CN117417419A - 一种百日咳毒素脱毒方法及无细胞百白破联合疫苗 - Google Patents
一种百日咳毒素脱毒方法及无细胞百白破联合疫苗 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117417419A CN117417419A CN202311723579.XA CN202311723579A CN117417419A CN 117417419 A CN117417419 A CN 117417419A CN 202311723579 A CN202311723579 A CN 202311723579A CN 117417419 A CN117417419 A CN 117417419A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- detoxification
- antigen
- pertussis
- glutaraldehyde
- formaldehyde
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 title claims abstract description 133
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 title claims abstract description 99
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 38
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 title claims abstract description 31
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 148
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 60
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 60
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 56
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 53
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 48
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 18
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 claims description 14
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 claims description 8
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 7
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 6
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 claims description 5
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 3
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 claims description 3
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 claims description 2
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 2
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 claims description 2
- 229940001442 combination vaccine Drugs 0.000 claims 3
- 241001090156 Huperzia serrata Species 0.000 claims 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 abstract description 14
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 abstract description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 3
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 abstract 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 56
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 53
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 53
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 39
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 34
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 34
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 28
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 24
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 23
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 19
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 18
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 15
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 15
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 15
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 13
- 229940124832 acellular pertussis vaccine Drugs 0.000 description 12
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 10
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 10
- 229940066827 pertussis vaccine Drugs 0.000 description 10
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 9
- 230000034994 death Effects 0.000 description 9
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 9
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 9
- 206010024378 leukocytosis Diseases 0.000 description 9
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 8
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 8
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 8
- BVHLGVCQOALMSV-JEDNCBNOSA-N L-lysine hydrochloride Chemical compound Cl.NCCCC[C@H](N)C(O)=O BVHLGVCQOALMSV-JEDNCBNOSA-N 0.000 description 7
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 229960005337 lysine hydrochloride Drugs 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000337 buffer salt Substances 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 230000036515 potency Effects 0.000 description 5
- 108010049290 ADP Ribose Transferases Proteins 0.000 description 4
- 102000009062 ADP Ribose Transferases Human genes 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 239000008098 formaldehyde solution Substances 0.000 description 4
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 108010038196 saccharide-binding proteins Proteins 0.000 description 4
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 4
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical class OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 3
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 229960004931 histamine dihydrochloride Drugs 0.000 description 3
- PPZMYIBUHIPZOS-UHFFFAOYSA-N histamine dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.NCCC1=CN=CN1 PPZMYIBUHIPZOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Chemical class 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- WTWSHHITWMVLBX-DKWTVANSSA-M sodium;(2s)-2-aminobutanedioate;hydron Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CC(O)=O WTWSHHITWMVLBX-DKWTVANSSA-M 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 101710194807 Protective antigen Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000002744 anti-aggregatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 description 2
- 210000000254 ciliated cell Anatomy 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 230000036449 good health Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 238000013215 result calculation Methods 0.000 description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 2
