CN107427568A - 用于肺炎球菌疫苗中的免疫原性组合物 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是提供免疫学组合物以对抗肺炎链球菌、特别是对抗肺炎链球菌血清组9，同时限制缀合物的数目。本发明因此涉及新的免疫原性组合物以用于肺炎链球菌疫苗，并涉及是使用所述免疫原性组合物在人对象、特别是婴儿和老年人中对抗肺炎球菌感染的免疫接种。

Description

用于肺炎球菌疫苗中的免疫原性组合物

发明领域

本发明涉及用于肺炎球菌疫苗中的新的免疫原性组合物。本发明的免疫原性组合物典型地包含缀合的荚膜糖抗原(糖缀合物)，其中所述糖来源于肺炎链球菌(Streptococus pneumoniae)的血清型。本发明的一个目的是提供免疫原性组合物以防御肺炎链球菌血清组9。

发明背景

由肺炎链球菌导致的感染在世界范围内是导致发病率和死亡率的主要因素之一。肺炎、发热性菌血症和脑膜炎是侵袭性肺炎链球菌疾病的最常见表现，而细菌在呼吸道内散播可导致中耳感染、鼻窦炎或者复发型支气管炎。与侵袭性疾病相比，非侵袭性的表现通常不太严重，但是被认为是更常见的。

肺炎链球菌疾病的病原体肺炎链球菌肺炎链球菌是革兰氏阳性包在荚膜内的球菌，被多糖荚膜包围。这个荚膜的成分差异允许在大约91个荚膜类型之间的血清型差异，其中一些通常与肺炎球菌疾病相关，其它则是罕见的。侵袭性肺炎球菌感染包括肺炎、脑膜炎和发热性菌血症(febrile bacteremia)；常见的非侵袭性表现是中耳炎、鼻窦炎和支气管炎。

肺炎球菌缀合物疫苗(PCV)是用于防御肺炎链球菌所致疾病的肺炎球菌疫苗。目前在全球市场上可获得三种PCV疫苗：(在一些国家称作Prevenar)(七价疫苗)、(十价疫苗)和(十三价疫苗)。

超出中13种血清型的导致疾病的特定血清型随着区域、群体变化，而且可能由于获得抗生素抗性、肺炎球菌疫苗导入和未知来源的长期趋势(seculartrend)而随着时间改变。

在免疫原性组合物中加入缀合物不是简单的过程，因为将缀合物组合入单个多价注射中可导致不同成分之间的竞争，并且可不利地影响任意单独缀合物的免疫原性。

这种干扰现象可限制多价疫苗中可包含的缀合物的数目。因此在限制组合物中缀合物数目的同时防御大量的血清型尽管具有重要价值，但是可能难以获得。

本发明的一个目的是在限制缀合物数目的同时提供适当地防御肺炎链球菌、特别是肺炎链球菌血清型9的免疫原性组合物。

肺炎链球菌血清型9包括四种不同类型：9V、9A、9L和9N，每种类型均产生其自身的类型特异性的荚膜多糖(Richards,J.C and M.B.Perry,1988,In A.M.Wu(ed.),Themolecular immunology complex carbohydrates.Plenum,New York,pp.593-594)。

本发明的一个目的是提供具有限制数目的缀合物的适当地防御肺炎链球菌血清型9V、9A、9L和9N的免疫原性组合物。

发明概述

本发明涉及包含来自肺炎链球菌血清型9V的至少一个糖缀合物的免疫原性组合物，用在免疫对象以抵抗肺炎链球菌血清型9N、9A和/或9L感染的方法中。优选地，所述组合物不包含来自肺炎链球菌血清型9N、9A和9L的荚膜糖。

本发明的一方面涉及包含来自肺炎链球菌血清型9V的至少一个糖缀合物的免疫原性组合物在制备用于免疫对象以抵抗肺炎链球菌血清型9N、9A和/或9L感染的药物中的应用。优选所述组合物不包含来自肺炎链球菌血清型9N、9A和9L的荚膜糖。

一方面，上述免疫原性组合物进一步包含来自肺炎链球菌血清型4、6B、14、18C、19F和/或23F的至少一个糖缀合物。

一方面，上述免疫原性组合物进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、5和/或7F的至少一个糖缀合物。

一方面，上述免疫原性组合物进一步包含来自肺炎链球菌血清型6A和/或19A的至少一个糖缀合物。

一方面，上述免疫原性组合物进一步包含来自肺炎链球菌血清型3、15B、22F、33F、12F、10A、11A和/或8的至少一个糖缀合物。

再一方面，上述免疫原性组合物进一步包含来自肺炎链球菌血清型2、15C、17F和/或20的至少一个糖缀合物。

再一方面，所述免疫原性组合物是7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24价肺炎球菌缀合物组合物。

再一方面，所述免疫原性组合物的糖缀合物单独地与CRM197缀合。

一方面，所述免疫原性组合物的来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14和/或23F的糖缀合物单独地与PD缀合，并且如果存在，来自肺炎链球菌血清型18C的糖缀合物与TT缀合并且来自肺炎链球菌血清型19F的糖缀合物与DT缀合。

一方面，所述糖缀合物是使用CDAP化学或者通过还原胺化化学制备。

所述免疫原性组合物可进一步包含来自其它病原体的抗原，和/或至少一种佐剂，如磷酸铝、硫酸铝或者氢氧化铝。

一方面，如通过ELISA试验，所述免疫原性组合物在人体内能激发至少0.35μg/ml的浓度的IgG抗体，所述IgG抗体可以结合肺炎链球菌血清型9N、9A和/或9L多糖。

一方面，如通过体外调理吞噬杀伤试验(OPA)确定，所述免疫原性组合物在至少50％的对象中能激发至少1:8的针对肺炎链球菌血清型9N、9A和/或9L的效价。

一方面，与预先免疫的群体相比，所述免疫原性组合物能显著增加针对肺炎链球菌血清型9N、9A和/或9L的应答者(responder)的比例。

一方面，与预先免疫的群体相比，所述免疫原性组合物能显著增加人类对象针对肺炎链球菌血清型9N、9L和/或9A的OPA效价。

一方面，所述免疫原性组合物用在免疫对象以抵抗肺炎链球菌血清型9N、9L和/或9A感染的方法中。

一方面，通过全身或粘膜途径施用所述免疫原性组合物，所述免疫原性组合物用于预防、治疗或者减轻对象中肺炎链球菌血清型9N、9A和/或9L导致的感染、疾病或病症的方法中，用于在对象中预防肺炎链球菌血清型9N、9A和/或9L感染，或者用于保护或治疗对肺炎链球菌血清型9N、9A和/或9L感染易感的人群的方法中。

一方面，，本发明涉及本申请文件中公开的所述免疫原性组合物在制备药物中的用途，所述药物用于通过全身或粘膜途径施用所述免疫原性组合物，以预防、治疗或者减轻对象中由肺炎链球菌血清型9N、9A和/或9L导致的感染、疾病或病症，以预防对象中肺炎链球菌血清型9N、9A和/或9L感染，或者在保护或治疗对肺炎链球菌血清型9N、9A和/或9L感染易感的人群的方法中使用。

一方面，本发明涉及预防、治疗或者减轻对象中与肺炎链球菌血清型9N、9A和/或9L相关的感染、疾病或病症的方法，其包括向所述对象施用免疫学有效量的本发明的所述免疫原性组合物。

一方面，本发明涉及在对象中预防肺炎链球菌血清型9N、9A和/或9L感染的方法，其包括向所述对象施用免疫学有效量的本发明的所述免疫原性组合物。

本发明进一步涉及包含本文公开的免疫原性组合物和信息页的试剂盒，其中所述信息页提及所述组合物激发针对肺炎链球菌血清型9A、9L和/或9N的功能性抗体的能力及生产所述试剂盒的程序。

WO2013/191459揭示了包含来自肺炎链球菌血清型9N和9V的糖缀合物的15价免疫原性组合物。相似地，WO2014/092377和中国专利申请号CN 101590224和CN 103656631揭示了组合来自肺炎链球菌血清型9N和9V的糖缀合物的免疫原性组合物。

令人惊奇地发现，血清型9V多糖缀合物除了激发血清组9V的功能性反应性抗体(functional reactive antibody)，可以另外激发血清组9中其它血清型(9A、9L和/或9N)的功能性交叉反应性抗体(functional cross-reactive antibody)。

附图

图1：交叉功能性OPA应答。在OPA中针对血清型9V、9A、9L和9N的功能性抗体的存在评估子集，所述子集是59组血清，其来源于用13价肺炎球菌缀合物疫苗(美国研究项目6115A1-004；ClinicalTrials.gov Identifier:NCT00427895)免疫接种的成人。在每组上方示出具有OPA阳性效价(即≥1:8)的样品百分比。每组下方的x轴中列出几何平均数效价(GMT)。

图2：66组匹配的接种前/后血清的交叉功能性OPA应答。在OPA中针对血清型9V、9A、9L和9N的功能性抗体的存在评估子集，所述子集是66组匹配的接种前和接种后的血清分组(serum panel)，其来源于用13价肺炎球菌缀合物疫苗(研究项目6115A1-3005；ClinicalTrials.gov Identifier:NCT00546572)免疫接种的成人。在每组上方示出具有OPA阳性效价(即≥1:8)的样品百分比。每组下方的x轴列出几何平均数效价(GMT)。

图3：肺炎球菌血清型9V(Pn9V)免疫之前和之后的反向累积分布曲线(reversecumulative distribution curve,RCDC)。

对于血清型9V的OPA效价的反向累积分布曲线，血清型9V来源于用13价肺炎球菌缀合物疫苗(研究项目6115A1-3005；ClinicalTrials.gov Identifier:NCT00546572)免疫接种的匹配的接种前和接种后血清分组(N＝66)。图点(plot)表示具有OPA阳性效价(即≥1:8)的血清百分比。

图4：肺炎球菌血清型9A(Pn9A)免疫之前和之后的反向累积分布曲线(RCDC)。

对于血清型9A的OPA效价的反向累积分布曲线，血清型9A来源于用13价肺炎球菌缀合物疫苗(研究项目6115A1-3005；ClinicalTrials.gov Identifier:NCT00546572)免疫接种的匹配的接种前和接种后血清分组(N＝66)。图点表示具有OPA阳性效价(即≥1:8)的血清百分比。

图5：肺炎球菌血清型9L(Pn9L)免疫之前和之后的反向累积分布曲线(RCDC)。

对于血清型9L的OPA效价的反向累积分布曲线，血清型9L来源于用13价肺炎球菌缀合物疫苗(研究项目6115A1-3005；ClinicalTrials.gov Identifier:NCT00546572)免疫接种的匹配的接种前和接种后血清分组(N＝66)。图点表示具有OPA阳性效价(即≥1:8)的血清百分比。

图6：肺炎球菌血清型9N(Pn9N)免疫之前和之后的反向累积分布曲线(RCDC)。

对于血清型9N的OPA效价的反向累积分布曲线，血清型9N来源于用13价肺炎球菌缀合物疫苗(研究项目6115A1-3005；ClinicalTrials.gov Identifier:NCT00546572)免疫接种的匹配的接种前和接种后血清分组(N＝66)。图点表示具有OPA阳性效价(即≥1:8)的血清百分比。

图7：在免疫接种13vPnC之后，来自研究项目B1851088(ClinicalTrials.govIdentifier:NCT01646398)的匹配的接种前/后血清的血清型9交叉功能性OPA应答。

在OPA中针对血清型9V、9A、9L和9N的功能性抗体的存在评估子集，所述子集是91组匹配的接种前和接种后的血清分组，其来自13vPnC(研究项目B1851088)接种的成人。每组上方示出OPA阳性效价(即≥1:8)的样品百分比。

图8：在免疫接种23vPS之后，来自研究项目B1851088的匹配的接种前/后血清的血清型9交叉功能性OPA应答。

在OPA中针对血清型9V、9A、9L和9N的功能性抗体的存在评估子集，所述子集是83组匹配的接种前和接种后的血清分组，其来自23vPS(研究项目B1851088)接种的成人。每组上方示出OPA阳性效价(即≥1:8)的样品百分比。

图9：在免疫接种13vPnC(13v)或23vPS(23v)之后，来自研究项目B1851088的匹配的接种前/后血清的血清型9交叉功能性OPA应答。

图10：来自研究项目B1851088的Pn9V&Pn9N 13vPnC反向累积分布曲线(RCDC)。

对于血清型9V和9N的OPA效价的反向累积分布曲线，血清型9V和9N来源于用13vPnC(日本研究项目B1851088)接种的匹配的接种前和接种后血清分组(N＝91)。

图11：来自研究项目B1851088的Pn9V&Pn9N 23vPS反向累积分布曲线(RCDC)。

对于血清型9V和9N的OPA效价的反向累积分布曲线，血清型9V和9N来源于用23vPS(日本研究项目B1851088)接种的匹配的接种前和接种后血清分组(N＝83)。

图12：来自研究项目B1851088的Pn9V&Pn9A 13vPnC反向累积分布曲线(RCDC)。

对于血清型9V和9A的OPA效价的反向累积分布曲线，血清型9V和9A来源于用13vPnC(日本研究项目B1851088)接种的匹配的接种前和接种后血清分组(N＝91)。

图13：来自研究项目B1851088的Pn9V&Pn9A 23vPS反向累积分布曲线(RCDC)。

对于血清型9V和9A的OPA效价的反向累积分布曲线，血清型9V和9A来源于用23vPS(日本研究项目B1851088)接种的匹配的接种前和接种后血清分组(N＝83)。

图14：来自研究项目B1851088的Pn9V&Pn9L 13vPnC反向累积分布曲线(RCDC)。

对于血清型9V和9L的OPA效价的反向累积分布曲线，血清型9V和9L来源于用13vPnC(日本研究项目B1851088)接种的匹配的接种前和接种后血清分组(N＝91)。

图15：来自研究项目B1851088的Pn9V&Pn9L 23vPS反向累积分布曲线(RCDC)。

对于血清型9V和9L的OPA效价的反向累积分布曲线，血清型9V和9L来源于用23vPS(日本研究项目B1851088)接种的匹配的接种前和接种后血清分组(N＝83)。

1.本发明的免疫原性组合物

本发明的免疫原性组合物典型包含缀合的荚膜糖抗原(也称作糖缀合物)，其中所述糖来源于肺炎链球菌的血清型。

优选地，肺炎链球菌荚膜糖的数目可以是从1种血清型(或者“v”，价)至24种不同血清型(24v)。在一实施方案中，有1种血清型。在一实施方案中，有2种不同血清型。在一实施方案中，有3种不同血清型。在一实施方案中，有4种不同血清型。在一实施方案中，有5种不同血清型。在一实施方案中，有6种不同血清型。在一实施方案中，有7种不同血清型。在一实施方案中，有8种不同血清型。在一实施方案中，有9种不同血清型。在一实施方案中，有10种不同血清型。在一实施方案中，有11种不同血清型。在一实施方案中，有12种不同血清型。在一实施方案中，有13种不同血清型。在一实施方案中，有14种不同血清型。在一实施方案中，有15种不同血清型。在一实施方案中，有16种不同血清型。在一实施方案中，有17种不同血清型。在一实施方案中，有18种不同血清型。在一实施方案中，有19种不同血清型。在一实施方案中，有20种不同血清型。在一实施方案中，有21种不同血清型。在一实施方案中，有22种不同血清型。在一实施方案中，有23种不同血清型。在一实施方案中，有24种不同血清型。如下文所述，荚膜糖缀合至载体蛋白以形成糖缀合物。

如果蛋白质载体对于组合物中2种或更多种糖是相同的，所述糖可以缀合于相同分子的蛋白质载体(载体分子具有2种或更多种不同糖与其缀合)[见例如WO 2004/083251]。

在一个优选的实施方案中，所述糖每种单独地缀合至蛋白质载体的不同分子(每个分子的蛋白质载体仅具有一种类型的糖与其缀合)。在所述实施方案中，所述荚膜糖被认为单独地与所述载体蛋白缀合。

对于本发明的目的，术语“糖缀合物”是指与载体蛋白共价连接的荚膜糖。在一个实施方案中，荚膜糖与载体蛋白直接连接。在另一个实施方案中，细菌糖通过间隔物(spacer)/接头(linker)与蛋白质连接。

1.1本发明的载体蛋白

本发明的糖缀合物的一个成分是所述糖缀合的载体蛋白。术语“蛋白质载体”或者“载体蛋白”或者“载体”在本文可互换使用。载体蛋白应适合标准缀合程序。

在一个优选实施方案中，所述糖缀合物的载体蛋白选自以下组成的组：DT(白喉毒素)、TT(破伤风类毒素)或者TT的片段C、CRM₁₉₇(白喉毒素的非毒性但抗原性相同的变体)、白喉毒素A链突变体CRM₁₉₇(CN103495161)、其它DT突变体(如CRM176、CRM228、CRM45(Uchida等(1973)J.Biol.Chem.218:3838-3844)、CRM9、CRM102、CRM103或者CRM107；及由Nicholls和Youle在Genetically Engineered Toxins,Ed:Frankel,Maecel Dekker Inc.(1992)中所述的其它突变；Glu-148的缺失或者Glu-148突变为Asp、Gln或者Ser，和/或Ala 158突变为Gly，以及在美国专利号4,709,017和4,950,740中公开的其它突变；Lys 516、Lys 526、Phe 530和/或Lys 534的至少一或多个残基的突变，及美国专利号5,917,017和6,455,673公开的其它突变；或者在美国专利号5,843,711中公开的片段；肺炎球菌肺炎球菌溶血素(ply)(Kuo等(1995)Infect lmmun 63:2706-2713)，包括以一些形式去毒性的ply，例如dPLY-GMBS(WO 2004/081515和WO 2006/032499)或者dPLY-formol、PhtX(包括PhtA、PhtB、PhtD、PhtE(PhtA、PhtB、PhtD或PhtE的序列在WO 00/37105和WO 00/39299中揭示))以及Pht蛋白的融合蛋白(例如PhtDE融合蛋白、PhtBE融合蛋白、Pht A-E(WO 01/98334、WO 03/054007、WO 2009/000826))、OMPC(脑膜炎球菌外膜蛋白-通常从脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)血清型B中提取(EP0372501))、PorB(来自脑膜炎奈瑟氏菌)、PD(流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)蛋白D；见例如EP0594610 B)、或者其免疫学功能等价物、合成肽(EP0378881、EP0427347)、热休克蛋白(WO 93/17712、WO 94/03208)，百日咳蛋白(WO 98/58668、EP0471177)、细胞因子、淋巴因子、生长因子或激素(WO 91/01146)、包含来自各种病原体衍生的抗原的多个人CD4+T细胞表位的人工蛋白质(Falugi等(2001)Eur J Immunol 31:3816-3824)如N19蛋白质(Baraldoi等(2004)Infect lmmun 72:4884-4887)、肺炎球菌表面蛋白PspA(WO 02/091998)、铁摄取蛋白(WO 01/72337)、难辨梭菌(Clostridium difficile)的毒素A或B(WO 00/61761)、运铁蛋白结合蛋白、肺炎球菌粘附蛋白(PsaA)、重组铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A(特别是其非毒性突变体(如在谷氨酸553具有取代的外毒素A(Douglas等(1987)J.Bacteriol.169(11):4967-4971))。其它蛋白质，如卵清蛋白、匙孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或者结核菌素的纯化的蛋白质衍生物(PPD)也可以用作载体蛋白。其它合适的载体蛋白包括失活的细菌毒素如霍乱类毒素(例如WO 2004/083251所述)、大肠杆菌LT、大肠杆菌ST及来自绿脓杆菌(P.aeruginosa)的外毒素A。

在一个优选实施方案中，所述糖缀合物的载体蛋白单独地选自TT、DT、DT突变体(如CRM₁₉₇)、流感嗜血杆菌蛋白D、PhtX、PhtD、PhtDE融合蛋白(特别是WO 01/98334和WO 03/054007中描述的那些)、去毒素的肺炎链球菌溶血素、PorB、N19蛋白、PspA、OMPC、难辨梭菌的毒素A或B以及PsaA组成的组。

