CN111840214A

CN111840214A - 一种兽用疫苗的温敏型水凝胶佐剂、制备方法及其应用

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Publication number: CN111840214A
Application number: CN202010855595.4A
Authority: CN
Inventors: 张金秋; 苗晋锋; 卢宇; 邓碧华; 周明旭; 马芳; 尹文竹
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-08-21
Filing date: 2020-08-21
Publication date: 2020-10-30
Anticipated expiration: 2040-08-21
Also published as: AU2020463769A1; AU2020463769B2; WO2022036885A1; ZA202203353B; CN111840214B

Abstract

本发明提供一种兽用疫苗的温敏型水凝胶佐剂、制备方法及其应用，涉及兽用疫苗佐剂领域。一种兽用疫苗的温敏型水凝胶佐剂，按照质量百分含量由如下成分组成：高分子胶束物质15%‑50%，非离子型纤维素醚0.1%‑5%，余量为水。本发明还提供所述兽用疫苗的一种温敏型水凝胶佐剂的制备方法，具体步骤包括：称取各组分，混合，在2‑10℃溶胀成均一体系，即得温敏型水凝胶佐剂。本发明温敏型水凝胶佐剂，原材料简单易得，价格低廉，黏度小，副作用小且能显著延长免疫持续期。

Description

一种兽用疫苗的温敏型水凝胶佐剂、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及兽用疫苗佐剂领域，具体涉及一种兽用疫苗的温敏型水凝胶佐剂、制备方法及其应用。

背景技术

佐剂通常是指能非特异性地增强机体对抗原的特异性免疫应答的物质。根据其作用机制不同，可将佐剂分为两大类：一类是免疫刺激性佐剂，如LPS、细胞因子等，对免疫系统的活性细胞呈现直接刺激或活化作用；另一类是抗原递呈系统(也称为疫苗传递系统，vaccine deliverysystem,VDS),如铝胶、矿物油、脂质体等，可以保护疫苗抗原，延长抗原在机体内的存留时间，从而形成持续的免疫刺激和高效的免疫反应。

目前，动物疫苗中使用较为广泛的仍然是矿物油佐剂，但由于疫苗中白油和表面活性剂所含比例较高，注射后动物应激反应较大，甚至形成无菌性化脓损害和接种部位附近的肉芽肿等，对畜禽产品品质产生了不良影响；且传统油包水疫苗通常粘度较大，注射困难，严重影响了疫苗的免疫效果和疫病的有效防控。

温敏型水凝胶是水凝胶的一种，在药物缓释、组织工程、细胞工程等方面已有应用。当体系温度低于临界转变温度时，温敏性基质能够与水分子结合形成氢键，使凝胶基质能够溶解于水中，体系为流动的液相。当温度升高至临界转变温度时，氢键受到破坏，疏水作用下聚合物链随之发生收缩，成胶基质与水相分离，体系发生相转变，成为凝胶态。凝胶体系具有特殊的网状交联结构，可以将药物或其他活性成分包裹在三维网状结构内，随着凝胶的溶蚀缓慢释放药物或其他活性物质，可使其免于快速降解或失活，延长药物在体内的作用时间，进而达到缓释控释的目的。

但是，现有技术中缺乏适用于兽用疫苗，黏度小，副作用小且能延长免疫持续期的温敏型水凝胶佐剂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种兽用疫苗的温敏型水凝胶佐剂，该佐剂原材料简单易得，价格低廉，黏度小，副作用小且能显著延长免疫持续期。

