RU2805210C2 - Стабильные эмульсии бактериальных антигенов - Google Patents

Abstract

Группа изобретений относится к эмульсии для получения вакцины для рыбы, содержащей масляную фазу, водную фазу, эмульгатор и неживой бактериальный антиген, содержащий эстеразу, выбранную из Aeromonas salmonicida или Moritella viscosa, где эмульгатор представляет собой полимерный эмульгатор, который представляет собой блок-сополимер, имеющий общую формулу A-B-A, в которой компонент B представляет собой двухвалентный остаток водорастворимого полиалкиленгликоля и компонент A представляет собой остаток жирорастворимой комплексной монокарбоновой кислоты, также относится к способу производства В/М эмульсии, включающему этапы: a) смешивания масляной фазы и полимерного эмульгатора и b) эмульгирования смеси из этапа a) с водной фазой, при этом водная фаза содержит неживой бактериальный антиген, также относится к вакцине, используемой для защиты рыбы от инфекции или заболевания, вызываемого бактерией, выбранной из Aeromonas salmonicida или Moritella viscosa, которая содержит эмульсию, также относится к применению полимерного эмульгатора для получения эмульсии из масляной фазы, водной фазы и неживого бактериального антигена, содержащего эстеразу, выбранную из Aeromonas salmonicida или Moritella viscosa, и также относится к способу вакцинации рыбы от инфекции или заболевания, вызываемого бактерией, выбранной из Aeromonas salmonicida или Moritella viscosa, включающему введение указанному субъекту вакцины. Группа изобретений обеспечивает повышение стабильности эмульсии масла и воды с неочищенным бактериальным антигеном, выбранным из Aeromonas salmonicida или Moritella viscosa. 5 н. и 7 з.п. ф-лы, 5 пр., 5 табл., 3 ил.

Description

Настоящее изобретение относится к области вакцинологии, более конкретно, изобретение относится к бактериальным вакцинам. В частности, изобретение относится к эмульсиям с масляной и водной фазами, эмульгатором и неживыми бактериальными антигенами; к способам производства таких эмульсий; к вакцинам из таких эмульсий, к полимерному эмульгатору для использования в таких эмульсионных вакцинах, а также к способу вакцинации такими вакцинами.

Инфекции, вызываемые патогенными бактериями, и развивающиеся в результате заболевания известны с начала цивилизации, они поражают как людей, так и животных, часто оказывая серьезное воздействие на здоровье и самочувствие. С середины 20-го века бактериальные инфекции можно эффективно лечить антибиотиками, хотя возрастающая устойчивость бактерий является постоянной угрозой. Использование антибиотиков в животноводстве в сельскохозяйственном секторе является особой ситуацией: с одной стороны, существует острая необходимость в лечении из-за высокой распространенности инфекций вследствие используемых способов и условий содержания животных. С другой стороны, повсеместное не терапевтическое использование антибиотиков, например, в кормах для животных, в настоящее время признается одной из причин повышения устойчивости бактерий, что также влияет на здоровье человека. В результате, от такого повсеместного использования антибиотиков отказываются во все большем количестве стран мира.

Наряду с усовершенствованием управления фермами, лучшей альтернативой для борьбы с бактериальной инфекцией и заболеваниями на постоянной основе является вакцинация. Бактериальные вакцины, как для людей, так и для животных, хорошо известны более века, и доступны во многих формах. Такие вакцины могут быть живыми, то есть, содержать способные к репликации (ослабленные) бактерии, или неживыми, то есть, содержать инактивированные бактерии или бактериальные компоненты.

Для вакцин, содержащих неживые антигены, часто необходим иммунный стимулятор для оптимальной эффективности: адъювант. В качестве эксципиента такой адъювант должен быть фармацевтически приемлемым и экономически оправданным. Хорошо известными адъювантами являются соли алюминия и масла. Масляные адъюванты могут быть минеральными или не минеральными, при этом минеральные масла, как правило, разрешены только для использования в ветеринарии.

Для облегчения введения, и для усиления действия адъюванта, масляный адъювант может быть эмульгирован с антигеном в водной фазе, с образованием эмульсии, которая может быть использована для изготовления вакцины. В такой эмульсии одна жидкая фаза диспергирована в другой, как правило, в виде эмульсии типа вода-в-масле (В/М) или масло-в-воде (М/В). Выбор того или иного типа эмульсии может быть основан на типе желательного иммунного ответа.

Для создания и поддержания такой эмульсии необходим вклад как механической, так и химической, энергии: отдельные жидкости смешивают в соответствующем устройстве с использованием определенных уровней сдвиговой силы, давления и температуры для диспергирования одной жидкой фазы в другой. Химическая энергия обеспечивается использованием эмульгатора (также: сурфактанта), который стабилизирует дисперсную фазу, располагаясь на границе раздела между водой и маслом. Вакцинная эмульсия может быть создана с одним или более адъювантами, с одним или более эмульгаторами.

Доступно большое количество эмульгаторов для использования в эмульсионных вакцинах, и количество новых разработанных эмульгаторов постоянно увеличивается. Краткий обзор в этой области был опубликован Ascarateil & Dupuis (2006, Vaccine vol. 24S2, p. S2/83 - S2/85).

Примерами сочетаний адъювантов и эмульгаторов, используемых в коммерческих ветеринарных вакцинах, являются: Amphigen^® (Zoetis), включающий легкое минеральное масло с лецитином в качестве эмульгатора; Xsolve^® (прежнее название: Microsol-Diluvac Forte^®, MSD Animal health), включающий сочетание адъювантов: легкого минерального масла и витамина E ацетата с эмульгатором Tween^® 80 (полисорбат 80, или полиоксиэтилен сорбитан моноолеат); и MetaStim^® (Zoetis), включающий сквалан, плюроник^® (неионный тройной блок-сополимер из блоков полиоксиэтилена и полиоксипропилена) и Tween 80.

Эмульсия, используемая в качестве вакцины, должна быть стабильной и не «распадаться», это означает, что вид, размер и количество капель дисперсной фазы не должно слишком сильно изменяться с течением времени, что могло бы в итоге приводить к уменьшению дисперсии и увеличению разделения фаз.

Поддержание стабильности эмульсии важно для использования и эффективности эмульсионной вакцины: недостаточно оптимальное распределение фаз может приводить к неправильному дозированию, к проблемам с безопасностью и может влиять на иммунологическую эффективность вакцинного антигена(ов).

Помимо первостепенного требования, чтобы вакцины были безопасными и эффективными, существуют некоторые особые требования к вакцинам, используемым в животноводстве. Они касаются аспектов легкости использования и, особенно, стоимости. Это связано с тем, что производство животного белка, как правило, является крупномасштабной и низкорентабельной областью хозяйства. Вследствие этого, ветеринарные вакцины часто бывают направлены одновременно против нескольких заболеваний или патогенов за счет содержания нескольких разных антигенов в одном вакцинном препарате. Это способствует уменьшению стресса для животных из-за предотвращения необходимости в повторных процедурах, а также уменьшает затраты на оплату труда, связанного с введением.

Современные масляно-адъювантные эмульсионные вакцины с неживыми бактериальными антигенами коммерчески доступны для большого количества патогенов, и для всех основных целевых видов сельскохозяйственных животных: свиней, крупного рогатого скота, овец, домашней птицы и рыбы. Лишь несколькими примерами таких вакцин с комплексными сочетаниями антигенов являются:

- PregGuard^® GOLD FP 10 (Zoetis), используемая для крупного рогатого скота и овец, содержащая 4 живых ослабленных вирусных антигена и бактерины из одного вида Campylobacter, а также из 5 видов или подвидов Leptospira, и содержащая в качестве адъюванта Amphigen^® в М/В эмульсии;

- Bovilis^® Rotavec^® Corona (Coopers), используемая для крупного рогатого скота, содержит 2 типа каждого из инактивированных бычьего ротавируса и бычьего коронавируса, токсоиды 2 видов бактерий Clostridia и антигены пилуса E. coli, адсорбированные на гидроксид алюминия; содержит в качестве адъюванта легкое минеральное масло в В/М эмульсии.

- Porcilis^® Ery+Parvo+Lepto (MSD Animal Health) для свиней, содержащая инактивированный свиной парвовирус, бактерины Erysipelothrix и 6 сероваров Leptospira, и содержащая в качестве адъюванта Diluvac Forte^® в М/В эмульсии;

- Nobilis^® Corvac 4 (MSD Animal Health) для домашней птицы, содержит бактерины 4 типов бактерий Haemophilus (Avibacterium) и содержит в качестве адъюванта легкое парафиновое масло в В/М эмульсии; и

- AQUAVAC^® PD7 Vet (MSD Animal Health) для атлантического лосося, содержащая инактивированные антигены 2 видов вирусов (вируса инфекционного панкреатического некроза и вируса лососевой анемии), и бактерии 5 видов или подвидов (Aeromonas salmonicida подвид salmonicida, Vibrio salmonicida, Vibrio anguillarum серотипов O1 и O2a, и Moritella viscosa), и содержащая в качестве адъюванта легкое парафиновое масло в В/М эмульсии.

Однако не из всех нужных сочетаний антигенов можно получать стабильные препараты. Это происходит в результате другого последствия необходимости того, чтобы бактериальные вакцины, используемые в сельском хозяйстве, были экономически доступными, а именно: чтобы такие вакцины, как правило, не содержали дорогие чистые компоненты (например, рекомбинантно экспрессируемые субъединицы) и не были произведены с использованием сложных методов очистки (например, хроматографии на колонке). На практике это означает, что неживые антигены, содержащиеся в таких вакцинах, будут, как правило, относительно неочищенными и иметь в некоторой степени неопределенный состав. Это особенно заметно при сравнении с более очищенными вакцинными антигенами в вакцинных препаратах с более высокой рыночной стоимостью, например, предназначенных для животных-компаньонов (кошек, собак и лошадей), или даже предназначенных для человека. Альтернативно, конкретный защитный антиген может быть неизвестен, так что неочищенный антигенный препарат является единственным вариантом, включающим необходимые антигены.

Таким образом, неживые бактериальные вакцины, предназначенные для использования в сельском хозяйстве, как правило, содержат слабо очищенные антигены, полученные, например, из инактивированной бактериальной культуры, или из экстрактов или фракций такой культуры. Такие довольно грубые антигены могут иметь в основе инактивированные клетки, возможно, промытые или сконцентрированные один раз, или антиген может быть основан на фракциях бактериальных клеток, например, клеток, которые были лизированы или разрушены. Как следствие, эти неочищенные антигенные препараты могут содержать неопределенные или непреднамеренные примеси, которые могут влиять на безопасность, эффективность или стабильность (комбинированной) вакцины. Именно поэтому вакцины в процессе их разработки должны проходить строгое тестирование на безопасность, эффективность и стабильность, прежде чем для них может быть получено разрешение на продажу от правительственных или регулирующих органов для вывода такой вакцины на рынок в качестве коммерческого продукта.

Неопределенные компоненты неживого антигенного препарата не обязательно являются нежелательными, поскольку они могут действовать в качестве дополнительного адъюванта и в этом качестве обеспечивать неспецифическое усиление иммунного ответа. Кроме того, можно ожидать, что потенциально внушающие беспокойство факторы биологической природы будут инактивированы в процессе обработки неживых бактериальных антигенов. Тем не менее, нежелательное влияние на безопасность, эффективность или стабильность вакцины может иметь место в процессе создания эмульсионной вакцины, содержащей неочищенный препарат антигена.

Таким образом, в данной области существует постоянная потребность в разработке доступных способов и материалов, которые позволят формулировать безопасные, стабильные и эффективные вакцины, содержащие эмульсии неживых бактериальных антигенов.

Вследствие этого, целью настоящего изобретения является преодоление недостатков предшествующего уровня техники и решение соответствующей проблемы в данной области путем предоставления стабильных эмульсий неживых бактериальных антигенов, которые могут быть использованы в качестве эффективных вакцин.

Неионные A-B-A блок-сополимерные эмульгаторы из полиалкиленгликоля и монокарбоновых кислот впервые были описаны в EP 0000424 для использования в диспергировании воды в топливе и в WO 96/07689 для диспергирования пигментов или органических красителей в органической среде. Разные варианты применения зависят от различий в молекулярной массе компонента B.