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 2
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 2
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108010000916 Fimbriae Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 206010025280 Lymphocytosis Diseases 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- -1 amine sulfate Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000003889 chemical engineering Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 208000023406 head swelling Diseases 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Substances N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 1
- 230000007888 toxin activity Effects 0.000 description 1
- 230000032895 transmembrane transport Effects 0.000 description 1
- 229940124856 vaccine component Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0016—Combination vaccines based on diphtheria-tetanus-pertussis
- A61K39/0018—Combination vaccines based on acellular diphtheria-tetanus-pertussis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/70—Multivalent vaccine
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Virology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明提供了一种百日咳毒素（PT）的脱毒方法及无细胞百白破联合疫苗，PT抗原采用甲醛和戊二醛作为脱毒剂；脱毒顺序为先用甲醛处理脱毒，再用戊二醛脱毒。脱毒后制备的吸附无细胞百白破联合疫苗具有良好的免疫原性和效价，毒性较低，安全、有效、质量可控。
Description
技术领域
本发明涉及疫苗技术领域，具体涉及一种百日咳毒素脱毒方法及无细胞百白破联合疫苗。
背景技术
百日咳是由百日咳杆菌引起的一种急性呼吸道传染病，主要发生在婴幼儿中。百日咳疫苗的免疫接种是预防百日咳的有效手段。
第一代疫苗，即从百日咳菌培养物的上清中纯化出含各种蛋白抗原而制备的疫苗，其中以丝状血凝素（FHA）、PT为主, 含有少量AGG。PT具有促淋巴细胞增多，激活胰岛细胞、组胺致敏等一系列生物学活性，是百日咳菌的主要毒力因子和保护性抗原，并只存在于百日咳菌中，须经化学或基因工程方法脱毒后才能作为疫苗成分。FHA是一种无毒的大分子多肽，与百日咳菌在上呼吸道纤毛细胞的粘附有关。经小鼠脑内攻击自动免疫和气雾攻击被动免疫均证实, PT、FHA是保护性抗原。这一代APV是含共纯化(co-purified) 各种蛋白抗原的混合物，不能人为控制各种抗原的比例，不同厂家、疫苗批间差异较大。
第二代疫苗是将各种抗原分别纯化后单独或混合而制备的疫苗，其中主要含PT、FHA、69KD蛋白( PRN )、菌毛蛋白( FIM，又称AGG)。PRN和FIM均与百日咳菌对呼吸道纤毛细胞的吸附有关，是保护性抗原。目前国内外开发的APV均是以PT为基础而组分各异的无细胞百白破(DTPa)三联疫苗。
第三代疫苗，即通过基因工程的方法获得单一或多种抗原成分，以确定的最适比例配比制备的APV。
PT是百日咳杆菌致病的主要毒力因子，同时也是其所产生的诸多生物活性物质中唯一不受争议的保护性抗原，百日咳杆菌是唯一能产生PT的细菌。PT是由Sl、S2、S3、S4和S5等5个亚单位以l：l：l：2：l的比例组成，为一个典型的“A-B核糖基转移酶”模式的细菌毒素。A部分由毒性亚基Sl构成，Sl主要具有识别PT生物学活性的功能，PT的大部分酶活性是Sl的作用，例如促淋巴细胞增多、激活胰岛素细胞、簇集CHO细胞生长和组胺致敏等，而B部分由S2、S3、S4(2个)和S5组成，参与真核细胞表面受体结合及毒性Sl亚基的跨膜运输。
由于PT的毒性可引起多种生物学反应，必须对其进行脱毒处理后才可用于组分百白破疫苗制备，目前PT脱毒的方式主要为化学脱毒和遗传脱毒。PT化学脱毒所采用的脱毒剂主要有甲醛、戊二醛、过氧化氢等。PT作为疫苗的有效组分，理论上脱毒后应失去毒性并保留良好的免疫原性。Oh H，et al.（Characterization of the carbohydrate bindingand ADP-ribosyltransferase activities of chemically detoxified pertussistoxins.Vaccine，2013，31(29):2988-2993）发现甲醛脱毒的PT丧失了大部分生化活性，但在2 ~3周内其生化活性便恢复至与天然PT相当的水平，易发生毒性逆转。戊二醛可使PT的糖类结合活性完全失去作用且不可逆，但并不能灭活PT的ADP-核糖基转移酶的活性。采用过氧化氢脱毒、EDTA、金属盐、硫酸铵共同脱毒，脱毒反应速率取决于过氧化氢、EDTA和金属盐。该方法脱毒过程中EDTA还会与金属盐螯合，反应复杂不易控制；同时由于缺乏抗聚集剂，在脱毒过程中蛋白质由于疏水作用聚集沉淀而不易除菌过滤，产量低，不适合大规模工业化生产。
