BR112012005518B1 - Novas formulações de vacina compreendendo adjuvantes contendo saponina - Google Patents

Novas formulações de vacina compreendendo adjuvantes contendo saponina Download PDF

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Abstract

novas formulações de vacina compreendendo adjuvante contendo saponina. a invenção proporciona novas emulsões óleo-em-água (o/a) , que aumentaram a estabilida-de na presença de suspensões virais ou bacterianas, especialmente aquelas concentradas e não purificadas (extratos brutos) ou purificado a um mínimo. a emulsão de acordo com a invenção pode ser utilizada como um excipiente para a administração de uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um imunógeno e, em particular, um imunógeno selecionado do grupo consistindo em um agente patogênico inativado, um patógeno atenu-ado, uma sub-unidade, um vetor de expressão recombinante, um plasmídeo ou combinações dos mesmos.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção se refere às emulsões de óleo-em- água, a sua utilização como adjuvantes e composições farmacêuticas, imunológicas ou vacinas compreendendo as mesmas.
DADOS INCORPORADOS COMO REFERÊNCIA
Esse pedido reivindica prioridade ao Pedido de Patente Provisório US número 61/241.171, depositado em 10 de setembro de 2009, e faz referência ainda aos Pedidos de Patentes que se seguem: Pedido de Patente US número 12/027.776, depositado em 7 de fevereiro de 2008, Pedido de Patente US número 10/899.181, depositado em 26 de julho de 2004, agora concedido como Patente US número 7.371.395 e Pedido de Patente Provisório US número 60/490.345, depositado em 24 de julho de 2003. Os pedidos precedentes e todos os documentos nele citados ou durante seu prosseguimento ("documentos citados no pedido") e todos os documentos citados ou referidos nos documentos citados pelo depositante e todos os documentos citados ou referidos no presente documento ("documentos citados no presente documento") e todos os documentos citados ou referidos nos documentos citados no presente documento, juntamente com instruções de qualquer fabricante, descrições, especificações do produto e folhas de produto para quaisquer produtos mencionados nesse documento ou em qualquer documento incorporado ao presente documento como referência, são incorporados ao presente documento como referência e podem ser empregados na prática da invenção.
HISTÓRICO DA INVENÇÃO
O uso de adjuvantes em vacinas é bem conhecido. Um adjuvante é um composto que, quando combinado com um antígeno de vacina, aumenta a resposta imune ao antígeno da vacina, em comparação com a resposta induzida pelo antígeno de vacina sozinho. Entre as estratégias que promovem a imunogenicidade do antígeno estão aquelas que tornam antígenos de vacina particulados, aquelas que polimerizam ou emulsionam antígenos de vacinas, os métodos de encapsulamento de antígenos de vacina, formas de aumento de respostas inatas de citocinas de hospedeiro e métodos que alvejam antígenos de vacina para células que apresentam antígenos (Nossal, 1999, em: Fundamental Immunology. Paul (Ed.), Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, PA; Vogel and Powell, 1995, em: Vaccine Design. The Subunit and Adjuvant Approach. Powell e Newman (Eds.), Pleemum Press, adjuvantes desempenham no aperfeiçoamento da imunogenicidade dos antígenos de vacina, o uso de adjuvantes na formulação de vacinas tem sido praticamente ubíquo (Nossal, 1999, supra; Vogel e Powell, 1995, supra; vide também publicação PCT WO 97/18837, os ensinamentos sendo incorporados ao presente documento como referência). Adjuvantes convencionais, bem conhecidas na técnica, são de natureza diversa. Eles podem, por exemplo, consistir em sais inorgânicos insolúveis em água, lipossomas, micelas ou emulsões, isto é, adjuvante de Freund. Outros adjuvantes podem ser encontrados em Vogel and Powell, 1995, supracitado. Embora não exista mecanismo simples de ação adjuvante, uma característica essencial é a sua capacidade de aumentar significativamente a resposta imune a um antígeno de vacina em comparação com a resposta induzida pelo antígeno de vacina sozinho (Nossal, 1999, supra; Vogel and Powell, 1995, supra). A este respeito, alguns adjuvantes são mais eficazes em aumentar respostas imunes humorais; outros adjuvantes são mais eficazes para aumentar respostas imunes mediadas por células (Vogel and Powell, 1995, supra), e ainda outro grupo de adjuvantes aumenta tanto respostas imunes mediadas por célula e humorais contra os antígenos da vacina (Vogel and Powell, 1995, supra).
De modo geral, as emulsões utilizadas na formulação de vacina compreendem uma mistura de óleo, solução aquosa e tensoativos. Algumas emulsões incorporam um tensoativo lipofílico, tal como SPAN 80® e um tensoativo hidrofílico tal como TWEEN 80®.
