KR20080041985A - 레시틴 유사유화제를 함유하는 나노좀 형태의 면역증강제및 그의 백신용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 레시틴 유사유화제를 함유하는 나노좀 형태의 면역증강제 및 이를 포함하는 백신용 조성물에 관한 것으로서, 상세하게는 레시틴 유사유화제로서 글리세릴 코코에이트/시트레이트/락테이트 또는 글리세릴 시트레이트/락테이트/리놀레이트/올레이트 중의 어느 하나, 오일 및 수성성분을 함유하는 나노좀 형태의 면역증강제 조성물 및 그의 백신용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 레시틴 유사 유화제를 함유하는 나노좀 형태의 면역증강제 조성물은 보다 강한 면역반응을 유도하고, 약효의 방출시간이 지속적이고, 동물에 적용시 안전성이 크게 증가되어 조성물의 유통기간을 늘여 제품의 단가 및 사용기간을 증가시키는 등 백신의 제형으로서 효과가 매우 우수하다.

레시틴 유사유화제, 나노좀, 면역증강제, 백신용 조성물

Description

레시틴 유사유화제를 함유하는 나노좀 형태의 면역증강제 및 그의 백신용 조성물{Adjuvant of Nanosome Form Comprising Pseudo Lecithin Emulsifier and Vaccine Composition Comprising same}

본원 발명은 레시틴 유사유화제를 이용한 나노좀 형태의 면역증강제(adjuvants) 및 이를 포함하는 백신용 조성물에 관한 것이다.

세균, 바이러스, 기생충 및 마이코플라스마 감염은 소, 돼지 및 친숙한 동물 등의 수의학적 동물에 널리 만연되어 있다. 이러한 감염 인자에 의해 야기된 질병들은 종종 항균 약제 요법에 내성이며, 이는 상기 치료 수단을 무력화한다. 결과적으로, 수의학적 동물들에서 감염성 질병을 억제하기 위해서 백신학적 접근법이 더욱더 사용된다. 전체 감염성 병원균을 화학적 불활성화 또는 적합한 유전자 조작 후에 백신 제형에 사용하기에 적합하게 만들 수 있다. 한편, 상기 병원균의 단백질 서브유닛을 재조합 발현 시스템에서 발현시키고 백신 제형에 사용하기 위해 정제시킬 수 있다.

면역증강제는 일반적으로 항원에 대한 체액 및/또는 세포 면역 반응을 증가시키는 임의의 물질을 지칭한다. 전통적인 백신들은 죽은 병원성 미생물의 비가공 제제로 구성되며, 병원성 미생물의 배양액과 관련된 불순물들은 면역 반응을 향상시키기 위한 면역증강제로서 작용할 수 있다. 그러나, 병원성 미생물 또는 정제된 단백질 서브유닛의 균질 제제를 백신접종을 위한 항원으로서 사용하는 경우, 상기와 같은 항원에 의해 발동된 면역성은 불충분하며 따라서 면역증강제로서 일부 외래물질의 첨가가 필요해 진다. 더욱이, 합성 및 서브유닛 백신은 제조에 비용이 많이 든다. 따라서, 면역증강제의 도움으로 면역 반응을 자극하는데 보다 적은 용량의 항원이 요구될 수 있으며, 이에 의해 백신 생산 비용이 절감될 수 있다.

전통적인 오일 면역증강제(Adjuvants)의 사용은 알루미늄하이드록사이드 등으로 몇몇의 항체와 결합하여 높은 효과를 나타내지만 부작용을 수반한다. 미네날 오일이나 비-미네날 오일을 기반으로하는 새로운 오일 면역증강제의 발전은 이러한 부작용을 피할 수 있다. 이러한 면역증강제는 그 원료(미네랄, 세균, 식물)와 성분(유제 현탁액)에 따라 분류된다. 상업적으로 이용되어지는 면역증강제는 알루미늄하이드록사이드, 카보폴(carbopol) 광물성 오일(미네랄오일) 또는 생분해성(Biodegradable) 오일 등이 있다.

면역증강제는 면역반응을 증폭하기 위하여 백신에 사용되는 것으로, 대부분의 약독생독(MLV) 백신은 면역증강제와 같은 부형제를 포함하지 않아도 면역원성이 높으나, 서브유니트 백신 및 유전자 백신은 면역원성이 약하여 부형제의 개발이 시급한 실정이다. 게다가 상기 서브유니트 백신 및 유전자 백신은 부작용이 적고, 세 균, 바이러스, 기생충 및 마이코플라스마 감염 등의 가축의 감염성 질병에 효과가 우수하여 백신의 부형제 즉, 면역증강제 개발은 당 분야에서 중요한 연구과제가 되고 있다.

다양한 백신을 위한 특정한 면역증강제의 개발은 항체를 좀더 정제하는 것과 마찬가지로 중요한 문제이다. 백신의 면역원성은 부형제의 종류에 따라서 유도 면역계의 방향 및 종류를 결정되며, 정확한 면역반응을 유도하기 위해서 병원체 종류에 따라 각기 다른 부형제를 필요로 한다. 게다가 최근 면역체계에 대한 지식이 진보됨에 따라 특정 병원체에 특이적 면역반응을 일으키는 면역증강제가 개발되었으나 면역증강제가 안전하고 부작용, 또는 국소 작용이나 농의 형성을 일으키지 않는다는 것을 증명하기 위해 반드시 시험이 실시되어야 한다. 따라서 다양한 백신을 위한 범용적이고 보편적인 면역증강제의 개발은 타겟종의 다양함 등으로 개발이 어렵다.