脱毒条件对PT进行处理后，毒性和免疫原性也有很大的差异。Yuen CT ,et al.（Effect of different detoxification procedures on the residual pertussistoxin activities in vaccines. Vaccine, 2016, 34(18): 2129-2134）同时开展了3组实验,分别对戊二醛脱毒、甲醛脱毒、先戊二醛脱毒再用甲醛脱毒PT的各种特性进行考察。其中采用戊二醛脱毒的PT保留ADP-核糖基转移酶活性最高，其产生结合抗体水平以及导致小鼠组胺致敏活性也最高；先用戊二醛再结合甲醛实验组的ADP-核糖基转移酶活性、结合抗体水平以及小鼠组胺致敏的活性次之，甲醛脱毒实验组对酶活性的去除最强。另外,不同的脱毒方式会改变B寡聚体的糖结合位点,从而导致脱毒后的PT产生不同的糖结合谱。
发明内容
本发明在针对PT抗原进行脱毒研究的大量实验中意外发现甲醛和戊二醛脱毒顺序是影响脱毒后疫苗的免疫原性和效价的关键因素。具体如下：
本发明所采取的技术方案是：一种百日咳毒素（PT）的脱毒方法，包括如下步骤：将PT抗原先用甲醛处理脱毒，再用戊二醛脱毒。
具体地，所述PT抗原为纯化后的PT抗原；
具体地，采用百日咳杆菌接种于琼脂培养基上，经多级培养后，离心分离培养上清和菌体部分，离心上清进行PT抗原的纯化。
具体地，将离心上清液采用硫酸胺进行沉淀，沉淀复溶后，通过层析纯化，得到纯化后的PT抗原。
具体地，可选择甘油作为抗聚集剂，将PT抗原中加入甘油，优选地，甘油终浓度10%~50%（V/V）。
具体地，第一次脱毒，甲醛终质量浓度0.1%~5%，优选地为0.2%~2%。
具体地，可加入促交联剂促进甲醛和蛋白交联反应。优选地，促交联剂浓度为0.01%~0.1%（w/w）。
更具体地，加入甲醛溶液后再加入赖氨酸盐酸盐溶液控温脱毒反应。
具体地，甲醛脱毒过程温度为10~50℃。
具体地，甲醛脱毒时间为1~50天。
具体地，第二次脱毒，戊二醛终质量浓度0.1%~5%，优选地为0.2%~2%。
具体地，戊二醛脱毒温度为10~50℃。
具体地，戊二醛脱毒温度为1~24小时。
具体地，戊二醛脱毒后，加入天冬氨酸盐终止反应。优选地，终浓度为0.1~1M。
具体地，终止反应结束后，通过透析或超滤方式去除甲醛、戊二醛，优选地，超滤方法。
本发明提供了一种由本发明所述的方法制备得到的脱毒PT。
具体地，本发明所述的脱毒PT抗原的分子量大于120KDa。
具体地，本发明所述的所述脱毒PT抗原的平均粒径为10-20nm。
本发明提供一种无细胞百白破联合疫苗，包含百日咳鲍特氏杆菌（Bordetellapertussis）液体培养物上清部分的PT抗原；所述PT抗原利用上述的方法进行脱毒。
具体地，疫苗还包含百日咳鲍特氏杆菌（Bordetella pertussis）液体培养物上清部分的FHA抗原；和/或，
百日咳鲍特氏杆菌上清和菌体部分的PRN抗原；和/或，
白喉杆菌液体培养物上清部分的DT抗原；和/或，
破伤风杆菌液体培养物上清部分的TT抗原。
具体地，所述联合疫苗各抗原的含量为每剂含PT抗原5~40μg，FHA抗原5~40μg，PRN抗原2~20μg，DT抗原2~20Lf，TT抗原2~5Lf。
具体地，所述PT抗原经脱毒后，与铝佐剂进行吸附，优选地，氢氧化铝佐剂。
本发明的有益效果是：本发明对采用先用甲醛处理脱毒，再用戊二醛对PT抗原脱毒，利用该方式脱毒后疫苗的免疫原性和效价较高，特异性毒性较低，且不发生毒性逆转，在去除毒性的同时很好的保留了免疫原性。脱毒过程不发生抗原凝集沉淀，抗原回收率高，适合大规模工艺化生产。
附图说明
图1为PT纯化蛋白SDS-PAGE检测示意图；
图2为PT纯化蛋白经甲醛和戊二醛脱毒后PT类毒素SDS-PAGE检测示意图；
图3为PT类毒素粒径检测示意图；
图4为疫苗免疫原性比较（JMP软件分析图）；
图5为质反应平行线法计算百日咳效价的软件截图（表6中批次1）；
图6为质反应平行线法计算百日咳效价的软件截图（表6中批次2）；
图7为质反应平行线法计算百日咳效价的软件截图（表6中批次3）。
具体实施方式
下面将结合本发明的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：PT抗原的获得
百日咳杆菌接种于琼脂培养基上，通过摇瓶、发酵罐逐级扩增菌种，发酵罐培养40小时后，采用连续流离心，分离培养上清和菌体部分，离心上清进行PT抗原的纯化。
将培养上清部分加入40%（W/V）硫酸铵进行沉淀，沉淀用缓冲液进行复溶，超滤换液。采用层析介质对超滤后的溶液进行纯化，得到纯化后的PT抗原（PT纯化蛋白）。采用SDS-PAGE法对PT纯化蛋白进行纯度检测，纯度不低于95%（图1）。
实施例2 PT抗原脱毒
将实施例1中的PT纯化蛋白中加入甘油、缓冲盐溶液中，PT纯化蛋白终浓度为200μg/ml，甘油终浓度50%（V/V）。
混合均匀后加入甲醛溶液和赖氨酸盐酸盐溶液，甲醛终浓度0.6%（w/w），赖氨酸盐酸盐终浓度0.05%（w/w）； 30℃条件下，脱毒25天；
甲醛反应结束后，加入终浓度为1%的戊二醛，在30℃条件下，脱毒12小时；加入终浓度为0.5M的天门冬氨酸钠终止反应， 30℃条件下反应2h。
采用100kDa截留分子量的超滤膜包，超滤换液至磷酸盐缓冲液中，去除甲醛、戊二醛，完成脱毒，除菌过滤。
利用上述相同方法制备3批次样品。
结果表明，经先甲醛再戊二醛脱毒后，PT抗原发生分子间和分子内的交联，脱毒后PT类毒素分子量变大，分子量＞120KDa（图2）。脱毒后PT类毒素粒径较小，且分布均匀（图3），蛋白未发生聚集现象，回收率＞80%；CHO细胞毒性为80μgPT不引起CHO细胞簇集，脱毒效果良好。
实施例3 吸附无细胞百白破疫苗免疫原性比较
实验组：将实施例2中脱毒后的PT类毒素与氢氧化铝进行吸附，得到PT原液。
将上述PT原液，与FHA原液、PRN原液、DT原液、TT原液按PT:FHA:PRN:DT:TT=25μg:25μg:10μg:15Lf:4Lf的比例进行混合，配制吸附无细胞百白破疫苗。
对照组1：将实施例1中的PT纯化蛋白中加入甘油、缓冲盐溶液中，PT纯化蛋白终浓度为200μg/ml，甘油终浓度50%（V/V）。
混合均匀后加入终浓度为1%的戊二醛，在30℃条件下，脱毒12小时；加入终浓度为0.5M的天门冬氨酸钠终止反应，30℃条件下反应2h。
戊二醛反应结束后，加入甲醛溶液和赖氨酸盐酸盐溶液，甲醛终浓度0.6%（w/w），赖氨酸盐酸盐终浓度0.05%（w/w）； 30℃条件下，脱毒25天；
采用100kDa截留分子量的超滤膜包，超滤换液至磷酸盐缓冲液中，去除戊二醛、甲醛，完成脱毒，除菌过滤。
将上述脱毒后的PT类毒素与氢氧化铝进行吸附，得到PT原液。
将上述PT原液，与FHA原液、PRN原液、DT原液、TT原液按PT:FHA:PRN:DT:TT=25μg:25μg:10μg:15Lf:4Lf的比例进行混合，配制吸附无细胞百白破疫苗。