No entanto, problemas de estabilidade podem ser observados com emulsões utilizadas como adjuvantes de vacinas, especificamente durante o armazenamento ou transporte. Isto é particularmente verdadeiro quando estas composições contêm imunógenos concentrados, especialmente imunógenos concentrados não purificados. Tipicamente, este é o caso com adjuvantes utilizados em vacinas inativadas (mortos). Este problema é ainda mais significativo com composições de vacinas multivalentes porque os imunógenos são mais concentrados no mesmo volume de diluente.
Outro problema com o uso de adjuvante está ligado ao risco de efeitos adversos, tais como, toxicidade ou inflamação no local da injeção. Por exemplo, uma resposta inflamatória local e/ou granulomas pode resultar após a injeção. A fim de limitar tal reação adversa, tensoativos e outros componentes na emulsão podem ser reduzidos; no entanto, a redução pode resultar em uma diminuição na estabilidade da composição de vacina. Existe, portanto, uma necessidade de novos adjuvantes e composições de vacina contendo tais adjuvantes, com segurança e estabilidade aumentada.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Em uma primeira modalidade a presente invenção provê uma nova emulsão óleo-em-água (O/W), com aumentada estabilidade na presença de suspensões bacterianas ou virais, especialmente aquelas concentradas e não purificadas ou fracamente purificadas.
Outra modalidade da presente invenção provê uma emulsão O/W estável, segura e facilmente administrável, especificamente injetável que age como um veículo para a liberação de uma composição farmacêutica compreendendo, pelo menos, um ingrediente ativo que pode ser, mais especificamente, um imunógeno.
Ainda outra modalidade da presente invenção provê uma emulsão O/W estável, segura e injetável agindo como um adjuvante para aumentar a resposta imune induzida por um imunógeno. Especificamente, a presente invenção provê um novo adjuvante que, quando utilizado em uma composição de vacina contendo um imunógeno aumenta a resposta imune celular do vacinado, resposta imune humoral ou, de preferência, ambas para o imunógeno.
Ainda outra modalidade da presente invenção provê uma composição estável, segura e imunogênica ou vacina compreendendo uma emulsão de O/W.
Uma modalidade adicional da presente invenção provê um método para obtenção de uma composição de vacina utilizando o adjuvante da invenção; a composição de vacina assim obtida, e métodos de uso das mesmas.
Ainda outra modalidade da presente invenção provê um kit compreendendo um ou mais frascos. Em uma modalidade, o kit compreende um frasco que contém o adjuvante da presente invenção e um imunógeno ou outro produto farmacêutico. Ainda em outra modalidade, o kit compreende um imunógeno ou outro produto farmacêutico em um primeiro frasco, e um adjuvante obtido de acordo com a presente invenção em um segundo frasco, com o adjuvante concebido para ser misturado com o imunógeno ou um produto de vacina antes da utilização.
Em uma modalidade, a presente invenção provê uma emulsão de óleo em água (O/W) injetável compreendendo: (1) uma solução aquosa compreendendo um imunógeno; (2) uma solução aquosa compreendendo um tensoativo hidrofílico iônico tal como saponina; (3) uma solução aquosa opcional compreendendo (4) um óleo mineral; (5) um tensoativo lipofílico não-iônico; (6) um tensoativo hidrofílico não-iônico apresentando um valor HLB baixo que compreende diésteres de ácido graxo de sorbitano etoxilados (geralmente apresentando valor HLB entre 11 e 13).
Em outra modalidade, a presente invenção provê uma emulsão de óleo em água injetável (O/W) compreendendo: (1) uma solução aquosa compreendendo um imunógeno; (2) uma solução aquosa compreendendo um tensoativo hidrófilo iônico, tal como saponina; (3) um óleo mineral; (4) um tensoativo lipofílico não-iônico; (5) um tensoativo hidrofílico não-iônico tendo um valor de HLB baixo que compreende diésteres de ácidos graxos de sorbitano etoxilados (geralmente tendo valor de HLB entre 11 e 13).
Em outra modalidade, a presente invenção provê uma emulsão de óleo em água (O/W) injetável compreendendo: (1) uma solução aquosa compreendendo um imunógeno; (2) uma solução aquosa compreendendo um tensoativo iônico, hidrófilo, tal como, saponina; (3) uma solução aquosa opcional compreendendo (4) um tensoativo hidrofílico não-iônico apresentando alto valor de balanço hidrofílico-lipofílico (HLB) maior que 13 e menor que 40, especificamente, o HLB > 13,5 e, de preferência HLB > 14; (5) um óleo mineral; (6) um tensoativo lipofílico não-iônico; (7) um tensoativo hidrofílico não-iônico apresentando um valor de HLB baixo (valor de HLB de cerca de 9 a cerca de 13).