사실상 부형제는 백신 효과의 주요 결정인자이며 실질적으로 백신의 안전성에도 영향을 끼친다. 백신과 함께 부형제는 FDA에서 승인 받고 있다. 이 승인은 주로 도축 시 주사부위 병변이 없어야 한다는 데에 근거하고, 반면에 부작용과 관련한 안전성 및 효능은 백신의 전체적 승인에서 고려된다.

상업적으로 유용한 면역증강제를 구별짓는 요소는 사용되는 제형의 특성에 있다. 카보폴이나 알루미늄하이드록사이드를 함유한 백신은 물을 기반으로하는 현 탁액으로서 제조되나, 오일 면역증강제를 함유한 백신은 다른 유제와 혼합하여 생산된다.

대표적인 오일 면역증강제의 형태로서 수중유적형(O/W), 유중수적형(W/O) 및 다중상(W/O/W)형의 에멀젼 등이 있다.

수중유적형 (오일 인 워터, O/W) 에멀젼

수중유적형 (O/W) 면역증강제를 갖는 백신은 알루미늄하이드록사이드 면역증강제를 갖는 백신보다 더 뛰어난 면역자극 특징을 갖는다. 그러나 비교적 빠른 항원의 유리로 인해 면역자극의 기간이 짧다. 오랜 기간 방어를 하기 위해서는 좀더 강력한 면역증강제 오일이 필요하다. 상업적으로 생산되는 백신 중에서 광물성 오일 부형제는 면역을 자극하는 오일의 형태로서 사용된다. 하지만 수중유적형 면역증강제는 좀더 공격적이어서 염증과 화농 같은 국소반응을 유발할 수 있다. 수중유적형의 면역지속 형태는 물이며, 물속에 확산되는 형태로서 광물성오일(미네날 오일)이 존재한다.

유중수적형(워터 인 오일, W/O) 에멀젼

유중수적형 (W/O) 면역증강제는 생분해성(biodegradable) 오일 안에 항원을 함유하는 매우 작은 물방울이 확산되어 있는 형태로서 제조된다. 항원을 함유하는 오일은 주사 후에 매우 천천히 유리되고 따라서 면역반응을 오랜 기간동안 부드럽 게 촉진시킨다. 유중수적형(W/O)의 항원은 지속적으로 면역반응을 유도한 오일과 그 안에 산개되어 있는 작은 물방울이 함유되어 있다.

오랜 기간의 효과를 가진 1회 접종 백신을 초점으로 할 때 유중수적형(W/O) 면역증강제는 광물성 오일을 함유하는 면역증강제와 비교 시 완만한 항원의 유리는 점진적이고 지속적인 면역반응을 유도하고, 생분해 능력은 더 빠른 면역반응을 가능하게 하며, 비광물성 수중유적형인 2오일 면역증강제는 주사부위의 국소반응을 최소화 시키는 장점을 지낸다.

오일 면역증강제는 일반적으로 유중수적형(W/O) 처방으로 강하고 오랫동안 면역반응을 유도한다. 이러한 것은 미네랄 오일에 기반을 둔 것으로 효과적이나 때때로 국소 부위에 항체반응을 일으킨다. 미네랄 오일이 아닌 다른 오일은 관용적이나 낮은 면역원에 대해 덜 효과적이다. 그러므로 미네랄오일과 다른 오일의 혼합물은 좋은 대안이 될 수 있다. 이러한 오일은 타겟의 종류, 면역반응의 종류, 접종의 루트, 안정성과 면역성간의 좋은 발란스를 획득하려는 의도에 따라 다를 수 있다.

유중수적형(W/O) 면역증강제는 강하고 오랫동안 면역을 유지시켜주는데 동물에 있어 발이나 입의 질환의 경우에 있어 증명된다. 소의 경우 한번의 접종으로 1년 동안 보호가 된다. 미네랄 오일을 베이스로 한 이것은 매우 효과적이다.

때때로 국소 반응이 발생하더라도 유중수적형 에멀젼은 다른 처방에 비해서 특정질병에 에 대항하는 효과가 좋기 때문에 사용되어진다.

비-미네날 오일은 투여하는 개체에 관용적이나 면역반응은 덜 효과적이다.

다중상(원터인 오일인 워터, W/O/W) 에멀젼

다중상 에멀젼은 다양한 항체와 반응하여 수중유적형(O/W) 면역증강제처럼 짧거나 유중수적형(W/O) 면역증강제처럼 장기간 면역반응을 유도할 수 있다. 이것은 일반적으로 유중수적형 처방보다 더 관용적인 것으로 알려져 있다. 외부의 수상은 높은 유동성을 부여하고 빠른 항원 반응을 유도해 준다. 안쪽의 수상은 오일에 의해 쌓여 있는 층으로 항체의 방출을 서서히 한다. 따라서 장기간의 면역 반응 유지시킬 수 있다.

새로운 면역증강제의 형태인 나노좀은 현재 새로운 컨셉으로서, "이뮤노졸(Immunosol)"이라고도 한다. 이 면역증강제의 역할은 아직까지 명확하지 않고 메커니즘도 다른 것으로 알려져 있다. 일반적으로 상기 나노좀 형태의 면역증강제의 작동 원리는 엔트랩된 항체의 저장소로 이해되어진다. 면역체계를 통하여 입자의 마이크로 확산에 의해 면역능을 가진 세포(예로서 B세포, T세포)를 늘려주거나 항원을 내어놓는 세포(Antigen presenting cell;APC)에 항체의 흡수를 촉진하는 것이다. 다른 메커니즘에는 림프구 트랩핑이나 사이토카인의 유도 및 항체 형성의 유도 및 흡수를 위한 세포막의 교란(Modification)등이 있다.

