TWI772097B - 人用溫敏型佐劑及其製作方法 - Google Patents

Abstract

本發明涉及一種溫敏型佐劑，其係用於製備注射型或噴霧型疫苗、且能夠隨外界溫度變化而發生相轉變；該溫敏型佐劑至少包括：約20wt%至約60 wt%之殼聚醣或殼聚醣衍生物；約10 wt%至約40 wt%之交聯劑；約1.0 wt%至約5.0 wt%之聚合物凝膠；約1.0 wt%至約5 wt%之增塑劑；以及其餘為稀釋劑。該溫敏型佐劑可以提高病毒抗原在生物體內，對免疫系統刺激的時間增加，進而可以增加記憶性免疫效果，並且該溫敏型佐劑的製作方式簡單、成本低廉，能夠廣泛地應用。

Description

人用溫敏型佐劑及其製作方法

本發明係關於一種疫苗用佐劑，特別是關於一種會隨著溫度改變而發生相變化的溫敏型佐劑，能夠應用於針對人體的噴霧或是注射相關劑型之疫苗。

疫苗接種被公認是用來預防病毒細菌感染動物之最有效且最具效率的作法，很多傳染病控制計劃之基礎係藉由用活的微生物或經滅活的微生物或其產物製成疫苗誘導專一性免疫。有效之疫苗接種程序容許在動物中形成針對專一抗原之免疫記憶能力，從而在日後與抗原接觸時在人體中引起快速且強烈的免疫反應。然而，至今仍有許多病毒性或細菌性疾病尚無可利用的疫苗，或還未能達到足夠的免疫作用。此外，許多疫苗因為其抗原效能太低或使用劣質佐劑、會產生嚴重副作用、穩定性低或是價格昂貴而不適用。因此，亟需研發出更有效的疫苗或相關佐劑產品。

將抗原與稱為佐劑之物質混合後，一起注射或噴霧至人體於人體內可增強免疫系統對抗原之免疫抗性，該稱為佐劑的物質係藉由直接作用於免疫系統或藉由修改抗原之藥物動力學特徵，來增強人體對野外病毒的抵禦反應且藉此增加抗原與免疫系統的相互作用時間。舉例來說，當使用滅活抗原單獨免疫時不足於產生免疫原性，特別是免疫原性低、分子量小的抗原，因此需要用不同種類的佐劑來增強抗原所誘導的免疫應答。然而，國內所使用的人用佐劑包含MF59或CpG免疫反應過大，然而完全凝膠水佐劑應激較小。

油包水(W/O)型油質疫苗是由抗原液、界面活性劑及礦物質油混合後，在高剪切力作用下製備而成。其免疫機理是在接種部位貯存一段時間，局部產生肉芽腫和炎症反應，吸引巨噬細胞、淋巴細胞等聚集以識別抗原，產生抗體。同時，緩慢擴散的油質佐劑使抗原輸送到二級淋巴器官的時間延長，不斷刺激機體的免疫系統，從而產生續期長、抗體水準高的免疫效力。雖然國內外疫苗生產廠家的生產工藝不斷改進，用油品質也不斷提高，但由於這種製劑的連續油相在注射部位有駐留的傾向，在不少的情形中，這種W/O型油質疫苗在接種部位附近產生大量肉芽腫，保護性抗體產生速度慢、易對動物屠體品質造成不良影響，並且在接種期間可能引起劇烈的疼痛。

另外，水包油(O/W)型佐劑疫苗具有注射部位顯現局部反應小且穩定性高的優勢，然而包含或者暴露在連續相中的抗原很快在注射部位分散和被體液酶分解，難以提供長期的保護性抗體，常常需要特殊的免疫刺激劑和多次加強免疫，製備成本高，不被廣泛使用。

