CN113842358B - 一种兽用子宫注入剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种新型兽用子宫注入剂的制备方法，属于兽药制剂领域，将吸附载体分别与利福昔明自微乳、生长修复因子混合制得自微乳载药粒子和生长修复因子载药粒子；将第一基质、第二基质与注射用水混合制得注射基质，将所述注射基质与所述自微乳载药粒子、所述生长修复因子载药粒子混合后冷冻干燥，制得所述子宫注入剂；本发明利用生长修复因子的促细胞生长作用和凝胶基质提供的细胞增殖微环境，加速子宫内膜表皮细胞修复，促进受损组织再生并建立防护屏障，可以预防子宫内新感染的发生，降低子宫内膜炎的发病率。

Description

一种兽用子宫注入剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及兽药制剂领域，具体涉及一种兽用子宫注入剂及其制备方法和应用。
背景技术
奶牛子宫内膜炎是养牛过程中比较常见的一种疾病，具有较高的发病率，但病死率较低，往往呈慢性经过。该病既会使病牛繁殖能力严重降低，还会使产奶量在一定程度上下降，甚至失去泌乳能力，如果症状严重还会引起不孕不育，甚至只能够被淘汰处理，另外还容易引发其他疾病，如子宫炎等。近几年，随着奶牛饲养规模的不断扩大，加之普遍应用人工授精技术，导致该病的发生呈持续升高趋势，严重损害奶牛养殖产业的经济效益，应加以防治。
利福昔明为利福霉素SV的人工半合成衍生物。与其它利福霉素类抗菌药一样，通过与细菌DNA-依赖RNA聚合酶的β-亚单位不可逆地结合而抑制细菌RNA的合成，最终抑制细菌蛋白质的合成。利福昔明抗菌谱广，对多数革兰氏阳性需氧菌具有高度抗菌活性，对革兰氏阴性菌中的大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌及革兰氏阳性厌氧菌也有较好的抗菌活性。利福昔明子宫内给药几乎不吸收，组织吸收水平低，对机体正常菌群无不良影响，无明显毒副作用，因此子宫内灌注利福昔明非常适合用于治疗奶牛子宫炎。
子宫注入疗法是指向奶牛子宫内灌注抗菌药物，治疗和预防奶牛子宫内膜炎的发生。但目前市面上的多数子宫注入剂以杀菌效果为主要目的，无法兼顾子宫表皮以及组织的修复，仅注重“治”，而忽视了“防”，而在奶牛分娩助产过程中子宫内膜或有损伤，且奶牛流产、难产、胎衣不下及人工授精操作不规范等均会给病原菌提供入侵的机会，致病菌很可能会在这段时间大量集聚，进而引发相关疾病，因此注入剂兼顾子宫表皮、组织的修复很有必要。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种兽用子宫注入剂及其制备方法和应用。
本发明的目的采用以下技术方案来实现：
一种兽用子宫注入剂的制备方法，依次包括以下步骤：
(1)制备利福昔明自微乳；
(2)将吸附载体与所述利福昔明自微乳混合，制得自微乳载药粒子；将吸附载体与生长修复因子混合，制得生长修复因子载药粒子；
(3)将第一基质、第二基质与注射用水混合，制得注射基质，将所述注射基质与所述自微乳载药粒子、所述生长修复因子载药粒子混合，制得所述子宫注入剂；
其中，所述吸附载体为硅酸钙、亲水型气相二氧化硅、微晶纤维素中的一种或几种；
所述生长修复因子包括表皮细胞生长因子，所述表皮细胞生长因子为寡肽-1、蓝铜肽中的一种或两种；
所述第一基质为水溶性丝素蛋白、壳聚糖、羟丙纤维素、羟丙甲纤维素、甲基纤维素、聚乙烯醇中的一种或几种；
所述第二基质为甲基乙烯基醚-马来酸酐共聚物、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、丙三醇中的一种或几种。
优选的，所述利福昔明自微乳中利福昔明的浓度不大于18wt.％；更优选为1-6wt.％；最优选为4wt.％。
优选的，所述利福昔明自微乳、所述吸附载体、所述表皮细胞生长因子、所述第一基质、所述第二基质的质量比例为(1-10)：(0.3-1.8)(0.05-0.3)：(5-14)：(0.45-0.65)。
优选的，所述生长修复因子还包括胶原蛋白肽和/或透明质酸钠。
优选的，所述利福昔明自微乳中利福昔明的浓度为4wt.％，所述吸附载体为质量比例2：1的硅酸钙与亲水型气相二氧化硅的混合物，所述生长修复因子为质量比例0.3：1：3的表皮细胞生长因子、胶原蛋白肽和透明质酸钠的混合物，所述第一基质为水溶性丝素蛋白，所述第二基质为甲基乙烯基醚-马来酸酐共聚物，所述利福昔明自微乳、所述吸附载体、所述生长修复因子、所述第一基质、所述第二基质的质量比例为5：1：4.3：10：0.5。
优选的，还包括步骤(4)：将所述步骤(3)制得的所述子宫注入剂进行冷冻干燥。
优选的，所述利福昔明自微乳的制备方法是，将乳化剂和助乳化剂混匀后加入油相溶液，再次混匀后加入利福昔明溶解，制得所述利福昔明自微乳。