在一个实施方案中，本发明的所述糖缀合物的载体蛋白是DT(白喉类毒素)。在另一个实施方案中，本发明的所述糖缀合物的载体蛋白是TT(破伤风类毒素)。

在另一个实施方案中，本发明的所述糖缀合物的载体蛋白是PD(流感嗜血杆菌蛋白D；见例如EP0594610B)。

CRM₁₉₇蛋白是一种非毒性形式的白喉毒素，但是与白喉毒素在免疫学上不能区别。CRM₁₉₇是由被非产生毒素的噬菌体β197^tox-感染的白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheria)产生的，所述噬菌体通过对产生毒素的β-棒状杆菌噬菌体进行亚硝基胍诱变产生(Uchida等(1971)Nature New Biology 233:8-11)。CRM₁₉₇蛋白具有与白喉毒素相同的分子量，但是由于在结构基因中一个单一碱基改变(鸟嘌呤改变为腺嘌呤)而与其不同。这种单一碱基改变导致在成熟蛋白质中的一个氨基酸取代(谷氨酸代替甘氨酸)及消除白喉毒素的毒性性质。CRM₁₉₇蛋白是糖的安全且有效的T细胞依赖性载体。关于CRM₁₉₇及其生产的进一步详细描述可见于例如美国专利号5,614,382。在一个实施方案中，本发明的所述荚膜糖与CRM₁₉₇蛋白或者CRM₁₉₇的A链缀合(见CN103495161)。在一个实施方案中，本发明的所述荚膜糖与通过遗传重组大肠杆菌表达而获得的CRM₁₉₇的A链缀合(见CN103495161)。在一个实施方案中，本发明的所述荚膜糖均与CRM₁₉₇缀合。在一个实施方案中，本发明的所述荚膜糖均与CRM₁₉₇的A链缀合。

因此，在常见的实施方案中，本发明的所述糖缀合物包含CRM₁₉₇作为载体蛋白，其中所述荚膜多糖共价连接至CRM₁₉₇。

1.2本发明的荚膜糖

在本说明书中，术语“糖”可以是指多糖或者寡糖并包括这二者。在常见的实施方案中，所述糖是多糖，特别是肺炎链球菌荚膜多糖。

荚膜多糖通过本领域技术人员已知的标准技术制备。

在本发明中，荚膜多糖可以例如从肺炎链球菌的血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、15C、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F中制备。典型地，荚膜多糖是通过将每种肺炎链球菌血清型在培养基(例如基于大豆的培养基)中生长而产生的，然后从细菌培养物中制备多糖。用于产生在本发明的糖缀合物中使用的各个多糖的肺炎链球菌细菌菌株可得自确立的培养收集物或临床样本。

通常通过从一个种子小瓶(seed vial)至种子培养瓶(seed bottle)按比例扩增生物体(每种肺炎链球菌血清型)的群体并经过一或多个种子发酵罐(seed fermentor)增加体积，直至达到生产规模的发酵体积。在生长周期结束时，将细胞裂解，然后收获裂解物液体培养基(lysate broth)以进行下游(纯化)加工(见例如WO 2006/110381、WO 2008/118752和美国专利申请公开号2006/0228380、2006/0228381、2008/0102498和2008/0286838)。

各个多糖典型通过离心、沉淀、超滤和/或柱层析纯化(见例如WO 2006/110352和WO 2008/118752)。

如本文进一步描述的，纯化的多糖可以是活性的(例如化学活化)以使其能起反应(例如直接与载体蛋白反应或者通过接头如eTEC间隔物反应)并且随后并入本发明的糖缀合物中。

肺炎链球菌荚膜多糖包含重复寡糖单位，其可含有多达8个糖残基。

在一个实施方案中，本发明的荚膜糖可以是一个寡糖单位，或者是重复寡糖单位的短于天然长度的糖链。在一个实施方案中，本发明的荚膜糖是相关血清型的重复寡糖单位。

在一个实施方案中，本发明的荚膜糖可以是寡糖。寡糖具有较少数目的重复单位(典型为5-15个重复单位)，并且典型是来源于合成或者通过多糖水解。

然而优选地，本发明的及本发明的免疫原性组合物中的所有荚膜糖均是多糖。高分子量的荚膜多糖由于在抗原性表面存在的表位而能诱导某些抗体的免疫应答。高分子量荚膜多糖的分离和纯化优选预期用于本发明的缀合物、组合物和方法中。

在一些实施方案中，在缀合之前纯化的多糖的分子量为5kDa-4,000kDa。在其它这种实施方案中，所述多糖的分子量为10kDa-4,000kDa、50kDa-4,000kDa、50kDa-3,000kDa、50kDa-2,000kDa、50kDa-1,500kDa、50kDa-1,000kDa、50kDa-750kDa、50kDa-500kDa、100kDa-4,000kDa、100kDa-3,000kDa、100kDa-2,000kDa、100kDa-1,500kDa、100kDa-1,000kDa、100kDa-750kDa、100kDa-500kDa、100-400kDa、200kDa-4,000kDa、200kDa-3,000kDa、200kDa-2,000kDa、200kDa-1,500kDa、200kDa-1,000kDa或者200kDa-500kDa。

在进一步的实施方案中，所述荚膜多糖的分子量为70kDa-150kDa、80kDa-160kDa、90kDa-250kDa、100kDa-1,000kDa、100kDa-500kDa、100kDa-400kDa、100kDa-160kDa、150kDa-600kDa、200kDa-1,000kDa、200kDa-600kDa、200kDa-400kDa、300kDa-1,000KDa、300kDa-600kDa、300kDa-500kDa或者500kDa-600kDa。在上述任何范围内的任何整数均预期为本公开的实施方案。

多糖在正常纯化程序期间的大小可以略为降低。另外，如本文所述，在缀合之前可以对多糖进行尺寸加工技术。可以应用机械或化学尺寸加工。可以使用乙酸进行化学水解。机械尺寸加工可以使用高压均质剪切进行。以上提及的分子量范围是指在缀合之前的经纯化的多糖(例如活化之前)。

在一个优选的实施方案中，所述经纯化的多糖是来自肺炎链球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、15C、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F或33F的荚膜多糖，其中所述荚膜多糖的分子量落入上述分子量范围之一之中。

如本文所用，术语多糖或载体蛋白-多糖缀合物的“分子量”是指通过大小排阻层析(SEC)组合多角度激光光散射检测仪(MALLS)计算的分子量。

在一些实施方案中，本发明来自血清型9V、18C、11A、15B、22F和/或33F的肺炎球菌糖是O-乙酰化的。在一些实施方案中，本发明来自血清型9V、11A、15B、22F和/或33F的肺炎球菌糖是O-乙酰化的。

多糖的O-乙酰化程度可以通过本领域已知的任何方法确定，例如通过质子NMR(见例如Lemercinier等(1996)Carbohydrate Research 296:83-96,Jones等(2002)J.Pharmaceutical and Biomedical Analysis 30:1233-1247,WO 2005/033148和WO 00/56357)。另一常用的方法在Hestrin(1949)J.Biol.Chem.180:249-261中描述。优选地，O-乙酰基团的存在通过离子-HPLC分析确定。

本发明描述的经纯化的多糖是化学活化以产生能与载体蛋白反应的糖。如下文描述，这些肺炎球菌缀合物是通过分开的程序制备并且配制为单一剂量制剂。

1.3本发明的糖缀合物

经纯化的糖经化学活化产生能直接或者通过接头与载体蛋白反应的糖(即活化的糖)。一旦活化，将每个荚膜糖分别与载体蛋白缀合以形成糖缀合物。在一个实施方案中，每个荚膜糖均与相同的载体蛋白缀合。所述糖的化学活化及随后与载体蛋白的缀合可以通过本文揭示的活化和缀合方法实现。

来自肺炎链球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、15C、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和/或33F的荚膜多糖如上文所述制备。

在一个实施方案中，所述多糖用1-氰-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸盐(CDAP)活化形成氰酸酯。然后将所述活化的多糖直接或者通过间隔物(接头)基团与载体蛋白(优选CRM₁₉₇)上的氨基基团结合。例如，所述间隔物可以是胱胺或者半胱胺以提供硫醇化多糖，硫醇化多糖可以通过在与如下物质反应之后获得的硫醚键与载体结合：马来酰亚胺-活化的载体蛋白(例如使用N-[γ-马来酰亚胺丁酰氧]琥珀酰亚胺酯(GMBS))或者卤素乙酰化载体蛋白(例如使用碘乙酰胺、N-琥珀酰亚胺溴乙酸盐(SBA；SIB)、N-琥珀酰亚胺(4-碘乙酰)氨基苯甲酸酯(SlAB)、磺基琥珀酰亚胺(4-碘乙酰)氨基苯甲酸酯(磺基-SIAB)、N-琥珀酰亚胺碘乙酸盐(SIA)，或者琥珀酰亚胺3-[溴乙酰胺]丙酸盐(SBAP))。优选地，将所述氰酸酯(任选通过CDAP化学产生)与己烷二胺或者己二酸二酰肼(ADH)结合，并使用碳二亚胺(例如EDAC或EDC)化学通过蛋白质载体上的羧基基团将氨基衍生的糖与载体蛋白(例如CRM₁₉₇)缀合。这种缀合在例如WO 93/15760、WO 95/08348和WO 96/129094中描述。

在本发明的一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、15C、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和/或33F的所述糖缀合物是通过使用CDAP化学制备的。在本发明的一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、8、9V、14、18C、19F和23F的所述糖缀合物是通过使用CDAP化学制备的。在本发明的一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、14、18C、19F和23F的所述糖缀合物是通过使用CDAP化学制备的。在本发明的一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、8、9V、14、18C、19A、19F和23F的所述糖缀合物是通过使用CDAP化学制备的。在本发明的一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、14、18C、19A、19F和23F的所述糖缀合物是通过使用CDAP化学制备的。在本发明的一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、14、18C、19A、19F和23F的所述糖缀合物是通过使用CDAP化学制备的。

其它合适的缀合技术使用碳二亚胺、酰肼、活性酯、norborane、p-硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S—NHS、EDC、TSTU。许多在国际专利申请公开号WO 98/42721中描述。缀合可包含羰基接头，其可以通过糖的游离羟基基团与CDI反应而形成(见Bethell等(1979)1.Biol.Chern.254:2572-2574；Hearn等(1981)J.Chromatogr.218:509-518)，随后与蛋白质反应形成氨基甲酸酯键。这可包括将异头端还原为伯羟基(primary hydroxyl)基团，任选的所述伯羟基基团的保护/去保护作用，所述伯羟基基团与CDI反应形成CDI氨基甲酸酯中间产物及将所述CDI氨基甲酸酯中间产物与蛋白质上氨基基团结合。

在一个优选的实施方案中，来自肺炎链球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、15C、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F的至少一个荚膜多糖通过还原胺化反应与载体蛋白缀合(如美国专利申请公开号2006/0228380、2007/184072、2007/0231340和2007/0184071、WO 2006/110381、WO 2008/079653和WO 2008/143709中所述)。

在本发明的一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型6A的所述糖缀合物通过还原胺化反应制备。在本发明的一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型19A的所述糖缀合物通过还原胺化反应制备。在本发明的一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型3的所述糖缀合物通过还原胺化反应制备。在本发明的一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型6A和19A的所述糖缀合物通过还原胺化反应制备。在本发明的一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型3、6A和19A的所述糖缀合物通过还原胺化反应制备。

在本发明的一个优选实施方案中，来自肺炎链球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的所述糖缀合物通过还原胺化反应制备。在本发明的一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型1、4、6B、9V、14、18C、19F和23F的所述糖缀合物通过还原胺化反应制备。在本发明的一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、9V、14、18C、19F和23F的所述糖缀合物通过还原胺化反应制备。在本发明的一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的所述糖缀合物通过还原胺化反应制备。在本发明的一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的所述糖缀合物通过还原胺化反应制备。在本发明的一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的所述糖缀合物通过还原胺化反应制备。在本发明的一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的所述糖缀合物均通过还原胺化反应制备。

在另一个优选的实施方案中，来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F和23F的所述糖缀合物均通过还原胺化反应制备。

在另一个优选的实施方案中，来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F、22F和23F的所述糖缀合物均通过还原胺化反应制备。

在另一个优选的实施方案中，来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F和23F的所述糖缀合物均通过还原胺化反应制备。

在另一个优选的实施方案中，来自肺炎链球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的所述糖缀合物均通过还原胺化反应制备。

在另一个优选的实施方案中，来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、12F、14、15C、18C、19A、19F、22F、23F和33F的所述糖缀合物均通过还原胺化反应制备。

在另一个优选的实施方案中，来自肺炎链球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、15C、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F的所述糖缀合物均通过还原胺化反应制备。

还原胺化反应包括2个步骤：(1)多糖的氧化，(2)活化的多糖与载体蛋白的还原以形成缀合物。在氧化之前，所述多糖任选被水解。可以应用机械或者化学水解方法。化学水解方法可以通过使用乙酸进行。

所述氧化步骤可包括与高碘酸盐反应。对于本发明的目的，术语“高碘酸盐”包括高碘酸盐和高碘酸；该术语还包括偏高碘酸盐(IO₄ ^-)和原高碘酸盐(IO₆ ^5-)，及包括高碘酸的各种盐(例如高碘酸钠和高碘酸钾)。在一个实施方案中，所述荚膜多糖在偏高碘酸盐、优选在高碘酸钠(NaIO₄)存在的条件下被氧化。在另一个实施方案中，所述荚膜多糖在原高碘酸盐、优选在高碘酸存在的条件下被氧化。

在一个实施方案中，所述氧化剂是稳定的硝酰基或者氮氧自由基(nitroxideradical)化合物，如哌啶-N-氧或者吡咯烷-N-样化合物，在存在氧化剂的条件下选择性氧化伯羟基(如WO 2014/097099所述)。在所述反应中，在催化循环中实际的氧化剂是N-氧铵盐(N-oxoammonium salt)。一方面，所述稳定的硝酰基或氮氧自由基化合物是哌啶-N-氧或吡咯烷-N-氧化合物。一方面，所述稳定的硝酰基或者氮氧自由基化合物具有TEMPO(2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧)或者PROXYL(2,2,5,5-四甲基-1-吡咯烷氧)部分。一方面，所述稳定的氮氧自由基化合物是TEMPO或其衍生物。一方面，所述氧化剂是具有N-卤素部分的分子。一方面，所述氧化剂选自N-氯琥珀酰亚胺、N-溴琥珀酰亚胺、N-碘琥珀酰亚胺、二氯异氰尿酸、1,3,5-三氯-1,3,5-噻嗪烷-2,4,6-三酮、二溴异氰尿酸、1,3,5-三溴-1,3,5-噻嗪烷-2,4,6-三酮、二碘异氰尿酸和1,3,5-三碘-1,3,5-噻嗪烷-2,4,6-三酮组成的组。优选地，所述氧化剂是N-氯琥珀酰亚胺。

在一个优选实施方案中，来自肺炎链球菌血清型12F的荚膜多糖通过还原胺化反应与载体蛋白缀合，其中氧化剂是2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧(TEMPO)游离自由基并且N-氯琥珀酰亚胺(NCS)作为共氧化剂(如WO 2014/097099所述)。因此，一方面，来自肺炎链球菌血清型12F的糖缀合物可通过包括如下步骤的方法获得：a)将12F糖与2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧(TEMPO)和N-氯琥珀酰亚胺(NCS)在水性溶剂中反应以产生活化的糖；以及b)将所述活化的糖与包含一或多个胺基团的载体蛋白反应(所述方法之后被称作“TEMPO/NCS还原胺化反应”)。

任选地，氧化反应通过加入猝灭剂被猝灭。所述猝灭剂可选自邻二醇、1,2-氨基醇、氨基酸、谷胱甘肽、亚硫酸盐、硫酸氢盐、连二亚硫酸盐、偏亚硫酸氢盐、硫代硫酸盐、亚磷酸盐、次磷酸盐或者(如甘油、乙二醇、丙烷-1,2-二醇、丁烷-1,2-二醇或者丁烷-2,3-二醇、抗坏血酸)。

在所述多糖的氧化步骤之后，所述多糖被称作是活化的，在下文称作“活化的多糖”。所述活化的多糖与载体蛋白可以是单独(独立冻干)或者一起(共同冻干)冻干的(冷冻干燥)。在一个实施方案中，所述活化的多糖和载体蛋白是共同冻干的。在另一个实施方案中，所述活化的多糖和载体蛋白是单独冻干的。

在一个实施方案中，冻干是在存在非还原糖时发生的，可能的非还原糖包括蔗糖、海藻糖、棉籽糖、水苏糖、松三糖、葡聚糖、甘露醇、乳糖醇和帕拉金糖醇。

缀合程序的第二步骤是使用还原剂使所述活化的多糖与载体蛋白还原以形成缀合物(所谓的还原胺化反应)。合适的还原剂包括氰基硼氢化物(如在存在Bronsted或Lewis酸时的氰基硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠或者硼氢化钠或锌)，胺硼烷如吡啶硼烷、2-甲基吡啶硼烷、2,6-二硼烷-甲醇、二甲基胺硼烷、t-BuMeⁱPrN-BH₃、苄胺-BH₃或者5-乙基-2-甲基吡啶硼烷(PEMB)或者硼氢化物交换树脂。在一个实施方案中，所述还原剂是氰基硼氢化钠。

在一个实施方案中，还原反应是在水状溶剂(例如选自PBS、MES、HEPES、Bis-tris、ADA、PIPES、MOPSO、BES、MOPS、DIPSO、MOBS、HEPPSO、POPSO、TEA、EPPS、Bicine或HEPB，pH6.0-8.5、7.0-8.0或者7.0-7.5)中进行。在另一个实施方案中，所述反应在质子惰性溶剂(aprotic solvent)中进行。在一个实施方案中，还原反应是在DMSO(二甲基亚砜)或者DMF(二甲基甲酰胺)溶剂中进行。DMSO或DMF溶剂可以用于重建已经冻干的活化的多糖和载体蛋白。

在还原反应结束时，在缀合物中可能留下未反应的醛基团，可以使用合适的封端剂封端。在一个实施方案中，这种封端剂是硼氢化钠(NaBH₄)。在缀合后(还原反应及任选封端)，可以通过本领域技术人员已知的各种技术纯化(对于多糖-蛋白质缀合物的量进行富集)所述糖缀合物。这些技术包括透析、浓缩/渗滤操作、切向流动过滤沉淀/洗脱、柱层析(DEAE或者疏水性作用层析)，以及深度过滤。在一个实施方案中，糖缀合物是通过渗滤或者离子交换层析或者大小排阻层析纯化的。

在一个实施方案中，所述糖缀合物是灭菌过滤的。

在本发明的一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、8、9V、14、18C、19F和23F的所述糖缀合物是使用CDAP化学制备的，并且来自肺炎链球菌血清型6A的所述糖缀合物是通过还原胺化反应制备的。

在本发明的一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、8、9V、14、18C、19F和23F的所述糖缀合物是使用CDAP化学制备的，并且来自肺炎链球菌血清型19A的所述糖缀合物是通过还原胺化反应制备的。

在本发明的一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、8、9V、14、18C、19F和23F的所述糖缀合物是使用CDAP化学制备的，并且来自肺炎链球菌血清型6A和19A的所述糖缀合物是通过还原胺化反应制备的。

在本发明的一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、8、9V、14、18C、19F和23F的所述糖缀合物是使用CDAP化学制备的，并且来自肺炎链球菌血清型3、6A和19A的所述糖缀合物是通过还原胺化反应制备的。

在本发明的一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、8、9V、14、18C、19F、22F和23F的所述糖缀合物是使用CDAP化学制备的，并且来自肺炎链球菌血清型6A的所述糖缀合物是通过还原胺化反应制备的。

在本发明的一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、8、9V、14、18C、19F、22F和23F的所述糖缀合物是使用CDAP化学制备的，并且来自肺炎链球菌血清型19A的所述糖缀合物是通过还原胺化反应制备的。

在本发明的一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、8、9V、14、18C、19F、22F和23F的所述糖缀合物是使用CDAP化学制备的，并且来自肺炎链球菌血清型6A和19A的所述糖缀合物是通过还原胺化反应制备的。

在本发明的一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、8、9V、14、18C、19F、22F和23F的所述糖缀合物是使用CDAP化学制备的，并且来自肺炎链球菌血清型3、6A和19A的所述糖缀合物是通过还原胺化反应制备的。

在一个实施方案中，本发明的所述糖缀合物是使用eTEC缀合方法制备的如WO2014/027302中所述。所述糖缀合物包含通过一或多个eTEC间隔物共价缀合到载体蛋白的糖，其中所述糖与eTEC间隔物通过氨基甲酸酯键共价缀合，并且其中所述载体蛋白通过酰胺键与eTEC间隔物共价缀合。本发明的eTEC连接的糖缀合物可以通过通式(I)表示：

其中包含eTEC间隔物的原子放在中间的框内。

eTEC间隔物包含7个线性原子(即–C(O)NH(CH₂)₂SCH₂C(O)-)，并且在所述糖与载体蛋白之间提供稳定的硫醚和酰胺键。eTEC连接的糖缀合物的合成包括所述糖的活化的羟基基团与硫代烷基胺反应物(如胱胺或者半胱胺或者其盐)的氨基基团的反应，形成氨基甲酸酯键至所述糖以提供硫醇化的糖。一或多个游离巯基基团的产生是通过与还原剂反应实现的，以提供活化的硫醇化糖。所述活化的硫醇化糖的游离巯基基团与在含有胺的残基上具有一或多个α-卤乙酰胺基团的活化的载体蛋白反应，产生硫醚键以形成缀合物，其中所述载体蛋白通过酰胺键连接到eTEC间隔物。