본 발명의 앞서 선행되어 나노좀 형태의 특허로 등록된 최근의 유사문헌은 US 2004/0258701A1이라는 미국특허로서 레시친을 이용하여 1차 유화한 후 이를 다시 초고압 균질기에 항원과 같이 투입하여 나노좀을 만드는 방법이며 국내에서 이 특허는 공개번호 10-2006-0006909로서 등록되어 있다.

상술한 종래기술에는 오일에 기반을 둔 유제현탁액 면역증강제가 경우에 따라 알루미늄 염보다 더 효과가 좋은 것이 사실이나, O/W 면역증강제의 경우에는 초기 면역반응은 강하나 장기간 지속되지 않으며, W/O 면역증강제의 경우에는 국소적인 부작용을 일으킬 수 있는 등의 문제점이 있다. 게다가 상기 두 가지의 면역증강제의 단점을 개선한 W/O/W 면역증강제의 경우, 레시틴을 포함하는 면역증강제가 나노좀 형태로 개발되어있으나, 비용이 비싸고 일반적인 계면활성제에 비해 안정성이 떨어지는 단점이 있다.

이에 본 발명자들은 보다 효과적이고 안전한 면역증강제의 개발을 위하여 예의 노력한 결과, 레시틴의 한계를 극복하고 이와 유사한 특징을 갖지만 산화 안정성과 제형 안정성이 획기적으로 개선된 레시틴 유사유화제를 함유하는 W/O/W 형태의 나노좀이 면역증강제로 유용하다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 레시틴 유사유화제를 이용한 나노좀 형태의 면역증강제 조성물 및 이의 백신용 조성물을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 레시틴 유사유화제인 글리세릴 코코에이트/시트레이트/락테이트 또는 글리세릴 시트레이트/락테이트/리놀레이트/올레이트, 오일 및 수성성분을 함유하는 나노좀을 포함하는 면역증강제 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적은 상기 면역증강제 및 항원성 물질을 포함하는 백신용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또 다른 목적은 상기 백신용 조성물을 인간을 제외한 동물에 주입하여 항원에 대한 항체 생성률을 높이는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명에서 용어 "레시틴 유사유화제"는 비이온성 계면활성제로서, 난황 및 대두에 다량으로 포함된 천연계면활성제인 레시틴과 화학적 구조가 유사한 화학물을 말한다. 본 발명의 레시틴 유사유화제는 하기의 구조에서 알 수 있듯이 시트릭애씨드와 라틱애씨드의 에스테르 결합에 다시 두 개의 글리세롤을 양쪽에 에스테르 결합시키고 다시 결합된 두 개의 글리세린기 OH에 각각 코코넛애씨드를 에스테르 결합시킨 것이며, 이때 R은 탄소수 12~16개인 포화지방산으로 구성되어있다. 하기 구조의 화학물은 포스파티딜콜린이 결합된 레시틴과는 달리 시트릭애씨드 락테이트 글리세롤 코코넛오일의 에스테르 결합으로 연결된 특징을 지닌 것으로, 구체적인 예로서 글리세릴 시트레이트/락테이트/리놀레이트/올레이트, 글리세릴 코코에이 트/시트레이트/락테이트 등이 있으며, 이로 제한하지 않는다. 상기 레시틴 유사유화제는 화학적으로 합성할 수 있으며, 자연계에서 추출할 수도 있고, 상품화 된 것을 구입하여 사용할 수도 있다

<레시틴 유사유화제의 구조>

* 상기 구조식에서 R1 및 R2는 C12-C16의 알킬기이다.

본 발명의 면역증강제 조성물에서 레시틴 유사유화제의 함량은 면역증강제 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 20% 중량% 이며 바람직하게는 0.1 내지 5%이다.

본 발명의 면역증강제 조성물에서 레시틴 유사유화제의 보조유화제로 폴리솔베이트(Polysorbate), 소르비탄올리에이트, 소르비탄세스퀴올리에이트를 사용할 수 있으며, 상기 폴리솔베이트는 예를 들어 트윈-80, 트윈-60, 트인-40 및 트윈-20이고, 소르비탄 올리에이트는 Span 80이고, 소르비탄세스퀴올리에이트는 Arlacel 83이다. 상기 보조유화제의 함량은 면역증강제 조성물의 총 중량에 대하여 0.1 내지 2 중량% 이며, 바람직하게는 0.2 내지 1 중량%이다.

본 발명에 사용된 "오일"은 투여되는 동물 및 동물 환자의 신체에 의해 대사될 수 없는 오일로서, 무기오일을 지칭한다.

본 발명에 사용된 "동물" 및 "동물 환자"는 모든 비인간 동물, 예를 들어 소, 양, 말, 염소 및 돼지를 지칭한다.

상기에서 언급한 "무기 오일"은 증류 기법을 통해 석유로부터 수득된 액체 탄화수소들의 혼합물을 지칭한다. 상기 용어는 "무기 경유", 즉 석유의 증류에 의해 유사하게 수득되지만 비중이 유동 파라핀보다 약간 더 낮은 오일을 포함한다. 상기 오일에는 알케인, 알켄, 알카인, 및 이들의 상응하는 산 및 알콜, 이들의 에테르 및 에스테르, 및 이들의 혼합물이 포함된다. 바람직하게는, 상기 오일의 개별적인 화합물들은 가벼운 탄화수소 화합물, 즉 탄소수 6 내지 30의 상기와 같은 성분들이다. 상기 오일을 합성에 의해 제조하거나 또는 석유 산물로부터 정제할 수 있다. 상기 오일은 대사될 수 없는 오일로, 본 발명의 면역증강제 및 백신 조성물에 사용하기에 바람직한 비극성 오일로서 예를 들어 미네랄 오일, 스쿠알렌, 하이드로게네이티드 폴리데센(hydrogenated polydecene), 하이드로게네이티드 캐스트롤(hydrogenated castrol), 파라핀 오일 및 사이클로 파라핀 등이 있으며, 이로 제한되지 않는다.

