TWI682779B - 豬疾病疫苗用佐劑及其製備方法 - Google Patents

Abstract

本發明涉及一種豬疾病疫苗用佐劑，其係由至少包括：約1.0重量份至約10.0重量份之高分子聚合物；約0.1重量份至約30重量份之分散劑；約0.1重量份至約30重量份之界面活性劑；及約50重量份至約98重量份之溶劑所組成；其中該高分子聚合物為卡波姆934、卡波姆940、卡波姆941、卡波姆971、卡波姆 974、卡波姆980、卡波姆 981、及其組合中之一種或一種以上；該分散劑為PEG-9、PEG-32、PEG-100、PEG-200、PEG-400、PEG-600、PEG-800、及其組合中之一種或一種以上。

Description

豬疾病疫苗用佐劑及其製備方法

本發明係關於一種家畜疫苗用佐劑，特別是關於一種豬疾病疫苗用佐劑及其製備方法。

近年來，複雜的豬呼吸道病給許多豬場造成了嚴重的損失，造成豬群生長速度緩慢、飼料報酬降低、死亡率上升，推遲上市以及管理上惡性循環等嚴重的經濟損失。按目前疾病發展的形勢估計，呼吸道疾病仍將是影響養豬生產的主要疾病。豬場複雜的呼吸道病主要是病毒、細菌、支原體，以及飼養管理不良引起的混合感染和繼發感染，如豬繁殖與呼吸綜合徵、豬環狀病毒、支原體及其它病毒、細菌，以飼養管理不良引起的仔豬斷奶後多系統衰竭綜合徵、豬呼吸疾病綜合徵等，抗生素藥物雖然對病毒無效，但可控制或治療細菌和支原體的危害，從而防止或減少豬只發生繼發感染。因此，對於複雜的豬呼吸道疾病，應堅持預防為主，採取綜合性防制措施，除了改善飼養管理條件、環境控制、加強免疫接種、衛生消毒等方面做好工作外，有針對性的選擇適當的藥物進行預防，是豬場呼吸道疾病防治工作中一項重要而且有效的技術措施。

疫苗接種被認為是用來預防病毒感染動物之最有效且最具效率的方式。然而，至今仍有許多病毒性或細菌性疾病尚無可利用的疫苗，或還未能達到足夠的免疫作用。此外，許多疫苗因為其抗原效能太低或使用劣質佐劑、會產生嚴重副作用、穩定性低或是價格昂貴而不適用。因此，亟需研發出更有效的疫苗或相關佐劑產品。

很多傳染病控制計劃之基礎係藉由用活的微生物或經滅活的微生物或其產物進行疫苗接種來誘導專一性免疫。有效之疫苗接種程序容許在動物中形成針對專一抗原之免疫記憶能力，從而在日後與抗原接觸時在動物中引起快速且強烈的免疫反應。然而，有些抗原僅具有弱免疫原性。該等抗原可能無力誘導在日後攻毒時足以為動物提供有效保護之免疫反應，或可能需要投與助增免疫原性以提供有效保護之其他藥劑。

將抗原與稱為佐劑之物質混合後，一起注射於動物體內可增強免疫系統對抗原之免疫抗性，該稱為佐劑的物質係藉由直接作用於免疫系統或藉由修改抗原之藥物動力學特徵，來增強動物體對野外病毒的抵禦反應且藉此增加抗原與免疫系統的相互作用時間。

習知油包水(W/O)型油質疫苗是由抗原液、界面活性劑及礦物質油混合後，在高剪切力作用下製備而成。其免疫機理是在接種部位貯存一段時間，局部產生肉芽腫和炎症反應，吸引巨噬細胞、淋巴細胞等聚集以識別抗原，產生抗體。同時，緩慢擴散的油質佐劑使抗原輸送到二級淋巴器官的時間延長，不斷刺激機體的免疫系統，從而產生續期長、抗體水準高的免疫效力。雖然國內外疫苗生產廠家的生產工藝不斷改進，用油品質也不斷提高，但由於這種製劑的連續油相在注射部位有駐留的傾向，在不少的情形中，這種W/O型油質疫苗在接種部位附近產生大量肉芽腫，保護性抗體產生速度慢、易對動物屠體品質造成不良影響，並且在接種期間可能引起劇烈的疼痛。

