至少约1.5倍，或至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或至少约100倍。

博德特氏菌的OMV产生可以使用本领域已知的任何常规方法来确定。作为非限制性实例，可以使用FM4-64测定来确定OMV产量。

修饰的细菌优选地是博德特氏菌，优选选自Bordetella ansorpii、鸟博德特氏菌(Bordetella avium)、支气管博德特氏菌(Bordetella bronchialis)、支气管败血性博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)、Bordetella flabilis、欣茨博德特氏菌(Bordetella hinzii)、霍氏博德特氏菌(Bordetella holmesii)、Bordetella muralis、副百日咳博德特氏菌(Bordetella parapertussis)、百日咳博德特氏菌、彼得氏博德特氏菌(Bordetella petrii)、伪欣氏博德特氏菌(Bordetella pseudohinzii)、Bordetellasputigena、Bordetella trematum、Bordetella tumbae和Bordetella tumulicola。优选地，用于本发明的博德特氏菌是百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌和支气管败血性博德特氏菌中的至少一种。优选地，修饰的博德特氏菌是百日咳博德特氏菌。

在一个优选的实施方案中，修饰的博德特氏菌是百日咳博德特氏菌。优选地，所述遗传修饰的细菌是百日咳博德特氏菌Tohama I菌株或其衍生物。优选地，衍生物Tohama I菌株是Tohama I菌株的链霉素抗性衍生物，并且最优选所述遗传修饰的细菌衍生自菌株B213或其衍生物。或者，遗传修饰的细菌是百日咳博德特氏菌B1917或B1920菌株或其衍生物。

此外或或者，如本文定义的修饰的博德特氏菌可包含以下至少一种突变：

-导致如本文定义的突变OmpA多肽表达的突变；

-导致Prn93(93kDa百日咳杆菌粘附素)保留在外膜中的突变；

-导致异源酰基转移酶活性的突变；

-导致百日咳毒素(Ptx)去毒的突变；以及

-减少或消除皮肤坏死毒素(DNT)表达的突变。

在一个实施方案中，如本文定义的修饰的博德特氏菌可包含以下突变：

-导致如本文定义的突变OmpA多肽表达的突变；和

-导致Prn93(93kDa百日咳杆菌粘附素)保留在外膜中的突变。

在一个实施方案中，如本文定义的修饰的博德特氏菌可包含以下突变：

-导致如本文定义的突变OmpA多肽表达的突变；和

-导致异源酰基转移酶活性的突变。

在一个实施方案中，如本文定义的修饰的博德特氏菌可包含以下突变：

-导致如本文定义的突变OmpA多肽表达的突变；和

-导致百日咳毒素(Ptx)去毒的突变。

在一个实施方案中，如本文定义的修饰的博德特氏菌可包含以下突变：

-导致如本文定义的突变OmpA多肽表达的突变；和

-减少或消除皮肤坏死毒素(DNT)表达的突变。

在一个实施方案中，如本文定义的修饰的博德特氏菌包含以下突变：

-导致如本文定义的突变OmpA多肽表达的突变；

-导致Prn93(93kDa百日咳杆菌粘附素)保留在外膜中的突变；

-导致异源酰基转移酶活性的突变；

-导致百日咳毒素(Ptx)去毒的突变；以及

-减少或消除皮肤坏死毒素(DNT)表达的突变。

百日咳杆菌粘附素(93kDa)

在一个实施方案中，如本文定义的修饰的博德特氏菌进一步包含导致Prn93(93kDa百日咳杆菌粘附素)保留在外膜中的突变，优选导致Prn93保留在OMV中。

百日咳杆菌粘附素(Prn)是一种已知的保护性抗原。Prn是一种自转运蛋白，在生长期间由百日咳博德特氏菌切割掉。如本文定义的修饰的博德特氏菌优选包含防止自催化切割的突变，导致全长Prn(93kDa)保留在OMV中而不是Prn(69kDa)脱落在环境中。

百日咳杆菌粘附素多肽优选与SEQ ID NO:5具有至少约35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或至少约100％的序列相同性，并且包含防止自催化切割的突变。优选地，所述突变在对应于SEQ ID NO:5的位置D738的位置。优选地，所述突变是保守氨基酸残基的取代。优选地，所述突变是Asp(D)至Asn(N)的取代，优选D738N突变。优选地，所述突变的百日咳杆菌粘附素多肽与SEQ IDNO:11具有至少约35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或至少约100％的序列相同性。

优选地，OMV中Prn93的保留增加了OMV的保护性免疫性。本发明人发现将Prn93保留在OMV的外膜中令人惊讶地导致OMV的免疫原性显著增加，例如当与OMV组合相同量的(纯化的)Prn的免疫原性相比时。优选地，在其外膜中包含Prn93的OMV的保护性免疫性与不包含Prn93组合、相同或相似量的(纯化的)百日咳杆菌粘附素的相同或相似OMV的保护性免疫性相比增加约1.5、2、2.5、3、3.5或至少约4倍。可以使用本领域已知的任何常规手段来确定保护性免疫性。优选地，保护性免疫性在小鼠接种后通过鼻内施用攻击并测定抗-Prn抗体浓度来测定。

酰基转移酶

在一个实施方案中，如本文定义的修饰的博德特氏菌还包含异源酰基转移酶活性。因此，修饰的博德特氏菌优选进一步包含引入异源酰基转移酶活性的修饰。优选地，所述修饰是如WO2018/167061中描述的修饰，所述专利通过引用并入本文。

引入异源酰基转移酶活性的修饰可以赋予细胞异源LpxA和异源LpxD酰基转移酶活性中的至少一种。

优选地，所述修饰引入异源lpxA和异源lpxD基因中至少一种基因的表达。优选地，所述修饰引入至少异源lpxA基因的表达。优选地，所述修饰是基因组修饰。

优选地，异源lpxA基因具有编码LpxA酰基转移酶的核苷酸序列，所述酶与SEQ IDNO:6具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或至少约100％的氨基酸序列相同性。lpxA基因可以得自或可得自假单胞菌属(Pseudomonas)，优选铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)物种。

优选地，异源lpxD基因具有编码LpxD酰基转移酶的核苷酸序列，所述酶与SEQ IDNO:7具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或至少约100％的氨基酸序列相同性。lpxD基因可以得自或可得自假单胞菌属，优选铜绿假单胞菌物种。

优选地，修饰的博德特氏菌还包含降低或消除分别由内源lpxA基因和/或内源lpxD基因编码的LpxA和/或LpxD酰基转移酶的活性的基因组修饰。

将异源酰基转移酶活性引入博德特氏菌中已在本领域中显示可降低LPS内毒性。本发明人现在发现，在博德特氏菌中引入异源LpxA酰基转移酶还增加OMV产生，即导致高起泡表型。特别地，如本文定义的异源酰基转移酶活性令人惊讶地增加sOMV和nOMV至少之一的产生。

百日咳毒素(Ptx)

虽然百日咳毒素是分泌的，且因此不是OMV的部分，但有少量可能残留在OMV中或OMV上。因此，在一个实施方案中，如本文定义的修饰的博德特氏菌还包含降低或消除百日咳毒素(Ptx)毒性的突变。优选地，所述突变导致与SEQ ID NO:5具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的百日咳毒素的毒性降低或消除。