Практическое применение эмульгаторам, описанным в EP 0000424, также было найдено в косметической промышленности в качестве эмульгаторов в кремах для кожи (Jang et al., 2015, Toxicol. Res., vol. 31, p. 105-136). Кроме того, описано фармацевтическое применение для усиления проникновения в кожу лекарственных средств (Casiraghi et al., 2012, AAPS PharmSciTech, vol. 13, p. 247-253).

Примечание: Эти эмульгаторы не такие как неионные блок-сополимерные эмульгаторы, которые обычно известны как полоксамер™ (BASF). Полоксамеры не содержат жирнокислотный компонент A, но являются сополимерами из блоков полиоксиэтилена и полиоксипропилена.

В WO 2002/067899 описано применение A-B-A блок-сополимерных эмульгаторов из полиалкиленгликоля и монокарбоновых кислот в масляных эмульсионных вакцинах. Конкретное описание относится к эмульгатору Arlacel^® P135 и его применению в низковязких В/М или В/М/В (вода-в-масле-в-воде) эмульсионных вакцинах с антигенами из двух инактивированных птичьих вирусов.

В WO2009/032481 описано применение в агрохимии A-B-A блок-сополимеров полиэтиленгликоля и 12-гидроксистеариновой кислоты. Их используют совместно со вторым полимерным эмульгатором для стабилизации М/В эмульсий гербицидов от нестабильности, возникающей вследствие кристаллизации ингредиентов.

В процессе разработки масляных адъювантных эмульсионных вакцин с разными сочетаниями неживых вирусных и бактериальных антигенов авторы изобретения иногда сталкивались с нестабильностью эмульсий. Эмульсии распадались (то есть, демонстрировали потерю дисперсности и увеличение разделения фаз) уже через несколько недель в испытаниях стабильности, что делало вакцину неэффективной. Очевидные возможные причины, такие как плохое качество партии используемого минерального масла или используемой пары эмульгаторов (полисорбат 80 и сорбитан моноолеат), были быстро исключены, оставляя проблему нерешенной. Без каких-либо предположений об отправной точке исследований был начат длительный поиск причин наблюдаемого распада эмульсии: как фактора, который подвергался воздействию, так и фактора, вызывающего данный эффект.

Неожиданно было обнаружено, что цель может быть достигнута и, следовательно, один или более недостатков предшествующего уровня техники могут быть преодолены, за счет использования полимерного эмульгатора конкретного класса, а именно: тройного блок-сополимера полиалкиленгликоля и жирных кислот. Было установлено, что это решает проблему возникновения нестабильности эмульсии даже в сложных смесях и даже при использовании относительно неочищенных препаратов неживых бактериальных антигенов.

Это открытие является чрезвычайно полезным для разработки бактериальных вакцин на эмульсионной основе. В частности, поскольку это позволяет преодолевать необходимость в изменении качества или состава неживых бактериальных антигенов, используемых в такой эмульсионной вакцине, появляется возможность использования относительно неочищенных препаратов неживых бактериальных антигенов в эмульсионных вакцинах. Фактически, теперь бактериальный антиген может быть даже использован в менее очищенном состоянии, чем прежде, и отсутствует необходимость в установлении уровня примесей: бактериальные антигены всех типов теперь можно формулировать в стабильную эмульсию по изобретению, не используя ничего, кроме обычных навыков.

Таким образом, данное решение является малозатратным и, кроме того, поскольку полимерный эмульгатор этого класса является эффективным при относительно низком процентном содержании по массе, становится доступен дополнительный объем в препарате для включения антигенов.

Точно не известно, каким образом полимерные эмульгаторы данного класса обеспечивают стабильность эмульсий из масла и воды, содержащих неживые бактериальные антигены. Хотя авторы изобретения не желают быть связаны какой-либо теорией или моделью, которая может объяснить эти результаты, они предполагают, что эмульгаторы на основе сорбитана, используемые в предшествующем уровне техники, в частности, полисорбат, распадались с течение времени, что приводило к потере эмульгирующей способности и последующему распаду эмульсии. Они также предполагают, что факторами, разрушающими эмульгаторы предшествующего уровня техники, являются ферменты, присутствующие в неочищенном препарате неживых бактериальных антигенов. Из различных присутствующих ферментов: протеаз, эстераз, карбогидраз и нуклеаз, эстеразы могут являться причиной распада эмульгаторов, учитывая, что можно наблюдать корреляцию увеличения содержания свободных жирных кислот с уменьшением концентрации эмульгаторов предшествующего уровня техники в эмульсиях, проявляющих признаки распада.

Такие бактериальные ферменты продуцируются многими известными видами бактерий, как грамположительных, так и грамотрицательных, и in vivo могут служить в качестве фактора вирулентности и/или для мобилизации питательных компонентов. Обзор по бактериальным эстеразам: Arpigny & Jaeger, 1999, Biochem. J., vol. 343, p. 177-183. Вовлечены все основные семейства бактерий, как неопасные, так и патогенные штаммы, такие как: Bacillus, Staphylococcus, Pseudomonas, Salmonella и многие другие. Следовательно, такие ферменты могут присутствовать в принципе в любом препарате неживых бактериальных антигенов.

В этом отношении было еще более удивительным то, что, как было установлено, полимерные эмульгаторы данного конкретного класса по изобретению не чувствительны к действию эстераз, учитывая, что данные эмульгаторы содержат сложноэфирные связи!

Это было совершенно не очевидно из любых данных в предшествующем уровне техники, поскольку отсутствует информация об устойчивости полимерных эмульгаторов данного типа к распаду, в частности, к распаду, вызываемому бактериальными ферментами, такими как эстеразы. Кроме того, мультивалентная эмульсионная вакцина представляет собой сложный препарат со множеством биологических и химических соединений, для которого очень сложно определить, какой фактор подвергается воздействию, и какой компонент композиции является причиной, в случае возникновения нестабильности эмульсии.

Множество потенциальных ингредиентов в типичной эмульсионной вакцине с неживыми бактериальными антигенами, из которых любой один или более могут оказывать негативное воздействие на один из других компонентов, включают, например:

- компоненты культуральной среды, используемой для выращивания бактериальной культуры: например, животную сыворотку, бульон или экстракт животных тканей, пептоны или гидролизаты животного или растительного происхождения, липиды, сахара, аминокислоты, витамины и минералы, пеногасители, противогрибковые средства и так далее,

- инактивирующее средство (следовые количества): например, тиомерсал, бензалкония хлорид, формальдегид, бетапропиолактон, или детергент и так далее,

- стабилизаторы: декстран, глицерин, желатин, аминокислоты, буферы и так далее,

- консерванты: тиомерсал, феноксиэтанол, формальдегид, антибиотики (например, гентамицин),

- компоненты бактерий: фрагменты клеточной стенки, внутренние клеточные органеллы, нуклеиновую кислоту; внешние бактериальные органеллы, такие как: пили, фимбрии или жгутики; бактериальные белки, липиды и углеводы, например: токсины, липополисахариды, различные ферменты и так далее,

- один или более адъювантов, эмульгаторов и их микроэлементы или примеси.

Кроме того, на стабильность эмульсии может влиять одно или более воздействий физических факторов при получении, очистке, формулировании, эмульгировании, фасовке, транспортировке и хранении вакцин.

Таким образом, в одном аспекте изобретение относится к эмульсии, содержащей масляную фазу, водную фазу, эмульгатор и неживой бактериальный антиген, отличающейся тем, что эмульгатор представляет собой полимерный эмульгатор, который представляет собой блок-сополимер, имеющий общую формулу A-B-A, в которой компонент B представляет собой двухвалентный остаток водорастворимого полиалкиленгликоля, и компонент A представляет собой остаток жирорастворимой комплексной монокарбоновой кислоты.

«Эмульсия» представляет собой смесь из по меньшей мере двух несмешивающихся жидкостей, при этом одна диспергирована в другой. Как правило, капли дисперсной фазы очень малы, с диаметром в несколько микрометров или менее.

Способы и оборудование для изготовления эмульсии в любом масштабе хорошо известны в данной области и описаны, например, в таких руководствах, как «Remington: the science and practice of pharmacy» (2000, Lippincot, USA, ISBN: 683306472) и «Veterinary vaccinology» (P. Pastoret et al. ed., 1997, Elsevier, Amsterdam, ISBN 0444819681).

Используемый в настоящем документе термин «включающий» (а также его вариации, такие как «включают», «включает» и «заключающий в себе») относится ко всем элементам, и в любом возможном сочетании, допустимом по изобретению, которые охвачены, или включены в раздел текста, параграф, пункт формулы изобретения, и так далее, в котором данный термин используется, даже если такие элементы или сочетания явно не перечислены; и не относится к исключению любого из таких элементов или сочетаний. Следовательно, любой такой раздел текста, параграф, пункт формулы изобретения, и так далее, также может относиться к одному или более вариантам осуществления, в которых термин «включает» (или его вариации) заменен такими терминами, как «состоит из», «состоящий из» или «состоит практически из».

«Масляная фаза» представляет собой жидкость на основе масла. Термин «масло» в настоящем документе используется в его обычном значении и означает неполярное химическое вещество, которое является гидрофобным и липофильным с высоким содержанием углеводорода. Масло может быть минеральным или не минеральным, например, синтетическим, животным или растительным. Некоторые не минеральные масла являются усвояемыми.

Масляная фаза может содержать эксципиенты, такие как эмульгатор. В зависимости от типа эмульсии масляная фаза представляет собой дисперсионную среду (как в В/М эмульсии) или представляет собой дисперсную фазу (как в М/В эмульсии). При использовании для формулирования вакцины масляная фаза может служить в качестве адъюванта. Наиболее часто используемым минеральным маслом в качестве адъюванта в ветеринарных вакцинах является легкое (или белое) вазелиновое масло, такое как Marcol^® (Exxon Mobile) или Drakeol^® (Penreco). Обычными не минеральными маслами в качестве адъювантов являются сквален и сквалан (масло печени акулы), а также токоферол (витамин E).

«Водная фаза» представляет собой жидкость на основе воды. Водная фаза может содержать, например, буфер или солевой раствор, и один или более эксципиентов, таких как эмульгатор или стабилизатор. Водная фаза может содержать антиген из патогена рыб по изобретению, в зависимости от типа эмульсии по изобретению.

«Антиген» представляет собой вещество, способное индуцировать иммунологическую реакцию у человека или животного, возможно, при помощи иммуностимулирующего соединения, такого как адъювант. Антигены могут быть получены путем синтеза или могут быть получены из биологического источника, например, они могут представлять собой микроорганизм (способный, или не способный, к репликации), или могут представлять собой его часть, например, белок, липид, углевод или нуклеиновую кислоту, или их сочетание, например: пептидогликан, липогликан, липопептид или липополисахарид, и так далее.

«Бактериальный антиген» представляет собой антиген, который происходит из, имеет в основе, или получен из бактерии.

«Неживой бактериальный антиген» представляет собой любой бактериальный антиген, который не является живой (то есть, способной к репликации) бактерией. Часто он представляет собой антигенный препарат на основе инактивированных (убитых) бактерий, также называемый «бактерин». Такой бактерин содержит инактивированные бактериальные клетки, как целые клетки, так и клетки, которые были более или менее повреждены или разрушены. Неживой бактериальный антиген также может представлять собой часть бактериальной клетки, например, экстракт, фракцию, гомогенат или полученный путем обработки ультразвуком гомогенат бактериальных клеток. Кроме того, неживой бактериальный антиген может представлять собой рекомбинантный продукт, такой как экспрессионный вектор или экспрессируемый белок. Все такие антигены хорошо известны в данной области.

Для изобретения, бактерия представляет собой прокариотический микроорганизм, который в настоящее время классифицируется в таксономическом суперцарстве Bacteria.

Неживой бактериальный антиген по изобретению, как правило, содержится в жидкости, такой как водный буфер. В зависимости от характеристик эмульсии по изобретению неживой бактериальный антиген по изобретению будет содержаться либо во внутренней водной фазе (в случае, если эмульсия по изобретению представляет собой В/М эмульсию), либо будет добавлен в водную фазу после эмульгирования (в случае, если эмульсия по изобретению представляет собой М/В эмульсию), как описано ниже.

«Эмульгатор» представляет собой молекулу с амфифильными свойствами, имеющую как гидрофобную, так и гидрофильную сторону. В данной области известно множество эмульгаторов с различными свойствами. Большинство из них коммерчески доступны и имеют разную степень чистоты.