对照组2：将实施例1中的PT纯化蛋白中加入甘油、缓冲盐溶液中，PT纯化蛋白终浓度为200μg/ml，甘油终浓度50%（V/V）。
混合均匀后加入终浓度为1%的戊二醛，在30℃条件下，脱毒12小时；加入终浓度为0.5M的天门冬氨酸钠终止反应， 30℃条件下反应2h。
戊二醛反应结束后，采用100kDa截留分子量的超滤膜包，超滤换液至磷酸盐缓冲液中，去除戊二醛，完成脱毒，除菌过滤。
将上述脱毒后的PT类毒素与氢氧化铝进行吸附，得到PT原液。
将上述PT原液，与FHA原液、PRN原液、DT原液、TT原液按PT:FHA:PRN:DT:TT=25μg:25μg:10μg:15Lf:4Lf的比例进行混合，配制吸附无细胞百白破疫苗。
对照组3：将实施例1中的PT纯化蛋白中加入甘油、缓冲盐溶液中，PT纯化蛋白终浓度为200μg/ml，甘油终浓度50%（V/V）。
混合均匀后加入甲醛溶液和赖氨酸盐酸盐溶液，甲醛终浓度0.6%，赖氨酸盐酸盐终浓度0.05%； 30℃条件下，脱毒25天；
采用100kDa截留分子量的超滤膜包，超滤换液至磷酸盐缓冲液中，去除甲醛，完成脱毒，除菌过滤。
将上述脱毒后的PT类毒素与氢氧化铝进行吸附，得到PT原液。
将上述PT原液，与FHA原液、PRN原液、DT原液、TT原液按PT:FHA:PRN:DT:TT=25ug:25ug:10ug:15Lf:4Lf的比例进行混合，配制吸附无细胞百白破疫苗。
试验动物：健康状况良好，体重12~14g 的NIH雌雄各半小鼠（SPF级）。
试验过程：选择健康状况良好的NIH小鼠，随机分组，每组10只，雌雄各半，分别腹腔注射给予1/3HD的实验组及对照组供试品；免疫两次，间隔两周。一免后14天每组小鼠眼眶采血，二免后14天即第28天将每组小鼠摘眼球采集全血，间接ELISA法测定血清PT抗体滴度。
Anti-PT IgG抗体检测：以有5μg/ml PT抗原的pH9.6碳酸盐缓冲液，过夜包被96孔酶标板。在1% BSA封闭后加梯度稀释的样本血清孵育1h，加入羊抗小鼠IgG-HRP 1h后，TMB显色液显色10 min，2N硫酸终止反应，在酶标仪读数。JMP软件进行统计分析。
表 1 不同脱毒步骤吸附无细胞百白破疫苗免疫后小鼠血清PT抗体滴度（log10）
结果如表1以及图4所示，结果表明：采用先用甲醛处理脱毒，再用戊二醛脱毒脱毒PT抗原，制备的无细胞百白破疫苗的PT抗体滴度较高，对比先用戊二醛处理脱毒，再用甲醛脱毒PT抗原以及单独使用甲醛处理脱毒或单独使用戊二醛处理脱毒，第一次免疫和第二次免疫PT抗体滴度均更高。
以上各图中，代表P＜0.05；/>代表P＜0.01；/>代表P＜0.001。
实施例4 吸附无细胞百白破疫苗（不同脱毒参数）效果验证
将实施例1中的PT纯化蛋白中加入甘油、缓冲盐溶液中，PT纯化蛋白终浓度为200μg/ml，甘油终浓度50%（V/V）；脱毒参数设置如下表2所示：
表2.吸附无细胞百白破疫苗不同脱毒参数实验设置
将上述脱毒后的PT类毒素与氢氧化铝进行吸附，得到PT原液。
将上述PT原液，与FHA原液、PRN原液、DT原液、TT原液按PT:FHA:PRN:DT:TT=25ug:25ug:10ug:15Lf:4Lf的比例进行混合，配制吸附无细胞百白破疫苗。
检测指标包括特异性毒性、效价以及毒性逆转三方面
1. 效价检测
按照《中国药典》三部（现行版）“吸附无细胞百白破联合疫苗3.2.4效价检测”进行效价测定。标准品为中国食品药品检定研究院第七代百日咳效力标准品，用生理盐水将百日咳效力标准品溶解至1IU/ml，然后5倍系列稀释至0.2IU/ml、0.04IU/ml。
待检品稀释：用生理盐水将供试品分别稀释8倍、40倍、200倍。
结果计算和判定：按质反应平行线法计算供试品效价，供试品按成品疫苗浓度稀释后，每1次人用剂量的免疫效价应不低于4.0 IU，且95%可信限的低限应不低于2.0 IU。
2. 特异性毒性
按《中国药典》三部（现行版）吸附无细胞百白破联合疫苗附录：无细胞百日咳疫苗原液制造及检定要求2.5项进行检测。
毒性参考品按照每批标示进行稀释，用体重14~16gNIH小鼠（雌性或雌雄各半），毒性参考品的每一稀释度和供试品各用一组，每组10只。每只小鼠腹腔注射0.5ml，分别进行小鼠白细胞增多试验和小鼠组胺致敏试验。
小鼠白细胞增多试验：于注射后3天分别取小鼠末梢血进行白细胞计数。使用全自动血细胞分析仪进行白细胞计数，将仪器输出的白细胞数取LOG值作为试验数据。将试验结果输入软件“Statistical Analysis”中22.Parallel Line Assay程序进行计算，根据计算结果，注射供试品的小鼠白细胞增多毒性的活性应不高于0.5LPU/ml。
小鼠组胺致敏试验：于注射后4天，每只小鼠腹腔注射0.5ml溶液（含二盐酸组胺4mg或二磷酸组胺2mg），30分钟后分别测小鼠肛温。将试验结果输入软件“StatisticalAnalysis”中22.Parallel Line Assay程序进行计算，根据计算结果供试品的小鼠组胺致敏毒性的活性应不高于0.8HSU/ml，且无动物死亡。
3.毒性逆转
供试品置37℃ 4周，然后按“小鼠组胺致敏试验”进行试验，组胺致敏毒性的活性应不高于0.8HSU/ml，且无动物死亡。
结果如下：
表3. 吸附无细胞百白破疫苗不同脱毒参数特异性毒性、效价、毒性逆转检测结果
实验效果：
组9-17实验数据，当甲醛脱毒温度为10-50℃，浓度为0.1%~5%；戊二醛脱毒温度为10-50℃，浓度为0.1%~5%时，特异性毒性、效价以及毒性逆转结果均符合要求。
组5和组6的数据说明，当甲醛和戊二醛浓度低于0.1%，为0.05%时，特异性毒性和毒性逆转实验均不合格，出现小鼠死亡，组6对比组5数据，甲醛和戊二醛浓度为0.05%时，单方面提高脱毒温度至50℃也无法补偿，特异毒性和毒性逆转实验均不合格；组18和组19的数据说明，当甲醛和戊二醛浓度高于5%，为6%时，效价检测不合格，其中组19每1次人用剂量的免疫效价3.1IU，且95%可信限的低限应1.0IU；对比组18数据，即使单方面降低脱毒温度至10℃也无法补充，其效价每1次人用剂量的免疫效价3.5IU，且95%可信限的低限应1.5IU，效价不合格。
组7和组8的数据说明，当甲醛和戊二醛脱毒温度低于10℃，为5℃时，特异毒性和毒性逆转实验均不合格，出现小鼠死亡；组7和组8数据对比，甲醛和戊二醛脱毒温度低于10℃，为5℃时，单方面提高脱毒甲醛和戊二醛脱毒浓度至5%也无法补偿，特异毒性和毒性逆转实验均不合格；同时组20和21的数据说明，当甲醛和戊二醛脱毒温度高于50℃，为60℃时，效价检测不合格；组20对比组21，单方面降低甲醛和戊二醛的浓度至0.1%，效价检测也不合格。
