KR20220070279A - 면역원성 조성물 - Google Patents

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KR20220070279A
KR20220070279A KR1020227014156A KR20227014156A KR20220070279A KR 20220070279 A KR20220070279 A KR 20220070279A KR 1020227014156 A KR1020227014156 A KR 1020227014156A KR 20227014156 A KR20227014156 A KR 20227014156A KR 20220070279 A KR20220070279 A KR 20220070279A
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lpxa
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bordetella pertussis
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KR1020227014156A
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나탈리 이사벨 데보스
스티븐 클레멘트 시몬스
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글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이.
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Abstract

본 발명은 특히 백신 분야에서 사용하기 위한 박테리아 균주, 특히 보르데텔라 속의 박테리아에 의해 유발되는 감염의 예방 또는 치료 분야에 관한 것이다.

Description

면역원성 조성물
본 발명은 백신 분야, 특히 보르데텔라 속의 박테리아, 특히 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis)에 의해 유발되는 감염의 예방 또는 치료에 관한 것이다.
보르데텔라 페르투시스에 의해 유발되는 백일해는 고도로 전염성인 기도 감염이다. 급성 감염은 호흡 부전, 폐 고혈압, 백혈구증가증 및 사망을 특징으로 하는 중증 질병을 유발할 수 있다. 백일해는 전 세계적으로 무세포 백일해 (aP) 또는 전세포 백일해 (wP) 백신이 사용되는 백신-예방가능 질환이다. 그러나, 이 질환은 백신접종된 집단에서 지속되었으며, 역학 데이터는 최근 몇 년 동안 백일해 발병률의 전 세계적 증가를 보고하였다.
백일해 균주의 진화 및 wP 백신과 비교하여 aP 백신으로부터의 감소된 보호 지속기간을 포함하여 여러 가정이 상정되었다. 백일해의 재출현 제어를 목표로 하는 연구 분야 중 하나는 새로운 백신의 개발에 관한 것이다.
병원체로부터 유래된 소포가 면역원성 조성물, 예컨대 백신의 개발에 사용되었다 [1]. 외막 소포 (OMV) 또는 이들의 유도체의 사용은 잠재적으로 광범위한 항원을 이들의 천연 형태로 전달할 수 있었다.
OMV는 고도로 가변적인 O 항원, 덜 가변적인 코어 올리고당 및 지질 A로 지정된 고도로 보존된 지질 모이어티로 구성된 박테리아 지질다당류 (LPS)를 포함한다. 박테리아 지질올리고당 (LOS)은 LPS와 동일한 다수의 기능적 활성을 갖는 유사한 지질 A 구조를 공유하지만 O-항원 단위가 결여되어 있다. 관련 기술분야에서, 용어 "LPS"는 LPS 및 LOS 박테리아 사카라이드 둘 모두를 지칭하기 위해 종종 사용된다.
그러나, OMV 내 LPS/LOS의 존재는 임상 및 규제 관점으로부터 문제를 제공할 수 있다. 예를 들어, LPS/LOS가 인체에서 분해될 때, 과도한 전염증성 시토카인의 생성이 유도될 수 있다. 인간 TLR4와의 이들의 상호작용을 통해, 특정 유기체 및 환자의 상태에 따라 많은 유해 효과 (반응원성), 예컨대 열, 오한, 쇼크 및 다양한 다른 증상을 잠재적으로 유발할 수 있다.
LPS/LOS의 내독성 활성은 주로 1 또는 2개의 포스페이트 기 및 다양한 수의 아실 쇄로 치환된 글루코사민 이당류로 이루어진 그의 지질 A 모이어티의 조성에 의해 결정된다 [2].
WO2018/167061 [3]은 보르데텔라 페르투시스에서 C3' 아실 쇄의 길이를 감소시키기 위한 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) (LpxAPa) 또는 네이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis) (LpxANm)로부터 유래된 LpxA 변이체의 사용을 기재한다. 외인성 LpxA 유전자는 플라스미드로부터 발현된 반면, 게놈 내인성 LpxA 유전자는 녹아웃되었다. LpxAPa의 에피솜 발현은 일부 아실 쇄의 길이를 감소시키는 효과를 가졌고, 저자는 TLR4 자극이 감소되었음을 언급하였다. 그러나, 균주는 강한 성장 결함을 나타내었다. 또한, LpxANm의 발현은 치명적이었다. 슈도모나스 아에루기노사로부터 유래된 LpxD 변이체가 비. 페르투시스에서 에피솜으로 발현되었을 때, 유사한 강한 성장 결함이 관찰되었다. 결과는 반응원성이 지질 A의 조작에 의해 변형될 수 있음을 확인하는 반면, 균주의 성장 결함은 백신 제조에 이러한 균주의 사용에 대한 주요 장애물이다.
그러므로, 면역원성 조성물, 예컨대 백신의 제조에 적합한 개선이 여전히 필요하다.
발명의 요약
본 출원인은 관련 기술분야에서 관찰된 문제를 극복하고 전세포 항원 및/또는 외막 소포 구성성분의 제조에 특히 적합한 신규 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아 균주를 개발하였다. 이들 구성성분은 면역원성 조성물, 예컨대 백신에서 사용될 수 있다.
제1 측면에서, 본 발명은 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 하기를 포함하는 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아에 관한 것이다: LpxA 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 게놈 LpxA 유전자, 여기서 LpxA 단백질은 서열식별번호(SEQ ID NO): 1에 비해 위치 170에서의 돌연변이 및/또는 위치 229에서의 돌연변이를 포함함; 및/또는 이종 LpxD 유전자의 적어도 하나의 게놈 삽입.
이러한 제1 측면에서, 본 발명은 바람직하게는 LpxA 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 게놈 LpxA 유전자를 포함하는 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아에 관한 것이며, 여기서 LpxA 단백질은 서열식별번호: 1에 비해 위치 170에서의 돌연변이 및/또는 위치 229에서의 돌연변이를 포함한다.
보르데텔라 페르투시스 (LpxABpe)로부터의 야생형 LpxA 단백질의 아미노산 서열은 서열식별번호: 1로 제공된다. 보르데텔라 파라페르투시스 (LpxABpa)로부터의 LpxA 단백질의 아미노산 서열은 서열식별번호: 2로 제공된다.
본 발명은 LpxA 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 게놈 LpxA 유전자를 포함하는 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아에 관한 것일 수 있으며, 여기서 LpxA 유전자는 보르데텔라 파라페르투시스 (LpxABpa)로부터 유래된다.
이러한 실시양태에서, 본 발명은 LpxA 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 게놈 LpxA 유전자를 포함하는 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아에 관한 것이며, 여기서 LpxA 단백질은 서열식별번호: 2를 갖는다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "돌연변이"는 참조 단백질 또는 폴리펩티드, 특히 야생형 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열과 비교하여 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열에서 아미노산 잔기의 결실, 첨가 또는 치환을 지칭한다.
아미노산 서열을 언급할 때 용어 "치환"은 상이한 아미노산 또는 아미노산 모이어티에 대한 아미노산의 변화를 지칭한다. 예를 들어, LpxA를 언급할 때, 치환은 서열식별번호: 1에 비한 아미노산의 변화를 지칭한다. 단백질 서열의 한 특정 위치에서 아미노산의 치환은 하기 주석 "(야생형 단백질의 아미노산 잔기)(아미노산 위치)(돌연변이된 단백질의 아미노산 잔기)"을 사용하여 언급된다. 예를 들어, G229A는 참조 단백질의 아미노산 서열 (여기서 서열식별번호: 1)의 229번째 위치에서 글리신 (G) 잔기의 알라닌 (A) 잔기 (돌연변이체에서)로의 치환을 지칭한다.
특히, 위치 170에서의 돌연변이는 서열식별번호: 1에 비한 치환이다. 더욱 특히, 위치 170에서의 돌연변이는 글리신의 치환이다. 더욱 더 특히, 위치 170에서의 돌연변이는 글리신의 세린으로의 치환 (G170S)이다.
특히, 위치 229에서의 돌연변이는 서열식별번호: 1에 비한 치환이다. 더욱 특히, 위치 229에서의 돌연변이는 글리신의 치환이다. 더욱 더 특히, 위치 229에서의 돌연변이는 글리신의 알라닌으로의 치환 (G229A)이다.
특히 LpxA 단백질은 서열식별번호: 1에 비해 위치 170에서의 돌연변이 및 위치 229에서의 돌연변이를 포함한다. 더욱 특히, 위치 170에서의 돌연변이는 글리신의 치환이고, 위치 229에서의 돌연변이는 글리신의 치환이다. 더욱 더 특히, 위치 170에서의 돌연변이는 글리신의 세린으로의 치환 (G170S)이고, 위치 229에서의 돌연변이는 글리신의 알라닌으로의 치환 (G229A)이다. 훨씬 더 특히, LpxA 단백질은 위치 170에서의 세린 잔기 및 위치 229에서의 알라닌 잔기를 포함한다. 특히, 및 위치 170 및/또는 229에서의 돌연변이에 더하여, LpxA 단백질은 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2와 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, LpxA 단백질은 서열식별번호: 2와 90% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, LpxA 단백질은 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 갖는다 (즉, 이는 100% 서열 동일성을 가짐).
코마모나스 테스토스테로니(Comamonas testosteroni) (LpxDCt)로부터의 LpxD 단백질의 아미노산 서열은 서열식별번호: 3으로 제공된다. 피. 아에루기노사 (LpxDPa)로부터의 LpxD 단백질의 아미노산 서열은 서열식별번호: 4로 제공된다.
특히, 이종 LpxD 유전자는 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4와 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 LpxD 단백질을 코딩한다. 보다 특히, 이종 LpxD 유전자는 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4와 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 LpxD 단백질을 코딩한다. 더욱 특히, 이종 LpxD 유전자는 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 100% 서열 동일성을 갖는 LpxD 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 이종 LpxD 유전자는 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 LpxD 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 이종 LpxD 유전자는 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 LpxD 단백질을 코딩한다.
용어 "이종 LpxD 유전자"는 그것이 도입된 숙주 유기체의 종과 상이한 종으로부터의 LpxD 유전자 또는 뉴클레오티드 서열을 지칭하며, 본 발명의 문맥에서, 이종 LpxD 유전자 또는 뉴클레오티드 서열은 일반적으로 보르데텔라 페르투시스의 야생형 균주에서 발견되지 않는다. 특정 실시양태에서, 이종 LpxD 유전자의 뉴클레오티드 서열은 보르데텔라 페르투시스에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다.
용어 "게놈"은 박테리아 세포 게놈, 즉 염색체 DNA를 지칭하는 반면, "게놈 삽입"은 박테리아 세포 게놈으로의 안정적인 통합을 지칭하는데 사용되며, 이에 의해 플라스미드에서 유전자의 발현과 같은 일시적 또는 에피솜 발현을 배제한다.
본 발명의 제1 측면에서, 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아에서의 내인성 LpxA 유전자의 발현 또는 활성은 야생형 보르데텔라 페르투시스 박테리아에 비해 변형, 감소, 억압 또는 불활성화된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아에서의 내인성 LpxD 유전자의 발현 또는 활성은 야생형 보르데텔라 페르투시스 박테리아에서 관찰되는 발현 또는 활성에 비해 변형, 감소, 억압 또는 불활성화될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아에서의 내인성 LpxA 유전자 및 내인성 LpxD 유전자 둘 모두의 발현 또는 활성은 야생형 보르데텔라 페르투시스 박테리아에 비해 변형, 감소, 억압 또는 불활성화된다.
일부 실시양태에서, 내인성 LpxA 유전자의 발현 또는 활성은 내인성 LpxA 유전자를 녹아웃시킴으로써 감소, 억압 또는 불활성화된다. 일부 실시양태에서, 내인성 LpxA 유전자의 발현 또는 활성은 예를 들어, 녹인(knock-in)을 통해 내인성 LpxA 유전자를 대체함으로써 변형, 감소, 억압 또는 불활성화된다. 일부 실시양태에서, 내인성 LpxA 유전자의 발현 또는 활성은 특히 위치 170 및/또는 229에서의 돌연변이에 의해 내인성 LpxA 유전자를 돌연변이시킴으로써 변형된다. 일부 실시양태에서, 내인성 LpxD 유전자의 발현 또는 활성은 내인성 LpxD 유전자를 녹아웃시킴으로써 감소, 억압 또는 불활성화된다. 일부 실시양태에서, 내인성 LpxD 유전자의 발현 또는 활성은 예를 들어, 녹인을 통해 내인성 LpxD 유전자를 대체함으로써 변형, 감소, 억압 또는 불활성화된다. 비제한적인 예로서, 녹아웃은 내인성 유전자의 일부 또는 전부를 제거, 예를 들어 결실시킴으로써 또는 각각의 내인성 유전자의 발현을 활성화시키는 내인성 프로모터를 불활성화시킴으로써 달성될 수 있다.
놀랍게도, 본 발명의 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아 균주는 관련 기술분야에서 관찰된 성장 이상을 나타내지 않는다.
특히, 본 발명의 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아 집단의 성장 프로파일은 보르데텔라 페르투시스 박테리아의 야생형 모 균주 집단의 성장 프로파일에 필적한다. 보다 특히, 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아 집단의 성장 곡선은 보르데텔라 페르투시스 박테리아의 야생형 모 균주 집단의 성장 곡선에 필적한다. 예를 들어, 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아 집단 및 야생형 그람-음성 박테리아 집단의 표준 발효 프로세스에서 경과 시간 및 성장률의 값은 필적한다. 보다 특히, 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아 집단 및 야생형 보르데텔라 페르투시스 박테리아 집단에 대한 경과 시간 및 성장률의 값은 20% 미만, 예를 들어 15% 미만, 10% 미만 또는 5% 미만만큼 다양하다. 더욱 특히, 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아 집단 및 야생형 보르데텔라 페르투시스 박테리아 집단에 대한 경과 시간 및 성장률의 값은 실질적으로 유사하다.
본 발명의 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아 균주는 예를 들어, 재조합 HEK-TLR4 리포터 세포주의 NF-kB 유도를 통해, 특히 TLR4 자극 검정, 특히 인간 TLR4 자극 검정을 사용하여 측정될 때, 야생형 보르데텔라 페르투시스 박테리아에 의해 발현된 지질 A와 비교하여 감소된 내독성 활성을 나타내는 지질 A를 발현한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 다른 적합한 검정을 알고 있을 것이다.
특히, 본 발명에 따른 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아 균주는 토하마(Tohama) I 모 균주, 및 보다 특히 토하마 I PTg 균주, 유전적으로 해독된 백일해 톡소이드를 발현하는 토하마 I 균주로부터 유래된다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "모 균주"는 재조합 균주를 구축하기 위한 출발 미생물로 사용되는 보르데텔라 페르투시스의 균주를 지칭하는 것으로 관련 기술분야에서 일반적인 의미를 취한다. 모 균주는 일반적으로 본 발명의 재조합 균주의 특징이 비교되는 야생형 또는 비교기 균주이다. 본 발명의 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아는 본원에 기재된 본 발명의 유전적 변형 또는 변형들을 제외하고는 일반적으로 그의 모 균주와 동질유전자일 것이다.
본 발명의 제2 측면에서, 제1 측면의 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아로부터 유래된 외막 소포 (OMV), 특히 외막 소포의 집단이 제공된다. 또한, 제1 측면의 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아로부터 유래된 전세포 항원이 제공된다.
본 발명의 제3 측면에서, 제2 측면에 따른 적어도 하나의 OMV 또는 OMV의 집단 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다. 특히, 면역원성 조성물은 또한 아주반트를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 OMV 또는 OMV들에 존재하는 항원 이외에 적어도 하나의 항원을 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 추가 항원은 (1) 백일해 톡소이드 (PT), (2) FHA, (3) 퍼탁틴 (PRN), (4) FIM2/FIM3, (5) 아데닐레이트 시클라제, (6) 디프테리아 톡소이드 (DT), (7) 파상풍 톡소이드 (TT), (8) 불활성화된 폴리오 바이러스 (IPV), (9) B형 간염 표면 항원 및 (10) Hib PRP로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 제4 측면에서, 적합한 포유동물에서 면역 반응을 유도하는데 사용하기 위한, 제1 측면에 따른 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아, 제2 측면의 적어도 하나의 OMV 또는 OMV의 집단 또는 제3 측면의 면역원성 조성물이 제공된다.
특히, 요법 및/또는 예방에서 사용하기 위한, 예를 들어 백신으로서 사용하기 위한, 제1 측면에 따른 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아, 제2 측면의 적어도 하나의 OMV 또는 OMV의 집단 또는 제3 측면의 면역원성 조성물이 제공된다.
특히, 제1 측면에 따른 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아, 제2 측면의 적어도 하나의 OMV 또는 OMV의 집단 또는 제3 측면의 면역원성 조성물을 적합한 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 적합한 포유동물에서 면역 반응을 유도하는 방법이 제공된다.
특히, 의약, 예를 들어 요법 및/또는 예방용 의약의 제조에서 사용하기 위한, 예를 들어 백신으로서 사용하기 위한, 제1 측면에 따른 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아, 제2 측면의 적어도 하나의 OMV 또는 OMV의 집단 또는 제3 측면의 면역원성 조성물이 제공된다. 한 실시양태에서, 보르데텔라 페르투시스에 의해 유발되는 질환의 치료 및/또는 예방용 의약의 제조에서 사용하기 위한, 제1 측면에 따른 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아, 제2 측면의 적어도 하나의 OMV 또는 OMV의 집단 또는 제3 측면의 면역원성 조성물이 제공된다.
본 발명의 제5 측면에서, LpxA 및 LpxD로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자를 박테리아의 게놈 내로 안정적으로 통합하는 것을 포함하는, 보르데텔라 페르투시스 박테리아의 지질 A의 반응원성을 조정하는 방법이 제공되며, 여기서:
(i) LpxA 유전자는 서열식별번호: 1 또는 2와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 LpxA 단백질을 코딩하고, 여기서 단백질은 서열식별번호: 1 또는 2에 따라 넘버링된 경우 위치 170에서의 세린 (S170) 및/또는 위치 229에서의 알라닌 (A229)을 포함하고/거나;
(ii) LpxD 유전자는 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4와 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 LpxD 단백질을 코딩한다.
바람직하게는, 본 발명의 이러한 제5 측면에서, 보르데텔라 페르투시스 박테리아의 지질 A의 반응원성을 조정하는 방법은 LpxA 유전자를 박테리아의 게놈 내로 안정적으로 통합하는 것을 포함하며, 여기서 LpxA 유전자는 서열식별번호: 1 또는 2와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 LpxA 단백질을 코딩하고, 여기서 단백질은 서열식별번호: 1 또는 2에 따라 넘버링된 경우 위치 170에서의 세린 (S170) 및/또는 위치 229에서의 알라닌 (A229)을 포함한다.
한 실시양태에서, 방법은 보르데텔라 파라페르투시스 (LpxABpa)로부터 유래된 LpxA 유전자를 박테리아의 게놈 내로 안정적으로 통합하는 것을 포함한다.
도 1(a). 보르데텔라 페르투시스로부터의 지질 A의 구조; 및 도 1(b). 보르데텔라 파라페르투시스로부터의 지질 A의 구조, 여기서 점선은 자연 발생 변이체 구조, 특히, 추가로 존재할 수 있는 1 및 2개의 2차 C16 아실 쇄, 및 C10 쇄의 손실을 갖는 소수 변이체를 나타낸다.
도 2. 보르데텔라 속으로부터의 LpxA 아미노산 서열의 정렬.
도 3. 비. 페르투시스 토마하(Tomaha) I PTg의 발효 프로파일. 곡선 1: 아세트산의 첨가에 의해 pH를 7.2로 조절하여 (곡선 3) 세포 브로쓰의 염기성화를 피하여 배양 정지를 초래함; 곡선 2: 용존 산소 농도; 곡선 4: 용존 산소 농도 (DO)를 25%로 유지하도록 교반 속도를 조작하여 산소 제한 (DO/속도 조절)을 피함; 곡선 5: 온도를 35℃에서 조절함.
도 4. 비. 파라페르투시스로부터 LpxA를 발현하는 본 발명의 재조합 비. 페르투시스 균주 (ΔLpxABpe/LpxABpa)의 발효 프로파일. 곡선 2: 용존 산소 농도 (DO)를 25%로 유지하도록 교반 속도를 조작하여 산소 제한 (DO/속도 조절)을 피함; 곡선 3: 온도를 35℃에서 조절함; 곡선 4: 아세트산의 첨가에 의해 pH를 7.2로 조절하여 (곡선 1) 세포 브로쓰의 염기성화를 피하여 배양 정지를 초래함; 곡선 5: 용존 산소 농도. NB: 배기 필터의 막힘으로 인해, 약 20분 동안 필터 대체 프로세스 동안 DO 및 교반 속도가 0으로 강하됨. 이는 발효 결과에 영향을 미치지 않았다.
도 5. ΔLpxABpe/LpxABpa (파선) 및 모 균주, 토하마 I PTg (흑색)의 교반 속도 발효 프로파일.
도 6(a). LC-MS에 의한 LOS의 구조적 분석 - 게놈으로 통합된 LpxABpa를 발현하는 ΔLpxABpe/LpxABpa의 비. 페르투시스로부터의 OMV. 도 6(b). LC-MS에 의해 결정된 바와 같은 LOS 구조. 실선은 이러한 LOS의 구조를 보여준다. 점선은 이러한 LOS 구조 및 야생형 비. 페르투시스 균주 토하마 I에서 발견되는 LOS 구조 간의 차이를 예시한다.
도 7(a). LC-MS에 의한 LOS의 구조적 분석 - LpxABpa를 에피솜으로 발현하는 비. 페르투시스로부터의 OMV. 도 7(b). LC-MS에 의해 결정된 바와 같은 소수 변이체 LOS 구조 (여기서 점선은 이러한 LOS 및 야생형 비. 페르투시스 균주 토하마 I에서 발견되는 LOS 구조 간의 차이를 예시함).
도 8(a). LC-MS에 의한 LOS의 구조적 분석 - 게놈으로 통합된 LpxABpa를 발현하는 ArnT 및 LpxABpe 이중 녹아웃 변이체인 비. 페르투시스 ΔArnT/ΔLpxABpe/LpxABpa로부터의 OMV. 도 8(b). LC-MS에 의해 결정된 바와 같은 LOS 구조. 실선은 이러한 LOS의 구조를 보여준다. 점선은 이러한 LOS 구조 및 야생형 비. 페르투시스 균주 토하마 I에서 발견되는 LOS 구조 간의 차이를 예시한다.
도 9(a). LC-MS에 의한 LOS의 구조적 분석 - 게놈으로 통합된 LpxABpa 및 LpxDPa를 발현하는 LpxABpe 및 DNT 이중 녹아웃 변이체인 비. 페르투시스 ΔLpxABpe/LpxABpa/ΔDNT/LpxDPa로부터의 OMV. 도 9(b). LC-MS에 의해 결정된 바와 같은 LOS 구조. 실선은 이러한 LOS의 구조를 보여준다. 점선은 이러한 LOS 구조 및 야생형 비. 페르투시스 균주 토하마 I에서 발견되는 LOS 구조 간의 차이를 예시한다.
도 10(b). LC-MS에 의한 LOS의 구조적 분석 - 게놈으로 통합된 LpxABpa 및 LpxDPa를 발현하는 LpxABpe, DNT 및 LpxDBpe 삼중 녹아웃 변이체인 비. 페르투시스 ΔLpxABpe/LpxABpa/ΔDNT/LpxDPa/ΔLpxDBpe로부터의 OMV. 도 10(b). LC-MS에 의해 결정된 바와 같은 LOS 구조. 실선은 이러한 LOS의 구조를 보여준다. 점선은 이러한 LOS 구조 및 야생형 비. 페르투시스 균주 토하마 I에서 발견되는 LOS 구조 간의 차이를 예시한다.
도 11(a). LC-MS에 의한 LOS의 구조적 분석 - LpxDPa를 에피솜으로 발현하는 비. 페르투시스 LpxDPa로부터의 OMV. 도 11(b). LC-MS에 의해 결정된 바와 같은 LOS 구조. 실선은 이러한 LOS의 구조를 보여준다. 점선은 이러한 LOS 구조 및 야생형 비. 페르투시스 균주 토하마 I에서 발견되는 LOS 구조 간의 차이를 예시한다.
도 12(a). LC-MS에 의한 LOS의 구조적 분석 - PagLBbr을 발현하는 ArnT 녹아웃 변이체인 비. 페르투시스 ΔArnT/PagLBbr로부터의 OMV. 도 12(b). LC-MS에 의해 결정된 바와 같은 LOS 구조. 실선은 이러한 LOS의 구조를 보여준다. 점선은 이러한 LOS 구조 및 야생형 비. 페르투시스 균주 토하마 I에서 발견되는 LOS 구조 간의 차이를 예시한다.
도 13(a). LC-MS에 의한 LOS의 구조적 분석 - 야생형 비. 페르투시스 토마하 I PTg로부터의 OMV. 도 13(b). LC-MS에 의해 결정된 바와 같은 LOS 구조.
도 14. HEK-hTLR4 세포에서 TLR4 신호전달의 시험관내 활성화. HEK-TLR4 세포는 재조합 비. 페르투시스 균주로부터의 OMV; 비. 페르투시스 토하마 I PTg 균주 (야생형 대조군)로부터의 OMV를 사용한 단백질 함량에 기초하여; 또는 벡세로, 퀸박셈 또는 인판릭스 헥사 백신을 사용한 인간 용량 (백신 대조군)의 등가 분획에 기초하여 자극되었다. 비자극된 세포는 음성 대조군으로 포함되었다 (데이터는 나타내지 않음).
도 15 HEK-hTLR4 세포에서 TLR4 신호전달의 시험관내 활성화. HEK-TLR4 세포는 재조합 비. 페르투시스 균주로부터의 OMV; 비. 페르투시스 토하마 I PTg 균주 (야생형 대조군)로부터의 OMV; 비. 페르투시스 토마하 I PTg로부터의 정제된 LPS; 또는 네이세리아 메닝기티디스 B ΔMsbB 균주 (ΔMsbB)로부터의 해독된 정제된 LPS를 사용한 LOS 함량에 기초하여 자극되었다. 비자극된 세포는 음성 대조군으로 포함되었다.
도 16. HEK-hTLR4 세포에서 TLR4 신호전달의 시험관내 활성화. HEK-TLR4 세포는 재조합 비. 페르투시스 균주로부터의 OMV; 비. 페르투시스 토하마 I PTg 균주 (야생형 대조군)로부터의 OMV; 또는 벡세로, 퀸박셈 및 인판릭스 헥사 백신을 사용한 단백질 함량에 기초하여 자극되었다. 비자극된 세포는 음성 대조군으로 포함되었다.
도 17. HEK-hTLR4 세포에서 TLR4 신호전달의 시험관내 활성화. HEK-TLR4 세포는 재조합 비. 페르투시스 균주로부터의 OMV; 비. 페르투시스 토하마 I PTg 균주 (야생형 대조군)로부터의 OMV; 비. 페르투시스로부터의 정제된 LPS; 또는 해독된 네이세리아 메닝기티디스 B ΔMsbB 균주 (ΔMsbB)로부터의 OMV를 사용한 LOS 함량에 기초하여 자극되었다. 자극은 LOS 함량에 의해 정규화되었다. 비자극된 세포는 음성 대조군으로 포함되었다.
도 18(a). LC-MS에 의한 LOS의 구조적 분석 - LpxEFn을 에피솜으로 발현하는 비. 페르투시스로부터의 OMV. 도 18(b). LC-MS에 의해 결정된 바와 같은 LOS 구조의 변이체, 여기서 변이체 구조는 포스페이트 제거를 갖는다 (위치는 흑색 화살표에 의해 표시됨).