因此，近年來市面上已出現一種緩釋疫苗，其係利用能夠隨著溫度改變而發生相變化的溫敏型原位凝膠作為疫苗的佐劑。原位凝膠在人體體外往往呈現為可供注射的流動性溶液態，抗原或佐劑均勻分佈在其中；當將疫苗注入人體內後，溶液態會受到人體溫影響而在注射部位發生相轉變成為流動性差的凝膠態或固體狀態，此時抗原分佈在半固體凝膠中形成緩慢釋放的藥物儲庫，此時抗原分佈在半固體凝膠中形成緩慢釋放的藥物儲庫，此類溫敏型佐劑具備了油包水(W/O)型油質疫苗及水包油(O/W)型佐劑疫苗的優點，除了能夠減少給藥次數、提高患者依從性、增強並延長體液免疫應答、提高細胞免疫應答強度、以及有利於免疫記憶性反應的產生以外，更不會引起嚴重的炎症反應。

有鑑於此，本發明人等經由潛心研究用於解決傳統技術問題點的各種可能方案，進而開發出一種不但能夠改善上述習用技術之問題點，而且針對現有技術的不足之溫敏型佐劑，本發明的溫敏型佐劑和聚合物凝膠是以殼聚醣為主要成分並改良習知的殼聚糖/甘油磷酸鈉鹽配方，並且在鼻腔黏膜中有良好的沾黏性，且無過敏反應，適用於人用的噴霧或注射相關的疫苗。

意即，本發明可以提供一種溫敏型佐劑一種溫敏型佐劑，其係用於製備噴霧型與注射型疫苗、且能夠隨外界溫度變化而發生相轉變，該溫敏型佐劑至少包括：約20wt%至約60wt%之殼聚醣或殼聚醣衍生物；約5.0wt%至約40wt%之交聯劑；約0.1wt%至約3.0wt%之聚合物凝膠；約0.1wt%至約3.0wt%之增塑劑；以及其餘為稀釋劑；其中該殼聚醣的脫乙醯程度為50%至100之範圍，分子量為在5萬~200萬之範圍；以及在實際施用時，該溫敏型佐劑在疫苗中體積百分比介於35%~50%之間，且該疫苗的相轉換溫度為在30~38℃之間。

根據本發明之一觀點，在本發明之溫敏型佐劑中，為了提高防止病毒的感染或增加疫苗穩定性及效能而達到防疫之效果，可以使產品達到良好之功效，在實際施用時，在實際施用時，該溫敏型佐劑在疫苗中體積百分比介於35%~50%之間，且該疫苗的相轉換溫度為在30~38℃之間。

根據本發明之觀點，該殼聚醣或殼聚醣衍生物相對於該交聯劑的重量比可以是在1：10~20：1之範圍，較佳為在1：10~15：1之範圍，最佳為在1：10~12：1之範圍。

依據本發明之一觀點，可使用於本發明之溫敏型佐劑之該緩衝劑並未特別加以限定，舉例來說，該殼聚醣的脫乙醯程度一般為50%至 100%之範圍；較佳為60%至100%之範圍；更佳為70%至100%之範圍；最佳為80%至100%之範圍。另外，該殼聚醣的分子量一般為在5萬~200萬之範圍；較佳為在10萬~200萬之範圍；更佳為在50萬~200萬之範圍；最佳在100萬~200萬之範圍。

依據本發明之一觀點，可使用於本發明之溫敏型佐劑之該殼聚醣衍生物並未特別加以限定；舉例來說，該殼聚醣衍生物為選自羧甲基殼聚醣、殼聚醣鹽酸鹽、殼聚醣乳酸鹽、殼聚醣醋酸鹽、殼聚醣硫酸脂、殼聚醣季胺鹽、殼聚寡醣、或甲殼素。

依據本發明之一觀點，可使用於本發明之溫敏型佐劑之該交聯劑並未特別加以限定；舉例來說，該交聯劑係選自纖維素、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯醯胺中的至少一種；較佳係選自聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯醯胺中的至少一種；最佳為聚丙烯酸。

依據本發明之一觀點，可使用於本發明之溫敏型佐劑之該增塑劑並未特別加以限定；舉例來說，該增塑劑可以是選自甘油、丙二醇、泊洛沙姆中的至少一種；較佳為甘油、泊洛沙姆中的至少一種；最佳為泊洛沙姆。