进一步的，脱毒时间为1d，甲醛和戊二醛脱毒温度低于10℃，为5℃时（组2）或甲醛和戊二醛浓度低于0.1%，为0.05%时（组1）时，特异性毒性和毒性逆转实验均不合格；同时脱毒时间为50d，甲醛和戊二醛脱毒温度高于50℃，为60℃（组27）或甲醛和戊二醛浓度高于5%，为6%时（组26）时，效价检测不合格。
进一步的，脱毒时间从1d（组3和4）、25d（组22和23）、50d（组24和25）；当甲醛脱毒温度为10-50℃，浓度为0.1%~5%；戊二醛脱毒温度为10-50℃，浓度为0.1%~5%时，特异毒性、效价以及毒性逆转结果均符合要求。
综上，说明甲醛脱毒温度为10-50℃，浓度为0.1%~5%；戊二醛脱毒温度为10-50℃，浓度为0.1%~5%为优选条件。
实施例5 吸附无细胞百白破疫苗（不同PT浓度）效果验证
将实施例1中的PT纯化蛋白中加入甘油、缓冲盐溶液中，PT纯化蛋白终浓度为50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml；甘油终浓度50%（V/V）；脱毒方法如下表4所示
表4.吸附无细胞百白破疫苗不同PT浓度实验设置
将上述脱毒后的PT类毒素与氢氧化铝进行吸附，得到PT原液。
将上述PT原液，与FHA原液、PRN原液、DT原液、TT原液按PT:FHA:PRN:DT:TT=25ug:25ug:10ug:15Lf:4Lf的比例进行混合，配制吸附无细胞百白破疫苗。
检测指标包括特异毒性、效价以及毒性逆转三方面
1. 效价检测
按照《中国药典》三部（现行版）“吸附无细胞百白破联合疫苗3.2.4效价检测”进行效价测定。标准品为中国食品药品检定研究院第七代百日咳效力标准品，用生理盐水将百日咳效力标准品溶解至1IU/ml，然后5倍系列稀释至0.2IU/ml、0.04IU/ml。
待检品稀释：用生理盐水将供试品分别稀释8倍、40倍、200倍。
果计算和判定：按质反应平行线法计算供试品效价，供试品按成品疫苗浓度稀释后，每1次人用剂量的免疫效价应不低于4.0 IU，且95%可信限的低限应不低于2.0 IU。
2. 特异性毒性
按《中国药典》三部（现行版）吸附无细胞百白破联合疫苗附录：无细胞百日咳疫苗原液制造及检定要求2.5项进行检测。
毒性参考品按照每批标示进行稀释，用体重14~16gNIH小鼠（雌性或雌雄各半），毒性参考品的每一稀释度和供试品各用一组，每组10只。每只小鼠腹腔注射0.5ml，分别进行小鼠白细胞增多试验和小鼠组胺致敏试验。
小鼠白细胞增多试验：于注射后3天分别取小鼠末梢血进行白细胞计数。使用全自动血细胞分析仪进行白细胞计数，将仪器输出的白细胞数取LOG值作为试验数据。将试验结果输入软件“Statistical Analysis”中22.Parallel Line Assay程序进行计算，根据计算结果，注射供试品的小鼠白细胞增多毒性的活性应不高于0.5LPU/ml。
小鼠组胺致敏试验：于注射后4天，每只小鼠腹腔注射0.5ml溶液（含二盐酸组胺4mg或二磷酸组胺2mg），30分钟后分别测小鼠肛温。将试验结果输入软件“StatisticalAnalysis”中22.Parallel Line Assay程序进行计算，根据计算结果，供试品的小鼠组胺致敏毒性的活性应不高于0.8HSU/ml，且无动物死亡。
3.毒性逆转
供试品置37℃ 4周，然后按“小鼠组胺致敏试验”进行试验，组胺致敏毒性的活性应不高于0.8HSU/ml，且无动物死亡。
结果如下表5
表5.吸附无细胞百白破疫苗不同PT浓度特异性毒性、效价、毒性逆转检测结果
如上表5实验结果显示，PT浓度从50-200μg/ml，采用先甲醛脱毒，再戊二醛脱毒的吸附无细胞百白破联合疫苗，其特异性毒性、效价、毒性逆转检测均合格。
实施例6吸附无细胞百白破联合疫苗的效价和毒性研究
1. 效价检测
将实施例3中实验组所述吸附无细胞百白破联合疫苗按照《中国药典》三部（现行版）“吸附无细胞百白破联合疫苗3.2.4效价检测”进行效价测定。
标准品为中国食品药品检定研究院第七代百日咳效力标准品，用生理盐水将百日咳效力标准品溶解至1IU/ml，然后5倍系列稀释至0.2IU/ml、0.04IU/ml。
待检品稀释：用生理盐水将供试品分别稀释8倍、40倍、200倍。
试验动物：健康状况良好，体重10~12g 的NIH雌雄各半小鼠（SPF级），分为试验组和对照组，试验组每组20只小鼠，对照组每组10只小鼠（共5组）。
试验过程：用不同稀释度的标准品和待检样品对试验组小鼠进行免疫，每只腹腔注射500µl，对照组不进行免疫。免疫3周后，免疫组每只小鼠脑内攻击0.03ml菌液（含菌80000）；对照组分别注射5个不同浓度的攻击菌液0.03ml，分别含菌80000，8000，800，80，8。小鼠攻击后观察14天。攻击后第3天，试验组动物每组至少16只，每日观察动物并记录死亡数，最初3天死亡的动物不作统计，至第14天有麻痹、头部肿胀、弓背及明显耸毛的动物也按死亡计算。
结果计算和判定：如图5-7所示（用“Statistical Analysis”软件中的“23.ProbitMethod”计算效价截图，图中a线为标准品的剂量反应曲线，b线为供试品的剂量反应曲线），按质反应平行线法计算供试品效价。供试品按成品疫苗浓度稀释后，每1次人用剂量的免疫效价应不低于4.0 IU，且95%可信限的低限应不低于2.0 IU。如达不到上述要求可进行复试，但所有的有效试验结果必须以几何平均值（如用概率分析法时，应用加权几何平均）来计算。达到上述要求即判为合格。
2. 特异性毒性
按《中国药典》三部（现行版）吸附无细胞百白破联合疫苗附录：无细胞百日咳疫苗原液制造及检定要求2.5项进行检测。
毒性参考品按照每批标示进行稀释，用体重14~16gNIH小鼠（雌性或雌雄各半），毒性参考品的每一稀释度和供试品各用一组，每组10只。每只小鼠腹腔注射0.5ml，分别进行小鼠白细胞增多试验和小鼠组胺致敏试验。
小鼠白细胞增多试验：于注射后3天分别取小鼠末梢血进行白细胞计数。使用全自动血细胞分析仪进行白细胞计数，将仪器输出的白细胞数取LOG值作为试验数据。将试验结果输入软件“Statistical Analysis”中22.Parallel Line Assay程序进行计算，根据计算结果，注射供试品的小鼠白细胞增多毒性的活性应不高于0.5LPU/ml。
小鼠组胺致敏试验：于注射后4天，每只小鼠腹腔注射0.5ml溶液（含二盐酸组胺4mg或二磷酸组胺2mg），30分钟后分别测小鼠肛温。将试验结果输入软件“StatisticalAnalysis”中22.Parallel Line Assay程序进行计算，根据计算结果，供试品的小鼠组胺致敏毒性的活性应不高于0.8HSU/ml，且无动物死亡。
