TW202216120A - 控制釋放之疫苗調配物 - Google Patents

Abstract

本發明係關於包含聚甘油聚蓖麻油酸酯(PGPR)之疫苗調配物。某些所揭示之例示性疫苗調配物包含水相，該水相包含不活化細菌及/或病毒及/或細菌及/或病毒抗原。一個特定實施例包含用於日齡雛雞之不活化H9N2 PGPR乳液類疫苗。所揭示之PGPR類疫苗調配物可單獨或與第二標準快速釋放疫苗組合投與或作為包括第二標準快速釋放疫苗之組合物投與。所揭示之疫苗延遲抗原釋放，且因此將接受疫苗之個體的免疫反應延遲通常7至35天。本發明亦關於一種用所揭示之疫苗調配物接種個體(諸如家禽或魚類)之方法，以及製造PGPR類疫苗調配物之方法。

Description

控制釋放之疫苗調配物

食用動物之商業生產需要保護動物抵禦多種不同病原體。為了建立且增強免疫性並保護動物，將不活化疫苗與活疫苗組合或分開使用。不活化疫苗調配物係基於有佐劑之抗原。不活化疫苗組合物可以多種不同形式調配，諸如油包水、水包油、水中油包水乳液及其他。

用疫苗賦予動物免疫力需要抑制動物並將疫苗注射至動物之肌肉或皮膚下組織中，其引起動物應激。最近，業界正嘗試減少注射次數以減少動物應激及痛苦。已開發的可表面上減少注射次數之一種方法係使用包括相同劑量之若干抗原的組合疫苗。大部分此等疫苗需要第二次追加注射以增強免疫反應及特異性IgG/IgY產生。初打及加打之概念為免疫學中之關鍵原理之一，且重複接種係常見實務，各動物需要注射兩次或更多次，注射之間間隔數週。

影響幼仔(諸如日齡雛雞)免疫接種功效的因素之一係母源抗體(MDA)水準。高MDA延遲或甚至可阻斷針對同源抗原之免疫反應。

本發明之某些所揭示實施例係關於一種新疫苗調配物。所揭示之調配物提供若干益處，包括允許使用單次疫苗注射對動物免疫系統進行促發及加強。某些所揭示之實施例亦呈現用於活體內控制及延遲抗原釋放之新系統，其解決與MDA相關之問題，減少或完全阻斷後代中之免疫反應。

本發明之一個所揭示實施例係關於第一疫苗調配物，其包含聚甘油聚蓖麻油酸酯(PGPR)，諸如0.01體積%至6體積% PGPR，更通常0.05體積%至2.0體積% PGPR，且甚至更通常0.6體積%至1.5體積%。一般熟習此項技術者應瞭解，申請人之PGPR疫苗調配物之實施例可與任何適合之抗原一起使用，包括例如(但不限於)選自以下之細菌及/或病毒抗原：不活化新城雞瘟病毒(NDV)及/或至少一種NDV免疫原性蛋白或其部分，諸如重組或天然存在之HN及/或F蛋白或次單元；不活化感染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus，IBDV)及/或至少一種IBDV免疫原性蛋白或其部分；不活化禽流感病毒(AI)及/或至少一種AI免疫原性蛋白或其部分；不活化感染性支氣管炎病毒(IBV)及/或至少一種IBV免疫原性蛋白或其部分；不活化禽里奧病毒(Avian Reo Virus，ARV)及/或至少一種ARV免疫原性蛋白或其部分；不活化禽間質肺炎病毒(AMPV)及/或至少一種AMPV免疫原性蛋白或其部分；不活化禽間質肺炎病毒(AMPV)及/或至少一種AMPV免疫原性蛋白或其部分；不活化沙門氏菌(Salmonella)及/或不活化沙門氏菌免疫原性蛋白或其部分；不活化副雞禽桿菌( Avibacterium paragallinarum)及/或不活化副雞禽桿菌免疫原性蛋白或其部分；不活化大腸桿菌及/或不活化大腸桿菌免疫原性蛋白或其部分；及/或不活化多殺性巴氏桿菌( Pasteurella multocida)及/或不活化免疫原性蛋白或其部分。

第一PGPR疫苗調配物可與一或多種其他疫苗組合使用。舉例而言，根據本發明之控制釋放之PGPR疫苗可與第二標準快速釋放疫苗組合使用或以包含第二標準快速釋放疫苗之單一組合物形式使用。標準快速釋放疫苗可包括任何適用於治療動物之不活化病毒或細菌及/或病毒或細菌抗原，包括但不限於本文中明確鑑別之使用PGPR乳液疫苗投與的彼等物。PGPR疫苗可為不活化之乳液疫苗組合物，其包括包含乳液夾帶抗原之基於PGPR的第一微胞，及包含相同或不同乳液夾帶抗原、諸如可使用聚山梨醇酯形成之第二微胞。

PGPR延遲抗原釋放。PGPR亦提供抗原釋放起始後可控的緩慢釋放。從而使接受PGPR類疫苗調配物之個體的免疫反應延遲。在投與PGPR疫苗之後，相對於接受基本上相同、但不包括PGPR之疫苗的個體而言，免疫反應之此延遲一般為至少7天，且更通常為21至35天。當MDA水準不排除免疫反應時，此允許抗原在接受PGPR類疫苗調配物之個體體內釋放。

根據本發明之疫苗調配物之一個特定實例包含用於日齡雛雞之不活化禽流感H9N2 PGPR乳液類疫苗。一個特定例示性實施例包含21%水性乳液相，其包含20% H9N2不活化抗原及1%聚山梨醇酯80；及79%油性乳液相，其包含76%礦物油、3%脫水山梨糖醇油酸酯及0.1至1.25% PGPR。

本發明亦關於一種組合，其包含含有聚甘油聚蓖麻油酸酯(PGPR)之第一不活化乳液疫苗調配物及第二標準快速釋放疫苗。疫苗可依任何次序分開投與或同時投與。組合可為包含如上文所論述之第一及第二疫苗的組合物。

本發明亦提供一種用根據本發明所揭示之PGPR類疫苗組合或疫苗組合物接種個體的方法。某些例示性試驗涉及用0.2 ml/劑至0.3 ml/劑PGPR類疫苗調配物接種日齡肉雞。對於H9N2 PGPR乳液類疫苗而言，此類方法使得H9N2誘導之HI效價於28及35日齡時高於3，且包含不活化H9N2之0.1及0.75% PGPR調配物在HI為3的約60%禽中誘導高於4的效價。包含PGPR之乳液疫苗當投與儘管存在母體抗體的日齡雛雞時，誘導針對不活化H9N2的抗體主動產生。該方法可進一步包含向個體接種根據本發明之PGPR類疫苗調配物與不包含PGPR之標準疫苗的組合，其中標準疫苗誘導促發效應，且PGPR調配物在數週後誘導加強效應。該方法可涉及在調配階段或即將注射至個體之前將PGPR乳液與標準疫苗(快速釋放)混合。

亦揭示一種製備包含PGPR之不活化乳液疫苗的方法。該方法可包括：形成包含不活化抗原之水相；形成包含PGPR之油相；及形成包含水相及油相之乳液。乳液可使用PGPR本身形成，諸如使用約2體積% PGPR形成。或者，乳液可使用PGPR與一或多種界面活性劑(諸如聚山梨醇酯80及/或脫水山梨糖醇油酸酯)之組合來形成。

