KR20020038770A

KR20020038770A - 애쥬번트로서의 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와옥톡시놀의 조합물의 용도 및 백신과 관련된 이의 용도

Info

Publication number: KR20020038770A
Application number: KR1020027003832A
Authority: KR
Inventors: 마틴 프리에드; 필리페 헤르만드; 베로니크 헨데릭스
Original assignee: 장 스테판느; 스미스클라인 비이참 바이오로지칼즈 에스.에이.
Priority date: 1999-09-24
Filing date: 2000-09-22
Publication date: 2002-05-23
Also published as: CN1391483A; HK1049106A1; WO2001021207A2; WO2001021207A3; CO5200837A1; JP2003509473A; BR0014282A; HUP0202885A2; NO20021433L; EP1221971A2; AU765824B2; CZ20021043A3; CA2383413A1; HUP0202885A3; MXPA02003067A; NO20021433D0; TR200200774T2; PL355163A1; IL148672A0; AU7907000A

Abstract

본 발명은 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제를 옥톡시놀과 함께 포함하는 신규한 애쥬번트 시스템 및 상기 애쥬번트 시스템을 항원과 함께 포함하는 백신에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 애쥬번트 및 백신을 제조하는 방법, 및 질병의 예방 또는 치료와 관련된 애쥬번트 및 백신의 용도를 제공한다.

Description

애쥬번트로서의 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 옥톡시놀의 조합물의 용도 및 백신과 관련된 이의 용도 {USE OF COMBINATION OF POLYOXYETHYLENE SORBITAN ESTER AND OCTOXYNOL AS ADJUVANT AND ITS USE IN VACCINES}

동통을 수반하는 주사의 필요성 및 이와 관련된 "주사에 대한 공포(needle fear)"로 인한 환자 순응도에 대한 부정적인 영향을 회피하는 것은 별문제로 하고라도, 점막 백신접종이 관심을 끄는데, 이는 항원을 점막 투여하면 다수의 병원체의 진입 경로인 점막 표면에서의 방어 반응을 유도시키는 데에 있어서 효율이 더 높은 것으로 동물에서 밝혀졌기 때문이다. 또한, 비내 백신접종과 같은 점막 백신접종은 코 점막에서 뿐만 아니라 생식기 점막과 같은 멀리 떨어진 점막 부위에서도점막 면역을 유도시킬 수 있는 것으로 암시되었다 (Mestecky, 1987, Journal of Clinical Immunology, 7, 265-276; McGhee and Kiyono, Infectious Agents and Disease, 1993, 2, 55-73). 관련 분야에서의 많은 연구에도 불구하고, 인간에 사용하기에 적합한 안전하고 유효한 애쥬번트가 동정되어야 한다. 본 발명은 이러한 문제점의 해법을 제공한다.

비이온성 계면활성제의 의학적 용도가 공지되었다. 예를 들어, 비강에서의 인슐린 흡수의 증강을 위해 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르, 폴리옥시에틸렌 에테르, 담즙산염 및 그 밖의 투과 증강제를 비내 투여하는 것이 공지되었다 (Hiraiet al. 1981, International Journal of Pharmaceutics, 9, 165-172; Hiralet al. 1981, International Journal of Pharmaceutics, 9, 173-184).

그 밖의 비이온성 계면활성제 포뮬레이션이 사용되어 왔다. 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 피마자유 또는 카프릴산/카프르산 글리세리드와 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노에스테르의 혼합물 및 항원을 포함하는 백신 프리퍼레이션(preparation)은 점막에 국소 투여된 후에 전신 면역 반응을 유도시킬 수 있다 (WO 94/17827). 상기 특허 출원에는 비이온성 계면활성제 TWEEN20^TM(폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노에스테르)와 Imwitor742^TM(카프릴산/카프르산 글리세리드)의 조합물, 또는 TWEEN20^TM과 폴리옥시에틸렌 피마자유의 조합물이 비내 면역화 후에 전신 면역 반응을 증강시킬 수 있는 것으로 기재되어 있다. 비내 투여된 항원에 대한 면역 반응의 증강에 대한 이러한 포뮬레이션의 효과에 관한 상세한 사항이 또한 공지되었다(Gizurarson et al. 1996. Vaccine Research, 5, 69-75; Aggerbecket al. 1997, Vaccine, 15, 307-316; Tebbeyet al., Viral Immunol1999; 12(1):41-5). WO 94/17827호에 기재된 실시예(특히, 실시예 4)에 있어서, 면역 반응을 증강시키는 데에 필요한 TWEEN20^TM의 농도는 매우 높았는데(36%), 카프릴산/카프르산 글리세리드가 존재하더라도 28%에서는 면역 반응의 증강이 일어나지 않았다.

또한, 비이온성 계면활성제는 비이온성 계면활성제 소포(NISV로 일반적으로 알려져 있음; US 5,679,355호)를 형성하도록 하는 방식으로 포뮬레이션화되었다. 이러한 비이온성 계면활성제의 포뮬레이션은 종종 콜레스테롤의 존재하에서 항원을 내부 수성상내에 또는 이중층 자체내에 포획하는 지질-이중층 소포를 형성한다.

WO 96/36352호 및 US 5,653,987호에는 주로 경구적 인슐린 전달용의 2종 이상의 흡수 증강제 및 물을 포함하는 액체 약제 제제가 기재되어 있으며, 여기서, 각각의 흡수 증강제의 양은 전체 포뮬레이션을 기준으로 하여 1 내지 10% w/w의 농도로 존재한다.

계면활성제는 전신 투여용의 오일 에멀션 애쥬번트의 포뮬레이션에 일반적으로 사용되며, 오일 소적을 안정화시키는 기능을 한다. 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르(TWEEN^TM) 및 소르비탄 지방산 에스테르(SPAN^TM)는 수중유 에밀션을 안정화시키기 위해 사용된다 (EP 0 399 843, WO 95/17210).

인플루엔자 바이러스 백신은 여태까지 트리톤(Triton) X-100 또는 트윈(Tween)과 에테르의 혼합물을 분할 인플루엔자 바이러스에 사용함으로써 제조되어 왔다. 2가지 분할물(split)의 전신 면역원성의 임상적 비교 결과, 이들은 필적하는 것으로 나타났다 (Gross et al. 1981. J. Clin Microbiol 14, 534-8). 생성된 분할 백신의 면역원성에 대한 그 밖의 계면활성제의 효과를 또한 조사하였다. 비경구 투여의 비교 실험에서, 무클리스(Mukhlis) 등은 전체(whole) 바이러스가 세정제 붕괴된 바이러스 보다 더욱 면역원성이지만, 여러가지 세정제 중에서 트리톤 X-100 및 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드(CTAB)가 세정제 엠피겐(empigen) 보다 근소하게 더 면역원성인 분할물을 제공함을 밝혀내었다 (1984 Vaccine 2, 199-203).

본 발명은 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제를 옥톡시놀과 함께 포함하는 신규한 애쥬번트 시스템에 관한 것이다. 본 발명은 이러한 신규한 애쥬번트, 이를 함유하는 백신, 및 이를 제조하는 방법 및 이를 백신으로 포뮬레이션화하는 방법을 제공한다. 질병의 예방 또는 치료와 관련된 본 발명의 애쥬번트 또는 백신의 용도가 또한 제공된다. 본 발명의 애쥬번트는 점막 애쥬번트로서 특히 유용하지만, 전신적으로도 효과적이다. 본 발명의 애쥬번트는 인플루엔자 백신과 관련하여 특히 유용하다.

도 1은 비내 전달된 비활성화된 인플루엔자 바이러스가 트윈80 및 트리톤과 함께 포뮬레이션화되는 경우에 통상적인 비경구 인플루엔자 백신 만큼 효율적으로 이미 확립된 전신성 HAI Ab 반응을 증강시킬 수 있음을 나타내준다.

