CN114502193A

CN114502193A - 免疫原性组合物

Info

Publication number: CN114502193A
Application number: CN202080069731.5A
Authority: CN
Inventors: N·I·德沃斯; S·C·西蒙斯
Original assignee: Glaxosmithkline Biology Co ltd
Current assignee: Glaxosmithkline Biology Co ltd
Priority date: 2019-10-01
Filing date: 2020-09-30
Publication date: 2022-05-13
Also published as: MX2022003871A; AU2020358775A1; CA3156017A1; WO2021064050A1; EP3799884A1; IL291559A; JP2022550560A; US20220339277A1; KR20220070279A; EP4038090A1; BR112022005345A2

Abstract

本发明涉及细菌菌株，特别是用于疫苗领域，特别是预防或治疗由博德特氏菌属细菌引起的感染的领域。

Description

免疫原性组合物

技术领域

本发明涉及疫苗领域，特别是预防或治疗由博德特氏菌属细菌，特别是百日咳博德特氏菌引起的感染。

背景技术

百日咳由百日咳博德特氏菌引起，是高度传染性的气道感染。急性感染可引起以呼吸衰竭、肺动脉高压、白细胞增多和死亡为特征的严重疾病。百日咳是一种疫苗可预防的疾病，全世界都使用无细胞百日咳(aP)或全细胞百日咳(wP)疫苗。然而，该疾病在接种疫苗的人群中持续存在，并且流行病学数据报道了近年来全世界百日咳发病率的增加。

已经假定了几种假设，包括百日咳菌株的进化和与wP疫苗相比，aP疫苗的保护持续时间缩短。旨在控制百日咳再次出现的研究领域之一是针对新疫苗的开发。

源自病原体的囊泡已用于开发免疫原性组合物如疫苗[1]。外膜囊泡(OMV)或其衍生物的使用可能以其天然形式递送广谱的抗原。

OMV包含细菌脂多糖(LPS)，所述细菌脂多糖(LPS)由高度可变的O抗原、较低可变的核心寡糖和称为脂质A的高度保守的脂质部分组成。细菌脂寡糖(LOS)具有类似的脂质A结构，具有与LPS相同的一系列功能活性，但它们缺乏O-抗原单位。在本领域中，术语“LPS”通常用于指LPS和LOS细菌糖两者。

然而，OMV中LPS/LOS的存在从临床和监管的观点来看可能存在问题。例如，当LPS/LOS在人体内降解时，可引起过量促炎性细胞因子的产生。通过它们与人TLR4的相互作用，它们可能引起许多副作用(反应原性)，例如发热、寒战、休克和各种其它症状，这取决于特定生物体和患者的状况。

LPS/LOS的内毒素活性主要由其脂质A部分的组成决定，所述脂质A部分由被一个或两个磷酸酯基团取代的葡糖胺二糖和可变数量的酰基链组成[2]。

WO2018/167061[3]描述了来源于铜绿假单胞菌(LpxA_Pa)或脑膜炎奈瑟氏球菌(LpxA_Nm)的LpxA变体用于减少百日咳博德特氏菌中C3'酰基链的长度的用途。外源LpxA基因从质粒表达，而基因组的内源LpxA基因被敲除。LpxA_Pa的附加型表达具有减小一些酰基链长度的作用，并且作者注意到TLR4刺激减少。然而，菌株表现出强生长缺陷。此外，LpxA_Nm的表达是致死性的。当来源于铜绿假单胞菌的LpxD变体在百日咳博德特氏中附加型表达时，观察到类似的强生长缺陷。尽管结果证实通过脂质A工程可以改变反应原性，但是菌株的生长缺陷是这些菌株在疫苗生产中使用的主要障碍。

因此，仍然需要适用于制造免疫原性组合物如疫苗的改进。

发明内容

申请人已经开发了新的重组百日咳博德特氏菌菌株，其克服了本领域中观察到的问题，并且特别适用于制备全细胞抗原和/或外膜囊泡组分。这些组分可用于免疫原性组合物如疫苗。

在第一方面，本发明涉及重组百日咳博德特氏菌。特别地，本发明涉及重组百日咳博德特氏菌，其包含：至少一个编码LpxA蛋白的基因组LpxA基因，其中所述LpxA蛋白包含相对于SEQ ID NO：1的170位的突变和/或229位的突变；和/或至少一个异源LpxD基因的基因组插入。

在该第一方面，本发明优选涉及包含至少一个编码LpxA蛋白的基因组LpxA基因的重组百日咳博德特氏菌，其中LpxA蛋白包含相对于SEQ ID NO：1的170位突变和/或229位突变。

来自百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)的野生型LpxA蛋白(LpxA_Bpe)的氨基酸序列以SEQ ID NO：1提供。来自副百日咳博德特氏菌(Bordetella parapertussis)的LpxA蛋白(LpxA_Bpa)的氨基酸序列以SEQ ID NO：2提供。

本发明可以涉及包含至少一个编码LpxA蛋白的基因组LpxA基因的重组百日咳博德特氏菌，其中LpxA基因来源于副百日咳博德特氏菌(LpxA_Bpa)。

在这样的实施方案中，本发明涉及包含至少一个编码LpxA蛋白的基因组LpxA基因的重组百日咳博德特氏菌，其中LpxA蛋白具有SEQ ID NO：2。

本文所用的术语“突变”是指与参照蛋白或多肽，特别是野生型蛋白或多肽的氨基酸序列相比，在蛋白或多肽的氨基酸序列中氨基酸残基的缺失，添加或置换。

术语“置换”当指氨基酸序列时，是指不同氨基酸或氨基酸部分的氨基酸变化。例如，当提及LpxA时，置换是指相对于SEQ ID NO：1的氨基酸变化。使用以下注释“(野生型蛋白质中的氨基酸残基)(氨基酸位置)(突变蛋白质中的氨基酸残基)”来提及蛋白质序列中一个特定位置处的氨基酸置换。例如，G229A指在参考蛋白的氨基酸序列(此处为SEQ IDNO：1)的229位的甘氨酸(G)残基被丙氨酸(A)残基(在突变体中)置换。

特别地，170位的突变是相对于SEQ ID NO：1的置换。更具体地，170位的突变是甘氨酸的置换。还更具体地，170位的突变是用丝氨酸置换甘氨酸(G170S)。

特别地，229位的突变是相对于SEQ ID NO：1的置换。更具体地，229位的突变是甘氨酸的置换。更具体地，229位的突变是用丙氨酸置换甘氨酸(G229A)。

特别地，相对于SEQ ID NO：1，LpxA蛋白包含170位的突变和229位的突变。还更具体地，170位的突变是甘氨酸的置换，229位的突变是甘氨酸的置换。还更具体地，170位的突变是甘氨酸被丝氨酸置换(G170S)，和229位的突变是甘氨酸被丙氨酸置换(G229A)。甚至还更具体地，LpxA蛋白在170位包含丝氨酸残基，在229位包含丙氨酸残基。特别地，除了170位和/或229位的突变之外，LpxA蛋白与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，LpxA蛋白与SEQ ID NO：2具有90％的序列同一性。在一些实施方案中，LpxA蛋白具有SEQ IDNO：2的氨基酸序列(即其具有100％序列同一性)。

来自睾丸酮丛毛单胞菌的LpxD蛋白(LpxD_Ct)的氨基酸序列以SEQ ID NO：3提供。来自铜绿假单胞菌的LpxD蛋白(LpxD_Pa)的氨基酸序列以SEQ ID NO：4提供。

特别地，异源LpxD基因编码与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的LpxD蛋白。更具体地，异源LpxD基因编码与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少95％氨基酸序列同一性的LpxD蛋白。还更具体地，异源LpxD基因编码与选自SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有100％序列同一性的LpxD蛋白。在一些实施方案中，异源LpxD基因编码具有SEQ IDNO：3的氨基酸序列的LpxD蛋白。在一些实施方案中，异源LpxD基因编码具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的LpxD蛋白。

术语“异源LpxD基因”是指来自与其导入的宿主生物的物种不同的物种中的LpxD基因或核苷酸序列，在本发明的上下文中，异源LpxD基因或核苷酸序列通常不在百日咳博德特氏菌的野生型菌株中发现。在某些实施方案中，可以对异源LpxD基因的核苷酸序列进行密码子优化以在百日咳博德特氏菌中表达。

术语“基因组”是指细菌细胞基因组，即染色体DNA，而“基因组插入”用于指稳定整合到细菌细胞基因组中，从而排除瞬时或附加型表达，例如质粒中基因的表达。

在本发明的第一方面，相对于野生型百日咳博德特氏菌，重组百日咳博德特氏菌中内源LpxA基因的表达或活性被修饰、降低、抑制或灭活。在本发明的一些实施方案中，相对于在野生型百日咳博德特氏菌中观察到的表达或活性，重组百日咳博德特氏菌中内源LpxD基因的表达或活性可以被修饰、降低、抑制或灭活。在本发明的一些实施方案中，相对于野生型百日咳博德特氏菌，重组百日咳博德特氏菌中内源LpxA基因和内源LpxD基因的表达或活性被修饰、降低、抑制或灭活。

在一些实施方案中，通过敲除内源LpxA基因来降低、抑制或灭活内源LpxA基因的表达或活性。在一些实施方案中，通过经由例如敲入替换内源LpxA基因来修饰、降低、抑制或灭活内源LpxA基因的表达或活性。在一些实施方案中，内源LpxA基因的表达或活性通过突变内源LpxA基因，特别是通过170位和/或229位的突变来修饰。在一些实施方案中，内源LpxD基因的表达或活性通过敲除内源LpxD基因而降低、抑制或灭活。在一些实施方案中，通过经由例如敲入替换内源LpxD基因来修饰、降低、抑制或灭活内源LpxD基因的表达或活性。作为非限制性实例，敲除可以通过去除(例如删除)部分或全部内源基因或通过灭活激活相应内源基因表达的内源启动子来实现。

令人惊奇的是，本发明的重组百日咳博德特氏菌菌株不显示本领域观察到的生长异常。

特别地，本发明的重组百日咳博德特氏菌群体的生长曲线与百日咳博德特氏菌的野生型亲代菌株群体的生长曲线相当。更具体地，重组百日咳博德特氏菌的群体的生长曲线与百日咳博德特氏菌的野生型亲代菌株的群体的生长曲线相当。例如，重组百日咳博德特氏菌群体和野生型革兰氏阴性菌群体在标准发酵过程中的经过时间和生长速率的值是相当的。更具体地，重组百日咳博德特氏菌群体和野生型百日咳博德特氏菌群体的经过时间和生长速率的值变化小于20％，例如小于15％、小于10％或小于5％。还更具体地，重组百日咳博德特氏菌群体和野生型百日咳博德特氏菌群体的经过时间和生长速率的值基本上相似。

本发明的重组百日咳博德特氏菌菌株表达脂质A，当与由野生型百日咳博德特氏菌表达的脂质A相比时，特别是当使用TLR4刺激测定，特别是人TLR4刺激测定，例如通过重组HEK-TLR4报告细胞系的NF-kB诱导测量时，其表现出降低的内毒素活性。本领域技术人员知道其它合适的测定。

具体地，根据本发明的重组百日咳博德特氏菌菌株来源于Tohama I亲代菌株，并且更具体地是Tohama I PTg菌株，即表达遗传脱毒的百日咳类毒素的Tohama I菌株。如本文所用，术语“亲代菌株”在本领域中具有其一般含义，是指用作构建重组菌株的起始微生物的百日咳博德特氏菌菌株。亲代菌株通常是本发明的重组菌株的特征与其比较的野生型或比较菌株。除了本文所述的本发明的一种或多种遗传修饰外，本发明的重组百日咳博德特氏菌与其亲代菌株通常是同基因的。

在本发明的第二方面，提供了外膜囊泡(OMV)，特别是来源于第一方面的重组百日咳博德特氏菌的外膜囊泡群体。还提供了来源于第一方面的重组百日咳博德特氏菌的全细胞抗原。

在本发明的第三方面，提供了包含至少一种根据第二方面的OMV或OMV群体和药学上可接受的赋形剂的免疫原性组合物。特别地，免疫原性组合物还可以包含佐剂。在一些实施方案中，本发明的免疫原性组合物可包含除OMV或OMV中存在的抗原外的至少一种抗原。在本发明的优选实施方案中，至少一种另外的抗原选自(1)百日咳类毒素(PT)、(2)FHA、(3)百日咳杆菌粘附素(PRN)、(4)FIM2/FIM3、(5)腺苷酸环化酶、(6)白喉类毒素(DT)、(7)破伤风类毒素(TT)、(8)灭活的脊髓灰质炎病毒(IPV)、(9)乙型肝炎表面抗原和(10)Hib PRP。

在本发明的第四方面，提供了用于在合适的哺乳动物中诱导免疫应答的根据第一方面的重组百日咳博德特氏菌、第二方面的至少一种OMV或OMV群体或第三方面的免疫原性组合物。

具体地，提供了根据第一方面的重组百日咳博德特氏菌，第二方面的至少一种OMV或OMV群体或第三方面的免疫原性组合物，其用于治疗和/或预防，例如用作疫苗。

特别地，提供了在合适的哺乳动物中诱导免疫应答的方法，其包括向所述合适的哺乳动物施用根据第一方面的重组百日咳博德特氏菌、第二方面的至少一种OMV或OMV群体或第三方面的免疫原性组合物。

具体地，提供了根据第一方面的重组百日咳博德特氏菌、第二方面的至少一种OMV或OMV群体或第三方面的免疫原性组合物，其用于制备药物，例如用于治疗和/或预防，例如用作疫苗。在一个实施方案中，提供了根据第一方面的重组百日咳博德特氏菌、第二方面的至少一种OMV或OMV群体或第三方面的免疫原性组合物，其用于制备用于治疗和/或预防由百日咳博德特氏菌引起的疾病的药物。

在本发明的第五方面，提供了调节百日咳博德特氏菌的脂质A的反应原性的方法，其包括将选自LpxA和LpxD的至少一种基因稳定地整合到细菌的基因组中，其中：

(i)所述LpxA基因编码与SEQ ID NO：1或2具有至少80％序列同一性的LpxA蛋白，并且其中当根据SEQ ID NO：1或2编号时，所述蛋白包含170位的丝氨酸(S170)和/或229位的丙氨酸(A229)；和/或

(ii)所述LpxD基因编码与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少90％氨基酸序列同一性的LpxD蛋白。

优选地，在本发明的该第五方面，调节百日咳博德特氏菌的脂质A的反应原性的方法包括将LpxA基因稳定整合到细菌的基因组中，其中LpxA基因编码与SEQ ID NO：1或2具有至少80％序列同一性的LpxA蛋白，并且其中当根据SEQ ID NO：1或2编号时，该蛋白包含170位的丝氨酸(S170)和/或229位的丙氨酸(A229)。

在一个实施方案中，该方法包括将来源于副百日咳博德特氏菌的LpxA基因(LpxA_Bpa)稳定地整合到细菌的基因组中。

附图说明

图1(A).来自百日咳博德特氏菌的脂质A的结构；和图1(B).来自副百日咳博德特氏菌的脂质A的结构，其中虚线显示天然存在的变体结构，特别是可能另外存在的一个和两个仲C16酰基链，和具有C10链缺失的少数变体。

图2.来自博德特氏菌属的LpxA氨基酸序列的比对。

图3.百日咳博德特氏菌Tomaha I PTg的发酵曲线。曲线1：通过添加乙酸将pH调节至7.2(曲线3)以避免细胞肉汤的碱化而导致停止培养；曲线2：溶解氧浓度；曲线4：操控搅拌速度以将溶解氧浓度(DO)保持在25％而避免氧限制(DO/速度调节)；曲线5：温度调节在35℃。

图4.表达来自副百日咳博德特氏菌的本发明重组百日咳博德特氏菌株(ΔLpxA_Bpe/LpxA_Bpa)的发酵曲线。曲线2：操控搅拌速度以将溶解氧浓度(DO)保持在25％以避免氧限制(DO/速度调节)；曲线3：温度调节在35℃；曲线4：通过添加乙酸将pH调节至7.2(曲线1)以避免细胞肉汤的碱化而导致停止培养；曲线5：溶解氧浓度。NB：由于排气过滤器的堵塞，在过滤器更换过程中DO和搅拌速度下降到0持续约20分钟。这不影响发酵的结果。

图5.ΔLpxA_Bpe/LpxA_Bpa(虚线)和亲代菌株Tohama I PTg(黑色)的搅拌速度发酵曲线。

图6(A).通过LC-MS对LOS的结构分析-来自表达基因组整合的LpxA_Bpa的ΔLpxA_Bpe/LpxA_Bp的百日咳博德特氏菌的OMV。图6(B).通过LC-MS测定的LOS结构。实线显示该LOS的结构。虚线表示该LOS结构与野生型百日咳博德特氏菌Tohama I中发现的LOS结构之间的差异。

图7(A).通过LC-MS对LOS的结构分析-来自百日咳博德特氏菌的OMV，附加型表达LpxA_Bpa。图7(B).通过LC-MS测定的少数变体LOS结构(其中虚线说明该LOS和野生型百日咳博德特氏菌株Tohama I中发现的LOS结构之间的差异)。

图8(A).通过LC-MS对LOS的结构分析-来自百日咳博德特氏菌ΔArnT/ΔLpxA_Bpe/LpxA_Bpa的OMV，其是表达基因组整合的LpxA_Bpa的ArnT和LpxA_Bpe双敲除变体。图8(B).通过LC-MS测定的LOS结构。实线表示该LOS的结构。虚线表示该LOS结构与野生型百日咳博德特氏菌株Tohama I中发现的LOS结构之间的差异。

图9(A).通过LC-MS对LOS的结构分析-来自百日咳博德特氏菌ΔLpxA_Bpe/LpxA_Bpa/ΔDNT/LpxD_Pa的OMV，其为表达基因组整合的LpxA_Bpa和LpxD_Pa的LpxA_Bpe和DNT双重敲除变体。图9(B).通过LC-MS测定的LOS结构。实线表示该LOS的结构。虚线表示该LOS结构与野生型百日咳博德特氏菌株Tohama I中发现的LOS结构之间的差异。