依據本發明之一觀點，可使用於本發明之溫敏形佐劑之聚合物凝膠為選自Carbopol 934、Carbopol 940,Carbopol 996、Carbopol 980、Carbopol Ultrez 10 Polymer、Carbopol 941、Carbopol 1342、Carbopol Ultrez 20 Polymer、Carbopol Ultrez 21 Polymer、Carbopol Ultrez 30 Polymer、Carbopol SC-200中之至少一種。

依據本發明之一觀點，可使用於本發明之溫敏型佐劑之該緩衝劑並未特別加以限定，舉例來說，該緩衝劑來源可以是自磷酸鹽緩衝劑、Tris-HCl緩衝劑、檸檬酸鈉-磷酸鹽緩衝劑、兩性離子緩衝劑、Hepes緩衝劑、馬來酸鹽緩衝劑、其衍生物、及彼等之混合物構成群組中所選出之至 少一種；適用於本發明之緩衝劑較佳使用來源為磷酸鹽緩衝劑、Tris-HCl緩衝劑、檸檬酸鈉-磷酸鹽緩衝劑、兩性離子緩衝劑、Hepes緩衝劑、或馬來酸鹽緩衝劑；更佳使用來源為磷酸鹽緩衝劑、Tris-HCl緩衝劑、檸檬酸鈉-磷酸鹽緩衝劑、或兩性離子緩衝劑；最佳使用來源為磷酸鹽緩衝劑。

依據本發明之一觀點，可使用於本發明之溫敏型佐劑之該佐劑配合使用的抗原液並未特別加以限定，舉例來說，例如可以是活毒抗原、滅活抗原、死毒抗原、次單位抗原、核酸抗原；適用於本發明之抗原液較佳使用來源為活毒抗原、或次單位抗原；更佳使用來源為次單位抗原。

另外，根據本發明之一觀點還可以提供一種溫敏型佐劑之製備方法，其係包括以下步驟：將約20wt%至約60wt%之殼聚醣或殼聚醣衍生物、及約0.1wt%重量份至約3.0wt%重量份之增塑劑，以第一操作條件予以充分混合，接著加入約5.0wt%至約40wt%之交聯劑持續攪拌12小時以上而形成組成物A；然後將0.1wt%至約3.0wt%之聚合物凝膠與稀釋劑以第二操作條件下充分混合而得到組成物B，且該組成物B的黏度為在10²mPa．s~10⁷mPa．s之間；以及將組成物B緩慢滴入組成物A之中，並在第三操作條件下充分混合而得到溫敏型佐劑。

根據本發明之一觀點，該組成物B的黏度為在10²mPa．s~10⁷mPa．s之間，若組成物B的黏度低於10²mPa．s會使得該溫敏形佐劑在相轉換形成凝膠時結構不穩定，無法有效包覆抗原液，若組成物B的黏度高於10⁷mPa．s會因黏度過高而無法在生物體內有效釋放抗原。又，該組成物B的黏度較佳為在10³mPa．s~10⁷mPa．s之間；更佳為在10⁴mPa．s~10⁷mPa．s之間；更佳為在10⁵mPa．s~10⁷mPa．s之間。

依據本發明之一觀點，其中(a)第一操作條件包括於40~80℃之溫度環境、攪拌轉速1200rpm~2400rpm、且調整pH值為5~8，進行反應1~5小時。

依據本發明之一觀點，其中(b)第二操作條件包括於在室溫環境中、攪拌轉速600rpm~1200rpm，持續攪拌2~3小時。

依據本發明之一觀點，其中(c)第三操作條件包括於40~80℃之溫度下，攪拌轉速800rpm~1200rpm，持續攪拌1~3小時。

接著，結合具體實施例對本發明做進一步說明。

圖1為顯示本發明之溫敏型佐劑S1至S3的粒徑-溫度變化圖。

圖2為顯示疫苗之效價驗證分析中第一組至第四組的IgG濃度分布圖。

圖3為顯示疫苗之效價驗證分析中第一組至第四組的IgG1濃度分布圖。

圖4為顯示疫苗之效價驗證分析中第一組至第四組的IgG2a濃度分布圖。

以下，針對本發明的實施態樣列舉不同的具體實施例而更加詳盡地敘述與說明，以便使本發明的精神與內容更為完備而易於瞭解；然而，本項技藝中具有通常知識者應當明瞭本發明當然不受限於此等實例而已，亦可利用其他相同或均等的功能與步驟順序來達成本發明。