본 발명의 면역증강제 조성물에서 오일 성분은 면역증강제 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 50 중량%이며, 바람직하게는 1 내지 20 중량%이며 보다 바람직하게는 1 내지 10 중량%이다.

본 발명의 수성 성분은 물, 완충 염수 또는 임의의 다른 적합한 수용액일 수 있으며, 면역증강제 조성물 총 부피에 대하여 1 내지 90 중량%의 양으로 존재한다.

본 발명에서 용어 "나노좀"은 통상적인 리포좀의 형태를 갖는 것으로 평균 소적 크기가 50 내지 500 nm이며, 바람직하게는 80 내지 300 nm이며, 가장 바람직하게는 100 내지 200nm인 나노화된 리포좀을 의미한다. 상기에서 언급한 용어 "리포좀"은 수용성 머리와 불용성의 꼬리를 가진 양친매성 분자로 구성된 입자의 상호 자발적인 결합 및 정렬된 콜로이드 입자로, 내부에는 친수성의 공간이 있으며 외부로는 닫힌 이중의 지질막을 가지고 있는 미세 소포체(일종의 주머니)로서 세포막과 유사한 이중막 구조를 가진다. 나노좀은 중앙의 친수성공간에 수용성 분자(DNA 포함)나 혹은 약물을 내포시키며, 외부의 지질 이중막에는 지용성 약물을 붙이거나, 혹은 양전하 및 음전하 물질을 결합시킬 수 있다. 나노좀의 가장 큰 특성은 다양성과 신축성으로 구조 변경이 용이하며, 구조와 성분을 달리 함으로서 전혀 새로운 물성과 기능 및 용도가 제공될 수 있다. 여기에 나노좀은 생체 적합성과 분해성, 안정성이 뛰어난 장점이 있어 수없이 많은 물질 및 약물의 전달물질로 광범위하게 이용될 수 있다. 일반적으로 나노좀을 포함한 리포좀이 약물 및 유전자전달에 유용한 이유는 크게 4가지로서: 1) 약물이나 DNA를 싸서 보호하여 혈중 내 효소 등에 의해 파괴되는 것을 막고; 2) 원 상태로는 세포 내로 들어가기 힘든 물질, 예컨대 DNA를 세포내로 끌고 들어가는 기능이 있으며; 3) 약물방출이 지연되도록 조절하는 일종의 약물송달시스템(DDS)역할을 할 수 있으며;4) 치료 물질을 표적세포로 향하게 하거나, 혹은 특정 부위로 가는 것은 막는 기능을 할 수 있다. 이로서 본 발명의 나노좀은 표적 약물의 효과를 극대화하면서 부작용을 최소화할 수 있는 장점이 있다.

본 발명의 면역증강제 조성물에 포함 가능한 물질로는 항암제(예로서, 아드리아마이신(adriamycin)), 항진균제(예로서, 암포테리신 비(amphotericin B)), 항세균제, 면역조절물질, 항원 및 항체, 사이토카인, 조영제(imaging agents), 헤모글로빈, 성장인자 등의 펩타이드, 단백질, 지방, 그리고 DNA 등이 있으며, 적합하고 바람직한 추가 성분들, 예를 들어 보존제, 삼투제, 생체 결합성 분자, 및 면역자극 분자를 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 나노좀은 생체세포막과 유사하므로 생체막 기능연구와 약물투과의 모델로도 널리 이용될 수 있다.

본 발명의 면역증강제는 W/O/W 형태로, 외부상은 수상이므로 부드럽게 혈관에 침투될 수 있으며, W/O 형태보다 지속시간이 길며, 생분해성 물질로서 안전하여 동물에게 스트레스를 덜 주며, W/O/W 면역증강제보다 크기가 작고 외부막이 견고해 약물의 안정성을 확보하는 등 약물의 효과를 극대화 한다.

본 발명의 나노좀의 "평균 소적 크기"는 입자 크기의 부피 분포 내의 부피 평균 직경(이하, VMD) 입자 크기를 지칭한다. 상기 VMD는 각각의 입자직경에 상기 크기의 모든 입자들의 부피를 곱하고 합하여 산출된다. 이어서 상기를 모든 입자의 전체 부피로 나눈다.

본 발명은 또한, 상기 면역증강제 조성물 및 항원성 물질을 함유하는 백신용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어 "백신"은 생체에 면역을 주는 항원을 함유한 생물학적인 제제(製劑)로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원(免疫原)을 말한다. 생체내 면역은 병원균의 감염 후에 생체내 면역력이 자동으로 얻어지는 자동면역과 외부에서 주입한 백신에 의하여 얻어지는 수동 면역으로 크게 나누어진다. 자동면역이 면역에 관계하는 항체의 생성 기간이 길고 지속적인 면역력의 특징이 있는 반면, 백신에 의한 수동 면역은 감염증 치료에 즉시 작용하나 지속력이 떨어지는 단점이 있다.