图10(B).通过LC-MS对LOS的结构分析-来自百日咳博德特氏菌ΔLpxA_Bpe/LpxA_Bpa/ΔDNT/LpxD_Pa/ΔLpxD_Bpe的OMV，其是表达基因组整合的LpxA_Bpa和LpxD_Pa的LpxA_Bpe、DNT和LpxD_Bpe三重敲除变体。图10(B).通过LC-MS测定LOS结构。实线表示该LOS的结构。虚线表示该LOS结构与野生型百日咳博德特氏菌株Tohama I中发现的LOS结构之间的差异。

图11(A).通过LC-MS对LOS的结构分析-来自百日咳博德特氏菌LpxD_Pa的OMV，其附加型表达LpxD_Pa。图11(B).通过LC-MS测定的LOS结构。实线表示该LOS的结构。虚线表示该LOS结构与野生型百日咳博德特氏菌株Tohama I中发现的LOS结构之间的差异。

图12(A).通过LC-MS对LOS的结构分析-来自百日咳博德特氏菌ΔArnT/PagL_Bbr的OMV，其为表达PagL_Bbr的ArnT敲除变体。图12(B).通过LC-MS测定的LOS结构。实线表示该LOS的结构。虚线表示该LOS结构与野生型百日咳博德特氏菌株Tohama I中发现的LOS结构之间的差异。

图13(A).通过LC-MS对LOS的结构分析-来自野生型百日咳博德特氏菌Tomaha IPTg的OMV。图13(B).通过LC-MS测定的LOS结构。

图14.HEK-hTLR4细胞中TLR4信号传导的体外活化。基于蛋白质含量用来自重组百日咳博德特氏菌株的OMV；来自百日咳博德特氏菌Tohama I PTg菌株(野生型对照)的OMV；或基于BEXSERO、QUINVAXEM或INFANRIX HEXA疫苗的人剂量(疫苗对照)的当量分数刺激HEK-TLR4细胞。包括未刺激的细胞作为阴性对照(数据未显示)。

图15.HEK-hTLR4细胞中TLR4信号传导的体外活化。基于LOS含量用来自重组百日咳博德特氏菌株的OMV；来自百日咳博德特氏菌Tohama I PTg菌株(野生型对照)的OMV；来自百日咳博德特氏菌Tomaha I PTg的纯化的LPS；或来自脑膜炎奈瑟氏球菌MsbB菌株MsbB(MsbB)的脱毒的纯化LPS刺激HEK-TLR4细胞。包括未刺激的细胞作为阴性对照。

图16.HEK-hTLR4细胞中TLR4信号传导的体外活化。基于蛋白质含量用来自重组百日咳博德特氏菌株菌株的OMV；来自百日咳博德特氏菌Tohama I PTg菌株(野生型对照)的OMV；或BEXSERO、QUINVAXEM和INFANRIX HEXA疫苗刺激HEK-TLR4细胞。包括未刺激的细胞作为阴性对照。

图17.HEK-hTLR4细胞中TLR4信号传导的体外活化。基于LOS含量用来自重组百日咳博德特氏菌株的OMV；来自百日咳博德特氏菌Tohama I PTg菌株(野生型对照)的OMV；纯化的来自百日咳博德特氏菌的LPS；或来自脱毒的脑膜炎奈瑟氏球菌B MsbB菌株(MsbB)的OMV刺激HEK-TLR4细胞。刺激按照LOS含量标准化。包括未刺激的细胞作为阴性对照。

图18(A).通过LC-MS的LOS的结构分析-来自百日咳博德特氏菌的OMV，其附加型表达LpxE_Fn。图18(B).通过LC-MS测定的LOS结构的变体，其中该变体结构去除了磷酸酯(由黑色箭头指示的位置)。

图19(A).通过LC-MS对LOS的结构分析-来自百日咳博德特氏菌的OMV，其附加型表达LpxE_Rc。图19(B).通过LC-MS测定的LOS结构的变体，其中该变体结构去除了磷酸酯(由黑色箭头指示的位置)。

图20.通过LC-MS对LOS的结构分析-来自百日咳博德特氏菌的OMV，其附加型表达LpxF_Fn。图20(B).通过LC-MS测定的LOS结构，显示对LOS结构没有可确认的影响。

图21：HEK-hTLR4细胞中TLR4信号传导的体外活化。基于LOS含量用来自表达LpxE_Fn的重组百日咳博德特氏菌株的OMV刺激HEK-TLR4细胞。来自百日咳博德特氏菌Tohama IPTg菌株(WT PTg)的OMV用作阳性对照，包括未刺激的细胞作为阴性对照。

图22.HEK-hTLR4细胞中TLR4信号传导的体外活化。基于蛋白质含量用来自表达LpxE_Fn的重组百日咳博德特氏菌株的OMV刺激HEK-TLR4细胞。来自百日咳博德特氏菌TohamaI PTg菌株(WT PTg)的OMV用作阳性对照，包括未刺激的细胞作为阴性对照。

图23.根据在Balb/c小鼠的鼻咽定殖模型中进行的研究，通过ELISA测量的个体抗体滴度(抗PRN IgG)和具有95％置信区间的几何平均值。

图24.根据在Balb/c小鼠的鼻咽定殖模型中进行的研究，按照组和按照天所示的，如通过每鼻腔的菌落形成单位(CFU)的平均数定义的细菌负荷的个体值和几何平均值。

图25.根据Balb/c小鼠的肺清除模型中进行的研究，在第28天通过ELISA测量的个体抗PRN IgG滴度和几何平均滴度(误差棒代表相关的95％置信区间)。

图26.根据在Balb/c小鼠的肺清除模型中进行的研究，作为天数的函数的按组的个体菌落形成单位(CFU)计数(小点)和几何平均值(大的连接点)。

图27(A)至(F).针对不同系列稀释液在培养物上清液中测量的已知与反应原性机制相关的六种细胞因子(即：IL1a、IL6、TNFa、IL1b、IL10、MIP1a)。

具体实施方式

本发明涉及包含LPS的重组百日咳博德特氏菌菌株，当与野生型百日咳博德特氏菌的LPS相比时，其表现出降低的内毒性。在本申请中提及LPS也包括LOS。LPS和LOS的内毒性主要通过脂质A部分的组成决定。

令人惊讶的是，本发明人发现本发明的细菌还表现出与野生型、非重组、百日咳博德特氏菌的细菌生长曲线相当的细菌生长曲线。

与细菌相关的术语“野生型”的使用是指自然界存在的典型菌株。这种野生型菌株缺乏本文所述的本发明的修饰。因此，术语“野生型”用于指与本发明的微生物相同菌株但缺乏本发明的遗传修饰的微生物，例如本文所述的LpxA和/或LpxD遗传修饰。野生型菌株也可称为亲代菌株。如本文所用，“内源”基因或蛋白质用于指在百日咳博德特氏菌的野生型亲代菌株中发现的未经修饰的基因(核酸序列)或蛋白质(氨基酸序列)，所述重组细菌最初来源于该菌株。

另一方面，术语“外源的”用于指在重组细菌由其来源的野生型百日咳博德特氏菌菌株中天然不存在的基因(核酸序列)或蛋白质(氨基酸序列)。术语“外源的”可以与术语“异源的”互换使用。

本发明涉及重组百日咳博德特氏菌菌株，其包含：至少一种编码LpxA蛋白的基因组LpxA基因，其中所述LpxA蛋白包含相对于SEQ ID NO：1的170位的突变和/或229位的突变；和/或至少一个异源LpxD基因的基因组插入。

细菌

本发明的重组百日咳博德特氏菌可来源于百日咳博德特氏菌的各种亲代菌株，作为非限制性实例包括：Tohama I，例如百日咳博德特氏菌Moreno-Lopez(ATCC：BAA-589)、BP165、BPW28、10536、18323、I135、BAA-2706、BAA-2705或PT/28G[W28](ATCC：53894)。优选地，本发明的重组百日咳博德特氏菌来源于表达遗传脱毒的百日咳类毒素，特别是称为PT-9K/129G的遗传脱毒的百日咳类毒素的菌株。表达PT-9K/129G遗传脱毒的百日咳类毒素的重组百日咳博德特氏菌菌株在PT的S1亚基内包含两个氨基酸置换，具体地是R9K和E129G(参见例如EP 0396964)。特别地，重组细菌所来源的百日咳博德特氏菌菌株是Tohama I。更具体地，重组百日咳博德特氏菌来源于表达遗传脱毒的百日咳类毒素的Tohama I菌株。还更具体地，重组百日咳博德特氏菌来源于表达遗传脱毒的百日咳类毒素PT-9K/129G的Tohama I菌株。还更具体地，重组百日咳博德特氏菌包含S1基因，其已被修饰以包括突变R9K和E129G，并表达遗传脱毒的百日咳类毒素PT-9K/129G。

虽然百日咳毒素是由百日咳博德特氏菌分泌的，但它仍然存在于分离的全细胞和外膜囊泡中。因此，使用表达遗传脱毒的PT的菌株是有利的。优选地，本发明的重组百日咳博德特氏菌不表达皮肤坏死毒素(DNT)基因。

细菌脂多糖和脂质A

细菌脂多糖(LPS)由高度可变的O抗原、较少可变的核心寡糖和称为脂质A的高度保守的脂质部分组成。脂质A由被一个或两个磷酸基团取代的葡糖胺二糖和多个不同长度的酰基链组成(图1)。LPS的内毒性活性主要由脂质A部分的组成决定。

图1(A)显示了来自野生型百日咳博德特氏菌的脂质A的结构。本发明部分地基于百日咳博德特氏菌LPS中脂质A的C2、C2'和/或C3'酰基链长度的改变。在优选的实施方案中，修饰百日咳博德特氏菌LPS中脂质A的C3'酰基链。在此实施方案中，百日咳博德特氏菌的LPS中脂质A的C2和C2'酰基链的长度也可以被修饰。为此，百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)的脂质A生物合成途径已被工程改造。

LpxA酰基转移酶

酰基转移酶LpxA(称为'LpxA')催化酯连接的伯β-羟基-肉豆蔻酸酯在脂质A 3和3'位转移至单糖前体(UDP-葡糖胺)，从而确定在两个位置处并入的酰基链的长度，其在革兰氏阴性细菌之间变化[4，5，6]。

LPS的内毒性活性主要由其脂质A部分的组成决定。虽然脂质A中酰基链数量的变化可影响通过TLR4的信号传导，但这些链中的变化差异地影响TLR4信号传导的机制尚未完全阐明[2]。

因此，异源LpxA基因的表达可降低LPS的内毒性。

来自铜绿假单胞菌(LpxA_Pa)和脑膜炎奈瑟氏球菌(LpxA_Nm)的LpxA分别催化具有10(C₁₀)或12(C₁₂)个碳原子的长度的酰基链的转移。然而，在以往的研究中，例如在WO2018/167061中描述的那些，在百日咳博德特氏菌中附加型表达LpxA_Pa或LpxA_Nm基因，且内源LpxA基因被灭活。LpxA_Pa的附加型表达将C3'酰基链的长度从C₁₄减少到C₁₀，但所得重组菌株表现出强生长缺陷，使得它们不适合大规模发酵和使用。另一方面，百日咳博德特氏菌中LpxA_Nm的附加型表达是致死的。

令人惊讶的是，本发明人发现在百日咳博德特氏菌中，来自副百日咳博德特氏菌的LpxA的基因组表达克服了本领域中观察到的适合度/生长问题，同时也降低了LPS的内毒性。

来自副百日咳博德特氏菌的LpxA的氨基酸序列以SEQ ID NO：2提供。来自百日咳博德特氏菌的LpxA的氨基酸序列以SEQ ID NO：1提供。

来自百日咳博德特氏菌的LpxA的氨基酸序列与来自副百日咳博德特氏菌的氨基酸序列在两个残基上不同，对应于SEQ ID NO：1和2的170位和229位氨基酸(图2)。据信在氨基酸170位和/或229位的特定置换的存在改变了LpxA在脂质A的位置C3'处选择性引入C₁₀酰基链的特异性。因此，本发明的重组百日咳博德特氏菌菌株可表达编码LpxA氨基酸序列的LpxA基因，其中170和229位氨基酸的一个或两个(当参照SEQ ID NO：1编号时)被选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和半胱氨酸(C)的氨基酸残基置换。特别地，重组百日咳博德特氏菌菌株可以表达编码LpxA氨基酸序列的LpxA基因，其中G170被丝氨酸(G170S)置换和/或其中G229被丙氨酸(G229A)置换。特别地，重组百日咳博德特氏菌菌株可表达编码LpxA氨基酸序列的LpxA基因，所述LpxA氨基酸序列包含170位的丝氨酸残基和/或229位的丙氨酸残基(当参照SEQ ID NO：1编号时)。

可通过标准分子生物学技术如随机诱变、定点诱变、定向进化、基因置换等引入氨基酸置换或突变。

优选地，除了上述突变之外，LpxA基因编码与SEQ ID NO：2具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，例如81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％或90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。

特别地，可以使用由GenomeQuest,Inc提供的GENEPAST算法测定两个序列的序列同一性。该算法以前被称为“Kerr”，并且在没有任何生物学加权的情况下进行序列同一性百分比的算术测定(Dufresne等人，Nature Biotechnology 20,1269-1271(2002),或Andree等人,World Patent Information,2008,vol.30,issue 4,300-308页)。通常，相对于和沿着所比较的最长序列的整个(即完整)长度计算序列同一性。

LpxD酰基转移酶

LpxD酰基转移酶(LpxD)催化脂质A的2和2'位的酰胺连接的β-羟基-肉豆蔻酸酯的转移，从而确定在两个位置引入的酰基链的长度，其在革兰氏阴性细菌间同样是变化的[6]。

外源LpxD变体的表达可以改善细菌LPS的内毒素特性。因此，本发明的重组百日咳博德特氏菌菌株可包含至少一个异源LpxD基因。特别地，异源LpxD基因被整合到细菌基因组中。

来自睾丸酮丛毛单胞菌的LpxD(LpxD_Ct)的合适氨基酸序列以SEQ ID NO：3提供。来自铜绿假单胞菌的LpxD(LpxD_Pa)的合适氨基酸序列以SEQ ID NO：4提供。

因此，在一些实施方案中，该至少一个异源LpxD基因是来自铜绿假单胞菌的LpxD基因。在一些实施方案中，所述至少一个异源LpxD基因是来自睾丸酮丛毛单胞菌的LpxD基因。在一些实施方案中，异源LpxD基因替代皮肤坏死毒素的基因座。在一些实施方案中，异源LpxD基因替代内源LpxD基因。在一些实施方案中，异源LpxD基因在BP0840启动子(外膜孔蛋白启动子)的控制下。甚至更具体地，敲除LpxD基因的野生型拷贝(LpxD_Bp)。

在一些实施方案中，由至少一个异源LpxD基因编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：3具有至少90％的同一性。

因此，在一些实施方案中，由至少一个LpxD基因编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：3具有至少90％、至少95％或100％的同一性。更特别地，LpxD氨基酸序列与SEQ ID NO：3具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。

在一些实施方案中，由至少一个异源LpxD基因编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：4具有至少90％的同一性。

因此，在一些实施方案中，由至少一个LpxD基因编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：4具有至少90％、至少95％或100％的同一性。更特别地，LpxD氨基酸序列与SEQ ID NO：4具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。

具体地，本发明的重组百日咳博德特氏菌表达异源LpxD基因和编码含有170位丝氨酸残基和229位丙氨酸残基的LpxA氨基酸序列的LpxA基因。更具体地，百日咳博德特氏菌表达LpxA_Bpa和LpxD_Pa。

在一些实施方案中，至少一个LpxA基因和至少一个LpxD基因整合到细菌基因组中。在其它实施方案中，LpxA基因整合到细菌基因组中，而LpxD基因可附加型表达。

重组细菌的内源LpxA和/或LpxD基因可以通过本领域技术人员熟知的方法进行灭活。例如，基因可以被敲除。

通常，内源LpxA基因是突变的，但它可以是灭活的或被例如SEQ ID NO：2替代。通常，内源LpxD基因是灭活的。在一些实施方案中，内源LpxA和内源LpxD基因均是灭活的。

在一些实施方案中，本发明的重组百日咳博德特氏菌包含另外的遗传修饰，如其它外源基因的表达和/或其它内源基因的灭活。作为非限制性实例，(1)内源ArnT基因(SEQID NO：18)可以是灭活的，例如缺失的或被敲除的；(2)内源性皮肤坏死毒素(DNT)基因(SEQID NO：19)是灭活的，例如缺失的或被敲除的；(3)细菌可表达来自支气管败血博德特氏菌的PagL(SEQ ID NO：16)；(4)细菌可表达来自异源革兰氏阴性细菌的LpxE蛋白(SEQ ID NO：6或7)；和/或(5)细菌可表达来自异源革兰氏阴性细菌的LpxF蛋白(SEQ ID NO：8)。

LpxE和LpxF磷酸磷酸酶

LpxE磷酸磷酸酶(LpxE)和LpxF磷酸磷酸酶(LpxF)是可用于从包含磷酸基团的脂质去除磷酸基团的水解酶。如果去除一个磷酸基团，则脂质A是“单磷酰脂质A”。关于脂质A，LpxE和LpxF的活性可分别导致在核心二糖的C1和C4'处去除磷酸基团。

参考文献[65]和[66]中公开了来自豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)(LpxE_Rl)和新凶手弗朗西斯菌(Francisella novicida)(LpxE_Fn)的LpxE磷酸酶。参考文献[67]中公开了来自新凶手弗朗西斯菌的LpxF磷酸磷酸酶(LpxF_Fn))。作者进一步公开了LpxE_Rl、LpxE_Fn和LpxF_Fn在大肠杆菌中的异源表达[68]和[69]。然而，这些参考文献没有公开在百日咳博德特氏菌中使用LpxE或LpxF。