首先，對於本說明書中所使用的特定用語或名詞進行描述性的說明；然而，下列說明僅為例示性說明，非作為限制本發明說明書及申請專利範圍。除非本說明書另有定義以外，在本文中所用的科學與技術詞 彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。

如本文中所使用，「疫苗」或「疫苗混合液」為可用於在接受者中誘發保護性免疫之組合物。因此，在受檢者已接種抗原之後，疫苗可預防、延緩或減輕曝露於相同或相關抗原之受檢者的疾病發展之嚴重程度(相對於未接種疫苗之受檢者)。藉由疫苗所提供之保護性免疫可為體液(抗體介導)免疫或細胞免疫，或兩者。例如，疫苗接種可消除或降低病原體或受感染細胞之負荷，或產生任何其他可量測之感染減輕。疫苗接種亦可降低已免疫(已接種疫苗)之受檢者的腫瘤負荷。

如本文中所使用，術語「保護性免疫」係指當受檢者已曝露於抗原，從而在受檢者中引起免疫反應(主動/後天或被動/先天，或兩者)時抵禦抗原所獲得的免疫力，從而使抗原失活及/或降低抗原負荷且形成免疫記憶(例如記憶T細胞或B細胞)。

藉由疫苗接種所提供之保護性免疫可能為部分的或僅在一部分已接種疫苗之受檢者中提供。因此，疫苗可在一部分免疫群體中誘發保護性免疫，因為有些個體可能無力建立強免疫反應或保護性免疫反應或(在有些情況下)任何免疫反應。此能力不夠可能歸因於個體的遺傳背景或歸因於免疫缺乏病狀(後天或先天性)或免疫抑制(例如，由於經化學療法治療或使用免疫抑制藥物以例如預防器官排斥反應或抑制自體免疫病狀)。向一部分免疫群體提供保護之疫苗仍然適用且視為有效。

如本文中所使用，術語「佐劑」係指當連同抗原投與時，使受檢者對彼抗原之免疫反應增強的化合物。

本文術語之「動物」意指所有非人類動物，包括哺乳動物。

在本文中，對於用以界定本發明範圍的數值與參數，本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差，因而大多是以約略的數 量值來表示，然而於具體實施例中則盡可能精確呈現的相關數值。在本文中，「約」通常視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定，一般係指代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，例如，該實際數值為在一特定數值或範圍的±10%、±5%、±1%、或±0.5%以內。

《製備例1》

首先，將20.0Kg的殼聚醣(脫乙醯程度為80%，分子量在80萬)、及2.0Kg的甘油一起加入調配瓶中，利用攪拌機(型號：UHM-10，廠牌：NIHONSEIKI日本)在無菌環境中以溫度45℃、攪拌轉速1200rpm、pH值為6.0的條件下，進行反應2小時；確認混合均勻後再緩慢加入30.0Kg的聚丙烯酸並持續攪拌8小時，進而得到組成物A1。

接著，如表1所示，將0.5Kg的聚合物凝膠、2.0Kg的泊洛沙姆)一起加入45.5Kg的磷酸鹽緩衝液中，在無菌環境中於室溫下以攪拌轉速800rpm均勻攪拌2小時而得到組成物B1，且該組成物B1的黏度為6.8×10⁶mPa．s。

然後，將組成物B1以滴管慢慢滴入組成物A1中，並繼續利用超高速均質機以800rpm、60℃之條件均質攪拌1小時，再經由冷凝降溫而得到本發明的溫敏型佐劑S1。接著，使用動態光散射儀檢測在25℃、37℃、50℃、及60℃時溫敏型佐劑S1的粒徑分布，計算出平均粒徑並記錄於表1中。