본 출원인은 본원에서 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르가 옥톡시놀과 조합된 형태로 함께 백신의 효능있는 애쥬번트로서 작용한다는 의외의 발견을 제시한다. 유리하게는, 이러한 조성물은 전신적으로 투여될 수 있지만, 점막 투여되는 경우에도 전신 면역 반응을 유도하기에 충분하다. 본 발명의 백신의 점막 투여에 의해 유도된 면역 반응은 적어도 통상적인 백신의 전신 투여 후에 관찰되는 면역 반응 만큼 높거나 적어도 이에 필적할 수 있다.

본 발명은 제조가 용이한 안전하고 효능있는 애쥬번트를 제공하며, 이러한 애쥬번트는 점막 경로 또는 전신 경로를 통해 투여될 수 있다.

첫 번째 일면에서, 본 발명은 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 옥톡시놀을 포함하는 애쥬번트를 제공한다.

또 다른 일면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 애쥬번트를 항원과 함께 포함하는 백신을 제공한다.

본 발명에 따른 애쥬번트를 인플루엔자 바이러스 항원과 함께 포함하는, 점막 표면, 특히 코 점막 투여용의 백신 조성물이 특히 바람직하다. 그러나, 대안적인 투여 경로 및 그 밖의 가능한 항원이 본 발명에 따른 백신과 관련하여 사용되며, 이는 하기 기술된다.

옥톡시놀 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르는 문헌["Surfactant systems" Eds: Attwood and Florence (1983, Chapman and Hall)]에 기재되어 있다. t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올(TRITON X-100^TM)을 포함하는 옥톡시놀 시리즈는 머크 인덱스 엔트리(Merck Index Entry) 6858 (Page 1162, 12^thEdition, Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, N.J., USA; ISBN 0911910-12-3)에 또한 기재되어 있다. 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트(TWEEN80^TM)를 포함하는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르는 머크 인덱스 엔트리 7742 (Page 1308, 12^thEdition, Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, N.J., USA; ISBN 0911910-12-3)에 기재되어 있다. 상기 두 물질은 상기 문헌에 기재된 방법을 사용하여 제조하거나 시그마 인코포레이티드(Sigma, Inc.)와 같은 상업적 공급원으로부터 구입할 수 있다.

본 발명에 따른 애쥬번트에 사용되는 바람직한 옥톡시놀로는 트리톤 X-45, 트리톤 X-102, 트리톤 X-114, 트리톤 X-165, 트리톤 X-205, 트리톤 X-305, 트리톤 N-57, 트리톤 N-101 및 트리톤 N-128과 같은 트리톤 시리즈로부터의 그 밖의 비이온성 계면활성제가 있지만, t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올(트리톤 X-100)이 특히 바람직하다.

본 발명의 애쥬번트는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 옥톡시놀을 포함한다. 바람직하게는, 옥톡시놀은 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올(TRITON-X-100^TM) 이다. 바람직하게는, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트(TWEEN80^TM) 이다.

본 발명에 따른 애쥬번트는 유리하게는 담즙산염 또는 콜산 유도체를 추가로 포함할 수 있다.

따라서, 본 발명의 애쥬번트는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트(트윈 80)와 같은 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르, t-옥틸페녹시 폴리에톡시에탄올(트리톤 X-100)과 같은 옥톡시놀, 및 소듐 데옥시콜레이트 또는 타우로데옥시콜레이트와 같은 담즙산염 또는 콜산 유도체를 포함할 수 있다. 한 가지 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명은 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트(트윈 80), t-옥틸페녹시 폴리에톡시에탄올(트리톤 X-100) 및 소듐 데옥시콜레이트를 포함하는 애쥬번트 포뮬레이션을 제공한다.

바람직하게는, 애쥬번트 포뮬레이션에 존재하는 비이온성 계면활성제의 농도는 40% 미만, 더욱 바람직하게는 약 20% 이하이다. 바람직한 범위는 약 0.001% 내지 20%, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 10%, 가장 바람직하게는 약 2%(w/v) 이하이다.

개개의 비이온성 계면활성제는 최종 백신 조성물에서 다음과 같은 바람직한 농도를 지닌다: 트리톤 X-100과 같은 옥틸페녹시 폴리에톡시에탄올 또는 노닐페녹시 폴리에톡시에탄올 또는 트리톤 시리즈의 그 밖의 세정제: 0.001% 내지 20%, 바람직하게는 0.001% 내지 10%, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 1%, 가장 바람직하게는 0.005 내지 0.1%(w/v); 트윈 80과 같은 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르: 0.01 내지 1%, 가장 바람직하게는 약 0.0%(w/v).

비이온성 계면활성제의 농도의 특히 바람직한 범위는 다음과 같다:

Tween 80^TM: 0.01 내지 1%, 가장 바람직하게는 약 0.1%(v/v);

Triton X-100^TM: 0.001 내지 0.1, 가장 바람직하게는 0.005 내지 0.02%(w/v).

본 발명의 한 가지 일면은 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제를 옥톡시놀과 함께 포함하는 백신 포뮬레이션이며, 여기서, 백신에 존재하는 항원은 비이온성 계면활성제 소포내에 포획되어 있지 않다.

본 발명에 따른 백신에 사용되는 인플루엔자 바이러스 항원은 면역 반응을 일으키기에 적합한 임의의 형태의 인플루엔자 항원일 수 있으며, 전체 바이러스로부터 제조되거나 재조합 수단에 의해 제조되는, 살아있거나 비활성화된 전체 바이러스, 분할 바이러스, 또는 서브유닛 항원을 포함한다. 항원의 생성을 위한 인플루엔자 바이러스는 수정란에서 통상적인 방법으로 증식되거나 조직 배양물에서 증식될 수 있다. 인플루엔자의 조직 배양을 위한 적합한 세포 기질로는 예를 들어MDCK 세포, MDCK의 클론으로부터의 세포 또는 MDCK 유사 세포와 같은 개 신장 세포, Vero 세포를 포함하는 AGMK 세포와 같은 원숭이 신장 세포, 또는 백신용의 인플루엔자 바이러스의 생성에 적합한 그 밖의 임의의 세포 타입이 있다. 적합한 세포 기질로는 또한 MRC-5 세포와 같은 인간 세포가 있다. 적합한 세포 기질은 세포주에 한정되지 않는데; 예를 들어, 계배(chicken embryo) 섬유아세포와 같은 1차 세포가 또한 포함된다.

일련의 정제 단계를 거친 분할 바이러스를 포함하는 인플루엔자 바이러스 항원 프리퍼레이션이 바람직하다. 따라서, 항원 프리퍼레이션은 다수의 상이한 상업적으로 이용가능한 방법, 예를 들어 본원에 참조로 포함되어 있는 특허 DD 300 833호 및 DD 211 444호에 기재된 스플릿 플루 프로세스 (split flu process)에 의해 생성될 수 있다. 상업적으로 입수할 수 있는 분할 인플루엔자 백신으로는 스미스클라인 비이참에 의해 판매되는 Fluarix^TM가 있다.

따라서, 본 발명에 따른 한 가지 바람직한 백신 포뮬레이션은 알(egg) 또는 조직 배양물 유래된 인플루엔자 항원, 바람직하게는 분할 인플루엔자 항원을, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 및 옥톡시놀과 함께 포함하며, 임의로 담즙산염 또는 콜산 유도체를 추가로 포함한다. 가장 바람직하게는, 이러한 포뮬레이션은 분할 인플루엔자 바이러스 항원, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트(트윈 80), t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올(트리톤 X-100) 및 소듐 데옥시콜레이트를 포함한다.

본 발명에 따른 인플루엔자 백신은 2개 이상의 인플루엔자 균주를 포함하는다가의 인플루엔자 백신인 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 백신은 3개의 균주를 포함하는 3가 백신이다. 통상적인 인플루엔자 백신은 3개의 인플루엔자 균주, 즉, A 균주 2개 및 B 균주 1개를 포함한다. 그러나, 예를 들어 범유행성 상황에서 유용할 수 있는 1가 백신이 본 발명에서 제외되는 것은 아니다. 1가의 범유행성 독감 백신은 가장 유력하게는 하나의 A 균주로부터의 인플루엔자 항원을 함유한다.