本发明人现已测试了外源LpxE和LpxF在百日咳博德特氏菌中的表达，并证明异源LpxE和/或LpxF的使用改变了脂质A的结构，并且还可以改变脂质A的特征，例如百日咳博德特氏菌LPS的内毒性特性。

因此，本发明的重组百日咳博德特氏菌菌株可包含至少一个异源LpxE基因和/或至少一个异源LpxF基因。特别地，至少一个异源LpxE基因和/或至少一个异源LpxF基因被整合到细菌基因组中。

LpxE是特异性地使核心二糖的C1位去磷酸化的磷酸磷酸酶。优选地，LpxE是来自选自豌豆根瘤菌(LpxE_Rl)和新凶手弗朗西斯菌(LpxE_Fn)的细菌的异源LpxE基因。来自豌豆根瘤菌和新凶手弗朗西斯菌的LpxE的合适氨基酸序列分别以SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7提供。

在一些实施方案中，异源LpxE基因替代编码糖基转移酶的ArnT基因的基因座(ΔArnT)。在一些实施方案中，异源LpxE基因在BP0840启动子(外膜孔蛋白启动子)的控制下。在一些实施方案中，由至少一种异源LpxE基因编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：6或SEQ IDNO：7具有至少90％同一性，至少95％或100％同一性。

在一个特定的实施方案中，异源LpxE基因是在BP0840启动子(外膜孔蛋白启动子)控制下的LpxE_Fn，其被插入到细菌基因组中并替代ArnT基因的基因座(ΔArnT)。

在一个实施方案中，本发明的重组百日咳博德特氏菌表达异源LpxE基因和编码含有170位丝氨酸残基和229位丙氨酸残基的LpxA氨基酸序列的LpxA基因。更具体地，所述百日咳博德特氏菌表达LpxA_Bpa和选自LpxE_Rl和LpxE_Fn的LpxE基因。在一些实施方案中，LpxA和LpxE基因整合到细菌基因组中。在其它实施方案中，LpxA基因整合到细菌基因组中，但LpxE基因附加型表达。

LpxF是特异性地使核心二糖的C4'位置去磷酸化的磷酸磷酸酶。优选地，LpxF是来自新凶手弗朗西斯菌的异源LpxF基因(LpxF_Fn)。来自新凶手弗朗西斯菌的LpxF的合适氨基酸序列以SEQ ID NO：8提供。

在一些实施方案中，所述至少一个异源LpxF基因是来自新凶手弗朗西斯菌的LpxF基因。在一些实施方案中，异源LpxF基因替代编码糖基转移酶的ArnT基因的基因座。在一些实施方案中，异源LpxF基因在BP0840启动子(外膜孔蛋白启动子)的控制下。在一些实施方案中，由至少一个异源LpxF基因编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：8具有至少90％同一性，至少95％或100％同一性。

脂质A酰基链

通常，革兰氏阴性细菌的脂质A由β-(1→6)-连接的二糖组成，所述二糖用至多8个不同长度和复杂度的脂肪酸以及带电荷的取代基如磷酸基团、磷酸乙醇胺残基或带正电荷的糖残基酰化，并且在不同细菌物种的脂质A内存在许多变化。二糖的2位和2’位(分别为还原和末端糖残基)的酰化导致酰胺连接的脂质，这也是当3-氨基-3-脱氧-d-葡糖胺被酰化时3-位和3’-位的情况。3和3’位的羟基以及脂肪酰基链的3-羟基也被酰化，产生酯连接的取代基。与β-(1→6)-连接的二糖附接的4-8个酰基的酰化程度在物种之间变化，并且在来自某些细菌物种的脂质A中通常存在多于单一形式。

通常，野生型百日咳博德特氏菌中脂质A的C2、C2'和C3'位的酰基链的长度为C₁₄。如本文所用，带有下标中的整数的'C'表示基于由整数表示的长度的碳链的分子。因此，C₁₄和C₁₀分别表示具有14碳原子链和10碳原子链的分子。

本发明的重组细菌产生脂质A，其中与野生型革兰氏阴性细菌产生的脂质A的相应酰基链的长度相比，C2和/或C2'和/或C3'位的酰基链的长度减少。

在本发明的重组细菌的优选实施方案中，所述细菌产生脂质A，其中与野生型革兰氏阴性细菌产生的脂质A的相应酰基链的长度相比，C3'位的酰基链的长度减少。在一些实施方案中，所述细菌产生脂质A，其中与野生型革兰氏阴性细菌产生的脂质A的相应酰基链的长度相比，C2和/或C2'位处的酰基链的长度也减少。

在一个优选的实施方案中，位置C3'处的酰基链的长度小于C₁₄，例如C₆至C₁₂、C₈至C₁₂或C₁₀至C₁₂，特别是C₁₀或C₁₂，例如C₆、C₈、C₁₀或C₁₂。在一个特别优选的实施方案中，C3'位的酰基链的长度为C₁₀。

特别地，位置C2处的酰基链的长度小于C₁₄，例如C₆至C₁₂、C₈至C₁₂或C₁₀至C₁₂，特别是C₁₀或C₁₂，例如，C₆、C₈、C₁₀或C₁₂。特别地，位置C2'处的酰基链的长度小于C₁₄，例如C₆至C₁₂、C₈至C₁₂或C₁₀至C₁₂，特别是C₁₀或C₁₂，例如，C₆、C₈、C₁₀或C₁₂。特别地，位置C3'处的酰基链的长度小于C₁₄，例如C₆至C₁₂、C₈至C₁₂或C₁₀至C₁₂，特别是C₁₀或C₁₂，例如，C₆、C₈、C₁₀或C₁₂。

在一些实施方案中，C2位和C2'位的酰基链的长度均小于C₁₄，例如C₆至C₁₂、C₈至C₁₂或C₁₀至C₁₂，特别是C₁₀或C₁₂，例如，C₆、C₈、C₁₀或C₁₂。在一些实施方案中，在位置C2和位置C3'处的酰基链的长度小于C₁₄，例如C₆至C₁₂、C₈至C₁₂或C₁₀至C₁₂，特别是C₁₀或C₁₂，例如，C₆、C₈、C₁₀或C₁₂。在一些实施方案中，C2'位和C3'位的酰基链的长度均小于C₁₄，例如C₆至C₁₂、C₈至C₁₂或C₁₀至C₁₂，特别是C₁₀或C₁₂，例如，C₆、C₈、C₁₀或C₁₂。在一些实施方案中，位置C2、位置C2'和位置C3'处的酰基链的长度小于C₁₄，例如C₆至C₁₂、C₈至C₁₂或C₁₀至C₁₂，特别是C₁₀或C₁₂，例如，C₆、C₈、C₁₀或C₁₂。

由本发明的重组细菌产生的脂质A可以作为具有不同长度的酰基链的种类的混合物存在。

因此，考虑到细胞中脂质A的总群体，C2位的酰基链的至少10％为C₁₀或C₁₂和/或C2'位置处的酰基链的至少10％为C₁₀或C₁₂和/或C3'位置处的酰基链的至少10％为C₁₀或C₁₂。特别地，至少10％可以是C₁₀或C₁₂，至少12％、至少15％、至少20％、至少24％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％可以是C₁₀或C₁₂。优选至少10％是C₁₀或C₁₂，至少80％，更优选至少90％是C₁₀或C₁₂。还更特别地，约100％是C₁₀或C₁₂。

细菌生长

本发明的重组菌株是稳定的，同时也适于大规模生长，例如在制造中。令人惊讶的是，本发明的重组百日咳博德特氏菌的生长曲线与野生型亲代菌株的生长曲线相当，表明所例举的LpxA突变和LpxD突变均不对培养物生长有害。

因此，本发明的重组细菌菌株特别适用于例如制备全细胞细菌抗原和/或OMV，然后可将其用作免疫原性组合物如疫苗的组分。

因此，本发明的重组革兰氏阴性细菌的培养物的生长速率与野生型亲代菌株的培养物的生长速率相当。特别地，在标准发酵方法中，例如在10升发酵体积中，经过时间和生长速率的值基本上类似，例如变化小于20％、小于15％、小于10％或小于5％。

外膜囊泡(OMV)

在第二方面，本发明涉及来源于第一方面的重组百日咳博德特氏菌的外膜囊泡或外膜囊泡群体。

OMV是由革兰氏阴性菌在生长过程中天然和组成性释放的脂质双层纳米级球形颗粒(直径10-500nm)。OMV通过细菌外膜的“出芽”产生，且与此一致，它们具有类似于细菌外膜的组成，包括脂多糖(LPS)、甘油磷脂、外膜蛋白和周质组分。通常，外膜囊泡从细菌人工制备，并且可以使用去污剂处理(例如用脱氧胆酸盐)或通过非去污剂方法制备。

形成OMV的技术包括用胆汁酸盐去污剂(例如石胆酸、鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、脱氧胆酸、胆酸、熊胆酸等的盐)或用脱氧胆酸钠处理细菌[7和8]。其它技术可在基本上不存在去污剂[9和10]的情况下使用诸如超声处理、均质化、微流化、空化、渗透压休克、研磨、法式滤压(French press)、共混的技术进行。用于本发明的OMV可使用具有约0.5％或更低，例如约0.4％、约0.3％、约0.2％、约0.1％、<0.05％或甚至零的脱氧胆酸盐的OMV提取缓冲剂进行制备。

OMV也可在细菌生长期间自发形成并释放到培养基中。因此，可以通过在培养基中培养本发明的细菌，从培养基中的较小OMV分离全细胞获得OMV。通过过滤，例如通过0.22μm过滤器，可以方便地将细菌囊泡与完整细菌分离。细菌滤液可以通过离心，例如高速离心(例如20000xg约2小时)进行澄清。OMV制备的另一种有用方法描述于[11]中，并且涉及粗OMV的超滤，而不是超离心。该方法可包括超滤发生后的超速离心步骤。[12]中描述了纯化细菌囊泡的简单方法，包括：(i)第一过滤步骤，其中基于它们的不同尺寸将囊泡与细菌分离，其中囊泡进入滤液中，例如使用0.22μm微滤；和(ii)第二过滤步骤，其中囊泡保留在渗余物中，例如使用0.1μm微滤。这两个步骤都可以使用切向流过滤。

本发明的OMV包括LOS(也称为LPS)。OMV中LOS的热原效应可能低于用相同量的纯化LOS所观察到的热原效应。因此，优选地当考虑热原性时，通常将来自本发明细菌的OMV与源自亲代菌株的OMV进行比较。LOS水平以内毒素的国际单位(IU)表示并可通过LAL测定(鲎变形细胞裂解物)测试。LOS可以以小于2000IU/μg OMV蛋白存在。

在本发明的一些实施方案中，OMV是去污剂提取的OMV(dOMV)。术语“dOMV”包括通过破坏革兰氏阴性细菌的外膜获得的各种蛋白脂质体囊泡，典型地通过去污剂提取方法以从其中形成囊泡。优选地，OMV是去污剂提取的OMV(dOMV)。特别地，本发明的OMV是使用脱氧胆酸盐制备的dOMV。更特别地，约0.5％或更低的脱氧胆酸盐，例如，约0.4％、约0.3％、约0.2％、约0.1％或约0.05％。

本发明的dOMV可以具有通过动态光散射DLS技术测量的约20至约500nm的粒度分布。特别地，本发明的dOMV可以具有约50至约500nm的粒度分布。更具体地，dOMV可以具有约75至约250nm，例如约75至约150nm的粒度分布。甚至更特别地，本发明的dOMV可以具有约20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145或150nm的平均直径。

在一些实施方案中，本发明的细菌可以被修饰以具有上调的抗原或异源抗原(即对于特定细菌菌株不是天然的抗原)的表达。作为这种修饰的结果，由这种修饰的细菌制备的囊泡含有更高水平的上调的或异源的抗原。上调的抗原在囊泡中表达的增加(相对于相应的野生型菌株测量)有利地是至少10％，以每单位质量囊泡的相关抗原的质量测量，并且更有利地是至少20％、30％、40％、50％、75％、100％或更多。

全细胞百日咳抗原

本发明的重组百日咳博德特氏菌可用作灭活的百日咳博德特氏菌细胞形式的全细胞百日咳(wP)抗原。细胞百日咳抗原的制备在本领域中有充分记载，并且可以通过热灭活百日咳博德特氏菌细胞的I期培养物而获得。wP抗原的量可以国际单位(IU)表示。例如，NIBSC提供了“百日咳疫苗国际标准”(NIBSC代码：94/532)，其含有每安瓿40IU。

当用于本发明的免疫原性组合物中时，细胞百日咳抗原通常以能够在施用时引发免疫应答的量存在。理想地，细胞百日咳抗原可引发保护性免疫应答。本发明免疫原性组合物中wP抗原的量通常为至少4IU/剂。wP抗原可以吸附到铝佐剂上或与铝佐剂混合，例如磷酸铝佐剂。

TLR4信号传导级联

当与来自野生型菌株的脂质A相比时，特别是当使用TLR4刺激测定测量时，本发明的细菌产生具有降低的内毒素活性的脂质A。

TLR4刺激测定是本领域技术人员公知的。TLR4信号传导级联的刺激可以导致NF-κB和/或激活蛋白1(AP-1)转录因子的激活，所述转录因子有助于几种促炎细胞因子例如IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α的表达，并因此在炎症中起关键作用。在某些细胞系例如HEK-Blue^TM-hTLR4细胞(Invivogen)中转录活性的测定可用于评估TLR4信号传导级联的刺激。更具体地，HEK-Blue^TM-hTLR4细胞的可诱导报告基因分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)在与五个NF-κB和AP-1结合位点融合的IL-12p40最小启动子的控制下。在用TLR4配体刺激后，NF-kB和AP-1的活化诱导碱性磷酸酶的分泌，其可通过测量655nm处的光密度(OD₆₅₅)在上清液中定量。

本发明的细菌，例如来源于本发明的细菌的全细胞抗原或OMV的内毒素活性可以使用TLR4刺激测定，特别是人TLR4刺激测定，更特别是具有在655nm下测量的光密度(OD)的人TLR4刺激测定进行确定。特别地，将本发明的全细胞或OMV的内毒素活性与野生型亲代菌株的内毒素活性进行比较。可以将本发明细菌来源的OMV激活TLR4信号传导的能力与野生型菌株来源的OMV以及其它细菌或商业免疫原性组合物，例如BEXSERO(含有来自奈瑟氏球菌OMV的B型脑膜炎疫苗)或QUINVAXEM(全细胞(wP)百日咳疫苗)来源的OMV进行比较。

更具体地，与来源于野生型细菌的OMV的内毒素活性相比，本发明的OMV的内毒素活性表现出降低或减少的TLR4信号传导级联的活化。具体地，当测试LpxA和/或Lpx突变体时，使用TLR4刺激测定获得的OD₆₅₅值应该与使用未刺激的细胞获得的OD₆₅₅值和/或用无细胞百日咳(aP)疫苗刺激的细胞观察到的OD₆₅₅值类似，例如约±0.5OD₆₅₅。

在一些实施方案中，TLR4刺激测定显示与来源于野生型细菌的OMV相比，本发明的OMV的TLR4信号传导级联的活化部分降低。具体地，用本发明的LpxA和/或LpxD细菌或OMV观察到的OD₆₅₅值可以比在未刺激的细胞中观察到的OD₆₅₅值和/或用aP疫苗刺激的细胞观察到的OD₆₅₅值高(≥±0.5OD₆₅₅)，但比用源自野生型细菌的OMV和/或用wP疫苗和/或含OMV的MenB疫苗刺激的细胞观察到的OD₆₅₅值低。

免疫原性组合物

在第三方面，本发明涉及包含至少一种来源于本发明的重组百日咳博德特氏菌的外膜囊泡和药学上可接受的赋形剂的免疫原性组合物。

本发明的OMV可用作免疫原性组合物中的活性成分。类似地，包含已被杀死和灭活(例如通过用福尔马林和/或加热处理)的本发明的完整重组百日咳博德特氏菌细胞的全细胞抗原也可用作免疫原性组合物中的活性成分。

术语“免疫原性组合物”广泛地指可以施用以引发针对组合物中存在的一种或多种抗原的免疫应答(例如抗体或细胞免疫应答)的任何组合物。因此，本发明的组合物是免疫原性的。

当免疫原性组合物预防、改善、减轻或消除受试者的疾病时，则此类组合物可称为疫苗。根据本发明的疫苗可以是预防性的(即预防感染)或治疗性的(即治疗感染)，但通常是预防性的。在某些实施方案中，免疫原性组合物是疫苗。预防性疫苗不能保证对疾病的完全保护，因为即使患者产生抗体，在免疫系统能够对抗感染之前也可能存在滞后或延迟。因此，且为了避免疑问，术语预防性疫苗也可以指改善未来感染的效果的疫苗，例如通过减少这种感染的严重性或持续时间。

术语“针对感染的保护”和/或“提供保护性免疫”是指受试者的免疫系统已被启动(例如通过接种疫苗)以引发免疫应答并排斥感染。特别地，所触发的免疫应答能够排斥百日咳博德特氏菌的感染。因此，接种疫苗的受试者可能被感染，但比对照受试者能更好地排斥感染。用作疫苗的免疫原性组合物包含免疫有效量的抗原以及所需的任何其它组分。“免疫学有效量”是指以单一剂量或作为系列的一部分向个体施用该量对于治疗或预防是有效的。通常，期望的结果是产生能够或有助于保护受试者抵抗病原体的抗原(例如病原体)特异性的免疫应答。该量根据待治疗个体的健康和身体状况、年龄、待治疗个体的分类组(例如非人灵长类动物、灵长类动物等)、个体免疫系统合成抗体的能力、期望的保护程度、疫苗的制剂、治疗医生对医学状况的评估和其它相关因素而变化。预期该量将落在可通过常规试验确定的相对宽的范围内。