在本发明的所述糖缀合物中，所述糖可以是多糖或者寡糖。所述载体蛋白可以选自如本文所述或者本领域技术人员已知的任何合适的载体。在惯常的实施方案中，所述糖是多糖。在一些这样的实施方案中，所述载体蛋白是CRM₁₉₇。在一些这样的实施方案中，所述eTEC连接的糖缀合物包含肺炎链球菌血清型33F荚膜多糖。

在特别优选的实施方案中，所述eTEC连接的糖缀合物包含肺炎球菌血清型33F(Pn33F)荚膜多糖，其通过eTEC间隔物共价缀合至CRM₁₉₇(血清型33F eTEC连接的糖缀合物)。

在一些实施方案中，本发明的来自肺炎链球菌血清型1、7F、9V和/或18C的所述糖缀合物是O-乙酰化的。在一些实施方案中，来自肺炎链球菌血清型1、7F和9V的所述糖缀合物是O-乙酰化的，并且来自肺炎链球菌血清型18C的所述糖缀合物是去-O-乙酰化的。

在一些实施方案中，来自肺炎链球菌血清型1的所述糖缀合物包含具有O-乙酰化程度如下所示的糖：10-100％、20-100％、30-100％、40-100％、50-100％、60-100％、70-100％、75-100％、80-100％、90-100％、50-90％、60-90％、70-90％或者80-90％。在其它实施方案中，所述O-乙酰化程度是≥10％、≥20％、≥30％、≥40％、≥50％、≥60％、≥70％、≥80％、≥90％或者大约100％。

在一些实施方案中，来自肺炎链球菌血清型7F的所述糖缀合物包含具有O-乙酰化程度如下所示的糖：10-100％、20-100％、30-100％、40-100％、50-100％、60-100％、70-100％、75-100％、80-100％、90-100％、50-90％、60-90％、70-90％或者80-90％。在其它实施方案中，所述O-乙酰化程度是≥10％、≥20％、≥30％、≥40％、≥50％、≥60％、≥70％、≥80％、≥90％或者大约100％。

在一些实施方案中，来自肺炎链球菌血清型9V的所述糖缀合物包含具有O-乙酰化程度如下所示的糖：10-100％、20-100％、30-100％、40-100％、50-100％、60-100％、70-100％、75-100％、80-100％、90-100％、50-90％、60-90％、70-90％或者80-90％。在其它实施方案中，所述O-乙酰化程度为≥10％、≥20％、≥30％、≥40％、≥50％、≥60％、≥70％、≥80％、≥90％或者大约100％。

在一些实施方案中，来自肺炎链球菌血清型18C的所述糖缀合物包含具有O-乙酰化程度如下所示的糖：10-100％、20-100％、30-100％、40-100％、50-100％、60-100％、70-100％、75-100％、80-100％、90-100％、50-90％、60-90％、70-90％或者80-90％。在其它实施方案中，所述O-乙酰化的程度为≥10％、≥20％、≥30％、≥40％、≥50％、≥60％、≥70％、≥80％、≥90％或者大约100％。然而优选地，来自肺炎链球菌血清型18C的所述糖缀合物是去-O-乙酰化的。在一些所述实施方案中，来自肺炎链球菌血清型18C的所述糖缀合物包含具有O-乙酰化如下所示的糖：0-50％、0-40％、0-30％、0-20％、0-10％、0-5％或者0-2％。在其它实施方案中，所述O-乙酰化的程度是≤50％、≤40％、≤30％、≤20％、≤10％、≤5％、≤2％或者≤1％。

O-乙酰化百分比％是指给定的糖相对于100％(其中每个重复单位相对于其乙酰化结构是完全乙酰化的)的百分比。

在一些实施方案中，本发明的所述糖缀合物包含分子量为10kDa-2,000kDa的糖。在其它这种实施方案中，所述糖的分子量为50kDa-1,000kDa。在其它这种实施方案中，所述糖的分子量为70kDa-900kDa。在其它这种实施方案中，所述糖的分子量为100kDa-800kDa。在其它这种实施方案中，所述糖的分子量为200kDa-600kDa。在进一步这样的实施方案中，所述糖的分子量为100kDa-1000kDa、100kDa-900kDa、100kDa-800kDa、100kDa-700kDa、100kDa-600kDa、100kDa-500kDa、100kDa-400kDa、100kDa-300kDa、150kDa-1,000kDa、150kDa-900kDa、150kDa-800kDa、150kDa-700kDa、150kDa-600kDa、150kDa-500kDa、150kDa-400kDa、150kDa-300kDa、200kDa-1,000kDa、200kDa-900kDa、200kDa-800kDa、200kDa-700kDa、200kDa-600kDa、200kDa-500kDa、200kDa-400kDa、200kDa-300、250kDa-1,000kDa、250kDa-900kDa、250kDa-800kDa、250kDa-700kDa、250kDa-600kDa、250kDa-500kDa、250kDa-400kDa、250kDa-350kDa、300kDa-1,000kDa、300kDa-900kDa、300kDa-800kDa、300kDa-700kDa、300kDa-600kDa、300kDa-500kDa、300kDa-400kDa、400kDa-1,000kDa、400kDa-900kDa、400kDa-800kDa、400kDa-700kDa、400kDa-600kDa、500kDa-600kDa。在上述任何范围内的任何整数均预期作为本公开的实施方案。在一些这样的实施方案中，所述糖缀合物是使用还原胺化反应制备的。

在一些实施方案中，本发明的所述糖缀合物的分子量为400kDa-15,000kDa、500kDa-10,000kDa、2,000kDa-10,000kDa、3,000kDa-8,000kDa或者3,000kDa-5,000kDa。在其它实施方案中，所述糖缀合物的分子量为500kDa-10,000kDa。在其它实施方案中，糖缀合物的分子量为1,000kDa-8,000kDa。仍在其它的实施方案中，所述糖缀合物的分子量为2,000kDa-8,000kDa或者3,000kDa-7,000kDa。在进一步的实施方案中，本发明的所述糖缀合物的分子量为200kDa-20,000kDa、200kDa-15,000kDa、200kDa-10,000kDa、200kDa-7,500kDa、200kDa-5,000kDa、200kDa-3,000kDa、200kDa-1,000kDa、500kDa-20,000kDa、500kDa-15,000kDa、500kDa-12,500kDa、500kDa-10,000kDa、500kDa-7,500kDa、500kDa-6,000kDa、500kDa-5,000kDa、500kDa-4,000kDa、500kDa-3,000kDa、500kDa-2,000kDa、500kDa-1,500kDa、500kDa-1,000kDa、750kDa-20,000kDa、750kDa-15,000kDa、750kDa-12,500kDa、750kDa-10,000kDa、750kDa-7,500kDa、750kDa-6,000kDa、750kDa-5,000kDa、750kDa-4,000kDa、750kDa-3,000kDa、750kDa-2,000kDa、750kDa-1,500kDa、1,000kDa-15,000kDa、1,000kDa-12,500kDa、1,000kDa-10,000kDa、1,000kDa-7,500kDa、1,000kDa-6,000kDa、1,000kDa-5,000kDa、1,000kDa-4,000kDa、1,000kDa-2,500kDa、2,000kDa-15,000kDa、2,000kDa-12,500kDa、2,000kDa-10,000kDa、2,000kDa-7,500kDa、2,000kDa-6,000kDa、2,000kDa-5,000kDa、2,000kDa-4,000kDa或者2,000kDa-3,000kDa。

在进一步的实施方案中，本发明的所述糖缀合物的分子量为3,000kDa-20,000kDa、3,000kDa-15,000kDa、3,000kDa-10,000kDa、3,000kDa-7,500kDa、3,000kDa-5,000kDa、4,000kDa-20,000kDa、4,000kDa-15,000kDa、4,000kDa-12,500kDa、4,000kDa-10,000kDa、4,000kDa-7,500kDa、4,000kDa-6,000kDa或者4,000kDa-5,000kDa。

在进一步的实施方案中，本发明的所述糖缀合物的分子量为5,000kDa-20,000kDa、5,000kDa-15,000kDa、5,000kDa-10,000kDa、5,000kDa-7,500kDa、6,000kDa-20,000kDa、6,000kDa-15,000kDa、6,000kDa-12,500kDa、6,000kDa-10,000kDa或者6,000kDa-7,500kDa。

所述糖缀合物的分子量通过SEC-MALLS测量。在上述任何范围内的任何整数均预期作为本公开的实施方案。

在一个优选实施方案中，本发明的血清型22F糖缀合物包含至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6或0.7或者大约0.8mM乙酸盐/mM血清型22F多糖。在一个优选实施方案中，所述糖缀合物包含至少0.5、0.6或0.7mM乙酸盐/mM血清型22F多糖。在一个优选实施方案中，所述糖缀合物包含至少0.6mM乙酸盐/mM血清型22F多糖。在一个优选实施方案中，所述糖缀合物包含至少0.7mM乙酸盐/mM血清型22F多糖。

在一个优选实施方案中，本发明的血清型33F糖缀合物包含至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.8mM乙酸盐/mM血清型33F荚膜多糖。在一个优选实施方案中，所述糖缀合物包含至少0.5、0.6或0.7mM乙酸盐/mM血清型33F荚膜多糖。在一个优选实施方案中，所述糖缀合物包含至少0.6mM乙酸盐/mM血清型33F荚膜多糖。在一个优选实施方案中，所述糖缀合物包含至少0.7mM乙酸盐/mM血清型33F荚膜多糖。在一个优选实施方案中，O-乙酰基的存在通过离子-HPLC分析确定。

在一个优选实施方案中，本发明的血清型15B糖缀合物包含至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.8mM乙酸盐/mM血清型15B荚膜多糖。在一个优选实施方案中，所述糖缀合物包含至少0.5、0.6或0.7mM乙酸盐/mM血清型15B荚膜多糖。在一个优选实施方案中，所述糖缀合物包含至少0.6mM乙酸盐/mM血清型15B荚膜多糖。在一个优选实施方案中，所述糖缀合物包含至少0.7mM乙酸盐/mM血清型15B荚膜多糖。在一个优选实施方案中，O-乙酰基基团的存在通过离子HPLC分析确定。

在一个优选实施方案中，本发明的血清型15B糖缀合物包含至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.8mM甘油/mM血清型15B荚膜多糖。在一个优选实施方案中，本发明的所述血清型15B糖缀合物包含至少0.5、0.6或0.7mM甘油/mM血清型15B荚膜多糖。在一个优选实施方案中，本发明的所述血清型15B糖缀合物包含至少0.6mM甘油/mM血清型15B荚膜多糖。在一个优选实施方案中，本发明的所述血清型15B糖缀合物包含至少0.7mM甘油/mM血清型15B荚膜多糖。

在一个优选实施方案中，本发明的所述血清型11A糖缀合物包含至少0.3、0.5、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2、2.6、3.0、3.4、3.8、4.2、4.6或大约5.0mM乙酸盐/mM血清型11A多糖。在一个优选实施方案中，本发明的所述血清型11A糖缀合物包含至少1.8、2.2或2.6mM乙酸盐/mM血清型11A多糖。在一个实施方案中，所述糖缀合物包含至少0.6mM乙酸盐/mM血清型11A多糖。在一个优选实施方案中，本发明的所述血清型11A糖缀合物包含至少0.6、1.0、1.4、1.8、2.2、2.6、3.0、3.4、3.8、4.2或大约4.6mM乙酸盐/mM血清型11A多糖及低于大约5.0mM乙酸盐/mM血清型11A多糖。在一个实施方案中，本发明的所述血清型11A糖缀合物包含至少0.6、1.0、1.4、1.8、2.2、2.6或大约3.0mM乙酸盐/mM血清型11A多糖及低于大约3.4mM乙酸盐/mM血清型11A多糖。在一个实施方案中，本发明的所述血清型11A糖缀合物包含至少0.6、1.0、1.4、1.8、2.2、2.6或大约3.0mM乙酸盐/mM血清型11A多糖及低于大约3.3mM乙酸盐/mM血清型11A多糖。上述任何数目均预期作为本公开的实施方案。

在一个优选实施方案中，本发明的所述血清型11A糖缀合物包含至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或大约1.0mM甘油/mM血清型11A多糖。在一个优选实施方案中，本发明的所述血清型11A糖缀合物包含至少0.2、0.3或0.4mM甘油/mM血清型11A多糖。在一个优选实施方案中，本发明的所述血清型11A糖缀合物包含至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或大约0.9mM甘油/mM血清型11A多糖及低于大约1.0mM甘油/mM血清型11A多糖。在一个优选实施方案中，本发明的所述血清型11A糖缀合物包含至少0.3、0.4、0.5、0.6或大约0.7mM甘油/mM血清型11A多糖及低于大约0.8mM甘油/mM血清型11A多糖。上述任何数目均预期作为本公开的实施方案。

表征本发明糖缀合物的另一种方式是通过载体蛋白(例如CRM₁₉₇)中与糖缀合的赖氨酸残基数，其可以被表征为缀合的赖氨酸的范围(缀合程度)。由于共价连接至多糖，载体蛋白的赖氨酸修饰证据可以通过使用本领域技术人员已知的常规方法进行氨基酸分析而获得。缀合导致与用于产生缀合材料的载体蛋白起始材料相比回收的赖氨酸残基数目减少。在一个优选实施方案中，本发明的所述糖缀合物的缀合程度为2-15、2-13、2-10、2-8、2-6、2-5、2-4、3-15、3-13、3-10、3-8、3-6、3-5、3-4、5-15、5-10、8-15、8-12、10-15或者10-12。在一个实施方案中，本发明的所述糖缀合物的缀合程度是大约2、大约3、大约4、大约5、大约6、大约7、大约8、大约9、大约10、大约11、大约12、大约13、大约14或者大约15。在一个优选实施方案中，本发明的所述糖缀合物的缀合程度为4-7。在一些这样的实施方案中，所述载体蛋白是CRM₁₉₇。

本发明的所述糖缀合物也可以通过糖与载体蛋白的比率(重量/重量)表征。在一些实施方案中，所述糖缀合物中多糖与载体蛋白的比率(w/w)是0.5-3(例如大约0.5、大约0.6、大约0.7、大约0.8、大约0.9、大约1.0、大约1.1、大约1.2、大约1.3、大约1.4、大约1.5、大约1.6、大约1.7、大约1.8、大约1.9、大约2.0、大约2.1、大约2.2、大约2.3、大约2.4、大约2.5、大约2.6、大约2.7、大约2.8、大约2.9或者大约3.0)。在其它实施方案中，糖与载体蛋白的比率(w/w)为0.5-2.0、0.5-1.5、0.8-1.2、0.5-1.0、1.0-1.5或者1.0-2.0。在进一步的实施方案中，糖与载体蛋白的比率(w/w)是0.8-1.2。在一个优选实施方案中，所述缀合物中荚膜多糖与载体蛋白的比率是0.9-1.1。在一些这样的实施方案中，所述载体蛋白是CRM₁₉₇。

本发明的所述糖缀合物和免疫原性组合物可以含有游离糖，其不共价缀合至所述载体蛋白，但仍然存在于所述糖缀合物组合物中。所述游离糖与所述糖缀合物可以是非共价关联(即非共价结合、附着或者包埋)。

在一个优选实施方案中，所述糖缀合物包含与多糖总量相比低于大约50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％或15％的游离多糖。在一个优选的实施方案中，所述糖缀合物包含与多糖总量相比低于大约25％的游离多糖。在一个优选的实施方案中，所述糖缀合物包含与多糖总量相比低于大约20％的游离多糖。在一个优选的实施方案中，所述糖缀合物包含与多糖总量相比低于大约15％的游离多糖。

所述糖缀合物也可以通过其分子大小分布(K_d)表征。可以使用大小排阻层析介质(CL-4B)确定缀合物的相对分子大小分布。在重力加料柱中使用大小排阻层析(SEC)以描述所述缀合物的分子大小分布。在介质中从孔中排除的大分子比小分子更快速洗脱。使用级分收集器收集柱洗脱物。通过糖测定比色检测所述级分。为了确定K_d，校准柱以确立在此分子完全排除的级分(V₀)、(K_d＝0)，以及表示最大截留的级分(V_i)、(K_d＝1)。达到指定样品属性的级分(V_e)通过表达式K_d＝(V_e-V₀)/(V_i-V₀)与K_d相关联。

在一个优选实施方案中，在CL-4B柱中至少30％的糖缀合物具有K_d低于或等于0.3。在一个优选实施方案中，在CL-4B柱中至少40％的所述糖缀合物具有K_d低于或等于0.3。在一个优选实施方案中，在CL-4B柱中至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％的所述糖缀合物具有K_d低于或等于0.3。在一个优选实施方案中，在CL-4B柱中至少60％的所述糖缀合物具有K_d低于或等于0.3。在一个优选实施方案中，在CL-4B柱中50％-80％的所述糖缀合物具有K_d低于或等于0.3。在一个优选实施方案中，在CL-4B柱中65％-80％的所述糖缀合物具有K_d低于或等于0.3。

糖链连接至载体蛋白上的赖氨酸的频率是表征本发明的所述糖缀合物的另一个参数。例如，在一些实施方案中，载体蛋白与多糖之间的至少一个共价键在多糖的每4个糖重复单位出现。在另一个实施方案中，载体蛋白与多糖之间的共价键在多糖的每10个糖重复单位出现至少一次。在另一个实施方案中，载体蛋白与多糖之间的共价键在多糖的每15个糖重复单位出现至少一次。在进一步的实施方案中，载体蛋白与多糖之间的共价键在多糖的每25个糖重复单位出现至少一次。

在惯常的实施方案中，所述载体蛋白是CRM₁₉₇，并且在CRM₁₉₇与多糖之间通过eTEC间隔物的共价键在所述多糖的每4、10、15或25个糖重复单位中出现至少一次。

在其它实施方案中，所述缀合物的每5-10个糖重复单位、每2-7个糖重复单位、每3-8个糖重复单位、每4-9个糖重复单位、每6-11个糖重复单位、每7-12个糖重复单位、每8-13个糖重复单位、每9-14个糖重复单位、每10-15个糖重复单位、每2-6个糖重复单位、每3-7个糖重复单位、、每4-8个糖重复单位、每6-10个糖重复单位、每7-11个糖重复单位、每8-12个糖重复单位、每9-13个糖重复单位、每10-14个糖重复单位、每10-20个糖重复单位、每4-25个糖重复单位或者每2-25个糖重复单位包含至少一个在载体蛋白与糖之间的共价键。在惯常的实施方案中，所述载体蛋白是CRM₁₉₇。

在另一个实施方案中，多糖的每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个糖重复单位在载体蛋白与糖之间存在至少一个键。在一个实施方案中，所述载体蛋白是CRM₁₉₇。上述任何范围内的任何整数均预期作为本公开的实施方案。

1.4本发明的糖缀合物的组合

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含本文揭示的任何糖缀合物。

1.4.1糖缀合物的组合

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含来自肺炎链球菌血清型9V的至少一个糖缀合物。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含来自如下两种肺炎链球菌血清型的每种的至少一个糖缀合物：9V和4、9V和6B、9V和14、9V和18C、9V和19F或者9V和23F。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含7种如下肺炎链球菌血清型的每种的至少一个糖缀合物：9V、4、6B、14、18C、19F和23F。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含8种如下肺炎链球菌血清型的每种的至少一个糖缀合物：9V、1、4、6B、14、18C、19F和23F；9V、4、5、6B、14、18C、19F和23F；9V、4、6B、7F、14、18C、19F和23F。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含10种如下肺炎链球菌血清型的每种的至少一个糖缀合物：9V、1、5、4、6B、7F、14、18C、19F和23F。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含11种如下肺炎链球菌血清型的每种的至少一个糖缀合物：9V、1、4、5、6A、6B、7F、14、18C、19F和23F；9V、1、4、5、6B、7F、14、18C、19A、19F和23F。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含12种如下肺炎链球菌血清型的每种的至少一个糖缀合物：9V、1、4、5、6A、6B、7F、14、18C、19A、19F和23F。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含13种如下肺炎链球菌血清型的每种的至少一个糖缀合物：9V、1、3、4、5、6A、6B、7F、14、18C、19A、19F和23F。