优选的，所述乳化剂为聚氧乙烯蓖麻油、蓖麻油聚氧乙烯醚、聚氧乙烯醚氢化蓖麻油、丙二醇单月桂酸甘油酯、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯、吐温80、吐温20中的一种或几种；
所述助乳化剂为丙三醇、聚乙二醇400、聚乙二醇600、二乙二醇单乙基醚中的一种或几种；
所述油相溶液为中链甘油三酯、肉豆蔻酸异丙酯、油酸乙酯、辛酸癸酸单甘油酯、辛酸癸酸三甘油酯、辛酸癸酸琥珀酸三甘酯中的一种或几种。
优选的，所述乳化剂、助乳化剂和所述油相溶液的质量比例为4：1：5。
本发明的另一目的在于提供一种前述制备方法制备得到的注入剂的应用方法，具体是将所述注入剂加入注射用水溶解摇匀，待注入剂溶液呈混悬水溶胶状态时进行子宫内灌注。
本发明的有益效果为：
(1)本发明利用自微乳系统对难溶性药物利福昔明增溶，分别以吸附剂对利福昔明自微乳和生长修复因子后分散混悬于水凝胶中，提高含药自微乳和表皮细胞生长因子的稳定性，同时，水凝胶可减少注射时的疼痛，而且可利用生长修复因子的促细胞生长作用和水凝胶提供的细胞增殖微环境，加速子宫内膜表皮细胞修复，促进受损组织再生并建立防护屏障，不仅能治愈子宫内膜已存在的感染，加快奶牛恢复健康体质，也可以预防子宫内新感染的发生，降低子宫内膜炎的发病率。相对于水凝胶而言，冻干粉则更便于贮存，产品稳定性受储存条件影响较小，可加入纯化水复溶。
(2)现有的子宫注入剂主要是直接将抗菌药物注入以获得杀菌效果，无法兼顾子宫表皮以及组织的修复，本发明通过加入生长修复因子并分散在是水凝胶中，可以促进增殖、加速修复，达到防治结合的目的；但加入的生长修复因子在微乳和水凝胶的水相环境中的稳定性较差，本发明加入吸附剂将所述生长修复因子混悬在水凝胶中，提高其在水相环境中的稳定性。
(3)本发明制备的利福昔明子宫注入剂为温敏型注入剂，注射前为流动性较好的流体状态，可轻易摇匀混悬的载药粒子，注入阻力低，具有粒径小、黏度低、使用方便的特点，当温度达35℃~40℃，即注射进入体内时，即成半固体水凝胶状态，较直接注入水凝胶更能均匀黏附覆盖子宫内壁，封闭毛孔，形成防菌层，其在体内形成的水凝胶生物粘附性很好，水凝胶不易随重力作用在子宫底部堆积。本发明制得的子宫注入剂在体内形成的水凝胶系统可被机体吸收利用，无毒，环保。
附图说明
利用附图对本发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制，对于本领域的普通技术人员，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据以下附图获得其它的附图。
图1是空白自微乳的伪三相图。
具体实施方式
结合以下实施例对本发明作进一步描述。
本发明的实施例涉及一种利福昔明子宫注入剂，由以下组分组成：利福昔明自微乳、吸附载体、生长修复因子、凝胶基质、Gantrez AN和注射用水，其中，所述吸附载体包括硅酸钙，所述生长修复因子包括表皮细胞生长因子、胶原蛋白肽和透明质酸钠，所述表皮细胞生长因子包括寡肽-1和/或蓝铜肽。
自微乳液系统(SMEDDS)是由油、表面活性剂和助表面活性剂或少量水组成的均一透明溶液，可作为疏水性、难吸收或易水解药物的载体。通过将药物包裹在油滴中，在体内遇体液自发分散形成O/W型微乳。该系统可通过提高药物的溶解度，降低表面张力，增加穿透性等优势显著提高药物生物利用度。
硅酸钙(型号：FLORITE PS-10)是白色外观细颗粒，具有良好的流动性，硅酸钙可通过将无定形化的API包覆在微孔中制成固体分散体，增强水溶性差的API的溶解。同时，硅酸钙也是一种具有良好的液体吸收性的合成硅酸钙，它与常规多孔材料不同，具有独特的花瓣状晶体结构和非常明显的孔径和孔穴体积。这些大孔是液体吸收量的关键因素，可吸收自身重量5倍的液体并转化为粉末状。硅酸钙的大孔在垂直方向上不断扩张，孔的开口与其体积相比实属小面积，使其具有保护填充在孔中液体不受外部氧气、蒸气、或其他元素影响的良好环境。硅酸钙不仅可用作API的稳定剂，还可作为优秀的液体载体使用于药物制剂。
表皮细胞生长因子是人体内一种重要的活性蛋白质多肽物质，能够强烈促进人体细胞的增殖、生长，快速修复受损的粘膜，恢复人体自身免疫力，可快速的进入皮肤的表皮组织，修复受损黏膜，促进其分化、增殖、迁移，最后覆盖损伤区域，完成粘膜的再生，增强免疫力，恢复机体自身功能。由于表皮细胞生长因子的自身特性，低温条件有助于保持其活性，在室温及以上条件活性会逐渐降低，因此单一成分一般都以冻干粉形式并冷藏保存，使用表皮细胞生长因子制备制剂时必须充分考虑其稳定性。