另外，水包油(O/W)型佐劑疫苗具有注射部位顯現局部反應小且穩定性高的優勢，然而包含或者暴露在連續相中的抗原很快在注射部位分散和被體液酶分解，難以提供長期的保護性抗體，常常需要特 殊的免疫刺激劑和多次加強免疫，製備成本高，不被廣泛使用。

因此，各界殷切期盼開發出一種能夠增加免疫反應及效果、且能具有免疫反應持續力等解決傳統技術的問題點的佐劑。

有鑑於此，本發明人等經由潛心研究用於解決傳統技術問題點的各種可能方案，進而開發出一種不但能夠改善上述習用技術之問題點，而且針對現有技術的不足，提供一種豬疾病疫苗用佐劑。本發明的佐劑可以減少現有疫苗的用油量，加快被免疫動物相應抗體的產生速度，減少疫苗製備成本，至此乃完成本發明。

具體而言，根據本發明之一觀點可以提供一種豬疾病疫苗用佐劑，其係由至少包括：約1.0重量份至約30.0重量份之高分子聚合物；約0.1重量份至約30.0重量份之分散劑；約0.1重量份至約30.0重量份之界面活性劑；及約50.0重量份至約98.0重量份之溶劑所組成。

依據本發明之一觀點，可使用於本發明之豬疾病疫苗用佐劑之該高分子聚合物並未特別加以限定，舉例來說，例如可以是卡波姆934、卡波姆940、卡波姆941、卡波姆971、卡波姆 974、卡波姆980、卡波姆 981、及其組合中之一種或一種以上；較佳可以是卡波姆934、卡波姆940、卡波姆941、卡波姆971、卡波姆 974、及其組合中之一種或一種以上；更佳可以是卡波姆934、卡波姆940、卡波姆941、及其組合中之一種或一種以上；最佳可以是卡波姆934、卡波姆940、及其組合中之一種或一種以上。

依據本發明之一觀點，可使用於本發明之豬疾病疫苗用佐劑之該分散劑並未特別加以限定，舉例來說，例如可以是PEG-9、PEG-32、PEG-100、PEG-200、PEG-400、PEG-600、PEG-800、及其組合中之一種或一種以上；較佳可以是PEG-100、PEG-200、PEG-400、PEG-600、PEG-800、及其組合中之一種或一種以上；更佳可以是PEG-200、PEG-400、PEG-600、及其組合中之一種或一種以上；最佳可以是PEG-400、PEG-600、及其組合中之一種或一種以上。

又，在本發明的豬疾病疫苗用佐劑中，高分子聚合物、分散劑、界面活性劑、及溶劑的含量比例並未特別加以限定的，只要是在不違反本發明之觀點或不脫離本發明之精神的前提下，可以視需要而加以調整。

舉例來說，高分子聚合物之總含量一般是在約1.0重量份至約30.0重量份之範圍；較佳為在約1.0重量份至約25.0重量份之範圍，更佳為在約1.0重量份至約20.0重量份之範圍，更理想為在約1.0重量份至約15.0重量份之範圍，特佳為在約1.0重量份至約10.0重量份之範圍；最佳為在約2.0重量份至約8.0重量份之範圍。

又，分散劑之總含量一般是在約0.1重量份至約30.0重量份之範圍；較佳為在約0.1重量份至約20.0重量份之範圍，更佳為在約0.1重量份至約10.0重量份之範圍，特佳為在約0.5重量份至約5.0重量份之範圍；最佳為在約0.5重量份至約3.0重量份之範圍。

再者，界面活性劑之總含量一般是在0.1重量份至約30.0重量份之範圍；較佳為在約0.1重量份至約20.0重量份之範圍，更佳為在約0.1重量份至約10.0重量份之範圍，特佳為在約0.5重量份至約5.0重量份之範圍；最佳為在約0.5重量份至約3.0重量份之範圍。

在本發明之豬疾病疫苗用佐劑中，為了提高防止豬呼吸道疾病的感染或增加疫苗穩定性及效能而達到防疫之效果，可以使產品達到良好之功效。根據本發明之一觀點，在實際施用時，該豬疾病疫苗用佐劑(Adj)與豬疾病抗原液(Vat)的摻混比(Adg：Vat)為 1：10(v/v)～1：1(v/v))。例如，在本發明之該豬疾病疫苗用佐劑(Adj)與豬疾病抗原液(Vat)的摻混比之比例可以是在約1：10(v/v)～1：1(v/v)；在某些具體實施例中，較佳為在約1：8(v/v)～1：1(v/v)之範圍；更佳為在約1：6(v/v)～1：1(v/v) 之範圍；特佳為在約1：4(v/v)～1：1(v/v)之範圍；最好的為約在1：3(v/v)～1：1(v/v)之範圍。