3.毒性逆转
按照实施例3方法制备3批次供试品置37℃ 4周，然后按“小鼠组胺致敏试验”进行试验，结果如下表所示。
吸附无细胞百白破联合疫苗的无细胞百日咳疫苗效价和特异性毒性检测结果，如下表6所示：
表6无细胞百日咳疫苗效价和特异性毒性
从上表可知，采用先甲醛脱毒，再戊二醛脱毒的吸附无细胞百白破联合疫苗，百日咳效价较高，特异性毒性合格，符合要求，且无毒性逆转现象发生，疫苗安全、有效。
Claims (18)
1.一种百日咳毒素（PT）的脱毒方法，其特征在于，包括如下步骤：将PT抗原先用甲醛处理脱毒，再用戊二醛脱毒。
2.根据权利要求1所述的百日咳毒素的脱毒方法，其特征在于，所述PT抗原为纯化后的PT抗原。
3.根据权利要求1-2任一项所述的百日咳毒素的脱毒方法，其特征在于，甲醛终质量浓度0.1%~5%。
4.根据权利要求1所述的百日咳毒素的脱毒方法，其特征在于，戊二醛终质量浓度0.1%~5%。
5.根据权利要求1所述的百日咳毒素的脱毒方法，其特征在于，甲醛脱毒温度为10~50℃。
6.根据权利要求1所述的百日咳毒素的脱毒方法，其特征在于，甲醛脱毒温度为1~50天。
7.根据权利要求1所述的百日咳毒素的脱毒方法，其特征在于，戊二醛脱毒温度为10~50℃。
8.根据权利要求1所述的百日咳毒素的脱毒方法，其特征在于，戊二醛脱毒时间为1~24小时。
9.根据权利要求1所述的百日咳毒素的脱毒方法，其特征在于，先在PT抗原中加入甘油，甘油终浓度10%~50%（V/V）。
10.根据权利要求1所述的百日咳毒素的脱毒方法，其特征在于，戊二醛脱毒后，用天冬氨酸盐终止反应。
11.根据权利要求1所述的百日咳毒素的脱毒方法，其特征在于，所用天冬氨酸盐的终浓度为0.1~1M。
12.根据权利要求1所述的百日咳毒素的脱毒方法，其特征在于，终止反应结束后，通过透析或超滤方式去除甲醛、戊二醛。
13.一种脱毒PT抗原，其特征在于，所述的脱毒PT抗原由权利要求1-12任一项所述的百日咳毒素的脱毒方法制备得到。
14.权利要求13所述的脱毒PT抗原，其特征在于，所述脱毒PT抗原的分子量大于120KDa。
15.一种根据权利要求1-12中任一项所述的百日咳毒素的脱毒方法制备的无细胞百白破联合疫苗，其特征在于，包含百日咳鲍特氏杆菌（Bordetella pertussis）液体培养物上清部分的PT抗原。
16.根据权利要求15所述的无细胞百白破联合疫苗，其特征在于，还包含百日咳鲍特氏杆菌（Bordetella pertussis）液体培养物上清部分的FHA抗原；和/或，
百日咳鲍特氏杆菌上清和菌体部分的PRN抗原；和/或，
白喉杆菌液体培养物上清部分的DT抗原；和/或，
破伤风杆菌液体培养物上清部分的TT抗原。
17.根据权利要求15所述的无细胞百白破联合疫苗，其特征在于，所述联合疫苗各抗原的含量为每剂含PT抗原5~40μg，FHA抗原5~40μg，PRN抗原2~20μg，DT抗原2~20Lf，TT抗原2~5Lf。
18.根据权利要求15所述的无细胞百白破联合疫苗，其特征在于，所述PT抗原经脱毒后，与铝佐剂进行吸附。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310032400 | 2023-01-10 | ||
| CN202310032400X | 2023-01-10 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117417419A true CN117417419A (zh) | 2024-01-19 |
| CN117417419B CN117417419B (zh) | 2024-04-19 |
Family
ID=89526949
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311723579.XA Active CN117417419B (zh) | 2023-01-10 | 2023-12-15 | 一种百日咳毒素脱毒方法及无细胞百白破联合疫苗 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117417419B (zh) |
| WO (1) | WO2024149109A1 (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024149109A1 (zh) * | 2023-01-10 | 2024-07-18 | 康希诺生物股份公司 | 一种百日咳毒素脱毒方法及无细胞百白破联合疫苗 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1236321A (zh) * | 1996-11-07 | 1999-11-24 | 史密丝克莱恩比彻姆生物有限公司 | 带有白喉类毒素和破伤风类毒素的无细胞百日咳疫苗 |
| CN1915424A (zh) * | 1995-05-04 | 2007-02-21 | 康诺特实验室有限公司 | 非菌体性百日咳疫苗及其制备方法 |
| CN102770444A (zh) * | 2010-02-26 | 2012-11-07 | 诺华有限公司 | 免疫原性蛋白和组合物 |
| CN104906569A (zh) * | 2015-05-20 | 2015-09-16 | 北京智飞绿竹生物制药有限公司 | 一种百日咳疫苗制剂及其联合疫苗 |
| WO2016155581A1 (zh) * | 2015-03-27 | 2016-10-06 | 成都欧林生物科技股份有限公司 | 一种分离纯化的无细胞百白破-b型流感嗜血杆菌-A群C群脑膜炎球菌联合疫苗及其制备方法 |
| CN114502193A (zh) * | 2019-10-01 | 2022-05-13 | 葛兰素史克生物有限公司 | 免疫原性组合物 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5578308A (en) * | 1990-02-12 | 1996-11-26 | Capiau; Carine | Glutaraldehyde and formalin detoxified bordetella toxin vaccine |
| EP1234580A1 (en) * | 1995-05-04 | 2002-08-28 | Aventis Pasteur Limited | Acellular Pertussis Vaccines and Methods of Preparation Thereof |