术语“抗原”是指当施用于受试者时引起针对该物质的免疫应答的物质。在本发明的上下文中，本发明的OMV是抗原。特别地，当施用于受试者时，免疫原性组合物将引发针对博德特氏菌(例如百日咳博德特氏菌)的免疫应答。特别地，针对博德特氏菌的免疫应答是保护性的，即它可以预防或减少由博德特氏菌，特别是百日咳博德特氏菌引起的感染或定殖。因此，组合物可以是药学上可接受的。通常，免疫原性组合物包括除了抗原之外的组分，例如它们通常包括一种或多种药物载体和/或赋形剂。此类组分的全面讨论可参见[13]。

“药学上可接受的载体”是本身不诱导抗体产生的载体。这样的载体是本领域普通技术人员公知的，且非限制性实例包括但不限于多糖，聚乳酸，聚乙醇酸，氨基酸共聚物，蔗糖，海藻糖，乳糖和脂质聚集体(例如油滴或脂质体)。免疫原性组合物也可含有稀释剂，如水，盐水，甘油等。无菌无热原、磷酸盐缓冲生理盐水是典型的稀释剂。这样的组合物还可以包括辅助物质，例如润湿剂或乳化剂，pH缓冲物质等。

组合物通常以水性形式施用于受试者，例如患者，特别是合适的哺乳动物，例如人。然而，在施用之前，组合物可以已经是非水性形式。例如，虽然一些疫苗以水性形式制备，然后也以水性形式填充和分配并施用，但其它疫苗在制备过程中经冻干并在使用时重构成水性形式。因此，本发明的组合物可以是干燥的，例如冻干的制剂。

该组合物可以包括防腐剂如硫柳汞或2-苯氧乙醇。然而，优选疫苗应基本上不含(即小于5μg/ml)汞物质，例如不含硫柳汞。更优选不含汞的疫苗。特别优选无硫柳汞的疫苗。

为了控制张力，可以包括生理盐，例如钠盐。可以使用氯化钠(NaCl)，其可以1至20mg/ml存在，例如约10±2mg/ml NaCl。

组合物通常具有介于200mOsm/kg和400mOsm/kg之间，特别是介于240-360mOsm/kg之间，更特别是290-310mOsm/kg范围内的重量克分子渗透浓度。

组合物可包含一种或多种缓冲剂。典型的缓冲剂包括：磷酸盐缓冲剂；Tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂；或柠檬酸盐缓冲剂。缓冲剂通常以5-20mM的范围包括。

组合物的pH通常介于5.0和8.1之间，更通常介于6.0和8.0之间，例如6.5和7.5之间，或介于7.0和7.8之间。

组合物优选是无菌的。特别地，该组合物是无热原的，例如每剂含有<1EU(内毒素单位，标准量度)，例如每剂量<0.1EU。该组合物可以不含谷蛋白。

组合物可以包括用于单次免疫的材料，或可以包括用于多次免疫的材料(即'多剂量'试剂盒)。在多剂量方案中优选包含防腐剂。作为在多剂量组合物中包含防腐剂的替代(或附加)，组合物可以包含在具有用于去除物质的无菌适配器的容器中。

免疫原性组合物，例如人疫苗，通常以约0.5ml的剂量体积施用，尽管例如可以对儿童施用半剂量(即约0.25ml)。

本发明的免疫原性组合物还可包含一种或多种免疫调节剂。优选地，一种或多种免疫调节剂包括一种或多种佐剂。如本文所用，“佐剂”是指当与一种或多种抗原(例如作为免疫原性组合物或疫苗的一部分)联合施用于受试者时，增加或增强受试者对所施用的一种或多种抗原的免疫应答(与不存在佐剂时获得的免疫应答相比)的化合物或物质(或化合物或物质的组合)。佐剂可以包括TH1佐剂和/或TH2佐剂，进一步讨论如下。

可用于本发明组合物的佐剂包括含矿物质的组合物如铝盐和钙盐。本发明的组合物可以包括矿物盐，例如氢氧化物(例如羟基氧化物)、磷酸盐(例如羟基磷酸盐，正磷酸盐)、硫酸盐等[例如参见参考文献14的第8和9章]，或不同矿物化合物的混合物，其中化合物采取任何合适的形式(例如凝胶、结晶、无定形等)，并且优选吸附。含矿物质的组合物也可配制为金属盐的颗粒。

称为“氢氧化铝”的佐剂通常是羟基氧化铝盐，其通常是至少部分结晶的。通过红外(IR)光谱，特别是通过在1070cm^-1处的吸附带和在3090-3100cm^-1处的强肩峰的存在，可将由式AlO(OH)表示的羟基氧化铝与其它铝化合物如氢氧化铝Al(OH)₃区分开[参考文献14的第9章]。氢氧化铝佐剂的结晶度由半高处的衍射带的宽度(WHH)反映，其中不良结晶颗粒由于较小的微晶尺寸而显示出较大的线加宽。表面积随着WHH增加而增加，并且已经看到具有较高WHH值的佐剂具有更大的抗原吸附能力。纤维状形态(例如，如透射电子显微照片中所见)对于氢氧化铝佐剂是典型的。氢氧化铝佐剂的pI通常为约11，即佐剂本身在生理pH下具有正的表面电荷。已经报道了氢氧化铝佐剂在pH 7.4下的吸附容量为1.8-2.6mg蛋白质/mg Al⁺⁺⁺。

称为“磷酸铝”的佐剂通常是羟基磷酸铝，通常还含有少量硫酸盐(即羟基磷酸铝硫酸盐)。它们可以通过沉淀获得，并且沉淀期间的反应条件和浓度影响磷酸盐对盐中羟基的取代度。羟基磷酸盐通常具有介于0.3和1.2之间的PO₄/Al摩尔比。羟基磷酸盐与严格的AlPO₄的区别可以在于羟基的存在。例如，在3164cm^-1处的IR谱带(例如，当加热至200℃时)指示结构羟基的存在[参考文献14的第9章]。

磷酸铝佐剂的PO₄/Al³⁺摩尔比可以介于0.3和1.2之间，特别地介于0.8和1.2之间，并且更特别地0.95±0.1。磷酸铝可以是无定形的，特别是对于羟基磷酸盐。典型的佐剂是PO₄/Al摩尔比介于0.84和0.92之间的无定形羟基磷酸铝，包括0.6mg Al³⁺/ml。磷酸铝通常是颗粒状的(例如在透射电子显微照片中看到的片状形态)。在任何抗原吸附之后，颗粒的典型直径在0.5-20μm范围内(例如约5-10μm)。已报道磷酸铝佐剂在pH7.4下的吸附容量为0.7-1.5mg蛋白质/mg Al⁺⁺⁺。

磷酸铝的零电荷点(PZC)与磷酸盐对羟基的取代度成反比，且该取代度可根据反应条件和用于通过沉淀制备盐的反应物的浓度而变化。PZC还通过改变溶液中游离磷酸根离子的浓度(更多的磷酸根＝更酸性的PZC)或通过添加缓冲剂如组氨酸缓冲剂(使PZC更碱性)而改变。根据本发明使用的磷酸铝可以具有介于4.0和7.0之间，更特别地具有5.0和6.5之间，例如约5.7的PZC。

用于制备本发明组合物的铝盐悬浮液可含有缓冲剂(例如磷酸盐或组氨酸或Tris缓冲剂)，但这并不总是必需的。悬浮液优选是无菌的和无热原的。悬浮液可以包括游离的含水磷酸根离子，例如以介于1.0和20mM之间，介于5和15mM之间，特别是约10mM的浓度存在。悬浮液也可包含氯化钠。

在一些实施方案中，佐剂组分包括氢氧化铝和磷酸铝两者的混合物。在这种情况下，可以存在比氢氧化物更多的磷酸铝，例如至少2：1的重量比，例如≥5：1、≥6：1、≥7：1、≥8：1、≥9：1等。在一些实施方案中，佐剂组分包括磷酸铝。在一些实施方案中，佐剂组分包括羟基磷酸铝硫酸盐。

用于施用于患者的组合物中Al⁺⁺⁺的浓度可以在10mg/mL和0.01mg/ml之间，例如小于5mg/ml、小于4mg/ml、小于3mg/ml、小于2mg/ml、小于1mg/ml，例如约5mg/ml、约4mg/ml、约3mg/ml、约2mg/ml、约1mg/ml、约0.3mg/ml、约0.05mg/ml或约0.01mg/ml。具体的范围是约0.3mg/ml至约1mg/ml。在一些实施方案中，0.85mg/剂的最大值是优选的，例如约0.5mg/l或约0.3mg/ml。

适合在本发明中用作佐剂的油乳液组合物包括角鲨烯-水乳液，如MF59[参考文献14的第10章；还参见参考文献15](5％角鲨烯、0.5％Tween80和0.5％Span85，使用微流化器配制成亚微米颗粒)。也可以使用完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。

皂苷制剂也可用作本发明的佐剂。皂苷是一组异质的甾醇糖苷和三萜糖苷，它们存在于广泛植物物种的树皮、叶、茎、根甚至花中。来自皂树的树皮中的皂苷作为佐剂已被广泛研究。皂苷也可以从菝葜(Smilax ornata)(sarsaprilla)、满天星(Gypsophillapaniculata)(brides veil)和肥皂草(Saponaria officianalis)(皂根)商购获得。皂苷佐剂制剂包括纯化制剂，如QS21，以及脂质制剂，如ISCOMs。QS21以Stimulon^TM销售。

AS01是含有MPL(3-O-脱酰基-4'-单磷酰脂质A)、QS21((Quillaja saponariaMolina,级分21)Antigenics,New York,NY,USA)和脂质体的佐剂系统。AS01B是含有MPL、QS21和脂质体(50μg MPL和50μg QS21)的佐剂系统。AS01E是含有MPL、QS21和脂质体(25μgMPL和25μg QS21)的佐剂系统。在一个实施方案中，免疫原性组合物或疫苗包含AS01。在另一个实施方案中，免疫原性组合物或疫苗包含AS01B或AS01E。在特定实施方案中，免疫原性组合物或疫苗包含AS01E。AS02是在油/水乳液中含有MPL和QS21的佐剂系统。AS02V是在油/水乳液(50μg MPL和50μg QS21)中含有MPL和QS21的佐剂系统。AS03是在油/水(o/w)乳液中含有α-生育酚和角鲨烯的佐剂系统。AS03A是在o/w乳液中含有α-生育酚和角鲨烯的佐剂系统(11.86mg生育酚)。AS03B是在o/w乳液中含有α-生育酚和角鲨烯的佐剂系统(5.93mg生育酚)。AS03C是在o/w乳液中含有α-生育酚和角鲨烯的佐剂系统(2.97mg生育酚)。在一个实施方案中，免疫原性组合物或疫苗包含AS03。AS04是含有吸附在铝盐(500μg Al3+)上的MPL(50μg MPL)的佐剂系统。在一个实施方案中，免疫原性组合物或疫苗包含AS04。在WO94/00153中公开了涉及使用QS21和3D-MPL的系统。WO 96/33739中公开了其中用胆固醇淬灭QS21的组合物。在WO95/17210中描述了在水包油乳剂中包含QS21、3D-MPL和生育酚的另外的佐剂制剂。在一个实施方案中，免疫原性组合物另外包含皂苷，其可以是QS21。该制剂还可以包含水包油乳液和生育酚(WO95/17210)。含有未甲基化CpG的寡核苷酸(WO96/02555)和其它免疫调节性寡核苷酸(WO 0226757和WO 03507822)也是TH1反应的优先诱导剂，并且适用于本发明。

另外的佐剂包括Toll样受体激动剂(特别是Toll样受体2激动剂、Toll样受体3激动剂、Toll样受体4激动剂、Toll样受体7激动剂、Toll样受体8激动剂和Toll样受体9激动剂)。本发明的组合物可包括一种或多种小分子免疫增强剂。例如，组合物可以包括TLR2激动剂(例如Pam3CSK4)、TLR4激动剂(例如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯，如E6020)、TLR7激动剂(例如咪喹莫特)、TLR8激动剂(例如瑞喹莫德(也是TLR7激动剂))和/或TLR9激动剂(例如IC31)。任何这样的激动剂理想地具有<2000Da的分子量。

用于本发明的TLR7激动剂理想地包括至少一个吸附部分。在TLR激动剂中包含这样的部分允许它们吸附至不溶性铝盐(例如通过配体交换或任何其他合适的机制)并改善它们的免疫学行为。含磷吸附部分是特别有用的，且因此吸附部分可以包括磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、亚膦酸酯、次亚膦酸酯等。TLR激动剂可以包括至少一个膦酸酯基团。在特定的实施方案中，本发明的组合物可以包括含有膦酸酯基团的TLR7激动剂。该膦酸酯基团可使激动剂吸附至不溶性铝盐。在一些实施方式中，TLR激动剂是3-(5-氨基-2-(2-甲基-4-(2-(2-(2-膦酰乙氧基)乙氧基)乙氧基)苯乙基)苯并[f]-[1,7]萘啶-8-基)丙酸，如下所示。

优选的TLR激动剂是水溶性的。因此，当在25℃和1个大气压下在水性缓冲剂中与pH 7的水混合以得到具有至少50μg/ml浓度的溶液时，它们可以形成均匀的溶液。因此，术语“水溶性”不包括在这些条件下仅微溶的物质。

本发明的组合物可以以各种不同形式制备。例如，组合物可以制备成作为液体溶液或悬浮液的可注射剂。也可制备适于在注射前溶解于或悬浮于液体媒介物中的固体形式(例如冻干组合物或喷雾冻干组合物)。组合物可以制备用于局部施用，例如作为软膏、乳膏或粉末。组合物可以使用细粉或喷雾剂制备用于肺部施用，例如作为吸入器。该组合物可以制备成用于鼻、耳或眼施用，例如作为滴剂。所述组合物可以是试剂盒形式，其被设计为使得组合的组合物刚好在施用给患者之前重构。这样的试剂盒可以包含一种或多种液体形式的抗原和一种或多种冻干的抗原。

当组合物在使用前临时制备(例如当组分以冻干形式存在时)并以试剂盒形式存在时，试剂盒可包含两个小瓶，或其可包含一个预填充的注射器和一个小瓶，注射器的内容物用于在注射前再活化小瓶的内容物。

组合疫苗

本发明的免疫原性组合物通常是组合疫苗，并且除了本发明的OMV之外，还可以包括来自百日咳博德特氏菌的保护性抗原和至少一种百日咳博德特氏菌病原体之外的抗原。

另外的保护性抗原可以是病毒和/或细菌。除了百日咳博德特氏菌之外，典型的细菌病原体包括但不限于：白喉棒状杆菌；破伤风梭菌；b型流感嗜血杆菌。典型的病毒病原体包括但不限于：脊髓灰质炎病毒和乙型肝炎病毒。为避免疑问，提及另外的抗原意图是指本发明免疫原性组合物中包括的除OMV组分以外的其它抗原性组分。例如，可以发现少量的百日咳类毒素作为OMV的成分，但将百日咳类毒素称为进一步的抗原是指在OMV成分之上或以上特别添加的一定量的百日咳类毒素，例如作为分离的蛋白质抗原。

无细胞百日咳抗原

除了本发明的OMV之外，本发明的免疫原性组合物还可包含一种或多种无细胞百日咳(aP)抗原，特别是选自以下公知的和充分表征的百日咳博德特氏菌：(1)脱毒的百日咳毒素(百日咳类毒素，或'PT')；(2)丝状血凝素('FHA')；(3)百日咳杆菌粘附素(也称为'PRN'或'69千道尔顿外膜蛋白')；(4)2型菌毛('FIM2')；(5)3型菌毛('FIM3')。最优选使用脱毒的PT和FHA。在一些实施方案中，使用PT、FHA和PRN。这些抗原优选通过从在改良的Stainer-Scholte液体培养基中生长的百日咳博德特氏菌培养物进行分离而制备。PT和FHA可以从发酵液中分离(例如通过吸附在羟基磷灰石凝胶上)，而百日咳杆菌粘附素可以通过热处理和絮凝(例如使用氯化钡)从细胞中提取。抗原可以在连续的层析和/或沉淀步骤中进行纯化。PT和FHA可以通过疏水色谱法、亲和色谱法和尺寸排阻色谱法进行纯化。百日咳杆菌粘附素可以通过离子交换色谱、疏水性色谱和尺寸排阻色谱进行纯化。

FHA和百日咳杆菌粘附素可以在根据本发明在使用之前用甲醛处理。PT可以通过用甲醛和/或戊二醛处理进行脱毒。作为该化学脱毒过程的替代方法，优选PT可以是突变PT，其中通过诱变降低了酶活性，例如遗传脱毒的PT，优选PT-9K/129G。

在一些实施方案中，本发明的免疫原性组合物还包含菌毛抗原FIM2和FIM3。

aP抗原可以以未吸附状态使用，或者可以在使用之前吸附到一种或多种铝盐佐剂上。通常，aP抗原基本上不含汞防腐剂如硫柳汞。

无细胞百日咳抗原在本发明的免疫原性组合物中可以在施用时能够引发免疫应答的量存在。理想地，无细胞百日咳抗原可引发保护性免疫应答。无细胞百日咳抗原的量通常以微克表示。PT在疫苗中的浓度通常介于5和50μg/ml之间。典型的PT浓度为5μg/ml、16μg/ml、20μg/ml或50μg/ml，例如，约20μg/剂或约25μg/剂。疫苗中FHA的浓度通常介于10和50μg/ml之间。典型的FHA浓度是10μg/ml、16μg/ml或50μg/ml，例如，每剂约20μg或每剂约25μg。疫苗中百日咳杆菌粘附素的浓度通常介于5和16μg/ml之间。典型的百日咳杆菌粘附素浓度是5μg/ml、6μg/ml或16μg/ml，例如，每剂约3μg或每剂约8μg。FIM2和FIM3可以以5和16μg/ml的浓度存在。FIM2和FIM3的典型浓度是5μg/ml、10μg/ml或20μg/ml，例如每剂约5μg或每剂约10μg。用于青少年和成人的加强疫苗通常每0.5ml剂量含有2.5至8μg PT、4至8μg FHA和2.5至8μg百日咳杆菌粘附素。通常，加强疫苗每0.5ml剂量包含4μg PT、4μg FHA和8μg百日咳杆菌粘附素，更优选5μg PT、2.5μg FHA和2.5μg百日咳杆菌粘附素。儿科疫苗通常每0.5ml剂量包含7μg PT、10μg FHA和10μg百日咳杆菌粘附素。