Соединение является «полимерным», если оно состоит из повторяющихся (молекулярных) единиц. Как это часто бывает с полимерными соединениями, число повторяющихся субъединиц может быть точно неизвестно, но оно статистически распределено вокруг среднего значения, лежащего в пределах определенного диапазона.

Молярное соотношение между компонентами A и B может варьироваться от 125:1 до 2:1. Относительное содержание по массе компонента B в полимерном эмульгаторе по изобретению может составлять до 80% масс/масс. Монокарбоновая кислота может иметь до 25 атомов углерода.

Полимерный эмульгатор по изобретению представляет собой амфифильную молекулу в том, что компоненты A являются «жирорастворимыми», то есть, имеют гидрофобную природу, и компонент B является «водорастворимым», то есть является гидрофильным.

Каждый из компонентов A и компонента B состоит из субъединиц, как описано в настоящем документе, и эти субъединицы соединены друг с другом эфирными связями. Сами компоненты A и B соединены сложноэфирной связью -COO-, в результате, подробная общая структура полимерного эмульгатора по изобретению представляет собой A-COO-B-OOC-A.

Термин «комплексный» указывает на то, что полимер из монокарбоновых кислот, компонент A, включает разные молекулы монокарбоновой кислоты для оказания влияния на длину цепи.

Конкретный состав полимерного эмульгатора по изобретению может быть выбран в зависимости от необходимых эмульгирующих свойств, при этом с учетом: желаемого типа эмульсии, используемого типа масла и характеристик включенного антигена (нескольких антигенов). Например, вариации могут включать размер и состав компонентов A и B, их молярное соотношение и их процентное содержание по массе в полной молекуле эмульгатора. Свойства этих молекул известны, и они коммерчески доступны. Все представители обладают недавно обнаруженным и полезным свойством устойчивости к распаду, вызываемому компонентами в неживых бактериальных антигенных препаратах. Следовательно, квалифицированный специалист вполне способен выбирать определенный тип полимерного эмульгатора по изобретению для достижения определенного эмульгирующего эффекта.

Полимерные эмульгаторы для использования по изобретению обычно коммерчески доступны, как правило, с разным качеством и степенью чистоты, от ряда поставщиков чистых химических реактивов. Примерами являются семейства полимеров, известные как: Atlox^® и Hypermer^® (Uniqema); Termul^® (Huntsman); Kolliphor^®, Dehymuls^® и Solutol^® (BASF); а также Cithrol^® (Croda).

Кроме того, можно добавлять один или более дополнительных эмульгаторов для получения сочетания эмульгаторов с определенными желательными свойствами. Хорошо известным способом описания характерных свойств (смесей) эмульгаторов является число ГЛБ (гидрофильно-липофильный баланс; Griffin 1949, J. Soc. Cosm. Chem., vol. 1, p. 311-326). Как правило, эмульгатор или смесь эмульгаторов с числом ГЛБ ниже 10 способствует получению В/М эмульсии; эмульгатор (смесь) с числом ГЛБ 10-16 способствует получению М/В эмульсии.

Подробности вариантов осуществления и дополнительные аспекты изобретения описаны ниже.

Настоящее изобретение особенно полезно в случае неживых бактериальных антигенов, которые могут вызывать распад эмульсии предшествующего уровня техники из масляной фазы и водной фазы, то есть, антигенов, которые содержат фермент с эстеразной активностью.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления эмульсии по изобретению неживой бактериальный антиген содержит эстеразу.

Термин «эстераза» по изобретению относится к ферментам, обладающим эстеразной активностью, в частности, эстеразам и липазам. Такие ферменты имеют коды в системе классификации ферментов IUBMB (Международный союз биохимии и молекулярной биологии) EC 3.1.1.1 или EC 3.1.1.3, соответственно.

Тесты для определения того, «содержит ли эстеразу» антиген по изобретению, представляют собой тесты на эстеразную активность, которые существуют в большом разнообразии форм и типов анализов, и коммерчески доступны. Обзоры тестов для бактериальных эстераз можно найти в публикациях Hasan et al. (2009, Biotechnol. Adv., vol. 27, p. 782-798) и Javed et al. (2018, Progr. in Bioph. и Mol. Biol., vol. 132, p. 23-34).

Простым вариантом определения эстеразной активности является спектрофотометрический анализ, с обнаружением желтого окрашивания от высвобождения нитрофенола из п-нитрофенилэфира за счет активности эстеразы. В публикации De Yan et al. (2013, Biotechn. & Appl. Biochem., vol. 60, p. 343-347) перечислены несколько вариантов анализа этого типа в ссылках № 2-16. Все они представляют собой вариации базового анализа, описанного De Caro et al. (1986, Eur. J. of Biochem., vol. 158, p. 601-607).

В настоящем изобретении для установления того, содержит ли неживой бактериальный антиген эстеразу, тест выполняют в соответствии с публикацией De Caro et al. (выше), с использованием в качестве субстрата п-нитрофенилбутирата. Квалифицированный специалист вполне способен спланировать и провести такой тест.

Любой уровень эстеразной активности в бактериальном антигене может быть вредным для стабильности эмульсий предшествующего уровня техники, особенно при долгосрочном хранении. Таким образом, при использовании соответствующих положительных и отрицательных эталонных стандартов, наличие любого поддающегося обнаружению уровня эстеразной активности позволяет классифицировать бактериальный антиген как содержащий эстеразу по изобретению.

В одном из вариантов осуществления эмульсия по изобретению не содержит (то есть свободна от) эмульгатор, подверженный распаду, вызываемому неживым бактериальным антигеном по изобретению; предпочтительно, подверженный распаду, вызываемому эстеразой, описанной в настоящем документе. Более предпочтительно, эмульсия не содержит эмульгатор на основе сорбата, или даже не содержит полисорбат, более предпочтительно: не содержит полисорбат и сорбитан моноолеат.

Как описано, полезный эффект по настоящему изобретению применим, в частности, к использованию таких эмульсий в качестве бактериальных вакцин для сельскохозяйственного сектора. Предпочтительный неживой бактериальный антиген по изобретению представляет собой инактивированную цельную бактериальную культуру, или является частью такой культуры.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления эмульсии по изобретению неживой бактериальный антиген представляет собой инактивированную бактериальную культуру, или является ее частью.

Предпочтительно, часть инактивированной бактериальной культуры выбирают из: осадка, супернатанта, концентрата, диализата, экстракта, полученного путем обработки ультразвуком гомогената, лизата и фракции такой культуры.

Что представляет собой «бактериальная культура» или «ее часть», хорошо известно квалифицированному специалисту и описывается в справочниках и руководствах, таких как «Veterinary vaccinology» (выше). По изобретению инактивированную бактериальную культуру используют либо в виде целой культуры, то есть, в виде всего содержимого конкретного сосуда для культивирования, либо в виде ее части.

Способы и материалы для получения инактивированной культуры или для получения ее части, как правило, известны и доступны в любом масштабе. Например: инактивацию бактерий можно проводить с использованием химических или физических средств; физическими средствами являются, например, нагревание, облучение или очень высокое давление; химическими средствами являются, например, инкубация с мертиолатом, формалином, диэтиламином, бинарным этиленамином, бета-пропиолактоном, бензалкония хлоридом или глутаральдегидом.

Супернатант или осадок можно получать центрифугированием.

Концентрат или диализат можно получать, например, методом тангенциальной фильтрации.

Экстракт можно получать, например, путем промывания или инкубации с растворителем или раствором детергента; растворитель может представлять собой жидкость или газ, жидкость, например, может быть водной, такой как вода или буфер; органическим растворителем, таким как спирт, ацетон или эфир; или может быть сверхкритической жидкостью, и так далее. Экстракт является частью, которая удаляется с растворителем, и его часто извлекают из растворителя в последующем процессе.

Полученный путем обработки ультразвуком гомогенат можно получать с использованием ультразвукового устройства, например, проточной ячейки для обработки ультразвуком.

Лизат можно получать физическими или (био)химическими способами, например, с использованием френч-пресса, или путем ферментативной обработки.

Фракция является частью целого, которую очищают от остального материала, например, фильтрата или осадка, при этом фракция является ретентатом.

Наиболее используемым в бактериальных вакцинах для сельскохозяйственного применения является неживой бактериальный антиген, который содержит инактивированные бактериальные клетки. Как правило, такой антигенный препарат из убитых бактериальных клеток называют бактерином.

Инактивированные бактериальные клетки могут иметь любую форму, и могут быть интактными или поврежденными. Инактивированные бактериальные клетки могут иметь любой уровень чистоты, например, могут быть с бактериальной культуральной средой, в которой они были ферментированы, или могут быть без культуральной среды, например, в результате осаждения, центрифугирования или концентрирования.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления эмульсии по изобретению неживой бактериальный антиген содержит инактивированные бактериальные клетки.

Бактерии, из которых получают неживой антиген, могут представлять собой любую бактерию, важную для медицины и/или ветеринарии, например, любую бактерию, которая является (потенциальным) патогеном, либо первичным, либо вторичным (оппортунистическим) патогеном.

Очевидно, также можно готовить и использовать сочетания неживых бактериальных антигенов из двух или более бактерий. Кроме того, желательными являются сочетания с антигенами из вирусных или паразитических патогенов.

Предпочтительными эмульсиями по изобретению являются эмульсии В/М типа, поскольку они, в случае использования в эмульсионных вакцинах, как правило, обеспечивают более сильную иммунную стимуляцию и с большей продолжительностью, по сравнению с эффектом М/В эмульсии.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления эмульсии по изобретению эмульсия представляет собой эмульсию типа вода-в-масле (В/М).

Для изготовления и стабилизации В/М эмульсии по изобретению выбирают полимерный эмульгатор по изобретению с желаемыми свойствами, предпочтительно имеющий число ГЛБ 10 или менее.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления В/М эмульсии по изобретению каждый из компонентов A имеет молекулярную массу по меньшей мере 500 г/моль.

В одном из вариантов осуществления В/М эмульсии по изобретению компонент B имеет молекулярную массу по меньшей мере 500 г/моль.

В предпочтительном варианте осуществления В/М эмульсии по изобретению все из компонентов A и компонента B имеют молекулярную массу по меньшей мере 500 г/моль.

Саму В/М эмульсию по изобретению можно использовать для формулирования другой эмульсии, такой как В/М/В эмульсия. Для этого может быть необходимо использовать дополнительный эмульгатор, либо вариант полимерного эмульгатора по изобретению, либо иной эмульгатор. Выбор и оптимизация таких условий находится в пределах квалификации специалиста в данной области.

Предпочтительными компонентами полимерного эмульгатора по изобретению являются полиэтиленгликоль и полигидроксистеариновая кислота. Эмульгаторы с этими строительными блоками, как показано, обладают полезными свойствами с точки зрения безопасности вакцин для рыб, полученных из этих эмульсий. Помимо этого, они обеспечивают хорошую эффективность вакцины, а также превосходную стабильность, даже в случае (относительно) неочищенных антигенов по изобретению. Кроме того, в их случае также необходимо использование относительно низкого процентного содержания по массе эмульгатора, и они являются эффективными даже при относительно высоком содержании водной фазы, диспергированной в масле. Это оставляет много пространства для включения антигена в водной фазе в В/М эмульсию по изобретению.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления В/М эмульсии по изобретению компонент A представляет собой полимер гидроксистеариновой кислоты.

Предпочтительно, гидроксистеариновая кислота представляет собой 12-гидроксистеариновую кислоту.

В одном из вариантов осуществления В/М эмульсии по изобретению компонент B представляет собой полимер этиленгликоля.

В предпочтительном варианте осуществления В/М эмульсии по изобретению компонент A представляет собой полигидроксистеариновую кислоту, и компонент B представляет собой полиэтиленгликоль.

Предпочтительно, полигидроксистеариновая кислота представляет собой поли(12-гидроксистеариновую кислоту).

Полиэтиленгликоль (ПЭГ) также известен как полиэтиленоксид (ПЭО) или полиоксиэтилен (ПОЭ).

В одном из вариантов осуществления В/М эмульсии по изобретению компонент A представляет собой полигидроксистеариновую кислоту (молекулярная масса 300 г/моль), и компонент B представляет собой полиэтиленгликоль (молекулярная масса 62 г/моль), таким образом, компонент A имеет 2-50 единиц гидроксистеариновой кислоты, и компонент B имеет 8-60 единиц этиленгликоля. В данном изобретении приведенные диапазоны также включают конечные точки.