도 19(a). LC-MS에 의한 LOS의 구조적 분석 - LpxERc를 에피솜으로 발현하는 비. 페르투시스로부터의 OMV. 도 19(b). LC-MS에 의해 결정된 바와 같은 LOS 구조의 변이체, 여기서 변이체 구조는 포스페이트 제거를 갖는다 (위치는 흑색 화살표에 의해 표시됨).
도 20. LC-MS에 의한 LOS의 구조적 분석 - LpxFFn을 에피솜으로 발현하는 비. 페르투시스로부터의 OMV. 도 20(b). LC-MS에 의해 결정된 바와 같은 LOS 구조는 LOS 구조에 대한 식별가능한 영향을 나타내지 않음.
도 21 HEK-hTLR4 세포에서 TLR4 신호전달의 시험관내 활성화. HEK-TLR4 세포는 LpxEFn을 발현하는 재조합 비. 페르투시스 균주로부터의 OMV를 사용한 LOS 함량에 기초하여 자극되었다. 비. 페르투시스 토하마 I PTg 균주 (WT PTg)로부터의 OMV는 양성 대조군으로 사용되었고, 비자극된 세포는 음성 대조군으로 포함되었다.
도 22. HEK-hTLR4 세포에서 TLR4 신호전달의 시험관내 활성화. HEK-TLR4 세포는 LpxEFn을 발현하는 재조합 비. 페르투시스 균주로부터의 OMV를 사용한 단백질 함량에 기초하여 자극되었다. 비. 페르투시스 토하마 I PTg 균주 (WT PTg)로부터의 OMV는 양성 대조군으로 사용되었고, 비자극된 세포는 음성 대조군으로 포함되었다.
도 23. Balb/c 마우스에서 비인두 집락화 모델에서 수행된 연구로부터 ELISA에 의해 측정된 개별 항체 역가 (항-PRN IgG) 및 95% 신뢰 구간을 사용한 기하 평균.
도 24. Balb/c 마우스에서 비인두 집락화 모델에서 수행된 연구로부터 그룹별 및 날짜별로 표시된 비강 당 콜로니-형성 단위 (CFU)의 수의 평균에 의해 정의된 바와 같은 박테리아 로드의 개별 값 및 기하 평균.
도 25. Balb/c 마우스에서 폐 청소 모델에서 수행된 연구로부터 28일차에 ELISA에 의해 측정된 개별 항-PRN IgG 역가 및 기하 평균 역가 (연관 95% 신뢰 구간을 나타내는 오차 막대 포함).
도 26. Balb/c 마우스에서 폐 청소 모델에서 수행된 연구로부터 날짜 함수로서 그룹별 개별 콜로니-형성 단위 (CFU) 카운트 (작은 도트) 및 기하 평균 (큰 연결 도트).
도 27(a) 내지 (f). 상이한 연속 희석액에 대해 배양 상청액에서 측정된 반응원성 메커니즘과 연관된 것으로 공지된 6개의 시토카인 (즉: IL1a, IL6, TNFa, IL1b, IL10, MIP1a).
발명의 상세한 설명
본 발명은 야생형 보르데텔라 페르투시스 박테리아의 LPS와 비교하여 감소된 내독성을 나타내는 LPS를 포함하는 재조합 보르데텔라 페르투시스 균주에 관한 것이다. 본 출원에서 LPS에 대한 언급은 LOS를 또한 포함한다. LPS 및 LOS 둘 모두의 내독성은 주로 지질 A 모이어티의 조성에 의해 결정된다.
놀랍게도, 본 발명자들은 본 발명의 박테리아가 또한 야생형 비재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아에 필적하는 박테리아 성장 프로파일을 나타낸다는 것을 발견하였다.
박테리아와 관련하여 용어 "야생형"의 사용은 자연에서 발생하는 전형적인 균주를 지칭한다. 이러한 야생형 균주는 본원에 기재된 본 발명의 변형이 결여되어 있다. 그러므로, 용어 "야생형"은 본 발명의 미생물과 동일한 균주의 미생물이지만 본 발명의 유전적 변형, 예를 들어 본원에 기재된 LpxA 및/또는 LpxD 유전적 변형이 결여되어 있는 미생물을 지칭하는데 사용된다. 야생형 균주는 또한 모 균주로 지칭될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 "내인성" 유전자 또는 단백질은 재조합 박테리아가 원래 유래된 보르데텔라 페르투시스 박테리아의 야생형 모 균주에서 발견되는 비변형된 유전자 (핵산 서열) 또는 단백질 (아미노산 서열)을 지칭하는데 사용된다.
한편, 용어 "외인성"은 재조합 박테리아가 유래된 야생형 보르데텔라 페르투시스 박테리아 균주에서 자연적으로 발견되지 않는 유전자 (핵산 서열) 또는 단백질 (아미노산 서열)을 지칭하는데 사용된다. 용어 "외인성"은 용어 "이종"과 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본 발명은 하기를 포함하는 재조합 보르데텔라 페르투시스 균주에 관한 것이다: LpxA 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 게놈 LpxA 유전자, 여기서 LpxA 단백질은 서열식별번호: 1에 비해 위치 170에서의 돌연변이 및/또는 위치 229에서의 돌연변이를 포함함; 및/또는 이종 LpxD 유전자의 적어도 하나의 게놈 삽입.
박테리아
본 발명의 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아는 비제한적인 예로서 하기를 포함하는 보르데텔라 페르투시스의 다양한 모 균주로부터 유래될 수 있다: 토하마 I, 예를 들어 보르데텔라 페르투시스 모레노-로페즈 (ATCC: BAA-589), BP165, BPW28, 10536, 18323, I135, BAA-2706, BAA-2705 또는 PT/28G [W28] (ATCC: 53894). 바람직하게는, 본 발명의 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아는 유전적으로 해독된 백일해 톡소이드, 특히 PT-9K/129G로 지칭되는 유전적으로 해독된 백일해 톡소이드를 발현하는 균주로부터 유래된다. PT-9K/129G 유전적으로 해독된 백일해 톡소이드를 발현하는 재조합 보르데텔라 페르투시스 균주는 PT의 S1 서브유닛 내에 2개의 아미노산 치환, 구체적으로 R9K 및 E129G를 포함한다 (예를 들어 EP0396964 참조). 특히, 재조합 박테리아가 유래된 보르데텔라 페르투시스의 균주는 토하마 I이다. 보다 특히 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아는 유전적으로 해독된 백일해 톡소이드를 발현하는 토하마 I의 균주로부터 유래된다. 더욱 특히, 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아는 유전적으로 해독된 백일해 톡소이드 PT-9K/129G를 발현하는 토하마 I의 균주로부터 유래된다. 더욱 더 특히, 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아는 돌연변이 R9K 및 E129G를 포함하도록 변형된 S1 유전자를 포함하고, 유전적으로 해독된 백일해 톡소이드 PT-9K/129G를 발현한다.
백일해 독소는 보르데텔라 페르투시스에 의해 분비되지만, 단리된 전세포 및 외막 소포에 여전히 존재할 수 있다. 따라서, 유전적으로 해독된 PT를 발현하는 균주의 사용이 유리하다. 바람직하게는, 본 발명의 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아는 피부 괴사성 독소 (DNT) 유전자를 발현하지 않는다.
박테리아 지질다당류 및 지질 A
박테리아 지질다당류 (LPS)는 고도로 가변적인 O 항원, 덜 가변적인 코어 올리고당 및 지질 A로 지정된 고도로 보존된 지질 모이어티로 구성된다. 지질 A는 1 또는 2개의 포스페이트 기 및 다양한 길이의 많은 아실 쇄로 치환된 글루코사민 이당류로 이루어진다 (도 1). LPS의 내독성 활성은 주로 지질 A 모이어티의 조성에 의해 결정된다.
도 1(a)는 야생형 보르데텔라 페르투시스로부터의 지질 A의 구조를 보여준다. 본 발명은 부분적으로 보르데텔라 페르투시스의 LPS에서 지질 A의 C2, C2' 및/또는 C3' 아실 쇄의 길이의 변형에 기초한다. 바람직한 실시양태에서, 보르데텔라 페르투시스의 LPS에서 지질 A의 C3' 아실 쇄가 변형된다. 이러한 실시양태에서, 보르데텔라 페르투시스의 LPS에서 지질 A의 C2 및 C2' 아실 쇄의 길이가 또한 변형될 수 있다. 이를 위해, 보르데텔라 페르투시스의 지질 A 생합성 경로가 조작되었다.
LpxA 아실트랜스퍼라제
아실트랜스퍼라제 LpxA ('LpxA'로 지칭됨)는 에스테르-연결 1차 β-히드록시-미리스테이트를 지질 A 3 및 3' 위치에서 단당류 전구체 (UDP-글루코사민)로 전달하는 것을 촉매하여, 두 위치 모두에 혼입된 아실 쇄의 길이를 결정하며, 이는 그람-음성 박테리아에 따라 다르다 [4, 5, 6].
LPS의 내독성 활성은 주로 그의 지질 A 모이어티의 조성에 의해 결정된다. 지질 A의 아실 쇄의 수의 변화는 TLR4를 통한 신호전달에 영향을 미칠 수 있지만, 이들 쇄의 변화가 TLR4 신호전달에 차등적으로 영향을 미치는 메커니즘은 완전히 해명되지는 않았다 [2].
그러므로, 이종 LpxA 유전자의 발현은 LPS의 내독성을 감소시킬 수 있다. 슈도모나스 아에루기노사 (LpxAPa) 및 네이세리아 메닝기티디스 (LpxANm)로부터의 LpxA는 각각 10 (C10) 또는 12 (C12)개의 탄소 원자의 길이를 갖는 아실 쇄의 전달을 촉매한다. 그러나, WO2018/167061에 기재된 것과 같은 이전 연구에서, LpxAPa 또는 LpxANm 유전자는 비. 페르투시스에서 에피솜으로 발현되었고, 내인성 LpxA 유전자는 불활성화되었다. LpxAPa의 에피솜 발현은 C3' 아실 쇄의 길이를 C14에서 C10으로 감소시켰지만, 생성된 재조합 균주는 강한 성장 결함을 나타내었으며, 이를 대규모 발효 및 사용에 부적합하게 만들었다. 한편, 보르데텔라 페르투시스에서 LpxANm의 에피솜 발현은 치명적이었다.
놀랍게도, 본 발명자들은 보르데텔라 페르투시스에서, 비. 파라페르투시스 (LpxABpa)로부터의 LpxA의 게놈 발현이 LPS의 내독성을 또한 감소시키면서 관련 기술분야에서 관찰된 적합성/성장 문제를 극복한다는 것을 발견하였다.
보르데텔라 파라페르투시스로부터의 LpxA의 아미노산 서열은 서열식별번호: 2로 제공된다. 보르데텔라 페르투시스로부터의 LpxA의 아미노산 서열은 서열식별번호: 1로 제공된다.
비. 페르투시스로부터의 LpxA의 아미노산 서열은 서열식별번호: 1 및 2의 위치 170 및 229에서의 아미노산에 상응하는 2개의 잔기가 비. 파라페르투시스와 상이하다 (도 2). 아미노산 위치 170 및/또는 위치 229에서의 특정 치환의 존재는 지질 A의 위치 C3'에서 C10 아실 쇄를 선택적으로 혼입하도록 LpxA의 특이성을 변경하는 것으로 여겨진다. 그러므로, 본 발명의 재조합 보르데텔라 페르투시스 균주는 위치 170 및 229 (서열식별번호: 1을 참조하여 넘버링된 경우)에서의 아미노산 하나 또는 둘 모두가 알라닌 (A), 세린 (S), 트레오닌 (T) 및 시스테인 (C)으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 의해 치환된 LpxA 아미노산 서열을 코딩하는 LpxA 유전자를 발현할 수 있다. 특히, 재조합 보르데텔라 페르투시스 균주는 G170이 세린에 의해 치환된 (G170S) 및/또는 G229가 알라닌에 의해 치환된 (G229A) LpxA 아미노산 서열을 코딩하는 LpxA 유전자를 발현할 수 있다. 특히, 재조합 보르데텔라 페르투시스 균주는 위치 170에서의 세린 잔기 및/또는 위치 229에서의 알라닌 잔기 (서열식별번호: 1을 참조하여 넘버링된 경우)를 포함하는 LpxA 아미노산 서열을 코딩하는 LpxA 유전자를 발현할 수 있다.
아미노산 치환 또는 돌연변이는 표준 분자 생물학 기술, 예컨대 무작위 돌연변이유발, 부위-지정 돌연변이유발, 지정된 진화, 유전자 대체 등에 의해 도입될 수 있다.
바람직하게는, LpxA 유전자는 상기 기재된 돌연변이(들)에 더하여 서열식별번호: 2와 적어도 80% 서열 동일성, 예를 들어 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 8%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89% 또는 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩한다.
특히, 두 서열의 서열 동일성은 게놈퀘스트, 인크.(GenomeQuest, Inc.)에 의해 제공된 진패스트(GENEPAST) 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 이 알고리즘은 예전에 "Kerr"로 불렸으며, 어떠한 생물학적 칭량도 없이 퍼센트 서열 동일성의 산술적 결정을 수행한다 (문헌 [Dufresne et al., Nature Biotechnology 20, 1269-1271 (2002)], 또는 [Andree et al., World Patent Information, 2008, vol. 30, issue 4, pages 300-308]). 일반적으로, 서열 동일성은 비교될 서열 중 가장 긴 것의 전체 길이 (즉, 전장)와 관련하여 및 이를 따라 계산된다.
LpxD 아실트랜스퍼라제
LpxD 아실트랜스퍼라제 (LpxD)는 지질 A의 2 및 2' 위치에서 아미드-연결 β-히드록시-미리스테이트를 전달하는 것을 촉매하여, 두 위치 모두에 혼입된 아실 쇄의 길이를 결정하며, 이는 다시 그람-음성 박테리아에 따라 다르다 [6].
외인성 LpxD 변이체의 발현은 박테리아 LPS의 내독성 프로파일을 개선할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 재조합 보르데텔라 페르투시스 균주는 적어도 하나의 이종 LpxD 유전자를 포함할 수 있다. 특히, 이종 LpxD 유전자는 박테리아 게놈 내로 통합된다.
씨. 테스토스테로니 (LpxDCt)로부터의 LpxD의 적합한 아미노산 서열은 서열식별번호: 3으로 제공된다. 피. 아에루기노사 (LpxDPa)로부터의 LpxD의 적합한 아미노산 서열은 서열식별번호: 4로 제공된다.
그러므로, 일부 실시양태에서 적어도 하나의 이종 LpxD 유전자는 피. 아에루기노사로부터의 LpxD 유전자이다. 일부 실시양태에서 적어도 하나의 이종 LpxD 유전자는 씨. 테스토스테로니로부터의 LpxD 유전자이다. 일부 실시양태에서, 이종 LpxD 유전자는 피부 괴사성 독소의 유전자좌를 대체한다. 일부 실시양태에서, 이종 LpxD 유전자는 내인성 LpxD 유전자를 대체한다. 일부 실시양태에서, 이종 LpxD 유전자는 BP0840 프로모터 (외막 포린 프로모터)의 제어 하에 있다. 훨씬 더 특히, LpxD 유전자 (LpxDBp)의 야생형 카피는 녹아웃된다.
일부 실시양태에서 적어도 하나의 이종 LpxD 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 서열식별번호: 3과 적어도 90% 동일성을 갖는다.
그러므로, 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 LpxD 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 서열식별번호: 3과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일성을 갖는다. 보다 특히, LpxD 아미노산 서열은 서열식별번호: 3과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는다.
일부 실시양태에서 적어도 하나의 이종 LpxD 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 서열식별번호: 4와 적어도 90% 동일성을 갖는다.
그러므로, 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 LpxD 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 서열식별번호: 4와 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일성을 갖는다. 보다 특히, LpxD 아미노산 서열은 서열식별번호: 4와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는다.
특히, 본 발명의 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아는 위치 170에서의 세린 잔기 및 위치 229에서의 알라닌 잔기를 포함하는 LpxA 아미노산 서열을 코딩하는 이종 LpxD 유전자 및 LpxA 유전자를 모두 발현한다. 보다 특히, 비. 페르투시스 박테리아는 LpxABpa 및 LpxDPa를 발현한다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 LpxA 유전자 및 적어도 하나의 LpxD 유전자는 박테리아 게놈 내로 통합된다. 다른 실시양태에서, LpxA 유전자는 박테리아 게놈 내로 통합되는 반면, LpxD 유전자는 에피솜으로 발현될 수 있다.
재조합 박테리아의 내인성 LpxA 및/또는 LpxD 유전자는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 수단에 의해 불활성화될 수 있다. 예를 들어, 유전자가 녹아웃될 수 있다.
일반적으로, 내인성 LpxA 유전자는 돌연변이되지만, 불활성화되거나 예를 들어 서열식별번호: 2로 대체될 수 있다. 일반적으로, 내인성 LpxD 유전자는 불활성화된다. 일부 실시양태에서, 내인성 LpxA 및 내인성 LpxD 유전자 둘 모두가 불활성화된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아는 추가적인 유전적 변형, 예컨대 다른 외인성 유전자의 발현 및/또는 다른 내인성 유전자의 불활성화를 포함한다. 비제한적인 예로서, (1) 내인성 ArnT 유전자 (서열식별번호: 18)는 불활성화, 예를 들어 결실 또는 녹아웃될 수 있음; (2) 내인성 피부 괴사성 독소 (DNT) 유전자 (서열식별번호: 19)는 불활성화, 예를 들어 결실 또는 녹아웃됨; (3) 박테리아는 보르데텔라 브론키셉티카로부터의 PagL (서열식별번호: 16)을 발현할 수 있음; (4) 박테리아는 이종 그람-음성 박테리아 (서열식별번호: 6 또는 7)로부터의 LpxE 단백질을 발현할 수 있음; 및/또는 (5) 박테리아는 이종 그람-음성 박테리아 (서열식별번호: 8)로부터의 LpxF 단백질을 발현할 수 있음.
LpxE 및 LpxF 포스페이트 포스파타제
LpxE 포스페이트 포스파타제 (LpxE) 및 LpxF 포스페이트 포스파타제 (LpxF)는 포스페이트 기를 포함하는 지질로부터 포스페이트 기를 제거하도록 작용할 수 있는 가수분해효소이다. 하나의 포스페이트 기가 제거되면, 지질 A는 "모노포스포릴 지질 A"이다. 지질 A와 관련하여, LpxE 및 LpxF의 활성은 각각 코어 이당류의 C1 및 C4'에서 포스페이트 기의 제거를 초래할 수 있다.
리조비움 레구미노사룸(Rhizobium leguminosarum) (LpxERl) 및 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida) (LpxEFn)로부터의 LpxE 포스파타제는 참고문헌 [65] 및 [66]에 개시되어 있다. 프란시셀라 노비시다 (LpxFFn)로부터의 LpxF 포스페이트 포스파타제는 참고문헌 [67]에 개시되어 있다. 저자는 이. 콜라이에서 LpxERl, LpxEFn 및 LpxFFn의 이종 발현을 추가로 개시한다 ([68] 및 [69]). 그러나, 이들 참고문헌은 보르데텔라 페르투시스에서 LpxE 또는 LpxF의 사용을 개시하지 않는다.
본 발명자들은 이제 보르데텔라 페르투시스에서 외인성 LpxE 및 LpxF의 발현을 테스트하였고, 이종 LpxE 및/또는 LpxF의 사용이 지질 A의 구조를 변경하고, 또한 지질 A의 특징, 예를 들어 비. 페르투시스 LPS의 내독성 프로파일을 변화시킬 수 있음을 입증하였다.
그러므로, 본 발명의 재조합 보르데텔라 페르투시스 균주는 적어도 하나의 이종 LpxE 유전자 및/또는 적어도 하나의 이종 LpxF 유전자를 포함할 수 있다. 특히, 적어도 하나의 이종 LpxE 유전자 및/또는 적어도 하나의 이종 LpxF 유전자는 박테리아 게놈 내로 통합된다.
LpxE는 코어 이당류의 C1 위치를 특이적으로 탈인산화하는 포스페이트 포스파타제이다. 바람직하게는, LpxE는 리조비움 레구미노사룸 (LpxERl) 및 프란시셀라 노비시다 (LpxEFn)로 이루어진 군으로부터 선택된 박테리아로부터의 이종 LpxE 유전자이다. 리조비움 레구미노사룸 및 프란시셀라 노비시다로부터의 LpxE의 적합한 아미노산 서열은 각각 서열식별번호: 6 및 서열식별번호: 7로 제공된다.
일부 실시양태에서, 이종 LpxE 유전자는 글리코실트랜스퍼라제를 코딩하는 ArnT 유전자의 유전자좌 (ΔArnT)를 대체한다. 일부 실시양태에서, 이종 LpxE 유전자는 BP0840 프로모터 (외막 포린 프로모터)의 제어 하에 있다. 일부 실시양태에서 적어도 하나의 이종 LpxE 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 서열식별번호: 6 또는 서열식별번호: 7과 적어도 90% 동일성, 적어도 95% 또는 100% 동일성을 갖는다.
한 특정 실시양태에서, 이종 LpxE 유전자는 박테리아 게놈 내에 삽입되고 ArnT 유전자의 유전자좌 (ΔArnT)를 대체하는 BP0840 프로모터 (외막 포린 프로모터)의 제어 하에 있는 LpxEFn이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아는 위치 170에서의 세린 잔기 및 위치 229에서의 알라닌 잔기를 포함하는 LpxA 아미노산 서열을 코딩하는 이종 LpxE 유전자 및 LpxA 유전자를 발현한다. 보다 특히, 비. 페르투시스 박테리아는 LpxERl 및 LpxEFn으로 이루어진 군으로부터 선택된 LpxABpa 및 LpxE 유전자를 발현한다. 일부 실시양태에서, LpxA 및 LpxE 유전자는 박테리아 게놈 내로 통합된다. 다른 실시양태에서, LpxA 유전자는 박테리아 게놈 내로 통합되지만 LpxE 유전자는 에피솜으로 발현된다.
LpxF는 코어 이당류의 C4' 위치를 특이적으로 탈인산화하는 포스페이트 포스파타제이다. 바람직하게는, LpxF는 프란시셀라 노비시다 (LpxFFn)로부터의 이종 LpxF 유전자이다. 프란시셀라 노비시다로부터의 LpxF의 적합한 아미노산 서열은 서열식별번호: 8로 제공된다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 이종 LpxF 유전자는 프란시셀라 노비시다로부터의 LpxF 유전자이다. 일부 실시양태에서, 이종 LpxF 유전자는 글리코실트랜스퍼라제를 코딩하는 ArnT 유전자의 유전자좌를 대체한다. 일부 실시양태에서, 이종 LpxF 유전자는 BP0840 프로모터 (외막 포린 프로모터)의 제어 하에 있다. 일부 실시양태에서 적어도 하나의 이종 LpxF 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 서열식별번호: 8과 적어도 90% 동일성, 적어도 95% 또는 100% 동일성을 갖는다.
지질 A 아실 쇄
일반적으로, 그람-음성 박테리아의 지질 A는 상이한 길이 및 복잡성의 최대 8개의 지방산으로 아실화된 β-(1→6)-연결 이당류 뿐만 아니라 하전된 치환체, 예컨대 포스페이트 기, 포스포에탄올아민 잔기, 또는 양으로 하전된 당 잔기로 이루어지고, 상이한 박테리아 종의 지질 A 내에 많은 변이가 있다. 이당류의 위치 2 및 2'에서의 아실화 (각각 환원 및 말단 당 잔기)는 아미드-연결 지질로 이어지며, 이는 또한 3-아미노-3-데옥시-d-글루코사민이 아실화될 때 3- 및 3'-위치에 대한 사례이다. 위치 3 및 3'에서의 히드록실 기 뿐만 아니라 지방 아실 쇄의 3-히드록실 기는 또한 아실화되어, 에스테르-연결 치환체를 생성한다. β-(1→6)-연결 이당류에 부착된 4-8개의 아실 기에 의한 아실화 정도는 종에 따라 다르며, 특정 박테리아 종으로부터의 지질 A에 단일 형태 초과가 종종 존재한다.
일반적으로, 야생형 보르데텔라 페르투시스에서 지질 A의 위치 C2, C2' 및 C3'에서의 아실 쇄의 길이는 C14이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 아래첨자의 정수가 뒤따르는 'C'는 정수로 표시되는 길이의 탄소 쇄에 기초한 분자를 나타낸다. 그러므로, C14 및 C10은 각각 14-탄소 원자 쇄 및 10-탄소 원자 쇄를 갖는 분자를 나타낸다.
본 발명의 재조합 박테리아는 위치 C2 및/또는 C2' 및/또는 C3'에서의 아실 쇄의 길이가 야생형 그람-음성 박테리아에 의해 생산된 지질 A의 상응하는 아실 쇄의 길이와 비교하여 감소된 지질 A를 생산한다.
본 발명의 재조합 박테리아의 바람직한 실시양태에서, 박테리아는 위치 C3'에서의 아실 쇄의 길이가 야생형 그람-음성 박테리아에 의해 생산된 지질 A의 상응하는 아실 쇄의 길이와 비교하여 감소된 지질 A를 생산한다. 일부 실시양태에서, 박테리아는 위치 C2 및/또는 C2'에서의 아실 쇄의 길이가 또한 야생형 그람-음성 박테리아에 의해 생산된 지질 A의 상응하는 아실 쇄의 길이와 비교하여 감소된 지질 A를 생산한다.
바람직한 실시양태에서, 위치 C3'에서의 아실 쇄의 길이는 C14 미만, 예컨대 C6 내지 C12, C8 내지 C12 또는 C10 내지 C12, 특히 C10 또는 C12, 예를 들어 C6, C8, C10 또는 C12이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 위치 C3'에서의 아실 쇄의 길이는 C10이다.
특히, 위치 C2에서의 아실 쇄의 길이는 C14 미만, 예컨대 C6 내지 C12, C8 내지 C12 또는 C10 내지 C12, 특히 C10 또는 C12, 예를 들어 C6, C8, C10 또는 C12이다. 특히, 위치 C2'에서의 아실 쇄의 길이는 C14 미만, 예컨대 C6 내지 C12, C8 내지 C12 또는 C10 내지 C12, 특히 C10 또는 C12, 예를 들어 C6, C8, C10 또는 C12이다. 특히, 위치 C3'에서의 아실 쇄의 길이는 C14 미만, 예컨대 C6 내지 C12, C8 내지 C12 또는 C10 내지 C12, 특히 C10 또는 C12, 예를 들어 C6, C8, C10 또는 C12이다.
일부 실시양태에서, 위치 C2 및 위치 C2' 둘 모두에서의 아실 쇄의 길이는 C14 미만, 예컨대 C6 내지 C12, C8 내지 C12 또는 C10 내지 C12, 특히 C10 또는 C12, 예를 들어 C6, C8, C10 또는 C12이다. 일부 실시양태에서, 위치 C2 및 위치 C3' 둘 모두에서의 아실 쇄의 길이는 C14 미만, 예컨대 C6 내지 C12, C8 내지 C12 또는 C10 내지 C12, 특히 C10 또는 C12, 예를 들어 C6, C8, C10 또는 C12이다. 일부 실시양태에서, 위치 C2' 및 위치 C3' 둘 모두에서의 아실 쇄의 길이는 C14 미만, 예컨대 C6 내지 C12, C8 내지 C12 또는 C10 내지 C12, 특히 C10 또는 C12, 예를 들어 C6, C8, C10 또는 C12이다. 일부 실시양태에서, 위치 C2, 위치 C2' 및 위치 C3'에서의 아실 쇄의 길이는 C14 미만, 예컨대 C6 내지 C12, C8 내지 C12 또는 C10 내지 C12, 특히 C10 또는 C12, 예를 들어 C6, C8, C10 또는 C12이다.