本领域已知的对Ptx部分或完全去毒的任何合适方法同样适用于本发明。作为非限制性实例，可以将一种或多种突变引入Ptx基因中，这些突变导致部分或完全去毒的Ptx。这些一种或多种突变可以是点突变，例如但不限于可导致Ptx亚基1中酶促位点失活的点突变。这种突变可以预防或减少小鼠的白细胞增多等。优选的突变位于氨基酸序列SEQ IDNO:12的R43和/或E163，优选位置43和/或位置163，优选R43K和/或E163G突变。

皮肤坏死毒素(DNT)

博德特氏菌OMV可包含少量细胞质蛋白皮肤坏死毒素(DNT)，残留的DNT可有助于OMV的反应原性。DNT之所以得名，是因为当将其在小鼠皮下注射时可导致坏死性皮肤损伤。在一个实施方案中，如本文定义的修饰的博德特氏菌进一步包含导致DNT表达减少或完全不存在的突变。优选地，所述DNT具有与SEQ ID NO:10具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、99％或100％序列相同性的序列。

作为非限制性实例，可以通过敲低或敲除编码DNT的基因来减少dnt基因表达，例如但不限于对控制DNT表达的元件的基因组修饰和/或对编码DNT的序列的基因组修饰。

外膜囊泡(OMV)

另一方面，本发明涉及可得自或得自如本文定义的修饰的博德特氏菌的博德特氏菌OMV。

一方面，本发明涉及包含如本文定义的修饰的多肽的OMV，优选所述OMV是博德特氏菌OMV。

例如用于疫苗的OMV(也称为“小泡(bleb)”)，传统上通过洗涤剂提取(dOMV纯化程序)制备，其中使用去氧胆酸盐等洗涤剂去除LPS并增加囊泡释放。通过细胞超声处理和DOC处理制备的OMV制剂与明矾佐剂组合，在小鼠模型中提供了针对百日咳攻击的保护作用[Roberts,R.,Vaccine 2008,26,4639-4646]，其效果与全细胞疫苗的效果相当。另一种含有PagL脱酰修饰的LPS的OMV显示出保护作用和较低的反应原性，后者通过体重增加和细胞因子诱导在体内确定[Asensio,C.J.,Vaccine 2011,29,1649-1656]。关于副百日咳博德特氏菌OMV的另一个有趣发现是其对百日咳和副百日咳的交叉保护作用[Bottero,D.Vaccine2013,31,5262-5268]。

高于某个阈值时，博德特氏菌的野生型LPS可能有毒，可使用洗涤剂去除野生型LPS，例如在OMV提取过程中。或者或另外，可以修饰LPS以降低内毒性。因此在一个实施方案中，本发明的博德特氏菌和/或OMV包含具有降低的毒性的修饰的LPS。作为非限制性实例，可以通过在博德特氏菌中引入异源酰基转移酶活性来获得具有降低的内毒性的修饰的LPS，如WO2018/167061所述。得自这种修饰的博德特氏菌的修饰的LPS优选具有与野生型博德特氏菌LPS的脂质A部分相比被修饰的脂质A部分，因为至少一个酰基链的长度较短。优选地，修饰的脂质A部分的位置3的酰基链的长度不比野生型博德特氏杆菌脂质A部分在相同位置3的酰基链的长度更长，优选修饰的脂质A部分的位置3的酰基链的长度不大于C₁₀，其中更优选修饰的脂质A部分位置3的酰基链长度与野生型博德氏杆菌脂质A部分在相同位置3的酰基链长度相同，优选在位置3的酰基链的长度是C₁₀。优选地，较短的酰基链选自以下：

i)脂质A部分3’位置的酰基链；

ii)脂质A部分2’位置的初级酰基链；

iii)脂质A部分2’位置的二级酰基链；和

iv)脂质A部分2位置的酰基链。

另外或或者，本发明的博德特氏菌具有或具有增加的3-O-脱酰酶活性，例如WO/2006/065139所述，其通过引用并入本文。优选地，这种修饰的博德特氏菌包含3-O-脱酰基化的LPS。

具有降低的内毒性的博德特氏菌LPS可能以比毒性野生型LPS更高的浓度存在于OMV中。因此，如本文定义的OMV可通过从博德特氏菌洗涤剂提取或自发释放获得。

包含本发明博德特氏菌的优选OMV可以是上清液或自发OMV，即如上文定义的sOMV，或天然OMV，即如上文定义的nOMV。或者，OMV是洗涤剂提取的OMV，即如上文定义的dOMV。

在进一步的方面，本发明涉及用于产生OMV、优选如本文定义的OMV的方法。优选地，所述方法包括以下步骤：i)在有利于产生OMV的条件下培养如本文定义的博德特氏菌属细菌菌群；并且任选地，回收OMV。

制备dOMV、sOMV和nOMV的方法在van de Waterbeemd et al(2010)和van deWaterbeemd et al(2013)(van de Waterbeemd B et al,Vaccine.2010；28(30):4810-6及van de Waterbeemd B.,PLoS One.2013 31；8(5):e65157)以及WO2013/006055中描述，所有这些文献均通过引用并入本文。

产生OMV的方法可以是任何常规洗涤剂提取方法。或者，提取方法可以是无洗涤剂提取方法，例如WO/2013/006055所述。在本文中应理解，不是洗涤剂提取的OMV的OMV产生方法不排除使用低浓度洗涤剂和/或使用温和洗涤剂。

与不包含如本文定义的修饰而其它方面相同的博德特氏菌的OMV产生相比，如本文定义的修饰的博德特氏菌的OMV产生增加。优选地，OMV产生增加至少约1.5倍，或至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或至少约100倍。

优选地，自发或上清液(sOMV)产生或产量增加至少约1.5倍，或至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或至少约100倍。另外或或者，洗涤剂OMV(dOMV)产生或产量增加至少约1.5倍，或至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或至少约100倍。另外或或者，天然OMV(nOMV)产生或产量增加至少约1.5倍，或至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或至少约100倍。另外或或者，EDTA-提取的(eOMV)产生或产量增加至少约1.5倍，或至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或至少约100倍。

组合物

一方面，本发明涉及包含如本文定义的修饰的博德特氏菌和如本文定义的OMV中至少之一的组合物。

优选地，所述组合物是药物组合物。所述药物组合物可包含本领域通常已知的药学上可接受的赋形剂、载体、介质或递送载体(参见例如“Handbook of PharmaceuticalExcipients”，Rowe等编辑，第7版，www.pharmpress.com)。药学上可接受的稳定剂、渗透剂、缓冲剂、分散剂等也可掺入药物组合物中。所述组合物的优选形式取决于预期的施用方式和治疗应用。药物载体可以是适合递送给患者的任何相容的无毒性物质。

用于肠胃外递送的药学上可接受的载体的实例是无菌缓冲的0.9％ NaCl或5％葡萄糖，任选补充有20％白蛋白。或者，本发明的活性成分可以悬浮在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。肠胃外施用的制剂必须是无菌的。本发明活性成分的肠胃外施用途径是通过已知方法施用，例如通过静脉内、腹膜内、肌肉内和动脉内或病灶内途径注射或输注。或者，所述组合物可以通过吸入施用。所述组合物可以通过输注或推注连续施用。优选地，所述组合物通过推注施用。用于肌内注射的典型药物组合物将配制为含有例如1-10ml包含有效剂量的本发明活性成分的磷酸盐缓冲盐水。用于制备可肠胃外施用的组合物的方法在本领域中是众所周知的并且在各种来源中更详细描述，包括例如“Remington：The Science and Practiceof Pharmacy”(Ed.Allen，L.V.第22版，2012，www.pharmpress.com)。“本发明的活性成分”在本文中被理解为如本文定义的修饰的博德特氏菌和OMV中的至少一种。