本发明的另一目的是提供上述兽用疫苗的温敏型水凝胶佐剂的制备方法。

本发明的再一目的是提供兽用疫苗的温敏型水凝胶佐剂的应用。

本发明的目的采用如下技术方案实现：

一种兽用疫苗的温敏型水凝胶佐剂，按照质量百分含量由如下成分组成：

高分子胶束物质15％-50％，

非离子型纤维素醚0.1％-5％，

余量为水。

在本发明中，所述高分子胶束物质为泊洛沙姆407、泊洛沙姆188、Soluplus、卡波姆中的一种或者几种的混合物。

在本发明中，所述非离子型纤维素醚为羟丙基甲基纤维素。

优选的技术方案中，兽用疫苗的温敏型水凝胶佐剂按照质量百分含量由如下成分组成：

余量为水。

在本发明中，所述泊洛沙姆为泊洛沙姆407和泊洛沙姆188，泊洛沙姆407的质量百分含量为14-30％，泊洛沙姆188的质量百分含量为1-5％。

本发明还提供所述兽用疫苗的一种温敏型水凝胶佐剂的制备方法，具体步骤包括：称取各组分，混合，在2-10℃溶胀成均一体系，即得温敏型水凝胶佐剂。

在本发明中，所述混合是在0-10℃条件下进行的。

本发明还提供一种含所述兽用疫苗的温敏型水凝胶佐剂的疫苗。

在本发明中，所述温敏型水凝胶疫苗包括质量比为0.5-4:1的温敏型水凝胶佐剂和抗原水溶液。

在本发明中，所述抗原为猪圆环病毒病毒或猪细小病毒。

本发明的有益效果：

(1)本发明兽用疫苗的温敏型水凝胶佐剂，成分简单，原材料易得，价格低廉，使用方便；与该佐剂相结合配制成的疫苗，通针性良好，黏度小易于注射，显著减轻了接种时的工作量；易储存，副作用小，且能显著延长免疫持续期。本发明所选原材料生物安全性和体内降解性均良好。凝胶在成胶后形成交联的网状三维结构，可在交联孔洞内负载抗原，而后随半固态凝胶在体内的溶蚀达到抗原的缓释效果。

(2)本发明温敏型水凝胶佐剂的制备方法，简单易操作，成本低。

附图说明

图1不同疫苗注射部位的组织切片观察。其中(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)分别对应温敏型水凝胶疫苗PCV2-1、温敏型水凝胶疫苗PCV2-2、温敏型水凝胶疫苗PCV2-3、温敏型水凝胶疫苗PCV2-4、温敏型水凝胶疫苗PCV2-5、温敏型水凝胶疫苗PCV2-6、温敏型水凝胶疫苗PCV2-7、温敏型水凝胶疫苗PCV2-8免疫组小鼠；(9)为对照疫苗PCV2-1免疫组小鼠；(10)为注射生理盐水的空白对照组小鼠。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不仅包括以下实施例，还包括在发明基础上的其他实施例。

本发明中各材料来源如下：

泊洛沙姆407、泊洛沙姆188均购自Sigma公司。

卡波姆购自Lubrizol公司。

Soluplus购自上海BASF公司，是聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物，由N-乙烯基-ε-己内酰胺、乙酸乙烯酯和聚乙二醇(57：30：13)共聚而成，分子量为90,000～140,000g/mol。

羟丙基甲基纤维素购自sigma公司。

实施例1温敏型水凝胶佐剂的筛选

温敏型水凝胶佐剂1，按照质量百分含量，由如下组分组成：

余量为水。

温敏型水凝胶佐剂2，按照质量百分含量，由如下组分组成：

余量为水。

温敏型水凝胶佐剂3，按照质量百分含量，由如下组分组成：

余量为水。

温敏型水凝胶佐剂4，按照质量百分含量，由如下组分组成：

余量为水。

温敏型水凝胶佐剂5，按照质量百分含量，由如下组分组成：

余量为水。

温敏型水凝胶佐剂6，按照质量百分含量，由如下组分组成：

余量为水。

温敏型水凝胶佐剂7，按照质量百分含量，由如下组分组成：

余量为水。

温敏型水凝胶佐剂8，按照质量百分含量，由如下组分组成：

余量为水。

按照各温敏型水凝胶佐剂的组分和含量，称取各物质，混合，置于冰水浴下搅拌，于4℃条件下静置12小时，以溶胀成均一体系，然后用0.22μm滤膜过滤除菌，分别得到温敏型水凝胶佐剂1-8。