본 발명의 재조합 박테리아에 의해 생산된 지질 A는 상이한 길이의 아실 쇄를 갖는 종의 혼합물로서 존재할 수 있다.
그러므로, 세포 내 지질 A의 총 집단을 고려하면, C2 위치에서의 아실 쇄의 적어도 10%는 C10 또는 C12이고/거나, C2' 위치에서의 아실 쇄의 적어도 10%는 C10 또는 C12이고/거나, C3' 위치에서의 아실 쇄의 적어도 10%는 C10 또는 C12이다. 특히, 적어도 10%는 C10 또는 C12일 수 있고, 적어도 12%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 24%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%는 C10 또는 C12일 수 있다. 바람직하게는 적어도 10%는 C10 또는 C12이고, 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%는 C10 또는 C12이다. 더욱 특히 약 100%는 C10 또는 C12이다.
박테리아 성장
본 발명의 재조합 균주는 안정적이지만, 또한 예를 들어 제조에서 대규모 성장에 적합하다. 놀랍게도, 본 발명의 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아의 성장 프로파일은 야생형 모 균주의 성장 프로파일에 필적하며, 이는 예시된 LpxA 돌연변이(들)도 LpxD 돌연변이(들)도 배양 성장에 해롭지 않다는 것을 나타낸다.
그러므로 본 발명의 재조합 박테리아 균주는 예를 들어 전세포 박테리아 항원 및/또는 OMV의 제조에 특히 적합하며, 따라서 이는 면역원성 조성물, 예컨대 백신의 구성성분으로서 사용될 수 있다.
그러므로, 본 발명의 재조합 그람-음성 박테리아의 배양물의 성장률은 야생형 모 균주의 배양물의 성장률에 필적한다. 특히, 표준 발효 프로세스에서, 예를 들어 10 리터 발효 부피에서, 경과 시간 및 성장률의 값은 실질적으로 유사하며, 예를 들어 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만 또는 5% 미만만큼 다르다.
외막 소포 (OMV)
제2 측면에서, 본 발명은 제1 측면의 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아로부터 유래된 외막 소포 또는 외막 소포의 집단에 관한 것이다.
OMV는 성장 동안 그람 음성 박테리아에 의해 자연적으로 및 구성적으로 방출되는 지질 이중층 나노크기 구형 입자 (직경 10-500 nm)이다. OMV는 박테리아 외막의 "출아"를 통해 생성되며, 이와 일치하게 지질다당류 (LPS), 글리세로인지질, 외막 단백질 및 주변 세포질 구성성분을 포함하여 박테리아 외막의 조성과 유사한 조성을 갖는다. 전형적으로, 외막 소포는 박테리아로부터 인공적으로 제조되며, 세제 처리 (예를 들어 데옥시콜레이트 사용)를 사용하여 또는 비세제 수단에 의해 제조될 수 있다.
OMV를 형성하는 기술은 담즙산 염 세제 (예를 들어 리토콜산, 케노데옥시콜산, 우르소데옥시콜산, 데옥시콜산, 콜산, 우르소콜산 등의 염) 또는 데옥시콜산나트륨으로 박테리아를 처리하는 것을 포함한다 [7 및 8]. 다른 기술은 기술, 예컨대 초음파 처리, 균질화, 미세유동화, 캐비테이션, 삼투압 쇼크, 그라인딩, 프렌치 프레스, 블렌딩 등을 사용하여 세제의 부재 하에 실질적으로 수행될 수 있다 [9 및 10]. 본 발명에 사용되는 OMV는 약 0.5% 데옥시콜레이트 이하, 예를 들어 약 0.4%, 약 0.3%, 약 0.2%, 약 0.1%, <0.05% 또는 심지어 0을 갖는 OMV 추출 완충제를 사용하여 제조될 수 있다.
OMV는 또한 박테리아 성장 동안 자발적으로 형성될 수 있으며, 배양 배지로 방출된다. 그러므로, OMV는 배양 배지에서 본 발명의 박테리아를 배양하고, 배양 배지에서 더 작은 OMV로부터 전세포를 분리함으로써 수득될 수 있다. 박테리아 소포는 예를 들어 0.22μm 필터를 통한 여과에 의해 전체 박테리아로부터 편리하게 분리될 수 있다. 박테리아 여과액은 원심분리, 예를 들어 고속 원심분리 (예를 들어 약 2시간 동안 20,000 x g)에 의해 정화될 수 있다. OMV 제조를 위한 또 다른 유용한 프로세스는 [11]에 기재되어 있으며, 고속 원심분리 대신 조 OMV의 한외여과를 포함한다. 프로세스는 한외여과가 수행된 후 초원심분리 단계를 포함할 수 있다. 박테리아 소포를 정제하기 위한 간단한 프로세스는 [12]에 기재되어 있으며, 하기를 포함한다: (i) 예를 들어 0.22μm 미세여과를 사용하여 소포를 여과액으로 통과시켜 이들의 상이한 크기에 기초하여 박테리아로부터 소포가 분리되는 제1 여과 단계; 및 (ii) 예를 들어 0.1μm 미세여과를 사용하여 잔류물에 소포가 유지되는 제2 여과 단계. 두 단계는 모두 접선 유동 여과를 사용할 수 있다.
본 발명의 OMV는 LOS (LPS로도 공지됨)를 포함할 것이다. OMV에서 LOS의 발열 효과는 동일한 양의 정제된 LOS에서 보이는 것보다 낮을 수 있다. 따라서, 바람직하게는 발열원성을 고려할 때, 일반적으로 본 발명의 박테리아로부터의 OMV는 모 균주로부터 유래된 OMV와 비교될 것이다. LOS 수준은 내독소의 국제 단위 (IU)로 표현되며, LAL 검정 (리물루스 아메바세포 용해물)에 의해 테스트될 수 있다. LOS는 OMV 단백질 μg 당 2000 IU 미만으로 존재할 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, OMV는 세제 추출된 OMV (dOMV)이다. 용어 "dOMV"는 전형적으로 세제 추출 프로세스에 의해 그람-음성 박테리아의 외막을 파괴하여 이로부터 소포를 형성함으로써 수득된 다양한 단백질리포솜 소포를 포함한다. 바람직하게는, OMV는 세제 추출된 OMV (dOMV)이다. 특히, 본 발명의 OMV는 데옥시콜레이트를 사용하여 제조된 dOMV이다. 보다 특히 약 0.5% 데옥시콜레이트 또는 그 이하, 예를 들어 약 0.4%, 약 0.3%, 약 0.2%, 약 0.1% 또는 약 0.05%.
본 발명의 dOMV는 동적 광산란 DLS 기술에 의해 측정된 바와 같이 약 20 내지 약 500 nm의 크기 분포를 가질 수 있다. 특히, 본 발명의 dOMV는 약 50 내지 약 500 nm의 크기 분포를 가질 수 있다. 보다 특히, dOMV는 약 75 내지 약 250 nm, 예를 들어 약 75 내지 약 150 nm의 크기 분포를 가질 수 있다. 훨씬 더 특히, 본 발명의 dOMV는 약 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145 또는 150 nm의 평균 직경을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 박테리아는 상향-조절된 항원 또는 이종 항원 (즉, 특정 박테리아 균주에 고유하지 않은 항원)의 발현을 갖도록 변형될 수 있다. 이러한 변형의 결과로, 이러한 변형된 박테리아로부터 제조된 소포는 더 높은 수준의 상향-조절된 또는 이종 항원(들)을 함유한다. 상향-조절된 항원의 소포에서의 발현 증가 (상응하는 야생형 균주에 비해 측정됨)는 소포의 단위 질량 당 관련 항원의 질량으로 측정시 유용하게 적어도 10%이고, 보다 유용하게는 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100% 또는 그 이상이다.
전세포 백일해 항원
본 발명의 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아는 불활성화된 비. 페르투시스 세포의 형태로 전세포 백일해 (wP) 항원으로 사용될 수 있다. 세포성 백일해 항원의 제조는 관련 기술분야에 잘 문서화되어 있으며, 비. 페르투시스 세포의 I상 배양물의 열 불활성화에 의해 수득될 수 있다. wP 항원의 양은 국제 단위 (IU)로 표현될 수 있다. 예를 들어, NIBSC는 '백일해 백신에 대한 국제 표준' (NIBSC 코드: 94/532)을 공급하며, 이는 앰플 당 40 IU를 함유한다.
본 발명의 면역원성 조성물에서 사용될 때, 세포성 백일해 항원은 전형적으로 투여될 때 면역 반응을 일으킬 수 있는 양으로 존재한다. 이상적으로, 세포성 백일해 항원은 보호성 면역 반응을 일으킬 수 있다. 본 발명의 면역원성 조성물 내 wP 항원의 양은 전형적으로 적어도 4 IU/용량이다. wP 항원은 알루미늄 아주반트, 예를 들어 인산알루미늄 아주반트 상에 흡착되거나 이와 혼합될 수 있다.
TLR4 신호전달 캐스케이드
본 발명의 박테리아는 특히 TLR4 자극 검정을 사용하여 측정될 때 야생형 균주로부터의 지질 A의 것과 비교하여 감소된 내독성 활성을 갖는 지질 A를 생산한다.
TLR4 자극 검정은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. TLR4 신호전달 캐스케이드의 자극은 NF-κB 및/또는 활성인자 단백질 1 (AP-1) 전사 인자의 활성화로 이어질 수 있으며, 이는 여러 전염증성 시토카인, 예를 들어 IL-1, IL-6, IL-8 및 TNF-α의 발현에 기여하고 그러므로 염증에 중요한 역할을 한다. 특정 계통, 예를 들어 HEK-블루™-hTLR4 세포 (인비보겐(Invivogen))에서 전사 활성의 결정은 TLR4 신호전달 캐스케이드의 자극을 평가하는데 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, HEK-블루™-hTLR4 세포의 유도성 리포터 유전자 분비 배아 알칼리 포스파타제 (SEAP)는 5개의 NF-κB 및 AP-1 결합 부위에 융합된 IL-12 p40 최소 프로모터의 제어 하에 있다. TLR4 리간드로 자극시, NF-kB 및 AP-1의 활성화는 알칼리 포스파타제의 분비를 유도하며, 이는 655 nm에서 광학 밀도 (OD655)를 측정함으로써 상청액에서 정량화될 수 있다.
본 발명의 박테리아, 예를 들어 본 발명의 박테리아로부터 유래된 전세포 항원 또는 OMV의 내독성 활성은 TLR4 자극 검정, 특히 인간 TLR4 자극 검정, 보다 특히 655 nm에서 측정된 광학 밀도 (OD)를 사용한 인간 TLR4 자극 검정을 사용하여 결정될 수 있다. 특히, 본 발명의 전세포 또는 OMV의 내독성 활성은 야생형 모 균주의 내독성 활성과 비교된다. 본 발명의 박테리아로부터 유래된 OMV에 의한 TLR4 신호전달을 활성화시키는 능력은 야생형 균주로부터 유래된 OMV 뿐만 아니라 다른 박테리아로부터 유래된 OMV 또는 상업적 면역원성 조성물, 예를 들어 벡세로 (네이세리아로부터의 OMV를 함유하는 메닝기티디스 B 백신) 또는 퀸박셈 (전세포 (wP) 백일해 백신)의 것과 비교될 수 있다.
보다 특히, 본 발명의 OMV의 내독성 활성은 야생형 박테리아로부터 유래된 OMV의 내독성 활성과 비교하여 TLR4 신호전달 캐스케이드의 감소된 또는 저하된 활성화를 나타낸다. 구체적으로, LpxA 및/또는 LpxD 돌연변이체를 테스트할 때 TLR4 자극 검정을 사용하여 수득된 OD655 값은 비자극된 세포를 사용하여 수득된 OD655 값 및/또는 무세포 백일해 (aP) 백신으로 자극된 세포에서 관찰된 OD655 값과 유사해야 한다 (예를 들어 약 ± 0.5 OD655).
일부 실시양태에서, TLR4 자극 검정은 야생형 박테리아로부터 유래된 OMV와 비교하여 본 발명의 OMV에 대한 TLR4 신호전달 캐스케이드 활성화의 부분적 감소를 보여준다. 구체적으로, 본 발명의 LpxA 및/또는 LpxD 박테리아 또는 OMV에서 관찰된 OD655 값은 비자극된 세포에서 관찰된 OD655 값 및/또는 aP 백신으로 자극된 세포에서 관찰된 OD655 값보다 높을 수 있지만 (≥0.5 OD655), 야생형 박테리아로부터 유래된 OMV 및/또는 wP 백신 및/또는 OMV-함유 MenB 백신으로 자극된 세포에서 관찰된 OD655 값보다 낮을 수 있다.
면역원성 조성물
제3 측면에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아로부터 유래된 적어도 하나의 외막 소포 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 OMV는 면역원성 조성물의 활성 성분으로서 유용하다. 유사하게, 사멸되고 비활성화된 (예를 들어 포르말린 및/또는 열을 사용한 처리에 의해) 본 발명의 전체 재조합 보르데텔라 페르투시스 세포를 포함하는 전세포 항원은 또한 면역원성 조성물의 활성 성분으로서 유용하다.
용어 "면역원성 조성물"은 조성물에 존재하는 항원 또는 항원들에 대해 면역 반응, 예컨대 항체 또는 세포성 면역 반응을 일으키기 위해 투여될 수 있는 임의의 조성물을 광범위하게 지칭한다. 그러므로, 본 발명의 조성물은 면역원성이다.
면역원성 조성물이 대상체로부터 질환을 예방, 호전, 경감 또는 제거하는 경우, 이러한 조성물은 백신으로 지칭될 수 있다. 본 발명에 따른 백신은 예방적 (즉, 감염 예방) 또는 치료적 (즉, 감염 치료)일 수 있지만, 전형적으로 예방적일 것이다. 특정 실시양태에서, 면역원성 조성물은 백신이다. 예방적 백신은 환자가 항체를 생성하더라도 면역계가 감염을 퇴치할 수 있을 때까지 지체 또는 지연이 있을 수 있기 때문에 질환으로부터 완전한 보호를 보장하지 않는다. 따라서, 및 의심의 여지를 없애기 위해, 용어 예방적 백신은 또한 예를 들어 이러한 감염의 중증도 또는 지속기간을 감소시킴으로써 미래 감염의 효과를 호전시키는 백신을 지칭할 수 있다.
용어 "감염에 대한 보호" 및/또는 "보호성 면역 제공"은 대상체의 면역계가 면역 반응을 촉발하고 감염을 격퇴하도록 (예를 들어 백신접종에 의해) 프라이밍되었음을 의미한다. 특히, 촉발된 면역 반응은 보르데텔라 페르투시스에 대한 감염을 격퇴할 수 있다. 그러므로 백신접종된 대상체는 감염될 수 있지만, 대조군 대상체보다 감염을 더 잘 격퇴할 수 있다. 백신으로 사용되는 면역원성 조성물은 면역학적 유효량의 항원(들), 뿐만 아니라 필요에 따라 임의의 다른 구성성분을 포함한다. '면역학적 유효량'은 단일 용량으로 또는 일련의 일부로 개체에게 해당 양을 투여하는 것이 치료 또는 예방에 효과적임을 의미한다. 일반적으로, 원하는 결과는 병원체로부터 대상체를 보호할 수 있거나 이에 기여하는 항원 (예를 들어, 병원체)-특이적 면역 반응의 생성이다. 이러한 양은 치료될 개체의 건강 및 신체 상태, 연령, 치료될 개체의 분류학적 그룹 (예를 들어 비인간 영장류, 영장류 등), 항체를 합성하는 개체의 면역계의 능력, 원하는 보호 정도, 백신 제형, 의학적 상황의 치료 의사의 평가, 및 기타 관련 인자에 따라 달라진다. 상기 양은 일상적인 시험을 통해 결정될 수 있는 상대적으로 넓은 범위에 속할 것으로 예상된다.
용어 "항원"은 대상체에게 투여될 때 성분에 대해 지정된 면역 반응을 일으키는 성분을 지칭한다. 본 발명의 문맥에서, 본 발명의 OMV는 항원이다. 특히, 대상체에게 투여될 때 면역원성 조성물은 보르데텔라, 예를 들어 보르데텔라 페르투시스에 대해 지정된 면역 반응을 일으킬 것이다. 특히 보르데텔라에 대해 지정된 면역 반응은 보호적이며, 즉, 보르데텔라, 특히 보르데텔라 페르투시스에 의해 유발되는 감염 또는 집락화를 예방 또는 감소시킬 수 있다. 그러므로 조성물은 제약상 허용되는 것일 수 있다. 일반적으로, 면역원성 조성물은 항원에 더하여 구성성분을 포함하며, 예를 들어 이들은 전형적으로 하나 이상의 제약 담체(들) 및/또는 부형제(들)를 포함한다. 이러한 구성성분에 대한 자세한 논의는 참고문헌 [13]에서 이용가능하다.
"제약상 허용되는 담체"는 그 자체로 항체의 생성을 유도하지 않는 담체이다. 이러한 담체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으며, 비제한적인 예로서, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 아미노산 공중합체, 수크로스, 트레할로스, 락토스, 및 지질 응집체 (예컨대 오일 소적 또는 리포솜)를 포함한다. 면역원성 조성물은 또한 희석제, 예컨대 물, 염수, 글리세롤 등을 함유할 수 있다. 멸균 발열원-제거, 포스페이트-완충 생리 식염수는 전형적인 희석제이다. 이러한 조성물은 또한 보조제 성분, 예컨대 습윤제 또는 유화제, pH 완충 성분 등을 포함할 수 있다.
조성물은 일반적으로 수성 형태로 대상체, 예를 들어 환자, 특히 적합한 포유동물, 예컨대 인간에게 투여될 것이다. 그러나, 투여 전에, 조성물은 비수성 형태일 수 있다. 예를 들어, 일부 백신은 수성 형태로 제조된 다음 수성 형태로도 충전 및 분포 및 투여되지만, 다른 백신은 제조 동안 동결건조되고, 사용 시 수성 형태로 재구성된다. 그러므로, 본 발명의 조성물은 동결건조된 제형과 같이 건조될 수 있다.
조성물은 보존제, 예컨대 티오메르살 또는 2-페녹시에탄올을 포함할 수 있다. 그러나, 백신은 수은 물질이 실질적으로 없어야 하며 (즉, 5μg/ml 미만), 예를 들어 티오메르살-비함유인 것이 바람직하다. 수은을 함유하지 않은 백신이 보다 바람직하다. 티오메르살-비함유 백신이 특히 바람직하다.
긴장성을 제어하기 위해, 생리학적 염, 예컨대 나트륨 염이 포함될 수 있다. 염화나트륨 (NaCl)이 사용될 수 있으며, 이는 1 내지 20 mg/ml, 예를 들어 약 10±2mg/ml NaCl로 존재할 수 있다.
조성물은 일반적으로 200 mOsm/kg 내지 400 mOsm/kg, 특히 240-360 mOsm/kg, 및 보다 특히 290-310 mOsm/kg 범위 내의 몰랄삼투압을 가질 것이다.
조성물은 하나 이상의 완충제를 포함할 수 있다. 전형적인 완충제는 하기를 포함한다: 포스페이트 완충제; 트리스 완충제; 보레이트 완충제; 숙시네이트 완충제; 히스티딘 완충제; 또는 시트레이트 완충제. 완충제는 전형적으로 5-20mM 범위로 포함될 것이다.
조성물의 pH는 일반적으로 5.0 내지 8.1, 및 더 전형적으로 6.0 내지 8.0, 예를 들어 6.5 내지 7.5, 또는 7.0 내지 7.8일 것이다.
조성물은 바람직하게는 멸균이다. 특히 조성물은 비발열성이며, 예를 들어 용량 당 <1 EU (내독소 단위, 표준 척도), 예를 들어 용량 당 <0.1 EU를 함유한다. 조성물은 글루텐을 함유하지 않을 수 있다.
조성물은 단일 면역화를 위한 물질을 포함할 수 있거나, 다중 면역화를 위한 물질을 포함할 수 있다 (즉, '다중 용량' 키트). 보존제의 포함은 다중 용량 배열에서 바람직하다. 다중 용량 조성물에 보존제를 포함하는 것에 대한 대안으로서 (또는 추가로), 조성물은 물질 제거를 위한 무균 어댑터를 갖는 컨테이너에 함유될 수 있다.
면역원성 조성물, 예를 들어 인간 백신은 전형적으로 약 0.5ml의 투여량 부피로 투여되지만, 예를 들어 어린이에게 절반 용량 (즉, 약 0.25ml)이 투여될 수 있다.
본 발명의 면역원성 조성물은 또한 하나 이상의 면역조절제를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 면역조절제 중 하나 이상은 하나 이상의 아주반트를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같은 "아주반트"는 예를 들어 면역원성 조성물 또는 백신의 일부로서 항원 또는 항원들과 함께 대상체에게 투여될 때 투여된 항원 또는 항원들에 대한 대상체의 면역 반응 (아주반트의 부재 하에 수득된 면역 반응과 비교하여)을 증가 또는 향상시키는 화합물 또는 성분 (또는 화합물들 또는 성분들의 조합)을 의미한다. 아주반트는 TH1 아주반트 및/또는 TH2 아주반트를 포함할 수 있으며, 이는 아래에서 추가로 논의된다.
본 발명의 조성물에서 사용될 수 있는 아주반트는 광물 함유 조성물, 예컨대 알루미늄 염 및 칼슘 염을 포함한다. 본 발명의 조성물은 광물 염, 예컨대 히드록시드 (예를 들어 옥시히드록시드), 포스페이트 (예를 들어 히드록시포스페이트, 오르토포스페이트), 술페이트 등 [예를 들어 참고문헌 14의 8 & 9장 참조], 또는 상이한 광물 화합물의 혼합물을 포함할 수 있으며, 화합물은 임의의 적합한 형태 (예를 들어 겔, 결정질, 무정형 등)를 취하고, 흡착이 바람직하다. 광물 함유 조성물은 또한 금속 염의 입자로서 제형화될 수 있다.
"수산화알루미늄"으로 공지된 아주반트는 전형적으로 옥시수산화알루미늄 염이며, 이는 일반적으로 적어도 부분적으로 결정질이다. 화학식 AlO(OH)로 표시될 수 있는 옥시수산화알루미늄은 적외선 (IR) 분광법에 의해, 특히 1070cm-1의 흡착 밴드 및 3090-3100cm-1의 강한 어깨의 존재에 의해 다른 알루미늄 화합물, 예컨대 수산화알루미늄 Al(OH)3과 구별될 수 있다 [참고문헌 14의 9장]. 수산화알루미늄 아주반트의 결정도 정도는 절반 높이에서의 회절 밴드의 폭 (WHH)에 의해 반영되며, 불량하게 결정질인 입자는 더 작은 결정자 크기로 인해 더 큰 라인 확장을 나타낸다. WHH가 증가함에 따라 표면적이 증가하고, 더 높은 WHH 값을 갖는 아주반트는 더 큰 항원 흡착 능력을 갖는 것으로 나타났다. 섬유질 형태학 (예를 들어 투과 전자 현미경 사진에서 볼 수 있는 바와 같음)은 수산화알루미늄 아주반트에 전형적이다. 수산화알루미늄 아주반트의 pI는 전형적으로 약 11이며, 즉 아주반트 자체는 생리학적 pH에서 양의 표면 전하를 갖는다. 수산화알루미늄 아주반트에 대해 pH 7.4에서 mg Al+++ 당 1.8-2.6 mg 단백질의 흡착 능력이 보고되었다.
"인산알루미늄"으로 공지된 아주반트는 전형적으로 알루미늄 히드록시포스페이트이며, 이는 종종 또한 소량의 술페이트 (즉, 알루미늄 히드록시포스페이트 술페이트)를 함유한다. 이들은 침전에 의해 수득될 수 있으며, 침전 동안의 반응 조건 및 농도는 염에서 히드록실에 대한 포스페이트의 치환 정도에 영향을 미친다. 히드록시포스페이트는 일반적으로 0.3 내지 1.2의 PO4/Al 몰비를 갖는다. 히드록시포스페이트는 히드록실 기의 존재에 의해 엄격한 AlPO4와 구별될 수 있다. 예를 들어, 3164cm-1의 IR 스펙트럼 밴드 (예를 들어 200℃로 가열되는 경우)는 구조적 히드록실의 존재를 나타낸다 [참고문헌 14의 9장].
인산알루미늄 아주반트의 PO4/Al3+ 몰비는 0.3 내지 1.2, 특히 0.8 내지 1.2, 및 보다 특히 0.95±0.1일 수 있다. 인산알루미늄은 특히 히드록시포스페이트 염의 경우 무정형일 수 있다. 전형적인 아주반트는 0.6mg Al3+/ml로 포함된 0.84 내지 0.92의 PO4/Al 몰비를 갖는 무정형 알루미늄 히드록시포스페이트이다. 인산알루미늄은 일반적으로 미립자 (예를 들어 투과 전자 현미경 사진에서 볼 수 있는 바와 같은 플레이트 유사 형태)일 것이다. 입자의 전형적인 직경은 임의의 항원 흡착 후 0.5-20μm (예를 들어 약 5-10μm) 범위이다. 인산알루미늄 아주반트에 대해 pH 7.4에서 mg Al+++ 당 0.7-1.5 mg 단백질의 흡착 능력이 보고되었다.
인산알루미늄의 영전하점 (PZC)은 히드록실이 포스페이트로 치환되는 정도와 반비례 관계에 있고, 이러한 치환 정도는 침전에 의한 염 제조에 사용되는 반응 조건 및 반응물 농도에 따라 달라질 수 있다. PZC는 또한 용액 중 유리 포스페이트 이온의 농도를 변화시킴으로써 (더 많은 포스페이트 = 더 산성인 PZC), 또는 완충제, 예컨대 히스티딘 완충제 (PZC를 더 염기성으로 만듦)를 첨가함으로써 변경된다. 본 발명에 따라 사용되는 인산알루미늄은 4.0 내지 7.0, 보다 특히 5.0 내지 6.5, 예를 들어 약 5.7의 PZC를 가질 수 있다.
본 발명의 조성물을 제조하는데 사용되는 알루미늄 염의 현탁액은 완충제 (예를 들어 포스페이트 또는 히스티딘 또는 트리스 완충제)를 함유할 수 있지만, 이것이 항상 필요한 것은 아니다. 현탁액은 바람직하게는 멸균이고, 발열원이 없다. 현탁액은 예를 들어 1.0 내지 20 mM, 5 내지 15 mM, 특히 약 10 mM의 농도로 존재하는 유리 수성 포스페이트 이온을 포함할 수 있다. 현탁액은 또한 염화나트륨을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 아주반트 구성성분은 수산화알루미늄 및 인산알루미늄 둘 모두의 혼합물을 포함한다. 이 경우, 예를 들어 적어도 2:1, 예를 들어 ≥5:1, ≥6:1, ≥7:1, ≥8:1, ≥9:1 등의 중량비로 히드록시드보다 더 많은 인산알루미늄이 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아주반트 구성성분은 인산알루미늄을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아주반트 구성성분은 알루미늄 히드록시포스페이트 술페이트를 포함한다.