如本文定义的修饰的博德特氏菌可以是减毒的或灭活的博德特氏菌。可以使用本领域已知的用于灭活细菌的任何常规方法来灭活博德特氏菌，例如但不限于进一步基因组修饰博德特氏菌、化学处理或热灭活博德特氏菌。优选的化学灭活是甲醛处理。

所述组合物还可包含至少一种额外抗原，优选至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种额外抗原。优选地，所述组合物还可以包含至少一种额外非博德特氏菌抗原，优选至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种额外非博德特氏菌抗原。

本发明的组合物可以进一步包含1、2、3或更多种博德特氏菌属细菌的抗原。所述组合物可以进一步包含灭活的博德特氏菌毒素，其是单独的或与其它博德特氏菌组分例如丝状血凝素、菌毛抗原和百日咳杆菌粘附素组合。

在本文中应当理解，这些组分可以单独添加到包含修饰的博德特氏菌和OMV至少之一的组合物中，或者一种或多种这些组分是所述组合物中修饰的博德特氏菌和OMV的部分。

所述组合物还可包含一种或多种佐剂。佐剂可存在于修饰的博德特氏菌和OMV至少之一中。或者或另外，可将(额外)佐剂添加到包含修饰的博德特氏菌和OMV至少之一的组合物中。佐剂可以是有机佐剂或无机佐剂。优选的无机佐剂是铝盐，例如但不限于磷酸铝和氢氧化铝。优选的有机佐剂可以是修饰的LPS，优选修饰的奈瑟氏菌或博德特氏菌LPS、修饰的LOS、角鲨烯、QS21或单磷酰脂质A(MPL)。

如本文定义的组合物可以是博德特氏菌疫苗。

医药用途

一方面，本发明涉及用作药物的组合物，其包含如本文定义的修饰的博德特氏菌和如本文定义的OMV中的至少一种。换句话说，本发明因此涉及本发明的修饰的博德特氏菌、本发明的OMV和本发明的药物组合物至少之一作为药物的用途。本发明还涉及一种使用如本文定义的修饰的博德特氏菌、OMV和药物组合物至少之一的治疗方法。

另一方面，本发明涉及包含如本文定义的修饰的博德特氏菌和OMV至少之一的组合物用于治疗，包括在受试者中诱导免疫应答。或者，本发明涉及包含如本文定义的修饰的博德特氏菌和OMV至少之一的组合物用于治疗，包括在受试者中刺激免疫应答。特别地，本发明因此涉及疫苗接种的方法。优选地，所述免疫应答是针对博德特氏菌感染诱导或刺激的。

一方面，本发明涉及如本文定义的组合物用于治疗或预防博德特氏菌感染。为此，已知三种博德特氏菌物种是人类病原体(百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌和支气管败血性博德特氏菌)。因此，博德特氏菌感染优选是百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌和支气管败血性博德特氏菌感染中至少一种，优选百日咳博德特氏菌感染。

百日咳博德特氏菌和偶尔的副百日咳博德特氏菌导致人的百日咳或顿咳，并且一些副百日咳博德特氏菌菌株可以在绵羊中定殖。支气管败血性博德特氏菌很少感染健康人，但在免疫功能低下患者已报道有该疾病。支气管败血性博德特氏菌在其它哺乳动物中引起多种疾病，包括分别在狗和猪中导致犬窝咳(kennel cough)和萎缩性鼻炎。这个菌属的其它成员在其它哺乳动物和鸟类(欣茨博德特氏菌(B.hinzii)、鸟博德特氏菌(B.avium))中引起类似疾病。

最优选地，针对百日咳博德特氏菌感染诱导或刺激免疫应答。在进一步优选的实施方案中，本发明涉及如本文定义的组合物用于治疗或预防顿咳。为此，受试者未接种疫苗或之前可能接种过博德特氏菌疫苗。还应注意，术语“顿咳”、“百日咳”和“百日咳(100-天咳嗽)”在本文中可互换使用。

在优选的实施方案中，本发明的药物组合物是疫苗。所述疫苗可以是优选包含如本文定义的OMV的无细胞疫苗。或者，所述疫苗是至少包含如本文定义的经修饰的博德特氏菌的全细胞疫苗。

本发明涉及用于治疗或预防博德特氏菌感染的(药物)组合物，其中所述组合物是包含如本文定义的修饰的博德特氏菌的全细胞疫苗。本发明的修饰的博德特氏菌可以是活细菌或活的减毒细菌或非活细菌。优选地，使用本领域本身已知的手段失活或杀死细菌。例如，修饰的博德特氏菌可以通过冷冻、热处理、机械破坏、化学处理或制药和疫苗接种领域已知的其它方法灭活(参见例如J.L.Pace、H.A.Rossi、V.M.Esposito、S.M.Frey、K.D.Tucker，R.I.Walker.Inactivated whole-cell bacterial vaccines:currentstatus and novel strategies.Vaccine 16:1563-1574(1998))。优选地，所述细菌是百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌或支气管败血性博德特氏菌，最优选百日咳博德特氏菌。

在一个可选的优选实施方案中，根据本发明的(药物)组合物是包含如本文定义的OMV的无细胞疫苗。

在另一个实施方案中，本发明涉及如本文定义的组合物用作药物或用于包括诱导或刺激受试者免疫应答的治疗，其中该组合物还包含至少一种非博德特氏菌抗原。所述抗原是如本文定义的任何抗原。特别地，博德特氏菌疫苗可以与本领域已知的其它疫苗组合。在优选的实施方案中，博德特氏菌疫苗与白喉疫苗和破伤风疫苗至少之一组合。在一个实施方案中，博德特氏菌疫苗与白喉疫苗以及破伤风疫苗组合。

根据本发明的药学上可接受的组合物和疫苗可用于治疗患有博德特氏菌感染或有风险获得博德特氏菌感染的受试者的方法，包括施用根据本发明的药物组合物、全细胞疫苗和无细胞疫苗至少之一。使用的特定佐剂、所述组合物中物质的相对量和绝对量以及施用的剂量方案是已知的或可由技术人员确定并且可根据诸如特定病原体感染或待治疗的特定对象的状态等加以调整。剂量方案可包括单剂量但也可包括多剂量，例如加强剂量，并且可优选口服、鼻内或肠胃外施用。用于疫苗接种目的的各种剂量方案是本领域已知的并且可以由技术人员适当地调整。

其它方面

一方面，本发明涉及产生本发明的修饰的博德特氏菌或OMV的方法。所述方法优选包括以下步骤：a)培养如本文定义的修饰的博德特氏菌；和任选地b)纯化和灭活所述修饰的博德特氏菌中至少之一。除了步骤b)，或代替步骤b)，可以提取和/或纯化OMV。纯化和灭活博德特氏菌的方法是本领域众所周知的。类似地，可以使用本领域已知的任何合适的方法进行OMV的纯化/提取。

一方面，本发明涉及产生疫苗配制剂，其包含如本文定义的优选灭活的修饰的博德特氏菌和OMV至少之一。所述方法优选包括以下步骤：a)培养如本文定义的修饰的博德特氏菌；b)纯化和灭活遗传修饰的细菌中至少之一，及c)将修饰的博德特氏菌和OMV至少之一、任选与其它疫苗组分一起配制成疫苗配制剂。除了步骤b)，或代替步骤b)，可以在步骤c)之前提取和/或纯化OMV。