1.4.2另外的糖缀合物组合

在一个实施方案中，在上文1.4.1定义的任何免疫原性组合物另外包含肺炎链球菌血清型15B的至少一个糖缀合物。

在一个实施方案中，在上文1.4.1定义的任何免疫原性组合物另外包含肺炎链球菌血清型22F的至少一个糖缀合物。

在一个实施方案中，在上文1.4.1定义的任何免疫原性组合物另外包含肺炎链球菌血清型33F的至少一个糖缀合物。

在一个实施方案中，在上文1.4.1定义的任何免疫原性组合物另外包含肺炎链球菌血清型8的至少一个糖缀合物。

在一个实施方案中，在上文1.4.1定义的任何免疫原性组合物另外包含肺炎链球菌血清型10A的至少一个糖缀合物。

在一个实施方案中，在上文1.4.1定义的任何免疫原性组合物另外包含肺炎链球菌血清型11A的至少一个糖缀合物。

在一个实施方案中，在上文1.4.1定义的任何免疫原性组合物另外包含肺炎链球菌血清型12F的至少一个糖缀合物。

在一个实施方案中，在上文1.4.1定义的任何免疫原性组合物另外包含2种如下肺炎链球菌血清型的每种的至少一个糖缀合物：

15B和22F，

15B和33F，

15B和12F，

15B和10A，

15B和11A，

15B和8，

22F和33F，

22F和12F，

22F和10A，

22F和11A，

22F和8，

33F和12F，

33F和10A，

33F和11A，

33F和8，

12F和10A，

12F和11A，

12F和8，

10A和11A，

10A和8，或者

11A和8。

在一个实施方案中，在上文1.4.1定义的任何免疫原性组合物另外包含3种如下肺炎链球菌血清型的每种的至少一个糖缀合物：

15B和22F和33F，

15B和22F和12F，

15B和22F和10A，

15B和22F和11A，

15B和22F和8，

15B和33F和12F，

15B和33F和10A，

15B和33F和11A，

15B和33F和8，

15B和12F和10A，

15B和12F和11A，

15B和12F和8，

15B和10A和11A，

15B和10A和8，

15B和11A和8，

22F和33F和12F，

22F和33F和10A，

22F和33F和11A，

22F和33F和8，

22F和12F和10A，

22F和12F和11A，

22F和12F和8，

22F和10A和11A，

22F和10A和8，

22F和11A和8，

33F和12F和10A，

33F和12F和11A，

33F和12F和8，

33F和10A和11A，

33F和10A和8，

33F和11A和8，

12F和10A和11A，

12F和10A和8，

12F和11A和8，或者

10A和11A和8。

在一个实施方案中，在上文1.4.1定义的任何免疫原性组合物另外包含4种如下肺炎链球菌血清型的每种的至少一个糖缀合物：

15B和22F和33F和12F，

15B和22F和33F和10A，

15B和22F和33F和11A，

15B和22F和33F和8，

15B和22F和12F和10A，

15B和22F和12F和11A，

15B和22F和12F和8，

15B和22F和10A和11A，

15B和22F和10A和8，

15B和22F和11A和8，

15B和33F和12F和10A，

15B和33F和12F和11A，

15B和33F和12F和8，

15B和33F和10A和11A，

15B和33F和10A和8，

15B和33F和11A和8，

15B和12F和10A和11A，

15B和12F和10A和8，

15B和12F和11A和8，

15B和10A和11A和8，

22F和33F和12F和10A，

22F和33F和12F和11A，

22F和33F和12F和8，

22F和33F和10A和11A，

22F和33F和10A和8，

22F和33F和11A和8，

22F和12F和10A和11A，

22F和12F和10A和8，

22F和12F和11A和8，

22F和10A和11A和8，

33F和12F和10A和11A，

33F和12F和10A和8，

33F和12F和11A和8，

33F和10A和11A和8，或者

12F和10A和11A和8。

在一个实施方案中，在上文1.4.1定义的任何免疫原性组合物另外包含5种如下肺炎链球菌血清型的每种的至少一个糖缀合物：

15B和22F和33F和12F和10A，

15B和22F和33F和12F和11A，

15B和22F和33F和12F和8，

15B和22F和33F和10A和11A，

15B和22F和33F和10A和8，

15B和22F和33F和11A和8，

15B和22F和12F和10A和11A，

15B和22F和12F和10A和8，

15B和22F和12F和11A和8，

15B和22F和10A和11A和8，

15B和33F和12F和10A和11A，

15B和33F和12F和10A和8，

15B和33F和12F和11A和8，

15B和33F和10A和11A和8，

15B和12F和10A和11A和8，

22F和33F和12F和10A和11A，

22F和33F和12F和10A和8，

22F和33F和12F和11A和8，

22F和33F和10A和11A和8，

22F和12F和10A和11A和8，或者

33F和12F和10A和11A和8。

在一个实施方案中，在上文1.4.1定义的任何免疫原性组合物另外包含6种如下肺炎链球菌血清型的每种的至少一个糖缀合物：

15B和22F和33F和12F和10A和11A，

15B和22F和33F和12F和10A和8，

15B和22F和33F和12F和11A和8，

15B和22F和33F和10A和11A和8，

15B和22F和12F和10A和11A和8，

15B和33F和12F和10A和11A和8，或者

22F和33F和12F和10A和11A和8。

在一个实施方案中，在上文1.4.1定义的任何免疫原性组合物另外包含7种如下肺炎链球菌血清型的每种的至少一个糖缀合物：15B和22F和33F和12F和10A和11A和8。

在一个实施方案中，上述任何免疫原性组合物另外包含肺炎链球菌血清型2的糖缀合物。

在一个实施方案中，上述任何免疫原性组合物另外包含肺炎链球菌血清型17F的糖缀合物。

在一个实施方案中，上述任何免疫原性组合物另外包含肺炎链球菌血清型20的糖缀合物。

在一个实施方案中，上述任何免疫原性组合物另外包含肺炎链球菌血清型15C的糖缀合物。

优选地，上述所有免疫原性组合物的糖缀合物均单独地与所述载体蛋白缀合。

在上述免疫原性组合物的一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型9V的糖缀合物缀合至CRM₁₉₇。在上述免疫原性组合物的一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型22F的糖缀合物缀合至CRM₁₉₇。在上述免疫原性组合物的一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型33F的糖缀合物缀合至CRM₁₉₇。在上述免疫原性组合物的一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型15B的糖缀合物缀合至CRM₁₉₇。在上述免疫原性组合物的一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型12F的糖缀合物缀合至CRM₁₉₇。在上述免疫原性组合物的一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型10A的糖缀合物缀合至CRM₁₉₇。在上述免疫原性组合物的一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型11A的糖缀合物缀合至CRM₁₉₇。在上述免疫原性组合物的一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型8的糖缀合物缀合至CRM₁₉₇。在上述免疫原性组合物的一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型4、6B、14、18C、19F和23F的糖缀合物缀合至CRM₁₉₇。在上述免疫原性组合物的一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型1、5和7F的糖缀合物缀合至CRM₁₉₇。在上述免疫原性组合物的一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型6A和19A的糖缀合物缀合至CRM₁₉₇。在上述免疫原性组合物的一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型3的糖缀合物缀合至CRM₁₉₇。在上述免疫原性组合物的一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型2的糖缀合物缀合至CRM₁₉₇。在上述免疫原性组合物的一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型17F的糖缀合物缀合至CRM₁₉₇。在上述免疫原性组合物的一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型20的糖缀合物缀合至CRM₁₉₇。在上述免疫原性组合物的一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型15C的糖缀合物缀合至CRM₁₉₇。

在一个实施方案中，上述所有免疫原性组合物的糖缀合物均单独地缀合至CRM₁₉₇。

在一个实施方案中，上述任何免疫原性组合物的来自肺炎链球菌血清型9V的所述糖缀合物单独地缀合至PD。

在一个实施方案中，上述任何免疫原性组合物的来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14和/或23F的所述糖缀合物单独地缀合至PD。

在一个实施方案中，上述任何免疫原性组合物的来自肺炎链球菌血清型18C的所述糖缀合物单独地缀合至TT。

在一个实施方案中，上述任何免疫原性组合物的来自肺炎链球菌血清型19F的糖缀合物缀合至DT。

在一个实施方案中，上述任何免疫原性组合物的来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14和/或23F的所述糖缀合物单独地缀合至PD，来自肺炎链球菌血清型18C的所述糖缀合物缀合至TT，并且来自肺炎链球菌血清型19F的所述糖缀合物缀合至DT。

在一个实施方案中，上述免疫原性组合物包含7-24种不同的肺炎链球菌血清型。在一个实施方案中，上述免疫原性组合物包含7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24种不同血清型的糖缀合物。

在一个实施方案中，上述免疫原性组合物包含7-20种不同肺炎链球菌血清型。在一个实施方案中，上述免疫原性组合物包含7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种不同肺炎链球菌血清型的糖缀合物。在一个实施方案中，上述免疫原性组合物包含16或20种不同血清型的糖缀合物。

在一个实施方案中，上述免疫原性组合物是8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20价肺炎球菌缀合物组合物。在一个实施方案中，上述免疫原性组合物是14、15、16、17、18或19价肺炎球菌缀合物组合物。在一个实施方案中，上述免疫原性组合物是16价肺炎球菌缀合物组合物。在一个实施方案中，上述免疫原性组合物是19价肺炎球菌缀合物组合物。在一个实施方案中，上述免疫原性组合物是20价肺炎球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F的糖缀合物。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F的糖缀合物。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含缀合的肺炎链球菌的糖，来自血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含缀合的肺炎链球菌的糖，来自血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F。

在一个实施方案中，本发明免疫原性组合物的糖缀合物由来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F的糖缀合物组成。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物的糖缀合物由来自血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F的糖缀合物组成。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物的糖缀合物由来自血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F的糖缀合物组成。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物的糖缀合物由来自1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F的糖缀合物组成。

优选地，本发明的免疫原性组合物的所有糖缀合物均单独地与载体蛋白缀合。在一个实施方案中，上述免疫原性组合物的糖缀合物单独缀合至CRM₁₉₇。

1.4.3进一步的糖缀合物组合

在一个实施方案中，上文1.4.1或1.4.2定义的任何免疫原性组合物不包含肺炎链球菌血清型9N的荚膜糖。

在一个实施方案中，上文1.4.1或1.4.2定义的任何免疫原性组合物不包含肺炎链球菌血清型9A的荚膜糖。

在一个实施方案中，上文1.4.1或1.4.2定义的任何免疫原性组合物不包含肺炎链球菌血清型9L的荚膜糖。

在一个实施方案中，上文1.4.1或1.4.2定义的任何免疫原性组合物不包含肺炎链球菌血清型9N和9A的荚膜糖。

在一个实施方案中，上文1.4.1或1.4.2定义的任何免疫原性组合物不包含肺炎链球菌血清型9N和9L的荚膜糖。

在一个实施方案中，上文1.4.1或1.4.2定义的任何免疫原性组合物不包含肺炎链球菌血清型9A和9L的荚膜糖。

在一个实施方案中，上文1.4.1或1.4.2定义的任何免疫原性组合物不包含肺炎链球菌血清型9N、9A和9L的荚膜糖。

在荚膜多糖缀合至载体蛋白之后，通过各种技术纯化糖缀合物(对于多糖-载体蛋白缀合物的量进行富集)。这些技术包括浓缩/渗滤、沉淀/洗脱、柱层析及深度过滤等。见例如美国申请公开号2007/0184072和WO2008/079653。在纯化各个糖缀合物之后，将其混合以配制本发明的免疫原性组合物。

2免疫原性组合物的剂量

2.1多糖的量

每剂量中选定的糖缀合物的量是在典型的接种者中诱导免疫保护性应答而无明显的不利副作用的量。这种量根据应用的特异性免疫原以及其怎样存在而不同。

免疫原性组合物中特定糖缀合物的量可以基于缀合物的总多糖量计算(缀合的和非缀合的)。例如，在100μg多糖剂量中，具有20％游离多糖的糖缀合物具有大约80μg缀合的多糖和大约20μg非缀合的多糖。糖缀合物的量根据链球菌血清型而可以变化。糖浓度可以通过糖醛酸测定确定。

免疫原性组合物中不同多糖成分的“免疫原性量”可以不同，并且均可包含大约1.0μg、大约2.0μg、大约3.0μg、大约4.0μg、大约5.0μg、大约6.0μg、大约7.0μg、大约8.0μg、大约9.0μg、大约10.0μg、大约15.0μg、大约20.0μg、大约30.0μg、大约40.0μg、大约50.0μg、大约60.0μg、大约70.0μg、大约80.0μg、大约90.0μg或大约100.0μg的任何特定多糖抗原。

通常地，对于给定血清型，每剂量包含0.1μg-100μg多糖，特别是0.5μg-20μg、更特别是1μg-10μg，及甚至更特别是2μg-5μg。上述任何范围内的任何整数均预期作为本公开的实施方案。

在一个实施方案中，对于给定血清型，每剂量包含1μg、2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μg、10μg、15μg或20μg的多糖。

2.2载体的量

通常地，每剂量包含5μg-150μg的载体蛋白，特别是10μg-100μg的载体蛋白、更特别是15μg-100μg的载体蛋白、更特别是25-75μg的载体蛋白、更特别是30μg-70μg的载体蛋白、更特别是30-60μg的载体蛋白、更特别是30μg-50μg的载体蛋白及更特别是40-60μg的载体蛋白。在一个实施方案中，所述载体蛋白是CRM₁₉₇。

在一个实施方案中，每一剂量包含大约25μg、大约26μg、大约27μg、大约28μg、大约29μg、大约30μg、大约31μg、大约32μg、大约33μg、大约34μg、大约35μg、大约36μg、大约37μg、大约38μg、大约39μg、大约40μg、大约41μg、大约42μg、大约43μg、大约44μg、大约45μg、大约46μg、大约47μg、大约48μg、大约49μg、大约50μg、大约51μg、大约52μg、大约53μg、大约54μg、大约55μg、大约56μg、大约57μg、大约58μg、大约59μg、大约60μg、大约61μg、大约62μg、大约63μg、大约64μg、大约65μg、大约66μg、大约67μg、68μg、大约69μg、大约70μg、大约71μg、大约72μg、大约73μg、大约74μg或者大约75μg的载体蛋白。在一个实施方案中，所述载体蛋白是CRM₁₉₇。

3进一步的抗原

本发明的免疫原性组合物包含缀合的肺炎链球菌糖抗原(糖缀合物)。其还可以进一步包括来自其它病原体(特别是来自细菌和/或病毒)的抗原。优选的进一步的抗原选自：白喉类毒素(D)，破伤风类毒素(T)，百日咳抗原(P)(其典型是非细胞的(Pa))，乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原(HBsAg)，甲型肝炎病毒(HAV)抗原，缀合的b型流感嗜血杆菌荚膜糖(Hib)，失活的脊髓灰质炎病毒疫苗(IPV)。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含D-T-Pa。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含D-T-Pa-Hib、D-T-Pa-IPV或者D-T-Pa-HBsAg。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含D-T-Pa-HBsAg-IPV或者D-T-Pa-HBsAg-Hib。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含D-T-Pa-HBsAg-IPV-Hib。

百日咳抗原：百日咳杆菌(Bordetella pertussis)导致百日咳。疫苗中的百日咳抗原是细胞的(完整细胞，失活的百日咳杆菌细胞形式)或非细胞的。细胞的百日咳抗原的制备有大量文献记载(例如其可以通过加热失活百日咳杆菌I期培养物获得)。然而，本发明优选使用非细胞的抗原。在使用非细胞抗原时，优选使用1、2或(优选为)3种如下抗原：(1)去毒性的百日咳毒素(百日咳类毒素，或者PT)；(2)丝状血凝素(FHA)；(3)百日咳杆菌粘附素(也已知是69千道尔顿外膜蛋白)。FHA和百日咳杆菌粘附素在根据本发明使用之前可以用甲醛处理。PT优选通过用甲醛和/或戊二醛处理而去毒性。非细胞的百日咳抗原优选吸附于一或多种铝盐佐剂上。或者，其可以非吸附状态加入。当加入百日咳杆菌粘附素时，优选其已经吸附于氢氧化铝佐剂上。PT和FHA可以吸附于氢氧化铝佐剂或者磷酸铝上。最优选所有的PT、FHA和百日咳杆菌粘附素吸附于氢氧化铝上。

失活的脊髓灰质炎病毒疫苗：脊髓灰质炎病毒导致脊髓灰质炎。不是使用口服的脊髓灰质炎病毒疫苗，本发明的优选实施方案使用IPV。在施用给患者之前，脊髓灰质炎病毒必须失活，并且这可以通过用甲醛处理实现。脊髓灰质炎可以由三种类型的脊髓灰质炎病毒之一引起。这三种类型是相似的且导致相同的症状，但是其抗原性不同，并且一种类型的感染对其它类型感染不起保护作用。因此优选在本发明中使用三种脊髓灰质炎病毒抗原：1型脊髓灰质炎病毒(例如Mahoney毒株)，2型脊髓灰质炎病毒(例如MEF-1毒株)及3型脊髓灰质炎病毒(例如Saukett毒株)。优选将病毒单独生长、纯化和失活，然后组合以提供大型三价混合物用在本发明中。

白喉类毒素：白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)导致白喉。可以对白喉毒素进行处理(例如使用福尔马林或甲醛)以除去毒性，同时保留在注射后诱导特异性抗毒素抗体的能力。这些白喉类毒素用于白喉疫苗中。优选的白喉类毒素是通过甲醛处理制备的那些。所述白喉类毒素可以通过将白喉杆菌在生长培养基中生长，随后用甲醛处理、超滤并沉淀而获得。然后所述类毒素材料可通过包括灭菌过滤和/或透析的程序处理。所述白喉类毒素优选吸附于氢氧化铝佐剂上。

破伤风类毒素：破伤风杆菌(Clostridium tetani)导致破伤风。可以对破伤风毒素进行处理以提供保护性类毒素。所述类毒素用于破伤风疫苗中。优选的破伤风类毒素是通过甲醛处理制备的那些。所述破伤风类毒素可通过将在生长培养基中生长，随后通过甲醛处理、超滤和沉淀而获得。然后将所述材料通过包括灭菌过滤和/或透析的程序处理。

甲型肝炎病毒抗原：甲型肝炎病毒(HAV)是导致病毒性肝炎的已知媒介物(agent)之一。优选的HAV成分基于失活的病毒，并且失活可通过福尔马林处理实现。

乙型肝炎病毒(HBV)是导致病毒性肝炎的已知媒介物之一。衣壳的主要成分是称作HBV表面抗原或者更常称作HBsAg的蛋白质，其典型是具有分子量～24kDa的226个氨基酸的多肽。所有现有的乙型肝炎病毒疫苗均含有HBsAg，并且当这种抗原施用给正常接种者时刺激抗HBsAg抗体的产生，这种抗体保护免受HBV感染。

对于疫苗生产，以两种方式制备HBsAg：以颗粒形式从慢性乙型肝炎病毒携带者血浆中纯化抗原，或者通过重组DNA方法表达所述蛋白质(例如在酵母细胞中重组表达)。与天然HBsAg(即在血浆纯化的产物中)不同，酵母表达的HBsAg通常是非糖基化的，这是用于本发明的HBsAg的最优选形式。

缀合的b型流感嗜血杆菌抗原：b型流感嗜血杆菌(Hib)导致细菌性脑膜炎。Hib疫苗典型基于荚膜糖抗原，其制备由大量文献记载。Hib糖可被缀合至载体蛋白以增强其免疫原性，尤其在儿童中。典型的载体蛋白是破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM197、流感嗜血杆菌蛋白D及来自脑膜炎球菌血清型B的外膜蛋白复合物。所述缀合物的糖部分可包含从Hib细菌中制备的全长磷酸多核糖基核糖醇和/或全长PRP的片段。Hib缀合物可以吸附于或者可以不吸附于铝盐佐剂。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物进一步包括缀合的脑膜炎奈瑟氏菌血清型Y荚膜糖(MenY)和/或缀合的脑膜炎奈瑟氏菌血清型C荚膜糖(MenC)。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物进一步包括缀合的脑膜炎奈瑟氏菌血清型A荚膜糖(MenA)、缀合的脑膜炎奈瑟氏菌血清型W135荚膜糖(MenW135)、缀合的脑膜炎奈瑟氏菌血清型Y荚膜糖(MenY)和/或缀合的脑膜炎奈瑟氏菌血清型C荚膜糖(MenC)。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物进一步包括缀合的脑膜炎奈瑟氏菌血清型W135荚膜糖(MenW135)、缀合的脑膜炎奈瑟氏菌血清型Y荚膜糖(MenY)和/或缀合的脑膜炎奈瑟氏菌血清型C荚膜糖(MenC)。

4佐剂

在一些实施方案中，本发明揭示的免疫原性组合物可进一步包含至少一种佐剂(例如1、2或3种佐剂)。术语“佐剂”是指增强对抗原的免疫应答的化合物或者混合物。抗原可以主要作为输送系统、主要作为免疫调节剂或者具有这两个强势特征而起作用。合适的佐剂包括适用于哺乳动物包括人的那些佐剂。

可用于人中的已知合适的输送系统类型佐剂的实例包括但不限于铝(例如磷酸铝、硫酸铝或者氢氧化铝)、磷酸钙、脂质体、水包油乳状液如MF59(4.3％w/v鲨烯、0.5％w/v聚山梨醇酯80(Tween 80)、0.5％w/v脱水山梨糖醇三油酸酯(Span 85))、油包水乳状液如Montanide，以及聚(D,L-乙丙交酯)(PLG)微粒或者纳米颗粒。