환자에게 투여하기 위한 조성물 중 Al+++의 농도는 10mg/ml 내지 0.01mg/ml, 예를 들어 5 mg/ml 미만, 4 mg/ml 미만, 3 mg/ml 미만, 2 mg/ml 미만, 1 mg/ml 미만, 예를 들어 약 5mg/ml, 약 4mg/ml, 약 3mg/ml, 약 2mg/ml, 약 1mg/ml, 약 0.3mg/ml, 약 0.05mg/ml 또는 약 0.01mg/ml일 수 있다. 특정 범위는 약 0.3mg/ml 내지 약 1mg/ml이다. 일부 실시양태에서, 최대 0.85mg/용량, 예를 들어 약 0.5mg/l 또는 약 0.3mg/ml가 바람직하다.
본 발명에서 아주반트로 사용하기에 적합한 오일 에멀젼 조성물은 스쿠알렌-물 에멀젼, 예컨대 MF59 [참고문헌 14의 10장; 또한 참고문헌 15 참조] (5% 스쿠알렌, 0.5% Tween 80, 및 0.5% Span 85, 미세유동화기를 사용하여 서브마이크론 입자로 제형화됨)를 포함한다. 완전 프로인트 아주반트 (CFA) 및 불완전 프로인트 아주반트 (IFA)가 또한 사용될 수 있다.
사포닌 제형이 또한 본 발명에서 아주반트로 사용될 수 있다. 사포닌은 광범위한 식물 종의 나무껍질, 잎, 줄기, 뿌리 및 심지어 꽃에서 발견되는 스테롤 글리코시드 및 트리테르페노이드 글리코시드의 이종 그룹이다. 퀼라이아 사포나리아 몰리나(Quillaia saponaria Molina) 나무의 나무껍질로부터의 사포닌은 아주반트로 널리 연구되어 왔다. 사포닌은 또한 스밀락스 오르나타(Smilax ornata) (사르사프릴라), 깁소필라 파니쿨라타(Gypsophilla paniculata) (신부 베일), 및 사포나리아 오피시아날리스(Saponaria officianalis) (비누 뿌리)로부터 상업적으로 수득될 수 있다. 사포닌 아주반트 제형은 정제된 제형, 예컨대 QS21, 뿐만 아니라 지질 제형, 예컨대 ISCOM을 포함한다. QS21은 스티뮬론(Stimulon)™으로 판매된다.
AS01은 MPL (3-O-데스아실-4'-모노포스포릴 지질 A), QS21 ((퀼라야 사포나리아 몰리나, 분획 21) 안티제닉스(Antigenics), 미국 뉴욕주 뉴욕 소재) 및 리포솜을 함유하는 아주반트 시스템이다. AS01B는 MPL, QS21 및 리포솜을 함유하는 아주반트 시스템 (50 μg MPL 및 50 μg QS21)이다. AS01E는 MPL, QS21 및 리포솜을 함유하는 아주반트 시스템 (25 μg MPL 및 25 μg QS21)이다. 한 실시양태에서, 면역원성 조성물 또는 백신은 AS01을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물 또는 백신은 AS01B 또는 AS01E를 포함한다. 특정 실시양태에서, 면역원성 조성물 또는 백신은 AS01E를 포함한다. AS02는 유/수 에멀젼에 MPL 및 QS21을 함유하는 아주반트 시스템이다. AS02V는 유/수 에멀젼에 MPL 및 QS21을 함유하는 아주반트 시스템 (50 μg MPL 및 50 μg QS21)이다. AS03는 유/수 (o/w) 에멀젼에 α-토코페롤 및 스쿠알렌을 함유하는 아주반트 시스템이다. AS03A는 o/w 에멀젼에 α-토코페롤 및 스쿠알렌을 함유하는 아주반트 시스템 (11.86 mg 토코페롤)이다. AS03B는 o/w 에멀젼에 α-토코페롤 및 스쿠알렌을 함유하는 아주반트 시스템 (5.93 mg 토코페롤)이다. AS03C는 o/w 에멀젼에 α-토코페롤 및 스쿠알렌을 함유하는 아주반트 시스템 (2.97 mg 토코페롤)이다. 한 실시양태에서, 면역원성 조성물 또는 백신은 AS03을 포함한다. AS04는 알루미늄 염 (500 μg Al3+) 상에 흡착된 MPL (50 μg MPL)을 함유하는 아주반트 시스템이다. 한 실시양태에서, 면역원성 조성물 또는 백신은 AS04를 포함한다. QS21 및 3D-MPL의 사용을 포함하는 시스템은 WO 94/00153에 개시되어 있다. QS21이 콜레스테롤로 켄칭된 조성물은 WO 96/33739에 개시되어 있다. 수중유 에멀젼에 QS21, 3D-MPL 및 토코페롤을 포함하는 추가적인 아주반트 제형은 WO 95/17210에 기재되어 있다. 한 실시양태에서 면역원성 조성물은 QS21일 수 있는 사포닌을 추가로 포함한다. 제형은 또한 수중유 에멀젼 및 토코페롤을 포함할 수 있다 (WO 95/17210). 비메틸화된 CpG 함유 올리고뉴클레오티드 (WO 96/02555) 및 다른 면역조정성 올리고뉴클레오티드 (WO 0226757 및 WO 03507822)는 또한 TH1 반응의 우선적 유도인자이며 본 발명에서 사용하기에 적합하다.
추가적인 아주반트는 Toll 유사 수용체 효능제 (특히, Toll 유사 수용체 2 효능제, Toll 유사 수용체 3 효능제, Toll 유사 수용체 4 효능제, Toll 유사 수용체 7 효능제, Toll 유사 수용체 8 효능제 및 Toll 유사 수용체 9 효능제)를 포함한다. 본 발명의 조성물은 하나 이상의 소분자 면역강화제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 TLR2 효능제 (예를 들어 Pam3CSK4), TLR4 효능제 (예를 들어 아미노알킬 글루코사미니드 포스페이트, 예컨대 E6020), TLR7 효능제 (예를 들어 이미퀴모드), TLR8 효능제 (예를 들어 레시퀴모드 (또한 TLR7 효능제)) 및/또는 TLR9 효능제 (예를 들어 IC31)를 포함할 수 있다. 임의의 이러한 효능제는 이상적으로 <2000Da의 분자량을 갖는다.
본 발명에서 사용되는 TLR7 효능제는 이상적으로 적어도 하나의 흡착성 모이어티를 포함한다. TLR 효능제에서의 이러한 모이어티의 포함은 불용성 알루미늄 염 상에 흡착하고 (예를 들어 리간드 교환 또는 임의의 다른 적합한 메커니즘에 의해) 이들의 면역학적 거동을 개선하도록 허용한다. 인-함유 흡착성 모이어티가 특히 유용하고, 따라서 흡착성 모이어티는 포스페이트, 포스포네이트, 포스피네이트, 포스포나이트, 포스피나이트 등을 포함할 수 있다. TLR 효능제는 적어도 하나의 포스포네이트 기를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 포스포네이트 기를 포함하는 TLR7 효능제를 포함할 수 있다. 이러한 포스포네이트 기는 효능제의 불용성 알루미늄 염으로의 흡착을 허용할 수 있다. 일부 실시양태에서, TLR 효능제는 하기 표시된 바와 같은 3-(5-아미노-2-(2-메틸-4-(2-(2-(2-포스포노에톡시)에톡시)에톡시)페네틸)벤조[f]-[1,7]나프티리딘-8-일)프로판산이다.
Figure pct00001
바람직한 TLR 효능제는 수용성이다. 그러므로, 25℃ 및 1 기압에서 pH 7의 물과 수성 완충제에서 혼합될 때 균일한 용액을 형성하여 적어도 50 μg/ml의 농도를 갖는 용액을 제공할 수 있다. 그러므로 용어 "수용성"은 이들 조건 하에 조금만 가용성(sparingly soluble)인 성분을 배제한다.
본 발명의 조성물은 다양한 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사제로 제조될 수 있다. 주사 전에 액체 비히클 내의 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태가 또한 제조될 수 있다 (예를 들어 동결건조된 조성물 또는 분무-동결 건조된 조성물). 조성물은 예를 들어 연고, 크림 또는 분말로서 국소 투여를 위해 제조될 수 있다. 조성물은 예를 들어 미세 분말 또는 스프레이를 사용하여 흡입기로서 폐 투여를 위해 제조될 수 있다. 조성물은 예를 들어 점적제로서 비강, 귀 또는 안구 투여를 위해 제조될 수 있다. 조성물은 조합된 조성물이 환자에게 투여되기 직전에 재구성되도록 설계된 키트 형태일 수 있다. 이러한 키트는 액체 형태의 하나 이상의 항원 및 하나 이상의 동결건조된 항원을 포함할 수 있다.
조성물이 사용 전에 즉석으로 제조되고 (예를 들어 구성성분이 동결건조된 형태로 제공되는 경우) 키트로서 제공되는 경우, 키트는 2개의 바이알을 포함할 수 있거나, 하나의 미리-충전된 주사기 및 하나의 바이알을 포함할 수 있으며, 주사기의 내용물은 주사 전에 바이알의 내용물을 재활성화시키기 위해 사용된다.
조합 백신
본 발명의 면역원성 조성물은 일반적으로 조합 백신일 것이고, 본 발명의 OMV에 더하여, 보르데텔라 페르투시스로부터의 추가 보호성 항원(들) 및 보르데텔라 페르투시스 이외의 적어도 하나의 병원체를 포함할 수 있다.
추가적인 보호성 항원(들)은 바이러스성 및/또는 박테리아성일 수 있다. 보르데텔라 페르투시스 외에도, 전형적인 박테리아 병원체는 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 코리네박테리움 디프테리아에(Corynebacterium diphtheriae); 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani); 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae) 유형 b. 전형적인 바이러스 병원체는 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 폴리오바이러스 및 B형 간염 바이러스. 의심의 여지를 없애기 위해, 추가 항원에 대한 언급은 OMV의 구성요소를 넘어 본 발명의 면역원성 조성물에 포함된 추가 항원성 구성성분을 지칭하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 소량의 백일해 톡소이드가 OMV의 구성요소로서 발견될 수 있지만, 추가 항원으로 백일해 톡소이드에 대한 언급은 예를 들어 단리된 단백질 항원으로서 OMV 구성요소 전체에 및 위에 구체적으로 첨가된 백일해 톡소이드의 양을 지칭한다.
무세포 백일해 항원
본 발명의 OMV에 더하여, 본 발명의 면역원성 조성물은 특히 하기 널리 공지되어 있고 잘 특징화된 비. 페르투시스 항원으로부터 선택된 하나 이상의 무세포 백일해 (aP) 항원을 추가로 포함할 수 있다: (1) 해독된 백일해 독소 (백일해 톡소이드, 또는 'PT'); (2) 사상형 혈구응집소 ('FHA'); (3) 퍼탁틴 ('PRN' 또는 '69 킬로달톤 외막 단백질'로도 공지됨); (4) 핌브리아 유형 2 ('FIM2'); (5) 핌브리아 유형 3 ('FIM 3'). 해독된 PT 및 FHA 둘 모두가 사용되는 것이 가장 바람직하다. 일부 실시양태에서 PT, FHA 및 PRN이 사용된다. 이들 항원은 바람직하게는 변형된 스타이너-숄트(Stainer-Scholte) 액체 배지에서 성장된 비. 페르투시스 배양물로부터의 단리에 의해 제조된다. PT 및 FHA는 발효 브로쓰로부터 단리될 수 있는 반면 (예를 들어 수산화인회석 겔 상에 흡착에 의해), 퍼탁틴은 열 처리 및 응집 (예를 들어 염화바륨 사용)에 의해 세포로부터 추출될 수 있다. 항원은 연속 크로마토그래피 및/또는 침전 단계에서 정제될 수 있다. PT 및 FHA는 소수성 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 퍼탁틴은 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.
FHA 및 퍼탁틴은 본 발명에 따라 사용하기 전에 포름알데히드로 처리될 수 있다. PT는 포름알데히드 및/또는 글루타르알데히드로 처리함으로써 해독될 수 있다. 이러한 화학적 해독 절차에 대한 대안으로서, 바람직하게는 PT는 효소 활성이 돌연변이유발에 의해 감소된 돌연변이체 PT, 예를 들어 유전적으로 해독된 PT, 바람직하게는 PT-9K/129G일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 핌브리아 항원 FIM2 및 FIM3을 추가로 포함한다.
aP 항원(들)은 비흡착된 상태로 사용될 수 있거나, 사용되기 전에 하나 이상의 알루미늄 염 아주반트(들) 상에 흡착될 수 있다. 전형적으로, aP 항원은 수은 보존제, 예컨대 티메로살이 실질적으로 없다.
무세포 백일해 항원은 투여될 때 면역 반응을 일으킬 수 있는 양으로 본 발명의 면역원성 조성물에 존재할 수 있다. 이상적으로, 무세포 백일해 항원은 보호성 면역 반응을 일으킬 수 있다. 무세포 백일해 항원의 양은 전형적으로 마이크로그램으로 표현된다. 백신 중 PT의 농도는 일반적으로 5 내지 50μg/ml이다. 전형적인 PT 농도는 5μg/ml, 16μg/ml, 20μg/ml 또는 50μg/ml, 예를 들어 용량 당 약 20μg 또는 용량 당 약 25μg이다. 백신 중 FHA의 농도는 일반적으로 10 내지 50μg/ml이다. 전형적인 FHA 농도는 10μg/ml, 16μg/ml 또는 50μg/ml, 예를 들어 용량 당 약 20μg 또는 용량 당 약 25μg이다. 백신 중 퍼탁틴의 농도는 일반적으로 5 내지 16μg/ml이다. 전형적인 퍼탁틴 농도는 5μg/ml, 6μg/ml 또는 16μg/ml, 예를 들어 용량 당 약 3μg 또는 용량 당 약 8μg이다. FIM2 및 FIM3은 5 및 16μg/ml의 농도로 존재할 수 있다. FIM2 및 FIM3의 전형적인 농도는 5μg/ml, 10μg/ml 또는 20μg/ml, 예를 들어 용량 당 약 5μg 또는 용량 당 약 10μg이다. 청소년 및 성인을 위한 부스터 백신은 전형적으로 0.5 ml 용량 당 2.5 내지 8 μg PT, 4 내지 8 μg FHA 및 2.5 내지 8 μg 퍼탁틴을 함유한다. 전형적으로, 부스터 백신은 0.5 ml 용량 당 4 μg PT, 4 μg FHA 및 8 μg 퍼탁틴, 보다 바람직하게는 5 μg PT, 2.5 μg FHA 및 2.5 μg 퍼탁틴을 포함한다. 소아 백신은 일반적으로 0.5 ml 용량 당 7 μg PT, 10 μg FHA 및 10 μg 퍼탁틴을 포함한다.
수성 구성성분이 PT, FHA 및 퍼탁틴을 각각 포함하는 경우, 이들의 중량비는 다양할 수 있지만 예를 들어 약 16:16:5, 약 5:10:6, 약 20:20:3, 약 25:25:8, 또는 약 10:5:3 (PT:FHA:PRN)일 수 있다.
디프테리아
코리네박테리움 디프테리아에는 디프테리아를 유발한다. 디프테리아 독소는 주사 후 특이적 항독소 항체를 유도하는 능력을 유지하면서 독성을 제거하기 위해 (예를 들어 포르말린 또는 포름알데히드를 사용하여) 처리될 수 있다. 디프테리아 백신에 사용되는 디프테리아 톡소이드는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 바람직한 디프테리아 톡소이드는 포름알데히드 처리에 의해 제조된 것이다. 디프테리아 톡소이드는 소 추출물로 보충될 수 있는 성장 배지 (예를 들어 펜톤(Fenton) 배지, 또는 링구드(Linggoud) & 펜톤 배지)에서 씨. 디프테리아에를 성장시킨 후 포름알데히드 처리, 한외여과 및 침전에 의해 수득될 수 있다. 특히 씨. 디프테리아에를 성장시키기 위한 성장 배지는 동물-유래 구성성분이 없다. 그 후, 톡소이드화된 물질은 멸균 여과 및/또는 투석을 포함하는 프로세스에 의해 처리될 수 있다. 대안적으로, 저장 동안 장기간 안정성을 유지하기 위해 포름알데히드-처리될 수 있는 유전적으로 해독된 디프테리아 독소 (예를 들어, CRM197)가 사용될 수 있다.
디프테리아 톡소이드는 아주반트, 예컨대 알루미늄 염 아주반트 상에 흡착될 수 있다.
조성물 내 디프테리아 독소 및/또는 톡소이드의 양은 일반적으로 독소/톡소이드의 양으로 정의되는 'Lf' 단위 ("응집 단위", 또는 "라임 응집 용량", 또는 "응집 한계")로 측정되며, 이는 1 국제 단위의 항독소와 혼합될 때 최적의 응집 혼합물을 생성한다 [16, 17]. 예를 들어, NIBSC는 앰플 당 300 LF를 함유하는 '디프테리아 톡소이드, 플레인' [18]을 공급하고, 또한 앰플 당 900 Lf를 함유하는 '응집 테스트용 디프테리아 톡소이드에 대한 2차 국제 참조 시약' (NIBSC 코드: 02/176)을 공급한다. 조성물 중 디프테리아 독소 또는 톡소이드의 농도는 이러한 참조 시약에 대해 교정된 참조 물질과 비교함으로써 응집 검정을 사용하여 쉽게 결정될 수 있다.
조성물 내 디프테리아 톡소이드의 면역화 효력은 일반적으로 국제 단위 (IU)로 표현된다. 효력은 실험실 동물 (전형적으로 기니피그)에서 조성물에 의해 부여되는 보호를 IU로 교정된 참조 백신과 비교함으로써 평가될 수 있다. NIBSC는 앰플 당 213 IU를 함유하는 '디프테리아 톡소이드 (흡착된)에 대한 4차 WHO 국제 표준' (NIBSC 코드: 07/216)을 공급하고, 이러한 검정의 교정에 적합하다.
3-희석 검정은 본 발명의 조성물의 효력을 결정하는데 사용될 수 있다. 면역화 후, 기니피그는 피하 또는 피내 경로에 의해 채혈 또는 시험감염된다. 대안적인 실시양태에서, 마우스가 기니피그 대신에 사용된다. 기니피그 또는 마우스를 채혈하는 경우, 개별 동물의 항독소 수준은 테스트될 유형의 백신에 대해 입증된 생체내 또는 시험관내 혈청학적 방법을 사용하여 수행된 독소 중화 테스트를 통해 적정된다. 한 실시양태에서, 동물-유래 구성성분을 포함하는 발효 배지에서 생산된 디프테리아 톡소이드가 확인을 위해 사용된다. 본 발명의 조성물의 효력은 적절한 통계적 방법을 사용하여 계산된다. 3-희석 검정의 경우, 추정 효력의 95% 신뢰 구간의 하한이 단일 인간 용량 당 30 IU보다 크지 않는 한, 효력의 추정값의 95% 신뢰 구간의 한계는 추정 효력의 50-200% 이내이다. 1-희석 테스트가 수행되는 경우, 테스트 백신의 효력은 인간 용량 당 30 IU보다 유의하게 더 큰 것으로 입증된다.
IU 측정에 의해, 조성물은 일반적으로 적어도 30 IU/용량을 포함한다. 조성물은 전형적으로 20 내지 80 Lf/ml의 디프테리아 톡소이드, 전형적으로 약 50 Lf/ml를 포함한다. 청소년 및 성인을 위한 부스터 백신은 전형적으로 0.5 ml 용량 당 4 Lf/ml 내지 8 Lf/ml의 디프테리아 톡소이드, 예를 들어 2.5 Lf, 바람직하게는 4 Lf를 함유한다. 소아 백신은 전형적으로 0.5 ml 용량 당 20 내지 50 Lf/ml의 디프테리아 톡소이드, 예를 들어 10 Lf 또는 25 Lf를 함유한다.
단백질 제제의 순도는 총 단백질에 대한 특정 단백질의 비율에 의해 표현될 수 있다. 조성물 내 디프테리아 톡소이드의 순도는 일반적으로 단백질 (투석불가능) 질소의 단위 질량 당 Lf 디프테리아 톡소이드의 단위로 표현된다. 예를 들어, 매우 순수한 독소/톡소이드는 1700 Lf/mg N 초과의 순도를 가질 수 있으며, 이는 조성물 내 대부분 또는 모든 단백질이 디프테리아 독소/톡소이드임을 나타낸다 [19].
파상풍
클로스트리디움 테타니는 파상풍을 유발한다. 파상풍 독소는 처리되어 보호성 톡소이드를 제공할 수 있다. 톡소이드는 파상풍 백신에 사용되며 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 그러므로, 본 발명의 조합 백신은 파상풍 톡소이드를 포함할 수 있다. 바람직한 파상풍 톡소이드는 포름알데히드 처리에 의해 제조된 것이다. 파상풍 톡소이드는 성장 배지 (예를 들어 소 카제인으로부터 유래된 래섬(Latham) 배지)에서 씨. 테타니를 성장시킨 후 포름알데히드 처리, 한외여과 및 침전에 의해 수득될 수 있다. 씨. 테타니를 성장시키기 위한 성장 배지는 동물-유래 구성성분이 없을 수 있다. 그 후, 물질은 멸균 여과 및/또는 투석을 포함하는 프로세스에 의해 처리될 수 있다.
파상풍 톡소이드는 아주반트, 예를 들어 알루미늄 염 아주반트 상에 흡착될 수 있다.
파상풍 톡소이드의 양은 톡소이드의 양으로 정의되는 'Lf' 단위 (하기 참조)로 표현될 수 있으며, 이는 1 국제 단위의 항독소와 혼합될 때 최적의 응집 혼합물을 생성한다 [14]. NIBSC는 앰플 당 690 LF를 함유하는 '응집 테스트용 파상풍 톡소이드에 대한 2차 국제 참조 시약' (NIBSC 코드: 04/150)을 공급하며, 이에 의해 측정이 교정될 수 있다.
청소년 및 성인을 위한 부스터 백신은 전형적으로 0.5 ml 용량 당 5 Lf의 파상풍 톡소이드를 함유한다. 소아 백신은 전형적으로 0.5 ml 용량 당 5 내지 10 Lf의 파상풍 톡소이드를 함유한다.
파상풍 톡소이드의 면역화 효력은 국제 단위 (IU)로 측정되며, 실험실 동물 (전형적으로 기니피그)에서 조성물에 의해 부여되는 보호를 예를 들어 앰플 당 469 IU를 함유하는 NIBSC의 '파상풍 톡소이드 흡착 제3 국제 표준 2000' [20, 21]을 사용하여 참조 백신과 비교함으로써 평가된다. 본 발명의 조성물 내 파상풍 톡소이드의 효력은 용량 당 적어도 35 IU, 예를 들어 적어도 70 IU/ml이어야 한다. 보다 특히, 본 발명의 조성물 내 파상풍 톡소이드의 효력은 용량 당 적어도 40 IU이다. 그러나, 성인 및 청소년을 위한 부스터 백신에서, 1차 면역화를 위해 의도된 소아 백신과 비교하여 감소된 항원 함량으로 인해 20 IU/용량의 감소된 효력이 허용될 수 있다.
다중 희석 검정은 본 발명의 조성물의 효력을 결정하는데 사용될 수 있다. 면역화 후, 기니피그는 피하 또는 피내 경로에 의해 채혈 또는 시험감염된다. 대안으로서, 기니피그 대신에 마우스가 사용될 수 있다. 기니피그 또는 마우스를 채혈하는 경우, 개별 동물의 항독소 수준은 테스트될 유형의 백신에 대해 입증된 생체내 또는 시험관내 혈청학적 방법을 사용하여 수행된 독소 중화 테스트를 통해 적정된다. 본 발명의 조성물의 효력은 적절한 통계적 방법을 사용하여 계산된다. 다중 희석 검정이 사용되는 경우, 95% 신뢰 구간의 하한 및 상한은 각각 추정 효력의 50-200% 이내이어야 한다. 어린이의 1차 면역화를 위해 사용되는 파상풍 백신의 추정 효력의 95% 신뢰 하한은 단일 인간 용량 당 40 IU 미만이 아니어야 한다.
조성물 내 파상풍 톡소이드의 순도는 일반적으로 단백질 (투석불가능) 질소의 단위 질량 당 Lf 파상풍 톡소이드의 단위로 표현된다. 파상풍 톡소이드는 적어도 1000 Lf/mg N의 순도를 가져야 한다.
Hib
헤모필루스 인플루엔자에 유형 b ('Hib')는 박테리아성 수막염을 유발한다. Hib 백신은 전형적으로 캡슐형 사카라이드 항원에 기초하며, 이의 제조는 관련 기술분야에서 잘 문서화되어 있다. 에이치. 인플루엔자에 박테리아는 동물-유래 구성성분의 부재 하에 배양될 수 있다. Hib 사카라이드는 특히 어린이에서 그의 면역원성을 향상시키기 위해 담체 단백질에 접합된다. 이들 접합체 내 전형적인 담체 단백질은 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, 디프테리아 독소의 CRM197 유도체, 또는 혈청군 B 수막구균으로부터의 외막 단백질 복합체 (OMPC)이다. 그러므로, 본 발명의 조합 백신은 담체 단백질에 접합된 Hib 캡슐형 사카라이드를 포함할 수 있다.
임의의 적합한 활성화 화학 및/또는 링커 화학이 Hib 사카라이드의 접합에 사용될 수 있다. 사카라이드는 전형적으로 접합 전에 활성화 또는 관능화될 것이다. 활성화는 예를 들어 시아닐화 시약, 예컨대 CDAP (예를 들어 1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트 [30, 31])를 포함할 수 있다. 다른 적합한 기술은 카르보디이미드, 히드라지드, 활성 에스테르, 노르보란, p-니트로벤조산, N-히드록시숙신이미드, S-NHS, EDC, TSTU를 사용하며; 또한 참고문헌 32의 도입부를 참조한다.
링커 기를 통한 연결은 임의의 공지된 절차, 예를 들어 참고문헌 33 및 34에 기재된 절차를 사용하여 이루어질 수 있다. 연결의 한 유형은 다당류의 환원성 아민화, 생성된 아미노 기를 아디프산 링커 기의 한쪽 말단과 커플링한 다음, 단백질을 아디프산 링커 기의 다른 말단에 커플링하는 것을 포함한다 [35, 36, 37]. 다른 링커는 B-프로피온아미도 [38], 니트로페닐-에틸아민 [39], 할로아실 할라이드 [40], 글리코시드 연결 [41, 42, 43], 6-아미노카프로산 [44], ADH [45], C4 내지 C12 모이어티 [46] 등을 포함한다. 링커 사용에 대한 대안으로서, 직접 연결이 사용될 수 있다. 단백질에 대한 직접 연결은 예를 들어 참고문헌 46 및 47에 기재된 바와 같이 다당류의 산화에 이어 단백질과의 환원성 아민화를 포함할 수 있다.
파상풍 톡소이드는 일반적으로 'PRP-T'로 지칭되는 접합체에서 사용될 수 있다. PRP-T는 시아노겐 브로마이드를 사용하여 Hib 캡슐형 다당류를 활성화시키고, 활성화된 사카라이드를 아디프산 링커 (예컨대 (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드), 전형적으로 히드로클로라이드 염)에 커플링한 후, 링커 사카라이드 실체를 파상풍 톡소이드 담체 단백질과 반응시킴으로써 제조될 수 있다.
CRM197 디프테리아 톡소이드는 또 다른 바람직한 Hib 담체 단백질이다 [47, 48, 49]. 바람직한 접합체는 아디프산 숙신산 디에스테르를 통해 CRM197에 공유결합으로 연결된 Hib 사카라이드를 포함한다 [50, 51].