水凝胶是一种由亲水性大分子链交联形成的具有网络状分子结构的材料，因其具有与人体组织相似的保水特性和力学性质，水凝胶被广泛应用于多种组织器官修复和重建，相较于其他给药途径和植入方式，可注射水凝胶具有多项优势。水凝胶具有与天然软组织相似的结构，体系内的高含水量的特性在结构和功能上可模拟细胞外基质成分，既能有效锚定、释放细胞因子或药物等活性物质，又对氧气、营养物质及其他代谢产物的高度通透性，为细胞的增殖和分化，以及支持细胞的增殖和迁移提供所需场所。由天然大分子丝素蛋白为基体的可注射水凝胶具有弱抗原性、良好的细胞粘附性、可吸收性和生物安全性，天然大分子水凝胶有利于细胞增殖、分化活动，为细胞长入、胶原沉积等过程提供微环境支持。
Gantrez AN是聚甲基乙烯基醚/马来酸酐共聚物，溶于水和/或乙醇，可形成高极性、无黏感的薄膜，具有极佳的湿粘合强度和生物粘附性。由于其优良的成膜性和粘附性，适用于喷涂绷带和造口术粘合剂。
实施例1
一种兽用子宫注入剂，按100ml计，由以下组分组成：利福昔明自微乳5g、吸附载体1g、生长修复因子(寡肽-1/蓝铜肽：胶原蛋白肽：透明质酸钠＝0.3：1：3)4.3g、水溶性丝素蛋白10g、Gantrez AN 0.5g、余量为注射用水；
其制备方法包括以下步骤：
(1)分别称取聚氧乙烯醚氢化蓖麻油(Cremophor RH 40)9.6g、二乙二醇单乙基醚(Transcutol P)48g放在涡旋混匀器中涡旋混匀，再将辛酸癸酸单甘油酯(Capmul MCM)38.4g加入到上述混合物中，涡旋混匀，得到空白自微乳，将4g的利福昔明溶解到所述空白自微乳中，制得利福昔明自微乳；
(2)将硅酸钙(FLORITE PS-10)、亲水型气相二氧化硅(AEROSIL 380)按质量比2：1置于方锥混合机中混合均匀，制得吸附载体混合物；
(3)将组方量90％的吸附载体置于配料罐中，加入组方量的利福昔明自微乳搅拌均匀，制得自微乳载药粒子；
(4)将组方量余量(10％)的吸附载体置于置于方锥混合机中，加入组方量的生长修复因子搅拌均匀，制得生长修复因子载药粒子；
(5)将组方量的水溶性丝素蛋白、Gantrez AN、注射用水加入到涡旋混匀器中，在常温下混合搅拌至液体呈澄清溶胶状态后，加入所述自微乳载药粒子和所述生长修复因子载药粒子，涡流剪切10-15min，真空冷冻干燥，充氮密封，制得含量规格为0.2g：100ml利福昔明子宫注入剂冻干粉；冻干粉避光冷藏保存，使用时加入注射用水(100mL/份，按0.2g利福昔明/份计)溶解摇匀，待注入剂呈混悬水溶胶状态，子宫内灌注。
制备环境温度控制在20℃-25℃，湿度控制在60％以下。
实施例2
同实施例1，区别在于不含吸附剂，工艺上将利福昔明自微乳和生长修复因子直接加到原步骤(5)中配成利福昔明子宫注入剂，具体步骤如下：
一种兽用子宫注入剂，按100ml计，由以下组分组成：利福昔明自微乳5g、生长修复因子(寡肽-1/蓝铜肽：胶原蛋白肽：透明质酸钠＝0.3：1：3)4.3g、水溶性丝素蛋白10g、Gantrez AN 0.5g、余量为注射用水；
其制备方法包括以下步骤：
(1)分别称取聚氧乙烯醚氢化蓖麻油(Cremophor RH 40)9.6g、二乙二醇单乙基醚(Transcutol P)48g放在涡旋混匀器中涡旋混匀，再将辛酸癸酸单甘油酯(Capmul MCM)38.4g加入到上述混合物中，涡旋混匀，得到空白自微乳，将4g的利福昔明溶解到所述空白自微乳中，制得利福昔明自微乳；
(2)将组方量的水溶性丝素蛋白、Gantrez AN、注射用水加入到涡旋混匀器中，在常温下混合搅拌至液体呈澄清溶胶状态后，加入所述利福昔明自微乳和组方量的生长修复因子载，涡流剪切10-15min，真空冷冻干燥，充氮密封，制得含量规格为0.2g：100ml利福昔明子宫注入剂冻干粉；冻干粉避光冷藏保存，使用时加入注射用水(100mL/份，按0.2g利福昔明/份计)溶解摇匀，待注入剂呈混悬水溶胶状态，子宫内灌注。
制备环境温度控制在20℃-25℃，湿度控制在60％以下。
实施例3
同实施例1，区别在于所述吸附载体为亲水型气相二氧化硅，具体步骤如下：
一种兽用子宫注入剂，按100ml计，由以下组分组成：利福昔明自微乳5g、亲水型气相二氧化硅1g、生长修复因子(寡肽-1/蓝铜肽：胶原蛋白肽：透明质酸钠＝0.3：1：3)4.3g、水溶性丝素蛋白10g、Gantrez AN 0.5g、余量为注射用水；
其制备方法包括以下步骤：
(1)分别称取聚氧乙烯醚氢化蓖麻油(Cremophor RH 40)9.6g、二乙二醇单乙基醚(Transcutol P)48g放在涡旋混匀器中涡旋混匀，再将辛酸癸酸单甘油酯(Capmul MCM)38.4g加入到上述混合物中，涡旋混匀，得到空白自微乳，将4g的利福昔明溶解到所述空白自微乳中，制得利福昔明自微乳；
(2)将组方量90％的吸附载体置于配料罐中，加入组方量的利福昔明自微乳搅拌均匀，制得自微乳载药粒子；
(3)将组方量余量(10％)的吸附载体置于置于方锥混合机中，加入组方量的生长修复因子搅拌均匀，制得生长修复因子载药粒子；