在一个实施方案中，本发明揭示的免疫原性组合物包含铝盐(alum)作为佐剂(例如磷酸铝、硫酸铝或者氢氧化铝)。在一个优选实施方案中，本发明揭示的免疫原性组合物包含磷酸铝或者氢氧化铝作为佐剂。在一个实施方案中，本发明揭示的免疫原性组合物包含0.1mg/mL至1mg/Ml或者0.2mg/mL至0.3mg/ml的磷酸铝形式的铝元素。在一个实施方案中，本发明揭示的免疫原性组合物包含大约0.25mg/mL的磷酸铝形式的铝元素。

已知可用于人中的合适的免疫调节类型佐剂的实例包括但不限于Aquilla树(QS21，Quil A)、TLR4激动剂如MPL(单磷酰脂质A)、3DMPL(3-O-去乙酰化MPL)或者GLA-AQ、LT/CT突变体、细胞因子如各种白细胞介素(例如IL-2，IL-12)或者GM-CSF等。

已知可用于人中的具有递送和免疫调节两个特征的合适的免疫调节类型佐剂的实例包括但不限于ISCOMS(见例如等(1998)J.Leukocyte Biol.64:713；WO 90/03184,WO 96/11711,WO 00/48630,WO 98/36772,WO 00/41720,WO 2006/134423和WO2007/026190)或者GLA-EM，其是TLR4激动剂和水包油乳状液的组合物。

对于兽医学(包括但不限于动物实验)的应用，可以使用弗氏完全佐剂(CFA)、弗氏不完全佐剂(IFA)、Emulsigen、N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-去胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷酰胺(CGP 11637，称作nor-MDP)、N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷酰胺基-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰基-sn-甘油-3-羟基磷酸氧)-乙胺(CGP 19835A，称作MTP-PE)，以及RIBI，其含有从细菌中提取的三种成分，在2％鲨烯/Tween 80乳状液中的单磷酸脂质A、海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨架蛋白(MPL+TDM+CWS)。

如本发明揭示的增强肺炎球菌疫苗效力的佐剂的进一步实例包括但不限于：(1)水包油乳状液制剂(有或没有其它特异性免疫刺激剂如胞壁酰基肽(见下文)或者细菌细胞壁成分)，例如(a)SAF，含有10％角鲨烷、0.4％Tween 80、5％普朗尼克嵌段聚合物L121(pluronic-blocked polymer L121)，以及thr-MDP，微流体化为亚微粒乳状液或者涡旋产生较大颗粒大小的乳状液，和(b)RIBI^TM佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem,Hamilton,MT)，含有2％鲨烯、0.2％Tween 80及一或多种细菌细胞壁成分如单磷酸脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架蛋白(CWS)，优选MPL+CWS(DETOX^TM)；(2)saponin佐剂，如QS21、STIMULON^TM(Cambridge Bioscience,Worcester,MA)、(Isconova,Sweden)或可使用(Commonwealth Serum Laboratories,Australia)，或者从其产生的颗粒如ISCOMs(免疫刺激性复合物)，所述ISCOMS可以没有另外的洗涤剂(例如WO 00/07621)；(3)弗氏完全佐剂(CFA)和弗氏不完全佐剂(IFA)；(4)细胞因子，如白细胞介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12(WO 99/44636))、干扰素(例如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)等；(5)单磷酸脂质A(MPL)或者3-O-去乙酰化MPL(3dMPL)(见例如GB-2220221、EP0689454)，当与肺炎链球菌糖一起使用时任选实质上没有铝(见例如WO 00/56358)；(6)3dMPL与例如QS21和/或水包油乳状液的组合(见例如EP0835318、EP0735898、EP0761231)；(7)聚氧乙烯醚或者聚氧乙烯酯(见例如WO99/52549)；(8)聚氧乙烯山梨聚糖酯表面活性剂与辛基酚聚醚(octoxynol)的组合(WO 01/21207)，或者聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂与至少一种另外的非离子表面活性剂如辛基酚聚醚的组合(WO 01/21152)；(9)saponin和免疫刺激性寡核苷酸(例如CpG寡核苷酸)(WO 00/62800)；(10)免疫刺激剂和金属盐颗粒(见例如WO00/23105)；(11)saponin和水包油乳状液，例如WO 99/11241；(12)saponin(例如QS21)+3dMPL+IM2(任选+固醇)，例如WO 98/57659；(13)作为免疫刺激剂以增强组合物效力的其它物质。胞壁酰基肽包括N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷酰胺(thr-MDP)、N-25乙酰基-去胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷酰胺(nor-MDP)、N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷酰胺基-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰基-sn-甘油-3-羟基磷酸氧)-乙胺MTP-PE)等。

在本发明的一个实施方案中，本发明揭示的免疫原性组合物包含CpG寡核苷酸作为佐剂。本发明使用的CpG寡核苷酸称作免疫刺激性CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)，并且因此除了特别指出之外这些术语可以互换使用。免疫刺激性CpG寡脱氧核苷酸含有一或多个免疫刺激性CpG基序，其是非甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸，任选在某些优选的碱基环境内。CpG免疫刺激性基序的甲基化状态通常是指二核苷酸中的胞嘧啶残基。含有至少一个非甲基化CpG二核苷酸的免疫刺激性寡核苷酸是这样的寡核苷酸：其含有通过磷酸键连接至3’鸟嘌呤的5’非甲基化胞嘧啶，并且其通过结合至Toll样受体9(TLR-9)激活免疫系统。在另一个实施方案中，免疫刺激性寡核苷酸可含有一或多个甲基化CpG二核苷酸，其通过TLR9激活免疫系统，但是与如果CpG基序是非甲基化相比不一样强。CpG免疫刺激性寡核苷酸可包含一或多个回文序列，其反过来可包围CpG二核苷酸。CpG寡核苷酸已经在许多授权的专利、公开的专利申请及其它公开物包括美国专利号6,194,388、6,207,646、6,214,806、6,218,371、6,239,116和6,339,068中描述。

在本发明的一个实施方案中，本发明揭示的免疫原性组合物包含在WO 2010/125480的第3页第22行至第12页第36行描述的任何CpG寡核苷酸。

已经鉴别了不同种类的CpG免疫刺激性寡核苷酸。这些被称作A、B、C和P类，并且在WO 2010/125480的第3页第22行至第12页第36行中详细描述。本发明的方法包括这些不同种类CpG免疫刺激性寡核苷酸的应用。

在本发明的一个实施方案中，本发明揭示的免疫原性组合物包含A类CpG寡核苷酸。在本发明的一个实施方案中，本发明揭示的免疫原性组合物包含B类CpG寡核苷酸。

本发明的B类寡核苷酸序列是在上文中广泛论述的以及在公开的WO 96/02555、WO98/18810及在美国专利号6,194,388、6,207,646、6,214,806、6,218,371、6,239,116和6,339,068中描述的那些。示例性的序列包括但不限于在这些后面的专利申请和专利中公开的那些。

在一个实施方案中，本发明的“B类”CpG寡核苷酸具有如下核酸序列：

5’TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT 3’(SEQ ID NO:1)，或者

5’TCGTCGTTTTTCGGTCGTTTT 3’(SEQ ID NO:2)，或者

5’TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 3’(SEQ ID NO:3)，或者

5’TCGTCGTTTCGTCGTTTTGTCGTT 3’(SEQ ID NO:4)，或者

5’TCGTCGTTTTGTCGTTTTTTTCGA 3’(SEQ ID NO:5)。

在任何这些序列中，所有的连接可以全部是硫代磷酸酯键。在另一个实施方案中，在任何这些序列中，一或多个连接可以是磷酸二酯，优选在CpG基序的“C”与“G”之间产生半软的CpG寡核苷酸。在任何这些序列中，乙基-尿苷或者卤素可以取代5'T；卤素取代的实例包括但不限于溴-尿苷或者碘-尿苷取代。

B类寡核苷酸的一些非限制性实例包括：

5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*G*C*T*T*T*T 3’(SEQ ID NO:6)，或者

5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T 3’(SEQ ID NO:7)，或者

5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 3’(SEQ ID NO:8)，或者

5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 3’(SEQ ID NO:9)，或者

5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*T*T*T*C*G*A 3’(SEQ ID NO:10)。

其中“*”是指硫代磷酸酯键。

在本发明的一个实施方案中，本发明揭示的免疫原性组合物包含C类CpG寡核苷酸。

在本发明的一个实施方案中，本发明揭示的免疫原性组合物包含P类CpG寡核苷酸。

在一个实施方案中，所述寡核苷酸包括至少一个硫代磷酸酯键。在另一个实施方案中，所有寡核苷酸的核苷酸间连接均是硫代磷酸酯键。在另一个实施方案中，所述寡核苷酸包括至少一个磷酸二酯样连接。在另一个实施方案中，所述磷酸二酯样连接是磷酸二酯键。在另一个实施方案中，亲脂性基团与所述寡核苷酸缀合。在一个实施方案中，所述亲脂性基团是胆固醇。

在一个实施方案中，本发明揭示的CpG寡核苷酸的所有核苷酸间连接均是磷酸二酯键(“软”寡核苷酸，如WO 2007/026190所述)。在另一个实施方案中，使本发明的CpG寡核苷酸对降解具有抗性(例如稳定化)。“稳定化寡核苷酸”是指对于体内降解(例如通过外切或内切-核酸酶)具有相对抗性的寡核苷酸。核酸稳定化可通过主链修饰完成。具有硫代磷酸酯连接的寡核苷酸提供最大活性并保护所述寡核苷酸免于细胞内内切和外切核酸酶的降解。

免疫刺激性寡核苷酸可具有嵌合的主链，其具有磷酸二酯与硫代磷酸酯连接的组合。对于本发明的目的，嵌合主链是指部分稳定化的主链，其中至少一个核苷酸间连接是磷酸二酯或者磷酸二酯样的，并且其中至少一个其它核苷酸间连接是稳定化核苷酸间连接，其中所述至少一个磷酸二酯或者磷酸二酯样的连接与所述至少一个稳定化连接是不同的。当磷酸二酯连接优选位于CpG基序内时，这种分子被称作“半软的”，如WO 2007/026190所述。

其它修饰的寡核苷酸包括磷酸二酯、硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、甲基硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和/或p-乙氧基连接。

混合的主链修饰的ODN可以如WO 2007/026190所述合成。

CpG寡核苷酸的大小(即沿着寡核苷酸长度的核苷酸残基数目)也可以有助于寡核苷酸的刺激性活性。为了促进吸收进细胞中，本发明的CpG寡核苷酸优选具有6个核苷酸残基的最低长度。如果存在足够的免疫刺激性基序，大于6个核苷酸残基的任何大小的寡核苷酸(甚至许多kb长)能诱导免疫应答，因为较大的寡核苷酸在细胞内降解。在某些实施方案中，所述CpG寡核苷酸的长度是6-100个核苷酸长，优选8-30个核苷酸长。在重要的实施方案中，本发明的核酸和寡核苷酸不是质粒或者表达载体。

在一个实施方案中，本发明揭示的CpG寡核苷酸包含取代或者修饰，如在WO 2007/026190的第134-137页所述在碱基和/或糖中的取代或修饰。

在一个实施方案中，本发明的CpG寡核苷酸是化学修饰的。化学修饰的示例为本领域技术人员已知，如在Uhlmann等(1990)Chem.Rev.90:543；S.Agrawal,Ed.,Humana Press,Totowa,USA 1993；Crooke等(1996)Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.36:107-129和Hunziker等(1995)Mod.Synth.Methods 7:331-417中描述。本发明的寡核苷酸可具有一或多个修饰，其中与由天然DNA或RNA组成的相同序列的寡核苷酸相比，每个修饰位于特定的磷酸二酯核苷酸间连接和/或位于特定的β-D-核糖单位和/或位于特定的天然核苷碱基位置。

在本发明的一些实施方案中，根据本领域技术人员已知的方法，可以将含有CpG的核酸与免疫原性载体简单混合(见例如WO 03/024480)。

在本发明的一个特定实施方案中，本发明揭示的任何免疫原性组合物包含2μg-100mg的CpG寡核苷酸、优选0.1mg-50mg CpG寡核苷酸、优选0.2mg-10mg CpG寡核苷酸、优选0.3mg-5mg CpG寡核苷酸、优选0.3mg-5mg CpG寡核苷酸，更优选0.5mg-2mg CpG寡核苷酸、更优选0.75mg-1.5mg CpG寡核苷酸。在一个优选的实施方案中，本发明揭示的任何免疫原性组合物均包含大约1mg CpG寡核苷酸。

5配制

本发明的免疫原性组合物可以配制为液体形式(即溶液或悬浮液)或者是冻干形式。液体制剂可以有利地直接从其包装形式施用，并且因此对于注射是理想的，不需要在水状介质中重建，而本发明的冻干的组合物需要在液体介质中重建。

本发明的免疫原性组合物的配制可以使用本领域公认的方法完成。例如，各个肺炎球菌缀合物可以用生理学可接受的运载体配制以制备组合物。这种运载体的实例包括但不限于水、缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及右旋糖溶液。

本发明提供了包含本发明揭示的任何糖缀合物的组合及药学可接受的赋形剂、载体或稀释剂的免疫原性组合物。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物是液体形式，优选水状液体形式。

本发明的免疫原性组合物可包含一或多种缓冲液、盐、二价阳离子、非离子洗涤剂、冷冻保护剂如糖，以及抗氧化剂如游离自由基清除剂或螯合剂，或者其任意多种组合。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含缓冲液。在一个实施方案中，所述缓冲液的pKa为大约3.5-大约7.5。在一些实施方案中，所述缓冲液是磷酸盐、琥珀酸盐、组氨酸或者柠檬酸盐。在某些实施方案中，所述缓冲液是琥珀酸盐，其终浓度为1mM-10mM。在一个特定实施方案中，所述琥珀酸盐缓冲液的终浓度是大约5mM。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含盐。在一些实施方案中，所述盐选自氯化镁、氯化钾、氯化钠及其组合。在一个特定的实施方案中，所述盐是氯化钠。在一个特定的实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含150mM氯化钠。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含表面活性剂。在一个实施方案中，所述表面活性剂选自：聚山梨醇酯20(TWEEN^TM20)、聚山梨醇酯40(TWEEN^TM40)、聚山梨醇酯60(TWEEN^TM60)、聚山梨醇酯65(TWEEN^TM65)、聚山梨醇酯80(TWEEN^TM80)、聚山梨醇酯85(TWEEN^TM85)、TRITON^TM N-1 01、TRITON^TM X-100、oxtoxynol 40、壬苯醇醚(nonoxynol)-9、三乙醇胺、三乙醇胺多肽油酸酯、聚乙二醇-660羟基硬脂酸酯(PEG-15、Solutol H 15)、聚乙二醇-35-蓖麻酸酯(EL)、大豆卵磷脂和泊洛沙姆(poloxamer)。在一个特定的实施方案中，所述表面活性剂是聚山梨醇酯80。在一些所述实施方案中，所述制剂中聚山梨醇酯80的终浓度是至少0.0001％-10％聚山梨醇酯80重量比(w/w)。在一些所述实施方案中，所述制剂中聚山梨醇酯80的终浓度是至少0.001％-1％聚山梨醇酯80重量比(w/w)。在一些所述实施方案中，所述制剂中聚山梨醇酯80的终浓度是至少0.01％-1％聚山梨醇酯80重量比(w/w)。在其它实施方案中，所述制剂中聚山梨醇酯80的终浓度是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％聚山梨醇酯80(w/w)。在另一个实施方案中，所述制剂中聚山梨醇酯80的终浓度是1％聚山梨醇酯80(w/w)。

在某些实施方案中，本发明的免疫原性组合物的pH是5.5-7.5、更优选pH 5.6-7.0，甚至更优选pH 5.8-6.0。

在一个实施方案中，本发明提供了充填有本发明揭示的任何免疫原性组合物的容器。在一个实施方案中，所述容器选自小瓶、注射器、烧瓶、发酵瓶、生物反应器、药袋、药罐、安瓶、药筒和一次性笔。在某些实施方案中，所述容器是硅化的(siliconized)。

在一个实施方案中，本发明的容器由玻璃、金属(如钢、不锈钢、铝等)和/或聚合物(例如热塑性塑料、弹性体、热塑性塑料弹性体)制成。在一个实施方案中，本发明的容器是由玻璃制成。

在一个实施方案中，本发明提供了充填有本发明揭示的任何免疫原性组合物的注射器。在某些实施方案中，所述注射器是硅化的和/或由玻璃制成。

本发明的免疫原性组合物的典型剂量是体积为0.1mL-2mL，更优选0.2mL-1mL，甚至更优选体积为约0.5mL。

因此，如上定义的容器或注射器充填有0.1mL-2mL、更优选0.2mL-1mL、甚至更优选大约0.5mL体积的本发明定义的任何免疫原性组合物。

6本发明的免疫原性组合物激发交叉反应性抗体的能力

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物在人中能激发IgG抗体，如通过ELISA确定的其能结合肺炎链球菌血清型9N、9A和/或9L多糖。

在ELISA(酶联免疫吸附测定)方法中，将来自接种对象血清的抗体与已经吸附于固体支持物的多糖一起温育。使用酶缀合的二级检测抗体检测结合的抗体。

在一个实施方案中，所述ELISA测定是由WHO在“Training Manual For EnzymeLinked Immunosorbent Assay For The Quantitation Of Streptococcus PneumoniaeSerotype Specific IgG(Pn PS ELISA)”中规定的标准化ELISA测定(见http://www.vaccine.uab.edu/ELISA％20protocol.pdf，2014年3月31日刊登)。

ELISA测量人血清中存在的类型特异性IgG抗-肺炎链球菌荚膜多糖(PS)抗体。当将稀释的人血清加入类型特异性荚膜PS包被的微滴定平板中时，针对荚膜PS特异的抗体结合至所述微滴定平板。结合平板的抗体使用羊抗人IgG碱性磷酸酶标记的抗体及随后的p-硝基苯基磷酸盐底物进行检测。着色的终产物的光密度与血清中存在的抗荚膜PS抗体的量成比例。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物在人中能激发通过ELISA确定的至少0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.3μg/ml、0.35μg/ml、0.4μg/ml或0.5μg/ml浓度的IgG抗体，所述IgG抗体可以结合肺炎链球菌血清型9N多糖。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物在人中能激发通过ELISA确定的至少0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.3μg/ml、0.35μg/ml、0.4μg/ml或0.5μg/ml浓度的IgG抗体，所述IgG抗体可以结合肺炎链球菌血清型9A多糖。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物在人中能激发通过ELISA确定的至少0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.3μg/ml、0.35μg/ml、0.4μg/ml或0.5μg/ml浓度的IgG抗体，所述IgG抗体可以结合肺炎链球菌血清型9L多糖。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物在人中能激发功能性抗体，如通过体外调理吞噬作用测定(OPA)(见实施例1)确定的所述抗体能杀死肺炎链球菌血清型9N、9A和/或9L。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物在人中能激发功能性抗体，如通过体外调理吞噬作用测定(OPA)确定的所述抗体能杀死肺炎链球菌血清型9N。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物在人中能激发功能性抗体，如通过体外调理吞噬作用测定(OPA)确定的所述抗体能杀死肺炎链球菌血清型9A。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物在人中能激发功能性抗体，如通过体外调理吞噬作用测定(OPA)确定的所述抗体能杀死肺炎链球菌血清型9L。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物在人中能激发功能性抗体，如通过体外调理吞噬作用测定(OPA)确定的所述抗体能杀死肺炎链球菌血清型9N和9A。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物在人中能激发功能性抗体，如通过体外调理吞噬作用测定(OPA)确定的所述抗体能杀死肺炎链球菌血清型9N和9L。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物在人中能激发功能性抗体，如通过体外调理吞噬作用测定(OPA)确定的所述抗体能杀死肺炎链球菌血清型9A和9L。

肺炎球菌调理吞噬作用测定(OPA)，其测量存在功能性抗体和补体时吞噬效应细胞杀死肺炎链球菌细胞，该测定被认为是评估肺炎球菌疫苗效力的重要的替代物。

体外调理吞噬作用测定(OPA)可以通过温育肺炎链球菌细胞、待检测的加热失活的人血清、分化型HL-60细胞(吞噬细胞)及外来的补体来源(例如幼兔补体)的混合物而进行。在温育期间进行调理吞噬作用，抗体和补体包被的细菌细胞在调理吞噬作用的基础上被杀死。从调理吞噬作用中逃脱的存活细菌的集落形成单位(cfu)通过将该测定混合物铺板而确定。OPA效价定义为与无检测血清的对照相比导致细菌计数降低50％的倒数稀释度。OPA效价是从涵盖这个50％杀死截断值的两个稀释度内插替换的。