접합체의 사카라이드 모이어티는 Hib 박테리아로부터 제조된 바와 같은 전장 폴리리보실리비톨 포스페이트 (PRP), 및/또는 전장 PRP의 단편을 포함할 수 있다. 1:5 (즉, 과량의 단백질) 내지 5:1 (즉, 과량의 사카라이드)의 사카라이드:단백질 비율 (w/w), 예를 들어 1:2 내지 5:1의 비율 및 1:1.25 내지 1:2.5의 비율을 갖는 접합체가 사용될 수 있다. 그러나, 바람직한 백신에서, 사카라이드 대 담체 단백질의 중량비는 1:2.5 내지 1:3.5이다. 파상풍 톡소이드가 항원 및 담체 단백질 둘 모두로 존재하는 백신에서, 접합체 중 사카라이드 대 담체 단백질의 중량비는 1:0.3 내지 1:2일 수 있다 [52].
Hib 항원의 양은 전형적으로 사카라이드 μg으로 표현된다. 백신 중 사카라이드의 농도는 전형적으로 3 내지 30μg/ml, 예를 들어 20μg/ml이다. Hib 접합체의 투여는 바람직하게는 ≥0.15μg/ml, 및 보다 바람직하게는 ≥1μg/ml의 항-PRP 항체 농도를 초래하고, 이들은 표준 반응 역치이다. 본 발명의 일부 실시양태에서, Hib 폴리리보실리비톨 포스페이트는 예를 들어 [53 또는 54]에 기재된 바와 같이 합성이다.
B형 간염 바이러스
B형 간염 바이러스 (HBV)는 바이러스성 간염의 원인이다. HBV 비리온은 외부 단백질 코트 또는 캡시드로 둘러싸인 내부 코어로 이루어지며, 코어는 바이러스 DNA 게놈을 함유한다. 캡시드의 주요 구성성분은 HBV 표면 항원 또는 보다 일반적으로 'HBsAg'로 공지된 단백질이며, 이는 전형적으로 ~24 kDa의 분자량을 갖는 226-아미노산 폴리펩티드이다. 기존의 모든 B형 간염 백신은 HBsAg를 함유하고, 이 항원이 정상 환자에게 투여되는 경우, 이는 HBV 감염으로부터 보호하는 항-HBsAg 항체의 생성을 자극한다. 그러므로, 본 발명의 면역원성 조성물은 HBsAg를 포함할 수 있다.
백신 제조를 위해, HBsAg는 수많은 방법으로, 예를 들어 재조합 DNA 방법에 의해 단백질을 발현함으로써 제조될 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 HBsAg는 예를 들어 효모 세포에서 재조합적으로 발현되어야 한다. 적합한 효모는 사카로미세스(Saccharomyces) (예컨대 에스. 세레비시아에(S.cerevisiae)), 하넨술라(Hanensula) (예컨대 에이치. 폴리모르파(H.polymorpha)) 또는 피치아(Pichia) 숙주를 포함한다. 효모는 동물-유래 구성성분의 부재 하에 배양될 수 있다. 효모-발현된 HBsAg는 일반적으로 비-글리코실화되고, 이는 본 발명의 면역원성 조성물에서 사용하기 위한 HBsAg의 가장 바람직한 형태이다. 효모-발현된 HBsAg는 고도로 면역원성이고, 혈액 생성물 오염의 위험 없이 제조될 수 있다. 재조합 효모로부터 HBsAg를 정제하기 위한 많은 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다.
HBsAg는 일반적으로 인지질을 포함하는 지질 매트릭스를 포함하는 실질적으로-구형인 입자 (약 20nm의 평균 직경)의 형태일 것이다. 효모-발현된 HBsAg 입자는 천연 HBV 비리온에서 발견되지 않는 포스파티딜이노시톨을 포함할 수 있다. 입자는 또한 면역계를 자극하기 위해 무독성 양의 LPS를 포함할 수 있다 [55]. 입자는 비이온성 계면활성제 (예를 들어 폴리소르베이트 20)가 효모 파괴 동안 사용되었다면 유지될 수 있다 [56].
HBsAg는 바람직하게는 HBV 서브타입 adw2로부터 유래된다.
HBsAg 정제를 위한 바람직한 방법은 세포 파괴 후: 한외여과; 크기 배제 크로마토그래피; 음이온 교환 크로마토그래피; 초원심분리; 탈염; 및 멸균 여과를 포함한다. 용해물은 세포 파괴 (예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 사용) 후에 침전되어, 한외여과를 위한 준비가 된 용액에 HBsAg를 남길 수 있다.
정제 후 HBsAg는 투석 (예를 들어 시스테인 사용)을 받을 수 있으며, 이는 HBsAg 제조 동안 사용되었을 수 있는 임의의 수은 보존제, 예컨대 티메로살을 제거하는데 사용될 수 있다 [57].
HBsAg의 양은 전형적으로 마이크로그램으로 표현된다. HBsAg를 함유하는 조합 백신은 일반적으로 5 내지 60 μg/ml를 포함한다. 본 발명의 조성물 중 HBsAg의 농도는 바람직하게는 60 μg/ml 미만, 예를 들어 ≤55 μg/ml, ≤50 μg/ml, ≤45 μg/ml, ≤40 μg/ml 등이다. 약 20 μg/ml의 농도, 예를 들어 용량 당 10μg이 전형적이다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 조성물은 '저용량'의 HBsAg를 포함한다. 이는 조성물 중 HBsAg의 농도가 ≤5 μg/ml, 예를 들어 <4, <3, <2.5, <2, <1 등임을 의미한다. 따라서, 전형적인 0.5ml 단위 용량 부피에서, HBsAg의 양은 2.5μg 미만, 예를 들어 <2, <1.5, <1, <0.5 등이다.
폴리오바이러스
폴리오바이러스는 소아마비를 유발한다. 참고문헌의 1의 24장에 더 자세히 개시된 바와 같은 불활성화된 폴리오 바이러스 백신 (IPV)이 수년 동안 공지되어 왔다. 그러므로, 본 발명의 조합 백신은 불활성화된 폴리오바이러스 항원을 포함할 수 있다.
폴리오바이러스는 세포 배양에서 성장될 수 있으며, 바람직한 배양은 원숭이 신장으로부터 유래된 Vero 세포주를 사용한다. Vero 세포는 편리하게는 배양된 미세담체일 수 있다. 성장 후, 비리온은 기술, 예컨대 한외여과, 정용여과 및 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있다. 동물 (및 특히 소) 물질이 세포 배양에서 사용되는 경우, 이들은 전염성 해면상 뇌병증 (TSE), 및 특히 소 해면상 뇌병증 (BSE)이 없는 공급원으로부터 수득되어야 한다. 바람직하게는, 폴리오바이러스는 동물-유래 구성성분이 없는 배지에서 배양된 세포에서 성장된다.
환자에게 투여하기 전에, 폴리오바이러스는 불활성화되어야 하며, 이는 포름알데히드 (또는 바람직하게는 비-알데히드 작용제)로 처리함으로써 달성될 수 있다. 소아마비는 세 가지 유형의 폴리오바이러스 중 하나에 의해 유발될 수 있다. 세 가지 유형은 유사하고, 동일한 증상을 유발하지만, 항원적으로 매우 상이하며, 한 유형에 의한 감염이 다른 유형에 의한 감염으로부터 보호하지 못한다. 따라서, 본 발명에서 3개의 폴리오바이러스 항원을 사용하는 것이 바람직하다: 폴리오바이러스 유형 1 (예를 들어 마호니(Mahoney) 균주), 폴리오바이러스 유형 2 (예를 들어 MEF-1 균주), 및 폴리오바이러스 유형 3 (예를 들어 소켓(Saukett) 균주). 폴리오바이러스 유형 1, 유형 2 및 유형 3의 다른 균주가 관련 기술분야에 공지되어 있으며 또한 사용될 수 있다. 바이러스는 바람직하게는 개별적으로 성장, 정제 및 불활성화된 다음 조합되어 본 발명에서 사용하기 위한 벌크 3가 혼합물을 제공한다.
IPV의 양은 전형적으로 'DU' 단위 ("D-항원 단위" [58])로 표현된다. 조합 백신은 일반적으로 용량 당 폴리오바이러스 유형 당 1-100 DU, 예를 들어, 약 40 DU의 유형 1 폴리오바이러스, 약 8 DU의 유형 2 폴리오바이러스, 및 약 32 DU의 유형 3 폴리오바이러스를 포함하지만, 이들보다 더 낮은 용량 [59, 60], 예를 들어 유형 1의 경우 10-20 DU, 유형 2의 경우 2-4 DU, 및 유형 3의 경우 8-20 DU를 사용하는 것이 가능하다. 본 발명의 조합 백신은 '저용량'의 폴리오바이러스를 포함할 수 있다. 유형 1 폴리오바이러스의 경우, 이는 조성물 중 바이러스의 농도가 ≤20 DU/ml 예를 들어 <18, <16, <14, <12, <10 등임을 의미한다. 유형 2 폴리오바이러스의 경우, 이는 조성물 중 바이러스의 농도가 ≤4 DU/ml 예를 들어 <3, <2, <1, <0.5 등임을 의미한다. 유형 3 폴리오바이러스의 경우, 이는 조성물 중 바이러스의 농도가 ≤16 DU/ml 예를 들어 <14, <12, <10, <8, <6 등임을 의미한다. 유형 1, 2 및 3 폴리오 바이러스의 세 가지가 모두 존재하는 경우, 세 가지 항원은 각각 5:1:4의 DU 비율로, 또는 임의의 다른 적합한 비율, 예를 들어 사빈(Sabin) 균주를 사용하는 경우 15:32:45의 비율로 존재할 수 있다 [61]. 사빈 균주로부터의 항원의 낮은 용량이 특히 유용하다 (≤10 DU 유형 1, ≤20 DU 유형 2, 및 ≤30 DU 유형 3 (단위 용량 당, 전형적으로 0.5 ml)).
IPV 구성성분이 사용되고 폴리오바이러스가 Vero 세포 상에서 성장된 경우, 백신 조성물은 바람직하게는 10ng/ml 미만, 바람직하게는 ≤1ng/ml, 예를 들어 ≤500pg/ml 또는 ≤50 pg/ml의 Vero 세포 DNA, 예를 들어 10ng/ml 미만의 ≥50 염기쌍 길이인 Vero 세포 DNA를 함유한다.
조합 백신의 제조
백신에서 사용하기 위한 이들 병원체로부터의 항원성 구성성분은 일반적으로 하기 약칭으로 지칭된다: 디프테리아 톡소이드의 경우 'D'; 파상풍 톡소이드의 경우 'T'; 백일해 항원의 경우 'P' ('aP'는 무세포임) (예를 들어 적어도 본 발명의 OMV, PT 및 FHA 및 임의로 퍼탁틴 및/또는 FIM2/FIM3 포함); B형 간염 표면 항원의 경우 HBsAg; 접합된 에이치. 인플루엔자에 b 캡슐형 사카라이드의 경우 'Hib'; 및 3가 불활성화된 폴리오바이러스의 경우 'IPV'.
본 발명의 실시양태는 하기 구성성분을 포함하는 조합 백신을 포함하나 이에 제한되지는 않는다:
- D, T, aP
- D, T, aP, IPV
- D, T, aP, HBsAg
- D, T, aP, Hib
- D, T, aP, Hib, IPV
- D, T, aP, HBsAg, Hib
- D, T, aP, HBsAg, IPV
- D, T, aP, HBsAg, IPV, Hib
이들 조합 백신은 나열된 항원만으로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 또는 추가 병원체로부터의 항원을 추가로 포함할 수 있다. 특히, 이들 조합 백신은 활성 성분으로 나열된 항원만을 함유하지만, 부형제, 예컨대 아주반트, 완충제 등을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서 aP 구성성분은 본 발명의 OMV, PT (바람직하게는 유전적으로 해독된 PT) 및 FHA로 이루어진다. 일부 실시양태에서 aP 구성성분은 본 발명의 OMV, PT (바람직하게는 유전적으로 해독된 PT), FHA 및 PRN으로 이루어진다. 일부 실시양태에서 aP 구성성분은 본 발명의 OMV, PT (바람직하게는 유전적으로 해독된 PT), FHA 및 FIM2/FIM3으로 이루어진다. 일부 실시양태에서 aP 구성성분은 본 발명의 OMV, PT (바람직하게는 유전적으로 해독된 PT), FHA, PRN 및 FIM2/FIM3으로 이루어진다.
소아 조합 백신의 경우, D:T의 비율은 전형적으로 1보다 크고 (즉, 소아 백신은 일반적으로 Lf 단위로 과량의 D를 가짐), 일반적으로 2:1 내지 3:1 (Lf 단위로 측정됨), 예를 들어 2.5:1이다. 대조적으로, 청소년 또는 성인 (일반적으로 D 및 T를 포함하는 적어도 하나의 소아 조합 백신을 받음)에게 투여되는 부스터 백신의 경우, T:D의 비율은 전형적으로 1보다 크고 (즉, 부스터 백신은 일반적으로 Lf 단위로 과량의 T를 가짐), 일반적으로 1.5:1 내지 2.5:1, 예를 들어 2:1이다.
하나의 유용한 백신은 본 발명의 OMV 및 단위 용량 당 2Lf D, 5Lf T, 4μg PT-9K/129G, 4μg FHA 및 8μg 퍼탁틴을 포함한다. 또 다른 유용한 백신은 본 발명의 OMV 및 단위 용량 당 25Lf D, 10Lf T, 25μg PT-9K/129G, 25μg FHA 및 8μg 퍼탁틴을 포함한다.
항원성 구성성분을 조합하여 다가 조성물을 제조하는 경우, 항원을 개별적으로 첨가할 수 있거나 미리 혼합할 수 있다. 조합 백신이 D 및 T 항원 및 추가 항원을 포함하는 경우, 미리 혼합된 D-T 구성성분을 조합 백신의 제조에 사용할 수 있다. 이러한 2가 구성성분은 추가 항원과 조합될 수 있다. D-T 혼합물이 조합 백신을 제조하는데 사용되는 경우, 혼합물 중 디프테리아 톡소이드 대 파상풍 톡소이드의 비율은 2:1 내지 3:1 (Lf 단위로 측정), 바람직하게는 2.4:1 내지 2.6:1, 예를 들어 바람직하게는 2.5:1일 수 있다.
치료 방법
본 발명의 제4 측면에서, OMV 또는 면역원성 조성물은 포유동물, 특히 적합한 포유동물에서 면역 반응을 유도하는데 사용될 수 있다. 적합한 포유동물은 바람직하게는 인간이고; 면역 반응은 바람직하게는 보호성이고, 바람직하게는 항체를 포함한다.
본 발명의 면역원성 및 제약 조성물은 관심 면역원에 대한 면역 반응을 일으키기 위한 생체내 사용을 위한 것이다. 본원에 개시된 바와 같이, 유효량의 본 발명의 면역원성 조성물 또는 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 면역 반응을 일으키는 방법이 제공된다. 면역 반응은 바람직하게는 보호성이고, 바람직하게는 항체 및/또는 세포 매개 면역을 포함한다. 방법은 부스터 반응을 일으킬 수 있다.
본 발명은 또한 포유동물에서 면역 반응을 일으키기 위한 방법에서 사용하기 위한 본 발명의 면역원성 조성물 또는 제약 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 포유동물에서 면역 반응을 일으키기 위한 의약의 제조에서 본 발명의 OMV 또는 OMV의 집단의 용도를 제공한다.
이들 용도 및 방법에 의해 포유동물에서 면역 반응을 일으킴으로써, 포유동물은 다양한 질환 및/또는 감염, 예를 들어 상기 논의된 바와 같은 박테리아성 및/또는 바이러스성 질환으로부터 보호될 수 있다. OMV 및 조성물은 면역원성이고, 보다 바람직하게는 백신 조성물이다. 본 발명에 따른 백신은 예방적 (즉, 감염 예방) 또는 치료적 (즉, 감염 치료)일 수 있지만, 전형적으로 예방적일 것이다.
포유동물, 특히 적합한 포유동물은 인간 또는 대형 수의학적 포유동물 (예를 들어 말, 소, 사슴, 염소 및 돼지)일 수 있다. 백신이 예방용인 경우, 인간은 바람직하게는 어린이 (예를 들어 토들러 또는 영아) 또는 십대이고; 백신이 치료용인 경우, 인간은 바람직하게는 십대 또는 성인이다. 어린이용으로 의도된 백신은 또한 예를 들어 안전성, 투여량, 면역원성 등을 평가하기 위해 성인에게 투여될 수 있다.
본 발명에 따라 제조된 백신은 어린이 및 성인 둘 모두를 치료하는데 사용될 수 있다. 그러므로, 인간 환자는 1세 미만, 5세 미만, 1-5세, 5-15세, 15-55세, 또는 적어도 55세일 수 있다. 일부 실시양태에서, 어린이는 1세 미만의 개체, 예를 들어 생후 1일 미만, 생후 약 1주, 생후 약 2주, 생후 약 3주, 생후 약 4주, 생후 약 2개월, 생후 약 3개월, 생후 약 4개월, 생후 약 5개월, 생후 약 6개월, 생후 약 7개월, 생후 약 8개월, 생후 약 9개월, 생후 약 10개월, 생후 약 11개월, 생후 약 12개월 미만이다.
백신 접종을 위한 특정 환자 그룹은 성인 (예를 들어 20 ~50세, ~60세, 및 바람직하게는 ~65세), 어린이 (예를 들어 ~5세 또는 생후 약 12개월 미만의 영아), 입원 환자, 의료 종사자, 군사 및 군인, 임산부, 만성 질환자, 또는 면역결핍 환자이다. 그러나, 백신은 이들 그룹에만 적합한 것은 아니며, 보다 일반적으로 집단에서 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 일반적으로 환자에게 직접 투여될 것이다. 직접 전달은 비경구 주사 (예를 들어 피하로, 복강내로, 정맥내로, 근육내로, 피내로, 또는 조직의 간질 공간으로)에 의해 성취될 수 있다. 대안적인 전달 경로는 직장, 경구 (예를 들어 정제, 스프레이), 협측, 설하, 질, 국소, 경피(transdermal) 또는 경피(transcutaneous), 비강내, 안구, 귀, 폐 또는 다른 점막 투여를 포함한다. 피내 및 근육내 투여가 두 가지 바람직한 경로이다. 주사는 바늘 (예를 들어 피하 바늘)을 통할 수 있지만, 바늘-없는 주사가 대안적으로 사용될 수 있다. 전형적인 근육내 용량은 0.5 mL이다.
본 발명은 전신 및/또는 점막 면역을 일으키기 위해, 바람직하게는 향상된 전신 및/또는 점막 면역을 일으키기 위해 사용될 수 있다.
이들 용도 및 방법은 바람직하게는 보르데텔라 페르투시스 및 임의로 코리네박테리움 디프테리아에, 클로스트리디움 테타니, 헤모필루스 인플루엔자에 혈청형 b, 폴리오 바이러스 및 B형 간염 바이러스 중 하나 이상에 의해 유발되는 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 것이다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 이들 용도 및 방법은 보르데텔라 페르투시스에 의해 유발되는 질환의 예방을 위한 것이다.
질환이 예방되는 대상체는 본 발명의 면역원성 조성물을 투여받는 대상체와 동일하지 않을 수 있다. 예를 들어, 면역원성 조성물은 자손을 보호하기 위해 (소위 '모성 면역화') 여성 (임신 전 또는 임신 중)에게 투여될 수 있다. 임산부의 면역화는 전달된 모성 항체로부터 생성된 수동적 면역 ('수동적 모성 면역')을 통해 영아에게 항체-매개 면역을 제공한다. 수동적 면역은 모성 항체가 태반을 통해 태아에게 전달될 때 자연적으로 발생한다. 수동적 면역은 어떠한 능동적 획득 면역 없이 태어나기 때문에 영아에게 특히 중요하다. 임산부에게 본 발명의 조성물의 투여는 임산부의 면역을 향상시키고, 항체가 태반을 통해 신생아에게로 통과되어, 영아에게 수동적 모성 면역을 부여한다. 그러나, 영아에서 수동적 면역은 일시적일 뿐이며, 생후 처음 몇 주 또는 몇 달 후에 감소하기 시작한다. 수동적 면역은 일시적일 뿐이므로, 수동적 면역이 감소하기 전에 영아에서 능동적 면역을 유도하기 위해 영아가 본 발명의 조성물의 투여를 받는 것이 중요할 수 있다. 출생 후 영아에게 제2 면역원성 조성물의 투여는 영아에서 능동적 면역을 유도하고, 임신 중에 모체로부터 통과되는 면역을 연장시킨다.
투여량은 단일 용량 스케줄 또는 다중 용량 스케줄에 의한 것일 수 있다. 다중 용량은 1차 면역화 스케줄 및/또는 부스터 면역화 스케줄에 사용될 수 있다. 다중 용량 스케줄에서, 다양한 용량은 동일한 또는 상이한 경로에 의해 제공될 수 있다 (예를 들어, 비경구 프라임 및 점막 부스트, 점막 프라임 및 비경구 부스트 등). 다중 용량은 전형적으로 적어도 1주 간격 (예를 들어 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 6주, 약 8주, 약 10주, 약 12주, 약 16주 등)으로 투여될 것이다. 한 실시양태에서, 다중 용량은 세계 보건 기구의 확장 면역화 프로그램 ("EPI")에서 종종 사용되는 바와 같이 출생 후 대략 6주, 10주 및 14주, 예를 들어 생후 6주, 10주 및 14주에 투여될 수 있다. 대안적인 실시양태에서, 2개의 1차 용량이 약 2개월 간격, 예를 들어 약 7, 8 또는 9주 간격으로 투여된 다음, 제2 1차 용량 후 약 6개월 내지 1년, 예를 들어 제2 1차 용량 후 약 6, 8, 10 또는 12개월에 하나 이상의 부스터 용량이 투여된다. 추가 실시양태에서, 3개의 1차 용량이 약 2개월 간격, 예를 들어 약 7, 8 또는 9주 간격으로 투여된 다음, 제3 1차 용량 후 약 6개월 내지 1년, 예를 들어 제3 1차 용량 후 약 6, 8, 10 또는 12개월에 하나 이상의 부스터 용량이 투여된다.
지질 A의 반응원성을 조정하는 방법
제5 측면에서, 본 발명은 LpxA 및 LpxD로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자를 박테리아의 게놈 내로 안정적으로 통합하는 것을 포함하는, 보르데텔라 페르투시스 박테리아의 지질 A의 반응원성을 조정하는 방법에 관한 것이며, 여기서:
(i) LpxA 유전자는 서열식별번호: 1 또는 2와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 LpxA 단백질을 코딩하고, 여기서 단백질은 서열식별번호: 1 또는 2에 따라 넘버링된 경우 위치 170에서의 세린 (S170) 및/또는 위치 229에서의 알라닌 (A229)을 포함하고/거나;
(ii) LpxD 유전자는 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4와 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 LpxD 단백질을 코딩한다. 상기 기재된 바와 같이, 그람-음성 박테리아, 특히 비. 페르투시스 박테리아의 지질 A의 반응원성은 지질 A 생합성 경로로부터의 외인성 효소, 예를 들어 아세틸트랜스퍼라제 LpxA 및 LpxD의 발현에 의해 조정될 수 있다.
LpxA 및 LpxD 유전자의 게놈 통합은 항생제 선택에 대한 필요 없이 외인성 DNA의 안정적인 발현을 허용한다. 또한, 놀랍게도 본 발명자들은 이러한 균주가 관련 기술분야에서 볼 수 있는 성장 결함을 갖지 않는다는 것을 발견하였다.
정의
본 개시내용 및 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "하나"는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 형태를 포함하며; 즉, "하나"는 달리 명시되지 않는 한 "하나 이상"을 의미한다.
"A 및/또는 B"와 같은 어구에서 사용된 바와 같은 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A" 및 "B"를 포함하도록 의도된다. 유사하게, "A, B 및/또는 C"와 같은 어구에서 사용된 바와 같은 용어 "및/또는"은 하기 실시양태 각각을 포함하도록 의도된다: A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).
용어 "포함하는(comprising)"은 "포함하는(including)"을 포함하며, 예를 들어 X를 "포함하는" 조성물은 추가적인 것을 포함할 수 있다 (예를 들어 X + Y). 단어 "실질적으로"는 "완전히"를 배제하지 않으며, 예를 들어 Y가 "실질적으로 없는" 조성물은 Y가 완전히 없을 수 있다. 일부 구현에서, 용어 "포함하는"은 표시된 활성제, 예컨대 인용된 폴리펩티드의 포함, 뿐만 아니라 다른 활성제, 및 제약 산업에 공지된 바와 같은 제약상 허용되는 담체, 부형제, 연화제, 안정화제 등의 포함을 지칭한다. 일부 구현에서, 용어 "로 본질적으로 이루어진"은 그의 유일한 활성 성분이 표시된 활성 성분(들), 예를 들어 항원이지만, 제형의 안정화, 보존 등을 위한 것이지만 표시된 활성 성분의 치료 효과에 직접 관여하지 않는 다른 화합물이 포함될 수 있는 조성물을 지칭한다. 전환 어구 "본질적으로 이루어진"의 사용은 청구 범위가 청구항에 인용된 특정된 물질 또는 단계를 포함하는 것으로 해석되어야 하며, 청구된 발명의 기본 및 신규 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것을 의미한다. 문헌 [In re Herz, 537 F.2d 549, 551-52, 190 USPQ 461, 463 (CCPA 1976)] (원문 강조)을 참조하며; 또한 MPEP § 2111.03을 참조한다. 그러므로, 본 발명의 청구범위에서 사용될 때 용어 "로 본질적으로 이루어진"은 "포함하는"과 등가물인 것으로 해석되도록 의도되지 않는다. 용어 "로 이루어진" 및 그의 변형은 달리 명시적으로 특정되지 않는 한 "로 제한된"을 의미한다. 특정 지역에서, 용어 "로 이루어진 활성 성분을 포함하는"은 "본질적으로 이루어진" 대신에 사용될 수 있다.
수치 값 x와 관련하여 용어 "약"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정된 바와 같은 특정 값에 대한 허용가능한 문맥 오차 범위 이내를 의미하며, 이는 값이 측정 또는 결정되는 방법, 즉 측정 시스템의 한계 또는 특정 목적에 필요한 정밀성의 정도에 부분적으로 의존할 것이다 (예를 들어 x±10%, x±5%, x±4%, x±3%, x±2%, x±1%).
단어 "실질적으로"는 "완전히"를 배제하지 않으며, 예를 들어 Y가 "실질적으로 없는" 조성물은 Y가 완전히 없을 수 있지만, 모든 중요한 측면에서 비함유 조건으로 기능하는 조건을 포함할 수 있지만, 수치 값은 일부 불순물 또는 성분의 존재를 나타낸다. 필요한 경우, 단어 "실질적으로"는 본 발명의 정의에서 생략될 수 있다. 특정 값이 명세서 및 청구범위에서 사용되는 경우, 달리 언급되지 않는 한, 용어 "실질적으로"는 특정 값에 대한 허용가능한 오차 범위를 의미한다.
방법이 투여 단계, 예를 들어 (a), (b), (c) 등을 언급하는 경우, 이들은 순차적인 것으로 의도되며, 즉, 단계 (c)는 단계 (b) 다음에 뒤따르고, 단계 (b)는 단계 (a)에 선행한다. 항체는 일반적으로 이들의 표적에 특이적일 것이며, 즉, 비관련 대조군 단백질, 예컨대 소 혈청 알부민보다 표적에 대해 더 높은 친화성을 가질 것이다.
본 특허 명세서 내에서 인용된 모든 참고문헌, 특허 또는 특허 출원은 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 구체적인 실시양태
실시양태 1.