(4)将组方量的水溶性丝素蛋白、Gantrez AN、注射用水加入到涡旋混匀器中，在常温下混合搅拌至液体呈澄清溶胶状态后，加入所述自微乳载药粒子和所述生长修复因子载药粒子，涡流剪切10-15min，真空冷冻干燥，充氮密封，制得含量规格为0.2g：100ml利福昔明子宫注入剂冻干粉；冻干粉避光冷藏保存，使用时加入注射用水(100mL/份，按0.2g利福昔明/份计)溶解摇匀，待注入剂呈混悬水溶胶状态，子宫内灌注。
制备环境温度控制在20℃-25℃，湿度控制在60％以下。
实施例4
同实施例1，区别在于所述吸附载体为微晶纤维素，具体步骤如下：
一种兽用子宫注入剂，按100ml计，由以下组分组成：利福昔明自微乳5g、微晶纤维素)1g、生长修复因子(寡肽-1/蓝铜肽：胶原蛋白肽：透明质酸钠＝0.3：1：3)4.3g、水溶性丝素蛋白10g、Gantrez AN 0.5g、余量为注射用水；
其制备方法包括以下步骤：
(1)分别称取聚氧乙烯醚氢化蓖麻油(Cremophor RH 40)9.6g、二乙二醇单乙基醚(Transcutol P)48g放在涡旋混匀器中涡旋混匀，再将辛酸癸酸单甘油酯(Capmul MCM)38.4g加入到上述混合物中，涡旋混匀，得到空白自微乳，将4g的利福昔明溶解到所述空白自微乳中，制得利福昔明自微乳；
(2)将组方量90％的吸附载体置于配料罐中，加入组方量的利福昔明自微乳搅拌均匀，制得自微乳载药粒子；
(3)将组方量余量(10％)的吸附载体置于置于方锥混合机中，加入组方量的生长修复因子搅拌均匀，制得生长修复因子载药粒子；
(4)将组方量的水溶性丝素蛋白、Gantrez AN、注射用水加入到涡旋混匀器中，在常温下混合搅拌至液体呈澄清溶胶状态后，加入所述自微乳载药粒子和所述生长修复因子载药粒子，涡流剪切10-15min，真空冷冻干燥，充氮密封，制得含量规格为0.2g：100ml利福昔明子宫注入剂冻干粉；冻干粉避光冷藏保存，使用时加入注射用水(100mL/份，按0.2g利福昔明/份计)溶解摇匀，待注入剂呈混悬水溶胶状态，子宫内灌注。
制备环境温度控制在20℃-25℃，湿度控制在60％以下。
实施例5
同实施例1，区别在于所述第一基质、第二基质分别为聚乙烯醇和丙三醇，具体步骤如下：
一种兽用子宫注入剂，按100ml计，由以下组分组成：利福昔明自微乳5g、吸附载体1g、生长修复因子(寡肽-1/蓝铜肽：胶原蛋白肽：透明质酸钠＝0.3：1：3)4.3g、聚乙烯醇13g、丙三醇0.65g、余量为注射用水；
其制备方法包括以下步骤：
(1)分别称取聚氧乙烯醚氢化蓖麻油(Cremophor RH 40)9.6g、二乙二醇单乙基醚(Transcutol P)48g放在涡旋混匀器中涡旋混匀，再将辛酸癸酸单甘油酯(Capmul MCM)38.4g加入到上述混合物中，涡旋混匀，得到空白自微乳，将4g的利福昔明溶解到所述空白自微乳中，制得利福昔明自微乳；
(2)将硅酸钙(FLORITE PS-10)、亲水型气相二氧化硅(AEROSIL 380)按质量比2：1置于方锥混合机中混合均匀，制得吸附载体混合物；
(3)将组方量90％的吸附载体置于配料罐中，加入组方量的利福昔明自微乳搅拌均匀，制得自微乳载药粒子；
(4)将组方量余量(10％)的吸附载体置于置于方锥混合机中，加入组方量的生长修复因子搅拌均匀，制得生长修复因子载药粒子；
(5)将组方量的聚乙烯醇、丙三醇、注射用水加入到涡旋混匀器中，在常温下混合搅拌至液体呈澄清溶胶状态后，加入所述自微乳载药粒子和所述生长修复因子载药粒子，涡流剪切10-15min，真空冷冻干燥，充氮密封，制得含量规格为0.2g：100ml利福昔明子宫注入剂冻干粉；冻干粉避光冷藏保存，使用时加入注射用水(100mL/份，按0.2g利福昔明/份计)溶解摇匀，待注入剂呈混悬水溶胶状态，子宫内灌注。
制备环境温度控制在20℃-25℃，湿度控制在60％以下。
对比例1(不含第一、第二基质)
一种兽用子宫注入剂，按100ml计，由以下组分组成：利福昔明自微乳余量、吸附载体0.1g、生长修复因子(寡肽-1/蓝铜肽：胶原蛋白肽：透明质酸钠＝0.3：1：3)4.3g；
其制备方法包括以下步骤：
(1)分别称取聚氧乙烯醚氢化蓖麻油(Cremophor RH 40)9.6g、二乙二醇单乙基醚(Transcutol P)48g放在涡旋混匀器中涡旋混匀，再将辛酸癸酸单甘油酯(Capmul MCM)38.4g加入到上述混合物中，涡旋混匀，得到空白自微乳，将4g的利福昔明溶解到所述空白自微乳中，制得利福昔明自微乳；
(2)将硅酸钙(FLORITE PS-10)、亲水型气相二氧化硅(AEROSIL 380)按质量比2：1置于方锥混合机中混合均匀，制得吸附载体混合物；
(3)将吸附载体置于置于方锥混合机中，加入组方量的生长修复因子搅拌均匀，制得生长修复因子载药粒子；