相關申請案之交叉參考 本申請案主張申請日期較早之美國臨時申請案第63/054,056號(2020年7月20日申請)之權益，該案以全文引用的方式併入本文中。

I. 術語及縮寫提供以下術語及縮寫之解釋以更好地描述本發明並指導一般技術者實施本發明。除非上下文另外清晰指示，否則如本文中所使用，「包含」意謂「包括」且單數形式「一(a)」或「一(an)」或「該(the)」包括複數個提及物。除非上下文另外清晰指示，否則術語「或」係指所述替代要素中之單一要素或兩種或更多種要素之組合。

除非另外解釋，否則本文中所使用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域之一般技術者通常所理解相同之含義。儘管類似或等效於本文中所描述之方法及材料可用於實施或測試本發明，但下文描述合適方法及材料。材料、方法及實施例僅為說明性的，且並不意欲為限制性的。自以下實施方式及申請專利範圍，本發明之其他特徵係顯而易見的。

除非另外指出，否則數值範圍之揭示內容應理解為指代範圍內之各離散點，包括端點。除非另外指明，否則本說明書或申請專利範圍中所使用之表示組分數量、分子量、百分比、溫度、時間等之所有數值均應理解為由術語「約」修飾。因此，除非另外含蓄或明確指示，或除非一般熟習此項技術者恰當地理解上下文具有更具決定性的解釋，否則所闡述之數值參數為近似值，其可視所尋求之所需特性及/或在如一般熟習此項技術者已知之標準測試條件/方法下的偵測極限而定。當直接且明確地區分實施例與所述先前技術時，除非用詞語「約」敍述，否則實施例數值不為近似值。

組合：組合包含兩種或更多種組分，其投與以使得第一組分之有效時間段與第二及後續組分之有效時間段重疊。組合可為包含組分之組合物，使得組分同時投與，或組合可為兩種或更多種各別組分基本上同時投與或以任何次序依序投與。

乳液：兩種或更多種不混溶物質之穩定混合物，其中一種物質(亦即分散相或次要組分)分散於另一種(亦即連續相或主要組分)內。舉例而言，乳膏為水包圍油滴之乳液，亦即水包油乳液。 乳化劑為幫助形成及維持乳液之物質。常見乳化劑尤其包括蛋白質、碳水化合物聚合物及長鏈醇及脂肪酸。

賦形劑：一種基本上呈生理學惰性之物質，用作醫藥組合物中的添加劑。賦形劑可以用於例如稀釋活性劑及/或修飾醫藥組合物之特性。

醫藥學上可接受：可吸收至個體體內而對個體無顯著不良毒理作用之物質。術語「醫藥學上可接受之形式」意謂醫藥學上可接受之任何衍生物或變化形式，諸如立體異構體、立體異構體混合物、對映異構體、溶劑合物、水合物、同晶型物、多晶型物、假晶、中性形式、鹽形式及前藥劑。

醫藥學上可接受之載劑：適用於本發明之醫藥學上可接受之載劑(媒劑)為習知的。Remington: The Science and Practice of Pharmacy,費城科學大學(The University of the Sciences in Philadelphia),編者Lippincott, Williams及Wilkins, Philadelphia, PA, 第21版(2005)描述了適用於醫藥遞送一或多種治療組合物及其他醫藥製劑之組合物及調配物。一般而言，載劑之性質將視所採用之特定投與模式而定。舉例而言，所揭示之疫苗調配物可包含醫藥學上及生理學上可接受之可注射流體(諸如水、生理鹽水、平衡鹽溶液、葡萄糖水溶液、甘油或其類似物)作為媒劑。在一些實例中，醫藥學上可接受之載劑可為無菌的，適於投與個體(例如藉由非經腸、肌肉內或皮下注射)。除生物學中性載劑以外，待投與之醫藥組合物亦可含有其他無毒輔助物質，諸如濕潤劑或乳化劑、防腐劑(諸如健大黴素(gentamycin)、青黴素(penicillin)及/或硫柳汞(thimerosal))、pH緩衝劑及其類似物，例如乙酸鈉或脫水山梨糖醇單月桂酸酯。在一些實例中，醫藥學上可接受之載劑係非天然存在的或合成的載劑。載劑亦可調配成攜載預選治療劑量之活性劑的單位劑型，例如存在於注射器中。

醫藥學上可接受之鹽：可用作藥物之化合物之生物學上相容鹽，該等鹽衍生自此項技術中熟知之多種有機及無機相對離子，且包括(僅舉例而言)鈉、鉀、鈣、鎂、銨、四烷基銨及其類似物；且當分子含有鹼性官能基時，有機或無機酸之鹽，諸如氫氯酸鹽、氫溴酸鹽、酒石酸鹽、甲磺酸鹽、乙酸鹽、順丁烯二酸鹽、草酸鹽及其類似物。醫藥學上可接受之酸加成鹽為在由生物學或其他方面不合需要之酸搭配物形成時保留游離鹼之生物有效性的鹽，該酸搭配物例如無機酸，諸如氫氯酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸及其類似物，以及有機酸，諸如乙酸、三氟乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、順丁烯二酸、丙二酸、丁二酸、反丁烯二酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、苯磺酸(苯磺酸鹽)、肉桂酸、杏仁酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸、水楊酸及類似物。醫藥學上可接受之鹼加成鹽包括衍生自無機鹼之鹼加成鹽，諸如鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、銨鹽、鈣鹽、鎂鹽、鐵鹽、鋅鹽、銅鹽、錳鹽、鋁鹽及其類似物。例示性鹽為銨鹽、鉀鹽、鈉鹽、鈣鹽及鎂鹽。衍生自醫藥學上可接受之有機無毒鹼之鹽包括(但不限於)以下之鹽：一級胺、二級胺及三級胺、經取代之胺(包括天然存在之經取代之胺)、環胺及鹼性離子交換樹脂，諸如異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二甲胺基乙醇、2 -二乙胺基乙醇、二環己胺、離胺酸、精胺酸、組胺酸、咖啡鹼、普魯卡因(procaine)、海卓胺(choline)、膽鹼、甜菜鹼、乙二胺、葡糖胺、甲基還原葡糖胺、可可豆鹼、嘌呤、哌𠯤、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺樹脂及其類似物。例示性有機鹼為異丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二環己胺、膽鹼及咖啡鹼。(參見例如S. M. Berge等人,「Pharmaceutical Salts」, J. Pharm. Sci., 1977; 66:1-19，其以引用之方式併入本文中)。

個體：經受治療、觀察或實驗之動物(人類或非人類)。「個體」包括例如(但不限於)人類及獸醫學個體，諸如人類及非人類哺乳動物、小鼠、貓、犬、豬、家禽、馬、反芻動物、牛科動物、乳牛、非人類靈長類動物及水生物種，諸如魚類。

界面活性劑 / 界面活性物質：一種化合物，其在溶解於水或水溶液中時減小表面張力或降低兩種液體之間的界面張力。界面活性劑分子通常具有極性或離子性「頭部」及非極性烴「尾部」。在溶解於水中時，界面活性劑分子聚集且形成微胞，其中非極性尾部向內定向,且極性或離子性頭部朝著水性環境向外定向。微胞通常在形狀方面為球形的且較小，直徑小於約10 nm。非極性尾部在微胞內產生非極性「囊」。溶液中之非極性化合物螯合在由界面活性劑分子形成之囊中，因此使得非極性化合物在水溶液內保持混合。