依據本發明之一觀點，可使用於本發明之豬疾病疫苗用佐劑之該界面活性劑並未特別加以限定，舉例來說，例如可以是、聚氧乙烯脂肪醇、辛酸葵酸聚乙二醇甘油酯(Labrasol)、吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80、吐溫81、吐溫85、聚氧乙烯氫化蓖麻油、普朗尼克F-68、聚氧乙烯月桂醇醚等。根據本發明之某些具體實施例，該界面活性劑例如可以是自、聚氧乙烯脂肪醇、辛酸葵酸聚乙二醇甘油酯(Labrasol)、吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80、吐溫81、吐溫85、聚氧乙烯氫化蓖麻油、普朗尼克F-68、聚氧乙烯月桂醇醚中之至少一種；適用於本發明之界面活性劑較佳使用為、聚氧乙烯脂肪醇、辛酸葵酸聚乙二醇甘油酯(Labrasol)、吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80、吐溫81、吐溫85、聚氧乙烯氫化蓖麻油、普朗尼克F-68、或聚氧乙烯月桂醇醚；更佳使用為、聚氧乙烯脂肪醇、辛酸葵酸聚乙二醇甘油酯(Labrasol)、吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80、吐溫81、或吐溫85；特佳使用來源為辛酸葵酸聚乙二醇甘油酯(Labrasol)、吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80、吐溫81、或吐溫85。

依據本發明之一觀點，上述之豬疾病疫苗用佐劑係進一步包含約0.1重量份至約5.0重量份之離子調節劑；較佳為0.1重量份至約4.0重量份之離子調節劑；更佳為0.1重量份至約3.0重量份之離子調節劑；最佳為0.1重量份至約2.0重量份之離子調節劑。

依據本發明之一觀點，可使用於本發明之豬疾病疫苗用佐劑中之離子調節劑為氯化鈉、氯化鉀、磷酸鈉、磷酸鉀、及其組合中之至少一種。

根據本發明之一觀點，該豬疾病係由豬生殖與呼吸症候群病毒(PRRSV)、豬流行性感冒病毒(SIV)、假性狂犬病病毒(PRV)、第二型豬環狀病毒(PCV II)、及豬呼吸道冠狀病毒(PRCV)中之至少一種所引起。

依據本發明之一觀點，可使用於本發明之豬疾病疫苗用佐劑之該佐劑配合使用的抗原液並未特別加以限定，舉例來說，例如可以是死毒抗原、次單位抗原、核酸抗原。根據本發明之某些具體實施例，該抗原液來源例如可以是自死毒抗原、次單位抗原、核酸抗原、其衍生物、及彼等之混合物構成群組中所選出之至少一種；適用於本發明之抗原液較佳使用來源為死毒抗原、次單位抗原、或核酸抗原；更佳使用來源為次單位抗原。

依據本發明之一觀點，上述豬疾病疫苗用佐劑可以進一步含有緩衝劑；該緩衝劑並未特別加以限定，舉例來說，例如可以是磷酸鈉緩衝劑、磷酸鉀緩衝劑、Tris-HCl緩衝劑。根據本發明之某些具體實施例，該緩衝劑來源例如可以是自磷酸鈉緩衝劑、磷酸鉀緩衝劑、Tris-HCl緩衝劑、檸檬酸鈉-磷酸鹽緩衝劑、兩性離子緩衝劑、Hepes緩衝劑、馬來酸鹽緩衝劑、其衍生物、及彼等之混合物構成群組中所選出之至少一種；適用於本發明之緩衝劑較佳使用來源為磷酸鈉緩衝劑、磷酸鉀緩衝劑、Tris-HCl緩衝劑、檸檬酸鈉-磷酸鹽緩衝劑、兩性離子緩衝劑、Hepes緩衝劑、或馬來酸鹽緩衝劑；更佳使用來源為磷酸鈉緩衝劑、磷酸鉀緩衝劑、Tris-HCl緩衝劑、檸檬酸鈉-磷酸鹽緩衝劑、或兩性離子緩衝劑；特佳使用來源為磷酸鈉緩衝劑、磷酸鉀緩衝劑、檸檬酸鈉-磷酸鹽緩衝劑、或兩性離子緩衝劑。