采用翻转法(一种温敏凝胶基质及其制备方法与应用，专利号ZL201610243442.8)，将上述不同配方配制的水凝胶置于西林瓶中，放入水浴中，水浴温度自30℃开始升温，控制升温速度在0.5℃/min，每温度点维持5-10min。将西林瓶倾斜60度，以样品保持30秒内不流动作为胶凝判定依据，记录不同温度下各样品的胶凝时间。

结果发现，上述8个温敏型水凝胶佐剂，在32℃以下，均无法胶凝，体系保持流动性。当温度升至34℃时，样品黏度陡增，体系流动性急剧下降，逐渐胶凝。

考察了上述各温敏型水凝胶佐剂在36-40℃(人或动物常见的体温范围)的成胶时间，结果如表1。由表1可见，温敏型水凝胶佐剂1-8在36-40℃均可成胶，且随着温度的升高，成胶的时间逐渐缩短。

表1不同水凝胶在36-40℃的成胶时间

组别

36℃

36.5℃

37℃

37.5℃

38℃

38.5℃

39℃

39.5℃

40℃

配方1

4’21

4’11

3’19

3’16

3’04

2’55

2’27

1’55

1’15

配方2

3’47

3’44

3’02

2’23

2’05

1’41

1’27

1’05

0’53

配方3

3’35

3’26

3’12

2’49

2’33

2’08

1’40

1’24

1’08

配方4

9’50

9’23

9’01

8’40

8’18

8’02

7’36

7’11

6’42

配方5

2’48

2’19

2’00

1’47

1’38

1’25

1’00

0’50

0’37

配方6

5’15

4’53

4’41

4’22

4’01

3’50

3’36

3’11

2’49

配方7

3’45

3’31

3’22

3’09

2’53

2’38

2’14

2’04

1’48

配方8

2’35

2’18

2’09

2’00

1’49

1’34

1’27

1’05

0’35

注：表1中4’21表示4分21秒，其他依次类推。

实施例2温敏型水凝胶疫苗的制备、性质评价及其应用

(1)猪圆环病毒2型灭活病毒液的制备

猪圆环病毒2型灭活病毒液(DBN-SX07株)由成都天邦生物科技有限公司提供，灭活前每毫升病毒液病毒含量为10⁶TCID₅₀。该灭活病毒液符合《兽用生物制品质量标准汇编》(2011)的相关要求。

(2)猪圆环病毒2型温敏型水凝胶灭活疫苗的制备

将实施例1制备的温敏型水凝胶佐剂1-8，分别与猪圆环病毒2型灭活病毒液(DBN-SX07株)按质量比3:1混合均匀，制备对应的温敏型水凝胶疫苗PCV2-1、温敏型水凝胶疫苗PCV2-2、温敏型水凝胶疫苗PCV2-3、温敏型水凝胶疫苗PCV2-4、温敏型水凝胶疫苗PCV2-5、温敏型水凝胶疫苗PCV2-6、温敏型水凝胶疫苗PCV2-7、温敏型水凝胶疫苗PCV2-8。疫苗的数字编号与温敏型水凝胶佐剂的数字编号一致。

对照疫苗PCV2-1的制备：参考发明专利ZL201610243442.8，称取Soluplus30g，加入50mM磷酸盐缓冲液至总质量为100g，4℃分散，配制成对照温敏型凝胶基质。将该对照温敏型凝胶基质与猪圆环病毒2型灭活病毒液按质量比3:1混合均匀，制备对照疫苗PCV2-1。

(3)疫苗的物理性状检测

将上述温敏型水凝胶疫苗1-8、对照疫苗PCV2-1分别置于4℃和37℃保存，观察其外观变化，并按现行《中国兽药典》附录中旋转式粘度计测定法进行黏度测定，具体结果见表2。