治療有效量或劑量：足以向個體或指定百分比之個體提供有益或治療效果之量。

治療時間窗：化合物之有效劑量或治療劑量在活體內保持治療有效的時長。

治療或療法：就疾病而言，任一術語包括(1)預防疾病，例如使得可暴露於或易患疾病、但尚未經歷或顯示疾病症狀之動物不出現疾病之臨床症狀，(2)抑制疾病，例如遏制疾病或其臨床症狀之發展，或 (3)緩解疾病，例如使疾病或其臨床症狀消退。

% ：除非另外明確指出，否則本文所述之所有百分比均為以體積計之百分比。

II. 乳液調配物類型某些所揭示實施例涉及形成用於遞送抗原之乳液，諸如不活化細菌及/或病毒及/或細菌抗原、病毒抗原或其組合。乳液為稱為分散相的一種液體於與第一液體不混溶之稱為連續相之第二液體中的分散液。對於疫苗調配物而言，此等相通常為水相(抗原性介質)及油相。可以添加界面活性劑以便使乳液穩定。界面活性劑可藉由其親水性:親脂性平衡(HLB)值定義，該值提供關於其對兩個相之相對親和性的資訊。不同類型之乳液可基於界面活性劑之HLB值製備。具有低HLB值之界面活性劑對油相具有高親和性且呈現油包水(W/O)乳液，其中抗原相液滴分散於連續油相中。具有高HLB值之界面活性劑對水相具有高親和性且呈現水包油(O/W)乳液，其中連續相為水且分散相為油。且最後，使用具有中等HLB值之某些界面活性劑系統，可以製得水包油包水(W/O/W)乳液，其中連續相為水相，分散相為油相，但油滴亦夾帶水相。

不同作用模式機制涉及不同疫苗乳液及其佐劑作用。第一機制為例如積存效應，其提供自注射位點緩慢的抗原釋放。積存效應並非唯一機制。舉例而言，油滴向引流淋巴結之微擴散可部分解釋自注射位點開槽移除乳液之後佐劑作用如何維持。

乳液之抗原釋放動力學亦根據乳液類型而變化。儘管無佐劑之蛋白質立即釋放，O/W乳液允許略微延遲，但蛋白質仍相對快速地釋放。或者，W/O乳液允許不釋放抗原或較慢的抗原釋放，此與乳液之穩定性相關。一旦乳液分解，則釋放大量抗原，但比O/W乳液更慢。W/O/W乳液具有中度的抗原釋放特性。

乳液亦保護抗原免於快速生理學降解，諸如經由酶的活體內降解，且可修飾抗原之電荷以變為免疫原性。乳液亦可產生炎症反應且刺激諸如巨噬細胞及淋巴球之抗原呈遞細胞的募集。其亦能夠促進抗原呈遞細胞(APC)對抗原的吸收。

1. 油包水乳液 當需要長期免疫時，建議牛科動物、小型反芻動物、家禽及魚類使用油包水乳液。對於口蹄病而言，例如，一次接種礦物油類乳液可保護牛科動物1年，而基於氫氧化鋁之調配物需要兩次或更多次加打。

油包水乳液允許降低疫苗劑量或抗原濃度。此為使疫苗獲得成本效益之重要考慮因素。

本發明之某些實施例係關於油包水乳液。一般熟習此項技術者應瞭解，鹼性油包水組合物中之水及油之相對量可變化，諸如20%至35%水相，通常約30%水，及65%至80%油相，通常約70%油。油部分可為適用於形成油包水疫苗乳液之任何油，諸如礦物油，例如C ₁₅-C ₃₀礦物油、植物油、合成油或其組合。

2. 水包油包水乳液 水包油包水(W/O/W)乳液之特徵為低黏度及其增強短期及長期免疫反應之能力。外部水相中之抗原可供免疫系統即刻利用，如水性調配物，而內部水相中之抗原緩慢釋放，如油包水乳液。

3. 水包油乳液 水包油乳狀液流動性強，耐受性好且誘導強烈的短期免疫反應。油相比率極低，介於15%與25%之間，部分解釋了其安全性。

III. 聚甘油聚蓖麻油酸酯 ( PGPR ) 及包含 PGPR 之疫苗調配物 A .PGPR 根據本發明之所揭示調配物包含聚甘油聚蓖麻油酸酯(PGPR)，其由聚合甘油及聚合蓖麻油酸製成。蓖麻油酸[較佳IUPAC名稱 = (9 Z,12 R)-12-羥基十八碳-9-烯酸，但亦稱為12-羥基-9-順-十八碳烯酸]，顯示於下文中，為成熟蓖麻植物(大戟科蓖麻( Ricinus communis L . Euphorbiacea))種子中天然存在之不飽和ω-9脂肪酸。

蓖麻油酸

聚甘油聚蓖麻油酸酯(PGPR)應理解為具有以下結構式：

， 其中R為

。

參考此等式，甘油單元之平均聚合度n為5，且蓖麻油酸之平均縮合數m為2。

已知PGPR可安全攝入或投與。舉例而言，PGPR在食品行業中廣泛地已知為極佳的油包水乳化劑，因為即使當水含量極高(諸如80%)時，PGPR亦形成極其穩定的乳液。PGPR在烘焙行業中用作錫潤滑乳液中之乳化劑。然而，PGPR主要應用在巧克力行業中。1951年進行短期大鼠飼餵試驗之後，自1952年起，PGPR已持續用於潤滑乳液中，且1952年在英國第一次用於調溫巧克力。因此，已廣泛研究PGPR食用安全性。

20世紀50年代中之PGPR安全測試計劃包括若干物種之急性毒性研究、30週及45週大鼠飼餵試驗、三代大鼠繁殖研究及多項間接代謝研究。此等研究確定PGPR如同正常膳食脂肪一樣被消化及利用。在20世紀60年代，計劃擴展至包括2歲大鼠及80週小鼠飼餵研究、非嚙齒動物(雞) 90天飼餵研究、PGPR誘導之大鼠、小鼠及雞肝及腎腫大研究，以及使用放射性標記物質對大鼠代謝之研究。亦進行人類研究以測定PGPR之可消化性及吸收，其包括肝功能測試與腎功能測試。發現98%之PGPR被大鼠消化且作為優於澱粉且幾乎等效於花生油之能量來源被利用。對大鼠之正常脂肪代謝或脂溶性維生素之利用沒有干擾。儘管與脂肪代謝具有緊密關係，但未發現對諸如生長、繁殖及組織穩態之維持之生命過程存在任何不利影響的證據。PGPR在2歲大鼠或80週小鼠飼餵研究中不具有致癌性。

1969年，聯合國糧食及農業組織/世界衛生組織食品添加劑聯合專家委員會(Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives，JECFA)之第13次報告將PGPR的人體每日允許攝入量(ADI)暫時設定為3.75 mg/kg體重，並要求進行更多的生物學研究。此ADI，在無暫時前綴之情況下，於1974年，在JECFA之第17次報告中升至7.5 mg/kg體重。1979年，歐洲共同體食品科學委員會(Scientific Committee for Food，SCF)亦將PGPR之ADI設定為7.5 mg/kg體重。歐洲即食食品中的PGPR最大使用量列於下表1中。 表 1 食品中之 PGPR 最大含量 ， 歐洲指令 95 / 2 / EC

: 編號	名稱	食品	最大含量
		如歐洲共同體(EC)第2991/94號法規附件A、B及C中定義的脂肪含量為41%或更少之可塗抹脂肪	4 g/kg
:-476	聚甘油聚蓖麻油酸酯	脂肪含量小於10%之類似可塗抹製品	4 g/kg
		調料	4 g/kg
		可可類糖果，包括巧克力	5 g/kg