Особенно благоприятные результаты при стабилизации В/М эмульсий по изобретению с относительно неочищенными неживыми бактериальными антигенами были получены с использованием в качестве эмульгатора ПЭГ-30-ди(полигидроксистеарата).

Таким образом, в одном из вариантов осуществления В/М эмульсии по изобретению полимерный эмульгатор представляет собой ПЭГ-30-ди(полигидроксистеарат).

Термин «ПЭГ-30» указывает на то, что среднее число молей этиленоксида, реагирующее на моль вещества, составляет 30.

«ПЭГ-30-ди(полигидроксистеарат)» имеет номер CAS 70142-34-6, и имеет номер HLB 5,5. Другим названием ПЭГ является макрогол; макрогол 30 диполигидроксистеарат описан в Европейской фармакопее в фармакопейной статье № 07/2011:2584.

ПЭГ-30-ди(полигидроксистеарат) коммерчески доступен, например, в виде Cithrol DPHS, Atlox 4912 (Uniqema), Termul 2510, Sabowax PIS и Dehymuls LE.

Cithrol DPHS (Croda) имеет среднюю молекулярную массу примерно 5000 г/моль, и имеет 5-15 единиц 12-гидроксистеариновой кислоты на компонент A, и 15-35 единиц этиленгликоля на компонент B. Ранее Cithrol DPHS был известен как Arlacel^® P135.

Примечание: Arlacel P135 не следует путать с Arlacel A, эмульгатором, который используется в полном адъюванте Фрейнда, представляющем собой смесь минерального масла и бактерий. Arlacel A является не блок-сополимером, а сложным эфиром, маннид моноолеатом, и имеет номер CAS 25339-93-9.

Как описано в разделе «Примеры» далее в настоящем документе, стабильная В/М эмульсия семивалентного антигена может быть получена при использовании Cithrol DPHS вместо двух эмульгаторов предшествующего уровня техники: полисорбата 80 (Tween^® 80) и сорбитан моноолеата (Span^® 80). Полученная М/В эмульсия, содержащая бактерины Moritella viscosa и Aeromonas salmonicida подвида salmonicida, как установлено, является стабильной в течение вплоть до трех недель в ускоренных испытаниях стабильности при 37°C, что соответствует инкубации в течение 12-24 месяцев в испытаниях стабильности в реальном времени при 4°C. Контрольная эмульсия с Tween и Span продемонстрировала полное и необратимое разделение фаз уже через 1 неделю при 37°C, что соответствует периоду до примерно 6 месяцев инкубации в испытаниях стабильности в реальном времени.

Количество полимерного эмульгатора по изобретению в эмульсии по изобретению определяют, исходя из различий в желаемых свойствах полученной эмульсии и предполагаемого использования эмульсии в качестве вакцины. Нижний предел определяется пределом эффективности конкретного используемого полимерного эмульгатора; верхний предел определяется практическими соображениями удобства использования, поскольку некоторые варианты полимерного эмульгатора, используемого по изобретению, имеют восковидную консистенцию.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления эмульсия по изобретению содержит количество полимерного эмульгатора по изобретению, которое составляет 0,01-15% масс/масс, выраженное в виде массовой процентной доли от массы вакцины, полученной из эмульсии.

Предпочтительно, эмульсия по изобретению содержит количество полимерного эмульгатора по изобретению, которое составляет 0,05-10; 0,1-5; 0,2-3; 0,3-2; 0,4-1,5 или даже 0,5-1% масс/масс от массы вакцины, полученной из эмульсии, в таком порядке предпочтения.

В предпочтительном варианте осуществления эмульсия по изобретению содержит количество полимерного эмульгатора по изобретению, составляющее 0,5% масс/масс от массы вакцины, полученной из эмульсии.

Для изобретения, термин «примерно» указывает на то, что количество может варьироваться в пределах ± 25% относительно указанного значения. Предпочтительно, «примерно» означает ± 20% относительно указанного значения, более предпочтительно, «примерно» означает ± 15, 12, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2% относительно указанного значения, или даже «примерно» означает ± 1% относительно указанного значения, в таком порядке предпочтения.

В одном из вариантов осуществления эмульсия по изобретению содержит количество масла, составляющее 10-90% масс/масс; при этом процентное содержание масла выражено по массе от массы вакцины, полученной из эмульсии.

Предпочтительно, эмульсия по изобретению содержит 20-80; 25-70 или даже 30-60% масс/масс от массы вакцины, полученной из эмульсии, в таком порядке предпочтения.

Подходящая масляная фаза для использования в эмульсии по настоящему изобретению представляет собой минеральные или не минеральные масла, а также смеси минеральных и не минеральных масел. Минеральные масла по изобретению включают, но не ограничиваются ими, парафиновые масла. Не минеральные масла по изобретению включают, но не ограничиваются ими, растительные масла, животные масла, природные углеводороды, усвояемые синтетические или полусинтетические масла (такие как Miglyol^® и Cetiol^®), сложные эфиры пропиленгликоля и C6-C24 жирных кислот, например, олеил олеаты, диэфиры каприновой или каприловой кислот и тому подобное. Подходящими растительными маслами по изобретению являются арахисовое масло, соевое масло, подсолнечное масло, а также производные, такие как токоферол. Подходящими животными маслами по изобретению являются сквалан и сквален, и тому подобное. Все они коммерчески доступны.

В одном из вариантов осуществления эмульсии по изобретению масляная фаза содержит легкое минеральное масло; предпочтительно, легкое минеральное масло представляет собой вазелиновое масло.

Такое легкое вазелиновое масло, как правило, доступно, примерами являются: Drakeol^® 6VR (Penreco), Marcol^® 52 (Exxon Mobile) и Klearol^® (Sonneborn).

Если эмульсия по изобретению предназначена для использования в качестве вакцины для людей, использование минерального масла может быть неприемлемым.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления эмульсии по изобретению масляная фаза содержит не минеральное масло; предпочтительно, не минеральное масло представляет собой сквалан, сквален или токоферол.

В одном из вариантов осуществления эмульсия по изобретению имеет один или более признаков, выбранных из группы, состоящей из следующего:

- неживой бактериальный антиген содержит эстеразу;

- неживой бактериальный антиген представляет собой инактивированную бактериальную культуру, или представляет собой ее часть; предпочтительно, часть инактивированной бактериальной культуры выбирают из: осадка, супернатанта, концентрата, диализата, экстракта, полученного путем обработки ультразвуком гомогената, лизата и фракции такой культуры;

- неживой бактериальный антиген содержит инактивированные бактериальные клетки;

- эмульсия представляет собой эмульсию типа вода-в-масле (В/М);

- каждый из компонентов A имеет молекулярную массу по меньшей мере 500 г/моль;

- компонент B имеет молекулярную массу по меньшей мере 500 г/моль;

- все из компонентов A и компонента B имеют молекулярную массу по меньшей мере 500 г/моль;

- компонент A представляет собой полимер гидроксистеариновой кислоты; предпочтительно, гидроксистеариновая кислота представляет собой 12-гидроксистеариновую кислоту;

- компонент B представляет собой полимер полиэтиленгликоля;

- компонент A представляет собой полигидроксистеариновую кислоту, и компонент B представляет собой полиэтиленгликоль; предпочтительно, полигидроксистеариновая кислота представляет собой поли(12-гидроксистеариновую кислоту);

- компонент A представляет собой полигидроксистеариновую кислоту, и компонент B представляет собой полиэтиленгликоль, при этом каждый компонент A имеет 2-50 единиц гидроксистеариновой кислоты, и компонент B имеет 8-60 единиц этиленгликоля;

- полимерный эмульгатор представляет собой ПЭГ-30-ди(полигидроксистеарат);

- полимерный эмульгатор представляет собой Cithrol DPHS;

- эмульсия содержит количество полимерного эмульгатора, которое составляет 0,01-15% масс/масс; предпочтительно, эмульсия содержит количество полимерного эмульгатора, которое составляет 0,05-10; 0,1-5; 0,2-3; 0,3-2; 0,4-1,5 или даже 0,5-1% масс/масс от массы вакцины, полученной из эмульсии, в таком порядке предпочтения;

- эмульсия содержит количество полимерного эмульгатора, составляющее примерно 0,5% масс/масс от массы вакцины, полученной из эмульсии;

- эмульсия содержит количество масла, составляющее 10-90% масс/масс; предпочтительно, эмульсия содержит 20-80; 25-70 или даже 30-60% масс/масс масла от массы вакцины, полученной из эмульсии, в таком порядке предпочтения;

- масляная фаза содержит легкое минеральное масло; предпочтительно, легкое минеральное масло представляет собой вазелиновое масло; и

- масляная фаза содержит не минеральное масло; предпочтительно, не минеральное масло представляет собой сквалан, сквален или токоферол.

В одном из вариантов осуществления эмульсии по изобретению неживой бактериальный антиген содержит эстеразу и инактивированные бактериальные клетки; эмульсия представляет собой эмульсию типа вода-в-масле (В/М); полимерный эмульгатор представляет собой ПЭГ-30-ди(полигидроксистеарат); эмульсия содержит количество полимерного эмульгатора, которое составляет 0,5-1% масс/масс от массы вакцины, полученной из эмульсии; эмульсия содержит количество масла, составляющее 30-60% масс/масс от массы вакцины, полученной из эмульсии; и масляная фаза содержит легкое вазелиновое масло.

Эмульсия по изобретению может быть получена с использованием хорошо известных способов и материалов. Подробности этих способов будут зависеть от характеристик используемого полимерного эмульгатора по изобретению и типа создаваемой эмульсии. Например, если эмульсия по изобретению относится к типу М/В, эмульсию масла и водную фазу можно готовить отдельно, а затем добавлять неживой бактериальный антиген по изобретению. Однако это обычно не применимо для эмульсии типа В/М, в этом случае водная фаза обычно содержит антиген с самого начала, поскольку она станет внутренней фазой.

Аналогично, при изготовлении М/В эмульсии полимерный эмульгатор по изобретению растворяют в водной фазе. Однако при изготовлении В/М эмульсии полимерный эмульгатор по изобретению растворяют в масляной фазе. Иногда может быть необходимо немного нагревать растворитель, например, до 50-60°C, чтобы эмульгатор полностью растворился. При необходимости дополнительные эмульгаторы могут содержаться в масле и/или в водной фазе. Для эмульсий обоих типов водную фазу и масляную фазу можно эмульгировать с использованием соответствующего оборудования, например, прибора для обработки ультразвуком, или смесителя типа ротор-статор.

Для получения эмульсии типа М/В, в которой антиген изначально не присутствует в водной фазе, использование высокоинтенсивного эмульгирования воды и масла является еще одним вариантом, например, с использованием микрофлюидизации. Однако, как хорошо известно специалистам в данной области, при изготовлении В/М эмульсии, где неживой бактериальный антиген содержится в водной фазе, которая будет эмульгирована, интенсивность используемого процесса эмульгирования должна быть совместима с хрупкой природой антигена для сохранения его иммунологических свойств без изменения.

Таким образом, в следующем аспекте изобретение относится к способу производства эмульсии типа масло-в-воде (М/В) по изобретению, включающему этапы:

a. смешивания водной фазы и полимерного эмульгатора,

b. эмульгирования смеси из этапа a. с масляной фазой, и

c. смешивания эмульсии из этапа b. с неживым бактериальным антигеном.

Все из водной фазы, полимерного эмульгатора, масляной фазы и неживого бактериального антигена являются такими, как описано выше в настоящем документе.

В аналогичном аспекте изобретение относится к способу производства В/М эмульсии по изобретению, включающему этапы:

a. смешивания масляной фазы и полимерного эмульгатора, и

b. эмульгирования смеси из этапа a. с водной фазой, при этом водная фаза содержит неживой бактериальный антиген.

Опять-таки, все из масляной фазы, полимерного эмульгатора, водной фазы и неживого бактериального антигена являются такими, как описано выше в настоящем документе.

Предпочтительно, способ производства по изобретению используют таким образом, который допускает медицинское применение полученной эмульсии, например, в вакцине. Обычно это касается использования оборудования и ингредиентов, которые являются фармацевтически приемлемыми, и соблюдения требований к качеству, таких как стандарты надлежащей производственной практики. Все это хорошо известно квалифицированному специалисту и предписано в правительственных нормативных актах, таких как Фармакопея, и в справочниках, таких как: Remington and Pastoret (оба приведены выше). Как правило, такое производство осуществляют асептически.