具體而言，根據本發明之一觀點可以提供一種豬疾病疫苗用佐劑之製備方法： (a)    將約3.0重量份至約10.0重量份之高分子聚合物、約0.5重量份至約5.0重量份之分散劑、及約85.0重量份至約95.0重量份之溶劑，以第一反應條件予以充分混合而形成分散液；(b) 將約0.5重量份至約5.0重量份之界面活性劑加入由上述(a)所得的該分散液中充分混合並於第二反應條件下形成豬疾病疫苗用佐劑。

根據本發明之一觀點，上述 (a) 第一反應條件包括於65℃~80℃之溫度下，攪拌轉速1200 rpm〜2400 rpm，進行反應1〜3小時後。

根據本發明之一觀點，上述(b) 第二反應條件包括於55℃~65℃之溫度下，攪拌轉速 800 rpm〜1200 rpm，進行反應2〜3小時。

根據本發明之一觀點，由上述製備方法所製得的佐劑之黏度為在0.5CP至2CP之間；較佳為在0.5CP至1.8CP之間；更佳為在0.5CP至1.5CP之間；最佳為在0.5CP至1.2CP之間。

據本發明之一觀點，由上述製備方法所製得的佐劑之粒徑大小為在0.5至5.0μm之間；較佳為在0.5至4.0μm之間；更佳為在0.5至3.0μm之間；較佳為在0.5至2.0μm之間；最佳為在0.5至1.0μm之間。

以下，針對本發明的實施態樣列舉不同的具體實施例而更加詳盡地敘述與說明，以便使本發明的精神與內容更為完備而易於瞭解；然而，本項技藝中具有通常知識者應當明瞭本發明當然不受限於此等實例而已，亦可利用其他相同或均等的功能與步驟順序來達成本發明。

此外，藉由下述具體實施例，可進一步證明本發明可實際應用之範圍，但不意欲以任何形式限制本發明之範圍。

首先，對於本說明書中所使用的特定用語或名詞進行描述性的說明；然而，下列說明僅為例示性說明，非作為限制本發明說明書及申請專利範圍。除非本說明書另有定義以外，在本文中所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。

如本文中所使用，"疫苗"為可用於在接受者中誘發保護性免疫之組合物。因此，在受檢者已接種抗原之後，疫苗可預防、延緩或減輕曝露於相同或相關抗原之受檢者的疾病發展之嚴重程度(相對於未接種疫苗之受檢者)。藉由疫苗所提供之保護性免疫可為體液(抗體介導)免疫或細胞免疫，或兩者。例如，疫苗接種可消除或降低病原體或受感染細胞之負荷，或產生任何其他可量測之感染減輕。疫苗接種亦可降低已免疫(已接種疫苗)之受檢者的腫瘤負荷。

如本文中所使用，術語"保護性免疫"係指當受檢者已曝露於抗原，從而在受檢者中引起免疫反應(主動/後天或被動/先天，或兩者)時抵禦抗原所獲得的免疫力，從而使抗原失活及/或降低抗原負荷且形成免疫記憶(例如記憶T細胞或B細胞)。

藉由疫苗接種所提供之保護性免疫可能為部分的或僅在一部分已接種疫苗之受檢者中提供。因此，疫苗可在一部分免疫群體中誘發保護性免疫，因為有些個體可能無力建立強免疫反應或保護性免疫反應或(在有些情況下)任何免疫反應。此能力不夠可能歸因於個體的遺傳背景或歸因於免疫缺乏病狀(後天或先天性)或免疫抑制(例如，由於經化學療法治療或使用免疫抑制藥物以例如預防器官排斥反應或抑制自體免疫病狀)。向一部分免疫群體提供保護之疫苗仍然適用且視為有效。

如本文中所使用，術語"佐劑"係指當連同抗原投與時，使受檢者對彼抗原之免疫反應增強的化合物。

在本文中，對於用以界定本發明範圍的數值與參數，本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差，因而大多是以約略的數量值來表示，然而於具體實施例中則盡可能精確呈現的相關數值。在本文中，「約」通常視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定，一般係指代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，例如，該實際數值為在一特定數值或範圍的±10%、±5%、±1%、或±0.5%以內。