根據本發明之調配物通常包含0.015%至6% PGPR，更通常0.05%至5% PGPR，諸如0.06%至1.5% PGPR或0.1%至1.25% PGPR。

B. 所治療的疾病及用於其的免疫原性組分所揭示之包含PGPR之疫苗實施例可用於治療多種病毒性及細菌性疾病。因此，所揭示之疫苗調配物包含PGPR及細菌及/或病毒免疫原性組分。對於家禽，諸如雞及水產養殖動物，諸如魚類，此類疾病包括例如(但不限於)： 新城雞瘟病毒(NDV)，作為不活化病毒及/或NDV免疫原性蛋白或其部分提供，諸如重組或天然存在之HN蛋白、F蛋白、其次單元及其組合。典型的NDV抗原濃度為50 PD ₅₀/劑(50%保護性劑量)，或換言之，5至50 µg/劑； 不活化法氏囊病病毒(IBDV)，作為不活化病毒及/或IBDV免疫原性蛋白或其部分提供，諸如重組或天然存在之免疫原性蛋白或其次單元。典型的IBDV抗原濃度為3至60 µg/劑； 禽流感病毒(AI)，作為不活化病毒及/或AI免疫原性蛋白或其部分提供，諸如重組或天然存在之HA蛋白或其次單元。典型的AI抗原濃度為10 ^8.4EID ₅₀/劑(50%卵感染性劑量)，或換言之，5至100 µg/劑； 感染性支氣管炎病毒(IBV)，作為不活化病毒及/或IBV免疫原性蛋白或其部分提供，諸如重組或天然存在之刺突蛋白或其次單元。典型的IBV抗原濃度為10 ⁷EID ₅₀/劑； 禽里奧病毒(ARV)，作為不活化病毒及/或ARV免疫原性蛋白或其部分提供，諸如重組或天然存在之Sigma C蛋白或其次單元。典型的ARV抗原濃度為10 ⁷CCID ₅₀/劑，或換言之，5至100 µg/劑； 禽間質肺炎病毒(AMPV)，作為不活化病毒及/或AMPV免疫原性蛋白或其部分提供，諸如重組或天然存在之免疫原性蛋白或其次單元。典型的AMPV抗原濃度為10 ⁷CCID ₅₀/劑； 沙門氏菌感染，諸如鼠傷寒沙門氏菌( Salmonella typhimurium)感染，其導致諸如沙門氏菌腸炎之疾病。不活化沙門氏菌通常用於疫苗中，但疫苗亦可包含沙門氏菌免疫原性蛋白或其部分，諸如重組或天然存在之免疫原性蛋白或其次單元。典型的沙門氏菌抗原濃度為10 ⁸CFU/劑(菌落形成單位/劑)； 由副雞禽桿菌( Avibacterium paragallinarum)引起之感染性鼻黏膜炎，作為不活化細菌及/或副雞禽桿菌免疫原性蛋白或其部分提供，諸如重組或天然存在之免疫原性蛋白或其次單元。典型的副雞禽桿菌濃度為10 ⁸CFU/劑； 由大腸桿菌感染引起之大腸桿菌病。大腸桿菌通常作為不活化細菌及/或大腸桿菌免疫原性蛋白或其部分提供，諸如重組或天然存在之免疫原性蛋白或其次單元。典型的大腸桿菌濃度為10 ⁸CFU/劑； 家禽霍亂，由多殺性巴氏桿菌( Pasteurella multocida)感染引起。多殺性巴氏桿菌通常作為不活化細菌及/或多殺性巴氏桿菌免疫原性蛋白或其部分提供，諸如重組或天然存在之免疫原性蛋白或其次單元。典型的多殺性巴氏桿菌濃度為10 ⁸CFU/劑； 水產養殖係在農業環境中飼養水生物種，且為全球成長最快之食品生產領域。基於FAO報告，水產養殖已超越牛肉及家禽之生產，且占全球食品生產之三分之一。生產系統之強化、引入水產養殖之物種的增加及影響水之環境變化(例如鹽度、pH值、CO ₂)已引起新興的傳染病，其對水產養殖之擴張造成巨大挑戰。

疾病預防為多層面策略，其中疫苗接種最為重要。向魚類接種疫苗對環境友好，在水產養殖中顯著減少抗生素使用且有助於控制一些疾病。不活化疫苗佔水產養殖中所用疫苗之最大比例，但其保護水平不明確。不論藉由注射、浸沒抑或與飼料共投與，均需要新型調配物來針對困擾魚類之細菌及病毒病原體，以實現更好的抗原穩定性及更長的免疫性持續時間。

以單價或多價(如但不限於表1所列)製劑產生之不活化/減毒或重組抗原在根據本發明之PGPR調配物中單獨經口投與魚類，諸如經由其飼料或藉由強制經口投與，或藉由注射，諸如肌肉內或腹膜內注射。在替代性實施例中，根據本發明之PGPR疫苗調配物可藉由噴灑、溶解及/或將魚浸沒於包含疫苗之水中而同時投與包含於水體中之整個魚群。此類群體疫苗接種方法可用於不同環境，諸如池塘、水族箱、天然棲息地、養魚場及淡水庫。 表 2 困擾魚類之病原體之非詳盡清單

疾病	病原體	主要魚類宿主
病毒神經性壞死	NNV(諾達病毒( Noda virus))	海鱸、海鯛、石斑魚、羅非魚、亞洲海鱸
感染性造血壞死	IHNV(棒狀病毒)	鮭魚
感染性鮭魚貧血	ISAV(副黏液病毒)	大西洋鮭
感染性胰臟壞死	IPNV(雙RNA病毒)	鮭魚、海鱸、海鯛、大菱鮃、鱈魚
胰臟疾病病毒	SAV(α病毒)	鮭魚
感染性脾臟及腎臟壞死	ISKNV 或RSIV(虹彩病毒)	海鱸、石斑魚、羅非魚、海鯛
羅非魚湖病毒病	TiLV	羅非魚
腸紅嘴病	耶爾森氏菌( Yersinia ruckeri)	鮭魚
弧菌病	弧菌屬( Vibrio sp)(鰻弧菌( anguillarum)、病海魚弧菌( ordalii)、殺鮭弧菌( salmonicida))	鮭魚、石斑魚、海鱸、海鯛、黃尾魚、鱈魚、大比目魚
癤瘡	殺鮭氣單胞菌屬( Aeromonas salmonicida sp)	鮭魚
細菌性腎病	鮭腎桿菌( Renibacterium salmoninarum)	鮭魚
鯰魚腸敗血症	雷伯氏桿菌( Edwarsiella ictalurid)	鯰魚
柱狀病	柱狀病黃桿菌( Flavobacterium columnaris)	羅非魚、海鯛、海鱸、大菱鮃、鮭魚、鯰魚
巴氏桿菌症	殺美人魚發光桿菌( Photobacterium damselae piscicida)	海鱸、海鯛
多重球菌	格氏乳球菌( Lactococcus garviae)	鱒魚、琥珀魚、黃尾魚
鏈球菌感染	鏈球菌屬( Streptococcus sp.)	羅非魚、海鱸、海鯛、鱒魚、黃尾魚
類鮭魚立克次體敗血症	鮭魚立克次氏體( Piscirickettsia salmonis)	鮭魚
運動型氣單胞菌屬敗血症	氣單胞菌屬( Aeromonas sp.)	鯰魚
傷口病	黏膠莫里氏菌( Moritella viscosa)	鮭魚
黏著桿菌感染	海中茴香黏著桿菌( Tenacibaculum maritimum)	鮭魚、大菱鮃