表2各的物理性状的比较

疫苗	外观(4℃)	外观(37℃)	黏度(cP，25℃)
				温敏型水凝胶疫苗PCV2-1	透明溶液	半透明凝胶	2.08±0.25
温敏型水凝胶疫苗PCV2-2	透明溶液	半透明凝胶	3.76±0.61
				温敏型水凝胶疫苗PCV2-3	透明溶液	半透明凝胶	2.03±0.75
温敏型水凝胶疫苗PCV2-4	透明溶液	半透明凝胶	12.38±0.72
				温敏型水凝胶疫苗PCV2-5	透明溶液	半透明凝胶	26.04±0.53
温敏型水凝胶疫苗PCV2-6	透明溶液	半透明凝胶	13.09±0.31
				温敏型水凝胶疫苗PCV2-7	透明溶液	半透明凝胶	3.99±0.43
温敏型水凝胶疫苗PCV2-8	透明溶液	半透明凝胶	23.01±0.91
				对照疫苗PCV2-1	透明溶液	半透明凝胶	63.97±4.06

根据《中国兽药典》要求，所有注射用疫苗的黏度应不超过200cP。采用本发明温敏型水凝胶佐剂制备的疫苗均满足要求，且通过表2可以看出，采用温敏型水凝胶佐剂制备的疫苗，黏度显著低于对照疫苗PCV2-1，便于临床注射使用。

(4)温敏型水凝胶疫苗的小鼠安全性评价

100只Balb/c雌性小鼠(18-22g)随机分成10组，每组10只。将上述各温敏型水凝胶疫苗和对照疫苗PCV2-1，分别免疫一组小鼠。免疫方法如下：颈背部皮下免疫小鼠，每只小鼠免疫0.2mL疫苗，同时设置只注射生理盐水的空白对照组。免疫后，连续14天观察小鼠状况，包括采食量、饮水量、精神状态、注射位点的变化及异常行为等，并通过组织切片评价不同试验组小鼠的病理变化。组织切片结果见图1。结果发现，对照疫苗PCV2-1试验组小鼠在注射后出现不停舔舐注射部位等轻微应激反应，14天后在注射位点附近仍有轻微脱毛现象，且从切片结果可见少量炎性细胞浸润。而其他各温敏型水凝胶疫苗组小鼠无明显应激反应，小鼠精神状态良好，无异常行为变化，注射后各组均没有出现皮肤破损或注射位点脱毛等情况，切片结果未见明显炎性细胞出现。

(4)温敏型水凝胶疫苗的免疫效力评价

选取猪圆环病毒2型抗原和抗体均为阴性的14日龄仔猪100头，随机分为10组，每组10头。将各温敏型水凝胶疫苗、对照疫苗PCV2-1分别免疫一组仔猪，同时设置空白对照组不免疫。免疫程序为：14日龄首免，间隔21天后进行二免，每次免疫剂量为1.0ml/头。于末次免疫后1个月、2个月、3个月、4个月和6个月，采血分离血清，用猪圆环病毒2型抗体ELISA检测试剂盒(武汉科前生物制品有限公司)进行抗体检测。空白对照组中每头仔猪的PCV2抗体效价均应为阴性(不高于1:40)，免疫猪PCV2抗体效价≥1:40判为抗体阳性，统计抗体阳性率。

表3各疫苗的免疫效力比较

注：表3中同列不含相同字母表示差异显著，p<0.05。

按照《兽用生物制品质量标准汇编(2010)》的要求，抗体阳性率≥80％为合格。通过表3可以看出，采用温敏型水凝胶佐剂1-3制备的疫苗免疫持续期可达6个月，其他疫苗的免疫持续期不超过3个月，因此温敏型水凝胶佐剂1-3制备的疫苗免疫效力显著优于温敏型水凝胶佐剂4-8及对照温敏型凝胶基质配制的疫苗。采用温敏型水凝胶佐剂1-3制备的疫苗完全满足商品猪的免疫防病要求，具有非常好的应用价值。