当含水组分包括PT、FHA和百日咳杆菌粘附素中的每一种时，它们的重量比可以变化，但可以是例如约16：16：5、约5：10：6、约20：20：3、约25：25：8或约10：5：3(PT：FHA：PRN)。

白喉

白喉棒状杆菌引起白喉。可以处理白喉毒素(例如使用福尔马林或甲醛)以去除毒性，同时保留在注射之后诱导特异性抗毒素抗体的能力。用于白喉疫苗的白喉类毒素是本领域熟知的。优选的白喉类毒素是通过甲醛处理制备的那些。白喉类毒素可通过使白喉棒状杆菌在可补充有牛提取物的生长培养基(如Fenton培养基或Linggoud&Fenton培养基)中生长，然后进行甲醛处理，超滤和沉淀而获得。特别地，用于生长白喉棒状杆菌的生长培养基不含动物源性组分。然后可以通过包括无菌过滤和/或透析的方法处理类毒素化材料。或者，可使用遗传脱毒的白喉毒素(例如CRM197)，其可进行甲醛处理以在储存期间保持长期稳定性。

白喉类毒素可吸附到佐剂如铝盐佐剂上。

组合物中白喉毒素和/或类毒素的量通常以“Lf单位(“絮凝单位”，或“石灰絮凝剂量”，或“絮凝限度”)测量，其定义为当与一个国际单位的抗毒素混合时，产生最佳絮凝混合物的毒素/类毒素的量[16,17]。例如，NIBSC提供每安瓿含有300LF的‘Diphtheria Toxoid,Plain’[18]，并且还提供每安瓿含有900Lf的‘The 2nd International ReferenceReagent For Diphtheria Toxoid For Flocculation Test’(NIBSC代码：02/176)，其含有每安瓿900Lf。组合物中白喉毒素或类毒素的浓度可以容易地使用絮凝测定通过与针对这些参比试剂校准的参比材料比较来确定。

组合物中白喉类毒素的免疫效力通常以国际单位(IU)表示。可通过将组合物在实验室动物(通常为豚鼠)中提供的保护与已在IU中校准的参考疫苗进行比较来评估效力。NIBSC提供了每安瓿含有213IU，并且适于校准这样的测定的‘4th WHO InternationalStandard for Diphtheria Toxoid(Adsorbed)’(NIBSC代码：07/216)。

三稀释测定法可用于测定本发明组合物的效力。免疫之后，通过皮下或皮内途径对豚鼠进行放血或挑战。在替代实施方案中，用小鼠代替豚鼠。当豚鼠或小鼠放血时，通过使用体内或体外血清学方法进行的毒素中和试验的方式滴定个体动物的抗毒素水平，所述血清学方法已在测试类型的疫苗上验证。在一个实施方案中，在包含动物来源的组分的发酵培养基中产生的白喉类毒素用于验证。使用适当的统计方法计算本发明组合物的效力。对于三稀释测定，效力估计的95％置信区间的极限在估计的效力的50-200％内，除非估计的效力的95％置信区间的下限大于30IU/单一人剂量。当进行单稀释试验时，证明试验疫苗的效力显著大于30IU/人剂量。

通过IU测量，组合物通常包含至少30IU/剂。组合物通常包含20至80Lf/ml的白喉类毒素，通常约50Lf/ml。用于青少年和成人的加强疫苗通常含有介于4Lf/mL和8Lf/ml之间的白喉类毒素，例如2.5Lf，优选4Lf/0.5ml剂量。儿科疫苗通常含有介于20和50Lf/ml之间的白喉类毒素，例如10Lf或25Lf/0.5ml剂量。

蛋白质制品的纯度可以通过特定蛋白与总蛋白的比率来表示。组合物中白喉类毒素的纯度通常以每单位质量蛋白质(不可透析)氮的Lf白喉类毒素的单位表示。例如，非常纯的毒素/类毒素可具有大于1700Lf/mg N的纯度，表明组合物中的大部分或全部蛋白质是白喉毒素/类毒素[19]。

破伤风

破伤风梭菌引起破伤风。破伤风毒素可被处理以产生保护性类毒素。类毒素用于破伤风疫苗，并且是本领域熟知的。因此，本发明的组合疫苗可以包括破伤风类毒素。优选的破伤风类毒素是通过甲醛处理制备的那些。破伤风类毒素可通过使破伤风梭菌在生长培养基(例如来源于牛酪蛋白的Latham培养基)中生长，随后进行甲醛处理、超滤和沉淀来获得。用于生长破伤风梭菌的生长培养基可以不含动物来源的组分。然后可以通过包括无菌过滤和/或透析的方法处理材料。

破伤风类毒素可以吸附到佐剂上，例如铝盐佐剂。

破伤风类毒素的量可以以“Lf”单位表示(参见下文)，其定义为当与一个国际单位的抗毒素混合时产生最佳絮凝混合物的类毒素的量[14]。NIBSC提供了每安瓿含有690LF的‘The 2nd International Reference Reagent for Tetanus Toxoid For FlocculationTest’(NIBSC代码：04/150)，通过该试剂可以校准测量值。

用于青少年和成人的加强疫苗通常含有5Lf破伤风类毒素/0.5ml剂量。儿科疫苗通常含有介于5和10Lf之间的破伤风类毒素/0.5ml剂量。

破伤风类毒素的免疫效力以国际单位(IU)测量，通过将组合物在实验室动物(通常为豚鼠)中提供的保护与参照疫苗进行比较来评估，例如使用每安瓿含有469IU的NIBSC’s‘Tetanus Toxoid Adsorbed Third International Standard 2000’[20,21]。本发明组合物中破伤风类毒素的效力应为每剂至少35IU，例如至少70IU/ml。更具体地，本发明组合物中破伤风类毒素的效力为每剂至少40IU。然而，在用于成人和青少年的加强疫苗中，20IU/剂量的效力降低可能是可接受的，因为与意图用于初次免疫的儿科疫苗相比，抗原含量降低。

多重稀释测定可用于测定本发明组合物的效力。免疫后，通过皮下或皮内途径对豚鼠进行放血或挑战。或者，可以用小鼠代替豚鼠。当对豚鼠或小鼠放血时，通过使用体内或体外血清学方法进行的毒素中和试验的方式滴定个体动物的抗毒素水平，所述血清学方法已在测试类型的疫苗上验证。使用适当的统计方法计算本发明组合物的效力。当使用多重稀释试验时，95％置信区间的下限和上限应分别在估计效力的50-200％内。用于儿童初次免疫的破伤风疫苗的估计效力的95％置信下限不应低于40IU/单一人剂量。

组合物中破伤风类毒素的纯度通常以每单位质量蛋白质(不可透析)氮的Lf破伤风类毒素的单位表示。破伤风类毒素应具有至少1000Lf/mg N的纯度。

Hib

b型流感嗜血杆菌(“Hib”)引起细菌性脑膜炎。Hib疫苗通常基于荚膜糖抗原，其制备在本领域中充分证明。流感嗜血杆菌细菌可以在不存在动物来源的组分的情况下培养。Hib糖与载体蛋白缀合以增强其免疫原性，特别是在儿童中。这些缀合物中的典型载体蛋白是破伤风类毒素、白喉类毒素、白喉毒素的CRM197衍生物或来自血清群B脑膜炎球菌的外膜蛋白复合物(OMPC)。因此，本发明的组合疫苗可包含与载体蛋白缀合的Hib荚膜糖。

任何合适的活化化学和/或接头化学可用于Hib糖的缀合。糖通常在缀合前被活化或官能化。活化可涉及例如氰化试剂如CDAP(例如1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐[30，31])。其他合适的技术使用碳二亚胺、酰肼、活性酯、降冰片烷、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU；另见参考文献[32]的引言)。

经由连接基团的连接可以使用任何已知的方法制备，例如，参考文献[33]和[34]中描述的方法。一种类型的连接涉及多糖的还原胺化，将所得氨基与己二酸接头基团的一端偶联，然后将蛋白质偶联至己二酸接头基团的另一端[35,36,37]。其它接头包括B-丙酰胺[38]、硝基苯基-乙胺[39]、卤代酰基卤化物[40]、糖苷键[41,42,43]、6-氨基己酸[44]、ADH[45]、C₄至C₁₂部分[46]等。作为使用接头的替代方案，可以使用直接连接。与蛋白质的直接连接可包括多糖的氧化，随后与蛋白质的还原胺化，如参考文献46和47中所述的。

破伤风类毒素可用于通常称为'PRP-T'的缀合物中。PRP-T可如下制备：使用溴化氰活化Hib荚膜多糖，将活化的糖偶联至己二酸接头(如(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)，通常为盐酸盐)，然后使接头-糖实体与破伤风类毒素载体蛋白反应。

CRM197白喉类毒素是另一种优选的Hib载体蛋白[47,48,49]。优选的缀合物包含经由己二酸琥珀酸二酯共价连接至CRM19的Hib糖。

缀合物的糖部分可以包含如从Hib细菌制备的全长多聚核糖基核糖醇磷酸酯(PRP)，和/或全长PRP的片段。可以使用具有介于1：5(即过量蛋白质)和5：1(即过量糖)之间的与糖：蛋白质比率(w/w)的缀合物，例如介于1：2和5：1之间的比率和介于1：1.25和1：2.5之间的比率。然而，在优选的疫苗中，糖与载体蛋白的重量比介于1：2.5和1：3.5之间。在破伤风类毒素同时作为抗原和作为载体蛋白二者存在的疫苗中，缀合物中糖与载体蛋白的重量比可介于1：0.3和1：2之间[52]。

Hib抗原的量通常以μg糖表示。疫苗中糖的浓度通常介于3至30μg/ml之间，例如20μg/ml。Hib缀合物的施用优选导致抗PRP抗体浓度≥0.15μg/ml，更优选≥1μg/ml，并且这些是标准响应阈值。在本发明的一些实施方案中，Hib多核糖基核糖醇磷酸酯是合成的，例如，如[52或54]中所述的。

乙型肝炎病毒

乙型肝炎病毒(HBV)是病毒性肝炎的原因。HBV病毒颗粒由被外部蛋白外壳或衣壳包围的内核组成，并且所述内核含有病毒DNA基因组。衣壳的主要组分是称为HBV表面抗原的蛋白质，或更通常“HBsAg”，其通常是分子量为～24kDa的226个氨基酸的多肽。所有现有的乙型肝炎疫苗都含有HBsAg，并且当将该抗原施用于正常患者时，其刺激抗HBsAg抗体的产生，所述抗HBsAg抗体防止HBV感染。因此，本发明的免疫原性组合物可包含HBsAg。

对于疫苗生产，HBsAg可以多种方式制备。例如，通过重组DNA方法表达蛋白质。用于本发明方法的HBsAg应当在例如酵母细胞中重组表达。合适的酵母包括酵母属(如酿酒酵母(S.cerevisiae))、汉逊酵母(Hanensula)(如多形汉逊酵母(H.polymorpha))或毕赤酵母宿主。酵母可以在不存在动物来源的组分的情况下培养。酵母表达的HBsAg通常是非糖基化的，且这是用于本发明免疫原性组合物的HBsAg的最优选形式。酵母表达的HBsAg是高度免疫原性的，并且可以在没有血液制品污染风险的情况下制备。从重组酵母中纯化HBsAg的许多方法是本领域已知的。

HBsAg通常为基本上球形颗粒的形式(平均直径约20nm)，包括含有磷脂的脂质基质。酵母表达的HBsAg颗粒可以包括在天然HBV病毒体中没有发现的磷脂酰肌醇。颗粒还可以包括非毒性量的LPS以刺激免疫系统[55]。如果在酵母的破碎过程中使用非离子表面活性剂，则颗粒可保留非离子表面活性剂(例如聚山梨醇酯20)[56]。

HBsAg优选来自HBV亚型adw2。

在细胞破碎之后，用于HBsAg纯化的优选方法涉及：超滤；尺寸排阻色谱；阴离子交换色谱；超速离心；脱盐；和无菌过滤。裂解液可以在细胞破碎之后沉淀(例如使用聚乙二醇)，从而使HBsAg留在溶液中，准备用于超滤。

纯化之后，可对HBsAg进行透析(例如用半胱氨酸)，其可用于去除在HBsAg制备过程中可能使用的任何汞防腐剂如硫柳汞[57]。

HBsAg的量通常以微克表示。含有HBsAg的组合疫苗通常包括介于5和60μg/ml之间。本发明组合物中HBsAg的浓度优选小于60μg/ml，例≤55μg/ml、≤50μg/ml、≤45μg/ml、≤40μg/ml等。约20μg/ml的浓度是典型的，例如10μg/剂。在本发明的一些实施方案中，组合物包括“低剂量”的HBsAg。这意味着组合物中HBsAg的浓度≤5μg/ml，例如<4、<3、<2.5、<2、<1等。因此，在典型的0.5ml单位剂量体积中，HBsAg的量小于2.5μg，例如<2、<1.5、<1、<0.5等。

脊髓灰质炎病毒

脊髓灰质炎病毒引起脊髓灰质炎。灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗(IPV)，如参考文献1的第24章中更详细公开的，在多年来是已知的。因此，本发明的组合疫苗可以包括灭活的脊髓灰质炎病毒抗原。

脊髓灰质炎病毒可以在细胞培养物中生长，且优选的培养物使用来源于猴肾的Vero细胞系。Vero细胞可方便地为培养的微载体。生长之后，病毒体可以用如超滤、渗滤和色谱的技术纯化。当动物(特别是牛)材料用于细胞培养时，它们应从没有传染性海绵状脑病(TSE)，特别是没有牛海绵状脑病(BSE)的来源获得。优选地，脊髓灰质炎病毒在无动物来源的组分的培养基中培养的细胞中生长。

在施用于患者之前，脊髓灰质炎病毒必须灭活，这可以通过用甲醛(或优选非醛试剂)处理来实现。脊髓灰质炎可由三种类型脊髓灰质炎病毒中的一种引起。这三种类型是相似的并且引起相同的症状，但是它们在抗原性上非常不同，并且一种类型的感染不能防止其它类型的感染。因此，本发明优选使用三种脊髓灰质炎病毒抗原：脊髓灰质炎病毒1型(例如Mahoney株)，脊髓灰质炎病毒2型(例如MEF-1株)和脊髓灰质炎病毒3型(例如Saukett株)。脊髓灰质炎病毒1型、2型和3型的其它毒株是本领域已知的，且也可以使用。病毒优选单独生长、纯化和灭活，然后组合得到用于本发明的本体三价混合物。

IPV的量通常以“DU”单位(“D-抗原单位”[58])表示。组合疫苗通常每剂量包含每个脊髓灰质炎病毒类型1-100DU，例如约40DU的1型脊髓灰质炎病毒，约8DU的2型脊髓灰质炎病毒和约32DU的3型脊髓灰质炎病毒，但是可以使用比这些更低的剂量[59,60]，例如10-20DU的1型脊髓灰质炎病毒、2-4DU的2型脊髓灰质炎病毒和8-20DU的3型脊髓灰质炎病毒。本发明的组合疫苗可以包括“低剂量”的脊髓灰质炎病毒。对于1型脊髓灰质炎病毒，这意指病毒在组合物中的浓度为≤20DU/ml，例如<18、<16、<14、<12、<10等。对于2型脊髓灰质炎病毒，这意指病毒在组合物中的浓度为≤4DU/ml，例如<3、<2、<1、<0.5等。对于3型脊髓灰质炎病毒，这意指病毒在组合物中的浓度为≤16DU/ml，例如<14、<12、<10、<8、<6等。当存在1型、2型和3型脊髓灰质炎病毒中的所有三种时，三种抗原可以分别以5：1：4的DU比率存在，或以任何其他合适的比率存在，例如当使用Sabin株时，比率为15：32：45[61]。来自Sabin株的低剂量抗原特别有用，具有≤10DU的1型，≤20DU的2型和≤30DU的3型(每单位剂量，通常0.5ml)。

当使用IPV组分且脊髓灰质炎病毒在Vero细胞上生长时，疫苗组合物优选含有少于10ng/ml，优选≤1ng/ml，例如≤500pg/ml或≤50pg/ml的Vero细胞DNA，例如少于10ng/ml的Vero细胞DNA(其为≥50个碱基对长)。

制备组合疫苗

用于疫苗中的来自这些病原体的抗原性组分通常由缩写名称表示：'D'为白喉类毒素；'T'为破伤风类毒素；'P'为百日咳抗原，其中'aP'是无细胞的(例如至少包括本发明的OMV、PT和FHA以及任选地百日咳杆菌粘附素和/或FIM2/FIM3)；HBsAg为乙型肝炎表面抗原；'Hib'为缀合的流感嗜血杆菌b荚膜糖；且'IPV'为3价灭活的脊髓灰质炎病毒。