본 발명의 상기 항원성 물질은 펩티드, 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 발현하는 유산균, 단백질, 상기 단백질을 발현하는 유산균, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 재조합 박테리아 및 재조합 바이러스로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다. 구체적인 예를 들면, 상기 항원 물질은 불활성화된 전체 또는 부분 세포 제제 형태, 또는 통상적인 단백질 정제, 유전 공학 기법 또는 화학 합성에 의해 수득되는 항원 분자 형태의 마이코플라스마 MYO, 마이코플라스마 하이오뉴모니아에, 해모필루스솜누스, 해모필루스 파라수이스, 보르데텔라 브론치셉티카, 액티노바실러스 플레우로뉴모니아에, 파스테우렐라 뮬토시다, 만헤이미아 헤몰리티카, 마이코플라스마 보비스, 마이코플라스마 갈라나시에움, 마이코박테륨 보비스, 마이코박테륨 파라 튜베르큘로시스, 클로스트리디알 스페시즈, 스트렙토코커스 유베리스, 스트렙토코커스 수이스, 스타필로코커스 아우레우스, 에리시펠로트릭스 루소파티아에, 캄필로박터 스페시즈, 퓨소박테륨 네크로포룸, 에스케리키아 콜라이, 살로넬라 엔테리카 세로바르스, 렙토스피라 스페시즈와 같은 병원성 세균; 칸디다와 같은 병원성 진균; 크립토스포리듐 파르븀, 네오스포라 카늄, 톡소플라스마 곤디, 에이메리아 스페시즈와 같은 원생동물; 오스테르타지아, 쿠페리아, 헤몬큐스, 파시올라와 같은 장내 기생충으로부터 제조된 항원이 있다. 추가적인 항원에는 불활성화된 전체 또는 부분 세포 제제 형태, 또는 통상적인 단백질 정제, 유전 공학 기법 또는 화학 합성에 의해 수득되는 항원 분자 형태의, 개 파보 바이러스, 소 헤르페스바이러스-1,3,6, 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV) 유형 1 및 2, 소 파라인플루엔자 바이러스, 소 호흡기 합포체 바이러스, 소 백혈증 바이러스, 린더페스트 바이러스, 구제역 바이러스, 광견병, 돼지 열 바이러스, 아프리카 돼지 열 바이러스, 돼지 파르보바이러스, 돼지 위장염 바이러스, PRRS 바이러스, 돼지 써코바이러스, 인플루엔자 바이러스, 돼지 잔물집병 바이러스, 테첸열 바이러 스, 의사광견병 바이러스 등의 병원성 바이러스가 포함된다.

상기 항원의 함량은 백신 조성물 총 중량에 대해서 1~50 중량%이며, 바람직하게는 10~ 30% 중량%이다.

본 발명에 따른 백신용 조성물은 안정제, 유화제, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, pH 조정제, 계면활성제, 리포솜, 이스콤(iscom) 보조제, 합성 글리코펩티드, 증량제, 카복시폴리메틸렌, 세균 세포벽, 세균 세포벽의 유도체, 세균백신, 동물 폭스바이러스 단백질, 서브바이랄(subviral) 입자 보조제, 콜레라 독소, N, N--디옥타데실-N',N'-비스(2-하이드록시에틸)-프로판디아민, 모노포스포릴 지질 A, 디메틸디옥타데실-암모늄 브로마이드 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 제 2 보조제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 따른 백신용 조성물은 전립선암, 결장암, 폐암, 유방암, 난소암, 두경부암, 외음부암, 방광암, 뇌암 및 신경교종으로 선택된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 질병의 예방용 또는 치료용인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 또한 수의학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. "수의학적으로 허용 가능한 담체"란 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항원보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 작용제, 흡착지연제 등을 포함한다. 백신용 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제로는 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 글리세린, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드 록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

또한, 본 발명의 백신용 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 슈크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비 경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 백신용 조성물을 인간을 제외한 동물에 주입하여 항원 에 대한 항체 생성률을 높이는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 "인간을 제외한 동물"은 포유류 또는 조류인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 "주입"은 피하주사, 근육내 주사, 피하내 주사, 복막내 주사, 비강투여, 구강투여, 경피투여 및 경구투여로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기에서 "주사" 또는 "투여"는 투여대상의 나이, 성별, 체중 등에 따라 투여량이 달라질 수 있고, 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서도 백신의 투여량이 본 발명의 백신용 면역증강제는 비경구, 점막(경구 및 비강 등) 및 경피성 경로에 의한 백신 투여시 함께 사용할 수 있다.

하기의 실험예 및 실시예들은 본 발명의 내용을 설명하나, 본 발명의 내용이 이에 한정된 것은 아니다.

실시예 1. 나노좀 형태의 면역증강제 제형의 제조

하기 표 1의 조성으로 나노좀 형태의 면역증강제를 제조하였다.

나노좀 형태의 면역증강제의 제조 (함량: 중량%)

성분		비교예1	비교예2	비교예3	비교예4	비교예5	실험예1	실험예2	실험예3	실험예4	실험예5	실험예6	실험예7	실험예8	실험예9	실험예10
정제수		to 100	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100
레시틴		0.1	1	4	10	20	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
A	글리세릴 시트레이트/ 락테이트/ 리놀레이트/ 올레이트	-	-	-	-	-	0.1	1	4	10	20	-	-		-	-
	글리세릴 코코에이트 / 시트레이트/ 락테이트	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0.1	1	4	10	20
B	미네랄 오일	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2
	트윈 60	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
C	마이코플라즈마 MYO	20	20	20	20	20	20	20	20	20	20	20	20	20	20	20

A상과 B상을 각각 80℃까지 가열하여 완전히 용해하고 B상을 A상에 혼입한 후 호모믹서(TK-homomixer, 마크-2-F)를 이용하여 3500rpm으로 혼합물을 유화시켰다. 유화된 혼합액은 40℃까지 천천히 냉각시킨 후 40℃가 되면 C상의 항원을 혼입한 다음, A, B, 및 C상이 혼합된 혼합액을 상기와 동일한 호모믹서를 이용하여 3500rpm으로 교반한 후 미세균질기(Niro. Soavi, 이탈리아)를 이용하여 1000Bar의 압력으로 각각 3회씩 통과시켰다.