본 발명의 백신 프리퍼레이션은 이러한 백신을 경구/협측/장/질/직장 또는 코 경로와 같은 점막 경로를 통해 투여함으로써 질병에 걸려있거나 걸리기 쉬운 포유동물을 방어하거나 치료하기 위해 사용되는 것이 바람직하다. 이러한 투여는 소적, 스프레이 또는 건조 분체 형태로 이루어질 수 있다. 분무형태화되거나 에어로졸화된 백신 포뮬레이션은 또한 본 발명의 일부를 형성한다. 경구 투여용의 위장 내성 캡슐 및 과립과 같은 장(腸)용 포뮬레이션, 직장 또는 질 투여용의 좌약은 또한 본 발명의 일부를 형성한다. 본 발명은 피부에 적용되는(경피적 전달) 항원의 면역원성을 증강시키기 위해 또한 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 애쥬번트는 예를 들어 근내 투여 또는 피하 투여에 의해 비경구적으로 전달될 수 있다. 비내 백신접종을 위해 사용되는 경우, 본 발명의 백신은 본질적으로 용혈성인 것이 바람직하다.

투여 경로에 따라, 다양한 투여 장치가 사용될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 비내 투여 경로의 경우, 상업적으로 입수가능한 Accuspray^TM(Becton Dickinson)과 같은 스프레이 장치가 사용될 수 있다.

비내용의 바람직한 스프레이 장치는 장치의 성능이 사용자에 의해 가해지는 압력과 무관한 장치이다. 이러한 장치는 압력 역치(threshold) 장치로서 알려져 있다. 액체는 역치 압력에 이르는 경우에만 노즐로부터 방출된다. 이러한 장치는 소적 크기가 규칙적인 일관된 스프레이를 수득하는 것을 더욱 용이하게 해준다. 본 발명과 관련하여 사용하기에 적합한 압력 역치 장치는 당 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 본원에 참조로 포함되어 있는 WO 91/13281, EP 311 863 B 및 EP 516 636 B 에 기재되어 있다. 이러한 장치는 파이퍼 게엠베하(Pfeiffer GmbH)로부터 상업적으로 입수할 수 있다.

바람직한 비내 장치는 1 내지 200㎛, 바람직하게는 10 내지 120㎛의 소적(액체로서 물을 사용하여 측정함)을 생성시킨다. 10㎛ 미만인 경우, 흡입의 위험이 있으므로, 소적의 약 5% 만이 10㎛ 미만인 것이 바람직하다. 120㎛ 보다 큰 소적은 더 작은 소적 만큼 잘 퍼지지 않으므로, 소적의 약 5% 만이 120㎛을 초과하는 것이 바람직하다.

2-용량(bi-dose) 전달은 본 발명에 따른 백신과 관련하여 사용되는 비내 전달 장치의 또 다른 바람직한 특징이다. 2-용량 장치는 1회 백신 용량의 2개 서브용량(subdose)을 함유하며, 1개의 서브용량이 각각의 비공에 투여된다. 일반적으로, 2개의 서브용량은 하나의 챔버내에 존재하며, 장치의 구성은 하나의 서브용량을 한번에 효율적으로 전달시켜줄 수 있다.

본 발명은 또 다른 일면에서 본 발명에 따른 백신 포뮬레이션을 함유하는 본원에 기술된 비내 투여 장치를 포함하는 키트를 제공한다. 본 발명의 이러한 일면의 한 가지 바람직한 구체예에 있어서, 비내 투여 장치는 인플루엔자 백신으로 채워진다.

특정한 백신 포뮬레이션의 경우, 그 밖의 백신 성분들이 포뮬레이션에 포함될 수 있다. 따라서, 본 발명의 애쥬번트 포뮬레이션은 담즙산 또는 이의 유도체를 특히 염 형태로 또한 포함할 수 있다. 이러한 물질로는 콜산의 유도체 및 이의 염, 특히 콜산 또는 또는 콜산 유도체의 나트륨염이 있다. 담즙산 및 이의 유도체의 예로는 콜산, 데옥시콜산, 체노데옥시콜산, 리토콜산, 우르소데옥시콜산, 하이오데옥시콜산 및 상기 언급된 담즙산의 글리코-, 타우로-, 아미도프로필-1-프로판술폰산-, 아미도프로필-2-히드록시-1-프로판술폰산 유도체, 또는 N,N-비스(3D글루코노아미도프로필)데옥시콜아미드가 있다. 한 가지 특히 바람직한 예는 최종 백신 용량에 존재할 수 있는 소듐 데옥시콜레이트(NaDOC)이다.

바람직하게는, 본 발명의 애쥬번트 포뮬레이션은 비소낭 형태의 현탁액 또는 수용액의 형태인 경우 유리하다. 이러한 포뮬레이션은 반복가능하게 제조하고 또한 멸균(450 또는 220nm 포어(pore) 막을 통한 터미널(terminal) 여과)시키기 쉽고, 애쥬번트의 복잡한 물리적 구조의 붕괴없이 스프레이 형태로 코 점막에 투여하기 쉽다.

본 발명의 또 다른 일면에 있어서, 본 발명에 따른 애쥬번트를 항원과 혼합시키는 것을 포함하여 백신을 제조하는 방법이 제공된다.

또 다른 일면에 있어서, 항원과 본 발명에 따른 애쥬번트를 혼합하고 이 혼합물을 피검자에게 투여하는 것을 포함하여, 피검자에게서 면역 반응을 유도시키거나 증강시키는 방법이 제공된다.

바람직하게는, 피검자에 대한 투여는 점막 표면, 더욱 바람직하게는 코 점막을 통해 이루어진다. 백신이 코 점막을 통해 투여되는 경우, 백신은 스프레이로서 투여되는 것이 바람직하다. 면역 반응을 유도시키거나 증강시키는 한 가지 바람직한 방법에 있어서, 전신성 반응이 백신의 코 투여에 의해 유도된다. 따라서, 본 발명에 따른 점막 백신은 바람직하게는 점막 경로를 통해 투여되는 경우 전신성 면역 반응을 일으킬 수 있다.

본 발명은 애쥬번트 포뮬레이션, 특히 환자의 점막에 적용하기 위한 애쥬번트 포뮬레이션의 제조와 관련된 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 및 옥톡시놀의 용도를 또한 제공한다. 또한, 본 발명은 백신 포뮬레이션, 특히 점막에 적용하기 위한 백신 포뮬레이션의 제조와 관련된 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르, 옥톡시놀 및 항원의 용도에 관한 것이다. 바람직하게는, 항원은 인플루엔자 바이러스 항원이다. 코 점막 투여용 보조제 및 백신이 특히 바람직하다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 백신을 투여하는 것은 인플루엔자 항원 프리퍼레이션을 포함하는 프라이밍 또는 부스팅 용량의 인플루엔자 백신과 같은 프라이밍 또는 부스팅 용량의 백신을 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 조성물은 광범위한 공급원으로부터 유래된 항원을 함유하는 백신을 포뮬레이션화시키는 데에 사용될 것으로 예견된다. 예를 들어, 항원으로는 인간, 세균 또는 바이러스 핵산, 병원체 유래된 항원 또는 항원성 프리퍼레이션, 종양 유래된 항원 또는 항원성 프리퍼레이션, GnRH 및 IgE 펩티드를 포함하는 숙주 유래된 항원, 재조합적으로 생성된 단백질 또는 펩티드, 및 키메라 융합 단백질이 있을 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 백신 포뮬레이션은 인간 병원체에 대해 면역 반응을 일으킬 수 있는 항원 또는 항원성 조성물을 함유하며, 이러한 항원 또는 항원성 조성물은 HIV-1(예를 들어, tat, nef, gp120 또는 gp160), gD 또는 이의 유도체 또는 HSV1 또는 HSV2로부터의 ICP27과 같은 즉시형 초기 단백질과 같은 인간 포진 바이러스, 사이토메갈로바이러스((특히 인간)(예를 들어, gB 또는 이의 유도체), 로타바이러스(살아있는 약독된 바이러스를 포함함), 엡스타인 바르 바이러스(예를 들어, gp350 또는 이의 유도체), 수두 대상포진 바이러스(예를 들어, gpI, II 및 IE63), 또는 B형 간염 바이러스(예를 들어, B형 간염 표면 항원 또는 이의 유도체), A형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스 및 E형 간염 바이러스와 같은 간염 바이러스로부터 유래되거나, 호흡기 합포체 바이러스(예를 들어, F 및 G 단백질 또는 이들의 유도체), 파라인플루엔자 바이러스, 홍역 바이러스, 유행성이하선염 바이러스, 인간 유두종 바이러스(예를 들어, HPV6, 11, 16, 18, ..), 플라비바이러스(예를 들어, 황열 바이러스, 뎅기 바이러스, 진드기 매개 뇌염 바이러스, 일본 뇌염 바이러스) 또는 인플루엔자 바이러스(알 또는 MDCK 세포, 또는 Vero 세포에서 증식된 전체의 살아있거나 비활성화된 바이러스, 분할 인플루엔자 바이러스 또는 전체 독감 비로솜(R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920) 또는 HA, NP, NA 또는 M 단백질과 같은 이의 정제 단백질 또는 재조합 단백질, 또는 이들의 조합물)와 같은파라믹소바이러스와 같은 그 밖의 바이러스 병원체로부터 유래되거나, 나이세리아 고노리아(Neisseria gonorrhea) 및 나이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis) (예를 들어, 캡슐형 다당류 및 이의 컨쥬게이트, 트랜스페린-결합 단백질, 락토페린 결합 단백질, PilC, 어드히신(adhesin))를 포함하는 나이세리아 종; 스트렙토코커스 피오제네스(Streptococcus pyogenes)(예를 들어, M 단백질 또는 이의 단편, C5A 프로테아제, 리포테이코산), 스트렙토코커스 아갈락티애(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans); 헤모필러스 두크레이(Haemophilus ducreyi); 브란하멜라 카타랄리스(Branhamella catarrhalis)로도 알려져있는 모락셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis) (예를 들어, 고분자량 및 저분자량 어드히신 및 인바진(invasin))를 포함하는 모락셀라 종; 보르데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis) (예를 들어, 퍼택틴, 퍼투시스 독소 또는 이들의 유도체, 사상 혈구응집소, 아데닐레이트 사이클라제, 핌브린(fimbrin)), 보르데텔라 파라퍼투시스(Bordetella parapertussis) 및 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica)를 포함하는 보르데텔라 종; 미코박테리움 투버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) (예를 들어, ESAT6, 항원 85A, 85B 또는 85C), 미코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 미코박테리움 레프래(Mycobacterium leprae), 미코박테리움 아비움(Mycobacterium avium), 미코박테리움 파라투버쿨로시스(Mycobacterium paratuberculosis), 미코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis) 를 포함하는 미코박테리움 종; 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila)를 포함하는 레지오넬라 종; 장관독성 대장균(E. coli)(예를 들어, 콜로니형성 인자, 열 불안정성 독소 또는 이의 유도체, 열안정성 독소 또는 이의 유도체), 장관출혈성 대장균, 장관병원성 대장균(예를 들어, 시가 독소 유사 독소 또는 이의 유도체)를 포함하는 대장균 종; 비브리오 콜레라(Vibrio cholera)(예를 들어, 콜레라 독소 또는 이의 유도체)를 포함하는 비브리오 종; 시겔라 소네이(Shigella sonnei), 시겔라 디센테리애(Shigella dysenteriae), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexnerii)를 포함하는 시겔라 종; 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica)(예를 들어, Yop 단백질), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 예르시니아 슈도투버쿨로시스(Yersinia pseudotuberculosis)를 포함하는 예르시니아 종; 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)(예를 들어, 독소, 어드히신 및 인바신) 및 캄필로박터 콜라이(Campylobacter coli)를 포함하는 캄필로박터 종; 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 살모넬라 파라티피(Salmonella paratyphi), 살모넬라 콜레라에수이스(Salmonella choleraesuis), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis)를 포함하는 살모넬라 종; 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)를 포함하는 리스테리아 종; 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori)(예를 들어, 우레아제, 카탈라제, 바쿠오레이팅(vacuolating) 독소)를 포함하는 헬리코박터 종; 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa)를 포함하는 슈도모나스 종; 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스태필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis)를 포함하는 스태필로코커스 종; 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium)을 포함하는 엔테로코커스 종; 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani)(예를 들어, 파상풍 독소 및 이의 유도체), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)(예를 들어, 보툴리눔 독소 및 이의 유도체), 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile)(예를 들어, 클로스트리디움 독소 A 또는 B 및 이들의 유도체)를 포함하는 클로스트리디움 종; 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis)(예를 들어, 보툴리눔 독소 및 이의 유도체)를 포함하는 바실러스 종; 코리네박테리움 디프테리애(Corynebacterium diphtheriae)(예를 들어, 디프테리아 독소 및 이의 유도체)를 포함하는 코리네박테리움 종; 보렐리아 버그도르페리(Borrelia burgdorferi)(예를 들어, OspA, OspC, DbpA, DbpB), 보렐리아 가리니(Borrelia garinii)(예를 들어, OspA, OspC, DbpA, DbpB), 보렐리아 아프젤리(Borrelia afzelii)(예를 들어, OspA, OspC, DbpA, DbpB), 보렐리아 안데르소니(Borrelia andersonii)(예를 들어, OspA, OspC, DbpA, DbpB), 보렐리아 험시(Borrelia hermsii)를 포함하는 보렐리아 종; 에를리히아 이퀴(Ehrlichia equi) 및 인간 과립구성 에를리히아의 작용제를 포함하는 에를리히아 종; 리케치아 리케치(Rickettsia rickettsii)를 포함하는 리케치아 종; 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis)(예를 들어, MOMP, 헤파린-결합 단백질), 클라미디아 뉴모니애(Chlamydia pneumoniae)(예를 들어, MOMP, 헤파린-결합 단백질), 클라미디아 시타시(Chlamydia psittaci)를 포함하는 클라미디아 종; 렙토스피라 인터로간스(Leptospira interrogans)를 포함하는 렙토스피라 종; 트레포네마팔리둠(Treponema pallidum)(예를 들어, 희소성 외막 단백질), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola), 트레포네마 하이오디센테리애(Treponema hyodysenteriae)를 포함하는 트레포네마 종과 같은 세균성 병원체로부터 유래되거나; 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum)을 포함하는 플라스모디움 종; 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondii)(예를 들어,SAG2, SAG3, Tg34)를 포함하는 톡소플라스마 종; 엔타모에바 히스톨리티카(Entamoeba histolytica)를 포함하는 엔타모에바 종; 바베시아 미크로티(Babesia microti)를 포함하는 바베시아 종; 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi)를 포함하는 트리파노소마 종; 기아르디아 람블리아(Giardia lamblia)를 포함하는 기아르디아 종; 레쉬마니아 메이저(Leshmania major)를 포함하는 레쉬마니아 종; 뉴모시스티스 카리니(Pneumocystis carinii)를 포함하는 뉴모시스티스 종; 트리코모나스 바지날리스(Trichomonas vaginalis)를 포함하는 트리코모나스 종; 스키조스토마 만소니(Schisostoma mansoni)를 포함하는 스키조스토마 종과 같은 기생체로부터 유래되거나, 칸디다 알비칸스(Candida albicans)를 포함하는 칸디다 종; 크립토코커스 네오포만스(Cryptococcus neoformans)를 포함하는 크립토코커스 종과 같은 효모로부터 유래된다.

바람직한 세균 백신은 스트렙토코커스 뉴모니애(예를 들어, 캡슐형 다당류 및 이의 컨쥬게이트, PsaA, PspA, 스트렙토리신, 콜린-결합 단백질)을 포함하는 스트렙토코커스 종으로부터 유래된 항원 및 단백질 항원 뉴몰리신(Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007; Rubins et al., Microbial Pathogenesis, 25, 337-342), 및 이들의 돌연변이체 해독된 유도체(WO 90/06951; WO 99/03884)를 포함한다. 그 밖의 바람직한 세균 백신은 헤모필러스 인플루엔자 타입 B(예를 들어, PRP 및 이의 컨쥬게이트), 난타입퍼블(non typeable) 헤모필러스 인플루엔자를 포함하는 헤모필러스 종으로부터 유래된 항원, 예를 들어 OMP26, 고분자량 어드히신, P5, P6, 단백질 D 및 지질단백질 D, 및 핌브린 및 핌브린 유래된 펩티드 (US 5,843,464) 또는 이들의 다수 복사체 변이체 또는 융합 단백질을 포함한다. 그 밖의 바람직한 세균 백신은 모락셀라 카타랄리스(이의 외막 소포 및 OMP106(WO97/41731)을 포함함) 및 나이세리아 메닌지티디스 B(이의 외막 소포를 포함함), 및 NspA(WO96/29412)를 포함한다.

B형 간염 표면 항원의 유도체는 당 분야에 널리 공지되어 있으며, 그 중에서도, 유럽 특허 출원 EP-A-414 374호; EP-A-0304 578호 및 EP 198-474호에 기재된 PreS1, PreS2 S 항원이 있다. 한 가지 바람직한 일면에 있어서, 본 발명의 백신 포뮬레이션은 특히 CHO 세포에서 발현되는 경우 HIV-1 항원인 gp120을 포함한다. 한 가지 또 다른 구체예에 있어서, 본 발명의 백신 포뮬레이션은 상기 규정된 gD2t를 포함한다.

본 발명의 한 가지 특정한 구체예에 있어서, 본 발명의 애쥬번트를 함유하는 백신은 생식기 사마귀를 초래하는 것으로 간주되는 인간 유두종 바이러스(HPV) (HPV 6 또는 HPV 11 등)로부터 유래된 항원 및 자궁경부암을 초래하는 HPV 바이러스 (HPV16, HPV18 등)으로부터 유래된 항원을 포함한다.

특히 바람직한 형태의 생식기 사마귀 예방용 또는 치료용 백신은 L1 입자 또는 캡소머, 및 HPV 6 및 HPV 11 단백질인 E6, E7, L1 및 L2로부터 선택된 1종 이상의 항원을 포함하는 융합 단백질을 포함한다.

가장 바람직한 형태의 융합 단백질은 WO 96/26277호에 기재된 L2E7, 및 GB 9717953.5호(PCT/EP98/05285)에 기재된 단백질 D(1/3)-E7 이다.

바람직한 HPV 자궁경부 감염 또는 자궁경부암 예방용 및 치료용 백신 조성물은 HPV 16 또는 18 항원을 포함할 수 있다. 이러한 항원으로는 예를 들어 L1 또는 L2 항원 단량체, 또는 바이러스 유사 입자(VLP)로써 함께 제공되는 L1 또는 L2 항원 또는 VLP 또는 캡소머 구조물내에 단독으로 제공되는 L1 단독 단백질이 있다. 이러한 항원, 바이러스 유사 입자 및 캡소머는 그 자체로 공지되어 있다 [참조: WO94/00152, WO94/20137, WO94/05792 및 WO93/02184].

추가의 초기 단백질이 단독으로 포함되거나 바람직하게는 E7, E2 또는 E5와 같은 융합 단백질로서 포함될 수 있으며; 특히 바람직한 이러한 구체예로는 L1E7 융합 단백질을 포함하는 VLP가 있다 (WO 96/11272)

특히 바람직한 HPV 16 항원은 HPV 16으로부터의 단백질 D - E6 또는 E7 융합체를 형성하도록 초기 단백질 E6 또는 E7을 단백질 D 캐리어와 융합된 형태로 포함하거나 이들의 조합물을 포함하거나; E6 또는 E7과 L2의 조합물 (WO 96/26277)을 포함한다.

대안적으로, HPV 16 또는 18 초기 단백질인 E6 및 E7은 하나의 분자, 바람직하게는 단백질 D-E6/E7 융합체로 제공될 수 있다. 이러한 백신은 임의로 HPV 18로부터의 E6, E7 또는 둘 모두를 함유할 수 있으며, 바람직하게는 단백질 D - E6 또는 단백질 D - E7 융합 단백질 또는 단백질 D E6/E7 융합 단백질의 형태로 함유할수 있다.

본 발명의 백신은 그 밖의 HPV 균주, 바람직하게는 균주 HPV 6, 11, 31, 33 또는 45로부터의 항원을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 백신은 말라리아를 일으키는 기생체로부터 유래된 항원을 포함할 수 있다. 예를 들어, 플라스모디아 팔시파룸(Plasmodia falciparum)으로부터의 바람직한 항원으로는 RTS,S 및 TRAP가 있다. RTS는 B형 간염 표면 항원의 preS2 부분의 4개 아미노산에 의해 B형 간염 바이러스의 표면(S) 항원에 연결된 플라스모디아 팔시파룸의 써컴스포로조이트(circumsporozoite; CS) 단백질의 실질적으로 모든 C-말단 부분을 포함하는 하이브리드 단백질이다. 이것의 전체 구조는 UK 특허 출원 9124390.7호를 우선권 주장하면서 WO 93/10152호로 공개된 국제 특허 출원 PCT/EP92/02591호에 기재되어 있다. 효모에서 발현되는 경우, RTS는 지질단백질 입자로서 생성되며, HBV로부터의 S 항원과 함께 코익스프레션(co-expression)되는 경우, RTS,S로서 공지된 혼합 입자를 생성시킨다. TRAP 항원은 국제 특허 출원 PCT/GB89/00895호에 기재되어 있다. 본 발명의 한 가지 바람직한 구체예는 말라리아 백신으로서 항원성 프리퍼레이션이 RTS,S 및 TRAP 항원의 조합물을 포함하는 말라리아 백신이다. 멀티스테이지(multistage) 말라리아 백신의 성분인 것으로 여겨지는 유망한 후보물질인 그 밖의 플라스모디아 항원으로는 플라스모디아 팔시파룸 MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, 시퀘스트린(Sequestrin), PfEMP1, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXP1, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs16, Pfs48/45, Pfs230 및 플라스모디움 종에 속하는 이들의 유사체가 있다.

본 발명의 포뮬레이션은 대안적으로 항종양 항원을 함유하여, 암의 면역요법적 치료에 유용할 수 있다. 예를 들어, 애쥬번트 포뮬레이션은 전립선, 유방, 결장직장, 폐, 췌장, 신장 또는 흑색종 암에 대한 항원과 같은 종양 거부 항원과 관련하여 사용된다. 전형적인 항원으로는 MAGE1 및 MAGE3 또는 흑색종의 치료를 위한 그 밖의 MAGE 항원인 PRAME, BAGE 또는 GAGE 가 있다 (Robbins and Kawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8, pps 628-636; Van den Eynde et al., International Journal of Clinical & Laboratory Research (submitted 1997); Correale et al. (1997), Journal of the National Cancer Institute 89, p293). 실제로, 이러한 항원은 흑색종, 폐 암종, 육종 및 방광 암종과 같은 광범위한 종양 타입에서 발현된다. 그 밖의 종양 특이적 항원이 본 발명의 애쥬번트와 관련하여 사용하기에 적합하며, 이러한 항원으로는 전립선 특이적 항원(PSA) 또는 Her-2/neu, KSA(GA733), MUC-1 및 암배아성 항원 (CEA)이 있지만 이들에 제한되지는 않는다. 따라서, 본 발명의 한 가지 일면에 있어서, 본 발명에 따른 애쥬번트 조성물 및 종양 거부 항원을 포함하는 백신이 제공된다.

또한, 상기 항원은 다수의 암 또는 면역학적거세(immunocastration)의 치료에 있어서는 짧은 10개 아미노산 길이 펩티드인 전장 고나도트로핀(Gonadotrophin) 호르몬 방출 호르몬(GnRH, WO 95/20600)과 같은 자기(self) 펩티드 호르몬일 수 있다.

본 발명의 조성물은 보렐리아 종으로부터 유래된 항원을 함유하는 백신을 포뮬레이션화하는 데에 사용되는 것으로 예견된다. 예를 들어, 항원으로는 핵산, 병원체 유래된 항원 또는 항원성 프리퍼레이션, 재조합적으로 생성된 단백질 또는 펩티드, 및 키메라 융합 단백질이 있을 수 있다. 특히, 항원은 OspA 이다. OspA는 Lipo-OspA로 일컬어지는 숙주 세포(E.Coli)에 의해 지질화된 형태의 완전한 성숙 단백질 또는 지질화되지 않은 유도체일 수 있다. 이러한 지질화되지 않은 유도체로는 인플루엔자 바이러스의 비구성 단백질(NS1)의 최초 81개 N-말단 아미노산 및 완전한 OspA 단백질을 지니는 지질화되지 않은 NS1-OspA 융합 단백질이 있으며, 또 다른 MDP-OspA는 3개의 추가의 N-말단 아미노산을 함유하는 OspA의 지질화되지 않은 형태이다.

본 발명의 백신은 알레르기의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 이러한 백신은 알레르겐 특이적 항원(예를 들어 Der p1) 및 알레르겐 비특이적 항원(예를 들어, 스탠워쓰 데카펩티드 (stanworth decapeptide)(EP 0 477 231 B1)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 인간 IgE로부터 유래된 펩티드)을 포함할 것이다.

각각의 백신 용량 중의 단백질의 양은 전형적인 백신에서 나타나는 현저한 유해 부작용없이 면역방어 반응을 유도시키는 양으로서 선택된다. 이러한 양은 사용되는 특정 면역원의 종류 및 이것이 제공되는 방식에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 각각의 용량은 단백질 1 내지 1000㎍, 바람직하게는 1 내지 500㎍, 바람직하게는 1 내지 100㎍, 가장 바람직하게는 1 내지 50㎍을 포함할 것이다. 특정 백신에 대한 최적량은 피검자에서의 적합한 면역 반응의 관찰을 포함하는 표준 실험에 의해 확인될 수 있다. 최초 백신접종 후, 피검자는 1회 추가면역화되거나 적당하게 간격을 두고 수 회 추가면역화될 수 있다.

본 발명의 백신은 또한 경구 경로에 의해 투여될 수 있다. 이러한 경우, 약제학적으로 허용되는 부형제는 제산성 완충제, 또는 장용 캡슐 또는 미세과립을 또한 포함할 수 있다. 본 발명의 백신은 질 경로에 의해 또한 투여될 수 있다. 이러한 경우, 약제학적으로 허용되는 부형제는 에멀션화제, CARBOPOL^?과 같은 중합체 및 질 크림 또는 질 좌제의 기타 공지된 안정제를 또한 포함할 수 있다. 본 발명의 백신은 직장 경로에 의해 또한 투여될 수 있다. 이러한 경우, 부형제는 왁스 및 직장 좌제의 제조와 관련하여 당 분야에 공지된 중합체를 또한 포함할 수 있다.

본 발명의 포뮬레이션은 예방 및 치료 목적으로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 감염성 질병 또는 암, 또는 알레르기, 또는 자기면역 질병에 걸려있거나 걸리기 쉬운 포유동물을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 또 다른 일면에 있어서, 의학에 사용되는 것으로 본원에 기술된 애쥬번트 조합물 및 백신이 제공된다. 백신 프리퍼레이션은 일반적으로 공지되어 있다 (New Trends and Developments in Vaccines, edited by Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978).

본 발명의 대안적인 관련 구체예에 있어서, 본 발명의 애쥬번트는 콜레라 독소 및 이의 B 서브유닛, 모노포스포릴 지질 A 및 이의 비독성 유도체 3-de-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A (UK patent no. GB 2,220,211), 면역학적으로 활성인 사포닌 분획 예를 들어, 남아메리카 수목인 퀼라자 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina)의 수피로부터 유래된 Quil A 및 이의 유도체(예를 들어, QS21,US Patent No. 5,057,540), 및 올리고누클레오티드 애쥬번트 시스템 CpG(WO 96/02555), 특히^5'TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT^3'(SEQ ID NO. 1)을 포함하는 그 밖의 애쥬번트와 추가로 조합될 수 있다.

본 발명을 하기 실시예에 의해 예시하지만 본 발명이 이들에 제한되는 것은 아니다. 하기 실시예에 있어서, 본 발명자들은 포름알데히드를 사용하여 비활성화시킨 알-증식된 전체 독감 바이러스, 또는 트리톤 X-100이 보충된 트윈-에테르 분할 바이러스 또는 알-증식된 NaDOC 분할 바이러스를 사용하였다. 트윈-80 및 트리톤 X-100의 농도는 실시예에 나타나 있다.

실시예 1, 혈청에서의 항체(Ab) 반응을 측정하기 위해 사용되는 방법

인플루엔자 특이적 혈청 Ig Ab의 측정을 위한 ELISA:

맥시솝 눈크 (Maxisorp Nunc) 면역플레이트를 PBS 중에 희석시킨 β-프로피오락톤(BPL) 비활성화된 인플루엔자 바이러스의 HA (공급원: SSD GmBH manufacturer, Dresden, Germany) 1㎍/㎖를 웰 당 50㎕로 사용하여 4℃에서 밤새 코팅시켰다. 플레이트상의 비어있는 부위를 포화 완충액인 1%BSA, 0.1% 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(트윈 20)을 함유하는 PBS를 사용하여 블록킹하였다 (1시간, 37℃). 그 후, 표준 곡선으로서 첨가된 기준 혈청(ELISA 유닛/㎖로서 표현되는 중간점 역가를 지니며 A열에 놓여지는 혈청)의 연속 2배 희석물(포화 완충액, 웰 당 50㎕) 및 혈청 샘플(1/100 희석율에서 출발하며 B열 내지 H열에 놓여짐)을 37℃에서 1시간 30분간 인큐베이션시켰다. 그 후, 플레이트를 세척 완충액(PBS, 0.1% 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(트윈 20))으로 3회 세척하였다. 그 후, 포화 완충액에 1/3000으로 희석시킨 바이오티닐화된 염소 항-인간 Ig(Amersham)을 37℃에서 1시간 30분간 인큐베이션시켰다 (50㎕/웰). 3회 세척하고 스트렙타비딘-양고추냉이 퍼옥시다제 컨쥬게이트(Amersham)를 첨가한 후, 플레이트를 5회 세척하고, 웰 당 50㎕의 레벨레이션(revelation) 완충액(OPDA 0.4㎎/㎖ (Sigma) 및 50mM pH 4.5 시트레이트 완충액 중의 H₂O₂0.03%)과 함께 실온에서 20분간 인큐베이션시켰다. 레벨레이션은 H₂SO₄2N을 웰 당 50㎕로 첨가함으로써 중지시켰다. 광학 밀도를 바이오라드(Biorad) 3550 면역판독기를 사용하여 492 및 630nm에서 판독하였다. 항체 역가는 소프트맥스프로(SoftMaxPro) 소프트웨어를 사용하여 4 매개변수 수학적 방법에 의해 계산하였다.

마우스에서의 독감 특이적 혈청 Ab의 적혈구응집 억제 (HAI) 활성

먼저 혈청(25㎕)을 보레이트 0.5M 완충액(pH 9) 100㎕ 및 데이드 베링(Dade Behring)에서 구입한 카올린 125㎕를 사용하여 실온(RT)에서 20분간 처리하였다. 원심분리(30분, 3000 RPM 또는 860g)한 후, 상층액 100㎕ (혈청의 1/10 희석물에상응함)을 취하고, 이를 0.5% 닭 적혈구와 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 3200 RPM(970g)에서 10분간 원심분리한 후에 상층액을 수집하였다. 혈청에 함유된 천연 적혈구응집 인자를 제거하기 위해 두 작업 모두를 수행하였다. 그 후, 처리된 혈청 25㎕를 96 웰 그레이너(Greiner) 플레이트에서 PBS 25㎕ (1/20에서 출발하는 연속 2배 희석물)에 희석시켰다. BPL 비활성화된 전체 바이러스를 4 적혈구응집 유닛의 농도(즉, 적혈구의 응집을 야기시켰던 최종 희석율 보다 4배 낮은 희석율)로 실온에서 30분간 첨가(25㎕/웰)하면서 교반시켰다. 그 후, 닭 적혈구를 실온에서 1시간 동안 첨가하였다 (25㎕/웰). 플레이트를 최종적으로 4℃에서 밤새 유지시킨 후에 판독하였다. HAI 역가는 바이러스 유도된 적혈구응집을 억제하는 최종 혈청 희석율의 역수에 상응한다.

실시예 2, 마우스에서의 비활성화된 전체 인플루엔자 바이러스의 비내 면역원성에 대한 트윈 80과 트리톤의 효과

종래에는, 대안적 인플루엔자 백신 (예를 들어, 애쥬번트 첨가된 비경구 백신, DNA 기재 백신 또는 점막 전달용 백신)의 전임상 평가가 나이브(naive) 동물에서 주로 이루어져 왔었다. 일반적으로, 이러한 실험으로부터 얻은 유망한 결과는 인간에게서 확인되지 않았다. 이는 대다수의 성인이 나이브 동물과는 달리 백신접종 전에 자연 감염을 통해 면역학적으로 "프라이밍(priming)"되어 있다는 사실 때문이었을 것이다. 따라서, 동물 모델에서 비내 인플루엔자 백신을 평가하기 위한 최상의 방법은 코 프라이밍된 동물에게서 이미 확립된 면역반응을 증강시켜줄 수 있는 이들의 능력을 시험하는 것이다. 본 발명자들은 본 실시예에서 이러한 반응에 대한 트윈-80과 트리톤 X-100의 효과를 평가하였다.

프라이밍은 피펫 (마취 상태에서)으로 각각의 비공에 PBS 10㎕에 함유된 BPL 비활성화된 A/Beijing/262/95 인플루엔자 바이러스의 HA 2.5㎍을 투여함으로써 0일째에 암컷 Balb/c 마우스(8주령)에서 수행하였다. 28일 후, 마우스(군 당 6마리)를 A:PBS; B: 트윈80(0.11%) + 트리톤 X-100(0.074%)의 어느 하나 중에 BPL 비활성화된 A/Beijing/262/95 인플루엔자 바이러스의 HA 5㎍을 함유하는 용액 20㎕ (비공 당 10㎕, 피펫에 의해 소적으로 전달됨)으로 (마취 상태에서) 비내 추가접종하거나, C: 인플루엔자 백신의 HA 1.5㎍을 근내 주사하여 추가접종하였다. 항원은 SSD GmBH 사(Dresden, Germany)로부터 입수하였다. HAI Ab 반응을 실시예 1에 기술된 바와 같이 혈청에서 측정하였다. 도 1에 도시된 바와 같이, 트윈80 및 트리톤과 함께 포뮬레이션화되는 경우, 비내 전달된 비활성화된 인플루엔자 바이러스는 통상적인 비경구 인플루엔자 백신 만큼 효율적으로 이미 확립된 전신성 HAI Ab 반응을 증강시킬 수 있었다. 그러나, 트윈80 및 트리톤 없이 비내 투여된 동일한 항원은 훨씬 덜 면역원성이었다.

실시예 3: 건강한 성인 피검자에서의 트윈80과 트리톤 X-100이 함유된 비내용 분할 인플루엔자 백신 및 허가된 통상의 비경구 백신(Fluarix ^TM )의 비교

실험에 사용된 포뮬레이션

알 유래된 분할 인플루엔자 항원의 2가지 포뮬레이션(A,B)을 평가하였다. A는 비내용 포뮬레이션이고, B는 근내 투여되는 Fluarix^TM/α-Rix^?이다. 상기 포뮬레이션은 1998/1999 시즌의 WHO 추천 균주로부터 제조된 3가지의 비활성화된 분할 비리온 항원을 함유한다.

비내 전달을 위해 사용되는 장치는 벡톤 딕킨슨(Becton Dickinson)의 Accuspray^TM비내용 주사기이다. A 포뮬레이션 100㎕를 각각의 비공에 분무하였다.

포뮬레이션의 조성.

비내용 포뮬레이션(A)는 하기 비활성화된 분할 비리온 및 포스페이트 완충 식염수 pH 7.4±0.1, 트윈 80 0.1%, 트리톤 X-100 0.015%, Na 데옥시콜레이트 0.0045% 및 35㎍/㎖ 미만의 티오머살을 함유한다:

1. A/Beijing/262/95 (H1N1)의 HA 30㎍

2. A/Sydney/5/97 (H3N2)의 HA 30㎍

3. B/Harbin/7/94의 HA 30㎍.

1개 용량의 부피는 200㎕ 이다 (각각의 비공에 대한 서브-용량 100㎕).

비교대상인 Fluarix^TM/α-Rix^?은 스미스클라인 비이참 바이오로지칼즈의 시판용의 비활성화된 3가 분할 인플루엔자 백신이다. 500㎕의 용량이 근내 투여된다.

이러한 용량은 상기 언급된 3가지 균주의 HA 15㎍, 트윈 80 1㎖ 당 500 내지 1000㎍ (0.05% 내지 0.1%), 트리톤 X-100 50 내지 170㎍/㎖ (0.005% 내지 0.017%), 소듐 데옥시콜레이트 최대 100㎍/㎖, 티오머살 100㎍/㎖ 및 포스페이트 완충 식염수 (pH 6.8 내지 7.5)를 함유한다.

면역원성 실험

제어되고 무작위화된 공개 실험을 통해 트윈 80 및 트리톤 X-100과 함께 포뮬레이션화된 비내용 분할 인플루엔자 백신과 통상적인 비경구 백신(즉, Fluarix^TM)의 면역원성을 비교 평가하였다. 20명의 건강한 성인 피검자(18세 내지 40세)에게 Fluarix^TM1회 용량을 투여하고, 10명의 피검자에게 비내용 인플루엔자 백신 1회 용량을 투여하였다. 비내용 포뮬레이션(200㎕)은 하기 비활성화된 비리온과 함께 포스페이트 완충 식염수 (pH 7.4±0.1), 트윈 80 (0.1%), 트리톤 X-100 (0.015%), 소듐 데옥시콜레이트 (0.0045%) 및 티오머살 (<35㎍/㎖)을 함유하였다: A/Beijing/262/95 (HINI)의 혈구응집소 30㎍, A/Sydney/5/97 (H3N2)의 혈구응집소 30㎍, B/Harbin/7/94의 혈구응집소 30㎍.

국소 증상 및 일반 증상 호소에 대한 추적 기간은 8일이었고, 두 백신은 모두 안전성 및 리액토제네시티(reactogenicity)와 관련하여 잘 허용되었다. 백신접종과 관련된 심각한 역효과는 보고되지 않았다.