接著，以下結合具體實施例對本發明做進一步說明。

在以下實施例及實驗中所使用的主要材料說明如下：豬呼吸道疾病抗原為採用台灣國年實業有限公司所製作的豬第二型環狀病毒(PCV2)的ORF2蛋白；高分子聚合物為採用為採用Lubrizol公司生產的Carbopol 934P、Carbopol 940；分散劑為採用BASF公司生產的PEG 400； 介面活性劑為採用SIGMA公司生產的吐溫80；其他未提及之材料皆為市售可得的。   《製備豬疾病疫苗用佐劑》 《製備例1》

首先，將90.0wt%的清水、5.0wt%的Carbopol 934P、1.0wt%的PEG-400、 PEG-600、1.0wt%的磷酸鈉、0.5wt%的氯化鈉、及0.5wt%的氯化鉀，一起加入調配瓶中，利用攪拌機在無菌環境下，溫度65℃下，振幅20mm，攪拌轉速1200 rpm，持續攪拌60分鐘，充分混合後得分散液M1。

接著，如表1所示，將2.0wt%的吐溫80加入分散液M1中，在無菌環境下於室溫下先行均勻攪拌2小時；繼續利用超高速均質機以800 rpm，振幅14 mm、55℃均質攪拌1小時，測得pH值為7.25，然後經由冷凝降溫而得到本發明的豬疾病疫苗用佐劑(S1)。   《製備例2》

首先，將92.0wt的清水、2.5wt%的Carbopol 934P、2.5wt%的Carbopol 940、1.0wt%的PEG-400、0.5wt%的PEG-600、及0.5wt%的氯化鈉，一起加入調配瓶中，利用攪拌機在無菌環境下，溫度70 ℃下，振幅22 mm，攪拌轉速1600 rpm，反應進行80分鐘，充分混合後得分散液M2。

接著，如表1所示，將1.0wt%的吐溫80加入分散液M2中，在無菌環境下於室溫下先行均勻攪拌2.2 小時；繼續利用超高速均質機以 900 rpm，振幅 16 mm、60 ℃均質攪拌1.2 小時，測得pH值調整為6.92，然後經由冷凝降溫而得到本發明的豬疾病疫苗用佐劑(S2)。   《製備例3》

首先，將93.0wt%的清水、4.5wt%的Carbopol 934P、1.0wt%的PEG-400，一起加入調配瓶中，利用攪拌機在無菌環境下，溫度 75 ℃下，振幅23 mm，攪拌轉速2000 rpm，反應進行120分鐘，充分混合後得分散液 M3。

接著，如表1所示，將1.5wt%的吐溫80加入分散液M3，在無菌環境下於室溫下先行均勻攪拌2小時；繼續利用超高速均質機以 1000 rpm，振幅17 mm、62 ℃均質攪拌1小時，測得pH值為6.8，然後經由冷凝降溫而得到本發明的豬疾病疫苗用佐劑(S3)。   《製備例4》

首先，將88.5wt%的清水、5.5wt%的Carbopol 940、1.0wt%的PEG-400、1.0wt%的PEG-600、0.5wt%的磷酸鈉、1.0wt%的氯化鈉、及1.0wt%的氯化鉀，一起加入調配瓶中，利用攪拌機在無菌環境下，溫度80 ℃下，振幅 25 mm，攪拌轉速 2400 rpm，反應進行180分鐘，充分混合後得分散液M4。

接著，如表1所示，將1.5wt%的吐溫80加入分散液M4中，在無菌環境下於室溫下先行均勻攪拌1小時；繼續利用超高速均質機以1200 rpm，振幅18 mm、65℃均質攪拌2小時，測得pH值為7.27，然後經由冷凝降溫而得到本發明的豬疾病疫苗用佐劑S4。

表1

組成分	製備例1	製備例2	製備例3	製備例4
高分子聚合物	Carbopol 934P(wt%)	5.0	2.5	2	0
Carbopol 940(wt%)	0	2.5	2.5	5.5
分散劑	PEG-400(wt%)	2.0	1.0	0.5	1.0
PEG-600(wt%)	0	0.5	0.5	1.0
界面活性劑	Tween 80(wt%)	1.0	1.0	1.5	1.5
離子調整劑	磷酸鈉(wt%)	1.0	0	0	0.5
氯化鈉(wt%)	0.5	0.5	0	1
氯化鉀(wt%)	0.5	0	0	1
溶劑	水(wt%)	90.0	92.0	93.0	88.5
豬疾病疫苗用佐劑	S1	S2	S3	S4
外觀狀態	乳白色液體
黏度(CP)	0.7	1.2	0.8	0.9
pH值	7.25	6.92	6.8	7.27
平均粒徑(μm)	0.8	0.76	0.81	0.75