《製備例2》

首先，將40.0Kg的殼聚醣(脫乙醯程度為80%，分子量在80萬)、及3.0Kg的甘油一起加入調配瓶中，利用攪拌機(型號：UHM-10，廠牌：NIHONSEIKI日本)在無菌環境中以溫度45℃、攪拌轉速1200rpm、pH值 為6.0的條件下，進行反應2小時；確認混合均勻後再緩慢加入15.0Kg的聚丙烯酸並持續攪拌8小時，進而得到組成物A2。

接著，如表1所示，將1.0Kg的聚合物凝膠、1.0Kg的泊洛沙姆一起加入34.0Kg的磷酸鹽緩衝液中，在無菌環境中於室溫下以攪拌轉速800rpm均勻攪拌2小時而得到組成物B2，且該組成物B2的黏度為7.1×10⁶mPa．s。

然後，將組成物B2以滴管慢慢滴入組成物A2中，並繼續利用超高速均質機以800rpm、60℃之條件均質攪拌1小時，再經由冷凝降溫而得到本發明的溫敏型佐劑S2。接著，使用動態光散射儀檢測在25℃、37℃、50℃、及60℃時溫敏型佐劑S2的粒徑分布，計算出平均粒徑並記錄於表1中。

《製備例3》

首先，將60.0Kg的殼聚醣(脫乙醯程度為80%，分子量在80萬)、及5.0Kg的甘油一起加入調配瓶中，利用攪拌機(型號：UHM-10，廠牌：NIHONSEIKI日本)在無菌環境中以溫度45℃、攪拌轉速1200rpm、pH值為6.0的條件下，進行反應2小時；確認混合均勻後再緩慢加入5.0Kg的聚丙烯酸並持續攪拌8小時，進而得到組成物A3。

接著，如表1所示，將2.0Kg的聚合物凝膠、0.5Kg的泊洛沙姆)一起加入32Kg的磷酸鹽緩衝液中，在無菌環境中於室溫下以攪拌轉速800rpm均勻攪拌2小時而得到組成物B3，且該組成物B3的黏度為7.9×10⁶mPa．s。

然後，將組成物B3以滴管慢慢滴入組成物A3中，並繼續利用超高速均質機以800rpm、60℃之條件均質攪拌1小時，再經由冷凝降溫而得到本發明的溫敏型佐劑S3。接著，使用動態光散射儀檢測在25℃、 37℃、50℃、及60℃時溫敏型佐劑S3的粒徑分布，計算出平均粒徑並記錄於表1中。

圖1為溫敏型佐劑S1、S2及S3的平均粒徑隨溫度變化的趨勢圖。由圖1可知，當溫度升高時，溫敏型佐劑S1、S2及S3的粒徑大小也會隨之增加，表示本發明之溫敏型佐劑S1、S2及S3的型態會隨著溫度變化而改變。

《兩相平衡系統試驗》

將上述製備例1至3所得到的溫敏型佐劑S1至S3分別與磷酸鹽緩衝液(PBS)以如表2所示之體積比例混合並進行加溫，觀察不同比例的混合液由液體轉變為凝膠的過程，並將相變溫度記錄於表2中。

接著由表2及圖2的結果可知，當溫敏型佐劑在S1至S3在混合液的體積比為15%時，其由液體轉變為膠體的相變溫度為分別在45℃、46.5℃、47℃；當溫敏型佐劑在S1至S3在混合液的體積比為20%時，其由液體轉變為膠體的相變溫度為分別在44.5℃、45℃、45.5℃；當溫敏型佐劑在S1至S3在混合液的體積比為25%時，其由液體轉變為膠體的相變溫度為分別在43℃、42.5℃、45℃；當溫敏型佐劑在S1至S3在混合液的體積比為30%時，其由液體轉變為膠體的相變溫度為分別在42℃、42℃、44℃；當溫敏型佐劑在S1至S3在混合液的體積比為35%時，其由液體轉變為膠體的相變溫度為分別在39.5℃、40℃、41℃；當溫敏型佐劑在S1至S3在混合液的體積比為40%時，其由液體轉變為膠體的相變溫度 為分別在37℃、36.5℃、37.5℃；當溫敏型佐劑在S1至S3在混合液的體積比為45%時，其由液體轉變為膠體的相變溫度為分別在34℃、34.5℃、35℃；當溫敏型佐劑在S1至S3在混合液的體積比為50%時，其由液體轉變為膠體的相變溫度為分別在30℃、29℃、33℃。