상기 레시틴 유사유화제인 A 상의 글리세릴 시트레이트/락테이트/리놀레이트/올레이트 및 글리세릴 코코에이트/시트레이트/락테이트는 독일의 사솔(Sasol)사로부터 구입하여 사용하였고, 항원성분인 C상의 마이코플라즈마 MYO는 Mycoplasma Hyopnemoniae OD410=0.1을 완충용액에 10% 농도로 용해하여 사용하였다.

실시예 2. 나노좀 입자의 입도 분포

본 발명의 면역증강제 조성물의 나노좀 입자의 입도 분포를 분석하기 위하여 상기 실시예 1의 비교예 1 내지 5 및 실험예 1 내지 10를 10%-Microplasma Hyopnemoniae OD410=0.1 완충용액에 적당한 농도로 희석한 후 나노좀 입자의 입도를 측정하였다. 상기 나노좀 입자의 입도는 제타사이저 엔에스(Zetasizer Ns) 장비를 이용하여 빛 산란방식을 분석하고 그 결과를 도 1과 도 2의 그래프로 나타내었다.

도 1 및 2 의 그래프에서도 알 수 있듯이, 레시틴유사유화제로 제조된 본 발명의 실험예 8의 면역증강제의 나노좀 입자의 입도분포(도 1)는, 레시틴을 포함하는 비교예 3의 조성물의 나노좀 입도분포(도 2)에 비해 그 균일도가 훨씬 우수하였다.

실시예 3. 나노좀 입자의 에너지 여과 투과 전자 현미경(EF-TEM)사진

글리세릴 코코에이트/시트레이트/락테이트를 포함하는 본 발명의 면역증강제 조성물의 나노좀 입자의 다중층 형성 여부를 판별하기 위하여 실험예 8의 조성물의 나노좀의 계면을 에너지 여과 투과 전자현미경(EF-TEM, Carl Zeiss)을 이용하여 촬영하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3 의 결과에서도 알 수 있듯이, 레시틴유사유화제인 글리세릴 코코에이트/시트레이트/락테이트로 제조된 본 발명의 면역증강제 조성물의 나노좀 입자의 계면이 이중층으로 구성된 것을 확인할 수 있었다. 모양이 원형이 아닌 것은 입자의 강도가 유연하기 때문인 것으로 판단된다.

실시예 4. 면역증강제 조성물의 안정성 시험

실시예 1에서 제조한 비교예 1 내지 5 및 실험예 1 내지 10의 조성물의 안정성 시험을 실시하였다. 안정성 평가는 조성물의 침전상태, 색상, 변취 정도를 4℃, 25℃, 42℃ 및 24시간 주기로 하여 4℃ 내지 50℃로 순환하는 온도순환의 조건에서 8주 동안 확인하였으며, 그 결과를 표2에 나타내었다.

면역증강제 조성물의 안정성 시험

안정성	침전상태				변취	색상
(온도)	25℃	42℃	온도순환	4℃	42℃	42℃
비교예 1	안정	안정	침전	침전	산패됨	변색(노란색)
비교예 2	안정	안정	침전	침전	산패됨	변색(노란색)
비교예 3	안정	안정	침전	침전	산패됨	변색(노란색)
비교예 4	안정	안정	침전	침전	산패됨	변색(노란색)
실험예 1	안정	안정	안정	안정	안정	안정(백색)
실험예 2	안정	안정	안정	안정	안정	안정(백색)
실험예 3	안정	안정	안정	안정	안정	안정(백색)
실험예 4	안정	안정	안정	안정	안정	안정(백색)
실험예 5	안정	안정	안정	안정	안정	안정(백색)
실험예 6	안정	안정	안정	안정	안정	안정(백색)
실험예 7	안정	안정	안정	안정	안정	안정(백색)
실험예 8	안정	안정	안정	안정	안정	안정(백색)
실험예 9	안정	안정	안정	안정	안정	안정(백색)
실험예 10	안정	안정	안정	안정	안정	안정(백색)

표 2의 결과에서도 알 수 있듯이, 레시틴으로 제조된 나노좀(비교예 1 내지 4)의 경우 4℃, 42℃ 및 24시간 주기로 하여 4℃ 내지 50℃로 순환하는 온도순환 조건에서 침전과 합일이 발생하나 레시틴 유사유화제인 글리세릴 코코에이트/시트레이트/락테이트를 포함하는 본 발명의 면역증강제 조성물의 경우에는 침전이나 변색 또는 변취 없이 안정하였다.

실시예 5. 면역증강제 조성물의 안전성 시험

본 발명의 면역증강제 조성물의 안전성을 시험하기 위하여 PBS에 희석한 본 발명의 실험예 8을 함량별로 준비하고, 하기와 같이 마우스, 기니픽, 토끼, 닭, 자돈에 대한 안전성 시험을 실시하였다. 그 시험결과는 하기 표 3에 나타내었다.

(1) 마우스에 대한 안전성 시험

체중 15-20g의 마우스 20마리를 공시하여 10마리에는 0.1㎖를 다른 10마리에는 0.2㎖를 피하에 접종하고 7일간 관찰하여 이상 없이 생존하는지 확인하였다.