Как описано, эмульсия по изобретению является особенно полезной при использовании в качестве вакцины против бактериального заболевания.

Таким образом, в следующем аспекте изобретение относится к эмульсии по изобретению для использования в качестве вакцины с целью защиты субъекта, человека или животного, от инфекции или заболевания, вызываемого бактерией.

В следующем аспекте изобретение относится к эмульсии по изобретению, используемой для вакцинации субъекта, человека или животного, от инфекции или заболевания, вызываемого бактерией.

В следующем аспекте изобретение относится к вакцине, используемой для защиты субъекта, человека или животного, от инфекции или заболевания, вызываемого бактерией, отличающейся тем, что вакцина содержит эмульсию по изобретению.

Как хорошо известно специалистам в данной области, эмульсия по изобретению может иметь применение «для использования в качестве вакцины» разными способами. Например, эмульсия сама может быть использована в качестве вакцины. Альтернативно, эмульсия может быть использована в качестве ингредиента при дальнейшей обработке, например, в В/М/В эмульсию, которая затем может быть использована в качестве вакцины. Кроме того, для использования в качестве вакцины может быть необходимо смешивание или включение определенных дополнительных ингредиентов, например, стабилизаторов или консервантов. Консервантами являются, например, тиомерсал, феноксиэтанол, формалин, антибиотики (например, гентамицин). Стабилизаторами являются, например, декстран, глицерин, желатин, аминокислоты или буферы. В зависимости от типа эмульсии дополнительные ингредиенты могут быть добавлены во время, или после, производства эмульсии по изобретению.

«Вакцина» представляет собой хорошо известную композицию с медицинским эффектом, и содержит иммунологически активный компонент, а также фармацевтически приемлемый носитель. В качестве «носителя» по изобретению выступает водная фаза или сама эмульсия. «Иммунологически активный компонент» по изобретению представляет собой неживой бактериальный антиген. Вакцина стимулирует иммунную систему субъекта, человека или животного, и индуцирует защитный иммунный ответ. Иммунный ответ может исходить от врожденной и/или от приобретенной иммунной системы субъекта, и может быть клеточного и/или гуморального типа.

Вакцина обеспечивает «защиту» «от инфекции или заболевания» за счет снижения у вакцинированного субъекта степени тяжести последующей инфекции, например, путем уменьшения количества патогенов или уменьшения продолжительности репликации патогена в организме субъекта, а также уменьшения количества, интенсивности или степени тяжести очагов поражения, вызываемых бактериальной инфекцией. Также, или в конечном итоге, вакцина является эффективной для уменьшения или ослабления (клинических) симптомов заболевания, которые могут быть вызваны такой инфекцией или репликацией, или ответом субъекта на такую инфекцию или репликацию. Справочным изданием для таких заболеваний и клинических признаков является «The Merck veterinary manual» 10-е издание, 2010, C.M. Kahn edt., ISBN: 091191093X. Такую вакцину в разговорной речи называют вакцина «против» конкретной бактерии или «бактериальной вакциной».

Для того, чтобы быть иммунологически эффективной, вакцина должна содержать достаточное количество антигена. Насколько большим является это количество, либо уже известно из информации о родственных вакцинах, либо может быть с легкостью определено, например, путем мониторинга иммунного ответа после вакцинации и (в случае субъекта-животного) провокационного инфицирования, например, путем мониторинга признаков заболевания субъекта, клинических показателей в баллах, либо путем повторного выделения патогена и сравнения этих результатов с ответом на вакцинацию, наблюдаемым у мнимо вакцинированных животных.

Количество неживого бактериального антигена по изобретению можно выражать разными способами, в зависимости от типа используемого антигена. Например, дозу антигена можно выражать в виде количества бактериальных клеток, подсчитанных перед тем, как они были инактивированы. Альтернативно, антиген можно количественно определять при помощи серологического или биохимического теста, такого как ELISA или AlphaLisa™, и выражать в относительных единицах, в сравнении с соответствующим эталонным стандартом. Все эти способы хорошо известны в данной области.

Вакцина по изобретению может быть использована в качестве профилактического, метафилактического или терапевтического воздействия.

Вакцина по изобретению может быть использована для эффективной примирующей вакцинации, за которой затем последует, и будет усиливать ее, бустерная вакцинация, с использованием той же самой или иной вакцины.

Вакцина по изобретению также может содержать другие соединения, такие как дополнительный антиген или микроорганизм, цитокин или иммуностимулирующая нуклеиновая кислота, содержащая неметилированный CpG, и так далее. Альтернативно, вакцина по изобретению сама может быть добавлена к вакцине.

Вакцину по изобретению может быть полезно сочетать с одним или более дополнительными антигенами, например, полученными из микроорганизма, патогенного для предполагаемого субъекта - человека или животного. Такой дополнительный антиген сам может представлять собой инфекционный микроорганизм или инактивированный микроорганизм, или субъединицу. Дополнительный антиген может состоять из биологической или синтетической молекулы, такой как белок, углевод, липополисахарид, липид или молекула нуклеиновой кислоты.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления вакцина по изобретению содержит по меньшей мере один дополнительный антиген.

Субъектами, получающими вакцину по изобретению, являются люди или животные, которые нуждаются в вакцинации от инфекции или заболевания, вызываемого конкретной бактерией, неживой антиген которой содержится в вакцине. Возраст, масса тела, пол, иммунологический статус и другие параметры вакцинируемого субъекта не критичны, хотя очевидно, что более предпочтительно вакцинировать здоровых, не инфицированных субъектов, и вакцинировать как можно раньше.

«Животное» по изобретению представляет собой любое животное, попадающее в сферу действия ветеринарии, например, крупный рогатый скот, свиньи, козы, овцы, олени, собаки, кошки, лошади, птицы, рыбы или креветки.

Выбор субъекта для вакцинации определяется спектром хозяев бактерии: для людей, для животных или для тех и других. Альтернативно, бактерия может быть патогенной для людей, но не для животного, являющегося носителем бактерии. В таком случае все еще может иметь смысл вакцинация животных в целях профилактики зоонозов и передаваемых с пищей заболеваний людей, которые в противном случае употребляли бы в пищу зараженный животный продукт, такой как, например, мясо, молоко или яйца.

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления вакцины по изобретению предназначены для субъекта, являющегося человеком и/или животным, неживой бактериальный антиген по изобретению получают из бактерии следующих семейств бактерий: Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Neisseria, Salmonella, Shigella, Listeria, Escherichia, Campylobacter, Clostridium, Mycobacterium, Pseudomonas, Leptospira, Legionella, Helicobacter, Bartonella, Bordetella, Borrelia, Brucella, Burkholderia, Chlamydia, Coxiella, Corynebacterium, Enterococcus, Francisella, Haemophilus, Mycoplasma, Treponema, Vibrio, Yersinia, Actinomyces, Bacteroides, Corynebacterium, Ehrlichia, Klebsiella, Nocardia, Rickettsia, Lactobacillus, Anaplasma (Ehrlichia) и Actinobacterium.

Названия, приведенные выше, относятся к семействам бактерий, к которым данные бактерии принадлежат в настоящее время. Однако данная таксономическая классификация может изменяться со временем, поскольку новые идеи могут приводить к переклассификации в новую или другую таксономическую группу. Но, поскольку при этом не изменяется сама бактерия, или ее антигенный репертуар, а лишь научное название или классификация, такие бактерии после переклассификации остаются в объеме изобретения.

Ссылка на семейство бактерий включает любую бактерию, которая относится к виду, подтипу, варианту, биотипу, серотипу или генотипу в данном семействе.

Такие бактерии для получения неживого бактериального антигена по изобретению можно получать из различных источников, например, в виде полевого изолята от человека или от животного в дикой природе или на ферме, или из различных лабораторий, (депозитарных) организаций или (ветеринарных) университетов.

Как описано, вакцина по изобретению имеет особое значение в области животноводства.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления вакцина по изобретению предназначена для защиты субъекта-животного от инфекции или заболевания, вызываемого бактерией.

Следовательно, для разных групп субъектов-животных неживой бактериальный антиген по изобретению получают из бактерии указанного семейства бактерий:

- Для вакцинации жвачных животных бактерию выбирают из: Pasteurella, Escherichia, Salmonella, Yersinia, Staphylococcus, Streptococcus, Mycobacterium, Moraxella, Bacillus, Brucella, Clostridia, Mannheimia, Haemophilus, Francisella, Fusobacterium, Histophilus, Fusobacterium, Trueperella (Arcanobacterium), Actinomyces, Clostridium, Coxiella, Campylobacter, Erysipelothrix, Leptospira, Listeria, Burkholderia, Nocardia, Mycoplasma, Bacteroides и Chlamydia.

- Для вакцинации свиней бактерию выбирают из: Mycoplasma, Lawsonia, Escherichia, Brachyspira, Streptococcus, Salmonella, Clostridium, Actinobacillus, Pasteurella, Haemophilus, Erysipelothrix, Leptospira, Burkholderia, Enterococcus, Mycobacterium и Bordetella.

- Для вакцинации домашней птицы бактерию выбирают из: Escherichia, Salmonella, Staphylococcus, Streptococcus, Ornitobacterium, Avibacterium, Haemophilus, Pasteurella, Erysipelothrix, Mycoplasma, Mycobacterium, Clostridium, Campylobacter, Shigella, Borrelia, Enterococcus, Listeria, Riemerella, Bordetella и Clostridium.

- Для вакцинации водного животного бактерию выбирают из: Aeromonas, Vibrio, Moritella, Edwardsiella, Francisella, Flexibacter, Pasteurella, Cytophaga, Corynebacterium, Renibacterium, Arthrobacter, Flavobacterium, Fusarium, Bacillus, Yersinia, Mycobacterium, Neorickettsia, Listonella, Flexibacter, Piscirickettsia, Streptococcus, Shewanella, Pseudomonas, Photobacterium, Clostridium, Tenacibaculum, Lactococcus, Leucothrix и Nocardia.

Учитывая, что экономическая маржа в случае вакцин, используемых в аквакультуре, является самой низкой в области животноводства, полезные эффекты настоящего изобретения особенно выгодно использовать в данной области.

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления вакцины по изобретению для защиты субъекта-животного животное представляет собой рыбу.

Термин «рыба» относится к плавниковой рыбе, как хрящевой, так и костной плавниковой рыбе, любой климатической зоны: холодных, умеренных, тропических вод, живущей в пресной, солоноватой, соленой воде. Рыбу можно выращивать в неволе как искусственно выращиваемую рыбу, племенную рыбу или декоративную рыбу. Предпочтительно, рыбу выбирают из: окуня, морского окуня, луциана, тиляпии, желтохвоста, сериолы, камбалы, пангасиуса, карпа, леща, осетра, сома, угря, форели, лосося, сига, палтуса, трески, кои, золотой рыбки.

В одном из вариантов осуществления рыба представляет собой лососевую рыбу; предпочтительно, лососевую рыбу выбирают из атлантического лосося, стальноголового лосося, чавычи, кижуча, горбуши, кеты и нерки, радужной форели, ручьевой форели, озерной форели и кумжи, а также гольца.

Как описано, эмульсия по изобретению допускает использование относительно большого объема воды в сравнении с маслом. Это дает возможность для включения относительно большой массы водной фазы, содержащей антиген, в вакцине, полученной из эмульсии по изобретению.

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления вакцины по изобретению соотношение вода:масло в вакцине составляет 40:60% масс/масс, или выше, по отношению к относительному количеству воды. Величина % масс/масс рассчитана от массы вакцины.

Более предпочтительно, соотношение вода:масло в вакцине по изобретению составляет 45:55, 50:50, 55:45, 60:40, 65:35, 70:30, 75:25, 80:20, 85:15 или даже 90:10% масс/масс от массы вакцины, в таком порядке предпочтения.

Для удобства обращения, для облегчения использования вакцины по изобретению и, в частности, ее введения путем инъекции, эмульсионная вакцина не должна иметь слишком высокую вязкость. Кроме того, за счет выбора определенной вязкости можно уменьшать или предотвращать возникновение седиментации или отстаивания дисперсной фазы в эмульсионной вакцине.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления вакцина по изобретению имеет вязкость менее 500 мПз.