本发明的实施方案包括但不限于包含以下组分的组合疫苗：

–D、T、aP

–D、T、aP、IPV

–D、T、aP、HBsAg

–D、T、aP、Hib

–D、T、aP、Hib、IPV

–D、T、aP、HBsAg、Hib

–D、T、aP、HBsAg、IPV

–D、T、aP、HBsAg、IPV、Hib

这些组合疫苗可基本上仅由所列的抗原组成，或可进一步包括来自其它病原体的抗原。特别地，这些组合疫苗仅包含作为活性成分列出的抗原，但可以进一步包含赋形剂如佐剂、缓冲剂等。在一些实施方案中，aP组分由本发明的OMV、PT(优选遗传脱毒的PT)和FHA组成。在一些实施方案中，aP组分由本发明的OMV、PT(优选遗传脱毒的PT)、FHA和PRN组成。在一些实施方案中，aP组分由本发明的OMV、PT(优选遗传脱毒的PT)、FHA和FIM2/FIM3组成。在一些实施方案中，aP组分由本发明的OMV、PT(优选遗传脱毒的PT)、FHA、PRN和FIM2/FIM3组成。

对于儿科组合疫苗，D：T的比率通常大于1(即儿科疫苗通常具有以Lf单位计的过量D)，并且通常在2：1和3：1之间(以Lf单位测量)，例如2.5：1。相反，对于向青少年或成人(其通常已经接受至少一种包含D和T的儿科组合疫苗)施用的加强疫苗，T：D的比率通常大于1(即加强疫苗通常具有以Lf单位计的过量T)并且通常介于1.5：1和2.5：1之间，例如2：1。

一种有用的疫苗包括本发明的OMV和每单位剂量2Lf D、5Lf T、4μg PT-9K/129G、4μg FHA和8μg百日咳杆菌粘附素。另一种有用的疫苗包括本发明的OMV，以及每单位剂量25Lf D、10Lf T、25μg PT-9K/129G、25μg FHA和8μg百日咳杆菌粘附素。

当组合抗原组分以制备多价组合物时，抗原可以单独添加，或者它们可以预混合。当组合疫苗包含D和T抗原以及其它抗原时，预混合的DT组分可用于制备组合疫苗。该二价组分可与其它抗原组合。当D-T混合物用于制备组合疫苗时，混合物中白喉类毒素与破伤风类毒素的比率可介于2：1至3：1(以Lf单位测量)之间，优选介于2.4：1至2.6：1之间，例如优选2.5：1。

治疗方法

在本发明的第四方面，OMV或免疫原性组合物可用于在哺乳动物，特别是合适的哺乳动物中诱导免疫应答。合适的哺乳动物优选为人；免疫应答优选是保护性的并且优选涉及抗体。

本发明的免疫原性和药物组合物在体内用于引发针对目的免疫原的免疫应答。如本文所公开的，提供了在哺乳动物中产生免疫应答的方法，包括施用有效量的本发明的免疫原性组合物或药物组合物的步骤。免疫应答优选是保护性的，并且优选涉及抗体和/或细胞介导的免疫。该方法可以产生增强响应。

本发明还提供了本发明的免疫原性组合物或药物组合物，其用于在哺乳动物中引发免疫应答的方法中。

本发明还提供了本发明的OMV或OMV群体在制备用于在哺乳动物中产生免疫应答的药物中的用途。

通过这些用途和方法在哺乳动物中产生免疫应答，可以保护哺乳动物对抗各种疾病和/或感染，例如对抗如上所述的细菌和/或病毒疾病。OMV和组合物是免疫原性的，更优选是疫苗组合物。根据本发明的疫苗可以是预防性的(即预防感染)或治疗性的(即治疗感染)，但通常是预防性的。

哺乳动物，特别是合适的哺乳动物可以是人或大型兽医哺乳动物(例如马、牛、鹿、山羊和猪)。当疫苗用于预防用途时，人优选是儿童(例如幼儿或婴儿)或青少年；当疫苗用于治疗用途时，人优选是青少年或成人。用于儿童的疫苗也可以施用于成人，例如用于评价安全性、剂量、免疫原性等。

根据本发明制备的疫苗可用于治疗儿童和成人。因此，人类患者可以小于1岁、小于5岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁或至少55岁。在一些实施方案中，所述儿童是1岁以下的个体，例如小于一天，约1周龄、约2周龄、约3周龄、约4周龄、约2月龄、约3月龄、约4月龄、约5月龄、约6月龄、约7月龄、约8月龄、约9月龄、约10月龄、约11月龄、小于约12月龄。

接受疫苗的具体患者组是老年人(例如20-50岁、～60岁，且优选～65岁)、年轻人(例如～5岁或小于约12个月的婴儿)、住院患者、保健工作人员、武装服务和军事人员、孕妇、慢性病患者或免疫缺陷患者。然而，这些疫苗不仅仅适用于这些组，而且可更普遍地用于人群中。

本发明的组合物通常直接施用于患者。直接递送可以通过肠胃外注射(例如皮下、腹膜内、静脉内、肌内、皮内或注射至组织的间质空间)来实现。可选的递送途径包括直肠、口服(例如片剂，喷雾剂)、口腔、舌下、阴道、局部、透皮或经皮、鼻内、眼、耳、肺或其它粘膜施用。皮内和肌内施用是两种优选的途径。注射可通过针(例如皮下注射针)进行，但也可使用无针注射。典型的肌内剂量为0.5mL。

本发明可用于引发全身和/或粘膜免疫，优选引发增强的全身和/或粘膜免疫。

这些用途和方法优选用于预防和/或治疗由百日咳博德特氏菌和任选地白喉棒杆菌、破伤风梭菌、流感嗜血杆菌血清型b、脊髓灰质炎病毒和乙型肝炎病毒中的一种或多种引起的疾病。在一个优选的实施方案中，这些用途和方法用于预防由百日咳博德特氏菌引起的疾病。

预防疾病的受试者可能不与接受本发明免疫原性组合物的受试者相同。例如，可将免疫原性组合物施用于女性(妊娠前或妊娠期间)以保护后代(所谓的“母体免疫”)。妊娠女性的免疫通过由转移的母体抗体产生的被动免疫(“被动母体免疫”)为婴儿提供抗体介导的免疫。当母体抗体通过胎盘转移到胎儿时，被动免疫自然发生。被动免疫对婴儿特别重要，因为婴儿出生时没有任何主动获得性免疫。向怀孕女性施用本发明的组合物增强了女性的免疫力，且抗体通过胎盘传递给新生儿，从而赋予婴儿被动母体免疫。然而，婴儿的被动免疫只是暂时的，且在生命的头几周或几个月后开始下降。由于被动免疫只是暂时的，因此在被动免疫减弱之前，婴儿接受本发明组合物的施用以诱导婴儿的主动免疫可能是重要的。在出生后给婴儿施用第二免疫原性组合物诱导婴儿的主动免疫，并延长妊娠期间从母亲传递的免疫。

剂量可以是单剂量方案或多剂量方案。多剂量可用于初次免疫方案和/或加强免疫方案。在多剂量方案中，各种剂量可通过相同或不同途径施用，例如胃肠外初次免疫和粘膜加强免疫，粘膜初次免疫和胃肠外加强免疫等。多剂量通常以至少1周间隔施用(例如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约10周、约12周、约16周等)。在一个实施方案中，多剂量可以在出生后约6周、10周和14周施用，例如在6周、10周和14周的年龄时施用，如世界卫生组织的扩大免疫计划(“EPI”)中经常使用的。在替代实施方案中，间隔约2个月，例如间隔约7、8或9周施用两个初级剂量，随后在第二初级剂量后约6个月至1年，例如在第二初级剂量后约6、8、10或12个月施用一个或多个加强剂量。在另一个实施方案中，间隔约2个月，例如间隔约7、8或9周施用三个初级剂量，随后在第三初级剂量后约6个月至1年，例如在第三初级剂量后约6、8、10或12个月施用一个或多个加强剂量。

调节脂质A反应原性的方法

在第五方面，本发明涉及调节百日咳博德特氏菌的脂质A的反应原性的方法，其包括将选自LpxA和LpxD的至少一种基因稳定地整合到细菌的基因组中，其中：

(ii)所述LpxD基因编码与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少90％氨基酸序列同一性的LpxD蛋白。如上所述，革兰氏阴性细菌，特别是百日咳杆菌的脂质A的反应原性可以通过来自脂质A生物合成途径的外源酶，例如乙酰转移酶LpxA和LpxD的表达来调节。

LpxA和LpxD基因的基因组整合允许外源DNA的稳定表达而不需要抗生素选择。此外，令人惊讶的是，本发明人发现这些菌株不具有本领域中见到的生长缺陷。

定义

如在本公开和权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“所述”包括复数形式，除非上下文另外清楚地指明；即，除非另有说明，“一”是指“一个或多个”。

在诸如“A和/或B”的短语中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”和“B”。同样地，在诸如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施方案中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。

术语“包含”涵盖“包括”，例如“包含”X的组合物可包括其它物质，例如X+Y。词语“基本上”不排除“完全”，例如“基本上不含”Y的组合物可以完全不含Y。在一些实施方式中，术语“包含”是指包括指定的活性剂，例如所述的多肽，以及包括其它活性剂和药学上可接受的载体、赋形剂、软化剂、稳定剂等，如制药工业中已知的。在一些实施方式中，术语“基本上由...组成”是指组合物，其仅有的活性成分是指定的活性成分，例如抗原，然而，可以包括用于稳定、保存制剂等的其它化合物，但不直接涉及指定活性成分的治疗效果。过渡性短语“基本上由...组成”的使用是指权利要求的范围应解释为包括权利要求中所述的具体材料或步骤，以及不实质上影响所要求保护的发明的基本和新颖特征的那些。参见，In reHerz,537F.2d 549,551-52,190USPQ 461,463(CCPA 1976)(原文中强调)；还参见MPEP§2111.03。因此，当在本发明的权利要求中使用时，术语“基本上由...组成”不旨在解释为等同于“包含”。除非另有明确规定，否则术语“由...组成”及其变体意指“限于”。在某些领域，术语“包含由...组成的活性成分”可用于代替“基本上由...组成”。

与数值x相关的术语“约”意指在本领域普通技术人员所确定的特定值的可接受的情境误差范围内，其将部分取决于如何测量或确定该值，即测量系统的限制或特定目的所需的精确度，例如x±10％、x±5％、x±4％、x±3％、x±2％、x±1％。

词语“基本上”不排除“完全”，例如“基本上不含”Y的组合物可以完全不含Y，但可以包括在所有重要方面如同不含的情况发挥作用的情况，但其中数值表示存在一些杂质或物质。必要时，词语“基本上”可以从本发明的定义中省略。在说明书和权利要求书中使用特定值的情况下，除非另有说明，否则术语“基本上”意指对于特定值具有可接受的误差范围。

在方法涉及施用步骤的情况下，例如作为(a)、(b)、(c)等，这些旨在是顺序的，即步骤(c)在步骤(b)之后，步骤(b)在步骤(a)之前。抗体通常对它们的靶标具有特异性，即它们对靶标的亲和力高于不相关的对照蛋白如牛血清白蛋白的亲和力。

本专利说明书中引用的所有参考文献、专利或专利申请在此通过引用并入本文。

本发明的具体实施方案

实施方案1.一种重组百日咳博德特氏菌，其包含：

(i)至少一个编码LpxA蛋白的基因组LpxA基因，其中所述LpxA蛋白包含相对于SEQID NO：1的170位的突变和/或229位的突变；和/或

(ii)至少一个异源LpxD基因的基因组插入。

实施方案2.如实施方案1所述的重组百日咳博德特氏菌，其包含至少一个编码LpxA蛋白的基因组LpxA基因，其中所述LpxA蛋白包含相对于SEQ ID NO：1的170位的置换和/或229位的置换。

实施方案3.如实施方案1或2所述的重组百日咳博德特氏菌，其中所述LpxA蛋白包含相对于SEQ ID NO：1的170位的丝氨酸残基和/或229位的丙氨酸残基。

实施方案4.如实施方案3的重组百日咳博德特氏菌，其中当根据SEQ ID NO：1编号时，所述LpxA蛋白包含(i)170位的丝氨酸残基和(ii)229位的丙氨酸残基。

实施方案5.如实施方案4的重组百日咳博德特氏菌，其包含编码与SEQ ID NO：1或2具有至少80％氨基酸序列同一性的LpxA蛋白的LpxA基因。

实施方案6.如前述实施方案中任一项所述的重组百日咳博德特氏菌，其包含编码LpxA蛋白的LpxA基因，其中所述LpxA基因来源于副百日咳博德特氏菌(LpxA_Bpa)。

实施方案7.如前述实施方案中任一项所述的重组百日咳博德特氏菌，其包含编码LpxA蛋白的LpxA基因，其中所述LpxA蛋白具有SEQ ID NO：2。

实施方案8.如前述实施方案中任一项所述的重组百日咳博德特氏菌，其中所述异源LpxD基因编码与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少90％氨基酸序列同一性的LpxD蛋白。

实施方案9.如实施方案8所述的重组百日咳博德特氏菌，其中所述异源LpxD基因编码与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少95％氨基酸序列同一性的LpxD蛋白。

实施方案10.如实施方案9所述的重组百日咳博德特氏菌，其中所述异源LpxD基因编码具有选自由SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4组成的组的氨基酸序列的LpxD蛋白。

实施方案11.如前述实施方案中任一项所述的重组百日咳博德特氏菌，其中所述内源LpxA基因是灭活的和/或所述内源LpxD基因是灭活的。

实施方案12.如前述实施方案中任一项所述的重组百日咳博德特氏菌，其产生脂质A，其中(i)至少30％的C3'酰基链长度为约C₁₀至约C₁₂；和/或(ii)至少30％的C2'酰基链长度为约C₁₀至约C₁₂；和/或(iii)至少30％的C2酰基链长度为约C₁₀至约C₁₂。

实施方案13.如前述实施方案中任一项所述的重组百日咳博德特氏菌细菌，其产生脂质A，其中(i)至少30％的C3'酰基链长度为C₁₀至约C₁₂。

实施方案14.如前述实施方案中任一项所述的重组百日咳博德特氏菌，其产生脂质A，其中(i)至少30％的C3'酰基链长度为C10。

实施方案15.如前述实施方案中任一项所述的重组百日咳博德特氏菌，其产生脂质A，其中所述脂质A的基本上所有C3'酰基链具有C10长度。

实施方案16.如前述实施方案中任一项所述的重组百日咳博德特氏菌，其产生与亲代菌株产生的脂质A相比具有降低的内毒性活性的脂质A，特别是当使用TLR4刺激测定，特别是人TLR4刺激测定测量时。

实施方案17.如前述实施方案中任一项所述的重组百日咳博德特氏菌，其中所述细菌的细菌群体的生长曲线与亲代菌株的群体的生长曲线相当。

实施方案18.如前述实施方案中任一项所述的重组百日咳博德特氏菌，其中所述细菌来源于Tohama I菌株并表达遗传脱毒的百日咳类毒素PT-9K/129G。

实施方案19.一种外膜囊泡(OMV)，其来源于如实施方案1至18中任一项所述的重组百日咳博德特氏菌，其包含掺入所述膜中的经修饰的脂质A，其中所述脂质A的基本上所有C3'酰基链具有C₁₀的长度和/或其中脂质A的基本上所有C2和C2'酰基链具有C₁₂的长度。

实施方案20.如实施方案19所述的分离的外膜囊泡，其包含掺入所述膜中的经修饰的脂质A，其中所述脂质A的基本上所有C3'酰基链具有C10长度。

实施方案21.如实施方案19或20所述的分离的外膜囊泡，其基本上不含皮肤坏死毒素和/或其含有内源性遗传脱毒的百日咳类毒素。

实施方案22.一种免疫原性组合物，其包含至少一种如实施方案19至21所述的分离的OMV和药学上可接受的赋形剂。

实施方案23.如实施方案22所述的免疫原性组合物，其还包含至少一种选自以下的另外的抗原：(1)百日咳类毒素(PT)、(2)FHA、(3)百日咳杆菌粘附素(PRN)、(4)FIM2/FIM3、(5)腺苷酸环化酶、(6)白喉类毒素(DT)、(7)破伤风类毒素(TT)、(8)灭活的脊髓灰质炎病毒(IPV)、(9)乙型肝炎表面抗原和(10)Hib PRP。

实施方案24.如实施方案19至21所述的OMV或如实施方案22或23所述的免疫原性组合物，其用于在合适的哺乳动物例如人中诱导免疫应答。

实施方案25.如实施方案19至21所述的OMV或如实施方案22或23所述的免疫原性组合物，其用于预防或用作疫苗，例如用于预防由百日咳博德特氏菌引起的疾病。

实施方案26.如实施方案19至21所述的OMV或如实施方案22或23所述的免疫原性组合物，其用于预防由百日咳博德特氏菌引起的疾病。

实施方案27.一种调节百日咳博德特氏菌的脂质A的反应原性的方法，其包括将选自LpxA和LpxD的至少一种基因稳定地整合到所述细菌的基因组中，其中：

实施方案28.一种重组百日咳博德特氏菌，其包含至少一个编码LpxA蛋白的基因组LpxA基因，其中所述LpxA蛋白包含170位的丝氨酸残基和229位的丙氨酸残基(相对于SEQID NO：1)，并且其中所述LpxA基因编码与SEQ ID NO：1或2具有至少80％同一性的氨基酸序列。

实施方案29.一种重组百日咳博德特氏菌，其包含至少一个编码LpxA蛋白的附加型LpxA基因，其中所述LpxA蛋白包含170位的丝氨酸残基和229位的丙氨酸残基(相对于SEQID NO：1)，并且其中所述LpxA基因编码与SEQ ID NO：1或2具有至少80％同一性的氨基酸序列。

实施方案30.一种重组百日咳博德特氏菌，其包含(i)至少一个编码LpxA蛋白的基因组LpxA基因，其中所述LpxA蛋白包含170位丝氨酸残基和229位丙氨酸残基(相对于SEQID NO：1)，并且其中所述LpxA基因编码与SEQ ID NO：1或2具有至少80％同一性的氨基酸序列，和(ii)至少一个异源LpxD基因的基因组插入，其中所述异源LpxD基因编码与SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：4具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