(2) 기니픽에 대한 안전성 시험

체중 300~400g의 기닉픽 15마리를 공시하여 근육 및 피하에 각각 5마리에 1㎖를 접종하고 7일 관찰하며 5마리는 0.1㎖씩 피내에 접종하여 7일간 관찰하여 이상 없이 생존하는지 확인하였다.

(3) 토끼에 대한 안전성 시험

체중 2㎏의 토끼 5마리에 2㎖를 근육 접종하고 7일간 관찰하여 이상없이 생존하는지 확인하였다.

(4) 닭에 대한 안전성 시험

6~8주령의 닭 10마리에 대하여 1㎖를 근육 접종하고 14일간 관찰하여 이상없이 생존하는지 확인하였다.

(5) 자돈에 대한 안전성 시험

생후 1~2개월령의 건강한 자돈 2마리에 백신 규정량의 2배를 근육에 접종하여 접종 후 1~2시간 이내에 과민반응이 없어야 하며 10일간 관찰하여 주사부위에 화농 및 괴사 등의 부작용이 없이 생존하는지 확인하였다.

면역증강제 조성물의 안전성 결과

조성물 함량	접종동물	접종수	접종량	접종부위	관찰일수	임상관찰	시험결과
10%	마우스	10	0.1㎖	피하	7	Normal	10/10 적합
		10	0.2㎖	피하	7	Normal	10/10 적합
	기니픽	5	1㎖	근육	7	Normal	5/5 적합
		5	1㎖	피하	7	Normal	5/5 적합
		5	0.1㎖	피내	7	Normal	5/5 적합
	토끼	5	2㎖	근육	7	Normal	5/5 적합
	닭	10	1㎖	근육	14	Normal	10/10 적합
	돼지	2	2㎖	근육	10	Normal	2/2 적합
20%	마우스	10	0.1㎖	피하	7	Normal	10/10 적합
		10	0.2㎖	피하	7	Normal	10/10 적합
	기니픽	5	1㎖	근육	7	Normal	5/5 적합
	토끼	5	2㎖	근육	7	Normal	5/5 적합
	닭	10	1㎖	근육	14	Normal	10/10 적합
	돼지	2	2㎖	근육	10	Normal	2/2 적합
30%	마우스	10	0.1㎖	피하	7	Normal	10/10 적합
		10	0.2㎖	피하	7	Normal	10/10 적합
	기니픽	5	1㎖	근육	7	Normal	5/5 적합
		5	1㎖	피하	7	Normal	5/5 적합
		5	0.1㎖	피내	7	Normal	5/5 적합
	토끼	5	2㎖	근육	7	Normal	5/5 적합
	닭	10	1㎖	근육	14	Normal	10/10 적합
	돼지	2	2㎖	근육	10	Normal	22 적합

실시예 6. 면역증강제 조성물을 포함하는 시험백신의 안전성 시험 및 효능효과

본 발명의 면역증강제 조성물의 함량별 시험백신을 제작하고 시험백신의 안전성 및 항체가 검정시험을 실시하였다. 이때 상기 시험백신은 면역증강제 조성물로서 실험예 8을 함량별로 준비하고, 마이코플라즈마 하이오뉴모니아 (Mycoplasma hyopnemoniae; OD410=0.1) 및 PBS를 이용하여 제작하였다.

6-1. 시험백신의 안전성 시험

시험백신의 안전성 시험은 실시예 5에서 실시한 동물에 대한 안전성 시험방법과 동일하게 실시하였으며, 그 결과는 표 4에 나타내었다.

시험백신의 농도별 안전성 시험

조성물 함량	접종동물	접종수	접종량	접종부위	관찰일수	임상관찰	시험결과
1%	마우스	10	0.1㎖	피하	7	Normal	10/10 적합
		10	0.2㎖	피하	7	Normal	10/10 적합
	기니픽	5	1㎖	근육	7	Normal	5/5 적합
		5	1㎖	피하	7	Normal	5/5 적합
		5	0.1㎖	피내	7	Normal	5/5 적합
	토끼	5	2㎖	근육	7	Normal	5/5 적합
	닭	10	1㎖	근육	14	Normal	10/10 적합
	돼지	2	2㎖	근육	10	Normal	2/2 적합
10%	마우스	10	0.1㎖	피하	7	Normal	10/10 적합
		10	0.2㎖	피하	7	Normal	10/10 적합
	기니픽	5	1㎖	근육	7	Normal	5/5 적합
		5	1㎖	피하	7	Normal	5/5 적합
		5	0.1㎖	피내	7	Normal	5/5 적합
	토끼	5	2㎖	근육	7	Normal	5/5 적합
	닭	10	1㎖	근육	14	Normal	10/10 적합
	돼지	2	2㎖	근육	10	Normal	2/2 적합
20%	마우스	10	0.1㎖	피하	7	Normal	10/10 적합
		10	0.2㎖	피하	7	Normal	10/10 적합
	기니픽	5	1㎖	근육	7	Normal	5/5 적합
	토끼	5	2㎖	근육	7	Normal	5/5 적합
	닭	10	1㎖	근육	14	Normal	10/10 적합
	돼지	2	2㎖	근육	10	Normal	2/2 적합
30%	마우스	10	0.1㎖	피하	7	Normal	10/10 적합
		10	0.2㎖	피하	7	Normal	10/10 적합
	기니픽	5	1㎖	근육	7	Normal	5/5 적합
		5	1㎖	피하	7	Normal	5/5 적합
		5	0.1㎖	피내	7	Normal	5/5 적합
	토끼	5	2㎖	근육	7	Normal	5/5 적합
	닭	10	1㎖	근육	14	Normal	10/10 적합
	돼지	2	2㎖	근육	10	Normal	22 적합

6-2. 시험백신의 항체가 시험.