《實施例1-4》

將豬疾病疫苗用佐劑S1~S4如表2所示之比例放於2000毫升燒杯中，再來將乳化均質機放入燒杯中，讓豬呼吸道疾病病疫苗用佐劑S1~S4覆蓋乳化均質機的攪拌棒達2/3(約15公分)，轉動乳化均質機的高速剪切力至3000rpm緩緩將病毒抗原懸浮液加入轉動中的佐劑S1〜佐劑S4中；最後，當抗原都加完時可將轉速調成5000rpm，在進行最後攪拌時間五至十分鐘，進而製得含本發明之豬疾病疫苗用佐劑之疫苗V1至V4，其中疫苗V1至V4中之ORF2蛋白的濃度為50μg/2ml。

表2

	實施例1	實施例2	實施例3	實施例4
病毒抗原懸浮液(ml)	350	350	350	350
佐 劑	S1(ml)	150	100	50	0
S2(ml)	0	50	50	50
S3(ml)	0	0	50	0
S4(ml)	0	0	0	100
含本發明之豬疾病疫苗用佐劑之疫苗	V1	V2	V3	V4

接著，將含有本發明之豬疾病疫苗用佐劑之疫苗V1至V4分別進行疫苗穩定性試驗、疫苗抗體水平試驗、及疫苗安全性試驗，並與含有市售佐劑之疫苗進行比較；其中比較例1為使用以市售白油佐劑配製而成的疫苗P1、比較例2為使用以市售水包油包水劑型佐劑配製而成的疫苗P2。

《疫苗穩定性試驗》

將實施例1-4所製得之含本發明之豬疾病疫苗用佐劑之疫苗V1至V4、以市售白油佐劑配製而成的疫苗P1、和以市售水包油包水劑型佐劑配製而成的疫苗P2分別放置在4°C、20°C、及37°C的環境中，觀察放置到90天後的疫苗的外觀變化，並將結果分別記載於表3中。其中○表示疫苗液外觀正常，△表示疫苗液有少量析出，×表示疫苗液有大量析出並有分層現象。

表3

	比較例1	比較例2	實施例1	實施例2	實施例3	實施例4
疫苗來源	P1	P2	V1	V2	V3	V4
4°C	7天	○	○	○	○	○	○
14天	○	○	○	○	○	○
28天	○	○	○	○	○	○
60天	△	○	○	○	○	○
90天	△	△	○	○	○	○
20°C	7天	○	○	○	○	○	○
14天	○	○	○	○	○	○
28天	○	○	○	○	○	○
60天	○	○	○	○	○	○
90天	△	△	○	○	○	○
37°C	7天	○	○	○	○	○	○
14天	○	○	○	○	○	○
28天	△	○	○	○	○	○
60天	×	△	○	○	○	○
90天	×	×	○	○	○	○

由上述表3之結果可知，含有本發明之豬疾病疫苗用佐劑之疫苗V1至V4，不論是在4℃、20℃、或是37℃的環境中存放達到90天都可以維持穩定的狀態，反觀以市售佐劑製備的P1、及P2，在長時間存放時容易受到溫度的影響而使得有析出或分層等不穩定的現象發生。

《疫苗抗體水平試驗》

在本試驗中，將35頭21-25日齡的無特定病原豬隻(specific  pathogen free, SPF)隨機平均分爲空白組、比較例1、比較例2、實施例1、實施例2、實施例3、及實施例4，共七組，並於豬隻的頸部肌肉接種2ml之樣品，其中空白組為使用PBS，比較例1為使用以市售白油佐劑配製而成的疫苗P1、比較例2為使用以市售水包油包水劑型佐劑配製而成的疫苗P2、實施例1至4則是使用含本發明之豬疾病疫苗用佐劑之疫苗V1至V4。

在接種前和接種後之第2、4、6、8、12、及16周對每組猪隻採血，並分離出血清後使用酵素免疫分析法(ELISA)檢測抗體水平。在ELISA Reader上測定各孔的OD _630nm值，並將各組的平均數值記錄於表4中。