(4)在利福昔明自微乳中加入所述生长修复因子载药粒子，涡流剪切10-15min，即得利福昔明子宫注入剂。
制备环境温度控制在20℃-25℃，湿度控制在60％以下。
对比例2(不含第二基质)
一种兽用子宫注入剂，按100ml计，由以下组分组成：利福昔明自微乳5g、吸附载体1g、生长修复因子(寡肽-1/蓝铜肽：胶原蛋白肽：透明质酸钠＝0.3：1：3)4.3g、壳聚糖9g、余量为注射用水；
其制备方法包括以下步骤：
(1)分别称取聚氧乙烯醚氢化蓖麻油(Cremophor RH 40)9.6g、二乙二醇单乙基醚(Transcutol P)48g放在涡旋混匀器中涡旋混匀，再将辛酸癸酸单甘油酯(Capmul MCM)38.4g加入到上述混合物中，涡旋混匀，得到空白自微乳，将4g的利福昔明溶解到所述空白自微乳中，制得利福昔明自微乳；
(2)将硅酸钙(FLORITE PS-10)、亲水型气相二氧化硅(AEROSIL 380)按质量比2：1置于方锥混合机中混合均匀，制得吸附载体混合物；
(3)将组方量90％的吸附载体置于配料罐中，加入组方量的利福昔明自微乳搅拌均匀，制得自微乳载药粒子；
(4)将组方量余量(10％)的吸附载体置于置于方锥混合机中，加入组方量的生长修复因子搅拌均匀，制得生长修复因子载药粒子；
(5)将组方量的壳聚糖、注射用水加入到涡旋混匀器中，在常温下混合搅拌至液体呈澄清溶胶状态后，加入所述自微乳载药粒子和所述生长修复因子载药粒子，涡流剪切10-15min，真空冷冻干燥，充氮密封，制得含量规格为0.2g：100ml利福昔明子宫注入剂冻干粉；冻干粉避光冷藏保存，使用时加入注射用水(100mL/份，按0.2g利福昔明/份计)溶解摇匀，待注入剂呈混悬水溶胶状态，子宫内灌注。
制备环境温度控制在20℃-25℃，湿度控制在60％以下。
对比例3(不含生长修复因子)
一种兽用子宫注入剂，按100ml计，由以下组分组成：利福昔明自微乳5g、吸附载体0.9g、水溶性丝素蛋白10g、Gantrez AN 0.5g、余量为注射用水；
其制备方法包括以下步骤：
(1)分别称取聚氧乙烯醚氢化蓖麻油(Cremophor RH 40)9.6g、二乙二醇单乙基醚(Transcutol P)48g放在涡旋混匀器中涡旋混匀，再将辛酸癸酸单甘油酯(Capmul MCM)38.4g加入到上述混合物中，涡旋混匀，得到空白自微乳，将4g的利福昔明溶解到所述空白自微乳中，制得利福昔明自微乳；
(2)将硅酸钙(FLORITE PS-10)、亲水型气相二氧化硅(AEROSIL 380)按质量比2：1置于方锥混合机中混合均匀，制得吸附载体混合物；
(3)将吸附载体置于配料罐中，加入组方量的利福昔明自微乳搅拌均匀，制得自微乳载药粒子；
(4)将组方量的水溶性丝素蛋白、Gantrez AN、注射用水加入到涡旋混匀器中，在常温下混合搅拌至液体呈澄清溶胶状态后，加入所述自微乳载药粒子和所述生长修复因子载药粒子，涡流剪切10-15min，真空冷冻干燥，充氮密封，制得含量规格为0.2g：100ml利福昔明子宫注入剂冻干粉；冻干粉避光冷藏保存，使用时加入注射用水(100mL/份，按0.2g利福昔明/份计)溶解摇匀，待注入剂呈混悬水溶胶状态，子宫内灌注。
制备环境温度控制在20℃-25℃，湿度控制在60％以下。
实验例
(一)加速稳定性实验
以制剂质量标准草案为基础，依据中国兽药典2020版附录中《兽药稳定性试验指导原则》对实施例1~实施例5、对比例1~对比例3进行了加速稳定性试验，对常规包装规格制剂样品的性状及含量等进行了考察和测定。
将实施例1~实施例5、对比例1~对比例3装入市售包材(玻璃瓶)中，密封，置于室温25℃条件下留样考察6个月，第1个月、2个月、3个月、6个月取样考察。
加速稳定性实验结果如下表所示：
结果表明：
(1)实施例1、实施例5、对比例2、对比例3加速稳定性良好，稳定性优劣排序为：实施例1、实施例5、对比例2、对比例3＞实施例3＞实施例4＞实施例2＞对比例1。
(2)实施例3(吸附载体为亲水型气相二氧化硅)加速6个月复溶后显微镜下可见有少量析出的利福昔明晶体分散于水溶胶中，而实施例1、实施例5、对比例2、对比例3吸附载体均是质量比例2：1的硅酸钙与亲水型气相二氧化硅的混合物，说明硅酸钙的吸附容量更大，能吸附更多的自微乳，因此吸附载体优选硅酸钙与亲水性气相二氧化硅的组合；由实施例1、实施例5、对比例2、对比例3的加速稳定性数据可发现，吸附载体可有效保护利福昔明自微乳，能提高利福昔子宫注入剂冻干粉及其复溶的直接灌注子宫注入剂的稳定性。
(3)实施例4(吸附载体为微晶纤维素)加速3月开始复溶后出现结块，加速6月复溶后可见有较多大小不一的小团块沉积在瓶底，难以形成水溶胶状，显微镜下观察可见有析出的利福昔明晶体粉末，说明相比亲水型气相二氧化硅和硅酸钙，微晶纤维素吸附容量较小，冻干复溶后的再分散性、助悬性也较差。