(i) LpxA 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 게놈 LpxA 유전자; 및/또는
(ii) 이종 LpxD 유전자의 적어도 하나의 게놈 삽입
을 포함하며, 여기서 LpxA 단백질은 서열식별번호: 1에 비해 위치 170에서의 돌연변이 및/또는 위치 229에서의 돌연변이를 포함하는 것인,
재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
실시양태 2. 실시양태 1에 있어서, LpxA 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 게놈 LpxA 유전자를 포함하고, 여기서 LpxA 단백질이 서열식별번호: 1에 비해 위치 170에서의 치환 및/또는 위치 229에서의 치환을 포함하는 것인 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
실시양태 3. 실시양태 1 또는 2에 있어서, LpxA 단백질이 서열식별번호: 1에 비해 위치 170에서의 세린 잔기 및/또는 위치 229에서의 알라닌 잔기를 포함하는 것인 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
실시양태 4. 실시양태 3에 있어서, LpxA 단백질이 서열식별번호: 1에 따라 넘버링된 경우 (i) 위치 170에서의 세린 잔기 및 (ii) 위치 229에서의 알라닌 잔기를 포함하는 것인 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
실시양태 5. 실시양태 4에 있어서, 서열식별번호: 1 또는 2와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 LpxA 단백질을 코딩하는 LpxA 유전자를 포함하는 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
실시양태 6. 임의의 선행 실시양태에 있어서, LpxA 단백질을 코딩하는 LpxA 유전자를 포함하고, 여기서 LpxA 유전자가 보르데텔라 파라페르투시스 (LpxABpa)로부터 유래된 것인 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
실시양태 7. 임의의 선행 실시양태에 있어서, LpxA 단백질을 코딩하는 LpxA 유전자를 포함하고, 여기서 LpxA 단백질이 서열식별번호: 2를 갖는 것인 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
실시양태 8. 임의의 선행 실시양태에 있어서, 이종 LpxD 유전자가 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4와 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 LpxD 단백질을 코딩하는 것인 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
실시양태 9. 실시양태 8에 있어서, 이종 LpxD 유전자가 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4와 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 LpxD 단백질을 코딩하는 것인 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
실시양태 10. 실시양태 9에 있어서, 이종 LpxD 유전자가 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 LpxD 단백질을 코딩하는 것인 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
실시양태 11. 임의의 선행 실시양태에 있어서, 내인성 LpxA 유전자가 불활성화되고/거나 내인성 LpxD 유전자가 불활성화된 것인 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
실시양태 12. 선행 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 지질 A를 생산하고, 여기서 (i) C3' 아실 쇄의 적어도 30%는 길이가 약 C10 내지 약 C12이고/거나; (ii) C2' 아실 쇄의 적어도 30%는 길이가 약 C10 내지 약 C12이고/거나; (iii) C2 아실 쇄의 적어도 30%는 길이가 약 C10 내지 약 C12인 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
실시양태 13. 선행 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 지질 A를 생산하고, 여기서 (i) C3' 아실 쇄의 적어도 30%는 길이가 C10 내지 약 C12인 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
실시양태 14. 선행 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 지질 A를 생산하고, 여기서 (i) C3' 아실 쇄의 적어도 30%는 길이가 C10인 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
실시양태 15. 선행 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 지질 A를 생산하고, 여기서 지질 A의 실질적으로 모든 C3' 아실 쇄가 C10의 길이를 갖는 것인 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
실시양태 16. 선행 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 특히 TLR4 자극 검정, 특히 인간 TLR4 자극 검정을 사용하여 측정될 때 모 균주에 의해 생산된 지질 A의 것과 비교하여 감소된 내독성 활성을 갖는 지질 A를 생산하는 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
실시양태 17. 선행 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 상기 박테리아의 박테리아 집단의 성장 곡선이 모 균주의 집단의 성장 곡선에 필적하는 것인 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
실시양태 18. 선행 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 박테리아가 토하마 I 균주로부터 유래되고 유전적으로 해독된 백일해 톡소이드 PT-9K/129G를 발현하는 것인 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
실시양태 19. 막 내로 혼입된 변형된 지질 A를 포함하는 실시양태 1 내지 18 중 어느 하나의 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아로부터 유래된 단리된 외막 소포 (OMV)이며, 여기서 지질 A의 실질적으로 모든 C3' 아실 쇄는 C10의 길이를 갖고/거나, 여기서 지질 A의 실질적으로 모든 C2 및 C2' 아실 쇄는 C12의 길이를 갖는 것인 단리된 외막 소포 (OMV).
실시양태 20. 실시양태 19에 있어서, 막 내로 혼입된 변형된 지질 A를 포함하고, 여기서 지질 A의 실질적으로 모든 C3' 아실 쇄가 C10의 길이를 갖는 것인 단리된 외막 소포.
실시양태 21. 실시양태 19 또는 20에 있어서, 피부 괴사성 독소가 실질적으로 없고/거나, 내인성 유전적으로 해독된 백일해 톡소이드를 함유하는 단리된 외막 소포.
실시양태 22. 실시양태 19 내지 21에 따른 적어도 하나의 단리된 OMV 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 면역원성 조성물.
실시양태 23. 실시양태 22에 있어서, (1) 백일해 톡소이드 (PT), (2) FHA, (3) 퍼탁틴 (PRN), (4) FIM2/FIM3, (5) 아데닐레이트 시클라제, (6) 디프테리아 톡소이드 (DT), (7) 파상풍 톡소이드 (TT), (8) 불활성화된 폴리오 바이러스 (IPV), (9) B형 간염 표면 항원 및 (10) Hib PRP로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가 항원을 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
실시양태 24. 적합한 포유동물, 예를 들어 인간에서 면역 반응을 유도하는데 사용하기 위한 실시양태 19 내지 21의 OMV 또는 실시양태 22 또는 23의 면역원성 조성물.
실시양태 25. 예방에서 또는 백신으로서 사용하기 위한, 예를 들어 보르데텔라 페르투시스에 의해 유발되는 질환의 예방에서 사용하기 위한 실시양태 19 내지 21의 OMV 또는 실시양태 22 또는 23의 면역원성 조성물.
실시양태 26. 보르데텔라 페르투시스에 의해 유발되는 질환의 예방에서 사용하기 위한 실시양태 19 내지 21의 OMV 또는 실시양태 22 또는 23의 면역원성 조성물.
실시양태 27. LpxA 및 LpxD로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자를 박테리아의 게놈 내로 안정적으로 통합하는 것을 포함하는, 보르데텔라 페르투시스 박테리아의 지질 A의 반응원성을 조정하는 방법이며, 여기서:
(i) LpxA 유전자는 서열식별번호: 1 또는 2와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 LpxA 단백질을 코딩하고, 여기서 단백질은 서열식별번호: 1 또는 2에 따라 넘버링된 경우 위치 170에서의 세린 (S170) 및/또는 위치 229에서의 알라닌 (A229)을 포함하고/거나;
(ii) LpxD 유전자는 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4와 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 LpxD 단백질을 코딩하는 것인, 방법.
실시양태 28. LpxA 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 게놈 LpxA 유전자를 포함하고, 여기서 LpxA 단백질은 (서열식별번호: 1에 비해) 위치 170에서의 세린 잔기 및 위치 229에서의 알라닌 잔기를 포함하고, 여기서 LpxA 유전자는 서열식별번호: 1 또는 2와 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 것인 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
실시양태 29. LpxA 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 에피솜 LpxA 유전자를 포함하고, 여기서 LpxA 단백질은 (서열식별번호: 1에 비해) 위치 170에서의 세린 잔기 및 위치 229에서의 알라닌 잔기를 포함하고, 여기서 LpxA 유전자는 서열식별번호: 1 또는 2와 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 것인 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
실시양태 30. 하기를 포함하는 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아: (i) LpxA 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 게놈 LpxA 유전자, 여기서 LpxA 단백질은 (서열식별번호: 1에 비해) 위치 170에서의 세린 잔기 및 위치 229에서의 알라닌 잔기를 포함하고, 여기서 LpxA 유전자는 서열식별번호: 1 또는 2와 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩함, 및 (ii) 이종 LpxD 유전자의 적어도 하나의 게놈 삽입, 여기서 이종 LpxD 유전자는 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩함.
실시양태 31. 하기를 포함하는 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아: LpxA 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 에피솜 LpxA 유전자, 여기서 LpxA 단백질은 (서열식별번호: 1에 비해) 위치 170에서의 세린 잔기 및 위치 229에서의 알라닌 잔기를 포함하고, 여기서 LpxA 유전자는 서열식별번호: 1 또는 2와 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩함, 및 (ii) 이종 LpxD 유전자의 적어도 하나의 게놈 삽입, 여기서 이종 LpxD 유전자는 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩함.
실시양태 32. 이종 LpxD 유전자의 적어도 하나의 게놈 삽입을 포함하는 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아이며, 여기서 이종 LpxD 유전자는 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 것인 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
실시양태 33. LpxA 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 게놈 LpxA 유전자를 포함하는 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아이며, 여기서 LpxA 단백질은 (서열식별번호: 1에 비해) 위치 170에서의 세린 잔기 및 위치 229에서의 알라닌 잔기를 포함하고, 여기서 LpxA 유전자는 서열식별번호: 1 또는 2와 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하고, 여기서 박테리아는 토하마 균주로부터 유래되고 유전적으로 해독된 백일해 톡소이드 PT-9K/129G를 발현하는 것인 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
실시양태 34. LpxA 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 에피솜 LpxA 유전자를 포함하는 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아이며, 여기서 LpxA 단백질은 (서열식별번호: 1에 비해) 위치 170에서의 세린 잔기 및 위치 229에서의 알라닌 잔기를 포함하고, 여기서 LpxA 유전자는 서열식별번호: 1 또는 2와 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하고, 여기서 박테리아는 토하마 I 균주로부터 유래되고 유전적으로 해독된 백일해 톡소이드 PT-9K/129G를 발현하는 것인 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
실시양태 35. 하기를 포함하는 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아: (i) LpxA 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 게놈 LpxA 유전자, 여기서 LpxA 단백질은 (서열식별번호: 1에 비해) 위치 170에서의 세린 잔기 및 위치 229에서의 알라닌 잔기를 포함하고, 여기서 LpxA 유전자는 서열식별번호: 1 또는 2와 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩함, 및 (ii) 이종 LpxD 유전자의 적어도 하나의 게놈 삽입, 여기서 이종 LpxD 유전자는 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하고, 여기서 박테리아는 토하마 I 균주로부터 유래되고 유전적으로 해독된 백일해 톡소이드 PT-9K/129G를 발현함.
실시양태 36. 하기를 포함하는 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아: LpxA 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 에피솜 LpxA 유전자, 여기서 LpxA 단백질은 (서열식별번호: 1에 비해) 위치 170에서의 세린 잔기 및 위치 229에서의 알라닌 잔기를 포함하고, 여기서 LpxA 유전자는 서열식별번호: 1 또는 2와 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩함, 및 (ii) 이종 LpxD 유전자의 적어도 하나의 게놈 삽입, 여기서 이종 LpxD 유전자는 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하고, 여기서 박테리아는 토하마 I 균주로부터 유래되고 유전적으로 해독된 백일해 톡소이드 PT-9K/129G를 발현함.
실시양태 37. 이종 LpxD 유전자의 적어도 하나의 게놈 삽입을 포함하는 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아이며, 여기서 이종 LpxD 유전자는 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하고, 여기서 박테리아는 토하마 I 균주로부터 유래되고 유전적으로 해독된 백일해 톡소이드 PT-9K/129G를 발현하는 것인 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
실시양태 38. LpxA 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 게놈 LpxA 유전자를 포함하는 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아이며, 여기서 LpxA 단백질은 (서열식별번호: 1에 비해) 위치 170에서의 세린 잔기 및 위치 229에서의 알라닌 잔기를 포함하고, 여기서 LpxA 유전자는 서열식별번호: 1 또는 2와 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하고, 여기서 박테리아는 토하마 I 균주로부터 유래되고, 유전적으로 해독된 백일해 톡소이드 PT-9K/129G를 발현하고 피부 괴사성 독소 (DNT) 유전자 (서열식별번호: 19)를 발현하지 않는 것인 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
실시양태 39. LpxA 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 에피솜 LpxA 유전자를 포함하는 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아이며, 여기서 LpxA 단백질은 (서열식별번호: 1에 비해) 위치 170에서의 세린 잔기 및 위치 229에서의 알라닌 잔기를 포함하고, 여기서 LpxA 유전자는 서열식별번호: 1 또는 2와 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하고, 여기서 박테리아는 토하마 I 균주로부터 유래되고, 유전적으로 해독된 백일해 톡소이드 PT-9K/129G를 발현하고 피부 괴사성 독소 (DNT) 유전자 (서열식별번호: 19)를 발현하지 않는 것인 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
실시양태 40. 하기를 포함하는 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아: (i) LpxA 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 게놈 LpxA 유전자, 여기서 LpxA 단백질은 (서열식별번호: 1에 비해) 위치 170에서의 세린 잔기 및 위치 229에서의 알라닌 잔기를 포함하고, 여기서 LpxA 유전자는 서열식별번호: 1 또는 2와 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩함, 및 (ii) 이종 LpxD 유전자의 적어도 하나의 게놈 삽입, 여기서 이종 LpxD 유전자는 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하고, 여기서 박테리아는 토하마 I 균주로부터 유래되고, 유전적으로 해독된 백일해 톡소이드 PT-9K/129G를 발현하고 피부 괴사성 독소 (DNT) 유전자 (서열식별번호: 19)를 발현하지 않음.
실시양태 41. 하기를 포함하는 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아: LpxA 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 에피솜 LpxA 유전자, 여기서 LpxA 단백질은 (서열식별번호: 1에 비해) 위치 170에서의 세린 잔기 및 위치 229에서의 알라닌 잔기를 포함하고, 여기서 LpxA 유전자는 서열식별번호: 1 또는 2와 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩함, 및 (ii) 이종 LpxD 유전자의 적어도 하나의 게놈 삽입, 여기서 이종 LpxD 유전자는 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하고, 여기서 박테리아는 토하마 I 균주로부터 유래되고, 유전적으로 해독된 백일해 톡소이드 PT-9K/129G를 발현하고 피부 괴사성 독소 (DNT) 유전자 (서열식별번호: 19)를 발현하지 않음.
실시양태 42. 이종 LpxD 유전자의 적어도 하나의 게놈 삽입을 포함하는 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아이며, 여기서 이종 LpxD 유전자는 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하고, 여기서 박테리아는 토하마 I 균주로부터 유래되고, 유전적으로 해독된 백일해 톡소이드 PT-9K/129G를 발현하고 피부 괴사성 독소 (DNT) 유전자 (서열식별번호: 19)를 발현하지 않는 것인 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
실시양태 43. 막 내로 혼입된 변형된 지질 A를 포함하는 실시양태 28 내지 42 중 어느 하나의 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아로부터 유래된 단리된 외막 소포 (OMV)이며, 여기서 지질 A의 실질적으로 모든 C3' 아실 쇄는 C10의 길이를 갖고/거나, 여기서 지질 A의 실질적으로 모든 C2 및 C2' 아실 쇄는 C12의 길이를 갖는 것인 단리된 외막 소포 (OMV).
실시양태 44. 막 내로 혼입된 변형된 지질 A를 포함하는 실시양태 28 내지 42 중 어느 하나의 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아로부터 유래된 단리된 외막 소포 (OMV)이며, 여기서 지질 A의 실질적으로 모든 C3' 아실 쇄는 C10의 길이를 갖는 것인 단리된 외막 소포 (OMV).
실시양태 45. 면역학적 유효량의 실시양태 43 또는 44에 따른 단리된 OMV 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 면역원성 조성물, 특히 제약 조성물, 예컨대 백신.
실시양태 46. 실시양태 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 박테리아가 이종 LpxE 유전자의 게놈 삽입을 포함하는 것인 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
실시양태 47. 실시양태 46에 있어서, 이종 LpxE 유전자가 리조비움 레구미노사룸 (LpxERl)으로부터 유래된 것인 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
실시양태 48. 실시양태 47에 있어서, 이종 LpxE 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열이 서열식별번호: 6인 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
실시양태 49. 실시양태 46에 있어서, 이종 LpxE 유전자가 프란시셀라 노비시다 (LpxEFn)로부터 유래된 것인 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
실시양태 50. 실시양태 49에 있어서, 이종 LpxE 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열이 서열식별번호: 7인 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
실시양태 51. 실시양태 46 내지 50 중 어느 하나에 있어서, 이종 LpxE 유전자가 BP0840 프로모터의 제어 하에 있는 것인 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
실시양태 52. 실시양태 46 내지 51 중 어느 하나에 있어서, 이종 LpxE 유전자가 박테리아 게놈 내에 삽입된 것인 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
실시양태 53. 실시양태 52에 있어서, 이종 LpxE 유전자가 ArnT 유전자의 유전자좌 (ΔArnT)를 대체하는 것인 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
실시양태 54. 실시양태 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 박테리아가 이종 LpxF 유전자의 게놈 삽입을 포함하는 것인 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
실시양태 55. 실시양태 54에 있어서, 이종 LpxF 유전자가 프란시셀라 노비시다 (LpxFFn)로부터 유래된 것인 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
실시양태 56. 실시양태 55에 있어서, 이종 LpxF 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열이 서열식별번호: 8인 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
실시양태 57. 실시양태 54 내지 56 중 어느 하나에 있어서, 이종 LpxF 유전자가 BP0840 프로모터의 제어 하에 있는 것인 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
실시양태 58. 실시양태 54 내지 57 중 어느 하나에 있어서, 이종 LpxF 유전자가 박테리아 게놈 내에 삽입된 것인 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
실시양태 59. 실시양태 58에 있어서, 이종 LpxF 유전자가 ArnT 유전자의 유전자좌 (ΔArnT)를 대체하는 것인 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
발명의 실시를 위한 형태
박테리아 균주 및 유전자 서열
표 1 내지 3은 사용된 핵심 박테리아 균주, DNA 및 아미노산 서열을 나열한다:
<표 1>
Figure pct00002
Figure pct00003
<표 2>
Figure pct00004
<표 3>
Figure pct00005
Figure pct00006
재조합 박테리아 균주의 생산 및 배양
이종 Lpx 유전자는 게놈 통합 또는 에피솜 (비-게놈) 발현에 의해 보르데텔라 페르투시스에서 발현되었다.
게놈 통합
관심 LpxABpa 서열 (서열식별번호: 9) 및 상동성 재조합을 허용하는 상류 및 하류 상동성 아암 (서열식별번호: 14 및 15)을 함유하는 합성 서열을 플랭킹 EcoRI 및 HindIII 제한 부위를 사용하여 벡터 pSORTP1 [62]에 클로닝하였다. 벡터 pSORTP1은 접합 전달의 기점, 겐타마이신 및 암피실린 선택 마커 및 스트렙토마이신에 민감성을 부여하는 rpsL 유전자의 카피를 함유한다.
pSORTP1 벡터를 이. 콜라이 SM10 λpir로 형질전환하고, 재조합 클론을 날리딕스산/스트렙토마이신-내성 비. 페르투시스 균주 토하마 I과 함께 공동-배양하여 벡터의 접합 전달을 허용하였다. 이 균주의 스트렙토마이신 내성은 rpsL 유전자의 돌연변이에 의해 부여된다. 플라스미드는 비. 페르투시스에서 복제할 수 없으며, 겐타마이신 내성을 부여하기 위해 상동성 재조합에 의해 박테리아 게놈 내로 통합되어야 한다. 겐타마이신 (야생형 비. 페르투시스를 제거하기 위해) 및 날리딕스산 (이. 콜라이 SM10 공여자 균주를 제거하기 위해)에 대한 공동 선택에 의해 재조합 비. 페르투시스를 수득하였다. rpsL 유전자의 기능적 카피를 함유하는 pSORTP1 벡터의 게놈 도입은 비. 페르투시스를 스트렙토마이신에 민감하게 만든다. 스트렙토마이신에 대한 선택은 마커 없는 돌연변이를 달성하기 위해 트랜스진의 다른 측면 상에 제2 상동성 재조합 사건에 의해 벡터 백본의 제거를 강제한다. 이 접근법을 사용하여, 비. 파라페르투시스로부터의 LpxA 서열을 발현하는 재조합 비. 페르투시스 토하마 I 균주를 수득하였다. 수많은 추가 균주를 하기와 같이 구축하였다:
균주 ΔArnT/PagLBbr에서, 비. 페르투시스 게놈의 ArnT 유전자좌를 비. 페르투시스 BP0840 (외막 포린)의 프로모터 영역의 제어 하에 비. 브론키셉티카 PagL 유전자의 카피로 대체하였다. 재조합 서열을 비. 브론키셉티카 PagL 서열을 함유하는 ArnT 상류 및 하류 영역으로 구축하였다. 플랭킹 EcoRI 및 HindIII 제한 부위를 사용하여 재조합 서열을 벡터 pSORTP1에 클로닝하였다. 형질전환 후, 상기 기재된 바와 같이, 생성된 균주는 ArnT 유전자의 녹아웃 및 PagL 유전자의 발현을 조합한다.
균주 ΔArnT/ΔLpxABpe/LpxABpa에서, 비. 페르투시스 게놈의 ArnT 유전자좌 (서열식별번호: 20)가 녹아웃된다.
균주 ΔLpxABpe/LpxABpa/ΔDNT/LpxDPa/ΔLpxDBpe에서, LpxDPa의 카피는 게놈 (서열식별번호: 21) 내로 통합되었으며, 이는 피부 괴사성 독소 (DNT) 유전자 (서열식별번호: 19)를 대체하였다. 야생형 LpxDBp가 후속적으로 녹아웃되었다.
균주 LpxEFn /ΔArnT/ΔLpxABpe/LpxABpa에서, 비. 페르투시스 게놈의 ArnT 유전자좌 (서열식별번호: 20)를 비. 페르투시스 BP0840 (외막 포린 서열식별번호: 17)의 프로모터 영역의 제어 하에 프란시셀라 노비시다 LpxE 유전자 (서열식별번호: 22)의 카피로 대체하였다. 재조합 서열을 프란시셀라 노비시다 LpxE 서열을 함유하는 ArnT 상류 및 하류 영역으로 구축하였다. 플랭킹 EcoRI 및 HindIII 제한 부위를 사용하여 재조합 서열을 벡터 pSORTP1에 클로닝하였다. 형질전환 후, 상기 기재된 바와 같이, 생성된 균주는 ArnT 유전자의 녹아웃 및 LpxE 유전자의 발현을 조합한다.
에피솜 발현
플랭킹 Acc65I 및 HindIII 부위를 사용하여 합성 서열을 벡터 pMMB67EH (ATCC Ref.: 37622)에 클로닝하였다. LpxDCt, LpxDPa, LpxEFn, LpxERl 및 LpxFFn을 코딩하는 서열은 비. 페르투시스에서의 발현을 위해 코돈 최적화되었다 (프라이어러티진 서비스(PriorityGENE service), 제네위즈(GENEWIZ)).
이종 LpxD, LpxE 또는 LpxF 유전자를 함유하는 pMMB67EH 벡터를 이. 콜라이 SM10 λpir로 형질전환하고, 재조합 클론을 날리딕스산/스트렙토마이신-내성 비. 페르투시스 균주 토하마 I과 함께 공동-배양하여 벡터의 접합 전달을 허용하였다. 그 후, 암피실린 및 날리딕스산에 대해 pMMB67EH 플라스미드를 함유하는 재조합 비. 페르투시스를 선택하였다. 각각의 pMMB67EH 구축물을 사용한 비. 페르투시스 토하마 I의 안정적인 형질전환을 이종 Lpx 서열의 PCR 검출에 의해 확인하였다.
비. 페르투시스 재조합 균주를 표준 조건에서 상업적으로 입수가능한 배지 (63 참조)에서 성장시켰으며; 배지를 에피솜 발현을 위해 1 mM IPTG로 보충하였다.
재조합 비. 페르투시스 ΔLpxABpe/LpxABpa의 성장 평가
박테리아 성장에 대한 임의의 잠재적인 영향을 평가하기 위해, 재조합 균주 ΔLpxABpe/LpxABpa를 10L 발효에서 테스트하였다.
간단히 말해서, 2개의 완전한 보르데-장구(Bordet-Gengou) 한천 플레이트를 사용하여 2개의 30mL, 24시간 사전배양물을 접종하였다. 그 후, 30 mL 사전배양물을 1L의 2개의 추가 24시간 사전배양물에 접종한 다음; 이들 2개의 제2 사전배양물 (대략 1.5L)을 사용하여 1의 OD650nm에서 10L 발효기를 접종하였다.
대략 9시간에 용존 산소 (DO)의 농도의 저하가 관찰되었으며; 이러한 저하는 배양물의 기하급수적인 성장률로 인한 산소 소비의 증가와 연관된다. 그 후, DO를 진탕 속도에 의해 제어하였다.
37.5시간 후 발효 프로세스의 종료는 주요 탄소 공급원 (Na-L-글루타메이트)의 고갈의 증거인 산소 소비의 감소에 의해 유발되는 교반 속도 감소에 의해 특징화되었다. 수확 당시의 광학 밀도 (OD650nm)는 10.1이었으며, 세포 생존율은 6.3 1010 (CFU/ml)이었다.
전반적으로, ΔLpxABpe/LpxABpa의 발효 프로파일은 유사한 발효 시간 및 DO까지의 경과 시간으로 토하마 I PTg 균주의 발효 프로파일에 필적하였다 (표 5, 도 3 내지 5).
<표 5>
비. 페르투시스 ΔLpxABpe/LpxABpa 및 토하마 I PTg에 대한 발효 파라미터.
Figure pct00007
OMV 생산
LPS 구조의 질량 분광광도법 분석 뿐만 아니라 인간 TLR4 수용체의 시험관내 자극을 위해 박테리아 배양물로부터 외막 소포 (OMV)를 생산하였다. 24시간 배양 후 박테리아 펠릿으로부터 세제 추출에 의해 OMV를 생산하였다.
간단히 말해서, 박테리아 펠릿을 20mM 트리스-HCl, 2mM EDTA 및 50 U/mL 벤조나제, pH 8.6에 재현탁하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. OMV의 세제 추출을 위해, 0.1% DOC를 첨가하고, 현탁액을 30분 동안 40℃에서 인큐베이션하였다. 세포 파편을 20,000g에서 30분 동안 (4℃) 원심분리에 의해 제거하고, 상청액을 멸균 여과하였다 (0.22μm). 그 후, 멸균 상청액을 초원심분리하고 (145,000g, 2h, 4℃), 1x PBS (5mM EDTA 포함)에 재현탁하고, 두 번째 초원심분리하고 (동일한 조건), 1x PBS (EDTA 없음)에 재현탁하고, 멸균 여과하였다 (0.22μm).
질량 분광광도법에 의한 LPS 구조의 특징화
OMV 제제를 액체 크로마토그래피 질량 분광광도법 (LC-MS)에 의해 분석하여 LpxA 및/또는 LpxD (또는 LpxE)의 게놈 돌연변이 및 이종 LpxA 및/또는 LpxD, LpxE 또는 LpxF 유전자의 에피솜 발현의 LPS의 구조에 대한 영향을 결정하였다. 야생형 균주 토하마 I PTg로부터의 OMV 제제를 대조군으로 사용하였다.
간단히 말해서, OMV 제제를 95% 에탄올로 침전시키고, 펠릿을 건조시키고, 50% 메탄올에 가용화시키고, 초음파 처리하였다. 초음파 처리된 물질을 원심분리하고, LOS 구조의 MS 분석을 위해 5μL의 상청액을 HPLC 칼럼에 주입하였다.