还应当理解，所述组合物在治疗如本文指定的医学状况中的用途还包括所述组合物在生产用于相应医学治疗的药物中的用途，以及通过向受试者施用有效量的组合物来治疗患有此类医学状况的受试者的方法。

一方面，本发明涉及博德特氏菌，优选百日咳博德特氏菌，其包含导致Prn93(93kDa百日咳杆菌粘附素)保留在外膜中的突变。所述博德特氏菌还可以包含以下突变中至少一种：

-导致如本文定义的突变OmpA多肽表达的突变；

-导致异源酰基转移酶活性的突变；

-导致百日咳毒素(Ptx)去毒的突变；以及

-减少或消除皮肤坏死毒素(DNT)表达的突变。

在一个实施方案中，本发明涉及可从所述博德特氏菌获得的OMV，其中优选所述OMV具有增加或改善的免疫原性，例如与OMV组合相同量(纯化的)Prn的免疫原性相比。

在进一步的实施方案中，本发明涉及OMV和博德特氏菌至少之一的生产、用途和包含其的组合物，优选如上文关于包含OmpA突变的修饰的博德特氏菌所定义。

一方面，本发明涉及博德特氏菌，优选百日咳博德特氏菌，其包含导致异源酰基转移酶活性的突变。所述修饰的博德特氏菌优选表达与SEQ ID NO:6(LpxA)或SEQ ID NO:7(LpxD)具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列相同性的蛋白质。所述博德特氏菌还可以包含以下突变的至少一种：

-导致如本文定义的突变OmpA多肽表达的突变；

-导致Prn93(93kDa百日咳杆菌粘附素)保留在外膜中的突变；

-导致百日咳毒素(Ptx)去毒的突变；以及

-减少或消除皮肤坏死毒素(DNT)表达的突变。

在一个实施方案中，本发明涉及产生OMV的方法，其中所述方法包括在有利于产生OMV的条件下培养博德特氏菌属细菌菌群的步骤，其中所述博德特氏菌属细菌具有如本文定义的异源酰基转移酶活性，并且任选地，回收OMV。优选地，所述产生OMV的方法与从包含OmpA突变的修饰的博德特氏菌产生OMV的方法相同或相似，如上文所述。

在进一步的实施方案中，本发明涉及OMV和博德特氏菌至少之一的产生、用途和包含其的组合物，优选如上文关于包含OmpA突变的修饰的博德特氏菌所定义。

一方面，本发明涉及博德特氏菌，优选百日咳博德特氏菌，其包含导致百日咳毒素(Ptx)去毒的突变。所述博德特氏菌还可以包含以下突变的至少一种：

-导致如本文定义的突变OmpA多肽表达的突变；

-导致Prn93(93kDa百日咳杆菌粘附素)保留在外膜中的突变；

-导致异源酰基转移酶活性的突变；和

-减少或消除皮肤坏死毒素(DNT)表达的突变。

在进一步的实施方案中，本发明涉及OMV和博德特氏菌至少之一的产生、用途和包含其的组合物，优选如上文关于包含OmpA突变的修饰的博德特氏菌所定义。

一方面，本发明涉及博德特氏菌，优选百日咳博德特氏菌，其包含减少或消除皮肤坏死毒素(DNT)表达的突变。所述博德特氏菌还可以包含以下突变的至少一种：

-导致如本文定义的突变OmpA多肽表达的突变；

-导致Prn93(93kDa百日咳杆菌粘附素)保留在外膜中的突变；

-导致异源酰基转移酶活性的突变；和

-减少或消除皮肤坏死毒素(DNT)表达的突变。

在进一步的实施方案中，本发明涉及OMV和博德特氏菌至少之一的产生、用途和包含其的组合物，优选如上文关于包含OmpA突变的修饰的博德特氏菌所定义。

本说明书中引用的所有专利和文献参考均通过引用整体并入本文。

以下实施例仅供示例说明之用，并不意图在以任何方式限制本发明的范围。

表1：序列标识符

SEQ ID NO.	描述
		1	百日咳博德特氏菌OmpAa.a.(wt)
2	百日咳博德特氏菌OmpA nt.(wt)
		3	百日咳博德特氏菌OmpA D124N突变a.a.
4	百日咳博德特氏菌OmpA D124N突变nt.
		5	百日咳博德特氏菌百日咳杆菌粘附素a.a.(wt)
6	LpxA铜绿假单胞菌a.a.
		7	LpxD铜绿假单胞菌a.a.
8	副百日咳博德特氏菌OmpA a.a.
		9	支气管败血性博德特氏菌OmpA a.a.
10	百日咳博德特氏菌DNT a.a.
		11	百日咳博德特氏菌百日咳杆菌粘附素D738N突变a.a.
12	百日咳博德特氏菌毒素(wt)

附图说明

图1：从百日咳博德特氏菌培养物中分离sOMV的示意图概述。除非另有说明，否则将sOMV在标准实验室条件下生长大约30小时后从200ml培养物分离。从这个sOMV分离过程中获得22μm无菌过滤的上清液、离心的+22μm无菌过滤的上清液和纯化的sOMV制剂。在sOMV鉴定实验之前，将样品储存在4℃。

图2：从百日咳博德特氏菌B1917(Wt)、B1917/OmpA-D124N、B1917/BP2019-D50N和B1917/OmpA-D124N/BP2019-D50N的细菌培养物获得的分离的sOMV制剂的sOMV浓度。将细菌培养物在35℃以200rpm生长约30小时。从200ml培养物分离sOMV并浓缩至1ml。通过FM4-64测定法确定的sOMV浓度针对浓度系数校正以获得原始sOMV浓度，****P>0.0001。灰色边界线表示两个单独生长的细菌培养物。

图3：应激对百日咳博德特氏菌B1917/Wt、B1917/OmpA-D124N、B1917/BP2019-D50N和B1917/OmpA-D124N/BP2019-D50N分泌sOMV的影响。sOMV浓度通过FM4-64测定法直接在与样品同时收集的无菌过滤的上清液样品中测定，以测量OD和pH值。将B1917(Wt)、B1917/OmpA-D124N、B1917/BP2019-D50N和B1917/OmpA-D124N/BP2019-D50N在200ml培养基中在35℃以200rpm生长约30小时，有或没有应激处理，***P<0.0001。A)基于生长约30小时后无菌过滤上清液的在应激条件下的sOMV分泌，和B)基于生长约30小时后无菌过滤上清液的在非应激条件下的sOMV分泌。

图4：从百日咳博德特氏菌B213(Wt)、B213/PagL-KI、B213/BP2329-KO和B213/OmpA-D124N的细菌培养物获得的分离的sOMV制剂的sOMV浓度。将细菌培养物在35℃以200rpm生长约30小时。从200ml培养物分离sOMV并浓缩至1ml。通过FM4-64测定法确定的sOMV浓度针对浓度系数校正以获得原始sOMV浓度，**P<0.01，***P<0.001。

图5：与相应野生型和OmpA-D124N突变体相比，从百日咳博德特氏菌B213突变体的细菌培养物获得的分离的sOMV制剂中测定的蛋白质浓度。将细菌培养物在35℃以200rpm生长约30小时。从200ml培养物分离sOMV并浓缩至1ml。蛋白质浓度通过BCA测定法测定并针对细菌培养物的原始体积进行校正，*P>0.05，**P>0.01，****P>0.0001。在B213(Wt)、B213/PagL-KI、B213/BP2329-KO和B1917/OmpA-D124N的sOMV制剂中通过BCA测量的蛋白质浓度。