用於治療此類疾病之特定魚類疾病及免疫原性組分包括以下： 海豚鏈球菌( Streptococcus Iniae)，通常作為不活化細菌及/或海豚鏈球菌所產生之免疫原性蛋白或部分用於疫苗中，諸如重組或天然存在之免疫原性蛋白或其次單元。疫苗調配物中之典型海豚鏈球菌濃度為0.01至0.04 OD/劑(光密度/劑)。 發光桿菌，通常作為不活化細菌及/或發光桿菌之免疫原性蛋白或免疫原性蛋白之部分用於疫苗中，諸如重組或天然存在之免疫原性蛋白或其次單元。典型的發光桿菌濃度為0.01至0.04 OD/劑(光密度)。 弧菌，通常作為不活化細菌及/或弧菌蛋白之免疫原性蛋白或免疫原性部分用於疫苗中，諸如重組或天然存在之免疫原性蛋白或其次單元。典型的弧菌濃度為0.01至0.04 OD/劑(光密度)。

C. 油及界面活性劑所揭示之疫苗實施例可使用PGPR在不添加一或多種界面活性劑情況下調配，諸如藉由將PGPR與鹼性油包水組合物組合。此等PGPR調配物亦包括如上文所論述之免疫原性組分，諸如不活化病毒、不活化細菌或其兩者，及/或免疫原性細菌及/或病毒蛋白或其部分，諸如重組或天然存在之免疫原性蛋白或次單元。

一般熟習此項技術者已知之任何油或此後開發之油(均適用於疫苗調配物)可用於形成根據本發明之PGPR調配物。適合之油包含礦物油、植物油及其組合。礦物油已用於本發明之某些例示性實施例，諸如C ₁₅-C ₃₀礦物油。

所揭示之乳液組合物，諸如具有不同相對量之水及油(諸如20%水至50%水及80%油至50%油)之油包水乳液，在本文中表示為20至50:80至50油包水乳液，更通常為20至30:80至70油包水乳液，亦可包括至少一種及可能複數種界面活性劑，諸如第一界面活性劑及第二界面活性劑。一般熟習此項技術者已知之任何界面活性劑或此後開發之界面活性劑(均適用於疫苗調配物)可用於形成根據本發明之PGPR調配物。適合之界面活性劑包括例如但不限於：山梨糖醇(S及T)、聚丙二醇-聚丙二醇(F-68)、聚山梨醇酯20 (PS20)、聚山梨醇酯40 (PS40)、聚山梨醇酯60 (PS60)、聚山梨醇酯80 (PS80)、甘露糖醇單油酸、油酸脫水甘露醇酯之乙氧基化衍生物、十甘油基單月桂酸酯、單硬脂酸甘油酯、2,6,10,15,19,23-六甲基二十四烷(鯊烷)、聚乙氧基化脂肪酸(例如硬脂酸)(SIMULSOL® M-53)、聚乙氧基化辛基苯酚/甲醛聚合物(TYLOXAPOL®)、聚氧乙烯脂肪醇醚(BRIJ®)、聚氧乙烯壬基苯基醚(TRITON® N)、聚氧乙烯異辛基苯基醚(TRITON® X)；環氧乙烷(EO)、環氧丙烷(PO)及/或環氧丁烷(BO)之共聚物(DOWFAX™)；磷脂醯膽鹼(卵磷脂)、壬基苯酚乙氧基化物(Tergitol™ NP系列)；衍生自月桂醇、鯨蠟醇、硬脂醇及油醇之聚氧乙烯脂肪醚(Brij界面活性劑)。本發明之某些所揭示例示性實施例使用以下界面活性劑： 脫水山梨糖醇，通常為合成非離子化合物，且通常具有約600 g/mol至1,200 g/mol之分子量； 脫水山梨糖醇油酸酯，諸如脫水山梨糖醇單油酸酯，展示如下，

； 聚山梨醇酯，諸如聚山梨醇酯80，展示如下，

； 具有約4,000 g/mol之分子量(FW)的嵌段聚合物； 甘露糖醇衍生物，通常為具有750 g/mol之FW的合成化合物； Ddab界面活性劑，其通常具有陽離子性極性頭部及630 g/mol之FW； 皂素，其天然存在且通常具有非離子性極性頭部及2,000 g/mol之FW； 具有兩性極性頭部及約900 g/mol之FW的磷脂； 具有約4,000 g/mol之FW的脂多醣；及 此類界面活性劑之組合。

某些所揭示實施例包含：鹼性油包水(70:30)乳液；0.05%至2.0% PGPR；免疫原性組分；第一界面活性劑，諸如0.25%至2.5%，通常約1%之第一界面活性劑，諸如聚山梨醇酯80；及第二界面活性劑，諸如2%至6%之第二界面活性劑，通常約3%之第二界面活性劑，諸如脫水山梨糖醇油酸酯，諸如脫水山梨糖醇單油酸酯。

D. PGPR 類疫苗調配物接種結果使用根據本發明之PGPR疫苗調配物進行的初始試驗證明，將PGPR添加至標準W/O家禽疫苗中改良了乳液品質，避免了相分離並改良了穩定性。添加至油相中之PGPR對乳液特性之影響為劑量依賴性的。初始測試0.06至0.5%範圍之PGPR且發現可改良乳液穩定性。

然而，顯而易見的是，當免疫接種之後第3週測試時，某些實施例的PGPR濃度與疫苗功效之間存在負相關性。由於疫苗中的抗原濃度沒有變化，因此目前咸信PGPR使疫苗乳液在活體內穩定，從而延遲抗原釋放且使抗原呈遞至免疫系統。

更多近期的研究證明，藉由向疫苗乳液中添加PGPR，在某些實施例之情況下使用0.5% PGPR，在投與包含PGPR之抗原組合物後，個體中之免疫反應延遲至少7天且更通常至少21天且至多34天。參見圖1。因此，將PGPR添加至疫苗乳液中可以在活體內控制抗原釋放時間。

圖2及圖3提供根據本發明之包括PGPR之疫苗調配物的抗體效價結果。更特定而言，製備一種疫苗調配物，其包括不活化新城雞瘟抗原，脫水山梨糖醇油酸酯及PGPR。接著以兩種不同劑量(0.3 ml劑量及0.012 ml劑量)向家禽皮下投與此等調配物。圖2及圖3展示相對於市售疫苗Nectiv (Phibro Animal Health Corporation所提供之用於新城雞瘟的W/O乳液疫苗)，根據本發明之疫苗調配物使免疫性的產生延遲。圖2及圖3確定根據本發明之PGPR疫苗調配物可在投與之後，使免疫性的產生至少延遲多達21天。因此，所揭示之PGPR調配物允許疫苗接種者控制抗原釋放時間，由此進一步能夠使免疫反應在田間條件下最佳化。

IV. 用 PGPR 調配物接種母體免疫幼齡動物出於兩個主要目的對養殖動物進行免疫：第一，在生長期及繁殖期間保護動物；且第二，經由母體免疫賦予後代保護作用(亦即IgG/IgY及IgA之被動轉移)。母體保護可持續數週(雞、狗、貓)至數月(牛、綿羊、豬)。然而，雖然母體免疫保護動物，但其亦阻斷活疫苗或不活化疫苗免疫接種產生後天性免疫反應。在家禽之特定情況下，針對新城雞瘟病毒(NDV)、感染性法氏囊病病毒(IBDV)及禽流感病毒之母體免疫性顯著降低孵化場中之日齡雛雞疫苗接種功效。