LpxA 재조합 균주
LpxABpa의 게놈 통합 및 발현은 재조합 비. 페르투시스 ΔLpxABpe/LpxABpa로부터의 OMV의 LPS 구조에 대한 유의한 영향을 미쳤으며, 위치 C3'의 아실 쇄의 100%는 C14에서 C10으로의 길이 감소를 표시한다 (도 6(b) - 점선은 C14에서 C10으로의 감소를 나타냄). 비교하여, 비. 페르투시스 토마하 I에서 에피솜 LpxABpa의 발현은 매우 낮고 정량화불가능한 영향을 미쳤으며 (균주 LpxABpa); C14에서 C10으로의 변이체는 에피솜 LpxABpa의 발현과 관련하여 소수에만 존재하지만, 도 7(b)는 여전히 그것이 야생형과 상이할 수 있음을 나타낸다 (C14에서 C10으로의 길이 감소). 참고로, 야생형 비. 페르투시스 토마하 I Ptg로부터의 LOS의 구조적 분석은 도 13에 나타낸다.
LpxABpa의 게놈 통합 및 발현은 ΔArnT와 조합될 때 LPS 구조에 대한 유사한 효과를 가졌으며, 위치 C3'의 아실 쇄의 100%는 C14에서 C10으로의 길이 감소를 표시한다 (도 8).
중요하게는, LpxABpa의 게놈 통합 및 발현은 또한 균주 ΔLpxABpe/LpxABpa/ΔDNT/LpxDPa 및 ΔLpxABpe/LpxABpa/ΔDNT/LpxDPa/ΔLpxDBpe에서 C3' 아실 쇄의 길이에 대한 동일한 효과를 가졌으며, 여기서 슈도모나스로부터의 LpxD가 또한 발현되었다 (도 9 및 10). 각각의 내인성 LpxD의 불활성화와 조합하여 외인성 LpxD 유전자의 발현은 외인성 LpxA 유전자의 활성에 대해 해로운 효과를 갖지 않았다. 또한, 유의한 성장 차이가 관찰되지 않았다.
유사하게, LpxEFn이 또한 발현된 균주에서, C3' 아실 쇄의 길이에 대한 LpxABpa의 게놈 통합 및 발현의 효과는 영향을 받지 않았으며, 100%가 C10의 길이를 나타내었다.
LpxD 재조합 균주
피. 아에루기노사 (LpxDPa)로부터의 LpxD의 에피솜 발현은 재조합 비. 페르투시스로부터의 OMV의 LPS 구조에 대해 부분적인 영향만을 미쳤으며 (도 11), 총 LPS의 36%만이 C2 및 C2' 아실 쇄 둘 모두 (24%) 또는 C2 또는 C2' 아실 쇄 중 오직 하나 (12%)에서 감소된 길이를 나타내었다.
LpxDPa의 게놈 발현은 LPS에 대한 영향을 증가시켰으며, 여기서 C2 및 C2' 아실 쇄 둘 모두의 길이는 LPS의 70%에서 감소되었고, C2 또는 C2' 중 오직 하나의 길이는 LPS의 30%에서 감소되었다 (도 9). LpxDBpe의 남아있는 활성의 제거는 두 위치 모두에서 100% 쇄 길이 감소를 유발하였다 (ΔLpxABpe/LpxABpa/ΔDNT/LpxDPa/ΔLpxDBpe, 도 10).
ΔArnT/PagL 재조합 균주
ArnT의 불활성화 및 PagL의 게놈 통합은 C3에서 C10 에스테르의 100% 제거를 유발하였다 (도 12). 참고로, 야생형 비. 페르투시스 토마하 I Ptg로부터의 OMV의 구조적 분석은 도 13에 나타낸다.
LpxE 재조합 균주
에프. 노비시다 (균주 B2982, 9.8)로부터의 LpxE (LpxEFn)의 경우, 에피솜 발현은 모노포스포릴 지질 A의 25%에서 생성되었다. 야생형 배경에서 LpxEFn의 게놈 발현은 모노포스포릴 지질 A의 분획을 91%로 증가시켰다. 그러나, LpxA 돌연변이체 배경에서 동일한 구축물의 발현은 놀랍게도 24% 모노포스포릴 지질 A만을 생성하였다. 알. 레구미노사룸 (균주 B2983, 9.9)으로부터의 LpxE에서 유사한 결과가 관찰되었다.
야생형 배경에서 LpxEFn 및 LpxERc를 발현하는 재조합 균주에 대한 구조적 데이터는 도 18 및 19에 제공된다 (다른 조합에 대한 특징화 데이터는 구체적으로 표시되지 않음).
LpxF 재조합 균주
에프. 노비시다 (균주 B2981, 9.10)로부터의 LpxF와 관련하여, 제한된 실험 세트에서, LOS 구조에 대한 식별가능한 영향이 관찰되지 않았다 (도 20).
HEK-hTLR4 세포에 대한 TLR4 신호전달 활성화의 시험관내 평가
TLR4 신호전달 캐스케이드의 자극은 NF-κB 및/또는 활성인자 단백질 1 (AP-1) 전사 인자의 활성화를 유발할 수 있으며, 이는 여러 전염증성 시토카인, 예를 들어 IL-1, IL-6, IL-8 및 TNF-α의 발현에 기여하며 그러므로 염증에서 핵심 역할을 한다.
재조합 비. 페르투시스로부터의 정제된 OMV를 사용할 때 TLR4 경로의 신호전달 활성화가 감소되는지 여부를 분석하기 위해, HEK-블루™-hTLR4 세포 (인비보겐)에서 TLR4 의존적 전사 활성을 결정하였다.
TLR4 리간드로 자극 시, NF-kB 및 AP-1의 활성화는 알칼리 포스파타제의 분비를 유도하며, 이는 QUANTI-블루™ 비색 검정을 사용하여 상청액에서 검출될 수 있다. TLR4 수용체 반응은 655nm에서 측정된 상청액에서 NF-κB- 및 AP-1-의존적 SEAP 생산을 측정하여 결정되었다. 각 샘플에 대해, 3개의 상이한 희석액을 삼중으로 테스트하였다. TLR4 자극에 기인한 신호의 비율은 항-TLR4 항체로 TLR4 수용체의 특이적 차단을 통해 시각화되며, 비관련 항체 (항-M72)가 대조군으로 사용된다. TLR4 신호전달을 활성화시키기 위해 다양한 재조합 비. 페르투시스 균주로부터 수득된 OMV의 능력을 토하마 I PTg 균주로부터 수득된 OMV의 능력과 비교하였다 (도 14 내지 17).
단백질 함량에 의해 정규화된 검정의 경우, 벡세로 (MenB OMV를 함유하는 MenB 백신), 퀸박셈 (wP 백신) 및 인판릭스 헥사 (aP 백신)가 대조군으로 포함되었다. LPS 함량에 의해 정규화된 검정의 경우, 비. 페르투시스로부터의 정제된 LPS, 네이세리아로부터의 해독된 (LpxL1 돌연변이체) 정제된 LPS 및 자극 없는 음성 대조군이 포함되었다.
HEK-hTLR4 데이터는 LpxA 독립형 돌연변이체 ΔLpxABpe/LpxABpa로부터의 OMV에 의한 TLR4 신호전달 캐스케이드의 활성화의 현저한 감소를 보여준다. 활성화 프로파일은 인판릭스 헥사의 것에 필적하였다 (± 0.5 OD) (즉 TLR4 신호전달 캐스케이드의 낮은 활성화).
LpxABpa, 즉 ΔArnT/ΔLpxABpe/LpxABpa, ΔLpxABpe/LpxABpa/ΔDNT/LpxDPa, 및 ΔLpxABpe/LpxABpa/ΔDNT/LpxDPa/ΔLpxDBpe의 게놈 삽입을 갖는 모든 재조합 비. 페르투시스 균주에서 유사한 결과가 수득되었다.
LPS 구조에 대한 이들의 부분적 효과에 따라, LpxD가 에피솜으로 발현된 LpxD 돌연변이체는 TLR4 신호전달 캐스케이드 활성화의 더 완만한 감소를 유도하였다. 보다 구체적으로, LpxD 돌연변이체에서 관찰된 OD655 값은 비자극된 세포에서 관찰된 OD655 값 및/또는 aP 백신으로 자극된 세포에서 관찰된 OD655 값보다 더 높았지만 (≥0.5 OD655), 야생형 그람-음성 박테리아로부터 유래된 OMV로 자극된 세포에서 관찰된 OD655 값보다 더 낮았다. 정규화된 단백질 및 LPS 둘 모두를 사용한 검정에서 감소가 관찰되었다.
균주 ΔArnT/ΔLpxABpe/LpxABpa에서 ΔArnT 돌연변이의 효과는 ΔLpxABpe/LpxABpa 돌연변이에 의해 제공된 TLR4 자극의 감소가 이미 판독을 포화시키고 추가 감소가 관찰되지 않을 수 있기 때문에 쉽게 유래될 수 없다. 한편, 균주 ΔArnT/PagLBbr로부터의 OMV의 경우, TLR4 자극의 증가가 관찰된다. 이러한 증가가 ΔArnT 돌연변이체 균주 둘 모두에서 관찰되지 않는다는 점을 감안할 때, 이러한 증가는 PagLBbr 활성을 통한 C3 아실 쇄의 제거에 의해 유발되는 것으로 가정된다.
흥미롭게도, LpxE 돌연변이체가 지질 A의 구조를 변경한 반면, 사용된 검정에서는 TLR4 자극의 유의한 감소가 검출되지 않았다 (도 21 및 22).
Balb/c 마우스에서 비인두 집락화 모델에서 수행된 효능 연구
이 연구의 목표는 DTPa 또는 DTPw 백신으로 백신접종된 마우스 또는 이전에 시험감염된 마우스 (회복기 마우스)와 비교하여 비인두 (NP) 집락화 모델에서 DTPa와의 공동-투여에서 dOMV 후보 백신의 야생형 보르데텔라 페르투시스 토하마 I 균주에 대한 영향을 평가하는 것이었다.
실험 설계:
25마리의 6주령 암컷 BALB/c 마우스를 하기 표 6 및 7에 나열된 그룹 중 하나에 할당하였다. 표 6은 25마리의 마우스를 포함하는 제1 연구를 자세히 설명한다. 이들 마우스 모두를 이전에 106 CF/10μl의 야생형 보르데텔라 페르투시스 토하마 I 균주로 시험감염하였다 (회복기 마우스). 이 연구는 "LIMS 20190306"으로 지칭된다. 제2 연구는 표 7에 자세히 설명되어 있으며, "LIMS 20190307"로 지칭된다.
두 연구 모두는 동일한 날에 105 CF/10μl의 보르데텔라 페르투시스 토하마 I 균주로 시험감염을 하기 위해 설정되었다. 따라서, 회복기 마우스 (LIMS 20190306)는 백신접종된 마우스 (LIMS 20190307)보다 나이가 더 많았다.
차콜-세팔렉신 한천 플레이트에서 콜로니 성장을 카운트함으로써 또는 PCR에 의한 정량화에 의해 측정된 콜로니-형성 단위 (CFU)의 수의 평균의 분포는 로그 정규인 것으로 가정된다. 통계적 방법은 방법 (고전적 또는 정량화에 의한)에 의한, 2개 인자 (백신 및 날짜) 및 그의 상호작용을 사용한 log10 값에 대한 분산 분석 (ANOVA)이다.
<표 6>
Figure pct00008
<표 7>
Figure pct00009
결과:
체액성 면역 반응은 도 23에 나타낸다. 도 23은 28일차에 ELISA에 의해 측정된 개별 항체 역가 항-PPRN IgG 뿐만 아니라 ANOVA 모델 및 이들의 95% 신뢰 구간으로부터 유래된 기하 평균 역가 (GMT)를 나타낸다. 연구 20190306의 그룹은 28 및 56일차에 평가되었음에 주목한다.
28일차에 ELISA에 의해 측정된 항-PRN IgG의 경우, 모든 백신접종된 그룹 (인판릭스, 이지 파이브, OMV LPXA 및 OMV WT)에서 면역원성이 관찰된다. 그러나, 다른 백신접종된 그룹과 비교하여 이지 파이브 백신접종 후 더 낮은 면역원성 (GMR >3)이 관찰된다. 더욱이, 두 시점 D28 및 D56에서 백신접종된 그룹과 비교하여 회복기 마우스에 대해 더 낮은 면역원성 (각각 136 및 346의 GMT)이 크게 나타난다.
보호 평가는 각 수집 시간 (시험감염 후 +2h 및 4, 7, 13, 21일차) 동안 비강 당 콜로니-형성 단위 (CFU)의 수의 평균에 의해 정의된 바와 같은 박테리아 로드에 관한 것이다. 기술 통계는 도 24에 제공된다.
무백신 그룹 (즉, 표 7의 백신 미접종 그룹 1) 및 다른 모든 그룹 간에 박테리아 로드의 유의한 차이가 강조되었으며, 이는 백신접종 또는 재감염 후 비강 집락화에 대한 일부 수준의 보호성 면역 반응을 시사한다.
백신 미접종 동물과 비교하여 회복기 동물 (표 6)에서 10 log 초과의 CFU 감소 (GMR=258)가 관찰되었으며, 이는 양성 대조군으로 이 그룹의 적합성을 확인한다.
전체적으로, 이는 이 모델이 감소된 비강 집락화의 검출을 허용한다는 것을 시사한다.
백신 미접종 동물과 비교하여 및 인판릭스 단독 (각각 GMR= 17.7 & 13.8)과 비교하여 OMV LpxA -인판릭스 (GMR=61) (표 7의 그룹 5) 및 OMV WT- 인판릭스 (GMR=48) (표 7의 그룹 4)에서 1 log 초과의 CFU 감소가 관찰되었지만, 백신 미접종 (회복기 마우스) 그룹 (각각 GMR=4.2 및 GMR=5.4)과 비교해서는 그렇지 않았다.
DTPa와의 공동-투여에서 OMV 백신 둘 모두를 사용한 백신접종은 백신 미접종 마우스 및 인판릭스 (DTPa) 백신접종된 마우스 둘 모두와 비교하여 보르데텔라 페르투시스 토하마 I 균주를 사용한 시험감염 후 비강 집락화를 유사하게 감소시켰다. 이는 DTPa 백신과 비교하여 비인두 집락화의 예방에 대한 OMV의 부가 가치를 나타낸다. 이는 또한 지질 A의 해독이 비강 집락화의 감소에 부정적인 영향을 미치지 않았음을 나타낸다.
Balb/c 마우스에서 폐 청소 모델에서 수행된 효능 연구
이 연구의 주요 목표는 보르데텔라 페르투시스 PRN(-) 균주에 대한 보호 효능 마우스 모델에 DTPa와의 공동-투여에서 dOMV백신의 부가 가치를 평가하는 것이었다.
보호 효능은 콜로니-형성 단위의 수 (CFU - log10)의 평균에 의해 각 수집 시간 (시험감염 후 +2h 및 2, 5 및 8일차) 동안 폐 당 박테리아 로드를 결정함으로써 평가하였다.
실험 설계:
20마리의 6주령 암컷 BALB/c를 표 8에 자세히 설명된 연구 그룹 중 하나에 무작위로 할당하였다. 마우스를 29일차에 5x106 CFU/50μl의 PRN(-) 보르데텔라 페르투시스 균주 FR5388로 시험감염하였다.
<표 8>
Figure pct00010
결과:
체액성 면역 반응은 도 25에 나타낸다. 도 25는 28일차에 ELISA에 의해 측정된 개별 항-PRN IgG 역가 (시험감염 1일전) 뿐만 아니라 ANOVA 모델 및 이들의 95% 신뢰 구간으로부터 유래된 기하 평균 역가 (GMT)를 나타낸다. 도 25의 모든 백신접종된 그룹에서 항-PRN IgG에 의해 볼 수 있는 바와 같이 백신 접종이 확인되었다. 다른 그룹보다 약 3배 더 낮은 추정 GMT를 갖는 "이지-파이브" 그룹을 제외하고 모든 그룹은 유사한 항-PRN 반응을 유도하였다. 이들 차이는 통계적으로 유의한 것으로 검출되었다.
페르투시스에 대한 보호 평가는 각 수집 시간 (시험감염 후 +2h 및 2, 5, 8일차) 동안 폐 당 콜로니-형성 단위 (CFU)의 수의 평균에 의해 정의된 바와 같은 박테리아 로드에 관한 것이다. 기술 통계는 도 26에 제공된다. 도 26에 나타낸 바와 같이, 무백신 그룹 및 다른 그룹 간에 유의한 차이가 강조되었으며, 이는 페르투시스 함유 백신으로 백신접종 후 보호성 면역 반응을 시사한다. 인판릭스 또는 이지 파이브로 면역화된 그룹에서 부분적 보호가 관찰되었다. 인판릭스로 면역화된 그룹 및 공동-투여에서 dOMV를 또한 투여받은 그룹 간에 유의한 차이가 관찰되었으며, 이는 PRNneg 균주의 폐 청소에서 DTPa 백신 위에 dOMV의 부가 가치를 나타낸다.
그룹에 따라 상이한 동력학 프로파일을 수득할 것으로 예상되었으며 (예를 들어 인판릭스 및 이지 파이브는 다른 모든 그룹과 상이해야 함), 이는 통계적 분석에서 그룹 및 날짜 간의 유의한 상호작용에 의해 반영된다.
백신 미접종 그룹과 비교하여 OMV (5일차에 130000 내지 42000의 GMR 및 8일차에 127439와 동등한 GMR) 및 인판릭스 또는 이지 파이브 그룹과 비교하여 OMV (5 및 8일차에 2000 미만의 GMR)로 백신접종 후 더 높은 CFU 감소가 관찰된다. 이들 3개의 OMV 그룹 간에 차이가 관찰되지 않는다. 이들 결과는 OMV LpxA 및 OMV LpxA/LpxD가 비. 페르투시스 PRN 음성 균주 집락화로부터 폐를 청소하는 것을 감소시키는데 OMV WT만큼 효과적이라는 것을 보여주기 때문에 긍정적이다.
인간 PBC의 자극
실험 설계:
자극된 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에 의한 반응원성 바이오마커 프로파일 (선천적 시토카인) 분비를 평가하기 위해 실험을 수행하였다. 3명의 건강한 혈액 공여자로부터 수집된 동결 PBMC를 해동하고, ml 당 5E6 세포의 농도로 96-웰 플레이트에 개별적으로 시딩하였다. 그 후, 세포를 단백질-등가물 제형과 함께 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 표 9에 자세히 설명된 바와 같이 사이에 5배 단계가 있는 8개의 연속 희석액을 제조하였다. 인큐베이션 종료 시, 수확된 배양 상청액에서 멀티플렉스 검정을 사용하여 시토카인을 측정하였다.
테스트를 위해 인간 표준 및 대조군을 제조하였다. 이 테스트에서, 하기 시토카인을 테스트하였다: IL-6, IL-10, TNF-α ("TFNa"), IL-1α ("IL-1a"), IL-1β ("IL-1b") 및 MIP-1α ("MIP1a").
<표 9>
자극 조건
Figure pct00011
결과:
반응원성 메커니즘과 연관된 것으로 공지된 6개의 시토카인 (즉: IL-6, IL-10, TNF-α ("TFNa"), IL-1α ("IL-1a"), IL-1β ("IL-1b") 및 MIP-1 α ("MIP1a"))을 상이한 연속 희석에 대해 배양 상청액에서 측정하였다. 도 27은 자극에 의해 및 시토카인에 의해 3명의 공여자의 평균에 상응한다 (이들 실험 조건에서 세포 생존율을 변경시킨 희석 #1 배제).
도 27은 OMV LpxA가 OMV 야생형 (WT)과 비교하여 인간 PBMC에 의한 감소된 선천적 시토카인 분비를 나타내었음을 보여주며, 이는 LpxA 돌연변이를 보유하는 OMV의 감소된 반응원성을 시사한다.
모든 희석에 대한 시토카인 및 희석 (그러나 여전히 희석 #1은 배제)을 그룹화하는 크루스칼-왈리스 곡선 아래 면적 (AUC) 분석으로부터 (도 27 및 표 9 참조), Al(OH)3 상에 흡착된 dOMV WT가 인판릭스 헥사보다 통계적으로 유의하게 더 높은 선천적 시토카인을 유도한 유일한 조건이었음이 관찰되었다. 다른 조건 간에 통계적 차이가 관찰되지 않았다. LpxA 또는 LpxA/LpxD 상에 돌연변이를 표시하는 비흡착된 dOMV는 OMV WT와 비교하여 인간 PBMC에 의한 감소된 선천적 시토카인 분비 경향을 보였으며, 이는 LpxA 또는 LpxA/D 돌연변이를 보유하는 OMV의 감소된 반응원성을 시사한다. OMV LpxA에 의해 유도된 선천적 시토카인 분비 수준은 벡세로와 동일한 범위 내에 있었고, 전세포 백신보다 더 낮은 경향을 보였다.
본 발명은 단지 예로서 설명되었으며, 첨부된 청구범위에 정의된 바와 같은 본 발명의 범위 및 사상 내에서 변형이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.