实施方案31.一种重组百日咳博德特氏菌，其包含至少一种编码LpxA蛋白的附加型LpxA基因，其中所述LpxA蛋白包含170位的丝氨酸残基和229位的丙氨酸残基(相对于SEQID NO：1)，并且其中所述LpxA基因编码与SEQ ID NO：1或2具有至少80％同一性的氨基酸序列，和(ii)至少一个异源LpxD基因的基因组插入，其中所述异源LpxD基因编码与SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：4具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

实施方案32.一种重组百日咳博德特氏菌，其包含至少一个异源LpxD基因的基因组插入，其中所述异源LpxD基因编码与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

实施方案33.一种重组百日咳博德特氏菌，其包含至少一个编码LpxA蛋白的基因组LpxA基因，其中所述LpxA蛋白包含170位丝氨酸残基和229位丙氨酸残基(相对于SEQ IDNO：1)，并且其中所述LpxA基因编码与SEQ ID NO：1或2具有至少80％同一性的氨基酸序列，并且其中所述细菌来源于Tohama菌株并表达遗传脱毒的百日咳类毒素PT-9K/129G。

实施方案34.一种包含至少一个编码LpxA蛋白的附加型LpxA基因的重组百日咳博德特氏菌，其中所述LpxA蛋白包含170位丝氨酸残基和229位丙氨酸残基(相对于SEQ IDNO：1)，并且其中所述LpxA基因编码与SEQ ID NO：1或2具有至少80％同一性的氨基酸序列，并且其中所述细菌来源于Tohama I菌株并表达遗传脱毒的百日咳类毒素PT-9K/129G。

实施方案35.一种重组百日咳博德特氏菌，其包含(i)至少一个编码LpxA蛋白的基因组LpxA基因，其中所述LpxA蛋白包含170位的丝氨酸残基和229位的丙氨酸残基(相对于SEQ ID NO：1)，并且其中所述LpxA基因编码与SEQ ID NO：1或2具有至少80％同一性的氨基酸序列，和(ii)至少一个异源LpxD基因的基因组插入，其中所述异源LpxD基因编码与SEQID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述细菌来源于Tohama I菌株并表达遗传脱毒的百日咳类毒素PT-9K/129G。

实施方案36.一种重组百日咳博德特氏菌，其包含至少一个编码LpxA蛋白的附加型LpxA基因，其中所述LpxA蛋白包含170位的丝氨酸残基和229位的丙氨酸残基(相对于SEQID NO：1)，并且其中所述LpxA基因编码与SEQ ID NO：1或2具有至少80％同一性的氨基酸序列，和(ii)至少一个异源LpxD基因的基因组插入，其中所述异源LpxD基因编码与SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：4具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述细菌来源于Tohama I菌株并表达遗传脱毒的百日咳类毒素PT-9K/129G。

实施方案37.一种重组百日咳博德特氏菌，其包含至少一个异源LpxD基因的基因组插入，其中所述异源LpxD基因编码与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述细菌来源于Tohama I菌株并表达遗传脱毒的百日咳类毒素PT-9K/129G。

实施方案38.一种重组百日咳博德特氏菌，其包含至少一个编码LpxA蛋白的基因组LpxA基因，其中所述LpxA蛋白包含170位的丝氨酸残基和229位的丙氨酸残基(相对于SEQID NO：1)，并且其中所述LpxA基因编码与SEQ ID NO：1或2具有至少80％同一性的氨基酸序列，并且其中所述细菌来源于Tohama I菌株，表达遗传脱毒的百日咳类毒素PT-9K/129G，并且不表达皮肤坏死毒素(DNT)基因(SEQ ID NO：19)。

实施方案39.一种重组百日咳博德特氏菌，其包含至少一个编码LpxA蛋白的附加型LpxA基因，其中所述LpxA蛋白包含170位的丝氨酸残基和229位的丙氨酸残基(相对于SEQID NO：1)，并且其中所述LpxA基因编码与SEQ ID NO：1或2具有至少80％同一性的氨基酸序列，并且其中所述细菌来源于Tohama I菌株，表达遗传脱毒的百日咳类毒素PT-9K/129G，并且不表达皮肤坏死毒素(DNT)基因(SEQ ID NO：19)。

实施方案40.一种重组百日咳博德特氏菌，其包含(i)至少一个编码LpxA蛋白的基因组LpxA基因，其中所述LpxA蛋白包含170位的丝氨酸残基和229位的丙氨酸残基(相对于SEQ ID NO：1)，并且其中所述LpxA基因编码与SEQ ID NO：1或2具有至少80％同一性的氨基酸序列，和(ii)至少一个异源LpxD基因的基因组插入，其中所述异源LpxD基因编码与SEQID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述细菌来源于Tohama I菌株，表达遗传脱毒的百日咳类毒素PT-9K/129G，并且不表达皮肤坏死毒素(DNT)基因(SEQ ID NO：19)。

实施方案41.一种重组百日咳博德特氏菌，其包含至少一个编码LpxA蛋白的附加型LpxA基因，其中所述LpxA蛋白包含170位的丝氨酸残基和229位的丙氨酸残基(相对于SEQID NO：1)，并且其中所述LpxA基因编码与SEQ ID NO：1或2具有至少80％同一性的氨基酸序列，和(ii)至少一个异源LpxD基因的基因组插入，其中所述异源LpxD基因编码与SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：4具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述细菌源自Tohama I菌株，表达遗传脱毒的百日咳类毒素PT-9K/129G，并且不表达皮肤坏死毒素(DNT)基因(SEQ ID NO：19)。

实施方案42.一种重组百日咳博德特氏菌，其包含至少一个异源LpxD基因的基因组插入，其中所述异源LpxD基因编码与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述细菌来源于Tohama I菌株，表达遗传脱毒的百日咳类毒素PT-9K/129G，并且不表达皮肤坏死毒素(DNT)基因(SEQ ID NO：19)。

实施方案43.一种分离的外膜囊泡(OMV)，其来源于实施方案28至42中任一项所述的重组百日咳博德特氏菌，所述外膜囊泡包含掺入所述膜中的经修饰的脂质A，其中所述脂质A的基本上所有C3'酰基链具有C₁₀的长度和/或其中所述脂质A的基本上所有C2和C2'酰基链具有C₁₂的长度。

实施方案44.一种分离的外膜囊泡(OMV)，所述外膜囊泡来源于实施方案28至42中任一项所述的重组百日咳博德特氏菌，所述外膜囊泡包含掺入到所述膜中的经修饰的脂质A，其中所述脂质A的基本上所有C3'酰基链具有C10长度。

实施方案45.一种免疫原性组合物，特别是药物组合物如疫苗，其包含免疫有效量的如实施方案43或44所述的分离的OMV和药学上可接受的载体。

实施方案46.如实施方案1至18中任一项所述的重组百日咳博德特氏菌，其中所述细菌包含异源LpxE基因的基因组插入。

实施方案47.如实施方案46所述的重组百日咳博德特氏菌，其中所述异源LpxE基因来自豌豆根瘤菌(LpxE_Rl)。

实施例48.如实施方案47所述的重组百日咳博德特氏菌，其中由所述异源LpxE基因编码的氨基酸序列是SEQ ID NO：6。

实施方案49.如实施方案46所述的重组百日咳博德特氏菌，其中所述异源LpxE基因来自新凶手弗朗西斯菌(LpxE_Fn)。

实施方案50.如实施方案49所述的重组百日咳博德特氏菌，其中由所述异源LpxE基因编码的氨基酸序列是SEQ ID NO：7。

实施方案51.如实施方案46至50中任一项所述的重组百日咳博德特氏菌，其中所述异源LpxE基因在BP0840启动子的控制下。

实施方案52.如实施方案46至51中任一项所述的重组百日咳博德特氏菌，其中所述异源LpxE基因被插入细菌基因组中。

实施方案53.如实施方案52所述的重组百日咳博德特氏菌，其中所述异源LpxE基因替代ArnT基因的基因座(ΔArnT)。

实施方案54.如实施方案1至18中任一项所述的重组百日咳博德特氏菌细菌，其中所述细菌包含异源LpxF基因的基因组插入。

实施方案55.如实施方案54所述的重组百日咳博德特氏菌，其中所述异源LpxF基因来自新凶手弗朗西斯菌(LpxF_Fn)。

实施方案56.如实施方案55所述的重组百日咳博德特氏菌，其中由所述异源LpxF基因编码的氨基酸序列是SEQ ID NO：8。

实施方案57.如实施方案54至56中任一项所述的重组百日咳博德特氏菌，其中所述异源LpxF基因在BP0840启动子的控制下。

实施方案58.如实施方案54至57中任一项所述的重组百日咳博德特氏菌，其中将所述异源LpxF基因插入到所述细菌基因组中。

实施方案59.如实施方案58所述的重组百日咳博德特氏菌，其中所述异源LpxF基因替代ArnT基因的基因座(ΔArnT)。

实施本发明的方式

细菌菌株和基因序列

表1至3列出了使用的关键细菌菌株、DNA和氨基酸序列：

重组细菌菌株的产生和培养

异源Lpx基因通过基因组整合或附加型(非基因组)表达在百日咳博德特氏菌中表达。

基因组整合

使用侧翼的EcoRI和HindIII限制性位点将含有目标LpxA_Bpa序列(SEQ ID NO：9)和允许同源重组的上游和下游同源臂(SEQ ID NO：14和15)的合成序列克隆到载体pSORTP1[62]中。载体pSORTP1含有接合转移的起点、庆大霉素和氨苄青霉素选择标记和赋予链霉素敏感性的rpsL基因拷贝。

将pSORTP1载体转化到大肠杆菌SM10λpir中并将重组克隆与萘啶酮酸/链霉素抗性的百日咳博德特氏菌Tohama I共培养以允许载体的接合转移。该菌株的链霉素抗性由rpsL基因中的突变赋予。质粒不能在百日咳博德特氏菌中复制并需要通过同源重组整合到细菌基因组中以赋予庆大霉素抗性。通过同时庆大霉素(以去除野生型百日咳博德特氏菌)和萘啶酮酸(以去除大肠杆菌SM10供体菌株)上的选择获得重组百日咳博德特氏菌。含有rpsL基因的功能性拷贝的pSORTP1载体的基因组引入使百日咳博德特氏菌对链霉素敏感。链霉素上的选择迫使通过转基因另一侧的第二同源重组事件去除载体骨架以实现无标记突变。使用这种方法，我们获得了表达来自副百日咳博德特氏菌的LpxA序列的重组百日咳博德特氏菌Tohama I菌株。许多另外的菌株构建如下：

在菌株ΔArnT/PagL_Bbr中，百日咳博德特氏菌基因组中的ArnT基因座被百日咳博德特氏菌BP0840(外膜孔蛋白)的启动子区控制下的支气管败血博德特氏菌PagL基因的拷贝替代。用含有支气管败血博德特氏菌PagL序列的ArnT上游和下游区域构建重组序列。使用侧翼的EcoRI和HindIII限制性位点将重组序列克隆到载体pSORTP1中。在转化之后，如上所述，所得菌株组合了ArnT基因的敲除和PagL基因的表达。

在菌株ΔArnT/ΔLpxA_Bpe/LpxA_Bpa中，百日咳博德特氏菌基因组中的ArnT基因座(SEQ ID NO：20)被敲除。

在菌株ΔLpxA_Bpe/LpxA_Bpa/ΔDNT/LpxD_Pa/ΔLpxD_Bpe中，将LpxD_pa的拷贝整合到基因组(SEQ ID NO：21)中，替代皮肤坏死毒素(DNT)基因(SEQ ID NO：19)。随后敲除野生型LpxD_Bp。

在菌株LpxE_Fn/ΔArnT/ΔLpxA_Bpe/LpxA_Bpa中，百日咳博德特氏菌基因组中的ArnT基因座(SEQ ID NO:20)被百日咳博德特氏菌BP0840(SEQ ID NO:17)的启动子区控制下的新凶手弗朗西斯氏菌LpxE基因的拷贝(外膜孔蛋白SEQ ID NO:22)所替代。用含有新凶手弗朗西斯菌LpxE序列的ArnT上游和下游区域构建重组序列。使用侧翼的EcoRI和HindIII限制性位点将重组序列克隆到载体pSORTP1中。在转化后，如上所述，所得菌株组合了ArnT基因的敲除和LpxE基因的表达。

附加型表达

使用侧翼Acc65I和HindIII位点将合成的序列克隆到载体pMMB67EH(ATCC参考：37622)中。对编码LpxD_Ct、LpxD_Pa、LpxE_Fn、LpxE_Rl和LpxF_Fn的序列进行密码子优化以在百日咳博德特氏菌中表达(PriorityGENE service，GENEWIZ)。

将含有异源LpxD、LpxE或LpxF基因的pMMB67EH载体转化到大肠杆菌SM10λpir且重组克隆与萘啶酮酸/链霉素抗性的百日咳博德特氏菌菌株Tohama I共培养以允许载体的接合转移。然后在氨苄青霉素和萘啶酸上选择含有pMMB67EH质粒的重组百日咳博德特氏菌。通过异源Lpx序列的PCR检测证实了用相应的pMMB67EH构建体对百日咳博德特氏菌TohamaI的稳定转化。

百日咳博德特氏菌重组菌株在标准条件下在市售培养基(参见63)中生长；培养基补充有1mM IPTG用于附加型表达。

重组百日咳博德特氏菌ΔLpxA_Bpe/LpxA_Bpa的生长评估

为了评估对细菌生长的任何潜在影响，在10L发酵中测试了重组菌株ΔLpxA_Bpe/LpxA_Bpa。

简单地说，用两个完全Bordet-Gengou琼脂平板接种两个30mL，24h预培养物，然后将30mL预培养物接种到另外两个1L的24h预培养物中；然后用这两个二次预培养物(约1.5L)接种OD_650nm为1的10L发酵罐。

在约9小时观察到溶解氧(DO)浓度下降；这种下降与由于培养物的指数生长率引起的氧消耗的增加有关。然后通过搅拌速度控制DO。

37.5小时之后发酵过程的结束通过由氧消耗减少引起的搅拌速度降低进行表征，氧消耗减少是主要碳源(Na-L-谷氨酸)耗尽的证据。收获时的光密度(OD_650nm)为10.1，细胞存活力为6.3×10¹⁰(CFU/ml)。

总之，ΔLpxA_Bpe/LpxA_Bpa的发酵曲线与Tohama I PTg菌株的发酵曲线相当，具有相似的发酵时间和经过时间与DO(表5，图3-5)。

表5.百日咳博德特氏菌ΔLpxA_Bpe/LpxA_Bpa和Tohama I PT的发酵参数

	ΔLpxA<sub>Bpe</sub>/LpxA<sub>Bpa</sub>	Tohama I PTg的平均值(n＝3)
			达到DO调节经过的时间(h)	9	9.1+/-2.1
发酵持续时间(h)	37.5	36.7+/-3.7
			光密度(OD<sub>650nm</sub>)	10.1	9.2+/-0.3
存活力(CFU/ml)	6.3 10<sup>+10</sup>	3.6 10<sup>+10</sup>+/-1.1 10<sup>+10</sup>

OMV产生

外膜囊泡(OMV)由细菌培养物产生，用于LPS结构的质谱分析以及人TLR4受体的体外刺激。培养24小时之后，用去污剂提取从细菌沉淀中产生OMV。

简言之，将细菌沉淀重悬于20mM Tris-HCl、2mM EDTA和50U/mL全能核酸酶(benzonase)，pH8.6中并在室温下孵育30分钟。对于OMV的去污剂提取，添加0.1％DOC并将悬浮液在40℃下孵育30min。通过以20000g离心30分钟(4℃)去除细胞碎片，并将上清液无菌过滤(0.22μm)。然后将无菌上清液超速离心(145000g，2h，4℃)，再悬浮于1xPBS(含5mMEDTA)中，第二次超速离心(相同条件)，再悬浮于1xPBS(不含EDTA)中并进行无菌过滤(0.22μm)。

通过质谱的LPS结构表征

通过液相色谱质谱(LC-MS)分析OMV制剂以测定LpxA和/或LpxD(或LpxE)的基因组突变和异源LpxA和/或LpxD、LpxE或LpxF基因的附加型表达对LPS结构的影响。来自野生型菌株Tohama I PTg的OMV制剂用作对照。

简言之，用95％乙醇沉淀OMV制剂，干燥沉淀物并溶解在50％甲醇中和超声处理。将超声处理的材料离心并将5μL上清液注射到HPLC柱上用于LOS结构的MS分析。

LpxA重组菌株

LpxA_Bpa的基因组整合和表达对来自重组百日咳博德特氏菌ΔLpxA_Bpe/LpxA_Bpa的OMV的LPS结构具有显著影响。在C3'位的100％的酰基链显示从C₁₄至C₁₀的长度减少(图6(B)-虚线显示C₁₄至C₁₀减少)。相比之下，百日咳博德特氏菌Tomaha I中附加型LpxA_Bpa的表达具有非常低的，不可量化的影响(菌株LpxA_Bpa)；尽管C₁₄至C₁₀变体关于附加型LpxA_Bpa的表达仅少量存在，图7(B)仍然表明其中它可以不同于野生型(从C₁₄到C₁₀的长度减少)。作为参考，来自野生型百日咳博德特氏菌Tomaha I Ptg的LOS的结构分析示于图13。

当与ΔArnT组合时，LpxA_Bpa的基因组整合和表达对LPS结构具有类似的影响，其中在C3'位的100％的酰基链显示从C₁₄至C₁₀的长度减少(图8)。

重要的是，在菌株ΔLpxA_Bpe/LpxA_Bpa/ΔDNT/LpxD_Pa和ΔLpxA_Bpe/LpxA_Bpa/ΔDNT/LpxD_Pa/ΔLpxD_Bpe中，LpxA_Bpa的基因组整合和表达对C3'酰基链的长度也具有相同的影响，其中来自假单胞菌属的LpxD也被表达(图9和10)。外源LpxD基因的表达与相应内源LpxD的灭活对外源LpxA基因的活性没有不利影响。此外，没有观察到显著的生长差异。