1:8或者更大的终点效价在这些杀死类型OPA中被认为是阳性结果。

在一个实施方案中，通过体外调理吞噬杀伤测定(OPA)确定，本发明的免疫原性组合物在至少50％的对象中能激发针对肺炎链球菌血清型9N的至少1:8的效价。在一个实施方案中，通过体外调理吞噬杀伤测定(OPA)确定，本发明的免疫原性组合物在至少60％、70％、80％、90％或至少93％的对象中能激发针对肺炎链球菌血清型9N的至少1:8的效价。

在一个实施方案中，通过体外调理吞噬杀伤测定(OPA)确定，本发明的免疫原性组合物在至少50％的对象中能激发针对肺炎链球菌血清型9A的至少1:8的效价。在一个实施方案中，通过体外调理吞噬杀伤测定(OPA)确定，本发明的免疫原性组合物在至少60％、70％、80％、90％或至少95％的对象中能激发针对肺炎链球菌血清型9A的至少1:8的效价。

在一个实施方案中，通过体外调理吞噬杀伤测定(OPA)确定，本发明的免疫原性组合物在至少50％的对象中能激发针对肺炎链球菌血清型9L的至少1:8的效价。在一个实施方案中，通过体外调理吞噬杀伤测定(OPA)确定，本发明的免疫原性组合物在至少60％、70％、80％、90％或至少95％的对象中能激发针对肺炎链球菌血清型9L的至少1:8的效价。

在一些实施方案中，所述对象由于例如天然暴露于肺炎链球菌(例如在成人对象的情况中)导致在肺炎球菌接种之前可具有血清型特异性OPA效价。

因此，可以进行在本发明的免疫原性组合物免疫接种前与免疫接种后血清的OPA活性对比，并对比其对于血清型9A、9L和9N的应答以评价应答者的潜在增加(见实施例1)。

在一个实施方案中，与预先免疫的人群相比本发明的免疫原性组合物显著增加应答者(即具有通过体外OPA确定效价为至少1:8的血清的个体)的比例。

因此，在一个实施方案中，与预先免疫的人群相比本发明的免疫原性组合物显著增加针对肺炎链球菌血清型9N的应答者(即具有通过体外OPA确定效价为至少1:8的血清的个体)的比例。

在一个实施方案中，与预先免疫的人群相比本发明的免疫原性组合物显著增加针对肺炎链球菌血清型9A的应答者(即具有通过体外OPA确定效价为至少1:8的血清的个体)的比例。

在一个实施方案中，与预先免疫的人群相比本发明的免疫原性组合物显著增加针对肺炎链球菌血清型9L的应答者(即具有通过体外OPA确定效价为至少1:8的血清的个体)的比例。

在一个实施方案中，与预先免疫的人群相比本发明的免疫原性组合物显著增加针对肺炎链球菌血清型9N和9A的应答者(即具有通过体外OPA确定效价为至少1:8的血清的个体)的比例。

在一个实施方案中，与预先免疫的人群相比本发明的免疫原性组合物显著增加针对肺炎链球菌血清型9N和9L的应答者(即具有通过体外OPA确定效价为至少1:8的血清的个体)的比例。

在一个实施方案中，与预先免疫的人群相比本发明的免疫原性组合物显著增加针对肺炎链球菌血清型9A和9L的应答者(即具有通过体外OPA确定效价为至少1:8的血清的个体)的比例。

在一个实施方案中，与预先免疫的人群相比本发明的免疫原性组合物显著增加针对肺炎链球菌血清型9N、9A和9L的应答者(即具有通过体外OPA确定效价为至少1:8的血清的个体)的比例。

也可以通过对比OPA效价中的潜在增高比较用本发明的免疫原性组合物免疫接种前和接种后的OPA活性。

因此，可以进行本发明的免疫原性组合物免疫接种前和接种后血清的OPA活性对比，及对比其对于血清型9A、9L和9N的应答以评价OPA效价的潜在增高(见实施例1)。

在一个实施方案中，与预先免疫接种的人群相比，本发明的免疫原性组合物能显著增加人对象的OPA效价。

因此，在一个实施方案中，与预先免疫接种的人群相比，本发明的免疫原性组合物能显著增加人对象针对肺炎链球菌血清型9N的OPA效价。在一个实施方案中，针对肺炎链球菌血清型9N的OPA效价的增加倍数为至少1.2、1.5、1.75、2.0或2.1。

在一个实施方案中，与预先免疫的人群相比，本发明的免疫原性组合物能显著增加人对象的针对肺炎链球菌血清型9A的OPA效价。在一个实施方案中，针对肺炎链球菌血清型9A的OPA效价的增加倍数为至少1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0或者7.5。

在一个实施方案中，与预先免疫的人群相比，本发明的免疫原性组合物能显著增加人对象的针对肺炎链球菌血清型9L的OPA效价。在一个实施方案中，针对肺炎链球菌血清型9L的OPA效价的增加倍数为至少1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0或4.2。

在一个实施方案中，与预先免疫的人群相比，本发明的免疫原性组合物能显著增加人对象的针对肺炎链球菌血清型9N和9A的OPA效价。在一个实施方案中，针对肺炎链球菌血清型9N的OPA效价的增加倍数为至少1.2、1.5、1.75、2.0或2.1，并且针对肺炎链球菌血清型9A的OPA效价的增加倍数为至少1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0或7.5。

在一个实施方案中，与预先免疫的人群相比，本发明的免疫原性组合物能显著增加人对象的针对肺炎链球菌血清型9N和9L的OPA效价。在一个实施方案中，针对肺炎链球菌血清型9N的OPA效价的增加倍数为至少1.2、1.5、1.75、2.0或2.1，并且针对肺炎链球菌血清型9L的OPA效价的增加倍数为至少1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0或4.2。

在一个实施方案中，与预先免疫的人群相比，本发明的免疫原性组合物能显著增加人对象的针对肺炎链球菌血清型9A和9L的OPA效价。在一个实施方案中，针对肺炎链球菌血清型9A的OPA效价的增加倍数为至少1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0或7.5，并且针对肺炎链球菌血清型9L的OPA效价的增加倍数为至少1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0或4.2。

在一个实施方案中，与预先免疫的人群相比，本发明的免疫原性组合物能显著增加人对象的针对肺炎链球菌血清型9N、9A和9L的OPA效价。在一个实施方案中，针对肺炎链球菌血清型9N的OPA效价的增加倍数为至少1.2、1.5、1.75、2.0或2.1，针对肺炎链球菌血清型9A的OPA效价的增加倍数为至少1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0或7.5，及针对肺炎链球菌血清型9L的OPA效价的增加倍数为至少1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0或4.2。

7本发明的免疫原性组合物的应用

在一个实施方案中，本发明揭示的免疫原性组合物用作药物。

本发明揭示的免疫原性组合物可用于各种治疗性或者预防性方法中以预防、治疗或者减轻对象中的细菌感染、疾病或病症。特别地，本发明的免疫原性组合物可用于预防、治疗或者减轻对象中的肺炎链球菌感染、疾病或者病症。

因此一方面，本发明提供了一种预防、治疗或者减轻对象中肺炎链球菌相关感染、疾病或病症的方法，其包括向所述对象施用免疫学有效量的本发明的免疫原性组合物。

一方面，本发明提供了一种预防、治疗或者减轻对象中肺炎链球菌血清型9N、9A和9L相关感染、疾病或病症的方法，其包括向所述对象施用免疫学有效量的本发明的免疫原性组合物。

一方面，本发明提供了一种预防、治疗或者减轻对象中肺炎链球菌血清型9N相关感染、疾病或病症的方法，其包括向所述对象施用免疫学有效量的本发明的免疫原性组合物。

一方面，本发明提供了一种预防、治疗或者减轻对象中肺炎链球菌血清型9A相关感染、疾病或病症的方法，其包括向所述对象施用免疫学有效量的本发明的免疫原性组合物。

一方面，本发明提供了一种预防、治疗或者减轻对象中肺炎链球菌血清型9L相关感染、疾病或病症的方法，其包括向所述对象施用免疫学有效量的本发明的免疫原性组合物。

一方面，本发明提供了一种预防、治疗或者减轻对象中肺炎链球菌血清型9N和9A相关感染、疾病或病症的方法，其包括向所述对象施用免疫学有效量的本发明的免疫原性组合物。

一方面，本发明提供了一种预防、治疗或者减轻对象中肺炎链球菌血清型9N和9L相关感染、疾病或病症的方法，其包括向所述对象施用免疫学有效量的本发明的免疫原性组合物。

一方面，本发明提供了一种预防、治疗或者减轻对象中肺炎链球菌血清型9A和9L相关感染、疾病或病症的方法，其包括向所述对象施用免疫学有效量的本发明的免疫原性组合物。

一方面，本发明提供了一种在对象中诱导针对肺炎链球菌血清型9N、9A和/或9L的免疫应答的方法，其包括向所述对象施用免疫学有效量的本发明的免疫原性组合物。

一方面，本发明提供了一种在对象中诱导针对肺炎链球菌血清型9N的免疫应答的方法，其包括向所述对象施用免疫学有效量的本发明的免疫原性组合物。

一方面，本发明提供了一种在对象中诱导针对肺炎链球菌血清型9A的免疫应答的方法，其包括向所述对象施用免疫学有效量的本发明的免疫原性组合物。

一方面，本发明提供了一种在对象中诱导针对肺炎链球菌血清型9L的免疫应答的方法，其包括向所述对象施用免疫学有效量的本发明的免疫原性组合物。

一方面，本发明的免疫原性组合物用于预防、治疗或者减轻对象中由于肺炎链球菌血清型9N、9A和/或9L所致的感染、疾病或者病症的方法中。

一方面，本发明的免疫原性组合物用于预防、治疗或者减轻对象中由于肺炎链球菌血清型9N所致的感染、疾病或者病症的方法中。一方面，本发明的免疫原性组合物用于预防、治疗或者减轻对象中由于肺炎链球菌血清型9A所致的感染、疾病或者病症的方法中。一方面，本发明的免疫原性组合物用于预防、治疗或者减轻对象中由于肺炎链球菌血清型9L所致的感染、疾病或者病症的方法中。

一方面，本发明的免疫原性组合物用于预防、治疗或者减轻对象中由于肺炎链球菌血清型9N和9A所致的感染、疾病或者病症的方法中。一方面，本发明的免疫原性组合物用于预防、治疗或者减轻对象中由于肺炎链球菌血清型9N和9L所致的感染、疾病或者病症的方法中。一方面，本发明的免疫原性组合物用于预防、治疗或者减轻对象中由于肺炎链球菌血清型9A和9L所致的感染、疾病或者病症的方法中。

在一个实施方案中，本发明揭示的任何免疫原性组合物均用于免疫对象抗肺炎链球菌血清型9N、9A和/或9L感染的方法中。

在一个实施方案中，本发明揭示的任何免疫原性组合物均用于免疫对象抗肺炎链球菌血清型9N感染的方法中。在一个实施方案中，本发明揭示的任何免疫原性组合物均用于免疫对象抗肺炎链球菌血清型9A感染的方法中。在一个实施方案中，本发明揭示的任何免疫原性组合物均用于免疫对象抗肺炎链球菌血清型9L感染的方法中。

在一个实施方案中，本发明揭示的任何免疫原性组合物均用于免疫对象抗肺炎链球菌血清型9N和9A感染的方法中。在一个实施方案中，本发明揭示的任何免疫原性组合物均用于免疫对象抗肺炎链球菌血清型9N和9L感染的方法中。在一个实施方案中，本发明揭示的任何免疫原性组合物均用于免疫对象抗肺炎链球菌血清型9A和9L感染的方法中。

一方面，本发明是关于本发明揭示的免疫原性组合物在生产预防、治疗或者减轻对象中肺炎链球菌血清型9N、9A和/或9L所致的感染、疾病或者病症的药物中的应用。

一方面，本发明是关于本发明揭示的免疫原性组合物在生产预防、治疗或者减轻对象中肺炎链球菌血清型9N和9A所致的感染、疾病或者病症的药物中的应用。一方面，本发明是关于本发明揭示的免疫原性组合物在生产预防、治疗或者减轻对象中肺炎链球菌血清型9N和9L所致的感染、疾病或者病症的药物中的应用。一方面，本发明是关于本发明揭示的免疫原性组合物在生产预防、治疗或者减轻对象中肺炎链球菌血清型9A和9L所致的感染、疾病或者病症的药物中的应用。

在一个实施方案中，本发明是关于本发明揭示的免疫原性组合物在生产免疫对象以抗肺炎链球菌血清型9N、9A和/或9L感染的药物中的应用。

在一个实施方案中，本发明是关于本发明揭示的免疫原性组合物在生产免疫对象以抗肺炎链球菌血清型9N感染的药物中的应用。在一个实施方案中，本发明是关于本发明揭示的免疫原性组合物在生产免疫对象以抗肺炎链球菌血清型9A感染的药物中的应用。在一个实施方案中，本发明是关于本发明揭示的免疫原性组合物在生产免疫对象以抗肺炎链球菌血清型9L感染的药物中的应用。

在一个实施方案中，本发明是关于本发明揭示的免疫原性组合物在生产免疫对象以抗肺炎链球菌血清型9N和9A感染的药物中的应用。在一个实施方案中，本发明是关于本发明揭示的免疫原性组合物在生产免疫对象以抗肺炎链球菌血清型9N和9L感染的药物中的应用。在一个实施方案中，本发明是关于本发明揭示的免疫原性组合物在生产免疫对象以抗肺炎链球菌血清型9A和9L感染的药物中的应用。

一方面，本发明提供了一种在对象中诱导针对肺炎链球菌血清型9N、9A和/或9L的免疫应答的方法。一方面，本发明提供了一种在对象中诱导针对肺炎链球菌血清型9N的免疫应答的方法。一方面，本发明提供了一种在对象中诱导针对肺炎链球菌血清型9A的免疫应答的方法。一方面，本发明提供了一种在对象中诱导针对肺炎链球菌血清型9L的免疫应答的方法。在一个实施方案中，本发明揭示的免疫原性组合物用作疫苗。更特别地，本发明揭示的免疫原性组合物可用于预防对象中肺炎链球菌血清型9N、9A和/或9L感染。因此一方面，本发明提供了一种在对象中预防肺炎链球菌血清型9N、9A和/或9L感染的方法，其包括向对象施用免疫学有效量的本发明的免疫原性组合物。在一些这样的实施方案中，所述感染选自肺炎、鼻窦炎、中耳炎、急性中耳炎、脑膜炎、菌血症、败血症、胸膜积液、结膜炎、骨髓炎、化脓性关节炎、心内膜炎、腹膜炎、心包炎、乳突炎、蜂窝组织炎、软组织感染和脑脓肿组成的组。一方面，待接种的所述对象是哺乳动物，如人、猫、绵羊、猪、马、牛或者狗。

一方面，本发明揭示的免疫原性组合物用于预防、治疗或者减轻对象中肺炎链球菌血清型9N、9A和/或9L相关感染、疾病或病症的方法中。在一些这样的实施方案中，所述感染、疾病或病症选自肺炎、鼻窦炎、中耳炎、急性中耳炎、脑膜炎、菌血症、败血症、胸膜积脓、结膜炎、骨髓炎、化脓性关节炎、心内膜炎、腹膜炎、心包炎、乳突炎、蜂窝组织炎、软组织感染和脑脓肿组成的组。

一方面，本发明揭示的免疫原性组合物用于预防对象中肺炎链球菌血清型9N、9A和/或9L感染的方法中。在一些这样的实施方案中，所述感染选自肺炎、鼻窦炎、中耳炎、急性中耳炎、脑膜炎、菌血症、败血症、胸膜积脓、结膜炎、骨髓炎、化脓性关节炎、心内膜炎、腹膜炎、心包炎、乳突炎、蜂窝组织炎、软组织感染和脑脓肿组成的组。一方面，待接种的所述对象是哺乳动物，如人、猫、绵羊、猪、马、牛或者狗。

一方面，本发明涉及本发明揭示的免疫原性组合物在生产预防、治疗或者减轻对象中肺炎链球菌血清型9N、9A和/或9L相关感染、疾病或者病症的药物中的应用。在一些这样的实施方案中，所述感染、疾病或者病症选自肺炎、鼻窦炎、中耳炎、急性中耳炎、脑膜炎、菌血症、败血症、胸膜积脓、结膜炎、骨髓炎、化脓性关节炎、心内膜炎、腹膜炎、心包炎、乳突炎、蜂窝组织炎、软组织感染和脑脓肿组成的组。

一方面，本发明涉及本发明揭示的免疫原性组合物在生产预防对象中肺炎链球菌血清型9N、9A和/或9L相关感染的药物中的应用。在一些这样的实施方案中，所述感染选自肺炎、鼻窦炎、中耳炎、急性中耳炎、脑膜炎、菌血症、败血症、胸膜积脓、结膜炎、骨髓炎、化脓性关节炎、心内膜炎、腹膜炎、心包炎、乳突炎、蜂窝组织炎、软组织感染和脑脓肿组成的组。一方面，待接种的所述对象是哺乳动物，如人、猫、绵羊、猪、马、牛或者狗。

本发明的免疫原性组合物可通过全身性或者经粘膜途径施用所述免疫原性组合物的手段用于保护或者治疗易感于肺炎链球菌血清型9N、9A和/或9L感染的人。在一个实施方案中，本发明揭示的免疫原性组合物通过肌肉、腹膜内、皮内或者皮下途径施用。在一个实施方案中，本发明揭示的免疫原性组合物通过肌肉、腹膜内、皮内或者皮下注射途径施用。在一个实施方案中，本发明揭示的免疫原性组合物通过肌肉或者皮下注射施用。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含至少一种来自肺炎链球菌9V的糖缀合物(如上文段落1.3中描述的糖缀合物)。

8用本发明的免疫原性组合物治疗的对象

如本文所揭示，本发明描述的免疫原性组合物可用于各种治疗或预防方法中，以预防、治疗或者减轻对象中的细菌感染、疾病或病症。

在一个优选实施方案中，所述对象是人。在最优选的实施方案中，所述对象是新生儿(即年龄在三个月以内)、婴儿(即年龄为3个月至1岁)或者幼童(即年龄为1岁至4岁)。

在一个实施方案中，本发明揭示的免疫原性组合物用作疫苗。

在这种实施方案中，待接种对象的年龄可以低于1岁。例如，待接种对象的年龄可以是大约1、大约2、大约3、大约4、大约5、大约6、大约7、大约8、大约9、大约10、大约11或者大约12个月。在一个实施方案中，待接种对象的年龄是大约2、4或者6个月。在另一个实施方案中，待接种对象的年龄小于2岁。例如，待接种对象的年龄可以是大约12-大约15个月。在一些情况中，需要仅仅1剂的本发明的免疫原性组合物，但是在一些情况中可以给予第2、3或4剂(见下文章节9)。

在本发明的一个实施方案中，待接种对象是50岁或更大年龄的成年人，优选55岁或更大年龄的成年人。在一个实施方案中，待接种对象是65或更大、70或更大、75或更大或80岁或更大年龄的成年人。

在一个实施方案中，待接种对象是免疫功能不全(immunocompromise)的个体、特别是人。免疫功能不全的个体通常定义为对于感染因素攻击呈现出减弱的或者降低的增加正常体液或细胞防御的能力的人。

在本发明的一个实施方案中，待接种的免疫功能不全的对象患有削弱免疫系统及导致抗体应答不足以预防或治疗肺炎球菌疾病的疾病或病症。

在一个实施方案中，所述疾病是原发性免疫缺陷疾病。优选地，所述原发性免疫缺陷疾病选自：组合的T细胞和B细胞免疫缺陷、抗体缺陷、明确定义的综合征、免疫失调疾病、吞噬细胞失调、先天性免疫缺陷、自发炎症性疾病及补体缺陷组成的组。在一个实施方案中，所述原发性免疫缺陷疾病选自在WO 2010/125480的第24页第11行至第25页第19行所述的疾病。

在本发明的一个特定实施方案中，待接种的免疫功能不全的对象患有选自如下一种的疾病：HIV感染、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、癌症、慢性心或肺疾病、充血性心力衰竭、糖尿病、慢性肝病、酒精中毒、肝硬化、脊髓液漏、心肌病、慢性支气管炎、肺气肿、慢性阻塞性肺病(COPD)、脾功能失调(如镰状细胞疾病)、脾功能缺失(无脾)、血液恶性肿瘤、白血病、多发性骨髓瘤、Hodgkin’s病、淋巴瘤、肾衰竭、肾病综合征和哮喘。

在本发明的一个实施方案中，待接种的免疫功能不全的对象患有营养失调。

在本发明的一个特定实施方案中，待接种的免疫功能不全的对象正在服用降低机体对感染抗性的药物或者治疗。在一个实施方案中，所述药物选自在WO 2010/125480的第26页第33行至第26页第4行所揭示的药物。