Предпочтительно, вакцина имеет вязкость менее 400 мПз, менее 300 мПз или даже от 100 до 300 мПз, в таком порядке предпочтения.

Такую вязкость следует определять при температуре примерно 20°C при помощи вискозиметра Brookfield DV-I+, используя шпиндель № 62, в течение 30 сек при 60 об/мин.

Методы и материалы для изменения вязкости эмульсии (вакцины) из масляной фазы и водной фазы хорошо известны квалифицированному специалисту. Например, за счет изменения количества воды в эмульсии или размера капель дисперсной фазы.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления вакцины по изобретению средний размер (диаметр) капель дисперсной фазы составляет менее 25 мкм.

Методы и оборудование для измерения размера частиц хорошо известны, и можно, например, использовать измерение рассеяния лазерного излучения.

В предпочтительном варианте осуществления вакцины по изобретению средний размер (диаметр) капель дисперсной фазы составляет менее 20 мкм; менее 15 мкм, менее 10 мкм, от 10 до 0,1 мкм или даже от 5 до 0,5 мкм, в таком порядке предпочтения.

В предпочтительном варианте осуществления вакцина по изобретению имеет в основе В/М эмульсию; содержит минеральное масло в качестве масляной фазы; содержит 0,5-1% масс/масс от массы вакцины ПЭГ-30-ди(полигидроксистеарата) в качестве эмульгатора; имеет соотношение вода:масло, составляющее 60:40-70:30% масс/масс от массы вакцины; имеет вязкость ниже 400 мПз и имеет средний размер (диаметр) капель дисперсной фазы, составляющий 20 мкм или менее.

Дополнительная оптимизация вакцины по изобретению находится в пределах компетентности квалифицированного специалиста. Как правило, это включает тонкую настройку эффективности вакцины для дополнительного усовершенствования создаваемой ею иммунной защиты. Это может быть выполнено путем адаптации дозы, объема, адъюванта или содержания антигена вакцины, или за счет использования другого пути введения, способа или режима. Все это входит в объем изобретения.

Следующие аспекты настоящего изобретения относятся к новым и патентоспособным вариантам применения и сочетаниям элементов изобретения, таких как полимерный эмульгатор и неживой бактериальный антиген, оба по изобретению.

Таким образом, в следующем аспекте изобретение относится к полимерному эмульгатору, используемому в эмульсионной вакцине, содержащей масляную фазу и водную фазу, который описан в настоящем документе, при этом эмульсия содержит неживой бактериальный антиген.

В следующем аспекте изобретение относится к использованию полимерного эмульгатора, описанного в настоящем документе, для производства эмульсии из масляной фазы, водной фазы и неживого бактериального антигена.

В следующем аспекте изобретение относится к использованию неживого бактериального антигена для производства эмульсии из масляной фазы и водной фазы, которая содержит полимерный эмульгатор, описанный в настоящем документе.

Вакцину по изобретению следует вводить субъекту, человеку или животному, для достижения ее полезного иммуногенного эффекта.

Таким образом, в следующем аспекте изобретение относится к способу вакцинации субъекта, человека или животного, от инфекции или заболевания, вызываемого бактерией, включающему введение указанному субъекту вакцины по изобретению.

«Введение» вакцины по изобретению субъекту, человеку или животному, можно осуществлять с использованием любого подходящего способа и пути введения. Как правило, оптимальный путь введения будет определен на основании используемого типа вакцины, а также характеристик субъекта и бактериального заболевания, от которого планируется защита. В зависимости от того, основана ли вакцина по изобретению на М/В или на В/М эмульсии, можно использовать разные методы введения. Например, в случае М/В эмульсионной вакцины вакцину по изобретению можно вводить энтеральным или мукозальным путем введения, то есть, при помощи глазных капель, капель в нос, перорально, через кишечник, при помощи капель в нос и рот, спрея. Другая возможность заключается в массовом введении, например, в питьевой воде, при помощи крупнокапельной струи, распыления, вместе с кормом и так далее.

Предпочтительным путем введения для способа вакцинации по изобретению является парентеральный путь введения.

«Парентеральный» путь введения означает введение через кожу, например, внутримышечным, внутрибрюшинным, внутрикожным, подслизистым или подкожным путем введения.

Само собой разумеется, что оптимальный путь введения вакцины по изобретению будет зависеть от характеристик используемой вакцины, а также от конкретных характеристик субъекта. Квалифицированный специалист вполне способен выбирать и оптимизировать такой путь и способ введения.

Объем дозы вакцины по изобретению, например, при введении парентеральным путем введения, представляет собой объем, который приемлем для субъекта, человека или животного, и может, например, составлять от примерно 0,1 до примерно 10 мл. Предпочтительно, одна доза имеет объем от 0,1 до 5 мл, более предпочтительно, одна доза имеет объем от 0,2 до 3 мл.

При введении внутримышечным путем введения объем одной дозы предпочтительно составляет от примерно 0,5 до примерно 3 мл, более предпочтительно, от 1 до 2 мл.

При введении внутрикожным путем введения объем одной дозы предпочтительно составляет от примерно 0,1 до примерно 0,5 мл, более предпочтительно, примерно 0,2 мл.

Способ, время введения и вводимый объем жидкой вакцинной композиции по изобретению, предпочтительно, интегрированы в существующие графики вакцинации другими вакцинами, которые могут потребоваться субъекту, человеку или животному, с целью уменьшения стресса для субъекта и для снижения затрат на рабочую силу. Эти другие вакцины можно вводить одновременно, параллельно или последовательно, способом, совместимым с их зарегистрированным использованием.

Далее изобретение будет дополнительно описано при помощи следующих неограничивающих примеров.

ПРИМЕРЫ

1. Пример 1: Анализ эмульсий предшествующего уровня техники

Для выяснения того, почему эмульсионные вакцины предшествующего уровня техники распадались, была проанализирована стабильность таких эмульсионных вакцин, содержащих неочищенные неживые бактериальные антигены, с полисорбатом 80 и сорбитан моноолеатом в качестве эмульгаторов. Используемые тестируемые вакцины содержали сочетание из 7 антигенов вирусного и бактериального происхождения, сопоставимо с вакцинами предшествующего уровня техники, и содержали идентичные количества следующих инактивированных антигенов в дозе (0,1 мл) вакцины:

- вирус болезни поджелудочной железы лосося (SPDV), штамм F93-125, ≥75% RPP (1)

- вирус инфекционного некроза поджелудочной железы (IPNV), серотип Sp, ≥1,5 единиц ELISA (2)

- Aeromonas salmonicida, подвид salmonicida, ≥10,7 log2 единиц ELISA (3)

- Vibrio salmonicida, ≥90% RPS (4)

- Vibrio anguillarum серотип O1, ≥75% RPS

- Vibrio anguillarum серотип O2a, ≥75% RPS

- Moritella viscosa, ≥5,8 log2 единиц ELISA (3)

(1) RPP: относительная процентная защита в лабораторном тесте с атлантическим лососем

(2) количество антигена, измеренное в конечном продукте

(3) серологический ответ у атлантического лосося

(4) RPS: относительная процентная выживаемость в лабораторном тесте с атлантическим лососем.

Тестируемые вакцины были сформулированы в виде эмульсий типа вода-в-масле, с легким вазелиновым маслом в качестве адъюванта, и содержали в качестве эмульгатора либо полисорбат 80 и сорбитан моноолеат, либо содержали 0,5% масс/масс Cithrol DPHS в качестве эмульгатора. Соотношение вода:масло по массе в вакцине составляло 45:55.

Варианты были протестированы в отношении присутствия антигена M. viscosa и/или антигена A. salmonicida:

1. тестируемая вакцина с семивалентными антигенами, в виде В/М эмульсии, с использованием эмульгаторов Tween 80 и Span 80

2. тестируемая вакцина 1, но без антигена M. viscosa

3. тестируемая вакцина 1, но без антигена A. salmonicida

4. тестируемая вакцина 1, но без антигенов M. viscosa и A. salmonicida

В соответствующих ускоренных испытаниях стабильности в вакцине № 1 наблюдали распад эмульсии уже через 1 неделю при 37°C, в вакцинах 2 и 3 наблюдали распад эмульсии через 2-3 недели, и вакцина 4 оставалась стабильной в течение полных 3 недель при 37°C.

Затем вакцины были проанализированы на увеличение уровня свободных жирных кислот во время испытаний стабильности в реальном времени при 4°C в течение нескольких месяцев. Это увеличение могло указывать на распад эмульгаторов (полисорбата 80 и сорбитан моноолеата) с течением времени. В разные моменты времени образцы отбирали и анализировали методом твердофазной экстракции (ТФЭ), с последующей эксклюзионной хроматографией (ЭХ). Вкратце: различные образцы нагружали на кремнеземный картридж для ТФЭ, и жирные кислоты элюировали при помощи метанола. Затем на этом элюате проводили разделение методом эксклюзионной хроматографии с использованием системы ВЭЖХ (Agilent™ 1200) с Oligopore™ колонками для гель-проникающей хроматографии при 35°C и при 50 бар. Использовали изократическую подвижную фазу из смеси тетрагидрофуран/уксусная кислота, и обнаружение проводили по показателю преломления. Для калибровки использовали образцы олеиновой кислоты в концентрации 1 или 2 мг/мл. Положительным контролем служил образец, содержащий полисорбат 80 и сорбитан моноолеат в тех же концентрациях, что и в тестируемых вакцинных эмульсиях.

Наложенные хроматограммы, сравнивающие паттерны пиков жирных кислот образцов, протестированных в испытании стабильности, приведены на панелях A и B Фигуры 1. На основании хроматограмм использовали результаты калибровочных образцов олеиновой кислоты для расчета количества свободных жирных кислот, в размерности мг/г, в других тестируемых образцах. Эти рассчитанные количества свободных жирных кислот, образовавшихся в разных тестируемых вакцинах с течением времени при 4°C, представлены на Фигуре 2.

1.1. Результаты:

Наложенная хроматограмма на Фигуре 1 - панели A показывает паттерны пиков жирных кислот, полученные при тестировании олеиновой кислоты (сплошная линия) и контрольного образца эмульгаторов предшествующего уровня техники в неизмененном виде (пунктирная линия). В то время как олеиновая кислота элюировалась в виде одного пика через примерно 20 минут времени элюции, эмульгаторы предшествующего уровня техники элюировались между временными точками 15 и 22 минут в определенном паттерне с несколькими пиками.

На Фигуре 1 - панели B проводится сравнение паттернов пиков жирных кислот, полученных от образцов тестируемых вакцин 1 (семивалентная В/М эмульсионная вакцина - сплошная линия) и 4 (тестируемая вакцина без антигенов M. viscosa и A. salmonicida - пунктирная линия), через 12 месяцев при 4°C.

В случае тестируемой вакцины 4 характерный паттерн пиков, соответствующий эмульгаторам предшествующего уровня техники, можно четко видеть между временными точками 15 и 22 минут, и отсутствует какое-либо увеличение пика олеиновой кислоты во временной точке 20 минут. Следовательно, в данной эмульсионной вакцине эмульгаторы не распадались, и это согласовывалось с наблюдаемой постоянной стабильностью данной вакцины.

Образец тестируемой вакцины 1 все еще демонстрировал некоторый паттерн эмульгаторов, но с меньшей высотой, и, кроме того, виден сильно увеличенный пик во временной точке 20 минут. Это свидетельствует об образовании олеиновой кислоты вследствие распада эмульгаторов, что коррелирует с наблюдаемой нестабильностью полной семивалентной вакцины-эмульсии с течением времени.

Аналогичный результат представлен на Фигуре 2, на которой отчетливо видно, что кумулятивное образование свободных жирных кислот и, следовательно, распад эмульгаторов, в вакцине 4 (без антигенов A. salmonicida и без антигенов M. viscosa) является ничтожно малым. Однако в вакцинах 1-3, содержащих антигены M. viscosa и/или A. salmonicida, высвобождаются значительные количества свободных жирных кислот в первые месяцы хранения. Это продолжается с более низкой скоростью в последующие месяцы. Кроме того, распад, вызываемый антигеном A. salmonicida, происходит в меньшей степени, чем распад, вызываемый антигеном M. viscosa.