當母源抗體水準已降低至不影響後天性免疫反應產生的水準時，根據本發明之PGPR調配物釋放不活化病毒或細菌或其一或多種抗原。對於雞而言，此通常出現在9至14日齡左右。因此，所揭示之PGPR疫苗調配物消除了對田間注射(疾病承壓地區之常見實務)之需求。一旦母源抗體出現有效降低，則向小雞投與田間注射。所揭示之PGPR疫苗調配物允許生產者向日齡雛雞投與適當疫苗，且藉此將完成疫苗接種之雞自孵化場送至田間，且藉此避免後續田間注射之必要性。

V. 使用 PGPR 調配物之初打及加打效果免疫記憶，定義為免疫系統對第二次接觸既定抗原相比於第一次接觸作出更劇烈反應的能力，係藉由解決某些感染而提供持久保護之基礎且為疫苗接種之目標。記憶為免疫系統之系統級特性，其由抗原特異性B及T細胞之頻率增加引起，以及由抗原特異性淋巴細胞分化成記憶細胞引起，記憶細胞可對抗原產生較快反應且可自我更新。對抗原之二次免疫反應的特徵在於活化漿細胞轉變為產生高度特異性IgG (IgY)。

近來，行業已努力減少向農畜投與之免疫接種及注射次數。生產動物接種疫苗需要生產者處理及約束各個別動物，此過程對動物而言有壓力且疼痛的。田間疫苗接種團隊之存在亦產生向農場引入病原體之風險。

所揭示之PGPR調配物實施例為生產者提供了組合使用PGPR疫苗之選項，且基本上與標準疫苗(快速釋放)同時使用。標準疫苗誘導促發效應，且PGPR調配物在數週後誘導加強效應。兩種各別疫苗中之每一者可分開且以任何次序投與。

第二個選項為將所揭示之PGPR乳液疫苗調配物與標準疫苗(快速釋放)混合在一起以形成合併的組合物。此合併可在調配階段或在即將注射至動物之前進行。此等混合乳液調配物可包含2種不同微胞：第一種基於PGPR，且第二種基於標準微胞形成組分，諸如聚山梨醇酯乳液。所揭示之PGPR調配物減少疫苗注射次數而不損害初始免疫反應或加強效應。

VI. 包含 PGPR 之醫藥調配物本發明之PGPR調配物可與本領域中常用之其他調配組分合併。不活化病毒或細菌及/或病毒及/或細菌抗原可調配為醫藥組合物且投與個體，諸如人類或獸醫學個體。所揭示之疫苗調配物可藉由多種已知途徑中之任一者投與，如一般熟習此項技術者將瞭解，諸如皮下注射、肌肉內注射、黏膜注射、腹膜內注射、浸液、噴霧等，且最通常為皮下或肌肉內投與。乳液可使用包含抗原(諸如不活化病毒或病毒抗原)之無菌水溶液、分散液或乳液來製備。最終劑型通常為在製造及儲存條件下穩定的無菌流體。所揭示之組合物可包括控制微生物的防腐劑。適合之防腐劑包括例如且不限於對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞、健大黴素(gentamycin)、青黴素及其類似物，及其任何及所有組合。在多數情況下，較佳包括等張劑，例如糖類，諸如山梨醇，包括脫水山梨糖醇油酸酯及聚山梨醇酯80、緩衝劑或氯化鈉。相對於僅使用PGPR，使用例如單硬脂酸鋁及/或明膠可額外延遲可注射組合物之吸收。

不活化細菌及/或病毒疫苗或包含細菌及/或病毒抗原之疫苗可以單次劑量全身性投與。或者，可以在投與期內，在適當時間間隔投與分次疫苗劑量，如根據各個別個體所確定。作為另一實例，疫苗可以在單位時間(諸如日、週或月)內，以兩次、三次、四次或更多次亞劑量投與。

VII. 實例提供以下實例以說明根據本發明之例示性實施例的某些特徵。一般熟習此項技術者應瞭解，本發明之範疇不限於此等實例所論述之特定特徵。

實例 1此實例評估投與市售日齡肉雞之不同濃度的包含PGPR之流感病毒疫苗中之抗原延遲釋放。

A. 背景由H9N2流感病毒引起之禽流感病對家禽行業具有實質性經濟影響，但使用市售不活化疫苗調配物基本上控制該疾病。舉例而言，在以色列(Israel)，常規地使用三種單價H9N2疫苗預防肉雞、產蛋雞及種雞發生疾病。

本發明之一個所揭示之實施例係關於投與日齡雛雞之新穎不活化H9N2疫苗。此新PGPR類疫苗可與其他不活化病毒或病毒抗原組合，諸如不活化IBDV及NDV抗原。此等新PGPR調配物設計成繞過母源抗體(MDA)所提供之中和作用。PGPR延遲抗原釋放且在血液中之母體抗體水準降低之後實現抗原活性。因此，本發明之所揭示PGPR疫苗調配物實施例可用於提供延遲的抗原釋放與減緩的抗原釋放。

試驗目的為評估具有極高MDA之肉雞，在日齡使用H9N2 PGPR類疫苗調配物疫苗接種之後之免疫反應。所測試之H9N2不活化疫苗係基於H9N2-215菌株且調配成若干濃度之PGPR。

B. 材料及方法1. 動物： 在實驗家禽房中，將作為育種群220 (Ross 40週齡)後代的135日齡肉雞關在地板圍欄中。

2. 疫苗： 製備4批H9N2-215流感病毒疫苗乳液，其包含不同的PGPR濃度，如下表2所示。 乳液 - 水相(21%)： a. 20 ml (20%) H9N2不活化抗原；及 b. 1 ml (1%)聚山梨醇酯80 (山梨糖醇T)

) (包含聚乙氧基化脫水山梨糖醇酯之MONTANOX)。

為了製備水相，機械地攪拌混合物數分鐘，且隨後在37℃下培育且大約每10分鐘渦旋，直至聚山梨醇酯80溶解為止。 乳液 - 油相(79%)： a. 礦物油 - 74.75-75.9 ml； b. 脫水山梨糖醇油酸酯(山梨糖醇S) - 3 ml (3%)；及 c. PGP，0.1至1.25 ml。

3. 乳液製備： 使用Silverson勻化器使油相在250 ml玻璃容器中混合30秒。將水相緩慢添加至油相中，同時以6,000 RPM之速度攪拌一分鐘45秒，其中Silverson的速度設定為8,000 RPM。將所得乳液裝填進HDPE瓶。 表 3 調配組合物

批號	抗原%	聚山梨醇酯 80%	油%	脫水山梨糖醇油酸酯%	PGPR%	體積(ml)
M-1-2470	20	1	75.9	3	0.1	100
M-1-2471	20	1	75.5	3	0.5	100
M-1-2472	20	1	75.25	3	0.75	100
M-1-2473	20	1	74.75	3	1.25	100