(5)温敏型水凝胶疫苗的仔猪安全性评价

对本实施例标题(4)中，仔猪在14日龄首免后进行连续7天的体温检测，具体结果见表4。从表4可以看出，各温敏型水凝胶疫苗免疫后猪只体温均在39.0-40.0℃的正常范围之内，无发热症状，而对照疫苗PCV2-1首免后1-5天，猪只体温大于40.0度。同时，对首免后的猪只进行注射部位的肉眼观察，发现注射各温敏型水凝胶疫苗的猪只未发现注射部位损伤、溃疡等异常现象；而免疫对照疫苗PCV2-1的猪只，有2只在注射部位出现肿块，7天左右消失。二免后，各组仔猪注射部位均未出现肉眼可见的不良反应。上述结果说明，采用温敏型水凝胶佐剂1-8制备的疫苗，免疫仔猪后副反应很小，对仔猪安全。

表4每组仔猪免疫后7天的平均体温变化(℃)

实施例3猪细小病毒病温敏型水凝胶灭活疫苗的制备及应用

(1)猪细小病毒(PPV BJ-2株)灭活抗原

猪细小病毒BJ-2株灭活病毒液由金宇保灵生物药品有限公司提供，灭活前每毫升病毒液中病毒含量不低于10⁶TCID₅₀。该猪细小病毒灭活病毒液符合《兽用生物制品质量标准汇编(2012)》的相关要求。

(2)猪细小病毒病温敏型水凝胶灭活疫苗的制备

将实施例1中温敏型水凝胶佐剂1-8分别与猪细小病毒BJ-2株灭活病毒液按质量比3:1混合均匀，得到温敏型水凝胶疫苗PPV-1、温敏型水凝胶疫苗PPV-2、温敏型水凝胶疫苗PPV-3、温敏型水凝胶疫苗PPV-4、温敏型水凝胶疫苗PPV-5、温敏型水凝胶疫苗PPV-6、温敏型水凝胶疫苗PPV-7、温敏型水凝胶疫苗PPV-8。疫苗编号与温敏型水凝胶佐剂的编号一致。

对照疫苗PPV-1的制备：按照发明专利ZL201610243442.8，称取Soluplus30g，加入50mM磷酸盐缓冲液至总质量为100g，4℃分散，配制成对照温敏型凝胶基质。将该对照温敏型凝胶基质与猪细小病毒BJ-2株灭活病毒液按质量比3:1混合均匀，得到对照疫苗PPV-1。

(3)疫苗的物理性状检测

将本实施例标题(2)中温敏型水凝胶疫苗PPV-1至温敏型水凝胶疫苗PPV-8、对照疫苗PPV-1分别置于4℃和37℃保存，观察其外观变化，并按现行《中国兽药典》附录中旋转式粘度计测定法进行黏度测定，具体结果见表5。

表5各猪细小病毒病疫苗的物理性状比较

通过表5可以看出，采用温敏型水凝胶佐剂1-8制备的疫苗，黏度均显著低于200cP，符合《中国兽药典》对注射用疫苗的黏度要求，且黏度显著低于对照疫苗PPV-1，更方便临床注射使用，减少劳动强度。

(4)安全性评价

参照《兽用生物制品质量标准汇编(2012)》的相关要求，分别进行仔猪安全性评价和乳鼠安全性评价。

仔猪安全性评价：将温敏型水凝胶疫苗PPV-1至温敏型水凝胶疫苗PPV-8和对照疫苗PPV-1分别接种4～6周龄健康易感仔猪(猪细小病毒血凝抑制抗体(PPV HI)效价不高于1:8)，每种疫苗均免疫2头，每头颈部肌肉注射疫苗4毫升，逐日观察21日。结果：各组均未出现由疫苗引起的局部或全身不良反应。