1.2. Выводы

В протестированных эмульсионных вакцинах можно было наблюдать высвобождение свободных жирных кислот с течением времени в результате распада эмульгаторов. Это коррелировало с наблюдаемым распадом эмульсии в испытаниях стабильности. Причиной распада эмульгаторов было присутствие неживых бактериальных антигенов из бактерий M. viscosa или A. salmonicida.

Следовательно, было продемонстрировано, что нестабильность эмульсионных вакцин, содержащих масляную фазу и водную фазу, может быть вызвана присутствием неживых бактериальных антигенов, которые вызывают распад эмульгатора полисорбата 80.

2. Пример 2: Испытания эффективности

2.1. Введение

Проводили следующий эксперимент для проверки того, будут ли иметь место последствия для эффективности вакцины в результате замены эмульгаторов предшествующего уровня техники Tween 80 и Span 80 на Cithrol DPHS в качестве эмульгатора. Экспериментальные протестированные вакцины содержали несколько антигенов, минеральное масло в качестве адъюванта, и были сформулированы в виде эмульсий типа вода-в-масле.

Аспекты безопасности этих эмульсионных вакцин также были изучены, но об этом в настоящем документе сообщается очень кратко.

2.2. Материалы и методы

2.2.1. Дизайн эксперимента

Для оценки серологического ответа после вакцинации на молодь атлантического лосося (примерно 35 граммов) за одну неделю до вакцинации воздействовали повышением температуры их воды от 12°C до 17°C, добавляя +2°C через день. Затем рыбу внутрибрюшинно вакцинировали вакцинами Hepta-P (эмульсией, содержащей семивалентный антиген, с полисорбатом и сорбитан олеатом в качестве эмульгаторов) или Hepta-C (аналогичной вакциной, содержащей Cithrol в качестве эмульгатора), в качестве экспериментальных групп. Также была включена контрольная группа, которой инъецировали солевой раствор. Три группы, каждая из 50 рыб, содержали в отдельных резервуарах при 17°C в течение девятинедельного периода иммунизации. Рыбу осматривали ежедневно.

Через 9 недель п/в собирали образцы крови от 35 рыб из каждой группы. Иммунный ответ против Aeromonas salmonicida и Moritella viscosa оценивали методом ELISA в отдельных образцах сыворотки.

2.2.2. Тестируемые вакцины

Обе протестированные вакцины Hepta-P и Hepta-C содержали одни и те же 7 антигенов, также содержащиеся в тестируемой вакцине 1, описанной выше в примере 1. Мнимая вакцина представляла собой стерильный солевой раствор (0,9% NaCl).

Флаконы с вакциной инкубировали в течение ночи при температуре окружающей среды (15°C) и встряхивали вручную перед использованием.

2.2.3. Тестируемые животные

Атлантический лосось, линии: Stofnfiskur, Исландия, смешанного пола, средняя масса при вакцинации составляла 33,5 грамма (n=20).

Тестируемых животных оставляли на 7 дней для акклиматизации к экспериментальным условиям.

Рутинный мониторинг заболеваемости проводил для экспериментальной популяции ветеринар, ответственный за здоровье рыб. Кроме того, рыбы используемой экспериментальной партии показали отрицательные результаты при тестировании на IPNV, SPDV и ISAV методом ПЦР.

Вакцинированные лососи были индивидуально маркированы подрезанием верхнечелюстной кости или подрезанием жирового плавника; лососей, которым вводили контрольное вещество, оставляли без маркировки.

Тестируемых животных содержали в резервуарах с пресной водой при температуре 17°C±2°C с содержанием кислорода по меньшей мере 85%, или при температуре 12°C±2°C с содержанием кислорода по меньшей мере 75%, pH=6,8-7,2.

Корм представлял собой коммерческий рыбный корм, доступный без ограничения. Кормление и контроль окружающей среды осуществляли ежедневно. После вакцинации рыб наблюдали до тех пор, когда они полностью восстанавливались после анестезии.

2.2.4. Вакцинация

Перед вакцинацией экспериментальные рыбы голодали в течение 36 часов и получали анестезию. Животные в экспериментальных и контрольных группах получали вакцину или контрольное вещество путем в/б инъекции в дозе 0,1 мл/дозу с использованием одноразовых шприцев размером 0,5×4 мм.

2.2.5. Мониторинг результатов

Дополнительные серологические данные получали от рыб, содержащихся при температуре 17°C: кровь собирали в 9 н. п/в от 35 рыб из каждой экспериментальной группы, которые содержались при температуре 17°C, и от 12 рыб из контрольной группы. После свертывания крови в течение ночи сыворотки смешивали 1:1 с 86% глицерином и хранили при -20°C до проведения анализа методом ELISA.

Используемые методы Elisa являются стандартными анализами для этих антигенов и, как хорошо известно, являются показателями in vivo эффективности.

Антитела против M. viscosa в сыворотке определяли прямым методом ELISA. Вкратце, планшеты для ELISA покрывали инактивированной M. viscosa, и тестируемые и контрольные сыворотки добавляли в планшет в серийных двукратных разведениях. Связавшиеся антитела обнаруживали при помощи антител кролика против IgM лосося, а затем HRP-конъюгированных антител мыши против IgG кролика. Цветная реакция, отражающая наличие связавшихся антител лосося, развивалась при добавлении субстрата TMB, и степень окрашивания измеряли при помощи ридера для ELISA. Титр антител выражали в виде Log2 значения максимального разведения образца, которое приводило к величине OD, равной 3-кратному среднему значению в отрицательной контрольной сыворотке, измеренному на каждом планшете.

Антитела против A. salmonicida в сыворотке определяли с использованием прямого метода ELISA, аналогичного тому, который описан для M. viscosa, за исключением того, что планшеты для ELISA покрывали инактивированной A. salmonicida. Титр антител выражали в виде Log2 значения максимального разведения образца, которое приводило к величине OD, равной 5-кратному среднему значению в отрицательной контрольной сыворотке, измеренному на каждом планшете.

Титры антител рассчитывали с использованием программы CBA™ (Abend Vertical), и титр выражали в виде Log2 значений максимального разведения, приводящего к 5-кратному превышению среднего фонового значения. Валидность была основана на том, что показатели тестируемых и контрольных образцов находились в определенных диапазонах значений.

2.3. Результаты и обсуждение

2.3.1. Результаты тестирования безопасности и серологии через 9 н. п/в и при 17°C

2.3.1.1. Ответ в виде выработки антител против A. salmonicida через 9 н. п/в

Специфические антитела против M. viscosa и A. salmonicida измеряли в одних и тех же сыворотках.

Титры антител против A. salmonicida, индуцированные вакциной Hepta-C, были значительно выше, чем титры, индуцированные вакциной Hepta-P (ANOVA, p<0,0001), при том, что используемые антигены и их количества были одинаковыми. Обе вакцины приводили к титрам, которые превышали требования к эффективности (10,7 Log2).

Как видно также из меньшего стандартного отклонения, титры антител, индуцированные вакциной Hepta-C, также показали меньший разброс между рыбами, чем в случае рыб, вакцинированных Hepta-P.

Титры ELISA в группе получения солевого раствора были ниже предела обнаружения (6,6). Результаты представлены в Таблице 1.

В группах обеих вакцин были индуцированы значительно более высокие титры антител в сравнении с контрольной группой. При этом вакцина Hepta-C показала даже более хорошие результаты, чем вакцина Hepta-P, с точки зрения эффективности против A. salmonicida.

Таблица 1: Серологические результаты против A. salmonicida через 9 н. п/в и при 17°C

	Log2 титров Ат против A. salmonicida
Группа	среднее значение	стандартное отклонение
Hepta-P (Tween+Span)	13,0	1,8
Hepta-C (Cithrol)	15,2	1,2
Солевой раствор	≤6,6	0,0

2.3.1.2. Ответ в виде выработки антител против M. viscosa через 9 н. п/в

В случае индукции серологического ответа против M. viscosa наблюдали такую же картину, что и в случае A. salmonicida: титры, индуцированные вакциной Hepta-C, были значительно выше (ANOVA, p<0,0001) и с меньшим разбросом, чем титры, индуцированные вакциной Hepta-P, хотя обе вакцины содержали одни и те же антигены и в одних и тех же количествах. Результаты представлены в Таблице 2. Обе вакцины индуцировали титры, которые превышали требования к эффективности (5,8 Log2).

В группах обеих вакцин были индуцированы значительно более высокие титры антител в сравнении с контрольной группой.

Опять-таки, в группах обеих вакцин были индуцированы значительно более высокие титры антител в сравнении с контрольной группой. При этом вакцина Hepta-C показала даже более хорошие результаты, чем вакцина Hepta-P, с точки зрения эффективности против M. viscosa.

Таблица 2: Серологические результаты против M. viscosa через 9 н. п/в и при 17°C

	Log2 титров Ат против M. viscosa
Группа	среднее значение	стандартное отклонение
Hepta-P (Tween+Span)	8,3	1,8
Hepta-C (Cithrol)	11,9	1,2
Солевой раствор	≤4,6	0,0

2.3.1.3. Аспекты безопасности

Некоторые побочные эффекты вакцинации, типичные при использовании масляных эмульсионных вакцин для лосося, наблюдались через 9 недель после вакцинации: внутрибрюшные спайки и меланизация. И то, и другое было в пределах допустимого уровня, и отсутствовали достоверные различия между двумя группами, получавшими экспериментальные вакцины, для любого из побочных эффектов.

2.4. Выводы

Профиль эффективности семивалентного вакцинного препарата на основе Cithrol является по меньшей мере таким же хорошим, как и у аналогичной вакцины, эмульгированной с Tween 80 и Span 80, поскольку у особей, получавших вакцину Hepta-C, был отмечен значительно более сильный иммунный ответ против A. salmonicida и против M. viscosa; в обоих случаях с более высокими титрами антител и с меньшим разбросом. Аспекты, относящиеся к безопасности вакцины, также не подверглись изменениям.

3. Пример 3: Эффективность против SPDV

3.1. Введение

В данном эксперименте авторы изобретения расширили область для результатов эффективности, описанных выше в примере 2. С использованием точно таких же вакцинных препаратов были протестированы защитные свойства при провокационном инфицировании вирусом болезни поджелудочной железы лосося (SPDV). Параллельное сравнение было проведено между препаратом семивалентной вакцины предшествующего уровня техники с эмульгаторами Tween 80+Span 80 и семивалентной вакциной на основе новой эмульсии с Cithrol DPHS в качестве эмульгатора. При вакцинациях использовали только половинную дозу на животное, что соответствует официальному тесту на эффективность для выпуска эффективных партий вакцин от SPDV.

3.2. Материалы и методы

3.2.1. Дизайн эксперимента

Вкратце: акклиматизированную молодь атлантического лосося в/б вакцинировали половиной полной дозы каждой вакцины. Стерильный солевой раствор использовали в качестве мнимой вакцины.

Животных экспериментальных групп выращивали в пресной воде при температуре 12°C в течение 6 недель, затем проводили внутримышечное провокационное инфицирование SPDV. Эффективность вакцин против SPDV определяли в виде относительной процентной защиты (RPP) вакцинированной группы в сравнении с контрольной группой путем обнаружения инфекции SPDV в сыворотке методом ПЦР.

3.2.2. Тестируемые вакцины

Используемые вакцины были такими же, как описано в примере 1: Hepta-P и Hepta-C. Контрольная группа получала солевой раствор (0,9% NaCl). Вакцину вводили в половинной дозе: 0,05 мл, с доставкой внутрибрюшинной инъекцией.

3.2.3. Тестируемые животные

Атлантический лосось, 38 на группу, линия: Salmobreed, смешанного пола, средняя масса при вакцинации составляла 28 граммов (n=20). Разные группы содержали в одном и том же резервуаре, различая их по маркировке.

3.2.4. Провокационное инфицирование

Провокационное инфицирование SPDV проводили через 6 недель после вакцинации. Перед проведением инфицирования всех раб переносили в специальное помещение для провокационного инфицирования и содержали в одном резервуаре в течение оставшихся 10 дней эксперимента.

Материалом для инфицирования был SPDV SAV3 штамма PD03-13p2, при 4,75 Log10 TCID50/мл. Инфицирующий материал вводили отдельным рыбам внутримышечной инъекцией 0,05 мл по боковой линии перед спинным плавником.

3.2.5. Сбор образцов крови после инфицирования

Через десять дней после провокационного инфицирования SPDV из хвостовой вены анестезированной рыбы собирали отдельные образцы крови для анализа методом ПЦР. После свертывания крови в течение ночи сыворотки собирали и хранили замороженными до использования.