图6：与相应野生型和OmpA-D124N突变体相比，LPS浓度归一化为25μg由百日咳博德特氏菌B213/PagL-KI和B213/BP2329-KO分泌的纯化的sOMV。将细菌培养物在35℃以200rpm生长约30小时。从200ml培养物分离sOMV并浓缩至1ml。LPS浓度通过苯酚硫酸法测定，归一化为25μg蛋白质并根据浓度系数校正以获得原始LPS浓度/25μg蛋白质。*P>0.05，***P<0.001。LPS浓度归一化为来自B213(Wt)、B213/PagL-KI、B213/BP2329-KO和B213/OmpA-D124N的sOMV制剂的25μg sOMV蛋白。

图7：LpxA突变体增加了OMV产生。将50ml培养物体积以3000rpm离心30分钟以将sOMV与生物质分离。将含有sOMV的上清液通过Nalgene真空系统无菌过滤并通过超速离心(UC)步骤在4℃以125000×g处理90分钟。最后，将sOMV沉淀重悬于2.5ml末端缓冲液(0.01MTris+3％蔗糖，pH 7.4)中。将离心步骤后培养物的沉淀生物质进一步加工成eOMV。将收获物的沉淀重悬于含有0.1M EDTA的9ml 0.1M Tris缓冲液pH8.6中并在室温温育30分钟，同时搅拌以提取eOMV。温育时间后，将悬浮液转移到UC管中并通过在4℃以23500×g高速离心15分钟将细胞与eOMV分离。将含有eOMV的上清液通过Nalgene真空系统进行无菌过滤并再次通过在4℃以125000×g将UC离心90分钟以沉淀eOMV。最后将eOMV沉淀重悬于2.5ml末端缓冲液中。通过Peterson分析sOMV和eOMV级分的总蛋白质浓度，通过PicoGreen分析DNA浓度，通过SDS-PAGE分析蛋白质模式，通过MS分析蛋白质组成以及通过DLS分析OMV大小。产量显示为每体积的OMV颗粒数。

图8：将Prn保留到OMV外膜后保护性免疫性增加。小鼠在第0天和第14天用OMV免疫，在第28天用百日咳博德特氏菌攻击。A)肺定殖。在第35天分析肺定殖。用16、4或1μgOMV-WT(灰色线)和16、4或1μg OMV-Prn93(黑色线)对小鼠免疫(sc)两次，感染小鼠后的肺定殖的回归分析。与WT-OMV(A)相比，用Prn-OMV免疫后的肺定殖显著降低了4.0(2.4-6.3)倍。B)抗Prn抗体应答。与仅omv-WT相比，将3μg纯化的Prn加入1人体剂量(HD)的omv-WT中使抗Prn抗体应答增加10倍，但在1HD的omv-Prn的外膜保留相同量的Prn使抗Prn抗体应答增加100倍。

实施例

1.菌株历史

百日咳博德特氏菌B1917(B.p.B1917)是来自一名患有顿咳的三岁荷兰患者的临床分离株(Mooi,F.R.,et al.,Bordetella pertussis strains with increased toxinproduction associated with pertussis resurgence.Emerg Infect Dis,2009.15(8):p.1206-13)。为了使B.p.B1917适合使用反向可选择自杀载体pSS1129(Stibitz，S，如上)的遗传工程，分离出对链霉素具有抗性的突变株(Strep^R)。这个突变株随后用于分离对萘啶酸具有抗性的突变株(Nal^R)并且这个克隆用作下述菌株构建的起始材料。

2.菌株构建

2.1菌株构建概述

使用遗传工程，在B.p.B1917基因组中引入几个突变；

1.OmpA-D124N：外膜蛋白A(OmpA)中的氨基酸变化D124N。

2.Prn-D738N：百日咳杆菌粘附素(Prn)中的氨基酸变化D738N。

3.LpxA^Pa：LpxA用其来自铜绿假单胞菌的同源物替代。

4.PtxA-R43K-E163G：百日咳毒素亚基1(PtxA)中的氨基酸变化R43K和E163G。

5.皮肤坏死毒素(Dnt)编码序列的缺失。

所述突变的详细概述见表2。

表2：B.p.B1917(Strep^R，Nal^R)中引入的突变概述

¹坐标基于B.p.B1917基因组序列(GenBank登录号：CP009751)。核苷酸突变显示为“原始核苷酸-CP009751中的坐标-新核苷酸”，例如‘g3,092,828a’表示在3,092,828位的胍残基改变为腺嘌呤残基。

²氨基酸变化显示为“原始氨基酸-残基编号-新氨基酸”，使用IUPAC单字母代码。

2.2使用反向可选择自杀载体pSS1129的B.p.B1917的遗传工程

使用反向可选择自杀载体pSS1129(Stibitz，S，如上)将所有突变引入百日咳博德特氏菌B1917(Strep^R，Nal^R)的基因组中。首先使用SnapGene(GSL Biotech，Chicago,USA)利用计算机设计构建体(及其构建所需的引物)。OmpA-D124N、Prn-D738N、PtxA-R43K-E163G和ΔDnt的构建体通过重叠延伸PCR创建(Horton,R.M.,et al.,Engineering hybrid geneswithout the use of restriction enzymes:gene splicing by overlapextension.Gene,1989.77(1):p.61-8)，为此在Eurofins MWG(Ebersberg,Germany)订购引物。通过计算机设计构建体LpxA^Pa，然后由GenScript(Nanjing,China)合成并克隆到pUC57中。具体PCR和克隆程序的详细信息在以下段落中针对每个构建体分别描述。

所有构建体最终都被克隆到自杀载体pSS1129中，然后转化到E.c.SM10中。带有构建体的pSS1129质粒可以通过接合从E.c.SM10转移至B.p.B1917(Strep^R，Nal^R)，这导致B.p.B1917对线性质粒的摄取。由于质粒与B.p.B1917因组上的构建体之间的同源性，这可能导致B.p.B1917基因组中同源重组和完整质粒的摄取。可以选择已将质粒整合到其基因组中的细胞，因为它们对氨苄青霉素/庆大霉素具有抗性并且对链霉素敏感(只有基因组重组体存活，因为pSS1129不能在B.p.B1917中作为质粒复制)。在质粒的基因组摄取后，细胞既含有设计用于在某一基因中引入基因组变化的构建体，也含有该基因的野生型版本。

将成功的第一个交叉克隆铺板于链霉素上，从而可以获得自发链霉素抗性克隆。这些克隆通常是引入的构建体与靶向基因的野生型版本之间交叉的结果。

如果第二次重组发生在第一次重组引入突变的另一侧，则重组体携带基因的突变版本。通过PCR验证在第二个交叉克隆中成功掺入所需的突变。OmpA的详细克隆程序概述如下。表2中描述的其它突变是使用本领域已知的类似标准分子生物学技术产生的。所述突变被引入到菌株B213和菌株B1917中。

2.2.1OmpA-引入氨基酸置换D124N

OmpA中的几个氨基酸被取代，并研究了这些突变对OMV形成的影响。百日咳博德特氏菌OmpA中的R139A和R139L取代似乎是致命的(数据未示出)。此外，完全敲除OmpA或敲除OmpA同系物BP2019和BP3342之一都会导致致命性。

发现D124N取代令人惊讶地导致活细胞和增加的OMV形成。值得注意的是，在同源物BP2019中相应位置的相同取代(D50N)产生了活细胞，但对OMV产生没有任何影响，而在同源物BP3342中相应位置的取代(D100N)似乎是致命的。