*所述百分比以體積計

4. 市售禽流感疫苗： 215，批號24011040； 947，批號24021037 1052，批號24031046

C. 試驗設計：將雞隨機分成9組。各組含有15隻禽。 第1、3、4、5、6、7組在一日齡時藉由SC注射接種0.2 ml/劑。 第8、9組在13日齡時藉由SC施藥接種0.3 ml/劑。

D. 實驗組 ：實驗組之描述如下表4。 表 4

群組	疫苗	疫苗接種時間 ( 天 )	疫苗接種劑量 (ml)
1	市售AI 215毒株	1	0.2
2	未接種疫苗之對照	1	0.2
3	市售疫苗(毒株215、947及1052)之混合物*	1	0.2
4	PGPR 0.1% AI 215毒株	1	0.2
5	PGPR 0.5% AI 215毒株	1	0.2
6	PGPR 0.75% AI 215毒株	1	0.2
7	PGPR 1.25% AI 215毒株	1	0.2
8	毒株215之市售疫苗	13	0.3
9	市售疫苗(毒株947、215、1052)之混合物*	13	0.3

*在注射之前，藉由使測試管內的疫苗升溫之後將三種疫苗等體積混合而製備的市售疫苗混合物。 **每劑之抗原負載量在各組之間無變化，所有組均包括20%含有抗原之尿囊液。

E. 評估參數 ：在第1天、第7天、第13天、第21天、第28天及第35天將雞抽血，且使用血球凝集抑制(HI)測試及215抗原之8HA單元測試血液之抗體反應。

F. 結果血清學結果呈現於表5及表6以及圖5中。 表 5 使用抗原 215 之 HI 測試中的抗體效價 ( Log2 )

群組	疫苗	疫苗接種年齡(天)	疫苗接種劑量(ml)	1D	7D	13D	21D	28D	35D
1	市售A1 215毒株	1	0.2	10.6	8.8	6.8	3	1.9	1.7
2	未接種疫苗之對照組	1	0.2	10.7	8.5	6.9	4.7	3.5	1.2
3	市售疫苗(毒株215、947及1052)之混合物	1	0.2	11.1	9.2	6.5	4.6	4.1	1.6
4	PGPR 0.1% A1 215毒株	1	0.2	10.2	8.3	6.4	5.1	4	4.8
5	PGPR 0.5% A1 215毒株	1	0.2	11.2	9.5	7	3.9	2.5	3
6	PGPR 0.75% A1 215毒株	1	0.2	10.9	9.1	6.8	5.2	3.9	4.2
7	PGRP 1.25% A1 215毒株	1	0.2	10.9	8.6	6.8	4.1	3.8	3.1
8	毒株215之市售疫苗	13	0.3	11.2	9	6.5	3.9	5.6	7.7
9	市售疫苗(毒株947、215、1052)之混合物	13	0.3	10.7	9.3	5.9	3.9	6.1	7.7

HI 效價高於 3 個單位之禽百分比 ( 抗原 215 )

群組	疫苗	疫苗接種年齡 ( 天 )	疫苗接種劑量 ( Ml )	第35 天之HI 效價	效價 ( Log2 ) 高於 3 之雞 %
1	市售A1 215毒株	1	0.2	1.7	14
2	未接種疫苗之對照組	1	0.2	1.2	13
3	市售疫苗(毒株215、947及1052)之混合物	1	0.2	1.6	14
4	PGPR 0.1% A1 215毒株	1	0.2	4.8	67
5	PGPR 0.5% 215毒株	1	0.2	3	40
6	PGPR 0.75% A1 215毒株	1	0.2	4.2	57
7	PGPR 1.25% A1 215毒株	1	0.2	3.1	36
8	毒株215之市售疫苗	13	0.3	7.4	93
9	市售疫苗(毒株947、215、1052)之混合物	13	0.3	7.7	100

自一日齡開始直至35日齡，一週一次，評估所有雞之H9抗體水準。所有肉雞在一日齡時具有極高的母源抗體效價(高於日齡雛雞之預期效價)。母源抗體效價每週下降大約2logs (以2為底)(T _{1 / 2}為3.5天)。在35日齡時，陰性對照組(第2組)之HI效價為1.2。

一日齡時注射之市售疫苗組(第1組及第3組)不能夠誘導抗體效價之任何增加且展現等效於陰性對照組(第2組)之抗體效價下降。

當MDA效價下降至HI 6時，在13日齡時注射的毒株215之市售疫苗及3種市售疫苗之混合物(第8組及第9組)誘導抗體於28日齡時開始顯著增加且在整個觀察期期間維持效價高於3.9 HI。

對於第4組、第6組及第7組(分別為0.1%、0.75%、1.25% PGPR實驗疫苗)，直至28日齡，抗體效價之降低與陰性對照組類似。相較於對照組(第2組)之HI 1.2，第4組及第6組(0.1%、0.75%之PGPR)在35日齡時分別顯示HI 4.9及4.2之顯著效價增加。第4組及第6組中約60%禽在35天時之HI效價高於3。

第5組及第7組(0.5%、0.1.25%之PGPR)在35日齡時顯示較低的效價增加，HI效價分別為3及3.1。

G. 結論 ：在28及35日齡時，本發明之PGPR類調配物誘導大於3之HI效價，且0.1及0.75%調配物在HI 3的約60%禽中誘導大於4之效價。

不管母源抗體，PGPR調配物能夠誘導針對不活化H9N2之抗體主動產生且未展示劑量反應效應。

實例 2為了證明所揭示之PGPR疫苗調配物對水產養殖動物之功效，將100條魚分成兩組，每組50條魚。在適應之後，一組魚將經由上述方法之一接種根據本發明之PGPR疫苗調配物。對照組之魚將進行假免疫。3至4週後，用毒性病毒攻擊魚。根據本發明之PGPR疫苗調配物之功效將根據兩組魚之間的死亡率差異來確定。

圖1提供接種市售疫苗及根據本發明之不活化PGPR乳液類新城雞瘟疫苗之日齡雛雞的抗體效價結果、死亡率及存活百分比。 圖2為肌肉內投與0.3 ml劑量之PGPR類疫苗調配物及投與0.3 ml劑量之市售疫苗之後的效價相對於時間之曲線圖，其對作為兩種不同疫苗調配物投與的結果而產生的效價進行比較。 圖3為肌肉內投與0.012 ml劑量之PGPR類疫苗調配物及投與0.012 ml劑量之市售疫苗之後的效價相對於時間之曲線圖，其對作為兩種不同疫苗調配物投與的結果而產生的效價進行比較。 圖4為示意圖，其說明在零時投與疫苗A，接著在零時後的時間投與疫苗A + B後的抗體產量(µg ml ^{- 1}血漿)，說明停滯期、對疫苗A之反應及對疫苗A + B之反應。 圖5為實例1所述之試驗中的抗體水準相對於疫苗接種後天數之曲線圖。

Claims (32)