由於一般人體的正常體溫是介於攝氏35.7.度至37.5度之間，考量疫苗的保存方式及人體的正常體溫，因此本發明之該溫敏型佐劑(Adj)在疫苗中的體積百分比一般是介於35%~50%之間，較佳為介於40%~50%之間，更佳為介於40%~45%之間。

《佐劑包覆率效果測試》

將20ml之溫敏型佐劑S1至S3分別放入燒杯中，並使用均質機以3000rpm之轉速進行攪拌，然後緩緩加入30ml之100ug/mL牛血清蛋白溶液，當全部加完之後再將轉速調成5000rpm持續攪拌10分鐘。

接著，將攪拌完成的混合液加熱至38℃，使其凝固成膠體，並將膠體放入10ml之PBS(pH 7.4,10mM,38℃)中輕微搖晃，使殘留在膠體表面沒有包覆進去的牛血清蛋白完全溶解在PBS之中，並將澄清液分離出來後置入UV分光光度計中，量測在280nm下之吸收值，並以牛血清蛋白溶液的標準檢量線換算出牛血清蛋白的濃度，因澄清液的總體積為10ml，將總體積成上濃度即為澄清液中所含的牛血清蛋白重量，而包覆率的計算公式如下：

計算而得的包覆率如表4所示。

由上述表3之結果可知，在實施例4至6中所使用的溫敏型佐劑S1、S2、及S3對於牛血清蛋白的包覆率分別為99.7%、98.5%、及98.1%，皆在98.1以上，顯示本發明之溫敏型佐劑具有良好的包覆率，能將有效將抗原包覆其中，減少原料損耗。

《疫苗之效價驗證》

首先，將磷酸鹽緩衝液(PBS)、製備例2中所得之溫敏型佐劑S2以如表4所示之比例進行混合，並以均質機攪拌，再緩緩將如表4所示之比例的肺炎抗原蛋白加入轉動中的溶液中；最後，當抗原液都加完時可將轉速調成5000rpm，再進行最後攪拌時間五至十分鐘，製成疫苗V1至V4。

接著，將上述所得到的疫苗V1至V4分別施打於五周齡大的Balb/c母鼠，每一實施例施打6隻，每隻小鼠施打的疫苗劑量為50uL。第一組、第二組、及第四組是以肌肉注射的方是施打，將小鼠麻痺後，在大腿肌肉上進行注射；而第三組則是以噴霧的方式施打，將疫苗放入噴瓶中並噴於小鼠的鼻腔及咽喉處。

在施打前須由臉頰取血，當後續血液分析的基礎質，在3周後(8周齡)後在注射或噴霧第二劑，於施打一個小時候進行臉頰採血，在6周後(11周齡)注射第三劑，也於施打一個小時候進行臉頰採血，在第9周 (14周齡)進行犧牲，用心臟取血並以酵素結合免疫吸附分析法檢測小鼠血液中IgG、IgG1和IgG2a的濃度，並將結果繪製成圖2至圖4以及換算出平均值紀錄於表4中。

由上表4及圖2至圖4的結果可知，第二組至第四組小鼠體內的IgG、IgG1和IgG2a濃度皆較第一組小鼠顯著提升；另將第三組、第四組分別與第二組進行比較，第三組與第四組小鼠體內的IgG濃度為分別為第二組小鼠的5.88倍、及6.4倍，第三組與第四組小鼠體內的IgG1濃度為分別為第二組小鼠的14.19倍、及14.88倍，第三組與第四組小鼠體內的IgG2a濃度為分別為第二組小鼠的3.85倍、及6.92倍，第三組與第四組中之小鼠體內的IgG、IgG1和IgG2a的濃度皆較第二組小鼠顯著提升，由此可知施打添加有本發明之溫敏型佐劑之疫苗V3~V4的小鼠，其體內所產生抗體量能夠比僅以PBS作為佐劑所製成的疫苗V2高，並且不論是以注射或式噴霧的方式施打，皆能有效提升免疫能力。