通过重叠延伸PCR创建引入点突变导致在OmpA中氨基酸变化D124N的诱变构建体(Horton,R.M.,et al.,如上)。B.p.B1917的基因组DNA被用作模板，使用引物对B1917-OmpA-Fw/OmpA-D124N-Rv进行PCR Ia及使用引物对OmpA-D124N-Fw/B1917-OmpA-Rv进行PCRIb(引物序列参见表3)。与B.p.B1917基因组相比，引物OmpA-D124N-Fw和OmpA-D124N-Rv含有点突变，大约每个引物的一半。因此，PCR产物Ia和Ib都含有与B.p.B1917基因组相同的错配。PCR产物Ia和Ib的混合物用作PCR II的模板，使用引物对B1917-OmpA-Fw/B1917-OmpA-Rv。所得扩增子是区域3,092,271-3,093,392(GenBank CP009751)的拷贝，除了导致OmpA中氨基酸变化D124N的突变g3,092,828a之外。

使用TA克隆将PCR II扩增子连接到线性pGEM-T Easy载体(Promega)中，产生pGEM-T Easy+PCR II。在E.c.JM109中扩增后，将质粒用EcoRI消化并纯化1007bp条带，然后连接到EcoRI消化的pSS1129中。随后将所得pSS1129+OmpA-D124N在E.c.SM10细胞中转化并将成功的转化体作为甘油原液储存。

将质粒pSS1129+OmpA-D124N通过接合从E.c.SM10移至B.p.B1917 Nal^R、Strep^R。然后使用两步抗生素选择程序将突变掺入B.p.基因组。通过测序鉴定的两个成功的第二个交叉克隆作为甘油原液储存。

表3：用于OmpA-D124N重叠延伸PCR和测序的引物

引物名称	序列(5’->3’)	用于	SEQ ID NO:
				B1917-OmpA-Fw	ggtcaatgcaacggtctagg	重叠延伸PCR(PCRs Ia和II)	13
OmpA-D124N-Rv	gccgatcgagttcgtgtggccaac	重叠延伸PCR(PCR Ia)	14
				OmpA-D124N-Fw	ttggccacacgaactcgatcgg	重叠延伸PCR(PCR Ib)	15
B1917-OmpA-Rv	atgctctccgacaggatg	重叠延伸PCR(PCRs Ib和II)	16
				OmpA-seq-Fw	cgtatgtaaggatgaacc	测序	17
OmpA-seq-Rv2	tgttcgagcatttccatg	测序	18

粗体：与B.p.B1917基因组相比的密码子变化。

粗体和下划线：与B.p.B1917基因组相比的核苷酸变化。

2.3百日咳博德特氏菌及突变株分泌sOMV性质的分析

对百日咳博德特氏菌和突变株关于其生长性能和sOMV分泌性质进行筛选。在特定时间点(T)测量光密度(590m)和pH以鉴定各种B213和B1917突变株与相应野生型相比的生长性能和sOMV分泌。使用多种测定法来量化和鉴定由百日咳博德特氏菌和突变株分泌到上清液中的sOMV。基于脂质含量，通过N-(3-三乙基铵丙基)-4-(6-(4-(二乙基氨基)苯基)已三烯基)二溴化吡啶(FM4-64)测定法对sOMV浓度进行定量。第二种方法用于sOMV量化，即二喹啉甲酸(BCA)测定，而sOMV的大小通过动态光散射(DLS)测量。sOMV的LPS浓度通过苯酚硫酸法测定。最后，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确定分泌的sOMV内的各种不同蛋白质。

2.3.1.百日咳博德特氏菌及突变株的接种和培养

将通过无菌棉签收集的在补充有300μg/ml链霉素的BG琼脂平板中生长的可见量的细菌用于预培养物接种。预培养物也可以通过之前制备的种子批(seedlots)接种。这个预培养物随后用于接种主培养物(MC)。将百日咳博德特氏菌和突变株在补充有1％THIJS补充剂的THIJS培养基中生长。预培养物总是在125ml PBF(平底培养瓶)中的50ml培养基中生长，而主培养物在50ml(125ml PBF)、100ml(250ml带挡板的培养瓶)或200ml(500ml PBF)中生长。除非另有说明，否则使细菌培养物在35℃、200rpm生长。

-标准实验室条件(无应激处理)

将细菌培养物在标准条件下在补充有1％ THIJS补充剂的THIJS培养基中生长。使培养物在35℃、200rpm生长，没有任何形式的应激。用预培养物接种MC，导致OD为0.05，除非另有说明。

-应激处理

由于已知应激是可能影响多种细菌物种生长和sOMV分泌性质的重要因素，因此对百日咳博德特氏菌和突变株的细菌培养物进行应激处理以检验应激对生长和sOMV分泌性质的影响。应激处理包括温度波动和缺氧，通过收集用于OD(590nm)和pH测量的样品以及用于随后sOMV量化的样品而获得结果。生长期间用于sOMV定量的样品通过0.22μM过滤器无菌过滤。作为应激处理的对照，将相应菌株的完全相同的细菌培养物在标准实验室条件下平行生长。这些对照培养物的OD和pH值仅在大约30小时的生长期开始和结束时测量，正如收集无菌过滤的上清液样品用于随后sOMV定量一样。

2.3.2.不同处理样品的收集

在培养开始和结束时以及在生长曲线表现的情况下也在生长期之间收集样品。将这些样品的sOMV浓度相互比较并与实际分离的sOMV的浓度进行比较以确定不同处理样品对百日咳博德特氏菌和突变株实际分泌的sOMV的代表性。在所述过程中收集各种样本的时刻显示在(图1)中。在用于sOMV量化和鉴定实验之前，将样品储存在4℃。

-0.22μM无菌过滤的上清

在生长期开始和结束时，从细菌培养物收集样品并通过0.22μM过滤器(Millex-GV注射器过滤器)过滤以去除细胞。在OD(590nm)测量的情况下，结合筛选生长期间sOMV分泌性质来鉴定生长特性，每2至3小时收集0.22μM无菌过滤样品。在sOMV量化实验之前，将样品储存在4℃，以确保目前sOMV的稳定性。

-离心结合0.22μM无菌过滤

在生长期结束时，将细菌培养物以1000*g离心30分钟，随后通过0.22μM

Rapid-Flow^TM 250ml无菌过滤装置进行无菌过滤。在sOMV量化实验之前，将样品储存在4℃，以确保目前sOMV的稳定性。

-分离和纯化的sOMV

在生长期结束时，分离分泌的sOMV(第2.3.4节)。在sOMV量化实验之前，将样品储存在4℃，以确保目前sOMV的稳定性。

2.3.3.百日咳博德特氏菌和突变株生长性质的测量

通过OD(590nm)测量针对生长特性筛选百日咳博德特氏菌和突变株。此外，还确定了pH值。这些测量在特定时间点进行以鉴定其随时间的生长性质。监测pH，因为它可以影响生长速率并可以引入应激。将细菌在50ml或200ml培养基中培养。通过预培养物或种子批接种培养物。

2.3.4.sOMV分离

除非另有说明，否则将百日咳博德特氏菌菌株的MC(200ml)在标准实验室条件下生长。大约30小时后收获细菌培养物以分离sOMV。图1显示了分离方案的示意图概述。记录培养物的质量以及在sOMV分离步骤后获得的产物以计算原始细菌培养物的sOMV浓度。将培养物在1000*g、20℃离心30分钟。弃去获得的沉淀，随后将上清液通过0.22μm