| US8916173B2 (en) * | 2013-03-08 | 2014-12-23 | Crucell Holland B.V. | Acellular pertussis vaccine |
| CN117417419B (zh) * | 2023-01-10 | 2024-04-19 | 康希诺生物股份公司 | 一种百日咳毒素脱毒方法及无细胞百白破联合疫苗 |
-
2023
- 2023-12-15 CN CN202311723579.XA patent/CN117417419B/zh active Active
-
2024
- 2024-01-02 WO PCT/CN2024/070120 patent/WO2024149109A1/zh unknown
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1915424A (zh) * | 1995-05-04 | 2007-02-21 | 康诺特实验室有限公司 | 非菌体性百日咳疫苗及其制备方法 |
| CN1236321A (zh) * | 1996-11-07 | 1999-11-24 | 史密丝克莱恩比彻姆生物有限公司 | 带有白喉类毒素和破伤风类毒素的无细胞百日咳疫苗 |
| CN102770444A (zh) * | 2010-02-26 | 2012-11-07 | 诺华有限公司 | 免疫原性蛋白和组合物 |
| WO2016155581A1 (zh) * | 2015-03-27 | 2016-10-06 | 成都欧林生物科技股份有限公司 | 一种分离纯化的无细胞百白破-b型流感嗜血杆菌-A群C群脑膜炎球菌联合疫苗及其制备方法 |
| CN104906569A (zh) * | 2015-05-20 | 2015-09-16 | 北京智飞绿竹生物制药有限公司 | 一种百日咳疫苗制剂及其联合疫苗 |
| CN114502193A (zh) * | 2019-10-01 | 2022-05-13 | 葛兰素史克生物有限公司 | 免疫原性组合物 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 胡业勤;段凯;李新国;潘聪;田聪;唐荣兴;朱德武;瞿明霞;杨晓明;: "组分无细胞百日咳疫苗纯化新工艺的建立", 中国新药杂志, no. 21, 15 November 2018 (2018-11-15), pages 38 - 44 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024149109A1 (zh) * | 2023-01-10 | 2024-07-18 | 康希诺生物股份公司 | 一种百日咳毒素脱毒方法及无细胞百白破联合疫苗 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2024149109A1 (zh) | 2024-07-18 |
| CN117417419B (zh) | 2024-04-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN117417419B (zh) | 一种百日咳毒素脱毒方法及无细胞百白破联合疫苗 | |
| US9771399B2 (en) | Immunogenic bacterial vesicles with outer membrane proteins | |
| CN103656631B (zh) | 多价肺炎球菌荚膜多糖-蛋白缀合物组合物及其制备方法 | |
| CN1709505B (zh) | 多价细菌荚膜多糖-蛋白质结合物联合疫苗 | |
| CN107427568A (zh) | 用于肺炎球菌疫苗中的免疫原性组合物 | |
| SK181898A3 (en) | Multivalent dtp-polio vaccines | |
| CN102302771B (zh) | 一种预防和治疗猪萎缩性鼻炎的多价灭活疫苗 | |
| US6696065B1 (en) | Acellular pertussis vaccines and methods of preparation thereof | |
| CN106999569B (zh) | 肠道病毒灭活的改进的方法、佐剂吸附及其获得的剂量减少的疫苗组合物 | |
| CN105963692B (zh) | 一种预防手足口病的联合疫苗 | |
| Cantor et al. | The effect of polyinosinic-polycytidylic acid upon graft-vs-host activity in BALB/c mice | |
| CN101497909B (zh) | 制备抗a型肉毒毒素免疫球蛋白抗体的方法 | |
| CN105112349A (zh) | 一种羊种布鲁氏菌分子标记疫苗株及其应用 | |
| CN106146626B (zh) | 一种红斑丹毒丝菌亚单位疫苗及制备方法及应用 | |
| CN105999256B (zh) | 一种预防手足口病的联合疫苗 | |
| CN105039233A (zh) | 一种牛种布鲁氏菌分子标记疫苗株及其应用 | |
| CN102286100A (zh) | 一种抗金黄色葡萄球菌肠毒素B的免疫球蛋白F(ab’)2及其制备方法 | |
| CN104208666A (zh) | 一种疫苗组合物及其制备方法和应用 | |
| Holmgren et al. | Immunochemical studies of two cholera toxin-containing standard culture filtrate preparations of Vibrio cholerae | |
| CN110917344B (zh) | 一种液体疫苗组合物及其应用 | |
| CN111053898B (zh) | 一种疫苗组合物及其应用 | |
| CN102178949A (zh) | 吸附无细胞百白破-Sabin株脊髓灰质炎联合疫苗及其制备 | |
| Amies | Loss of immunogenic properties of vaccinia virus inactivated by formaldehyde | |
| CN105753949A (zh) | 一种红斑丹毒丝菌抗原蛋白及应用 | |
| CN110251667A (zh) | 一种免疫组合制剂及其制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |