TWI750929B

TWI750929B - 氣霧免疫用之溫敏型佐劑及其製作方法

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Publication number: TWI750929B
Application number: TW109142313A
Authority: TW
Inventors: 林建宏
Original assignee: 林建宏
Priority date: 2020-12-02
Filing date: 2020-12-02
Publication date: 2021-12-21
Also published as: TW202222341A

Abstract

本發明提供一種氣霧免疫用之溫敏型佐劑，其係用於製作家禽類疫苗，並且使疫苗能夠隨外界溫度變化而發生相轉變，該溫敏型佐劑至少包括1wt%~20wt%營養劑、0.1 wt%~3.0wt%的界面活性劑、0.5 wt%~8.0wt%的輔助劑、以及其餘為去離子水；在實際施用時，該溫敏型佐劑(Adj)與病毒抗原液(Vat)是以 1：1(v/v)～1：5(v/v)之間的摻混比例製成疫苗混合液(Adg：Vat)；該疫苗混合液的相轉變溫度為在36~40℃之間，並且從液體相轉變為膠體的時間為在90秒以內。

Description

氣霧免疫用之溫敏型佐劑及其製作方法

本發明係關於一種疫苗用佐劑及其製作方法，特別是關於一種適用於氣霧免疫並且會隨著溫度改變而發生相變化的溫敏型佐劑及其製作方法。

在用來控制包含例如禽類新城病之大流行病的各種手段當中，疫苗通常扮演著不可或缺的重要角色。尤其，在該類流行病的特定病毒株引起大量感染而於短時間內爆發重大疫情的情況下，一般是無法以控制環境衛生等之物理手段、或者使用諸如抗生素或抗病毒劑等之化學藥劑來加以對抗的，在此之際，通常只能倚賴接種疫苗抑制感染程度及範圍來進行防疫。

其次，禽類新城病是由動物副黏科病毒的新城病病毒株(NDV)所引起的急性傳染病。然而，截至目前為止尚無一種值得信賴之可靠有效的治療藥物。因而，在習用技術上，為了防止發生此類傳染病所採用的預防手段通常是一種利用對不同日齡的雞群實施計畫免疫之方法，及時接種新城疫苗，快速提高機體抗體水平。

雖然新城疫疫苗接種方法有很多，例如注射、滴鼻、點眼、飲水、或氣霧免疫等方式，但不同免疫方式的效果是不一樣的，其中又以氣霧免疫的效果比點眼、滴鼻、飲水強，所能產生的抗體水平更高，且較注射免疫產生抗體快。此外，氣霧免疫不用抓雞，操作方便，省時省力、不驚動雞群，是大型養雞場首選的免疫方式。

氣霧免疫法是利用噴霧器或霧化器使疫苗液形成特定粒徑範圍的霧化粒子，該些霧化粒子會均勻的分散在空氣之中，可以隨著動物呼吸而從鼻腔進入動物體內，或是附著於動物皮膚表面經由皮膚吸收至體內，能夠使動物群產生良好一致的免疫效果。但氣霧免疫也有其弊端，對於技術要求高，操作不到位很容易導致免疫失敗，特別是疫苗氣霧化後之霧化粒子容易受到環境溫度及濕度的影響而縮小或是蒸發，反而會引發呼吸道的不良反應。由於疫苗液主要是由抗原液與搭配抗原液使用的佐劑所組成，因此各界殷切期盼開發出一種適用於氣霧免疫法的佐劑，藉以解決習知氣霧免疫法容易受操作技術影響的問題。

有鑑於此，本發明人等經由潛心研究用於解決傳統技術問題點的各種可能方案，進而開發出一種不但能夠改善上述習用技術之問題點，而且針對現有技術的不足之溫敏型佐劑，本發明的溫敏型佐劑具有優異的包覆率及保水度，並且與病毒抗原液以特定比例混合後，能夠在接觸到動物體時快速從液體相轉變成膠體而附著於動物呼吸道或皮膚表面，可以提高病毒抗原在生物體內的含量，對免疫系統刺激的時間增加，進而可以增加動物的記憶性免疫效果。

換言之，本發明可以提供一種氣霧免疫用之溫敏型佐劑，其係用於製作家禽類疫苗，並且使疫苗能夠隨外界溫度變化而發生相轉變，該溫敏型佐劑至少包括1wt%~20wt%營養劑、0.1~3.0wt%的界面活性劑、0.5~8.0wt%的輔助劑、以及其餘為去離子水；其中該營養劑包含有殼聚糖或殼聚糖衍生物、以及乳糖；該界面活性劑為選自tween 20、tween 40、tween 60、及tween 80中之至少一種；輔助劑為選自甘油、丙二醇、乙二醇、二乙二醇單乙基醚、甘油酯、聚乙二醇脂肪酸酯中的至少一種；以及在實際施用時，該溫敏型佐劑(Adj)與病毒抗原液(Vat)是以 1：1(v/v)～1：5(v/v)之間的摻混比例製成疫苗混合液(Adg：Vat)；該疫苗混合液的相轉變溫度為在36~40℃之間，並且從液體相轉變為膠體的時間為在90秒以內。

根據本發明之一實施例，其中該溫敏型佐劑對於病毒抗原液的包覆率為在50%以上。

根據本發明之一實施例，其中該溫敏型佐劑的黏度為在5~100Pa·s之間。

根據本發明之一實施例，其中該膠體的蒸發速率為在1.5μg/cm ²·s以下。

根據本發明之一實施例，其中該膠體的表面張力為在20~150N/m之間

根據本發明之一實施例，其中該膠體的滲透壓為在280~300mOsm/kg。

根據本發明之一實施例，其中該殼聚糖衍生物為選自羧甲基殼聚糖、殼聚糖鹽酸鹽、殼聚糖乳酸鹽、殼聚糖醋酸鹽、殼聚糖硫酸脂、殼聚糖季胺鹽、殼聚寡醣、或甲殼素。

如根據本發明之一實施例，其係進一步包含pH值調整劑，以使該溫敏型佐劑的pH值為在4.0~8.0之間。

另外，本發明還可以提供一種氣霧免疫用之溫敏型佐劑的製作方法，其係包含有以下步驟：(a) 將乳糖投入去離子水中攪拌至完全溶解，再加入殼聚糖或殼聚糖衍生物並予以充分混合而獲得第一組分；(b) 將輔助劑投入去離子水中攪拌至完全溶解而獲得第二組分；(c) 將界面活性劑投入去離子水中攪拌至完全溶解而獲得第三組分；其中(d)先將該第二組分投入該第一組分中，持續攪拌30~100分鐘，然後投入該第三組分，繼續攪拌30~100分鐘後即獲得該溫敏型佐劑；其中在該第一組分中，該乳糖的重量百分濃度為在1~10wt%，該殼聚糖或殼聚糖衍生物的重量百分濃度為在2~15wt%；在該第二組分中，該輔助劑的重量百分濃度為在10wt~50wt%，且該輔助劑為選自甘油、丙二醇、乙二醇、二乙二醇單乙基醚、甘油酯、聚乙二醇脂肪酸酯中的至少一種；在該第三組分中，該界面活性劑的重量百分濃度為在5wt%~30wt%，且該界面活性劑為選自tween 20、tween 40、tween 60、及tween 80中之至少一種；以及在100重量份之該溫敏型佐劑中，該第一組分的重量份為在70重量份~85重量份之間；該第二組分的重量份為在10重量份~20重量份之間；該第三組份的重量份為在5重量份~10重量份之間。

以下，針對本發明的實施態樣列舉不同的具體實施例而更加詳盡地敘述與說明，以便使本發明的精神與內容更為完備而易於瞭解；然而，本項技藝中具有通常知識者應當明瞭本發明當然不受限於此等實例而已，亦可利用其他相同或均等的功能與步驟順序來達成本發明。

此外，藉由下述具體實施例，可進一步證明本發明可實際應用之範圍，但不意欲以任何形式限制本發明之範圍。

首先，對於本說明書中所使用的特定用語或名詞進行描述性的說明；然而，下列說明僅為例示性說明，非作為限制本發明說明書及申請專利範圍。除非本說明書另有定義以外，在本文中所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。

如本文中所使用，「疫苗」或「疫苗液」為可用於在接受者中誘發保護性免疫之組合物。因此，在受檢者已接種抗原之後，疫苗可預防、延緩或減輕曝露於相同或相關抗原之受檢者的疾病發展之嚴重程度(相對於未接種疫苗之受檢者)。藉由疫苗所提供之保護性免疫可為體液(抗體介導)免疫或細胞免疫，或兩者。例如，疫苗接種可消除或降低病原體或受感染細胞之負荷，或產生任何其他可量測之感染減輕。疫苗接種亦可降低已免疫(已接種疫苗)之受檢者的腫瘤負荷。

如本文中所使用，術語「佐劑」係指當連同抗原投與時，使受檢者對彼抗原之免疫反應增強的化合物。

在本文中，對於用以界定本發明範圍的數值與參數，本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差，因而大多是以約略的數量值來表示，然而於具體實施例中則盡可能精確呈現的相關數值。在本文中，「約」通常視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定，一般係指代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，例如，該實際數值為在一特定數值或範圍的±10%、±5%、±1%、或±0.5%以內。

首先，請參閱圖1，其為顯示本發明之溫敏型佐劑的標準製作流程圖，包含有以下步驟：

步驟T1：將乳糖投入去離子水中攪拌至完全溶解，再加入殼聚糖或殼聚糖衍生物並予以充分混合而獲得第一組分。

步驟T2：將輔助劑投入去離子水中攪拌至完全溶解而獲得第二組分。

步驟T3：將界面活性劑投入去離子水中攪拌至完全溶解而獲得第三組分。

步驟T4：先將該第二組分投入該第一組分中，持續攪拌30~100分鐘，然後投入該第三組分，繼續攪拌30~100分鐘後即獲得溫敏型佐劑。

在第一組分中的殼聚糖或殼聚糖衍生物以及乳糖是作為佐劑的營養劑成分，並且調整殼聚糖或殼聚糖衍生物與乳糖的反應比例而具備能夠隨溫度變化而發生相轉變之特性；殼聚糖或殼聚糖衍生物相對於乳糖的重量比為在10：1~1：1之間，較佳為在8：1~1：1之間，更佳為在5：1~1：1之間，最佳為在3：1~1：1之間。由於乳糖常溫下為固態，因此在步驟T1中必須要先把乳糖以去離子水溶解完成後，在與殼聚糖或殼聚糖衍生物混合。該乳糖在該第一組分中的重量百分濃度為在1~10wt%，而該殼聚糖或殼聚糖衍生物在該第一組分中的重量百分濃度為在2~15wt%。

殼聚糖的脫乙醯程度一般為50%至100%的範圍；較佳為60%至100%的範圍；更佳為70%至100%的範圍；最佳為80%至100%的範圍。另外，殼聚糖的分子量一般為在5萬~200萬的範圍；較佳為在10萬~200萬的範圍；更佳為在50萬~200萬的範圍；最佳在100萬~200萬的範圍。

另外，依據本發明之一觀點，可使用於本發明的溫敏型佐劑的所述殼聚糖衍生物並未特別加以限定；舉例來說，所述殼聚糖衍生物為選自羧甲基殼聚糖、殼聚糖鹽酸鹽、殼聚糖乳酸鹽、殼聚糖醋酸鹽、殼聚糖硫酸脂、殼聚糖季胺鹽、殼聚寡醣、或甲殼素；較佳為選自羧甲基殼聚糖、殼聚糖鹽酸鹽、殼聚糖乳酸鹽、殼聚糖醋酸鹽、殼聚糖硫酸脂、或殼聚糖季胺鹽；更佳為選自羧甲基殼聚糖、殼聚糖鹽酸鹽、或殼聚糖乳酸鹽、殼聚糖醋酸鹽；最佳為選自羧甲基殼聚糖或殼聚糖乳酸鹽。

根據本發明的技術思想，在該第二組分中，該輔助劑的重量百分濃度為在10wt~50wt%。再者，該輔助劑為選自甘油、丙二醇、乙二醇、二乙二醇單乙基醚、甘油酯、及聚乙二醇脂肪酸酯中的至少一種；較佳為選自甘油、丙二醇、乙二醇、及二乙二醇單乙基醚中的至少一種；更佳為選自甘油、丙二醇、及乙二醇中的至少一種；最佳為甘油、及丙二醇中的至少一種。

另外，在該第三組分中，該界面活性劑的重量百分濃度為在5wt%~30wt%，且該界面活性劑為選自tween 20、tween 40、tween 60、及tween 80中之至少一種。

根據本發明的技術思想，在100重量份之該溫敏型佐劑中，該第一組份一般為在70重量份~85重量份之間，較佳為在75重量份~85重量份中間，最佳為在80重量份~85重量份之間；該第二組份一般為在10重量份~20重量份之間，較佳為在10重量份~18重量份之間，最佳為在10重量份~15重量份之間；該第三組份一般為在5重量份~10重量份之間，較佳為在5重量份~8重量份之間，最佳為在5重量份~7重量份之間。

承上，經由上述步驟完成之溫敏型佐劑，其包括有1wt%~20wt%的營養劑、0.1~3.0wt%的界面活性劑、0.5~8.0wt%的輔助劑、以及其餘為去離子水。在實際施用時，該溫敏型佐劑(Adj)與病毒抗原液(Vat)是以 1：1(v/v)～1：5(v/v)之間的摻混比例製成疫苗混合液(Adg：Vat)；該疫苗混合液的相轉變溫度為在36~40℃之間，並且從液體相轉變為膠體的時間為在90秒以內。再者，該溫敏型佐劑對於病毒抗原液的包覆率為在50%以上，較佳為在60%以上，更佳為在70%以上，最佳為在80%以上。

接著，以下結合具體實施例對本發明做進一步說明。《製備例1》

首先，將10g的乳糖投入去840g的去離子水中，在室溫環境下攪拌至完全溶解，再加入30g的羧甲基殼聚糖(脫乙醯程度為80%，分子量約為80萬)，並以15rpm持續攪拌至完全混合而獲得第一組分。

接著，將20g的甘油投入100g的去離子水中攪拌至完全溶解而獲得第二組分；再將5g的tween 80投入60g的去離子水中攪拌至完全溶解而獲得第三組分。

經由上述步驟獲得880g的第一組分、120g的第二組分、以及65g的第三組分後，先將該第二組分投入該第一組分中，持續攪拌100分鐘，然後投入該第三組分，再繼續攪拌30~100分鐘並以pH值調整劑將pH值調整至4~8之間，進而獲得溫敏型佐劑S1。接著，使用黏度劑量測溫敏型佐劑S1的黏度並記錄於表1中。《製備例2》

首先，將30g的乳糖投入去840g的去離子水中，在室溫環境下攪拌至完全溶解，再加入50g的羧甲基殼聚糖(脫乙醯程度為80%，分子量約為80萬)，並以15rpm持續攪拌至完全混合而獲得第一組分。

接著，將40g的甘油投入100g的去離子水中攪拌至完全溶解而獲得第二組分；再將10g的tween 80投入60g的去離子水中攪拌至完全溶解而獲得第三組分。

經由上述步驟獲得920g的第一組分、140g的第二組分、以及70g的第三組分後，先將該第二組分投入該第一組分中，持續攪拌100分鐘，然後投入該第三組分，再繼續攪拌30~100分鐘並以pH值調整劑將pH值調整至4~8之間，進而獲得溫敏型佐劑S2。接著，使用黏度劑量測溫敏型佐劑S2的黏度並記錄於表1中。《製備例3》

首先，將50g的乳糖投入去840g的去離子水中，在室溫環境下攪拌至完全溶解，再加入70g的羧甲基殼聚糖(脫乙醯程度為80%，分子量約為80萬)，並以15rpm持續攪拌至完全混合而獲得第一組分。

接著，將50g的甘油投入100g的去離子水中攪拌至完全溶解而獲得第二組分；再將15g的tween 80投入60g的去離子水中攪拌至完全溶解而獲得第三組分。

經由上述步驟獲得960g的第一組分、150g的第二組分、以及75g的第三組分後，先將該第二組分投入該第一組分中，持續攪拌100分鐘，然後投入該第三組分，再繼續攪拌30~100分鐘並以pH值調整劑將pH值調整至4~8之間，進而獲得溫敏型佐劑S3。接著，使用黏度劑量測溫敏型佐劑S3的黏度並記錄於表1中。《製備例4》

首先，將70g的乳糖投入去840g的去離子水中，在室溫環境下攪拌至完全溶解，再加入100g的羧甲基殼聚糖(脫乙醯程度為80%，分子量約為80萬)，並以15rpm持續攪拌至完全混合而獲得第一組分。

接著，將70g的甘油投入100g的去離子水中攪拌至完全溶解而獲得第二組分；再將20g的tween 80投入60g的去離子水中攪拌至完全溶解而獲得第三組分。

經由上述步驟獲得1010g的第一組分、170g的第二組分、以及80g的第三組分後，先將該第二組分投入該第一組分中，持續攪拌100分鐘，然後投入該第三組分，再繼續攪拌30~100分鐘並以pH值調整劑將pH值調整至4~8之間，進而獲得溫敏型佐劑S4。接著，使用黏度劑量測溫敏型佐劑S4的黏度並記錄於表1中。

表1

	製備例1	製備例2	製備例3	製備例4
第一組分	殼聚糖	30	50	70	100
乳糖	10	30	50	70
水	840	840	840	840
第二組分	甘油	20	40	50	70
水	100	100	100	100
第三組分	tween 80	5	10	15	20
水	60	60	60	60
溫敏型佐劑	S1	S2	S3	S4
物性分析	黏度(Pa·s)	6	10	20	40

《相轉化時間及相轉化溫度分析》

將上述製備例1至4所得到的溫敏型佐劑S1至S4分別與磷酸鹽緩衝液(PBS)以如表2所示之體積比例混合並進行加溫，觀察不同比例的混合液由液體轉變為凝膠的過程，並將相變溫度及相轉換時間記錄於表2中。

表2

	溫敏型佐劑S1	溫敏型佐劑S2	溫敏型佐劑S3	溫敏型佐劑S4
溫敏型佐劑:PBS	轉換溫度℃	轉換時間(s)	轉換溫度℃	轉換時間(s)	轉換溫度℃	轉換時間(s)	轉換溫度℃	轉換時間(s)
15:85	42	90	45	120	44	131	44.5	141
20:80	41	83	42	116	42.5	125	44	137
25:75	37	80	40	110	39.5	120	40	132
30:70	36.5	76	37	103	37.5	116	36	127
35:65	36	72	35	99	36	110	35.5	122
40:60	30	70	33	94	34	104	35	116
45:55	27.5	68	32	91	33	100	33.5	110
50:50	25	67	29.5	87	30	95	31.5	105

由上述表2的結果可知，溫敏型佐劑S1在不同比例時的相轉換溫度為在25~42℃之間，相轉換時間在90秒以內；溫敏型佐劑S2在不同比例時的相轉換溫度為在29.5~45℃之間，相轉換時間在120秒以內；溫敏型佐劑S3在不同比例時的相轉換溫度為在30~44℃之間，相轉換時間在131秒以內；溫敏型佐劑S4在不同比例時的相轉換溫度為在31.5~44.5℃之間，相轉換時間在141秒以內。由於一般家禽的體溫大約藉在36~40℃左右，考量疫苗的保存方式及家禽的正常體溫，因此本發明之該溫敏型佐劑(Adj)與病毒抗原液(Vat)的摻混比之比例可以是在約1：5(v/v)～1：1(v/v)之範圍；在某些具體實施例中，較佳為在約1：3(v/v)～2：3(v/v)之範圍；最佳為約在3：7(v/v)，其中又以溫敏型佐劑S1的相轉換時間在90秒以內為最佳。《表面張力及蒸發速率分析》

將製備例1至4所得到的溫敏型佐劑S1至S4分別與PBS以3：7(v/v)之比例混合後得到混合液P1至P4，然後分別量測在不同溫度環境中之混合液P1至P4的滲透壓、表面張力、及蒸發速度，再將結果紀錄於表3。

滲透壓是利用微量型滲透壓分析儀進行測試，表面張力是利用表面張力計進行測試.。而蒸發速度在各個溫度環境中(相對溼度50%)，將15g之樣品放入蒸發皿(直徑：7cm)中，並將蒸發皿放入通風櫃中，經一定時間間隔測定蒸發皿中剩餘樣品的重量，進而換算出蒸發速度。

表3

	溫度
20℃	37℃	45℃
混合液P1	滲透壓(mOsm/kg)	280	285	288
表面張力(N / m)	91	83	74
蒸發速度(μg/cm ²·s)	1.15	1.05	1.01
混合液P2	滲透壓(mOsm/kg)	281	283	287
表面張力(N / m)	104	94	82
蒸發速度(μg/cm ²·s)	1.25	1.17	1.07
混合液P3	滲透壓(mOsm/kg)	291	290	288
表面張力(N / m)	79	67	54
蒸發速度(μg/cm ²·s)	1.31	1.27	1.20
混合液P4	滲透壓(mOsm/kg)	295	294	290
表面張力(N / m)	79	67	54
蒸發速度(μg/cm ²·s)	1.30	1.22	1.19

混合液P1~P4皆在37℃由液體相轉換為膠體並由上述表3的結果可知，混合液P1~P4的滲透壓皆在280~300 mOsm/kg，表面張力會隨著溫度上升而降低，蒸發速度亦隨著溫度上升而降低。《佐劑包覆率效果測試》

將80ml之溫敏型佐劑S1至S4分別放入燒杯中，並使用均質機以3000rpm之轉速進行攪拌，然後緩緩加入20ml之1mg/ml牛血清蛋白溶液(牛血清蛋白重量為20mg)，當全部加完之後再將轉速調成5000rpm持續攪拌10分鐘。

接著，將攪拌完成的混合液加熱至38℃，使其凝固成膠體，並將膠體放入10ml之PBS(pH 7.4, 10 mM, 38 ℃) 中輕微搖晃，使殘留在膠體表面沒有包覆進去的牛血清蛋白完全溶解在PBS之中，並將澄清液分離出來後置入UV分光光度計中，量測在280nm下之吸收值，並以牛血清蛋白溶液的標準檢量線換算出牛血清蛋白的濃度，因澄清液的總體積為10ml，將總體積成上濃度即為澄清液中所含的牛血清蛋白重量，而包覆率的計算公式如下：

計算而得的包覆率如表4所示。

表4

	實施例1	實施例2	實施例3	實施例4
牛血清蛋白溶液(ml)	20	20	20	20
溫敏型佐劑S1(ml)	80	0	0	0
溫敏型佐劑S2(ml)	0	80	0	0
溫敏型佐劑S3(ml)	0	0	80	0
溫敏型佐劑S4(ml)	0	0	0	80
包覆率(%)	97.5	90.7	88.1	70.5

由上述表4的結果可知，在實施例1至4中所使用的溫敏型佐劑S1、S2、及S3對於牛血清蛋白的包覆率分別為97.5%、90.7%、88.1%及70.5%。《活毒疫苗之力價驗證》

首先，將磷酸鹽緩衝液(PBS)、製備例1至4中所得之溫敏型佐劑S1至S4分別以如表5所示之比例放入2000毫升的燒杯中，並將均質機放入燒杯中，讓燒杯中的溶液覆蓋於均質機的攪拌棒達2/3(約15公分)後，轉動均質機(型號:T.T-S.M-S，廠牌:台灣大鼎機械)的高速剪切力至3000rpm，再緩緩將400毫升的VII基因型新城病活毒抗原液(10 ^6.5TCID _50/ml)加入轉動中的溶液中；最後，當抗原液都加完時可將轉速調成5000rpm，在進行最後攪拌時間五至十分鐘，製成活毒疫苗V1至V4。

接著，將上述所得到的活毒疫苗V1至V4分別通過噴霧器進行氣霧免疫，操作條件為：噴射壓力2Kg/cm ²~30Kg/cm ²；流速為0.4~3L/min、氣流溫度25~37℃、空氣相對濕度50~80％，將疫苗溶液製備成符合粒徑分布50~1000微米、霧粒濃度達10~30%及微生物學活性達到疫苗免疫要求的液相氣溶膠，在氣霧箱中以霧化方式對雞隻進行免疫，每個氣霧箱中各有10隻免疫 1日齡雞隻，並於1週、2週、3週、4週、5週及6週採血分離待測血清。

其次，進行血球凝集( hemagglutination；HA)試驗，即在 96 孔 U 型盤上的每一排加入 25μl 的 0.85%生理鹽水，再來於第1排加入 25 μl 的待測血清。

接下來利用微量吸管充分混合後，取第2排的待測血清 25μl 加入第二孔，以再取25 μl 加入第3排，如此序列稀釋至第10排，抗原呈現 2倍至 1024 倍稀釋，第11排中之25 μl混合液不使用。每排並以 3 孔相同樣本重複進行測試。

然後，以 HI 緩衝劑稀釋VII基因型新城病抗原液至每 25 μl 稀釋液中含有 8 HAU 的VII基因型新城病抗原液，並且於每一孔中加入25 μl 稀釋液並靜置15分鐘。

接著，再於每孔加入 50 μL 0.96％紅血球懸浮液，經室溫下靜置60 分鐘後判讀血球是否有凝集作用，而最高稀釋倍數仍有血球凝集作用者為病毒力價，然後將各實施例每組10隻雞隻試驗結果的病毒力價之平均值分別記錄於表5。

表5

	實施例5	實施例6	實施例7	實施例8
VII基因型新城病活毒抗原液(ml)	400	400	400	400
PBS(ml)	1000	1000	1000	1000
溫敏型佐劑S1(ml)	600	0	0	0
溫敏型佐劑S2(ml)	0	600	0	0
溫敏型佐劑S3(ml)	0	0	600	0
溫敏型佐劑S4(ml)	0	0	0	600
活毒疫苗	V1	V2	V3	V4
抗體力價	第0周	25	21	22	24
第1周	61	64	72	81
第2周	101	107	114	128
第3周	74	89	101	112

由上述表5的結果可知，實施例5~實施例8中，經施打添加有本發明的溫敏型佐劑的活毒疫苗V1~V4的雞隻，其體內的抗體力價在第1周迅速爬升至60以上，在第2周時達到最高值至100以上，到第3周時雖有下滑，但其體內的抗體力價仍可維持在70以上。

綜上所述，本發明的內容已經以如上的實施例舉例說明了，然而本發明並非僅限定於此等實施方式而已。本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可再進行各種的更動與修飾；例如，將前述實施例中所例示的各技術內容加以組合或變更而成為新的實施方式，此等實施方式也當然視為本發明所屬內容。因此，本案所欲保護的範圍也包括後述的申請專利範圍及其所界定的範圍。

T1~T4:步驟

圖1為顯示本發明之溫敏型佐劑的標準製作流程圖。

T1~T4:步驟

Claims

一種氣霧免疫用之溫敏型佐劑，其係用於製作家禽類疫苗，並且使疫苗能夠隨外界溫度變化而發生相轉變，該溫敏型佐劑至少包括1wt%~20wt%營養劑、0.1~3.0wt%的界面活性劑、0.5~8.0wt%的輔助劑、以及其餘為去離子水；其中該營養劑包含有殼聚糖或殼聚糖衍生物、以及乳糖；該界面活性劑為選自tween 20、tween 40、tween 60、及tween 80中之至少一種；輔助劑為選自甘油、丙二醇、乙二醇、二乙二醇單乙基醚、甘油酯、聚乙二醇脂肪酸酯中的至少一種；以及在實際施用時，該溫敏型佐劑(Adj)與病毒抗原液(Vat)是以 1：1(v/v)～1：5(v/v)之間的摻混比例製成疫苗混合液(Adg：Vat)；該疫苗混合液的相轉變溫度為在36~40℃之間，並且從液體相轉變為膠體的時間為在90秒以內。
如請求項1之氣霧免疫用之溫敏型佐劑，其中該溫敏型佐劑對於病毒抗原液的包覆率為在50%以上。
如請求項1之氣霧免疫用之溫敏型佐劑，其中該溫敏型佐劑的黏度為在5~100Pa·s之間。
如請求項1之氣霧免疫用之溫敏型佐劑，其中該膠體的蒸發速率為在1.5μg/cm ²·s以下。
如請求項1之氣霧免疫用之溫敏型佐劑，其中該膠體的表面張力為在20~150N/m之間。
如請求項1之氣霧免疫用之溫敏型佐劑，其中該膠體的滲透壓為在280~300mOsm/kg。
如請求項1之氣霧免疫用之溫敏型佐劑，其中該殼聚糖的脫乙醯程度為55%至80%之範圍，分子量為在50~100萬之範圍。
如請求項1之氣霧免疫用之溫敏型佐劑，其中該殼聚糖衍生物為選自羧甲基殼聚糖、殼聚糖鹽酸鹽、殼聚糖乳酸鹽、殼聚糖醋酸鹽、殼聚糖硫酸脂、殼聚糖季胺鹽、殼聚寡醣、或甲殼素。
如請求項1之氣霧免疫用之溫敏型佐劑，其係進一步包含pH值調整劑，以使該溫敏型佐劑的pH值為在4.0~8.0之間。
一種氣霧免疫用之溫敏型佐劑的製作方法，其係包含有以下步驟： (a) 將乳糖投入去離子水中攪拌至完全溶解，再加入殼聚糖或殼聚糖衍生物並予以充分混合而獲得第一組分； (b) 將輔助劑投入去離子水中攪拌至完全溶解而獲得第二組分； (c) 將界面活性劑投入去離子水中攪拌至完全溶解而獲得第三組分；其中 (d)先將該第二組分投入該第一組分中，持續攪拌30~100分鐘，然後投入該第三組分，繼續攪拌30~100分鐘後即獲得該溫敏型佐劑；其中在該第一組分中，該乳糖的重量百分濃度為在1~10wt%，該殼聚糖或殼聚糖衍生物的重量百分濃度為在2~15wt%；在該第二組分中，該輔助劑的重量百分濃度為在10wt~50wt%，且該輔助劑為選自甘油、丙二醇、乙二醇、二乙二醇單乙基醚、甘油酯、聚乙二醇脂肪酸酯中的至少一種；在該第三組分中，該界面活性劑的重量百分濃度為在5wt%~30wt%，且該界面活性劑為選自tween 20、tween 40、tween 60、及tween 80中之至少一種；以及在100重量份之該溫敏型佐劑中，該第一組分的重量份為在70重量份~85重量份之間；該第二組分的重量份為在10重量份~20重量份之間；該第三組份的重量份為在5重量份~10重量份之間。