Rapid-Flow^TM 250ml无菌过滤装置进行无菌过滤。将>100千道尔顿(kDa)的片段通过中空纤维mPES/>

过滤模块浓缩成大约50ml。将浓缩产物用由0.1M Tris、pH8.6组成的Tris缓冲液补至等重，然后在125.000*g、4℃超速离心(UC)90分钟。将假设含有sOMV的生成的沉淀重悬在由0.01M Tris、pH 7.4组成的末端缓冲液中。将sOMV制剂储存在4℃以确保随后用于sOMV量化实验的sOMV制剂的稳定性。

2.3.5.通过FM4-64测定法测定的脂质浓度

FM4-64是一种染料，在掺入脂质环境后会发出荧光信号，因此可以确定膜内容物的浓度，从而确定sOMV浓度，如本领域所述。上清液中的膜内容物被假定为百日咳博德特氏菌和突变株产生sOMV的结果。使用OMV储备溶液(B1917WT)绘制标准曲线。所述储备溶液含有已知浓度的由洗涤剂刺激的OMV(基于蛋白质含量)，源自百日咳博德特氏菌B1917野生型菌株。将储备溶液在THIJS培养基中稀释，产生范围在0.31μg/ml-10μg/ml之间的标准曲线。包括THIJS培养基和milliQ或PBS作为阴性对照。将50μl标准品、对照和样品一式三份添加到黑色96孔微量滴定板(Greiner 655209，黑色平底)中。FM4-64染料通过将FM4-64(250μM)在MilliQ中稀释制备，终浓度为5μM。将50μl制备的FM4-64染料添加到每个孔中并立即在645nm测量荧光信号，在485nm激发(方案：FM4-64 Synaptored 485 645)。sOMV的浓度(μg/ml)通过使用标准曲线的方程式计算。

2.3.6.通过BCA测定法测定的蛋白质浓度

Pierce BCA蛋白质测定(Thermo Scientific)是一种比色测定法，通常用于确定总蛋白质浓度，也用于上清液中。假设样品中的蛋白质含量是百日咳博德特氏菌和突变株产生sOMV的结果。这个测定使用铜(Cu+2)还原成Cu+1的反应，这是碱性介质中蛋白质的双缩脲反应的结果。Cu+1通过含有BCA的试剂检测。两个BCA分子与一个Cu+1分子结合，导致颜色从淡蓝色变为紫色。标准曲线用牛血清白蛋白(BSA)制备，范围在25μg/ml-500μg/ml之间。在562nm测量吸光度。使用标准曲线方程式计算蛋白质的实际浓度。

2.3.7.通过苯酚硫酸法测定LPS浓度

LPS被称为天然佐剂，通过刺激B细胞发育来增强细胞免疫应答，但也能触发T细胞产生干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子TNF。脂质A是LPS的主要成分，起佐剂作用。虽然LPS对免疫系统可以产生刺激作用，但LPS浓度过高时也会产生毒性。用于确定LPS浓度的常用KDO测定法不适用于百日咳博德特氏菌LPS，因为百日咳博德特氏菌LPS仅含有单一KDO分子。苯酚硫酸法被用作LPS测定的替代方法。这种比色法用于测量sOMV内的碳水化合物浓度，本领域认为这与LPS浓度有关。为了确定sOMV内的LPS浓度，从分离自脑膜炎奈瑟菌Lpxl1突变株的已知浓度为0.39mg/ml的LPS制备标准品并制备浓度范围在0.003mg/ml-0.39mg/ml之间的系列稀释液。将50μl分离的sOMV制剂以及50μl标准品一式两份加入micronic管中。加入150μl硫酸，然后加入30μl的5％苯酚。随后，将管在90℃加热5分钟，然后在室温冷却5分钟。将200μl转移到平底96孔板中并在490nm测量OD。sOMV中LPS的浓度使用标准曲线方程式计算。

2.3.8.动态光散射

通过DLS确定分离的sOMV的大小(d/nm)。将100μl的sOMV制剂加入比色皿中并置于Malvern公司的配备633nm红色激光的Zetasizer Nano Series的Zen 3600中。在25℃测量大小。

2.3.9.通过SDS-PAGE确定的各种蛋白质

执行SDS-page以检查分离的sOMV中的各种蛋白质，将含有3M Tris·HCl、5％SDS、50％甘油、100mM二硫苏糖醇(DTT)和专有的粉色示踪染料的10μl Lane MarkerReducing样品缓冲液(5×)(Thermo scientific)加入40μl样品中。将混合样品在100℃加热10分钟，然后将10-15μl上样到NuPAGE Novex 4-12％ Bis-Tris凝胶的孔中并使用1％(2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液在恒定200伏特运行35分钟。包括

Sharp预染蛋白质标准品作为标记。将凝胶用考马斯蓝(Imperial蛋白质染料，Thermo Scientific)染色2小时，然后在milliQ中脱色直至考马斯蓝背景消失。扫描凝胶并调整对比度以创建清晰可见的条带。

2.3.10.统计

方差分析(ANOVA)用于确定与对照相比不同样本之间的显著性差异。如果将一组样本与总体对照进行比较，则使用Tukeys检验，而如果在所有单个样本之间检查显著性差异，则使用Dunnett检验。如果仅在两个样本之间进行比较，则应用非配对T检验。只有当P<0.05时，才认为所述突变体与对照或不同收集的样本相比存在显著性差异。

3.结果

新创建的百日咳博德特氏菌B1917突变株和预先创建的百日咳博德特氏菌B213LPS突变株的产生sOMV性质的分析

3.1sOMV浓度

分离的sOMV制剂的sOMV浓度通过FM4-64测定确定并针对浓度系数进行校正，以计算原始细菌培养物的sOMV浓度(图2)。与B1917(Wt)(0.02μg/L±0.10)相比，B1917/OmpA-D124N确实显示sOMV分泌增加(315.21μg/L±12.23)，P<0.0001。(图3和数据未示出)。与B1917(Wt)(2.88μg/L±0.11)相比，观察到B1917/OmpA-D124N/BP2019-D50N也显著增加(178.48μg/L±6.98)，P<0.0001。在B1917/BP2019-D50N的分离的sOMV制剂中观察到sOMV浓度未增加(图3)。

3.2与B213(Wt)和B213/OmpA-D124N相比，B213/PagL-KI和B213/BP2329-KO在生长期间的sOMV分泌性质

在生长性质鉴定期间收集的无菌过滤的上清液样品中测定sOMV浓度。测试了几种突变体。突变体B213-PagL-KI表达PagL基因。PagL是一种脂质A修饰酶，可使脂质A脱酰。突变体B213/B2329-KO敲除了BP2329糖基转移酶，导致缩短的寡糖。与B213(Wt)相比，B213/OmpA-D124N示出sOMV浓度显著增加，p<0.01(图4)。与B213(Wt)相比，观察到B213/PagL-KI和B213/BP2329-KO的sOMV分泌减少，分别为p<0.01和p<0.001。

3.3基于蛋白质含量鉴定百日咳博德特氏菌和突变株的sOMV分泌性质。

除了基于通过FM4-64的脂质测定鉴定sOMV分泌外，还应用了第二种方法。进行BCA测定以量化相对于相应野生型和OmpA-D124N突变体，得自新创建的百日咳博德特氏菌突变株(B1917/BP2019-D50N和B1917/OmpA-D124N/BP2019-D50N)和预先创建的B213 LPS突变株(B213/PagL-KI和B213/BP2329-KO)的细菌培养物的分离的sOMV制剂中的蛋白质含量。为了比较结果，使用与先前在FM4-64测定期间使用的相同的分离的sOMV制剂。