在本发明的一个特定实施方案中，待接种的免疫功能不全的对象是吸烟者。

在本发明的一个特定实施方案中，待接种的免疫功能不全的对象的白细胞计数低于5×10⁹个细胞/L、或低于4×10⁹个细胞/L、或低于3×10⁹个细胞/L、或低于2×10⁹个细胞/L、或低于1×10⁹个细胞/L、或低于0.5×10⁹个细胞/L、或低于0.3×10⁹个细胞/L或者低于0.1×10⁹个细胞/L。

白色血细胞计数(白细胞计数)：血液中白色血细胞(WBC)的数目。WBC通常是作为CBC(全血计数)的一部分而测量的。白色血细胞是血液中的抗感染细胞，与称作红细胞的红色(携带氧的)血细胞不同。存在不同类型的白色血细胞，包括中性粒细胞(多形核白细胞；PMN)、杆状核粒细胞(略不成熟的中性粒细胞)、T型淋巴细胞(T细胞)、B型淋巴细胞(B细胞)、单个核细胞(monocyte)、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。所有类型的白色血细胞均在白色血细胞计数中反映出来。白色血细胞计数的正常范围通常是4,300-10,800个细胞/立方毫米血液。这也可以称作白细胞计数及可以国际单位4.3-10.8×10⁹个细胞/L表示。

在本发明的一个特定实施方案中，待接种的免疫功能不全的对象患有中性粒细胞减少症。在本发明的一个特定实施方案中，待接种的免疫功能不全的对象的中性粒细胞计数低于2×10⁹个细胞/L、或低于1×10⁹个细胞/L、或低于0.5×10⁹个细胞/L、或低于0.1×10⁹个细胞/L或者低于0.05×10⁹个细胞/L。

低白色血细胞计数或者“中性粒细胞减少症”是通过在循环血液中中性粒细胞的异常低下的水平表征的病症。中性粒细胞是一种特殊种类的白色血细胞，其帮助预防和对抗感染。癌症患者经历中性粒细胞减少的最常见原因是化疗的副作用。化疗诱导的中性粒细胞减少增加了患者感染及中断癌症治疗的风险。

在本发明的一个特定实施方案中，待接种的免疫功能不全的对象具有CD4+细胞计数低于500/mm³、或CD4+细胞计数低于300/mm³、或CD4+细胞计数低于200/mm³、或CD4+细胞计数低于100/mm³、75/mm³或者CD4+细胞计数低于50/mm³。

CD4细胞检测通常以mm³为单位报告细胞数目。正常CD4计数在500-1600之间，CD8计数在375-1100之间。CD4计数在HIV人群中显著下降。

在本发明的一个实施方案中，本文揭示的任何免疫功能不全的对象是人类男性或者人类女性。

9方案

在一些情况中，仅仅需要1剂本发明的免疫原性组合物，但是在一些情况中如在更严重的免疫缺陷病症中，可以给予第2、3或4剂。在初始接种后，对象可接受适当间隔的一或多次加强免疫。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物的接种安排是单剂量。在特定的实施方案中，所述单剂量安排是针对至少2岁的健康人。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物的接种安排是多剂量安排。在特定的实施方案中，所述多剂量安排由间隔大约1个月至大约2个月的一系列2次剂量组成。在特定的实施方案中，所述多剂量安排由间隔大约1个月的一系列2次剂量组成，或者由间隔大约2个月的一系列2次剂量组成。

在另一个实施方案中，所述多剂量安排由间隔大约1-2个月的一系列3次剂量组成。在另一个实施方案中，所述多剂量安排由间隔大约1个月的一系列3次剂量组成，或者由间隔大约2个月的一系列3次剂量组成。

在另一个实施方案中，所述多剂量安排由间隔大约1-大约2个月的一系列3次剂量，随后是在第一次剂量后大约10-大约13个月的第4次剂量组成。在另一个实施方案中，所述多剂量安排由间隔大约1个月的一系列3次剂量，随后是在第1次剂量后大约10-大约13个月的第4次剂量组成，或者由间隔大约2个月的一系列3次剂量，随后是在第1次剂量后大约10-大约13个月的第4次剂量组成。

在一个实施方案中，多剂量安排由在一岁时的至少1次(例如1、2或3次剂量)剂量，随后的至少1次幼童剂量组成。

在一个实施方案中，多剂量安排由从2个月龄开始，间隔大约1-大约2个月(例如两次剂量之间间隔28-56天)的一系列2或3次剂量，随后在12-18个月龄的1次幼童剂量组成。在一个实施方案中，多剂量安排由从2个月龄开始，间隔大约1-2个月(例如两次剂量之间间隔28-56天)的一系列3次剂量，随后在12-15个月龄的1次幼童剂量组成。在另一个实施方案中，多剂量安排由从2个月年龄开始，间隔大约2个月的一系列2次剂量，随后在12-18个月龄的1次幼童剂量组成。

在一个实施方案中，所述多剂量安排由在年龄为2、4、6和12-15个月龄的4次剂量组成。

在一个实施方案中，在第0天给予初次剂量(prime dose)，及在剂量间隔大约2-大约24周、优选剂量间隔4-8周给予一或多次加强。

在一个实施方案中，初次剂量在第0天给予，并且在大约3个月后给予加强。

10试剂盒与方法

在一个实施方案中，本发明涉及包含本发明揭示的免疫原性组合物和信息说明页的试剂盒。

在一个实施方案中，所述信息说明页提及了所述组合物激发肺炎链球菌血清型9A、9L和/或9N的功能性抗体的能力。

在一个实施方案中，所述信息说明页提及了所述组合物激发肺炎链球菌血清型9N的功能性抗体的能力。

在一个实施方案中，所述信息说明页提及了所述组合物在人群中激发≥0.35μg/mL浓度的针对肺炎链球菌血清型9A、9L和/或9N的抗荚膜抗体的能力。

在一个实施方案中，所述信息说明页提及了所述组合物在人群中激发≥0.35μg/mL浓度的针对肺炎链球菌血清型9N的抗荚膜抗体的能力。

在一个实施方案中，所述信息说明页提及了所述组合物在人群中激发针对抗肺炎链球菌血清型9A、9L和/或9N的OPA效价的能力。

在一个实施方案中，所述信息说明页提及了所述组合物在人群中激发针对抗肺炎链球菌血清型9N的OPA效价的能力。

在一个实施方案中，本发明涉及生产包含免疫原性组合物和信息说明页的试剂盒的方法，所述方法包括如下步骤：

-生产本发明揭示的免疫原性组合物，及

-在同一所述试剂盒中组合所述免疫原性组合物与信息说明页，其中所述信息说明页提及了所述组合物激发针对肺炎链球菌血清型9A、9L和/或9N的功能性抗体的能力。

在一个实施方案中，本发明涉及生产包含免疫原性组合物和信息说明页的试剂盒的方法，所述方法包括如下步骤：

-生产本发明揭示的免疫原性组合物，及

-在同一所述试剂盒中组合所述免疫原性组合物与信息说明页，其中所述信息说明页提及了所述组合物在人群中激发≥0.35μg/mL浓度的针对肺炎链球菌血清型9A、9L和/或9N的抗荚膜抗体的能力。

在一个实施方案中，本发明涉及生产包含免疫原性组合物和信息说明页的试剂盒的方法，所述方法包括如下步骤：

-生产本发明揭示的免疫原性组合物，及

-在同一所述试剂盒中组合所述免疫原性组合物与信息说明页，其中所述信息说明页提及了所述组合物在人群中激发针对肺炎链球菌血清型9A、9L和/或9N的OPA效价的能力。

在一个实施方案中，本发明涉及生产包含免疫原性组合物和信息说明页的试剂盒的方法，所述方法包括如下步骤：

-生产本发明揭示的免疫原性组合物，及

-印刷信息说明页，其中所述信息说明页提及了所述组合物激发针对肺炎链球菌血清型9A、9L和/或9N的功能性抗体的能力

-在同一所述试剂盒中组合所述免疫原性组合物与所述信息说明页。

在一个实施方案中，本发明涉及生产包含免疫原性组合物和信息说明页的试剂盒的方法，所述方法包括如下步骤：

-生产本发明揭示的免疫原性组合物，及

-印刷信息说明页，其中所述信息说明页提及了所述组合物在人群中激发≥0.35μg/mL浓度的针对肺炎链球菌血清型9A、9L和/或9N的抗荚膜抗体的能力

-在同一所述试剂盒中组合所述免疫原性组合物与所述信息说明页。

在一个实施方案中，本发明涉及生产包含免疫原性组合物和信息说明书的试剂盒的方法，所述方法包括如下步骤：

-生产本发明揭示的免疫原性组合物，及

-印刷信息说明页，其中所述信息说明页提及了所述组合物在人群中激发针对肺炎链球菌血清型9A、9L和/或9N的OPA效价的能力

-在同一所述试剂盒中组合所述免疫原性组合物与所述信息说明页。11方法

在一个实施方案中，本发明涉及一种方法，其包括如下步骤：

-为对象注射免疫学有效量的本发明定义的任何免疫原性组合物；

-从所述对象中收集血清样品；

-通过体外调理吞噬杀伤测定(OPA)检测所述血清样品的针对肺炎链球菌血清型9N的调理吞噬杀伤活性。

在一个实施方案中，本发明涉及一种方法，其包括如下步骤：

-为对象注射免疫学有效量的本发明定义的任何免疫原性组合物；

-从所述对象中收集血清样品；

-通过体外调理吞噬杀伤测定(OPA)检测所述血清样品的针对肺炎链球菌血清型9A的调理吞噬杀伤活性。

在一个实施方案中，本发明涉及一种方法，其包括如下步骤：

-为对象注射免疫学有效量的本发明定义的任何免疫原性组合物；

-从所述对象中收集血清样品；

-通过体外调理吞噬杀伤测定(OPA)检测所述血清样品的针对肺炎链球菌血清型9L的调理吞噬杀伤活性。

在一个实施方案中，本发明涉及一种方法，其包括如下步骤：

-为对象注射免疫学有效量的本发明定义的任何免疫原性组合物；

-从所述对象中收集血清样品；

-通过体外调理吞噬杀伤测定(OPA)检测所述血清样品的针对肺炎链球菌血清型9N、9A和/或9L的调理吞噬杀伤活性。

本发明的特定实施方案在如下编号的段落中陈述：

1.包含来自肺炎链球菌血清型9V的至少一种糖缀合物的免疫原性组合物，用在免疫对象针对肺炎链球菌血清型9N、9A和/或9L感染的方法中。

2.段落1的免疫原性组合物，其中所述组合物不包含来自肺炎链球菌血清型9N的荚膜糖。

3.段落1-2中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物不包含来自肺炎链球菌血清型9A的荚膜糖。

4.段落1-3中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物不包含来自肺炎链球菌血清型9L的荚膜糖。

5.段落1的免疫原性组合物，其中所述组合物不包含来自肺炎链球菌血清型9N、9A和9L的荚膜糖。

6.段落1-5中任一项的免疫原性组合物，其进一步包含来自肺炎链球菌血清型4的至少一种糖缀合物。

7.段落1-6中任一项的免疫原性组合物，其进一步包含来自肺炎链球菌血清型6B的至少一种糖缀合物。

8.段落1-7中任一项的免疫原性组合物，其进一步包含来自肺炎链球菌血清型14的至少一种糖缀合物。

9.段落1-8中任一项的免疫原性组合物，其进一步包含来自肺炎链球菌血清型18C的至少一种糖缀合物。

10.段落1-9中任一项的免疫原性组合物，其进一步包含来自肺炎链球菌血清型19F的至少一种糖缀合物。

11.段落1-10中任一项的免疫原性组合物，其进一步包含来自肺炎链球菌血清型23F的至少一种糖缀合物。

12.段落1-5中任一项的免疫原性组合物，其进一步包含来自肺炎链球菌血清型4、6B、14、18C、19F和23F的糖缀合物。

13.段落1-12中任一项的免疫原性组合物，其进一步包含来自肺炎链球菌血清型1的至少一种糖缀合物。

14.段落1-13中任一项的免疫原性组合物，其进一步包含来自肺炎链球菌血清型5的至少一种糖缀合物。

15.段落1-14中任一项的免疫原性组合物，其进一步包含来自肺炎链球菌血清型7F的至少一种糖缀合物。

16.段落1-15中任一项的免疫原性组合物，其进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、5和7F的糖缀合物。

17.段落1-16中任一项的免疫原性组合物，其进一步包含来自肺炎链球菌血清型6A的至少一种糖缀合物。

18.段落1-17中任一项的免疫原性组合物，其进一步包含来自肺炎链球菌血清型19A的至少一种糖缀合物。

19.段落1-15中任一项的免疫原性组合物，其进一步包含来自肺炎链球菌血清型6A和19A的糖缀合物。

20.段落1-19中任一项的免疫原性组合物，其进一步包含来自肺炎链球菌血清型3的至少一种糖缀合物。

21.段落1-20中任一项的免疫原性组合物，其进一步包含来自肺炎链球菌血清型15B的至少一种糖缀合物。

22.段落1-21中任一项的免疫原性组合物，其进一步包含来自肺炎链球菌血清型22F的至少一种糖缀合物。

23.段落1-22中任一项的免疫原性组合物，其进一步包含来自肺炎链球菌血清型33F的至少一种糖缀合物。

24.段落1-23中任一项的免疫原性组合物，其进一步包含来自肺炎链球菌血清型12F的至少一种糖缀合物。

25.段落1-24中任一项的免疫原性组合物，其进一步包含来自肺炎链球菌血清型10A的至少一种糖缀合物。

26.段落1-25中任一项的免疫原性组合物，其进一步包含来自肺炎链球菌血清型11A的至少一种糖缀合物。

27.段落1-26中任一项的免疫原性组合物，其进一步包含来自肺炎链球菌血清型8的至少一种糖缀合物。

28.段落1-20中任一项的免疫原性组合物，其进一步包含来自肺炎链球菌血清型22F和33F的糖缀合物。

29.段落1-20中任一项的免疫原性组合物，其进一步包含来自肺炎链球菌血清型15B、22F和33F的糖缀合物。

30.段落1-23中任一项的免疫原性组合物，其进一步包含来自肺炎链球菌血清型12F、10A、11A和8的糖缀合物。

31.段落1-30中任一项的免疫原性组合物，其进一步包含来自肺炎链球菌血清型2的至少一种糖缀合物。

32.段落1-31中任一项的免疫原性组合物，其进一步包含来自肺炎链球菌血清型17F的至少一种糖缀合物。

33.段落1-32中任一项的免疫原性组合物，其进一步包含来自肺炎链球菌血清型20的至少一种糖缀合物。

34.段落1-30中任一项的免疫原性组合物，其进一步包含来自肺炎链球菌血清型2、17F和20的糖缀合物。

35.段落1-34中任一项的免疫原性组合物，其进一步包含来自肺炎链球菌血清型15C的至少一种糖缀合物。

36.段落1-35中任一项的免疫原性组合物，其是7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24价肺炎球菌缀合物组合物。

37.段落1-35中任一项的免疫原性组合物，其是14、15、16、17、18、19或20价肺炎球菌缀合物组合物。

38.段落1-35中任一项的免疫原性组合物，其是16价肺炎球菌缀合物组合物。

39.段落1-35中任一项的免疫原性组合物，其是20价肺炎球菌缀合物组合物。

40.段落1-39中任一项的免疫原性组合物，其中所述糖缀合物单独地缀合至CRM₁₉₇。

41.段落1-39中任一项的免疫原性组合物，其中所有糖缀合物均单独地缀合至CRM₁₉₇。

42.段落1-39中任一项的免疫原性组合物，其中来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14和/或23F的所述糖缀合物单独地缀合至PD。

43.段落9-39或42中任一项的免疫原性组合物，其中来自肺炎链球菌血清型18C的糖所述缀合物单独地缀合至TT。

44.段落10-39或42-43中任一项的免疫原性组合物，其中来自肺炎链球菌血清型19F的所述糖缀合物单独地缀合至DT。

45.段落1-44中任一项的免疫原性组合物，其中所述糖缀合物是使用CDAP化学方法制备的。

46.段落1-44中任一项的免疫原性组合物，其中所述糖缀合物是通过还原胺化反应制备的。

47.段落1-44中任一项的免疫原性组合物，其中来自肺炎链球菌血清型6A的所述糖缀合物是通过还原胺化反应制备的。

48.段落1-44或47中任一项的免疫原性组合物，其中来自肺炎链球菌血清型19A的所述糖缀合物是通过还原胺化反应制备的。

49.段落1-44或47-48中任一项的免疫原性组合物，其中来自肺炎链球菌血清型3的所述糖缀合物是通过还原胺化反应制备的。

50.段落1-49中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物进一步包含来自其它病原体的抗原。

51.段落1-49中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物进一步包含选自如下的抗原：白喉类毒素(D)、破伤风类毒素(T)、百日咳抗原(P)(典型是非细胞的抗原(Pa))、乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原(HBsAg)、甲型肝炎病毒(HAV)抗原、缀合的b型流感嗜血杆菌荚膜糖(Hib)、失活的脊髓灰质炎病毒疫苗(IPV)。

52.段落1-51中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物进一步包含至少一种佐剂，最优选为本文公开的任何佐剂。

53.段落1-51中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物进一步包含至少一种佐剂，其选自由磷酸铝、硫酸铝和氢氧化铝组成的组。

54.段落1-51中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含磷酸铝形式的0.1mg/mL-1mg/mL的铝元素作为佐剂。

55.段落1-54中任一项的免疫原性组合物，通过ELISA测定确定其在人中能激发≥0.35μg/mL浓度的能结合肺炎链球菌血清型9N多糖的IgG抗体。

56.段落1-55中任一项的免疫原性组合物，通过ELISA测定确定其在人中能激发≥0.35μg/mL浓度的能结合肺炎链球菌血清型9A多糖的IgG抗体。

57.段落1-56中任一项的免疫原性组合物，通过ELISA测定确定其在人中能激发≥0.35μg/mL浓度的能结合肺炎链球菌血清型9L多糖的IgG抗体。

58.段落1-57中任一项的免疫原性组合物，通过体外调理吞噬作用测定(OPA)确定其在人中能激发能杀死肺炎链球菌血清型9N、9A和/或9L的功能性抗体。

59.段落1-58中任一项的免疫原性组合物，通过体外调理吞噬作用杀伤测定(OPA)确定其在至少50％的对象中能激发针对肺炎链球菌血清型9N的至少1:8的效价。

60.段落1-59中任一项的免疫原性组合物，通过体外调理吞噬作用杀伤测定(OPA)确定其在至少50％的对象中能激发针对肺炎链球菌血清型9A的至少1:8的效价。

61.段落1-60中任一项的免疫原性组合物，通过体外调理吞噬作用杀伤测定(OPA)确定其在至少50％的对象中能激发针对肺炎链球菌血清型9L的至少1:8的效价。

62.段落1-61中任一项的免疫原性组合物，与预先免疫的人群相比，其能显著增加针对肺炎链球菌血清型9N的应答者的比例.