表4

	空白組	比較例1	比較例2	實施例1	實施例2	實施例3	實施例4
疫苗來源	PBS	P1	P2	V1	V2	V3	V4
接種前	0.1535±0.0552	0.1240±0.0511	0.1358±0.0555	0.1238±0.0558	0.1352±0.0524	0.1125±0.0508	0.1285±0.0547
第2周	0.1247±0.0415	0.4153±0.1825	0.4251±0.1942	0.9841±0.0455	0.9241±0.0414	0.8647±0.0357	0.8745±0.0366
第4周	0.1574±0.0413	0.9825±0.1931	0.8551±0.2973	1.3415±0.0268	1.2934±0.0358	1.2814±0.0247	1.3046±0.0476
第6周	0.1366±0.0305	1.3588±0.2909	1.3541±0.3825	1.6825±0.0298	1.5781±0.0274	1.5874±0.0497	1.6172±0.0282
第8周	0.1625±0.0385	1.4411±0.1992	1.3681±0.2845	1.9938±0.0422	1.8425±0.0287	1.8842±0.0435	1.8158±0.0437
第12周	0.1524±0.0346	1.2107±0.3893	1.1581±0.1873	1.9885±0.0447	1.8354±0.0399	1.8876±0.0311	1.8274±0.0343
第16周	0.1544±0.0336	0.9124±0.2801	0.8978±0.1941	1.5873±0.0378	1.5214±0.0205	1.5256±0.0386	1.5579±0.0368

由上述表4之結果可知，實施例1至4的OD _630nm值在第2周後皆能達到0.85以上，明顯高於比較例1及比較例2的OD _630nm值，顯示含有本發明之豬疾病疫苗用佐劑之疫苗V1至V4在豬隻體內產生抗體的速度優於含有市售佐劑的疫苗P1及P2。再者，比較各組OD _630nm最大值，實施例1至4的OD _630nm最大值依序分別為1.9938、1.8425、1.8842、及1.8158，而比較例1及比較2的OD _630nm最大值則分別為1.4411及1.3681，顯示含有本發明之豬疾病疫苗用佐劑之疫苗V1至V4在豬隻體內產生的最高抗體水平可較含有市售佐劑的疫苗提升至少26%以上。

另外，接種後第12周實施例1至4的OD _630nm值仍維持在接近最大值之數值，且在接種後第16周亦皆維持在1.5以上，反觀比較例1及比較例2的OD _630nm值到第12周時已大幅下降，到第16周時更已分別降至0.9124及0.8978，顯示含有本發明之豬呼吸道疾病疫苗用佐劑之疫苗V1至V4在豬隻體內具有緩釋的效果，能夠延長抗體在豬隻體內的時間，進而提升疫苗的有效性。

再者，比較各組平均數值的標準差值可知，比較例1及比較例2各組在接種疫苗後的OD _630nm值之標準差值皆在0.15以上，而實施例1至4各組在接種疫苗後的OD _630nm值之標準差值皆在0.1以下；顯示相較於含有市售佐劑的疫苗P1及P2，含有本發明之豬疾病疫苗用佐劑之疫苗V1至V4在不同豬隻體內所產生的抗體水平較為平均，產生抗體的效果不會因為豬隻個體改變而受到影響。

《疫苗安全性試驗》

將上述空白組、比較例1、比較例2、實施例1、實施例2、實施例3、及實施例4中之各豬隻接種樣品後，量測7天內各組豬隻的體溫並將平均數值記錄於表5；另外，觀察7天內各組豬隻的局部反應、精神變化、食慾，及生長狀況，並將結果紀錄於表5。

表5

	空白組	比較例1	比較例2	實施例1	實施例2	實施例3	實施例4
疫苗來源	PBS	P1	P2	V1	V2	V3	V4
接種前體溫	38.5	38.7	38.6	38.8	38.7	38.5	38.6
接種後體溫	1日	38.7	39.1	39.9	39.1	39.2	38.8	39.4
2日	39.1	40.1	39.8	39.1	39.0	39.1	39.2
3日	38.4	39.7	39.8	39.0	39.1	39.0	39.1
4日	38.9	39.6	39.4	38.7	38.9	38.7	38.9
5日	39.3	39.2	39.2	38.9	38.5	38.5	39.0
6日	39.1	39.1	39.0	38.8	38.6	38.6	38.7
7日	39.2	38.9	38.8	38.5	38.6	38.7	38.8
局部反應	無	輕微 發炎	無	無	無	無	無
精神變化	正常	正常	正常	正常	正常	正常	正常
食慾	正常	正常	正常	正常	正常	正常	正常
生長狀況	正常	正常	正常	正常	正常	正常	正常