3.3.1.与B1917(Wt)和B1917/OmpA-D124N相比，纯化的B1917/BP2019-D50N和B1917/OmpA-D124N/BP2019-D50N分泌的sOMV的蛋白质含量

在蛋白质含量中观察到相同趋势，正如之前观察到的基于脂质含量的sOMV浓度，通过FM4-64测定确定(图2)。B1917/OmpA-D124N/BP2019-D50N的分离的sOMV制剂的蛋白质含量(439.16μg/L±21.28)以及与相应B1917(Wt)(217.07μg/L±27.6)相比增加的蛋白质含量，P<0.0001。与B1917(Wt)相比，观察到B1917/OmpA-D124N(826.56μg/L±15.45)大量显著增加，6.4倍增加，P<0.0001。

3.3.2与B213(Wt)和B213/OmpA-D124N相比，纯化的B213/PagL-KI和B213/Bp2329-KO分泌的sOMV的蛋白质含量

即使是百日咳博德特氏菌B1917菌株，也观察到分离的sOMV制剂中蛋白质含量与先前FM4-64所示的相同趋势(图4和图5)。与B213(Wt)(155.99μg/L±4.59)相比，观察到B213/OmpA-D124N(181.97μg/L±6.7)的蛋白质含量显著增加。与B213(Wt)相比，观察到B213/PagL-KI(120.51μg/L±5.48)和B213/Bp2329-KO(80.83μg/L±4.55)的蛋白质含量均有所降低，这种蛋白质含量降低是显著的，分别为P<0.01和P<0.001。

3.4基于总碳水化合物浓度鉴定百日咳博德特氏菌和突变株分泌的sOMV的LPS含量

LPS是一种天然佐剂，可通过刺激T细胞产生IFN-γ和TNF而增强免疫应答。确定LPS浓度是为了更好地了解新创建的百日咳博德特氏菌突变株和先前创建的B213LPS突变株(B213/PagL-KI和B213/BP2329-KO)分泌的sOMV的毒性。B213/PagL-KI和B213/BP2329-KO都含有LPS修饰突变，这可能会通过周质中LPS相关结构的积累导致sOMV产生增加，导致在分泌的sOMV中LPS浓度增加。sOMV的LPS浓度采用苯酚硫酸法测定。与先前用于FM4-64和BCA的相同分离的sOMV制剂用于LPS测定。

为了能够在百日咳博德特氏菌和突变株分泌的sOMV的LPS浓度之间进行可靠比较，将LPS浓度归一化为25μg蛋白质。这些蛋白质浓度先前通过BCA确定。与B1917菌株相比，观测到B213菌株的LPS浓度增加。与B213(Wt)(0.325mg/25μg蛋白质±0.005)相比，B213/BP2329-KO(0.66mg/25μg蛋白质±0.02)和B213/PagL-KI(0.41mg/25μg蛋白质±0.01)的LPS浓度显著增加。对于B213/OmpA-D124N(0.272mg/25μg蛋白质±0.005)，未观察到显著增加(图6)。对于B1917突变株B1917/OmpA-D124N和B1917/OmpA-D124N/BP2019-D50N，与B1917(Wt)相比，来自分离过程的sOMV没有显著差异(数据未示出)。

3.5.OmpA突变体和LpxA突变体中增加的sOMV和eOMV产生

将异源LpxA酰基转移酶活性引入百日咳博德特氏菌以降低LPS内毒性。令人惊讶地，我们观察到异源酰基转移酶活性的引入增加了OMV产生(图7)。与野生型相比，异源LpxA表达后，sOMV和eOMV的OMV产生显著增加。

3.6Prn保留在OMV外膜后保护性免疫性增强

通过比较OMV-prn93和OMV-WT与纯化的prn69的混合物，证实膜结合prn93的增强的免疫原性(图8)。OMV-prn93含有约3μg Prn/人体剂量(50μg)，类似于acP(无细胞百日咳疫苗)。比较特异性抗Prn抗体应答示出，与混合OMV-WT的3μg纯化Prn69相比，OMV-Prn93诱导10倍高的抗Prn抗体滴度。用OMV-WT或OMV-Prn对小鼠进行免疫接种后对鼻内攻击的保护作用是OMV-Prn的4倍好。

Claims (15)

1.一种多肽，其包含与SEQ ID NO:1具有至少50％序列相同性的序列，并且包含OmpA样结构域中的突变，其中优选所述突变位于对应于SEQ ID NO:1的位置110-140中任一位置的位置，并且其中与不包含所述突变的其它方面相同的多肽相比，包含所述突变的多肽当在博德特氏菌(Bordetella)中表达时增加OMV产生。

2.根据权利要求1的多肽，其中所述突变是单个氨基酸残基的突变。

3.根据权利要求1或2的多肽，其中所述突变是氨基酸残基的取代，优选在对应于SEQID NO:1的位置124的位置处的取代，优选D124N取代。

4.一种多核苷酸，其编码权利要求1至3任一项定义的多肽，优选其中所述多核苷酸与SEQ ID NO:4具有至少50％的序列相同性。

5.一种博德特氏菌属细菌，其在编码与SEQ ID NO:1具有至少50％序列相同性的多肽的基因中包含基因组修饰，其中优选所述修饰位于该基因的开放阅读框中，并且其中优选地，与不包含所述修饰的相同细菌相比，所述修饰增加博德特氏菌的OMV(外膜囊泡)产生。

6.根据权利要求5的博德特氏菌属细菌，其中所述基因组修饰导致权利要求1至3任一项定义的多肽的表达和/或其中所述基因组修饰在包含与SEQ ID NO:2具有至少50％的序列相同性的序列的基因中。

7.根据权利要求5或6的博德特氏菌属细菌，其中所述博德特氏菌属细菌是百日咳博德特氏菌(B.pertussis)、副百日咳博德特氏菌(B.parapertussis)和支气管败血性博德特氏菌(B.bronchiseptica)中的至少一种。

8.根据权利要求5至7任一项的博德特氏菌属细菌，其中所述细菌还包含在以下至少一个中的突变：

i)编码LpxA的内源基因；

ii)编码百日咳杆菌粘附素的内源基因。

9.根据权利要求5至8任一项的博德特氏菌属细菌，其中所述细菌进一步包含在以下至少一个中的突变：

i)编码Ptx的内源基因；和

ii)编码DNT的内源基因。

10.可得自权利要求5至9任一项定义的博德特氏菌属细菌的博德特氏菌OMV，其中所述博德特氏菌OMV优选包含权利要求1至3任一项定义的多肽。

11.一种产生OMV的方法，其中所述方法包括以下步骤：

i)在有利于产生OMV的条件下培养权利要求5至9任一项定义的博德特氏菌属细菌的群体；和

ii)任选地，回收所述OMV。

12.一种组合物，包含以下至少一种：

i)权利要求5至9任一项定义的博德特氏菌属细菌，其中优选所述细菌是灭活细菌；和

ii)权利要求10定义的OMV，

其中优选所述组合物是药物组合物。

13.根据权利要求12的组合物，其用作药物的。

14.根据权利要求12的组合物，其用于治疗或预防博德特氏菌感染，优选百日咳博德特氏菌感染。

15.根据权利要求12的组合物或根据权利要求13或14的用于所述用途的组合物，其中所述组合物是无细胞疫苗或细胞疫苗，并且其中所述组合物优选还包含至少一种非博德特氏菌抗原。

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