63.段落1-62中任一项的免疫原性组合物，与预先免疫的人群相比，其能显著增加针对肺炎链球菌血清型9A的应答者的比例。

64.段落1-63中任一项的免疫原性组合物，与预先免疫的人群相比，其能显著增加针对肺炎链球菌血清型9L的应答者的比例。

65.段落1-64中任一项的免疫原性组合物，与预先免疫的人群相比，其能显著增加人对象针对肺炎链球菌血清型9N的OPA效价。

66.段落1-65中任一项的免疫原性组合物，与预先免疫的人群相比，其能显著增加人对象针对肺炎链球菌血清型9A的OPA效价。

67.段落1-66中任一项的免疫原性组合物，与预先免疫的人群相比，其能显著增加人对象针对肺炎链球菌血清型9L的OPA效价。

68.段落1-67中任一项的免疫原性组合物，用于免疫对象以抵抗肺炎链球菌血清型9N感染的方法中。

69.段落1-67中任一项的免疫原性组合物，用于免疫对象以抵抗肺炎链球菌血清型9A感染的方法中。

70.段落1-67中任一项的免疫原性组合物，用于免疫对象以抵抗肺炎链球菌血清型9L感染的方法中。

71.段落1-67中任一项的免疫原性组合物，用于免疫对象以抵抗肺炎链球菌血清型9N和9A感染的方法中。

72.段落1-67中任一项的免疫原性组合物，用于免疫对象以抵抗肺炎链球菌血清型9N和9L感染的方法中。

73.段落1-67中任一项的免疫原性组合物，用于免疫对象以抵抗肺炎链球菌血清型9A和9L感染的方法中。

74.段落1-67中任一项的免疫原性组合物，用于免疫对象以抵抗肺炎链球菌血清型9N、9A和9L感染的方法中。

75.段落1-67中任一项的免疫原性组合物，用于预防、治疗或减轻对象中肺炎链球菌血清型9N、9A和/或9L所致的感染、疾病或病症的方法中。

76.段落1-67中任一项的免疫原性组合物，用于预防对象中血清型9N、9A和/或9L肺炎链球菌感染。

77.段落1-67中任一项的免疫原性组合物，用于通过全身性或经粘膜途径施用所述免疫原性组合物，保护或者治疗易感于肺炎链球菌血清型9N、9A和/或9L感染的人的方法中。

78.一种预防、治疗或减轻对象中与肺炎链球菌血清型9N、9A和/或9L相关感染、疾病或病症的方法，其包括向对象施用免疫学有效量的段落1-67中任一项的免疫原性组合物。

79.一种预防对象中肺炎链球菌血清型9N、9A和/或9L感染的方法，其包括向对象施用免疫学有效量的段落1-67中任一项的免疫原性组合物。

80.段落1-67中任一项的免疫原性组合物，其中所述对象是小于1岁的人。

81.段落1-67中任一项的免疫原性组合物，其中所述对象是小于2岁的人。

82.段落1-67中任一项的免疫原性组合物，其中所述对象是50岁或更大年龄的成人。

83段落1-82中任一项的免疫原性组合物，用于多剂量接种安排中。

84.包含本发明揭示的免疫原性组合物和信息说明页的试剂盒。

85.包含段落1-67中任一项的免疫原性组合物和信息说明页的试剂盒。

86.段落85或86的试剂盒，其中所述信息说明页提及所述组合物激发针对肺炎链球菌血清型9A、9L和/或9N的功能性抗体的能力。

87.段落85或86的试剂盒，其中所述信息说明页提及所述组合物激发针对肺炎链球菌血清型9N的功能性抗体的能力。

88.段落85或86的试剂盒，其中所述信息说明页提及所述组合物在人群中激发≥0.35μg/mL浓度的针对肺炎链球菌血清型9A、9L和/或9N的抗荚膜抗体的能力。

89.段落85或86的试剂盒，其中所述信息说明页提及所述组合物在人群中激发≥0.35μg/mL浓度的针对肺炎链球菌血清型9N的抗荚膜抗体的能力。

90.段落85-89中任一项的试剂盒，其中所述信息说明页提及所述组合物在人群中激发针对肺炎链球菌血清型9A、9L和/或9N的OPA效价的能力。

91.段落85-89中任一项的试剂盒，其中所述信息说明页提及所述组合物在人群中激发针对肺炎链球菌血清型9N的OPA效价的能力。

92.一种生产包含免疫原性组合物和信息说明页的试剂盒的方法，所述方法包括如下步骤：

-生产段落1-67中任一项的免疫原性组合物，及

-在同一所述试剂盒中组合所述免疫原性组合物与所述信息说明页，其中所述信息说明页提及所述组合物激发针对肺炎链球菌血清型9A、9L和/或9N的功能性抗体的能力。

93.一种生产包含免疫原性组合物和信息说明页的试剂盒的方法，所述方法包括如下步骤：

-生产段落1-67中任一项的免疫原性组合物，及

-在同一所述试剂盒中组合所述免疫原性组合物与所述信息说明页，其中所述信息说明页提及所述组合物在人群中激发≥0.35μg/mL浓度的针对肺炎链球菌血清型9A、9L和/或9N的抗荚膜抗体的能力。

94.一种生产包含免疫原性组合物和信息说明页的试剂盒的方法，所述方法包括如下步骤：

-生产段落1-67中任一项的免疫原性组合物，及

-在同一所述试剂盒中组合所述免疫原性组合物与所述信息说明页，其中所述信息说明页提及所述组合物在人群中激发针对肺炎链球菌血清型9A、9L和/或9N的OPA效价的能力。

95.一种生产包含免疫原性组合物和信息说明页的试剂盒的方法，所述方法包括如下步骤：

-生产段落1-67中任一项的免疫原性组合物，及

-印刷信息说明页，其中所述信息说明页提及所述组合物激发针对肺炎链球菌血清型9A、9L和/或9N的功能性抗体的能力，

-在同一所述试剂盒中组合所述免疫原性组合物及所述信息说明页。

96.一种生产包含免疫原性组合物和信息说明页的试剂盒的方法，所述方法包括如下步骤：

-生产段落1-67中任一项的免疫原性组合物，及

-印刷信息说明页，其中所述信息说明页提及所述组合物在人群中激发≥0.35μg/mL浓度的针对肺炎链球菌血清型9A、9L和/或9N的抗荚膜抗体的能力，

-在同一所述试剂盒中组合所述免疫原性组合物及所述信息说明页。

97.一种生产包含免疫原性组合物和信息说明页的试剂盒的方法，所述方法包括如下步骤：

-生产段落1-67中任一项的免疫原性组合物，

-印刷信息说明页，其中所述信息说明页提及所述组合物在人群中激发针对肺炎链球菌血清型9A、9L和/或9N的OPA效价的能力，

-在同一所述试剂盒中组合所述免疫原性组合物及所述信息说明页。

98.一种方法，其包括如下步骤：

-为对象注射免疫学有效量的如段落1-67中任一项定义的免疫原性组合物，

-从所述对象中收集血清样品，

-通过体外调理吞噬杀伤作用测定(OPA)检测所述血清样品的针对肺炎链球菌血清型9N、9A和/或9L的调理吞噬杀伤活性。

99.一种在对象中诱导针对肺炎链球菌血清型9N、9A和/或9L的免疫应答的方法，其包括向所述对象施用免疫学有效量的如段落1-67中任一项的免疫原性组合物。

100.段落1-67中任一项的免疫原性组合物在生产用于免疫对象抗肺炎链球菌血清型9N、9A和/或9L感染的药物中的应用。

101.段落1-67中任一项的免疫原性组合物在生产用于预防、治疗或者减轻对象中肺炎链球菌血清型9N、9A和/或9L所致的感染、疾病或病症的药物中的应用。

102.段落1-67中任一项的免疫原性组合物在生产用于预防对象中肺炎链球菌血清型9N、9A和/或9L感染的药物中的应用。

如本文所用，术语“大约”是指在统计学平均值范围内，如指定的浓度范围、时间范围、分子量、温度或pH。这种范围可以是在给出的数值或范围的数量级内，典型在20％、更典型在10％及甚至更典型在5％或1％范围内。有时这种范围可以在用于测量和/或确定给定数值或范围的标准方法的典型实验误差内。由术语“大约”涵盖的可允许的偏差根据研究的特定系统而定，并且可以被本领域技术人员轻易理解。当在本说明书中列举范围时，在这个范围内的每个整数均预期作为本发明的实施方案。

本发明人意在术语“包含”“包括”“含有”在每种情况中可以分别任选由术语“由…组成”替换。

本专利说明书中引用的所有参考文献或专利申请均通过引用并入本文。

本发明在所附实施例中阐明。除非另外详细描述，则下文的实施例使用本领域技术人员熟知且常规的标准技术进行。所述实施例只是举例说明，不限制本发明。

实施例

实施例1：评估肺炎链球菌血清组9内的交叉反应性调理吞噬免疫应答

在存在功能性抗体和补体条件下测量由吞噬效应细胞对肺炎链球菌细胞的杀伤的肺炎球菌调理吞噬作用测定(OPA)，被认为是评估肺炎球菌疫苗效力的重要替代品(surrogate)。

材料和方法

将来自用13价肺炎球菌缀合物疫苗(13vPnC)接种的成人的两个随机选定的免疫血清子集合在OPA测定中针对血清型9V、9A、9L和9N进行检测。血清分别从美国临床试验6115A1-004(N＝59，接种后)和6115A1-3005(N＝66，匹配的接种前和接种后)中收集。

研究项目6115A1-3005(ClinicalTrials.gov Identifier:NCT00546572)是3期、随机、活性对照、修改的双盲试验，在研究登记之前至少5年接受1剂23vPS的70岁和更大年龄的能走动的老年个体中评估与23价肺炎链球菌多糖疫苗(23vPS)相比的安全性、耐受性和免疫原性(见http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00546572，2014年3月31日存取)。

研究项目6115A1-004(ClinicalTrials.gov Identifier:NCT00427895)是3期、随机、活性对照、修改的双盲试验，在60-64岁未接受过23vPS接种的成人中评估与23价肺炎链球菌多糖疫苗(23vPS)相比13价肺炎链球菌缀合物疫苗(13vPnC)的安全性、耐受性和免疫原性，以及在未接受23vPS接种的18-59岁成人中评估13vPnC的安全性、耐受性和免疫原性(见http://clinicaltrials.gov/show/NCT00427895，2014年3月31日存取)。

在这些研究中检测的13价肺炎球菌缀合物疫苗(13vPnC)含有来自肺炎球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的缀合物，其单独地缀合至白喉毒素交叉反应性物质197(CRM₁₉₇)载体蛋白。

OPA用于测量人血清中针对肺炎链球菌血清型9V、9N、9A和/或9L的功能性抗体。在测定反应中建立检测血清，所述测定反应测量荚膜多糖特异性免疫球蛋白调理吞噬细菌、触发补体沉积、从而促进吞噬细胞吞噬和杀死细菌的能力。OPA效价定义为导致与无检测血清的对照孔相比细菌计数降低50％的倒数稀释度。OPA效价是从涵盖这个50％杀伤截断值的两个稀释度内插替换的(interpolate)。

OPA方法是基于Hu等(2005)Clin Diagn Lab Immunol12:287-295所述的方法。将检测的热失活的血清系列稀释2.5倍，并与靶细菌一起加入测定平板中，摇动温育30分钟。然后在孔中加入分化的HL-60细胞(吞噬细胞)和幼兔血清(3-4周龄，Arkansas，12.5％终浓度)，效应细胞与靶的比率为大约200:1，在37℃摇动温育。为了终止反应，在所有孔中加入80μL的0.9％NaCl，混合，并将10μL等份移至含有200μL水的HTS HV过滤平板的孔中。在真空下使液体通过该平板过滤，并在每个孔中加入150μL的培养基并过滤。然后将过滤平板在37℃、5％CO₂温育过夜，然后用脱色溶液(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA)固定。将平板用考马斯蓝染色并再脱色一次。对集落进行成像并在Cellular Technology Limited(CTL)(Shaker Heights,OH)分析仪上计算。以当与不含有血清的细菌-效应细胞-补体对照孔相比导致细菌菌落数目降低50％的最低血清稀释度的倒数确定OPA抗体效价。

统计学分析：计算Pearson双尾相关性。

结果-在9V、9A、9L和9N中OPA应答

在各自微集落调理吞噬作用测定(mcOPA)中评估用针对血清型9A、9L和9N的13vPnC免疫接种的成人的免疫血清中的交叉功能性应答，以及对血清型9V的同源功能性应答。检测来自用13vPnC接种的成人的两个随机选定的免疫血清子集合。血清分别收集自美国临床试验6115A1-004(N＝59，接种后)和6115A1-3005(N＝66，匹配的接种前和接种后)。

研究项目6115A1-004中的对象先前未接受过任何肺炎球菌接种，并接受1剂13vPnC作为研究方案的一部分。来自研究项目6115A1-004的免疫血清示出对于所有血清型相似百分比的应答者，对于血清型9V、9A、9L和9N的数值分别为98.3％、98.3％、100％和93.2％(图1)，其支持来自6115A1-3005的结果(图2)。在血清型9V与9A之间观测到相对良好的OPA效价相关性(Pearson相关性ρ＝0.5456，p<0.0001)或者9L(ρ＝0.7353，p<0.0001)，但是9N没有(ρ＝0.1217，p<0.3627)。

研究项目6115A1-3005中的对象在研究登记之前至少5年前先接受过1剂23vPS，并接受1剂13vPnC作为研究方案的一部分。在OPA中评估来自用13vPnC(研究6115A1-3005)免疫的成人的匹配的接种前和接种后血清分组(N＝66)对血清型9V的同源应答以及抗9V抗体对血清型9A、9L和9N的交叉反应性。如图2所示，在OPA测定中检测到对于9A(84％)、9A(66％)、9L(82％)和9N(86％)的相对较高的免疫性(百分比应答者)，这可能是由于他们先前的23Vps免疫接种，其包括来自血清型9V和9N的未缀合的多糖。然而，在用13vPnC接种后，所有四个血清型的百分比应答者均增加至95％或更高，其仅含有来自血清组9的血清型9V缀合物。效价值的增加倍数在表1中示出，并且在血清型之间是相似的也提示交叉反应性。

表1：匹配的接种前和接受后OPA效价增加倍数，13vPnC

OPA效价分布更广泛的分析在图3-6中的反向累积分布曲线(RCDC)中示出。RCDC示出针对血清型9V、9A、9L的接种后血清型特异性免疫应答的增加，并且对于9N的程度较低。使用Pearson’s相关性检测分析9V/9A、9V/9L和9V/9N之间的各个匹配的/样品的效价增加倍数的相关性。在血清型9V和9A(Pearson相关性ρ＝0.8720，p<0.0001)或者9N(ρ＝0.5801，p<0.0001)之间观测到效价增加倍数的相对良好的相关性，但是与9L的程度较低(ρ＝0.1804，p<0.1640)。

结论

基于这些数据，13vPnC疫苗通过提供对血清型9A、9L和9N另外的保护而很可能提供更广泛的血清型覆盖。

实施例2：在肺炎链球菌血清组9内进一步评估交叉反应性调理吞噬免疫应答

在来自三期临床研究的血清中进一步评估13vPnC诱导的血清型9V特异性抗体与血清型9A、9L和9N的细菌(即在血清型9A、9L和9N的OPA中杀死细菌)的功能性交叉反应的能力。

材料和方法

在OPA测定中针对血清型9V、9A、9L和9N检测用13价肺炎球菌缀合物疫苗(13vPnC)接种的成人的随机选定的免疫血清的子集合。血清收集自日本成人临床研究B1851088(ClinicalTrials.gov Identifier:NCT01646398)的接种前和接种后血清。

研究项目B1851088是3期、随机、修改的双盲、活性对照试验，在未接受过肺炎球菌疫苗接种的日本65岁或更大年龄的老年人中评估13价肺炎球菌缀合物疫苗的安全性、耐受性和免疫原性(见https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01646398，2015年11月30日存取)。

在这些研究中检测的13价肺炎球菌缀合物疫苗(13vPnC)含有来自肺炎球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的缀合物，其单独地缀合至白喉毒素交叉反应物质197(CRM₁₉₇)载体蛋白。

OPA和统计学分析如实施例1所述进行。

结果-在血清型9V、9A、9L和9N中的OPA应答

研究项目B1851088中的对象先前未接受肺炎球菌疫苗接种，并接受1剂13vPnC或23vPS(23价肺炎球菌多糖疫苗，由来自血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F和33F的纯化的荚膜多糖的混合物组成)作为研究方案的一部分。在来自用13vPnC或23vPS免疫的日本成人的免疫血清中对于血清型9A、9L和9N的交叉功能性应答在各自的血清组9OPA中评估。

在OPA测定中针对血清型9A、9L和9N检测来自13vPnC或23vPS接种的成人的一个接种前和接种后血清的子集合。9V OPA效价得自报导的临床数据。血清选自日本临床试验B1851088 13vPnC arm(N＝91，匹配的接种前和接种后血清)和23vPS arm(N＝83，匹配的接种前和接种后血清)。血清选自根据报导的临床数据对于9V的接种前OPA效价较低或者阴性的对象。来自B1851088的所有对象均未预先暴露于23vPS疫苗。

在接种前观测到相对低基线的血清组9OPA效价。在用13vPnC或23vPS接种后，血清组9OPA应答增加至高应答者比率：13vPnC接种对象对于9V、9A、9L和9N分别为100％、98％、92％和96％，23vPS接种对象对于9V、9A、9L和9N分别为100％、88％、94％和100％(图7和图8)。

13vPnC仅含有来自血清组9的血清型9V多糖，23vPS含有来自9V和9N二者的多糖。因此，血清型9N应答在23vPS接种后是同源的，在13vPnC接种后是异源的(与血清型9V交叉反应)。

无论接受的疫苗，在接种后的血清组9OPA GMT对于所有血清组9血清型是高的(图9)。图10-15示出对于13vPnC或23vPS接种的血清组9OPA应答的反向累积分布曲线。

在来自三个肺炎球菌疫苗研究(6115A1-004、6155A1-3005(实施例1)和B1851088(实施例2))的血清样品中评估功能性交叉反应性血清组9OPA应答。令人惊奇地，13vPnC诱导的对于血清型9V的免疫应答与血清组9(9A、9L和9N)内的所有异源血清型不同程度地交叉反应。基于这些数据，13vPnC疫苗应提供除了针对血清型9V的预期保护之外的针对血清型9A、9L和9N的另外的保护。

在本说明书中提及的所有出版物和专利申请指示本发明所属领域的技术人员的水平。所有出版物和专利申请均以相同程度通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利申请是明确的并且单独地的指示通过引用并入本文。

尽管在前文为了清晰理解而通过举例说明和实施例在一定程度上详细描述了本发明，但是某些改变和修改包含在所附的权利要求书的范围内。

序列表

<110> 辉瑞公司

<120> 用于肺炎球菌疫苗中的免疫原性组合物

<130> PC72094

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> "B class" CpG oligonucleotide

<400> 1

tcgtcgtttt tcggtgcttt t 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> "B class" CpG oligonucleotide

<400> 2

tcgtcgtttt tcggtcgttt t 21

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> "B class" CpG oligonucleotide

<400> 3

tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> "B class" CpG oligonucleotide

<400> 4

tcgtcgtttc gtcgttttgt cgtt 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> "B class" CpG oligonucleotide

<400> 5

tcgtcgtttt gtcgtttttt tcga 24

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> "B class" CpG oligonucleotide

<400> 6

tcgtcgtttt tcggtgcttt t 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> "B class" CpG oligonucleotide

<400> 7

tcgtcgtttt tcggtcgttt t 21

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> "B class" CpG oligonucleotide

<400> 8

tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> "B class" CpG oligonucleotide

<400> 9

tcgtcgtttc gtcgttttgt cgtt 24

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> "B class" CpG oligonucleotide

<400> 10

tcgtcgtttt gtcgtttttt tcga 24

Claims (15)

1.一种免疫原性组合物，其包含来自肺炎链球菌(S.pneumoniae)血清型9V的至少一种糖缀合物，用于免疫对象抗肺炎链球菌血清型9N、9A和/或9L感染的方法中。

2.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述组合物不包含来自肺炎链球菌血清型9N、9A和9L的荚膜糖。

3.权利要求1-2中任一项的免疫原性组合物，其进一步包含来自肺炎链球菌血清型4、6B、14、18C、19F和23F的糖缀合物。

4.权利要求1-3中任一项的免疫原性组合物，其进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、3、5、6A、7F和19A的至少一种糖缀合物。

5.权利要求1-4中任一项的免疫原性组合物，通过ELISA测定确定，其在人中能激发至少0.35μg/ml的浓度的可以结合肺炎链球菌血清型9N多糖的IgG抗体。

6.权利要求1-5中任一项的免疫原性组合物，通过体外调理吞噬作用测定(OPA)确定，其在人中能激发可以杀死肺炎链球菌血清型9N、9A和/或9L的功能性抗体。

7.权利要求1-6中任一项的免疫原性组合物，通过体外调理吞噬杀伤测定(OPA)确定，其在至少50％的对象中能激发至少1:8的抗肺炎链球菌血清型9N的效价。

8.权利要求1-7中任一项的免疫原性组合物，用于免疫对象抗肺炎链球菌血清型9N、9A和9L感染的方法中。

9.权利要求1-7中任一项的免疫原性组合物，用于预防对象中肺炎链球菌血清型9N、9A和/或9L感染。

10.一种预防、治疗或减轻对象中肺炎链球菌血清型9N、9A和/或9L相关的感染、疾病或病症的方法，其包括向所述对象施用免疫学有效量的权利要求1-7中任一项的免疫原性组合物。

11.包含权利要求1-7中任一项的免疫原性组合物和信息说明页的试剂盒。

12.权利要求11的试剂盒，其中所述信息说明页提及所述组合物激发抗肺炎链球菌血清型9A、9L和/或9N的功能性抗体的能力。

13.一种生产包含免疫原性组合物和信息说明页的试剂盒的方法，所述方法包括如下步骤：

-生产权利要求1-7中任一项的免疫原性组合物；

-印刷信息说明页，其中所述信息说明页提及所述组合物激发抗肺炎链球菌血清型9A、9L和/或9N的功能性抗体的能力；

-将所述免疫原性组合物与所述信息说明页组合在同一所述试剂盒中。

14.一种在对象中诱导对肺炎链球菌血清型9N、9A和/或9L的免疫应答的方法，其包括向所述对象施用免疫学有效量的权利要求1-7中任一项的免疫原性组合物。

15.权利要求1-7中任一项的免疫原性组合物在生产用于预防对象中肺炎链球菌血清型9N、9A和/或9L感染的药物中的应用。