乳鼠安全性评价：将温敏型水凝胶疫苗PPV-1至温敏型水凝胶疫苗PPV-8和对照疫苗PPV-1分别接种3～5日龄乳鼠，每种疫苗均免疫5只，每只皮下注射疫苗0.1毫升，连续观察10日。结果：各组均健活，均未出现由疫苗引起的局部或全身不良反应。

(5)免疫效力评价

将温敏型水凝胶疫苗PPV-1至温敏型水凝胶疫苗PPV-8和对照疫苗PPV-1分别接种体重350～400g健康豚鼠(猪细小病毒血凝抑制抗体(PPV HI)效价不高于1:8)，每种疫苗均免疫5只，每只豚鼠均肌肉注射疫苗0.5毫升。空白对照组设有5只豚鼠，不免疫。于免疫后28日、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月，各组豚鼠分别采血，分离血清，检测猪细小病毒血凝抑制抗体效价(检测方法按《中国兽药典》附录要求进行)。

表6各疫苗的免疫效力比较

按照《兽用生物制品质量标准汇编(2012)》的要求，免疫豚鼠应至少4只出现抗体阳性，且效价不低于1∶64(PPV HI≥6，log2)，对照豚鼠血凝抑制抗体效价均应不高于1∶8(PPV HI≤3，log2)，判为合格。通过表6可以看出，采用温敏型水凝胶佐剂1-3制备的疫苗免疫豚鼠后的免疫持续期可达6个月以上，采用温敏型水凝胶佐剂4-8和对照温敏型凝胶基质所制备的疫苗，免疫后5个月血凝抑制抗体水平显著下降，低于1∶64(PPVHI≥6，log2)，免疫持续期仅达4个月，且显著低于采用温敏型水凝胶佐剂1-3所制备的疫苗免疫后的抗体效价。因此，温敏型水凝胶佐剂1-3所制备的疫苗免疫效力显著优于温敏型水凝胶佐剂4-8和对照温敏型凝胶基质所制备的疫苗。采用温敏型水凝胶佐剂1-3制备的疫苗完全满足兽用生物制品质量标准，符合商品猪的免疫防病要求，具有非常好的应用价值。

Claims

1.一种兽用疫苗的温敏型水凝胶佐剂，其特征在于，按照质量百分含量由如下成分组成：

高分子胶束物质15%-50%，

非离子型纤维素醚0.1%-5%，

余量为水。

2.根据权利要求1所述兽用疫苗的温敏型水凝胶佐剂，其特征在于：所述高分子胶束物质为泊洛沙姆407、泊洛沙姆188、Soluplus、卡波姆中的一种或者几种的混合物。

3.根据权利要求1所述兽用疫苗的温敏型水凝胶佐剂，其特征在于：所述非离子型纤维素醚为羟丙基甲基纤维素。

4.根据权利要求3所述兽用疫苗的温敏型水凝胶佐剂，其特征在于，按照质量百分含量由如下成分组成：

泊洛沙姆 15-35%，

Soluplus 0.1-10%，

卡波姆 0.01-0.2%，

羟丙基甲基纤维素 0.1-5%，

余量为水。

5.根据权利要求4所述兽用疫苗的温敏型水凝胶佐剂，其特征在于，所述泊洛沙姆为泊洛沙姆407和泊洛沙姆188，泊洛沙姆407的质量百分含量为14-30%，泊洛沙姆188的质量百分含量为1-5%。

6.根据权利要求1所述兽用疫苗的一种温敏型水凝胶佐剂的制备方法，其特征在于，具体步骤包括：称取各组分，混合，在2-10℃溶胀成均一体系，即得温敏型水凝胶佐剂。

7.一种含权利要求1—6之一所述兽用疫苗的温敏型水凝胶佐剂的疫苗。

8.根据权利要求7所述兽用疫苗的温敏型水凝胶疫苗，其特征在于，所述疫苗包括质量比为0.5-4:1的温敏型水凝胶佐剂和抗原水溶液。

9.根据权利要求8所述温敏型水凝胶疫苗，其特征在于，所述抗原为猪圆环病毒病毒或猪细小病毒。