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720 attgccggct cggcccgcat tggcaagcgc tgccagattg gcggggccgc caacatttta 780 ggccatttaa ccatcgccga tgggaccgtc atcagcccga cctcgatggt cacccgctcg 840 ctgcccaagg cgggcttcta caccggcatc ttcccgctcc aagaaaacga gcagtgggag 900 aagaatgcgg ccaccttccg ccagctgtac actttacgcg agcgcgtgaa gaaactggag 960 caagctctgg ccgaggggcg ccagagcaac aacggcaact ga 1002 <210> 13 <211> 1062 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LpxD Pseudomonas aeruginosa (codon optimised) <400> 13 atgatgagca ctttaagcta cactttaggc cagctggccg cccatgtggg cgccgaggtc 60 cgcggcgacg ccgatctgcc cattcaaggt ttagccacgc tgcaagaagc cggcccggcg 120 cagctgagct ttttagcgaa cccccagtac cgcaagtacc tcccggagtc gcgcgccggc 180 gccgtgctgc tgaccgccgc ggacgccgac ggcttcgccg gcaccgcttt agtcgtggcc 240 aatccctatt tagcgtacgc ctctttatcg cacctcttcg atcgcaaacc gaaggccgcc 300 gcgggcatcc acccgaccgc gatcgtggcc gccgatgccg aagtggaccc gagcgcgagc 360 gtgggggcct atgccgtcat cgagagcggc gcccgcatcg gcgccggcgt gagcatcggc 420 gcgcattgcg tgattggcgc gcgcagcgtc attggcgaag gcggctggct ggcgccgcgc 480 gtgactttat accatgacgt gaccatcggc gctcgcgtca gcattcagag cggcgccgtc 540 atcgggggcg agggctttgg cttcgccaac gagaagggcg tctggcagaa aatcgcccaa 600 atcggcggcg tcaccatcgg cgacgacgtg gagattggcg ccaacaccac catcgatcgc 660 ggcgcgctgt cggacaccct catcggcaat ggcgtcaagc tggacaacca gattatgatc 720 gcgcacaacg tgcagatcgg cgaccatacc gccatggccg cttgtgtggg cattagcggc 780 agcgccaaga tcggccgcca ctgcatgctg gccggcggcg tgggtttagt gggccatatc 840 gagatttgcg acaacgtgtt cgtcaccggc atgaccatgg tgacccggag catcacggag 900 ccgggctcgt acagcagcgg caccgcgatg caaccggccg ccgagtggaa gaagtcggcc 960 gcccgcatcc gccaactgga tgacatggcg cgccgtttac aacagctgga gaagcgcctc 1020 gccgccgtga ccagcagcgg cgatgccagc agcgacgcct ga 1062 <210> 14 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N-term insert for genomic integration into B. pertussis <400> 14 accatctgca agtaccaggg ccgggccctg gtcgacggcc aactggtcgc cgaagccaag 60 ctgatgtgcg cgatccgtag cctggaagag taa 93 <210> 15 <211> 491 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C-term insert for genomic integration into B. pertussis <400> 15 gcctgcgcat aggcatggtc gccggcgagc cttcgggcga cctgctggcc gggcgcatca 60 tcgccggcct gcaggcccgg gcacccggcg tgcactgcgc cggcataggc gggccccaga 120 tggcggcgcg cggcttcgag gcctggcacc ccatgcatgc gctcacggtg ttcggctaca 180 tcgatgcgtt caagcggatt cccagcctgc tgtcgaccta cggcgacgtc aagcggcgcc 240 tgctggccga gccgccgtcg gtgttcgtgg gcatcgacgc gccggatttc aacctgcgcc 300 tggagcacca gttgcgccag gccggtaccc ccaccgtgca tttcgtcggt ccctcgatct 360 gggcctggcg ctacgaacgc atcaacaaga tccgcgccgc cgtctcccac atgctggtgc 420 tgtttccgtt cgaggaagcg ctctatcgca aggaaggaat cccggtcacc tatgtcggcc 480 atccgctggc c 491 <210> 16 <211> 537 <212> DNA <213> Bordetella bronchiseptica <400> 16 atgcaatttc tcaagaaaaa caagcccctg ttcggcatcg ttacactggc tctggcatgt 60 gccaccgccc aggcgcagcc cactcagggc ggggtcagcc tgcattacgg tattggcgac 120 cactatcagc gcgtcacgct gaactacgaa acccccacgc tctggagcca ccagttcggc 180 ggcaattggg gccgcctgga cctgaccccc gaactgggcg cgtcatactg gtgggccgac 240 ggctcgcgct cgcccggcca cgtgtggcag gccagcgcca ttccgatgtt ccgctggtgg 300 accggcgagc gcttttacat cgaggccggc atcggcgcca cggttttcag cagcaccagc 360 ttcgccgaca agcgcatcgg ttcggccttc cagtttggcg accatatcgg gctgggcttc 420 ctgctgacgc ccagcaaccg catcggcctg cgctattcgc acttctccaa cgccggcatc 480 aaggaaccga accccggcct cgatatcgtg cagctgacct atacgtacca gttctga 537 <210> 17 <211> 296 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Porin promoter (BP0840 promoter; BX640413.1:174494-174789) <400> 17 tccttgagtg aactgggggg tcggcgattt ccagtttctc aaatccggtt cggatgaacc 60 atgcatacaa cctattgaat cttcacagtt agcccgcgcg cgattccgga ttaaggggac 120 aggatgttgc aacttaccaa caatggggcg ggaaaccggc ttttttctga gcctgaccat 180 agccagtcct gccgattttt gatgcaatag cgtcaacttc ccttcgcgga gttagggggg 240 gcggcaggcc ggtatgtgct gcattgctgc tcttgtcact caaatcaacg gagatt 296 <210> 18 <211> 1620 <212> DNA <213> Bordetella pertussis <400> 18 atgactctcg ctacccgatc catgcaaccc catgcggttt cccctggcca ggccaggtcc 60 tggcccctgc ccgcggcggg ctggctgctt ctcgcggtcg gcgtctggct ggccttcctg 120 tcctggatgc ggcccctggc gctgcccgac gaagggcgct acgccggcgt ggcctgggac 180 atgctgcgca acggctcgtt cgcggtgccg ctcatcgacg gcatgccgta tttccacaag 240 ccgccgctgt actactggct ggccgagctg tcgttccgcc tgttcggcgt caacgaatgg 300 gcggcgcgcc tgccctcggc gctggccgcc tgggccagcg ccgtcgcgct gtacctgttc 360 gtgcgccgcc atcgcgacgc cgcgtccgcg acgctctgcg tgctggtgct ggccacgctg 420 ccgctgtttt tcggcggcgc ccagtacgcc aacatggata tgctggtggc cggcatgatc 480 acgctgtgcg tgctggccgg cgccgacacg gcgctgcgtg tccgcggcgg gcaggcctgg 540 cgcgccatgg cgctggccac cggcgtgtgc gccgcgctgg ccatgctggc caaggggctg 600 atcgggctgg tgctgccggg cgcgatcctg ctggcctggc tggcgtggcg gcgcgactgg 660 cgcggcctgc gggccttgct gtggccgccc gccatcctgg cgttcgcggt ggtggccgtg 720 ccctggttct ggctgatgca ggtacgctac ccgggctttt tccagtactt cttcgtccac 780 cagcatttcg agcgtttcgc gcagaccggc ttcaacaatg tgcagccgtt ctggttctac 840 ctgcccgtca tcgcgggcct ggcattgccg tggtcgttgt gggccggcgg cttgctgcgc 900 aagcaattct gggccgccga cgccgacccg gacggcttgc gccgcctggc gctggtctgg 960 ctggcggtca tcgtggcgtt tttctccatg ccgcagtcca agctggtcgg ctacatcatg 1020 ccggtgctgc cgccgctggc cttcctgctg gccgaagtgg tgatgggcgc cttgcgcgac 1080 ccggcggtgg cgcgggccac gcgccgcatg gcgcgcgtca gcgccctggt ggcggtggcc 1140 atctgcgtga ccgcggtgtt cgtggcgtcg ttcaacgccc gcggcagttc gcgcgagctg 1200 gccctgtcgc tgcgcggcga gctgcggccg gacgacacgc tggtggccct gcatacctat 1260 ccgttcgacc tgcagctgta tgcccatgcg gcccggccga tgtgggtggt cgacgactgg 1320 agcaaccccg aaattcccaa gcgcgacaat tggcgcaggg agctctacga cgcggtccag 1380 ttcgagccgg ccctgggcga gcggctgctg gtctcggcag atactttcca gcagcgcctg 1440 tgccaggcgc cggagggcag ccgttactgg gtctggggca cggcggccga cgaagaggcg 1500 tacgcgccgc tgcgcggcca ggcggcgcgc tttgccgacg cgcggcgcag cctctggctg 1560 gtgctggtgg acgaagcctt caaggggcgt gtctgtgacg gaacgcccac aggcggctag 1620 <210> 19 <211> 4395 <212> DNA <213> Bordetella pertussis <400> 19 gtggataaag atgaatcggc attgcggcaa cttgtcgaca tggcgcttgt aggctacgac 60 ggcgtggtgg aagagttgct ggcgctgccc tcggaagagt ccggggatct tgcgggtgga 120 cgggccaaac gagagaaggc cgaattcgcg ctgtttagcg aagcgcccaa cggggatgaa 180 cccatcggcc aggatgctcg tacatggttc tattttccca agtaccgccc ggtggcggtt 240 tccaatttga agaaaatgca ggtggcgatt cgtgctcgtc tcgagcctga gtcattgatc 300 ctgcagtggt tgatcgcact cgatgtctat ctcggcgtgt tgatcgccgc cttgtcccgc 360 actgtgatca gcgacctggt attcgagtat gtcaaggcgc gctacgagat ctactaccta 420 ctgaatcgcg tgccgcatcc gctggcgacg gcgtacctca agcgccgccg ccagcgtccg 480 gtggatcgtt cgggacgtct gggctcggtg ttcgaacacc cgctatggtt cgcctacgac 540 gaattggccg gcaccgtcga tctggatgcc gacatctacg agcaggcgct cgccgaaagc 600 atcgaacgcc gcatggacgg agagccggac gacggcagtc tggataccgc cgaacacgac 660 gtatggcgtt tgtgccgcga cggcatcaat cggggcgagc aggcgatttt ccaggcatcc 720 ggcccatatg gcgtggtcgc ggatgcaggg tatatgcgca ccgttgccga tctggcgtat 780 gccgatgcat tggcggattg cctgcatgcc caactgcgca tccgggcgca aggctcggtc 840 gatagcccgg gagacgagat gccacgcaaa cttgatgcgt gggaaatcgc caagtttcat 900 ctggccgcga cccagcaggc gcgggttgat ctgctcgagg cggcgttcgc gctcgactac 960 gccgccttgc gcgatgtgcg cgtctacggc gattaccgca atgcgctggc tcttcggttc 1020 atcaagcgcg aggccttgcg gttgctgggg gcgcggcgcg gcaacgcctc tacgatgccg 1080 gcggttgcgg ctggcgagta cgacgaaatc gtggccagtg gagcagccaa tgacgcggct 1140 tatgtatcca tggccgccgc gttgatcgcg ggcgtgctct gcgatctcga gagcgcgcag 1200 cgcacgttgc ccgtcgtatt ggccaggttt cggccccttg gcgtgcttgc gcgattcaga 1260 aggctggagc aggaaaccgc gggcatgctg cttggcgacc aggagccgga gcctcggggc 1320 ttcatcagtt ttaccgattt tcgcgatagc gacgcgttcg ccagctacgc ggagtatgcg 1380 gcccagttca acgactatat cgatcaatac agcatactcg aggcgcagcg gctggcgcgg 1440 attctggccc tgggctcgcg gatgacggtc gatcaatggt gccttcccct gcagaaagta 1500 cggcactaca aggtgctgac atcgcagcca gggctgatcg cgcgtggaat cgaaaatcac 1560 aacaggggca ttgaatattg cctggggcgg ccgccgctga ccgatctgcc gggtcttttc 1620 accatgttcc agctccatga ttccagctgg ctgttggtat cgaacatcaa cggtgagctt 1680 tggtctgatg tccttgcgaa cgctgaggtg atgcagaatc ctacgctggc cgcccttgcc 1740 gagccgcaag gccgctttcg aaccggccgt cgaacgggcg ggtggtttct cggcggcccc 1800 gcgactgaag ggccaagtct gcgcgacaac tacctcctca aattgaggca gagcaatccg 1860 gggctggatg tcaagaaatg ctggtatttc gggtatcggc aagagtacag gctgcccgca 1920 ggcgcgctgg gtgtgccgct attcgctgtt tccgttgccc tgaggcacag tctggacgac 1980 ctcgcggcgc acgcgaagtc cgctttgtac aaacccagcg aatggcagaa gttcgccttc 2040 tggatcgtgc cgttctaccg ggaaatattc ttttcgaccc aggatcgttc ctatcgggtc 2100 gatgtgggga gcatcgtctt tgattcgatt tccttgcttg cctcggtgtt cagcatagga 2160 gggaagttgg gcagtttcac ccgtacccag tatggcaacc tgcgcaattt cgtggtgcgg 2220 caacgcatcg cggggttgag cgggcagcgc ttgtggcgtt cggtgctcaa ggagcttccg 2280 gcattgatcg gagccagcgg gttgcgcctg tcgcgttcgc tgctcgtcga tctgtatgag 2340 atcttcgagc ccgtgcctat ccgtcggctt gtcgcgggat tcgtgagcgc cactacggtc 2400 ggcgggcgta accaggcctt cctgcggcag gcattctccg ctgccagttc ctcggccggg 2460 cgcacggggg gccaattggc aagcgaatgg cggatggccg gcgtggacgc caccggtttg 2520 gtcgagtcca cgtcgggcgg caggtttgag ggcatctaca cgcgcggctt gggaccgttg 2580 agcgagtgca ccgagcactt catcgtcgaa tccgggaatg cctacagagt catctgggat 2640 gcatacacgc atggttggcg cgtggtcaat gggcgtttgc cgccgaggct gacctatacc 2700 gttccggttc ggctgaacgg gcaaggccac tgggagacgc atctggatgt ccctggccgg 2760 ggtggggcgc cggaaatctt cggacgcatc cgcacgcgta atctggtcgc ccttgccgcc 2820 gagcaggccg cgccgatgcg ccgcctgctc aaccaggcga ggcgtgtggc gctcaggcat 2880 atcgatacct gcaggagcag gcttgcgttg ccgcgcgctg aatccgatat ggacgcggcg 2940 atccggattt tcttcggaga gccggacgcc ggccttcgcc agcgcatcgg gcgacgcctg 3000 caggaggtca gggcctatat cggcgatctg agtccggtca atgacgtgct gtaccgggcg 3060 ggatatgacc tcgacgatgt cgcaacgctg tttaacgcag tggaccggaa cacgtcgctg 3120 ggcaggcagg ctcggatgga gttgtatctg gatgccattg tcgatttgca tgccaggctc 3180 ggctatgaaa atgcgcgttt tgtcgacctg atggcgttcc acctgctcag cctgggccat 3240 gccgcgacgg ccagtgaggt cgtggaggcc gtttcgcccc ggctgctggg caatgtgttc 3300 gatatctcga acgtcgccca gctcgaacgc ggtatcggga atcccgccag caccggtctt 3360 ttcgtcatgc tgggcgccta ttcggaatcg tcgcccgcga tattccagtc gttcgtgaac 3420 gatatatttc ccgcatggcg acaggcttcc ggcggggggc cgctggtatg gaacttcggt 3480 cctgccgcca tcagcccgac gcgcctggat tacgcaaata ccgatatcgg attgctcaac 3540 catggggata tttccccgct gcgcgccagg ccgccattgg gcggcaggcg cgacatcgat 3600 cttcctccgg ggctggatat ttcgttcgtg cgttacgacc gcccggtgcg catgtccgcg 3660 ccgcgtgcgc tcgacgccag cgtcttcagg ccggtcgacg ggcctgtcca tggctatatt 3720 caatcgtgga cgggggctga gatcgaatat gcgtacggcg cgcccgcagc ggcacgcgag 3780 gtcatgctga ccgacaatgt gcggatcatc agcatcgaga acggcgatga aggggcgatc 3840 ggggtgcgcg tgaggctcga cactgttccc gtcgcgacgc cgctcatcct gactggcggc 3900 tccttgagcg ggtgcacgac gatggttggg gtcaaggagg gctacctggc cttctaccac 3960 actggcaagt cgaccgaact cggggattgg gcgactgcgc gcgaaggcgt acaggcgctt 4020 taccaggccc atttggcgat ggggtacgcg ccgatctcaa tcccggcgcc gatgcgcaat 4080 gacgacttgg tcagcatcgc cgcgacctac gaccgggcgg tcattgccta tctgggcaag 4140 gatgtgccgg gaggcggcag tacgcgcata acgcgtcacg atgagggggc gggcagtgtg 4200 gtttcgttcg actacaacgc agcagtccag gcgtcggccg ttccccgcct cggccaggta 4260 tacgttctga tttccaacga cggacaaggg gcgcgagccg tcctgctggc ggaggatctg 4320 gcctgggcag gcagcggcag tgccttggat gtgttgaacg aacgattggt gacgttgttt 4380 ccggcgccgg tctga 4395 <210> 20 <211> 1427 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Construct for ArnT KO <400> 20 gtgtgccagc tgggaaatca tcgtcgtcga cgacggcagc accgacgata ccgccgagct 60 gatggcgcaa tggtccgcgg tcgagggcat ccgctacgtg cagctgtcgc gcaatttcgg 120 caaggaggcc gccctgacgg ccggcctgga agccgcggac ggcgacgccg tcatctgtct 180 ggacgccgac atgcagcatc cgcccgaact gataggcgac atgctggcgg cctggcgcaa 240 cggcgccgac atggtctacg cggtgcggcg ccagcgcgac gacgagccgt ggttcaagcg 300 tgtcggcgcc cgcgcgttct accgcctgct gagcacggcg cgcggcgtcg aggtgccgcc 360 gcacgcgggc gacttccgcc tgatggaccg ccgcgtggtc gaggccctgg tggcgctgcc 420 cgaacgcacc cgcttcatga aggggctgta tgcctgggtg ggcttcaagt cgcaggccgt 480 gccctacacc ccgcaagcgc gccgccatgg cgccagccac ttcagcgcct ggaagctgtt 540 tcgcctggcc tgcgacggcc tgaccgcctt caccacctgg ccgctgcggc tggtcagcct 600 catcggcgtg ctgttcgcgc tgctgtcgct gtcctacggc ggttacctgg tggccgacta 660 tctcatcagc ggcaacgcgg tgtccggctg gaccaccatc gtcaccgcgc tgctgttctt 720 tgccggcatc aacctgattt cgctgggcgt ggtgggcgag tacgtggccc ggatcttcga 780 cgaagtgaaa ggccggcccc tgttcatcgc ccgtcaacgc cgcgggcgcg ccaagcgcgc 840 ggccaaggcg cgttcccaat gactctcgct acccgatcca tgcaacccca tgcggtttcc 900 cctggccagg ccaggtcctg gcccctgccc gcggcgggct ggctgcttct cgcggtcgga 960 tagctcgagt gacggaacgc ccacaggcgg ctagcgacga atgtcaggaa ggccagcccg 1020 atcaacacca gggccagcag cacgtcatag ggcagcgacg tggcgtgcag cagccaggca 1080 tatgacaact cattgatggc gaaacccagg gctgacacaa ggaagaaacg ccgggcggct 1140 atggtccagg atgccgcaag gtggcggaaa gtgagtctga aatgaccagt gaacgatacg 1200 acgaaggcca acagccagcc caccacgttg gcccccagcg ggggcaggcc ggcccattcc 1260 acgcaggcga ccgcgacggc ccaatgggtg gcggccgcgg cgcatccgac ggcaatgaac 1320 caggcaatct gtcgcagcag gccgcgcatg tcgaagaggt gtctcccttg aggaaccagg 1380 ccggcgatgt ccgttgccgg cgcatcgcgg tgtgcggcga tgatttt 1427 <210> 21 <211> 2705 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Construct for replacing DNT with LpxD P. aeruginosa <400> 21 cgccgccagc atttccgagg cgctcggcta cgagcccggc gtcaacggta tccacgcgcc 60 agcggctgcc tgagtccggc ctggcctggc gataaggcgg tgcgtgcagg cgtggctgcg 120 atcgcaccgt aaccgttggt gcggcgtcct gatctccgga gcgttcggct gggagatggc 180 tgcgcatccg atgggccggt tcttgtgtgt ttgctagcct gactaacagg cgacctgggg 240 tcgtttccgg tttccggtca ggggcaaaca aacgtggata aagatgaatc ggcattgcgg 300 caacttgtcg acatggcgct tgtaggctac gacggcgtgg tggaagagtt gctggcgctg 360 ccctcggaag agtccgggga tcttgcgggt ggacgggcca aacgagagaa ggccgagttc 420 gcgctgttta gcgaagcgcc caacggggat gaacccatcg gccaggactg agagctctcc 480 ttgagtgaac tggggggtcg gcgatttcca gtttctcaaa tccggttcgg atgaaccatg 540 catacaacct attgaatctt cacagttagc ccgcgcgcga ttccggatta aggggacagg 600 atgttgcaac ttaccaacaa tggggcggga aaccggcttt tttctgagcc tgaccatagc 660 cagtcctgcc gatttttgat gcaatagcgt caacttccct tcgcggagtt agggggggcg 720 gcaggccggt atgtgctgca ttgctgctct tgtcactcaa atcaacggag attggtacca 780 tgatgagcac tttaagctac actttaggcc agctggccgc ccatgtgggc gccgaggtcc 840 gcggcgacgc cgatctgccc attcaaggtt tagccacgct gcaagaagcc ggcccggcgc 900 agctgagctt tttagcgaac ccccagtacc gcaagtacct cccggagtcg cgcgccggcg 960 ccgtgctgct gaccgccgcg gacgccgacg gcttcgccgg caccgcttta gtcgtggcca 1020 atccctattt agcgtacgcc tctttatcgc acctcttcga tcgcaaaccg aaggccgccg 1080 cgggcatcca cccgaccgcg atcgtggccg ccgatgccga agtggacccg agcgcgagcg 1140 tgggggccta tgccgtcatc gagagcggcg cccgcatcgg cgccggcgtg agcatcggcg 1200 cgcattgcgt gattggcgcg cgcagcgtca ttggcgaagg cggctggctg gcgccgcgcg 1260 tgactttata ccatgacgtg accatcggcg ctcgcgtcag cattcagagc ggcgccgtca 1320 tcgggggcga gggctttggc ttcgccaacg agaagggcgt ctggcagaaa atcgcccaaa 1380 tcggcggcgt caccatcggc gacgacgtgg agattggcgc caacaccacc atcgatcgcg 1440 gcgcgctgtc ggacaccctc atcggcaatg gcgtcaagct ggacaaccag attatgatcg 1500 cgcacaacgt gcagatcggc gaccataccg ccatggccgc ttgtgtgggc attagcggca 1560 gcgccaagat cggccgccac tgcatgctgg ccggcggcgt gggtttagtg ggccatatcg 1620 agatttgcga caacgtgttc gtcaccggca tgaccatggt gacccggagc atcacggagc 1680 cgggctcgta cagcagcggc accgcgatgc aaccggccgc cgagtggaag aagtcggccg 1740 cccgcatccg ccaactggat gacatggcgc gccgtttaca acagctggag aagcgcctcg 1800 ccgccgtgac cagcagcggc gatgccagca gcgacgcctg aaagcttttg aacgaacgat 1860 tggtgacgtt gtttccggcg ccggtctgaa tcgcattccg cgaaacggcg ggcgcgcagg 1920 cctcgcccga tcggccggcc gggccgcgcg atgcgcggcc cggccgcatt gggacgcggc 1980 ctttattgct tttccacgcc cgccttcttg aacagctcgg cccattgcgg cacctgctgc 2040 ttgaccttgg cttgcagcgc ctcgggatta gcctcgttgg tcagcacctc ggcgcccagc 2100 tgcttcatgc gctcctggaa cttgggatcg gccaggccgg cctgcaggct cttgaccagc 2160 ttgtcgacca ccggcttggg cgtgcccttg ggggcccaca tgccgtgcca gatacccact 2220 tcgaaaccct tgtagccgga ctcgtccatg gtgggcaggt cgggcagggt gggcacgcgc 2280 ttgaggctgg tgaccgcgta ggccttcacc ttgccgctgg tgatctgctg cgtggtattg 2340 gtggtctggt cgcacatcag gtcgacctgc ttgcccagca gatcgttcat ggccggcgcc 2400 gtgcccttgt agggaatggt cagcaggttg acgcccagcg cctcgaccag catggtgccg 2460 cacaagtggc tggccgcgcc gatgccggca ttggccagtg aaatcttgtc ggcgttcttc 2520 ttgacgtact cggccagttc cttgatgttg ttgggcggga aatcgccgcg ggcaatgatg 2580 gtcatcggca cgtccaccac caggccgatg ggctcgaagc tggtgtaggg ctcgtagccg 2640 gggttcttgt acagcgaggg cgcggtcgag aagccggcgt gcatgagcag gatcgagtag 2700 ccgtc 2705 <210> 22 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> LpxE F. novicida (optimized for expression in B. pertussis) <400> 22 atgctgaagc agaccctcca gacgaacttc caaggtttca aggacatctt caagaagccg 60 aagctgcaca accacaagct gccccgctac ctccagctga agtacacctt catcccttta 120 ctgattttag tgatcttcgc gtactacaac ctcgataccc ccgtcgagaa ctacatcaag 180 cacagcatgc cgaacatcgt cggcgtcatc tttggcaaga tcacggacgt cggcaaggcc 240 gagtacattt taatcatctg cggcgtgatc gttttagccc gtttattcac cgacagccag 300 aagctgagcg cgaacacgcg cgcgatgttc gacaaggtct cggcctatgc cggcttcatt 360 ttagccacgg tggccatctc gggcattctg ggccagattt taaagatgat catcgggcgc 420 gcgcgcccca agttcttttt agagtatggc agccactact tccaacactt ccacgccccc 480 ggctacgact ttgccagcat gcccagcggc cactcgatca cggtcggcgc catgttcatc 540 gccttcttct acatcttccc gaagctgcgc tatttctggt atttactcat cgtcgtgttc 600 gccggctcgc gcatcatggt cggctctcac tatccgagcg acgtcatctt cggcgtcgcg 660 ttcggctgct actgcaccgc ctatatctac tactggatgc gcaatcgcga gatcatctaa 720 <210> 23 <211> 735 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> LpxE R. leguminosarum (optimized for expression in B. pertussis) <400> 23 atgcgcgcct tctgggcctc tttagaccgc cgctggcgcc gcagcggcgt gggcatgccg 60 ccgctgcgct ggcaagcatg tttatttgtc actttaaacg cggtgatttt aagcatgctg 120 ctgttcgacg cgccgatcgg cgcgagcaag gcccccgccc cggtgaagca tctgggggaa 180 ctgctgacgg gcttcggcga ctcggcttgg ctgatctaca ccagcatctt attattcttc 240 caaggtcgcg ccggctacaa gctgctgaaa acggcccgct cgaaggccca agccttatat 300 gtcagctgga tcggcgccta tctgttcttc accgtggtct tcagcggttt actggccaat 360 ctgctgaagc gcgccatcgg ccgcgcccgc ccggaccatt tccacgacta cggcatgttc 420 agcttcgccc cgttctcggg ccacagcgcc ttcgagagct tcccgagcgg ccatagcacc 480 accgtgggcg cctttttcgc cgcctttgct ttactgttcc cgcgctaccg cgtggcgttc 540 atcgcttgtg ccatctggct gggcatgacc cgcgtgatgg tgggcgccca ttacccgagc 600 gatgtcatcg ccggtttagc ctttggcgct tggttctctt tactgaccgc catcgtgttc 660 gcgcgctgtg gtttactgtt caagctggcc ccggacggct ggccgctcgc gaagcgttta 720 ttccgcaccg cgtaa 735 <210> 24 <211> 669 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> LpxF F. novicida (optimized for expression in B. pertussis) <400> 24 atggcccgct tccacatcat tttagggctg gtggtgtgct tcttcgcttg gatcttcttt 60 ttaatcttcc cgaatttaga catccagttt gccggccact tctacaactc gagcgcccat 120 cagttcatcg gcggctacga cgggtttctg ggctttttac actggttcgc gcgcttcttc 180 cctatcttct tcagcatcat cgtgatttta tttttactgg gctctttatt cattgacaag 240 ttcaagatca agtaccggaa ggcgatcttt ttcatcgccg tgtgtttatg gatcggcccc 300 ggtttagtcg tcaactacgt cttcaaggac cactggggcc gcccgcgccc ggtcatggtc 360 gagcagttca acggcgacaa gatcttccag ccgcccttcg tgatctcgag ccagtgcgac 420 aagaactgca gcttcgtctg cggcgacgcc agcatgggct tctggctgtt cgcgttcatg 480 ccgctgctcg ccacccgcaa gaagaagctg gtggccttca tcgccgccgt ggtcgccggc 540 ggcggtttag gcctcatgcg catgagccaa ggcggccact tctttagcga cgtcgtgttt 600 tgcggcatct tcgtgtacat cagcacttgg gtggtctacg ccctcatgta ccgcaagaag 660 gaatactaa 669

Claims (20)

  1. (i) LpxA 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 게놈 LpxA 유전자; 및/또는
    (ii) 이종 LpxD 유전자의 적어도 하나의 게놈 삽입
    을 포함하며, 여기서 LpxA 단백질은 서열식별번호(SEQ ID NO): 1에 비해 위치 170에서의 돌연변이 및/또는 위치 229에서의 돌연변이를 포함하는 것인,
    재조합 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis) 박테리아.
  2. 제1항에 있어서, LpxA 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 게놈 LpxA 유전자를 포함하고, 여기서 LpxA 단백질이 서열식별번호: 1에 비해 위치 170에서의 치환 및/또는 위치 229에서의 치환을 포함하는 것인 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, LpxA 단백질이 서열식별번호: 1에 비해 위치 170에서의 세린 잔기 및/또는 위치 229에서의 알라닌 잔기를 포함하는 것인 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
  4. 제3항에 있어서, LpxA 단백질이 서열식별번호: 1에 따라 넘버링된 경우 (i) 위치 170에서의 세린 잔기 및 (ii) 위치 229에서의 알라닌 잔기를 포함하는 것인 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
  5. 제4항에 있어서, 서열식별번호: 1 또는 2와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 LpxA 단백질을 코딩하는 LpxA 유전자를 포함하는 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
  6. 제4항에 있어서, 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 LpxA 단백질을 코딩하는 LpxA 유전자를 포함하는 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 LpxD 유전자가 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4와 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 LpxD 단백질을 코딩하는 것인 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
  8. 제6항에 있어서, 이종 LpxD 유전자가 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4와 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 LpxD 단백질을 코딩하는 것인 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
  9. 제7항에 있어서, 이종 LpxD 유전자가 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 LpxD 단백질을 코딩하는 것인 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 LpxA 유전자가 불활성화되고/거나 내인성 LpxD 유전자가 불활성화된 것인 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 A를 생산하고, 여기서 (i) C3' 아실 쇄의 적어도 30%는 길이가 약 C10 내지 약 C12이고/거나; (ii) C2' 아실 쇄의 적어도 30%는 길이가 약 C10 내지 약 C12이고/거나; (iii) C2 아실 쇄의 적어도 30%는 길이가 약 C10 내지 약 C12인 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 특히 TLR4 자극 검정, 특히 인간 TLR4 자극 검정을 사용하여 측정될 때 모 균주에 의해 생산된 지질 A의 것과 비교하여 감소된 내독성 활성을 갖는 지질 A를 생산하는 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아의 박테리아 집단의 성장 곡선이 모 균주의 집단의 성장 곡선에 필적하는 것인 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아.
  14. 막 내로 혼입된 변형된 지질 A를 포함하는 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 재조합 보르데텔라 페르투시스 박테리아로부터 유래된 단리된 외막 소포 (OMV)이며, 여기서 지질 A의 실질적으로 모든 C3' 아실 쇄는 C10의 길이를 갖고/거나, 여기서 지질 A의 실질적으로 모든 C2 및 C2' 아실 쇄는 C12의 길이를 갖는 것인 단리된 외막 소포 (OMV).
  15. 제13항에 있어서, 피부 괴사성 독소가 실질적으로 없고/거나, 내인성 유전적으로 해독된 백일해 톡소이드를 함유하는 단리된 외막 소포.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 단리된 OMV 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 면역원성 조성물.
  17. 제16항에 있어서, (1) 백일해 톡소이드 (PT), (2) FHA, (3) 퍼탁틴 (PRN), (4) FIM2/FIM3, (5) 아데닐레이트 시클라제, (6) 디프테리아 톡소이드 (DT), (7) 파상풍 톡소이드 (TT), (8) 불활성화된 폴리오 바이러스 (IPV), (9) B형 간염 표면 항원 및 (10) Hib PRP로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가 항원을 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  18. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 적합한 포유동물, 예를 들어 인간에서 면역 반응을 유도하는데 사용하기 위한 OMV 또는 면역원성 조성물.
  19. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 예방에서 또는 백신으로서 사용하기 위한 OMV 또는 면역원성 조성물.
  20. LpxA 및 LpxD로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자를 박테리아의 게놈 내로 안정적으로 통합하는 것을 포함하는, 보르데텔라 페르투시스 박테리아의 지질 A의 반응원성을 조정하는 방법이며, 여기서
    (i) LpxA 유전자는 서열식별번호: 1 또는 2와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 LpxA 단백질을 코딩하고, 여기서 단백질은 서열식별번호: 1 또는 2에 따라 넘버링된 경우 위치 170에서의 세린 (S170) 및/또는 위치 229에서의 알라닌 (A229)을 포함하고/거나;
    (ii) LpxD 유전자는 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4와 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 LpxD 단백질을 코딩하는 것인 방법.
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