(4)实施例2(不含吸附剂)因为缺少吸附剂的保护，利福昔明自微乳直接分散于水溶胶体系中，从加速第2个月起复溶后出现分层现象，加速时间越长，分层现象越明显，而且子宫注入剂冻干粉中利福昔明含量也明显降低，说明吸附剂对子宫注入剂冻干粉制剂与其有效成分的稳定性都有关键性作用。
(5)对比例1(自微乳给药体系)是混悬生长修复因子载药粒子的利福昔明自微乳制剂，自微乳可提高利福昔明溶解度并提高生物利用度，但从制剂性状和有效成分降解情况可发现对比例1的加速稳定性相对较差，推算对比例1的利福昔明子宫注入剂贮存有效期是最短的。
(二)触变性-相变温度和相变时间
采用试管倒置法检测本发明子宫注入剂的相变温度和相变时间。
1、相变温度：取液体状态的子宫注入剂25ml至小瓶，小瓶置于集热式磁力加热搅拌器中，以1℃*5min-1的速率缓慢升温，升温范围为25℃~50℃，水银温度计记录温度，通过小瓶颠倒法测定小瓶内液体凝固时的温度T。
实验结果如下表所示：
结果表明：
(1)实施例1、实施例3、对比例3的子宫注入剂在低温下(25℃-32℃)呈混悬水溶胶状态，在37℃条件下，变为混悬水凝胶结构，倒置不流动，其相变温度为37℃，能符合子宫注入剂灌注到体内(约38℃~39℃)则触变成水凝胶的研发目标。
(2)与实施例1相比，对比例2仅用水溶性丝素蛋白制成水凝胶基质，但相变温度与实施例1相近(约38℃)。
(3)与实施例1相比，实施例2的载药自微乳和生长修复因子直接被分散于水溶胶体系中，这导致实施例2的相变温度变成40℃，实施例2的液态子宫注入剂灌注到子宫内依然可以触变成水凝胶，但水凝胶的黏稠度相对较低。
(4)与实施例1相比，实施例4的吸附载体更换为微晶纤维素，其相变温度变成34℃，这可能会导致子宫注入剂在灌注过程中易受气温影响，子宫注入剂在用输精管灌注过程中就已部分凝固，堵塞输精管，灌注操作无法继续进行，严重影响产品的使用可执行性。
(5)与实施例1相比，实施例5的水凝胶基质不同导致液态子宫注入剂在31℃时则变为混悬水凝胶结构，与实施例4同理，这会严重影响产品的使用可执行性。
(6)对比例1的子宫注入剂没有温敏触变性，这导致该制剂在奶牛子宫内粘附性较差。
2、相变时间：将3份装有25ml水溶胶状态的子宫注入剂的玻璃管置于38.5℃恒温水浴锅中，观察子宫注入剂的变化。当将玻璃管倒置后，子宫注入剂不再流动，则认为该液体形成水凝胶，所需的最短时间为凝胶化时间。
3份子宫注入剂凝胶时间实验结果如下表所示：
结果表明，实施例1、实施例3、实施例4和对比例2、对比例3的液态子宫注入剂在38.5℃条件下变成水凝胶状态的时间相近，实施例5的平均成凝胶时间较短(约27s)，这些液态子宫注入剂灌注到奶牛子宫后均能均匀分散并形成水凝胶黏附在子宫黏膜上发挥药效，而实施例2的成凝胶时间较长，可能会与对比例1的子宫注入剂一样，注入奶牛子宫后可流动的液态子宫注入剂会沉积在子宫底部，不能均匀分散在整个子宫黏膜上。
(三)注入剂对伤口贴合度测试
评价注入剂凝胶对组织的粘附性和贴合程度的测试方法，选取大鼠，腹腔注射麻药麻醉后，剃除背部毛发，用剪刀剪出直径为1cm的圆形伤口，将液态的子宫注入剂注射进圆形伤口，通过不同的形变观察水凝胶对伤口的贴合程度。
结果表明：
(1)无论是用镊子横向、纵向拉扯伤口，还是实验员双手分别抓住大鼠头部和两后腿扭曲大鼠身体拉扯伤口，在不同形变作用下，实施例1、实施例3、实施例4、对比例3的水凝胶在大鼠伤口上粘附性能良好，未观察到水凝胶与组织之间的脱离或开裂，证明水凝胶有很好的贴合作用，对组织有良好的粘附特性和封闭伤口的作用；
(2)在不同形变作用下，可见实施例2、对比例2的水凝胶与大鼠伤口上的组织之间有少许脱离；
(3)实施例5的水凝胶成膜性最好、粘附性最好；
(4)对比例1的液态子宫注入剂不能在伤口处形成水凝胶。
(四)体外降解性能测试
测试方法：取5份相同重量、相同体积的注入剂凝胶块分别浸泡在含有鸡蛋清溶菌酶(10mg/mL)的PBS中，38.5℃恒温，观察水凝胶在PBS中状态，直至完全降解，记录时间。
5份水凝胶块体外降解时间结果如下表所示：
结果表明，实施例1、实施例3、实施例4和对比例3的液态子宫注入剂形成的水凝胶会随时间增加缓慢降解，大约18h可以降解完全，实施例2和对比例2的水凝胶降解较快，约16h可降解完全，这几个配方均可符合利福昔明子宫注入剂“弃奶期0日”的休药期要求，而实施例5的水凝胶块整整1天(24h)还没能降解完全，休药期不合格，但约32h也可降解完全。
(五)组织相容性和体内降解性测试
测试方法：选取健康成年雄性SD大鼠，自由进水进食，维持一定的环境温度和湿度，使其适应环境。在大鼠背部皮下注射0.5mL本发明制得的液态子宫注入剂后，分别于0h、3h、6h、10h、14h、18h、22h观察注射部位周围组织的反应情况。