类似地，在同时表达LpxEFn的菌株中，基因组整合和LpxABpa的表达对C3'酰基链长度的影响不受影响，100％表现出C₁₀的长度。

LpxD重组菌株

来自铜绿假单胞菌的LpxD(LpxD_Pa)的附加型表达仅对来自重组百日咳博德特氏菌的OMV的LPS结构具有部分影响(图11)，其中仅36％的总LPS在C2和C2'酰基链两者(24％)或仅在C2或C2'酰基链之一(12％)处显示减小的长度。

LpxD_pa的基因组表达增加了对LPS的影响，其中C2和C2'酰基链两者的长度在70％的LPS中减小，并且C2或C2'中仅一者的长度在30％的LPS中减小(图9)。去除LpxD_Bpe的剩余活性导致两个位置的100％链长度减小(ΔLpxA_Bpe/LpxA_Bpa/ΔDNT/LpxD_Pa/ΔLpxD_Bpe，图10)。

ΔArnT PagL重组菌株

ArnT的灭活和PagL的基因组整合导致C3处C10酯的100％去除(图12)。作为参考，来自野生型百日咳博德特氏菌Tomaha I Ptg的OMV的结构分析示于图13。

LpxE重组菌株

对于来自新凶手弗朗西斯菌(菌株B2982,9.8)的LpxE，LpxE_Fn，游离型表达导致25％的单磷酰脂质A。LpxE_Fn在野生型背景中的基因组表达将单磷酰脂质A的分数增加到91％。然而，相同构建体在LpxA突变体背景中的表达令人惊讶地仅产生24％的单磷酰脂质A。用来自豌豆根瘤菌(菌株B2983，9.9)的LpxE观察到类似的结果。

在野生型背景中表达LpxE_Fn和LpxE_Rc的重组菌株的结构数据在图18和19中提供(其它组合的表征数据未具体显示)。

LpxF重组菌株

关于来自新凶手弗朗西斯菌(菌株B2981，9.10)的LpxF，在有限的一组实验中，没有观察到对LOS结构的可鉴别的影响(图20)。

HEK-hTLR4细胞上TLR4信号传导活化的体外评估

TLR4信号传导级联的刺激可以导致NF-κB和/或激活蛋白1(AP-1)转录因子的激活，其有助于几种促炎细胞因子例如IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α的表达，并因此在炎症中起关键作用。

为了分析当使用来自重组百日咳博德特氏菌的纯化OMV时TLR4途径的信号传导活化是否降低。测定了在HEK-Blue^TM-hTLR4细胞(Invivogen)中的TLR4依赖性转录活性。

在用TLR4配体刺激后，NF-kB和AP-1的活化诱导碱性磷酸酶的分泌，这可以使用QUANTI-Blue^TM比色测定法在上清液中检测。测定TLR4受体应答，测量在655nm测量的上清液中NF-κB-和AP-1-依赖性SEAP产生。对于每个样品，一式三份测试三种不同的稀释液。可归因于TLR4刺激的信号的比例通过用抗TLR4抗体特异性阻断TLR4受体而显现，其中不相关的抗体(抗M72)用作对照。从各种重组百日咳博德特氏菌菌株获得的OMV激活TLR4信号传导的能力与从Tohama I PTg菌株获得的OMV进行比较(图14-17)。

对于通过蛋白质含量标准化的测定，包括BEXSERO(含有MenB OMV的MenB疫苗)、QUINVAXEM(wP疫苗)和INFANRIX HEXA(aP疫苗)作为对照。对于通过LPS含量标准化的测定，包括来自百日咳博德特氏菌的纯化的LPS、来自奈瑟氏球菌的脱毒的(LpxL1突变体)纯化LPS和无刺激的阴性对照。

HEK-hTLR4数据显示来自LpxA独立突变体ΔLpxA_Bpe/LpxA_Bpa的OMV对TLR4信号级联激活的显著降低。活化特性与INFANRIX HEXA相当(±0.5OD)，即TLR4信号级联的低活化。

用所有具有LpxA_Bpa基因组插入的重组百日咳博德特氏菌菌株，即ΔArnT/ΔLpxA_Bpe/LpxA_Bpa、ΔLpxA_Bpe/LpxA_Bpa/ΔDNT/LpxD_Pa和ΔLpxA_Bpe/LpxA_Bpa/ΔDNT/LpxD_Pa/ΔLpxD_Bpe，获得了类似的结果。

根据它们对LPS结构的部分影响，其中附加型表达LpxD的那些LpxD突变体诱导TLR4信号传导级联活化的更适度的降低。更具体地，用LpxD突变体观察到的OD₆₅₅值比在未刺激的细胞中观察到的OD₆₅₅值和/或用aP疫苗刺激的细胞观察到的OD₆₅₅值高(≥±0.5OD₆₅₅)，但比用来自野生型革兰氏阴性细菌的OMV刺激的细胞观察到的OD₆₅₅值低。在使用标准化的蛋白质和LPS的测定中观察到该降低。

ΔArnT突变在菌株ΔArnT/ΔLpxA_Bpe/LpxA_Bpa中的影响无法轻易得出，因为ΔLpxA_Bpe/LpxA_Bpa突变提供的TLR4刺激降低已经使读数饱和，并且无法观察到进一步降低。另一方面，对于来自菌株ΔArnT/PagL_Bbr的OMV，观察到TLR4刺激的增加。鉴于在两种ΔArnT突变株中均未观察到这种增加，假设这种增加是由通过PagL_Bbr活性去除C3酰基链引起的。

有趣的是，虽然LpxE突变体改变了脂质A的结构，但在使用的测定中，没有检测到TLR4刺激的显著降低(图21和22)。

在Balb/c小鼠的鼻咽定殖模型中进行的效力研究

本研究的目的是与用DTPA或DTPw疫苗接种的小鼠，或针对野生型百日咳博德特氏菌Tohama I菌株先前攻击的小鼠(恢复期小鼠)相比，评估dOMV候选疫苗与DTPa共同施用在鼻咽(NP)定殖模型中的影响。

实验设计：

将25只6周龄雌性Balb/c小鼠分配到下表6和7中列出的组中的一组。表6详述了涉及25只小鼠的第一研究。所有这些小鼠先前用10⁶CF/10μl野生型百日咳博德特氏菌TohamaI菌株攻击(恢复期小鼠)。本研究被称为“LIMS 20190306”。第二研究详见表7，并称为“LIMS20190307”。

两个研究都是为了在同一天用10⁵CF/10μl百日咳博德特氏菌Tohama I菌株进行攻击而建立的。因此，(LIMS 20190306的)恢复期小鼠年龄比(LIMS 20190307的)疫苗接种小鼠大。

通过计数Charcoal-céphalexin琼脂平板上的菌落生长或通过PCR定量测定的菌落形成单位(CFU)数量平均值的分布假设为对数正态分布。统计方法是，通过方法(经典的或通过定量)，用2个因子(疫苗和天)及其相互作用对log10值进行方差分析(ANOVA)。

表6

表7

结果：

体液免疫应答示于图23。图23表示在第28天通过ELISA测量的抗-PPRN IgG的单个抗体滴度，以及源自ANOVA模型的几何平均滴度(GMT)和它们的95％置信区间。注意，研究20190306中的组已经在第28天和第56天进行了评价。

对于在第28天通过ELISA测量的抗PRN IgG，在所有接种组(Infanrix、Easy Five、OMV LPXA和OMV WT)中观察到免疫原性。然而，与其它接种组相比，在Easy Five接种之后观察到较低的免疫原性(GMR>3)。此外，在2个时间点D28和D56，与接种组相比，恢复期小鼠显示出低得多的免疫原性(GMT分别为136和346)。

保护的评估涉及细菌负荷，其定义为每个收集时间(攻击后+2h和第4、7、13、21天)的每鼻腔菌落形成单位(CFU)的平均数。描述性统计在图24中给出。

无疫苗组(即表7的未接种疫苗组1)和所有其他组之间突出显示了细菌负荷的显著差异，表明接种疫苗或再感染后对鼻腔定殖有一定程度的保护性免疫反应。

与未接种疫苗的动物相比，在恢复期动物(表6)中观察到超过10log CFU减少(GMR＝258)，这证实了该组作为阳性对照的适用性。

总之，这表明该模型允许检测减少的鼻腔定殖。

与未接种疫苗的动物相比，且与单独的Infanrix(分别为GMR＝17.7和13.8)相比，但与未接种疫苗的(恢复期小鼠)组(分别为GMR＝4.2和GMR＝5.4)相比，对于OMV LpxA-Infanrix(GMR＝61)(表7的第5组)和OMV WT–Infanrix(GMR＝48)(表7的第4组)观察到大于1log的CFU减少。

与未接种疫苗和Infanrix(DTPa)接种的小鼠相比，用与DTPa共同施用的两种OMV疫苗接种同样减少了用百日咳博德特氏菌Tohama I菌株攻击后的鼻腔定殖。这表明与DTPa疫苗相比，OMV在预防鼻咽定殖上的附加效用。这也表明脂质A的脱毒不会负面影响鼻腔定殖的减少。

在Balb/c小鼠的肺清除模型中进行的效力研究

本研究的主要目的是评估与DTPa共同施用的dOMV疫苗在针对百日咳博德特氏菌PRN(-)菌株的保护性效力小鼠模型中的附加效用。

通过菌落形成单位的平均数(CFU-log10)确定每个收集时间(攻击后+2h和第2、5和8天)的每个肺的细菌负荷来评估保护效力。

实验设计：

将二十只6周龄雌性BALB/c随机分配至表8中详述的研究组之一。在第29天用5x10⁶ CFU/50μl的PRN(-)百日咳博德特氏菌菌株FR5388攻击小鼠。

表8

结果：

体液免疫应答示于图25。图25显示了在第28天(攻击前1天)通过ELISA测定的单个抗PRN IgG滴度，以及来自ANOVA模型的几何平均滴度(GMT)和它们的95％置信区间。通过图25中所有疫苗接种组中的抗PRN IgG观察的，证实了疫苗摄取。除了估计GMT比其它组低约3倍的“Easy-Five”组外，所有组都诱导相似的抗PRN反应。已检测到这些差异具有统计学显著性。

针对百日咳的保护性的评估涉及细菌负荷，其定义为每个收集时间(攻击后+2h和第2、5、8天)每个肺的菌落形成单位(CFU)数的平均值。描述性统计在图26中给出。如图26所示，无疫苗组与其它组之间的显著差异突出显示，表明用含百日咳的疫苗接种后的保护性免疫应答。在用Infanrix或Easy Five免疫的组中观察到部分保护。在用Infanrix免疫的组和也接受共同施用的dOMV的组之间观察到显著差异，表明dOMV在DTPa疫苗之上在PRNneg菌株的肺清除中的附加效用。

预期根据组获得不同的动力学特性(例如，Infanrix和Easy Five应该与所有其他组不同)，并且这通过统计学分析中组和天之间的显著相互作用反映。

与未接种疫苗组相比，在用OMV接种后观察到更高的CFU减少(在第5天GMR在130000和42000之间，在第8天等于127439)，并且与Infanrix或Easy Five组相比，在用OMV接种后观察到更高的CFU减少(在第5天和第8天GMR小于2000)。在这3个OMV组之间没有观察到差异。这些结果是积极的，因为它们表明OMV LpxA和OMV LpxA/LpxD在减少从百日咳博德特氏菌PRN阴性菌株定殖的肺清除方面与OMVWT同样有效。。

人PBC的刺激

实验设计：

进行实验以评估由经刺激的人外周血单核细胞(PBMC)分泌的反应原性生物标志物谱(先天细胞因子)。将从3个健康献血者收集的冷冻PBMC解冻并以5E6细胞/ml的浓度单独接种在96孔板中。然后将细胞与蛋白质等同制剂在37℃孵育24小时。如表9中详述，制备8个连续稀释液，它们之间具有5倍的梯级。在孵育结束时，在收获的培养物上清液中使用多重测定测量细胞因子。

制备人标准品和对照用于测试。在该测试中，测试了以下细胞因子：IL-6、L-10、TNF-α(“TFNa”)、L-1α(“IL-1a”)、IL-1β(“IL-1b”)和MIP-1α(“MIP1a”)。

表9：刺激条件

结果：

在不同系列稀释度的培养物上清液中测量了已知与反应原机制相关的六种细胞因子(即：IL-6、IL-10、TNF-α(“TFNa”)、IL-1α(“IL-1a”)、IL-1β(“IL-1b”)和MIP-1α(“MIP1a”))。图27对应于通过刺激和通过细胞因子(不包括在这些实验条件下改变细胞存活力的稀释#1)的3个供体的平均值。

图27显示，与OMV野生型(WT)相比，OMV LpxA显示降低的人PBMC的先天细胞因子分泌，表明具有LpxA突变的OMV的反应原性降低。

从分组细胞因子和所有稀释度上的稀释液(但仍排除稀释度#1)的Kruskal-Wallis曲线下面积(AUC)分析(参见图27和表9)，观察到吸附在Al(OH)3上的dOMV WT是诱导比Infanrix Hexa统计学上显著更高的先天细胞因子的唯一条件。在其它条件之间没有观察到统计学差异。与OMV WT相比，在LpxA或LpxA/LpxD上显示突变的非吸附dOMV显示人PBMC的先天细胞因子分泌减少的趋势，表明具有LpxA或LpxA/D突变的OMV的反应原性降低。由OMV LpxA诱导的先天细胞因子分泌水平与Bexsero在相同的范围内，并且倾向于低于全细胞疫苗。

应当理解，本发明仅通过示例的方式进行了描述，并且在保持所附权利要求限定的本发明的范围和精神内的同时可以进行修改。

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[69]WO2015/179270

Claims

1.一种重组百日咳博德特氏菌，其包含：

(i)至少一个编码LpxA蛋白的基因组LpxA基因，其中所述LpxA蛋白包含相对于SEQ IDNO：1的170位的突变和/或229位的突变；和/或

(ii)至少一个异源LpxD基因的基因组插入。

2.如权利要求1所述的重组百日咳博德特氏菌，其包含至少一个编码LpxA蛋白的基因组LpxA基因，其中所述LpxA蛋白包含相对于SEQ ID NO：1的170位的置换和/或229位的置换。

3.如权利要求1或2所述的重组百日咳博德特氏菌，其中所述LpxA蛋白包含相对于SEQID NO：1的170位的丝氨酸残基和/或229位的丙氨酸残基。

4.如权利要求3所述的重组百日咳博德特氏菌，其中当按照SEQ ID NO：1编号时，所述LpxA蛋白包含(i)170位的丝氨酸残基和(ii)229位的丙氨酸残基。

5.如权利要求4所述的重组百日咳博德特氏菌，其包含编码与SEQ ID NO：1或2具有至少80％氨基酸序列同一性的LpxA蛋白的LpxA基因。

6.如权利要求4所述的重组百日咳博德特氏菌，其包含编码具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的LpxA蛋白的LpxA基因。

7.如前述权利要求中任一项所述的重组百日咳博德特氏菌，其中所述异源LpxD基因编码与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少90％氨基酸序列同一性的LpxD蛋白。

8.如权利要求6所述的重组百日咳博德特氏菌，其中所述异源LpxD基因编码与SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：4具有至少95％氨基酸序列同一性的LpxD蛋白。

9.如权利要求7所述的重组百日咳博德特氏菌，其中所述异源LpxD基因编码具有选自SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的氨基酸序列的LpxD蛋白。

10.如前述权利要求中任一项所述的重组百日咳博德特氏菌，其中所述内源LpxA基因是灭活的和/或所述内源LpxD基因是灭活的。

11.如前述权利要求中任一项所述的重组百日咳博德特氏菌，其产生脂质A，其中(i)至少30％的C3'酰基链长度为约C₁₀至约C₁₂；和/或(ii)至少30％的C2'酰基链长度为约C₁₀至约C₁₂；和/或(iii)至少30％的C2酰基链长度为约C₁₀至约C₁₂。

12.如前述权利要求中任一项所述的重组百日咳博德特氏菌，其产生与亲代菌株产生的脂质A相比具有降低的内毒素活性的脂质A，特别是当使用TLR4刺激测定，特别是人TLR4刺激测定测量时。

13.如前述权利要求中任一项所述的重组百日咳博德特氏菌，其中所述细菌的细菌群体的生长曲线与亲代菌株群体的生长曲线相当。

14.一种分离的外膜囊泡(OMV)，其来源于如权利要求1至12中任一项所述的重组百日咳博德特氏菌，所述外膜囊泡包含掺入所述膜中的经修饰的脂质A，其中所述脂质A的基本上所有C3'酰基链具有C₁₀的长度和/或其中所述脂质A的基本上所有C2和C2'酰基链具有C₁₂的长度。

15.如权利要求13所述的分离的外膜囊泡，其基本上不含皮肤坏死毒素和/或其含有内源性遗传脱毒的百日咳类毒素。

16.一种免疫原性组合物，其包含至少一种如权利要求13至15中任一项所述的分离的OMV和药学上可接受的赋形剂。

17.如权利要求16所述的免疫原性组合物，其还包含至少一种选自以下的另外的抗原：(1)百日咳类毒素(PT)、(2)FHA、(3)百日咳杆菌粘附素(PRN)、(4)FIM2/FIM3、(5)腺苷酸环化酶、(6)白喉类毒素(DT)、(7)破伤风类毒素(TT)、(8)灭活的脊髓灰质炎病毒(IPV)、(9)乙型肝炎表面抗原和(10)Hib PRP。

18.如权利要求13至15中任一项所述的OMV或如权利要求16或17所述的免疫原性组合物，其用于在合适的哺乳动物例如人中诱导免疫应答。

19.如权利要求13至15中任一项所述的OMV或如权利要求16或17所述的免疫原性组合物，其用于预防或用作疫苗。

20.一种调节百日咳博德特氏菌的脂质A的反应原性的方法，其包括将至少一种选自LpxA和LpxD的基因稳定地整合到所述细菌的基因组中，其中：