由上述表5所示之結果可知，實施例1至4的豬隻不論是在接種後體溫、局部反應、精神變化、食慾、或是生長狀況皆維持在正常的狀態，並沒有出現任何由疫苗免疫而引起的不良反應，顯示使用本發明之豬疾病疫苗用佐劑所製成的疫苗具有優良的安全性，不會影響豬隻的健康。

從而，可以確認經施打使用本發明之豬疾病疫苗用佐劑之疫苗的豬隻能夠增加免疫保護能力，進而具有對抗豬呼吸道疾病感染之優異的效果。所以，本發明之豬疾病疫苗用佐劑能夠明顯地提高豬隻的免疫力及免疫細胞增殖，增強疫苗對豬隻在疾病上誘發保護性免疫反應。

綜上所述，本發明的內容已經以如上的實施例舉例說明了，然而本發明並非僅限定於此等實施方式而已。本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可再進行各種的更動與修飾；例如，將前述實施例中所例示的各技術內容加以組合或變更而成為新的實施方式，此等實施方式也當然視為本發明所屬內容。因此，本案所欲保護的範圍也包括後述的申請專利範圍及其所界定的範圍。

圖1為顯示本發明中之疫苗抗體水平試驗的比較示意圖。

無。

Claims (8)

1. 一種豬疾病疫苗用佐劑，其係適用於含有次單位抗原的疫苗，該佐劑的構成至少包括：約1重量份至約10.0重量份之高分子聚合物；約0.5重量份至約5.0重量份之分散劑；約0.5重量份至約5.0重量份之界面活性劑；及約50重量份至約98重量份之溶劑；其中該高分子聚合物為卡波姆934、卡波姆940、卡波姆941、卡波姆971、卡波姆974、卡波姆980、卡波姆981、及其組合中之至少一種；該分散劑為PEG-9、PEG-32、PEG-100、PEG-200、PEG-400、PEG-600、PEG-800、及其組合中之至少一種。
2. 如請求項1所記載之豬疾病疫苗用佐劑，其中該界面活性劑係選自聚氧乙烯脂肪醇、辛酸葵酸聚乙二醇甘油酯(Labrasol)、吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80、吐溫81、吐溫85、聚氧乙烯氫化蓖麻油、普朗尼克F-68、聚氧乙烯月桂醇醇醚中的至少一種。
3. 如請求項1所記載之豬疾病疫苗用佐劑，其中進一步包含約0.1重量份至約3重量份之離子調節劑。
4. 如請求項3所記載之豬疾病疫苗用佐劑，其中該離子調節劑為氯化鈉、氯化鉀、磷酸鈉、磷酸鉀、磷酸鋁、及其組合中之至少一種。
5. 一種豬疾病疫苗用佐劑之製備方法，其係包括以下步驟：(a)將約1.0重量份至約10.0重量份之高分子聚合物、約0.5重量份至約5.0重量份之分散劑、及約50.0重量份至約98.0重量份之溶劑，以第一反應條件予以充分混合而形成分散液； (b)將約0.5重量份至約5.0重量份之界面活性劑加入由上述(a)所得的該分散液中充分混合並於第二反應條件下形成豬呼吸道疾病疫苗用佐劑；其中該高分子聚合物為卡波姆(Carbomer)934、卡波姆(Carbomer)940、卡波姆(Carbomer)941、卡波姆(Carbomer)971、卡波姆(Carbomer)974、卡波姆(Carbomer)980、卡波姆(Carbomer)981、及其組合中之至少一種；該分散劑為PEG-9、PEG-32、PEG-100、PEG-200、PEG-400、PEG-600、PEG-800、及其組合中之至少一種；該第一反應條件包括於65℃~80℃之溫度下，攪拌轉速1200rpm~2400rpm，進行反應1~3小時；該第二反應條件包括於55℃~65℃之溫度下，攪拌轉速800rpm~1200rpm，進行反應2~3小時；以及該豬疾病疫苗用佐劑係適用於含有次單位抗原的疫苗。
6. 如請求項5所記載之豬疾病疫苗用佐劑之製備方法，其中步驟(a)進一步包含加入0.1重量份至約5.0重量份之離子調節劑。
7. 如請求項5所記載之豬疾病疫苗用佐劑之製備方法，其中該豬疾病疫苗用佐劑的黏度為在0.5CP至2.0CP之間。
8. 如請求項5所記載之豬疾病疫苗用佐劑之製備方法，其中該豬疾病疫苗用佐劑的粒徑大小為在0.5至5.0μm之間。

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