백신의 면역원성은 혈청 적혈구응집 억제(HI) 역가를 평가하여, 혈청전환율(각각의 백신 균주에 대해, 0일째와 비교하여 21일째의 혈청 HI 역가가 4배 이상 증가한 백신접종을 받은 자의 비율로서 정의됨), 전환 인자(각각의 백신 균주에 대해, 0일째와 비교하여 21일째의 혈청 HI 기하 평균 역가(GMT)의 증가 배수로서 정의됨) 및 혈청보호율(보호를 나타내는 것으로 용인되는 백신접종(각각의 백신 균주에 대해) 후의 40 이상의 혈청 HI 역가를 나타내는 백신접종을 받은 자의 비율로서정의됨)을 측정함으로써 조사하였다. 일반적으로, 인플루엔자 백신은 국제적 규제 요건을 충족시키기 위해 각각의 균주에 대해 40% 이상의 혈청전환율, 70% 이상의 혈청보호율 및 2.5 이상의 전환 인자를 지닐 필요가 있다. 이는 18 내지 60세의 성인에 적용되며; 노인에게는 상이한 기준이 적용된다.

또한, 점막 IgA 항체 반응은 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)에 의해 평가하였다.

Fluarix^TM또는 비내용 포뮬레이션의 1회 투여 후 21일째의 HI 혈청양성(seropositivity)율, 혈청전환율 및 혈청보호율은 표 1에서 알 수 있다.

표 1:

1회 투여 후 21일째의 HI 혈청양성율, 혈청전환율 및 혈청보호율

균주	군	시기	N	혈청양성율n %	혈청보호율n %	혈청전환율n %
A/Beijing	비내용 백신 +트윈80 및 트리톤 X100	0일21일	2020	4 20.017 85.0	0 0.015 75.0	15 75.0
A/Beijing	Fluarix^TM	0일21일	1919	4 21.119 100.0	3 15.818 94.7	19 100.0
A/Sydney	비내용 백신 +트윈80 및 트리톤 X100	0일21일	2020	13 65.020 100.0	3 15.019 95.0	15 75.0
A/Sydney	Fluarix^TM	0일21일	1919	14 73.719 100.0	1 5.318 94.7	16 84.2
B/Harbin	비내용 백신 +트윈80 및 트리톤 X100	0일21일	2020	10 50.020 100.0	7 35.018 90.0	14 70.0
B/Harbin	Fluarix^TM	0일21일	1919	17 89.519 100.0	11 57.919 100.0	15 78.9

혈청양성율(n,%): 10 이상의 역가를 나타낸 피검자의 인원수 및 비율

혈청보호율(n,%): 40 이상의 역가를 나타낸 피검자의 인원수 및 비율

혈청전환율(n,%): 0일에서 21일까지 4배 이상의 역가 증가를 나타낸 피검자의 인원수 및 비율

모든 경우, 전환 인자 (백신접종 후의 혈청 HI GMT의 증가 배수)는 2.5 보다 컸고, 이는 성공적인 인플루엔자 백신의 경우 필요한 수준이었다.

21일 내지 0일 사이에 특정/전체 점막 IgA 항체 비의 2배 또는 4배 증가를 나타낸 피검자의 비율 (1회 투여)은 표 2에서 알 수 있다.

표 2:

21일 내지 0일 사이의 특정/전체 IgA 비의 2배 또는 4배 증가를 나타낸 피검자의 비율 (1회 투여)

균주	군	N	2배 증가(%)	4배 증가(%)
A/Beijing	트윈 및 트리톤Fluarix^TM	2019	55.052.6	30.026.3
A/Sydney	트윈 및 트리톤Fluarix^TM	2019	65.047.4	45.05.3
B/Harbin	트윈 및 트리톤Fluarix^TM	2019	40.026.3	30.05.3

요약

상기 표로 작성된 면역원성 결과는 비내용 포뮬레이션이 1회 투여 후 21일째에 통상적인 비경구 백신(Fluarix^TM)의 혈청양성율, 혈청전환율 및 혈청보호율과 유사한 수준을 발생시킨다는 것을 보여준다. 비내용 포뮬레이션은 통상적인 비경구 백신(Fluarix^TM) 보다 1회 투여 후에 더 우수한 점막 IgA 반응을 일으켰다.

Claims

환자의 점막 표면에 적용하기 위한 애쥬번트의 제조와 관련된 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 옥톡시놀의 조합물의 용도.
제 1항에 있어서, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르가 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트 (TWEEN80^TM)임을 특징으로 하는 용도.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 옥톡시놀이 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올(TRITON X-100^TM)임을 특징으로 하는 용도.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 담즙산염 또는 콜산 유도체를 추가로 포함함을 특징으로 하는 용도.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 점막 투여용 백신의 제조와 관련하여 항원과 함께 사용됨을 특징으로 하는 애쥬번트의 용도.
제 5항에 있어서, 항원이 인간 면역결핍 바이러스, 수두 대상포진 바이러스, 단순 포진 바이러스 타입 1, 단순 포진 바이러스 타입 2, 인간 사이토메갈로바이러스, 뎅기 바이러스, A형, B형, C형 또는 E형 간염 바이러스, 호흡기 합포체 바이러스, 인간 유두종 바이러스, 인플루엔자 바이러스, Hib, 수막염 바이러스, 살모넬라, 나이세리아, 보렐리아, 클라미디아, 보르데텔라, 스트렙토코커스, 미코플라스마, 미코박테리아, 헤모필러스, 플라스모듐 또는 톡소플라스마, 스탠워쓰 데카펩티드 (stanworth decapeptide); 또는 종양 관련된 항원(TMA), MAGE, BAGE, GAGE, MUC-1, Her-2 neu, LnRH, CEA, PSA, KSA, 또는 PRAME 를 포함하는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 용도.
제 6항에 있어서, 항원이 인플루엔자 바이러스로부터의 항원 또는 항원성 프리퍼레이션(preparation)임을 특징으로 하는 용도.
제 7항에 있어서, 항원성 프리퍼레이션이 분할 인플루엔자 바이러스 프리퍼레이션임을 특징으로 하는 용도.
제 7항 또는 제 8항에 있어서, 인플루엔자에 대한 예방용 백신의 제조와 관련됨을 특징으로 하는 용도.
제 5항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 의학에 사용되는 백신의 제조와 관련됨을 특징으로 하는 용도.
폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르(a), 옥톡시놀(b) 및 항원(c)을 혼합하고, 점막 투여용 백신 용량의 형태로 백신을 제공하는 것을 포함하여, 백신을 제조하는 방법.
제 11항에 있어서, 백신이 비내 에어로졸 또는 스프레이 장치내에 제공됨을 특징으로 하는 방법.
폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르, 옥톡시놀 및 항원을 포함하는 백신으로 충전된, 스프레이 또는 에어로졸 장치, 더욱 상세하게는 2-용량(bi-dose) 장치.
제 13항에 있어서, 항원이 인플루엔자 항원 또는 항원성 프리퍼레이션임을 특징으로 하는 스프레이 또는 에어로졸 장치.
제 14항에 있어서, 항원성 프리퍼레이션이 분할 인플루엔자 바이러스 프리퍼레이션임을 특징으로 하는 스프레이 또는 에어로졸 장치.
폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르, 옥톡시놀 및 항원을 포함하는 백신 조성물을 안전하고 유효한 양으로 포유동물의 점막에 투여하는 것을 포함하여, 병원성 감염, 암, 또는 알레르기에 걸려있거나 걸리기 쉬운 포유동물을 치료하는 방법.
제 16항에 있어서, 백신이 비내적으로 투여됨을 특징으로 하는 방법.
제 16항 또는 제 17항에 있어서, 백신이 분할 인플루엔자 바이러스 프리퍼레이션과 같은 인플루엔자 항원성 프리퍼레이션 또는 인플루엔자 항원을 포함하는 인플루엔자 바이러스 백신임을 특징으로 하는 방법.