1. 一種包含0.015至6%聚甘油聚蓖麻油酸酯(PGPR)之控制釋放之乳液疫苗調配物。
2. 如請求項1之控制釋放之乳液疫苗調配物，其包含0.1%、0.25%、0.75%或1.25% PGPR。
3. 如請求項1之控制釋放之乳液疫苗調配物，其包含20至50:80至50油包水乳液。
4. 如請求項1至3中任一項之控制釋放之乳液疫苗調配物，除PGPR之外，其進一步包含極性足以產生乳液之單一界面活性劑。
5. 如請求項1之控制釋放之乳液疫苗調配物，其包含0.25%至2.5%之第一界面活性劑及2%至6%之第二界面活性劑。
6. 如請求項5之控制釋放之乳液疫苗調配物，其中該第一界面活性劑為聚山梨醇酯80且該第二界面活性劑為脫水山梨糖醇油酸酯。
7. 如請求項1至3、5及6中任一項之控制釋放之乳液疫苗調配物，其調配用於家禽且包含： 不活化新城雞瘟病毒(NDV)及/或至少一種NDV免疫原性蛋白或其部分，諸如重組或天然存在之HN及/或F蛋白或其次單元； 不活化感染性法氏囊病病毒( Infectious Bursal Disease Virus，IBDV)及/或至少一種IBDV免疫原性蛋白或其部分； 不活化禽流感病毒(AI)及/或至少一種AI免疫原性蛋白或其部分； 不活化感染性支氣管炎病毒(IBV)及/或至少一種IBV免疫原性蛋白或其部分； 不活化禽里奧病毒(ARV)及/或至少一種ARV免疫原性蛋白或其部分；及/或 不活化禽間質肺炎病毒(AMPV)及/或至少一種AMPV免疫原性蛋白或其部分。
8. 如請求項7之控制釋放之乳液疫苗調配物，其包含： 約50 PD ₅₀/劑(50%保護性劑量)或5 µg/劑至50 µg/劑之NDV抗原濃度， 3 µg/劑至60 µg/劑之IBDV抗原濃度； 約10 ^8.4EID ₅₀/劑(50%卵感染性劑量)或5 µg/劑量至100 µg/劑之AI抗原濃度； IBV抗原濃度； 10 ⁷CCID ₅₀/劑或5 µg/劑至100 µg/劑之ARV抗原濃度；及 10 ⁷CCID ₅₀/劑之AMPV抗原濃度。
9. 如請求項1至3、5及6中任一項之控制釋放之乳液疫苗調配物，其調配用於家禽且包含： 不活化沙門氏菌( Salmonella)及/或不活化沙門氏菌免疫原性蛋白或其部分； 不活化副雞禽桿菌( Avibacterium paragallinarum)及/或不活化副雞禽桿菌免疫原性蛋白或其部分； 不活化大腸桿菌及/或不活化大腸桿菌免疫原性蛋白或其部分；及/或 不活化多殺性巴氏桿菌( Pasteurella multocida)及/或不活化免疫原性蛋白或其部分。
10. 如請求項9之控制釋放之乳液疫苗調配物，且包含10 ⁸CFU/劑的各種抗原性組分。
11. 如請求項1至3、5及6中任一項之控制釋放之乳液疫苗調配物，其調配用於魚類且包含0.01至0.04 OD/劑的以下各物： 不活化海豚鏈球菌( Streptococcus Iniae)及/或不活化免疫原性海豚鏈球菌蛋白或其部分； 不活化發光桿菌( photobacterium)及/或不活化發光桿菌免疫原性蛋白或其部分；及/或 不活化弧菌( Vibrio)及/或免疫原性弧菌蛋白之免疫原性蛋白或免疫原性部分。
12. 如請求項1之控制釋放之乳液疫苗調配物，其包含用於日齡雛雞之不活化H9N2 PGPR乳液類疫苗。
13. 如請求項12之控制釋放之乳液疫苗調配物，其包含， 21%水性乳液相，其包含20% H9N2不活化抗原及1 ml (1%)聚山梨醇酯80；及 79%油性乳液相，其包含76%礦物油、3 ml (3%)脫水山梨糖醇油酸酯及0.1至1.25% PGPR。
14. 如請求項1之控制釋放之乳液疫苗調配物，其中相對於接受相同、但不包括PGPR之疫苗的個體，接受該疫苗之個體的免疫反應延遲7至21天。
15. 如請求項1至3、5、6及12至14中任一項之控制釋放之乳液疫苗調配物，其進一步包含以組合形式或以組合物形式投與之第二標準快速釋放疫苗。
16. 一種控制釋放之油包水乳液疫苗調配物，其包含： 20至50:80至50油包水乳液； 0.015至6%聚甘油聚蓖麻油酸酯(PGPR)； 視情況存在的0.25%至2.5%第一界面活性劑； 視情況存在的2%至6%第二界面活性劑；及 免疫原性組分，其選自：不活化新城雞瘟病毒(NDV)及/或至少一種NDV免疫原性蛋白或部分；不活化感染性法氏囊病病毒(IBDV)及/或至少一種IBDV免疫原性蛋白或其部分；不活化禽流感病毒(AI)及/或至少一種AI免疫原性蛋白或其部分；不活化感染性支氣管炎病毒(IBV)及/或至少一種IBV免疫原性蛋白或其部分；不活化禽里奧病毒(ARV)及/或至少一種ARV免疫原性蛋白或其部分；不活化禽間質肺炎病毒(AMPV)及/或至少一種AMPV免疫原性蛋白或其部分；不活化沙門氏菌及/或不活化沙門氏菌免疫原性蛋白或其部分；不活化副雞禽桿菌及/或不活化副雞禽桿菌免疫原性蛋白或其部分；不活化大腸桿菌及/或不活化大腸桿菌免疫原性蛋白或其部分；不活化多殺性巴氏桿菌及/或不活化免疫原性蛋白或其部分；不活化海豚鏈球菌及/或不活化免疫原性海豚鏈球菌蛋白或其部分；不活化發光桿菌及/或不活化發光桿菌免疫原性蛋白或其部分；及/或不活化弧菌及/或免疫原性弧菌蛋白之免疫原性蛋白或免疫原性部分。
17. 如請求項16之控制釋放之油包水乳液疫苗調配物，其中該第一界面活性劑為聚山梨醇酯80且該第二界面活性劑為脫水山梨糖醇油酸酯。
18. 如請求項17之控制釋放之油包水乳液疫苗調配物，其包含1%聚山梨醇酯80及3%脫水山梨糖醇單油酸酯。
19. 一種組合，其包含， 第一疫苗調配物，其包含如請求項1至18中任一項之聚甘油聚蓖麻油酸酯(PGPR)；及 第二標準快速釋放疫苗。
20. 如請求項19之組合，其中該等疫苗以任何順序分開或同時投與。
21. 如請求項19之組合，其中該組合為包含該第一及第二疫苗之組合物。
22. 一種如請求項1至18中任一項之疫苗調配物或如請求項19至21中任一項之組合的用途，其用於製造供接種個體之藥劑。
23. 如請求項22之用途，其中包含不活化H9N2之PGPR類調配物誘導之HI效價於28及35日齡時高於3。
24. 如請求項22之用途，其中包含H9N2之0.1及0.75% PGPR調配物在HI為3的約60%禽中誘導高於4的效價。
25. 如請求項22之用途，其中將包含PGPR之油包水乳液疫苗投與儘管存在母源抗體的日齡雛雞，以誘導其主動產生針對不活化H9N2之抗體。
26. 如請求項22之用途，其中該藥劑與不包含PGPR之標準疫苗組合接種該個體，其中該標準疫苗誘導促發效應，且該PGPR調配物在21至35天後誘導加強效應。
27. 如請求項26之用途，其包含形成包含該第一疫苗調配物及該標準疫苗調配物之組合物。
28. 如請求項22至27中任一項之用途，其中該個體為家禽或水生物種。
29. 如請求項28之用途，其中該個體為日齡雛雞。
30. 如請求項28之用途，其中該個體為魚類。
31. 一種製備包含PGPR之不活化乳液疫苗的方法，該方法包含， 形成包含不活化抗原之水相； 形成包含PGPR之油相；及 形成包含該水相及該油相之乳液。
32. 如請求項31之方法，其中， 該水相包含H9N2抗原及聚山梨醇酯80；且 該油相包含礦物油、脫水山梨糖醇油酸酯及PGPR。

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