본 발명의 면역증강제 조성물을 포함하는 시험백신의 효능을 알아보기 위하여 다음과 같이 시험을 실시하고 항체가를 검정하였다.

상기 시험백신의 효능은 마우스 30마리를 공시하여 백신규정량의 1/10(0.1㎖)를 피하에 접종하고 14일 후 채혈하여 ELISA법으로 마이코플라즈마 하이오뉴모니아 항체가를 측정하고 각 시험백신별로 항체가를 비교하였다. 이때 본 발명의 면역증강제 조성물의 항체가가 대조군이 10배 이하이고 시험군이 512배 이상일 때 효능효과가 있다고 판단하였다.

본 발명의 면역증강제 조성물의 함량(실험예 8)	평균항체가 (소수첫째자리반올림)
0 (음성대조군:음성혈청)	0
1%	757.9
10%	1515.7
20%	1777.5
30%	2746.7

표 5의 결과에서도 알 수 있듯이, 본 발명의 면역증강제 조성물 함량이 1 내지 30% 모두에서 시험백신의 효능이 뛰어난 것으로 나타났으며, 면역증강제 조성물의 함량이 높을수록 백신의 효능이 증가함을 관찰할 수 있었다.

이상에서 상세히 설명하듯이, 레시틴 유사유화제를 함유하는 본 발명의 면역증강제 조성물은 보다 강한 면역반응을 유도하고, 약효의 방출시간이 지속적이고, 동물에 적용시 안전성도 탁월하였다. 더 구체적으로, 상기 면역증강제 조성물은 종래의 레시틴을 함유하는 면역증강제 조성물에 비해서 제조과정이 용이하고, 밀도가 균일하고, 산화 및 산패를 막음으로써 입자의 침전을 억제하고, 제형의 안정성이 크게 증가되어 조성물의 유통기간을 늘여 제품의 단가 및 사용기간을 증가시키는 등 백신의 제형으로서 효과가 매우 우수하다.

최근, 올레오 케미칼 기술이 발전을 거듭함에 따라 다양한 제품들이 시중에 판매되고 있고, 이들 중 값비싼 레시틴을 대체할 수 있는 화합물이 없을까 연구하던 중에 본 발명과 같이 글리세릴 코코에이트/시트레이트/락테이트 또는 글리세릴 시트레이트/락테이트/리놀레이트/올레이트와 같은 레시틴 유사유화제를 포함하는 나노좀이 생간단가가 저렴하면서도 레시틴보다 훨씬 월등한 효과를 나타냄을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었으며, 상기 성분들을 부형제로 한 나노좀을 개발하게 되었다.

현재 본 발명자들은 글리세릴 코코에이트/시트레이트/락테이트 또는 글리세릴 시트레이트/락테이트/리놀레이트/올레이트와 같은 레시틴 유사유화제를 포함하는 나노좀에 여러가지 항원을 접목시켜 다양한 동물백신으로 개발 중이며, 화장품 또는 농약 전착제(식물에 잘 달라붙게 하는 용도)로서 개발이 진행 중이다.

도 1은 레시틴으로 제조된 면역증강제의 나노좀 입자의 입도분포를 나타낸 그래프이다.

도 2는 글리세릴 코코에이트/시트레이트/락테이트로 제조된 면역증강제의 나노좀 입자의 입도분포를 나타낸 그래프이다.

도 3은 글리세릴 코코에이트/시트레이트/락테이트로 제조된 면역증강제의 나노좀 입자의 전이 전자현미경(TEM)사진이다.

Claims (9)

1. 하기 구조식 1로 정의되는 레시틴 유사유화제, 오일성분 및 수성성분을 함유하는 나노좀 형태의 면역증강제 조성물.

   <구조식 1>

   

   상기 구조식 1에서 R1 및 R2는 C12-16의 알킬기이다.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 레시틴 유사유화제는 글리세릴 코코에이트/시트레이 트/락테이트 또는 글리세릴 시트레이트/락테이트/리놀레이트/올레이트인 면역증강제 조성물.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 레시틴 유사유화제 함량은 조성물의 총 중량에 대하여 0.01 내지 20 중량%인 것을 특징으로 하는 면역증강제 조성물.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 오일성분은 비극성 무기 오일로서, 미네랄 오일, 스쿠알렌, 하이드로게네이티드 폴리데센(hydrogenated polydecene) 및 하이드로게네이티드 캐스트롤(hydrogenated castrol)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 면역증강제 조성물.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 면역증강제 조성물은 W/O/W 다중상 에멀젼형태이며, 나노좀의 평균 소적 크기가 50 내지 500 nm인 면역증강제 조성물.
6. 제 1 항의 면역증강제 조성물 및 항원성 물질을 함유하는 백신용 조성물.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 항원성 물질은 펩티드, 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 발현하는 유산균, 항원 단백질, 상기 항원단백질을 발현하는 유산균, 올리고 뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드, 재조합 박테리아 및 재조합 바이러스로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 백신용 조성물.
8. 제 6 항에 있어서, 전립선암, 결장암, 폐암, 유방암, 난소암, 두경부암, 외음부암, 방광암, 뇌암 및 신경교종으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 질병의 예방용 또는 치료용인 것을 특징으로 하는 백신용 조성물.
9. 제 6 항의 조성물을 인간을 제외한 동물에 주입하여 항원에 대한 항체 생성률을 높이는 방법.

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