從而，可以確認經施打使用本發明之溫敏型佐劑之疫苗的動物能夠增加免疫保護能力，進而具有對抗病毒感染之優異的效果。所以， 本發明之溫敏型佐劑佐劑能夠明顯地提高動物的免疫力及免疫細胞增殖，增強疫苗對動物在傳染疾病上誘發保護性免疫反應。

綜上所述，本發明的內容已經以如上的實施例舉例說明了，然而本發明並非僅限定於此等實施方式而已。本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可再進行各種的更動與修飾；例如，將前述實施例中所例示的各技術內容加以組合或變更而成為新的實施方式，此等實施方式也當然視為本發明所屬內容。因此，本案所欲保護的範圍也包括後述的申請專利範圍及其所界定的範圍。

Claims (4)

1. 一種人用溫敏型佐劑之製備方法，其中該溫敏型佐劑係用於製備噴霧型與注射型疫苗、且能夠隨外界溫度變化而發生相轉變；該製備方法包括以下步驟：(a)將殼聚醣或殼聚醣衍生物、及甘油，以第一操作條件予以充分混合，接著加入聚丙烯酸持續攪拌8小時而形成組成物A；(b)將聚合物凝膠、泊洛沙姆與稀釋劑以第二操作條件下充分混合而得到組成物B，且該組成物B的黏度為在10²mPa．s~10⁷mPa．s之間；以及(c)將上述(b)所得的組成物B緩慢滴入上述(a)所得的組成物A之中，並在第三操作條件下充分混合而得到溫敏型佐劑；其中在該組成物A中，該殼聚醣或殼聚醣衍生物的重量百分濃度為在69wt%、該甘油的重量百分濃度為在5.2wt%、以及該聚丙烯酸的重量百分濃度為在25.8wt%；在該組成物B中，該聚合物凝膠的重量百分濃度為在2.8wt%、該泊洛沙姆的重量百分濃度為在2.8wt%、以及該稀釋劑的重量百分濃度為在94.4wt%；該組成物A相對於組成物B的重量比為29：18；該殼聚醣的脫乙醯程度為50%至100%之範圍，分子量為在5萬~200萬之範圍；該聚合物凝膠為選自Carbopol 934、Carbopol 940、Carbopol 996、Carbopol 980、Carbopol Ultrez 10 Polymer、Carbopol 941、Carbopol 1342、Carbopol Ultrez 20 Polymer、Carbopol Ultrez 21 Polymer、Carbopol Ultrez 30 Polymer、Carbopol SC-200中的至少一種；以及 該第一操作條件包括於45℃之溫度環境、攪拌轉速1200rpm、且調整pH值為6，進行反應2小時；該第二操作條件包括於在室溫環境中、攪拌轉速800rpm~，持續攪拌2小時；該第三操作條件包括於60℃之溫度下，攪拌轉速800rpm，持續攪拌1小時。
2. 如請求項1所記載之人用溫敏型佐劑之製備方法，其中該殼聚醣衍生物為選自羧甲基殼聚醣、殼聚醣鹽酸鹽、殼聚醣乳酸鹽、殼聚醣醋酸鹽、殼聚醣硫酸脂、殼聚醣季胺鹽、殼聚寡醣、或甲殼素。
3. 如請求項1所記載之人用溫敏型佐劑之製備方法，其中該稀釋劑係選自磷酸鹽緩衝劑(PBS)、Tris-HCl緩衝劑、檸檬酸鈉-磷酸鹽緩衝劑、兩性離子緩衝劑、Hepes緩衝劑、或馬來酸鹽緩衝劑中的至少一種。
4. 一種人用溫敏型佐劑，其係利用請求項1至3中任一項的製備方法所製作而成；其中該溫敏型佐劑係用於製備噴霧型與注射型疫苗、且能夠隨外界溫度變化而發生相轉變，在實際施用時，該溫敏型佐劑在疫苗中的體積百分比介於35%~50%之間，且該疫苗的相轉換溫度為在30~38℃之間。

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