实验结果：在大鼠背部皮下注射液态子宫注入剂后常规观察结果表明，实施例1~实施例5和对比例1~对比例3的液态子宫注入剂在体内形成的凝胶的生物相容性良好，注入初期未见明显的包囊、毛细血管充血等组织炎症反应，与皮下组织交互性良好，各凝胶块在皮下组织的降解时间与“体外降解性能测试”结果基本一致，对比例1(自微乳给药体系)的子宫注入剂约6min即可被皮下组织完全吸收。
由此可见，除了实施例5在体内形成的水凝胶降解时间太长外，其他4个实施例制得的子宫注入剂都具有良好的组织相容性和生物降解性，说明本发明制成的子宫注入剂在体内的水凝胶可被组织吸收利用，而且不加入第二基质和生长修复因子(对比例2和对比例3)并不会影响其水凝胶块在体内的组织相容性，另外，自微乳给药体系(对比例1)可快速被组织吸收、发挥药效。
(六)刺激性评价方法
前面5个实验结果表明，实施例1是利福昔明子宫注入剂冻干粉的最佳配方，而对比例1和对比例2的配方均是实施例1配方中减少一种物料组成的，因此可推断对比例1和对比例2的刺激性比实施例1小，所以选取实施例1和对比例1作为代表配方进行刺激性评价。
雌性成年健康普通级新西兰兔28只，随机分成染毒组与对照组，无子宫炎症状，无发情表现。
染毒组以正常推荐剂量的1倍、3倍和5倍剂量将液态利福昔明子宫注入剂，用钝性针头将药液灌注至阴道内，每隔48小时重复一次，连用3次；对照组用生理盐水0.2ml/kg进行相同操作。
观察雌性家兔阴道内灌注利福昔明子宫注入剂后全身状况及局部反应：包括是否有疼痛、不安，流出浑浊分泌物，阴部局部红肿等。
在家兔最后一次给药后24h，采用空气栓塞法处死家兔，解剖取出阴道标本，纵向切开，肉眼观察阴道粘膜有无充血、红肿、分泌物增多、糜烂等刺激表现。按阴道粘膜刺激反应评分表和阴道粘膜刺激强度评价表进行阴道粘膜刺激反应评分及刺激强度评价。
阴道粘膜刺激反应评分表如下：
阴道粘膜刺激强度评价表如下：
平均分值 评价
0～0.4 无刺激性
0.4～1.5 轻度刺激
1.51～2.5 中度刺激性
>2.5 重度刺激性
所述注入剂对家兔阴道粘膜肉眼观察刺激反应强度评价结果如下表所示。
试验结果显示：
(1)用药期间，三组家兔全身状况均未见异常，阴道口也未见明显充血、红肿及异常分泌物流出；
(2)肉眼观察取出的阴道组织，对照组未见阴道粘膜充血、水肿及出血点，实施例1染毒组仅有1份阴道样本有轻度充血、少量分泌物，两组阴道粘膜刺激指数在0~0.4，说明实施例1制得的液态子宫注入剂对家兔阴道黏膜刺激强度为无刺激性，而对比例1的阴道粘膜刺激指数为0.5，说明对比例1的液态子宫注入剂为轻度刺激，与实施例1相比，刺激性较大。
(3)3倍和5倍剂量的实施例1、对比例1利福昔明子宫注入剂对阴道粘膜的刺激性均较小，呈现轻度刺激。
综上所述，实施例1与对照组刺激性相似，比对比例1刺激性更小。
(七)药效实验
1、本发明所述利福昔明子宫注入剂灌注对奶牛乳汁残留检测
选取某大型奶牛养殖场9头确诊为患有子宫内膜炎且没使用过任何抗菌药物治疗的正产奶牛，子宫灌注本发明配方一所述利福昔明子宫注入剂。给药前(0h)采空白乳样，然后用灭菌子宫洗涤器将本发明所述液态利福昔明子宫注入剂100ml，输入至子宫角内，隔48h后(2天后同一时间)重复1次，共二次给药。于最后一次给药后的第1、4、8、12、16、20、24、32、48、60h分别采集乳样1000ml(每次在每个乳区采乳样250ml，将四个乳区采样后混合均匀)，进行HPLC分析，检测乳样中的利福昔明含量，乳样血药浓度与时间的数据结果如下表所示。
结果显示：
(1)患子宫内膜炎的奶牛子宫灌注实施例1、对比例1和对比例3的利福昔明子宫注入剂后，实施例1和对比例3乳中利福昔明动力学过程很相似，并类似于一级吸收一室开放模型，乳中利福昔明浓度低，在给药后16h乳中利福昔明浓度已降至接近最低定量限(方法定量限为0.05μg/ml)，给药后20h乳中均未测得利福昔明，已低于乳中最高残留限量0.06μg/ml，说明实施例1符合休药期要求，而且不加生长修复因子(对比例3)并不会影响乳中利福昔明动力学过程。
(2)数据显示对比例1(自微乳给药体系)1h或2h时乳样药物浓度已到达峰值，在给药8h后乳中利福昔明浓度仅测得0.06μg/ml(最高残留限量)，说明自微乳给药体系吸收快，降解也快，提示本发明的子宫注入剂(实施例1)发挥药效的时间比自微乳子宫注入剂更长。
综上所述，相比于自微乳直接给药，本发明制成的利福昔明子宫注入剂(实施例1)更有利于长时间发挥药效，却不会增加乳中药物残留的风险。
2、本发明所述利福昔明子宫注入剂对奶牛子宫内膜炎的治疗效果试验
试验药物：
本发明实施例1所述利福昔明子宫注入剂，规格100ml；
本发明对比例1所述利福昔明子宫注入剂，规格100ml；
本发明对比例3所述利福昔明子宫注入剂，规格100ml；
对照药物：氟苯尼考子宫注入剂，含量10％；