3.2.6. ПЦР в реальном времени SPDV

РНК экстрагировали из отдельных сывороток, в которые был добавлен инактивированный вирус лошадиного гриппа, EIV. 35 образцов на группу анализировали с геном nsP1 SPDV, в анализе ПЦР в реальном времени для выявления распространенности виремии SPDV, в качестве меры защиты от провокационного инфицирования. Анализ ПЦР в реальном времени, специфический для гена HA EIV, также проводили для выявления добавленного в сыворотку EIV в качестве положительного контроля качества экстрагирования РНК.

Относительную (эксперимент против контроля) распространенность инфекции SPDV (обнаружение методом ПЦР SPDV в сыворотке) использовали для расчета эффективности тестируемых вакцин, на основании распространенности рыб, положительных по SPDV, после провокационного инфицирования. Уровень защиты выражали в виде абсолютной (+ или -), а также в виде относительной разницы в распространенности инфекции между вакцинированными группами и контрольной группой, как относительную процентную защиту (RPP), которую рассчитывали следующим образом: RPP= [1 - (% ПЦР-положительной рыбы в вакцинированной группе/% ПЦР-положительной рыбы в контрольной группе)] x 100.

Статистический анализ относительного количества в группах инфицированной рыбы с обнаруженным методом ПЦР SPDV в сыворотке выполняли с использованием точного критерия Фишера, сравнивая вакцинированные группы с группой получения солевого раствора. Кроме того, также проводили попарное сравнение между группами распространенности положительной по результатам анализа рыбы в группах, получавших одну и ту же дозу, с использованием точного критерия Фишера. Уровень значимости (α) устанавливали на 0,05, и критерий был двусторонним. Статистические расчеты проводили с использованием программы SAS.

3.3. Результаты и обсуждение

Все образцы были положительными в анализе ПЦР по добавленному гену EIV, что служило внутренним контролем очистки РНК. Таким образом, все образцы были пригодными для анализа.

Обзор результатов анализа ПЦР на SPDV в сыворотках, собранных через 10 д после инфицирования, приведен в Таблице 3, где показаны распространенность и рассчитанное значение RPP для каждой группы в сравнении с распространенностью в группе получения солевого раствора.

Таблица 3: Распространенность и значения RPP по результатам обнаружения методом ПЦР SPDV в сыворотке через 10 д. п/и

Группа	% положительных (Ct≤35)	RPP%
Hepta-P (Tween+Span)	11	88
Hepta-C (Cithrol)	29	71
Солевой раствор	97	0

Результаты ПЦР для группы получения солевого раствора показали, что в/м инфицирование SPDV было успешным, поскольку количество положительных по результатам анализа рыб в этой группе составляло 97% (34 из 35).

Распространенность SPDV-положительной рыбы во всех вакцинированных группах была значительно ниже, чем распространенность в контрольной группе, о чем свидетельствовало значение p в точном критерии Фишера, равное 0,0001.

Важно отметить, что, хотя все вакцинированные животные получали только половинную дозу вакцины, две группы (Hepta-P и Hepta-C) существенно не отличались друг от друга по распространенности инфекции SPDV после провокационного инфицирования; p-значение в двустороннем критерии Фишера составляло 0,133.

3.4. Вывод

Результаты показывают, что вакцинные препараты на основе Cithrol эффективно защищают рыбу от провокационного инфицирования SPDV, и до уровня защиты (от половинной дозы), который незначительно меньше, чем уровень при использовании современных коммерческих вакцин.

4. Пример 4: Оптимизация вакцинной композиции

4.1. Введение

После установления того, что новый вакцинный препарат с полимерным эмульгатором по изобретению может быть использован в качестве безопасной и эффективной вакцины для рыбы, могут быть оптимизированы другие аспекты.

В частности, вязкость нового препарата, протестированная для вакцины Hepta-C, описанной в приведенных выше примерах, была довольно низкой. Хотя это явно не влияло на безопасность и эффективность, было обнаружено, что новая вакцина проявляла признаки так называемой «седиментации» при хранении. Это означает, что при хранении дисперсная водная фаза имеет тенденцию к смещению вниз под действием силы тяжести. Это не то же самое, что распад эмульсии, то есть, утрата дисперсии и наблюдаемое разделение фаз. Кроме того, в отличие от распада, седиментация полностью обратима, и фазы могут быть быстро перераспределены простым встряхиванием вручную перед введением.

Некоторый уровень седиментации является обычным явлением для эмульсионных вакцин типа вода-в-масле, и в большинстве сопроводительных листков-вкладышей рекомендуется быстрое встряхивание эмульсии перед введением. Тем не менее, такая седиментация может сделать коммерческий продукт менее привлекательным внешне. Вследствие этого, авторы изобретения разработали несколько вариантов протестированных препаратов для оптимизации также и этого аспекта новой эмульсии и вакцины.

4.2. Тестируемые варианты

Тестируемый вакцинный препарат Hepta-C имел соотношение воды к маслу 45:55% масс/масс и содержал 0,5% масс/масс Cithrol DPHS; обе процентные величины рассчитаны от массы вакцины. В результате был получен препарат с вязкостью примерно 70 мПз. Вязкость измеряли, как описано в настоящем документе.

Для предотвращения, или по меньшей мере для значительного уменьшения, седиментации водной фазы содержание воды, как и содержание Cithrol, варьировали для повышения вязкости. Протестированными вариантами были варианты с соотношениями вода:масло, составляющими 50:50, 60:40 и 70:30% масс/масс. Кроме того, в некоторых образцах содержание Cithrol было увеличено до 1,0% масс/масс. Композиция протестированных вариантов вакцин была практически такой же, как композиция Hepta-C, помимо тестируемых переменных.

Для оценки влияния разных композиций на седиментацию разные вакцинные композиции разливали в 500-мл флаконы, все до одинакового объема, и хранили их статически в течение 24 часов при 4°C. После этого периода вертикальную высоту седиментационной линии (если она видна) измеряли в миллиметрах, и делили ее на вертикальную высоту всего объема. Любой результат для этого соотношения высот, составляющий менее 1, свидетельствовал о наличии некоторого уровня седиментации.

В небольшом эксперименте с условиями, аналогичными условиям примера 1, варианты эмульсионных вакцин также были протестированы на их способность индуцировать защитные уровни антител против A. salmonicida и M. viscosa. В Таблице 5 представлены результаты титрования методом ELISA; титры защитных АТ соответствуют уровням выше 10,7 или 5,8 Log2, соответственно.

4.3. Результаты

Объединенные результаты для вязкости и седиментации приведены в Таблице 4. Серологические результаты приведены в Таблице 5.

Таблица 4: Влияние вариаций в композиции на вязкость препаратов типа вода-в-масле с Cithrol в качестве эмульгатора

Соотношение вода:масло (% масс/масс)	% масс/масс Cithrol	Вязкость (мПз)	Отношение высоты седиментации
45:55	0,5	57,5	0,67
50:50		72,0	0,79
60:40		135	0,89
70:30		265	1
50:50	1,0	84,0	0,83
60:40		154	0,98
70:30		341	1

Таблица 5: Log2 титров в анализе ELISA, индуцированных при вакцинации вариантами эмульсионных вакцин

Вакцинная композиция	A. salmonicida	M. viscosa
Солевой раствор	≤6,6	≤4,6
Hepta-P	14,0	9,1
Hepta-C, 0,5%, 45:55	16,0	12,8
Hepta-C, 0,5%, 60:40	14,7	11,5
Hepta-C, 0,5%, 70:30	16,1	12,5
Hepta-C, 1%, 50:50	15,4	12,2
Hepta-C, 1%, 60:40	15,9	12,3
Hepta-C, 1%, 70:30	15,8	11,4

4.4. Выводы

Можно сделать несколько выводов:

- увеличение содержания воды в эмульсии оказывает большее влияние на вязкость, чем увеличение содержания Cithrol

- (почти) полное предотвращение седиментации (после 24 часов при 4°C) может быть достигнуто за счет увеличения содержания воды в эмульсии до соотношения 70:30 вода:масло, и/или за счет увеличения содержания Cithrol до 1% масс/масс.

- все вакцинные композиции индуцировали защитные уровни антител против A. salmonicida и M. viscosa.

5. Пример 5: Испытания стабильности образцов вакцин.

Вакцины Hepta-P и Hepta-C, протестированные в примере 2, описанном выше, подвергали испытаниям стабильности: анализу стабильности «во время использования» путем инкубации при 25°C; при этом данная инкубация, продолжающаяся более 8 часов, соответствует расширенному анализу стабильности.

При 25°C вакцинные эмульсии Hepta-P распадались через 5 дней, в то время как эмульсии Hepta-C оставались неизменными вплоть до окончания эксперимента по изучению стабильности через 8 дней.

Подписи к фигурам

Фигура 1:

Наложенные хроматограммы для сравнения паттернов пиков жирных кислот из конкретных образцов:

Панель A: стандартный образец олеиновой кислоты (2 мг/мл) [сплошная линия] и образец эмульгаторов предшествующего уровня техники [пунктирная линия].

Панель B: образцы тестируемой эмульсионной вакцины 1 (полная семивалентная вакцина) [сплошная линия] и тестируемой эмульсионной вакцины 4 (вакцина без антигенов M. viscosa и A. salmonicida) [пунктирная линия].

Горизонтальная ось: время (минуты); вертикальная ось: показатель преломления (оПП).

Фигура 2:

Результаты определения методом эксклюзионной хроматографии образования свободных жирных кислот в результате распада эмульгаторов в эмульсионных вакцинах предшествующего уровня техники.

По горизонтальной оси показано время, в месяцах, хранения при 4°C; по вертикальной оси показано измеренное количество свободной жирной кислоты (ЖК).

Claims (14)

1. Эмульсия для получения вакцины для рыбы, содержащая масляную фазу, водную фазу, эмульгатор и неживой бактериальный антиген, содержащий эстеразу, выбранную из Aeromonas salmonicida или Moritella viscosa, где эмульгатор представляет собой полимерный эмульгатор, который представляет собой блок-сополимер, имеющий общую формулу A-B-A, в которой компонент B представляет собой двухвалентный остаток водорастворимого полиалкиленгликоля и компонент A представляет собой остаток жирорастворимой комплексной монокарбоновой кислоты.

2. Эмульсия по п. 1, где неживой бактериальный антиген содержит инактивированные бактериальные клетки.

3. Эмульсия по п. 1 или 2, представляющая собой эмульсию типа вода-в-масле (В/М).

4. Эмульсия по п. 3, представляющая собой В/М эмульсию, где все из компонентов A и компонента B имеют молекулярную массу по меньшей мере 500 г/моль.

5. Эмульсия по п. 3 или 4, представляющая собой В/М эмульсию, где компонент A представляет собой полигидроксистеариновую кислоту и компонент B представляет собой полиэтиленгликоль.

6. Эмульсия по любому из пп. 3-5, представляющая собой В/М эмульсию, где полимерный эмульгатор представляет собой ПЭГ-30-ди(полигидроксистеарат).

7. Эмульсия по любому из пп. 1-6 для использования в качестве вакцины с целью защиты рыбы от инфекции или заболевания, вызываемого бактерией, выбранной из Aeromonas salmonicida или Moritella viscosa.

8. Способ производства В/М эмульсии по любому из пп. 3-6, включающий этапы:

a) смешивания масляной фазы и полимерного эмульгатора и

b) эмульгирования смеси из этапа a) с водной фазой, при этом водная фаза содержит неживой бактериальный антиген.

9. Вакцина, используемая для защиты рыбы от инфекции или заболевания, вызываемого бактерией, выбранной из Aeromonas salmonicida или Moritella viscosa, которая содержит эмульсию по любому из пп. 1-6.

10. Вакцина по п. 9, предназначенная для защиты рыбы.

11. Применение полимерного эмульгатора по любому из пп. 1 и 4-6 для получения эмульсии из масляной фазы, водной фазы и неживого бактериального антигена, содержащего эстеразу, выбранную из Aeromonas salmonicida или Moritella viscosa.

12. Способ вакцинации рыбы от инфекции или заболевания, вызываемого бактерией, выбранной из Aeromonas salmonicida или Moritella viscosa, включающий введение указанному субъекту вакцины по любому из пп.9, 10.