试验方法：
选取某大型奶牛养殖场77头确诊为子宫内膜炎的奶牛，随机分为11组，每组7头，分组与处理见试验分组及处理表。
各药物采用子宫灌注法处理，严格执行外阴清洗与消毒措施，一律采用输精枪塑料外套管作为投药导管，用后弃之防止个体患牛间交叉感染。
试验分组及处理表如下：
治疗效果判定：
(1)治愈(完全恢复)：阴道排出的粘液透明无异味，其他临床症状消失，恢复正常发情周期，正常配种并确定已妊娠，治疗前后对照；
(2)有效(明显好转)：子宫明显软化，收缩性强，其他症状减轻，但发情配种后未妊娠，治疗前后对照；
(3)无效(无明显好转)：与治疗前比较无明显变化，治疗前后对照；
(4)产后至初配日的间隔时间(天)：与空白对照组比较；
(5)痊愈受胎率：对治疗后判为痊愈的牛进行输精，统计情期内受胎率、一次情期受胎率和总受胎率。
所述利福昔明子宫注入剂对奶牛子宫内膜炎的临床治疗效果如下表所示：
空白对照组的7头患子宫内膜炎牛观察期为10天，病状没有任何好转。所有牛在观察期后立即应用药物进行治疗，防止影响生产。
从临床治疗效果可见，实施例1的利福昔明子宫注入剂高剂量灌注的治愈率和有效率均为85.7％，中剂量的治愈率和有效率分别为71.4％和85.7％，治疗效果明显优于低剂量组；对照药物氟苯尼考组的治疗效果与对比例3的利福昔明子宫注入剂中剂量相同，治疗效果比对比例1中剂量较好；治疗效果排序为：实施例1＞对照组＞对比例3＞对比例1＞空白组，但氟苯尼考灌注后对奶牛有一定刺激作用，表现为躁动不安。
(八)其他稳定性实验
上述实验结果可确定实施例1为本发明利福昔明子宫注入剂的最优组合，以制剂质量标准草案为基础，依据中国兽药典2020版附录中《兽药稳定性试验指导原则》对本发明的子宫注入剂冻干粉(实施例1)进行了温度试验、光照试验、高湿试验、长期稳定性试验，对常规包装规格制剂样品的性状、检查中的主要指标及含量等进行了考察和测定，根据考察结果推算有效期。
(1)温度稳定性试验
将本发明的制剂装入市售包材(玻璃瓶)中，密封，置于冰箱-15℃、4℃和室温25℃条件下留样考察30天，每隔5天取样考察。结果表明，本发明的制剂在上述条件下未见分层、变色等现象，复溶后没有明显结块、分层、析出现象，保持均匀的混悬水溶胶状，表明该制剂的温度稳定性好。
(2)光照试验
将本发明的制剂装入市售包材(玻璃瓶)中，密封，置于装有日光灯的光照箱或其他适宜的光照装置内，照度为4500±500lx的条件下放置10天，分别在第5天、10天取样。结果显示，本发明的制剂未见分层、变色等现象，复溶后没有明显结块、分层、析出现象，能保持均匀的水溶胶状，表明该制剂的光照稳定性好。
(3)高湿试验
将本发明的制剂装入市售包材(玻璃瓶)中，密封，置于25℃±2℃、相对湿度90％±5％的条件下放置10天，分别在第5天、10天取样考察。结果显示，本发明的制剂在上述条件下吸湿性符合要求，未发现结块、变色等现象，复溶后没有明显结块、分层、析出现象，保持均匀的水溶胶状，表明该制剂的高湿稳定性好。
(4)有效期
测定结果表明：本制剂在遮光、密闭，2℃-8℃条件保存有效期均超过24个月，暂定有效期为24个月。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (4)

1.一种兽用子宫注入剂的制备方法，其特征在于，依次包括以下步骤：
(1)制备利福昔明自微乳；
(2)将吸附载体与所述利福昔明自微乳混合，制得自微乳载药粒子；将吸附载体与生长修复因子混合，制得生长修复因子载药粒子；
(3)将第一基质、第二基质与注射用水混合，制得注射基质，将所述注射基质与所述自微乳载药粒子、所述生长修复因子载药粒子混合，制得所述子宫注入剂；
其中，所述利福昔明自微乳中利福昔明的浓度为4wt.％；
所述吸附载体为质量比例2：1的硅酸钙与亲水型气相二氧化硅的混合物；
所述生长修复因子为质量比例0.3：1：3的表皮细胞生长因子、胶原蛋白肽和透明质酸钠的混合物，所述表皮细胞生长因子为寡肽-1、蓝铜肽中的一种或两种；
所述第一基质为水溶性丝素蛋白；
所述第二基质为甲基乙烯基醚-马来酸酐共聚物；
所述利福昔明自微乳、所述吸附载体、所述生长修复因子、所述第一基质、所述第二基质的质量比例为5：1：4.3：10：0.5。
2.根据权利要求1所述的一种兽用子宫注入剂的制备方法，其特征在于，还包括步骤(4)：将所述步骤(3)制得的所述子宫注入剂进行冷冻干燥。
3.一种兽用子宫注入剂，其特征在于，由权利要求1-2之一所述制备方法制备得到。
4.一种权利要求3所述兽用子宫注入剂在制备治疗奶牛子宫内膜炎的药物中的应用，其特征在于，将所述兽用子宫注入剂加入注射用水溶解摇匀，待注入剂溶液呈混悬水溶胶状态时进行子宫内灌注。
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