Em outra modalidade, a presente invenção provê uma emulsão de óleo em água injetável (O/W) compreendendo: (1) uma solução aquosa compreendendo um imunógeno; (2) uma solução aquosa compreendendo um tensoativo hidrofílico iônico, tal como saponina; (3) um tensoativo hidrofílico não-iônico apresentando alto valor de balanço hidrofílico-lipofílico (HLB) maior que 13 e menor que 40, especificamente, o HLB > 13,5 e, de preferência HLB > 14; (4) um óleo mineral; (5) um tensoativo lipofílico não-iônico; (6) um tensoativo hidrofílico não-iônico apresentando um valor de HLB baixo (valor de HLB de cerca de 9 a cerca de 13).
Ainda em outra modalidade, a presente invenção provê uma composição de vacina compreendendo uma nova emulsão que contém pelo menos um imunógeno adequado para promover uma resposta imunológica em um vacinado. A invenção provê ainda composições nas quais a emulsão atua como um adjuvante para aumentar a resposta imune induzida pelo imunógeno, especificamente, para aumentar a resposta celular, a resposta humoral ou, de preferência ambos.
Em outra modalidade, a presente invenção provê um método de obtenção de uma composição de vacina em que um imunógeno, especialmente um imunógeno na forma seca, que pode ser obtido, por exemplo, por liofilização ou por vitrificação ou em uma solução aquosa, especialmente onde a dita forma seca ou a dita solução aquosa compreende adicionalmente um tensoativo iônico, por exemplo, saponina e opcional e adicionalmente compreende hidróxido de alumínio que é misturado com o adjuvante de acordo com a presente invenção. O imunógeno pode ser selecionado do grupo consistindo em: agentes patogênicos inativados, agentes patogênicos atenuados, antígenos de subunidade, antígenos purificados, antígenos não purificados ou antígenos produzidos de forma recombinante utilizando bactérias, leveduras, plantas, insetos ou células de animais, vetores de expressão, incluindo plasmídeos, semelhantes. Os antígenos podem ser purificados por meios bem conhecidos na técnica, incluindo, mas não limitado a, ultrafiltração, ultracentrifugação, filtração em gel por exclusão de tamanho, cromatografia de troca iônica, e purificação PEG. O agente patogênico pode ser bacteriano, viral, protozoários, ou de origem fúngica ou o imunógeno pode constituir uma antitoxina.
Em outra modalidade, a presente invenção provê um método de induzir uma resposta imune em um vacinado contra um agente patogênico compreendendo administração da composição de vacina da presente invenção ao vacinado.
Em outra modalidade, a presente invenção provê kits que compreendem um único frasco contendo imunógenos purificados e a emulsão de acordo com a presente invenção. Em tal modalidade, os imunógenos contidos dentro do único frasco compreendem antígenos do vírus FMD (febre aftosa) purificados.
Em outra modalidade, a presente invenção provê kits que compreendem pelo menos dois frascos, em um primeiro frasco um imunógeno, especialmente um imunógeno na forma seca ou em solução em um meio aquoso, especialmente onde a dita forma seca ou a dita solução aquosa compreende adicionalmente um tensoativo iônico, vantajosamente saponina, compreendendo também opcionalmente hidróxido de alumínio, e em um segundo frasco um adjuvante ou uma emulsão de acordo com a presente invenção. O uso de kits que compreendem pelo menos dois frascos é particularmente eficaz nos casos em que a combinação dos componentes separados (isto é, a mistura em um único frasco do conteúdo de pelo menos dois frascos) resultaria em uma formulação de vacina de estabilidade reduzida.
É observado que nesta revelação e especificamente nas reivindicações, termos, tais como, "compreende", "compreendido", "compreendendo" e semelhantes podem apresentar o significado atribuído a tais termos na lei de Patentes dos Estados Unidos; por exemplo, podendo significar "inclui", "incluído", "incluindo" e similares; e que termos, tais como, "consistindo essencialmente de" e "consiste essencialmente de" apresentam o significado que lhes é atribuído pela lei de Patentes dos Estados Unidos, por exemplo, permitem os elementos não explicitamente citados, mas exclui os elementos que são encontrados na técnica anterior ou que afetam uma característica básica ou nova da presente invenção.
Estas e outras modalidades são divulgadas ou são óbvias a partir de e englobadas pela Descrição Detalhada que se segue.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Uma revelação completa da presente invenção, incluindo o melhor modo de realizar a mesma, a um versado na técnica, é estabelecida mais especificamente no restante do relatório descritivo, incluindo a referência às figuras anexas, onde: A figura 1 apresenta gráficos de determinação da temperatura de inversão de fase (PIT) (medida por condutividade) para as formulações de vacina dos experimentos 1 e 2 nos dias 7, 22, 121, e 330 (estudo de estabilidade anual). A determinação da PIT é uma medida da estabilidade da formulação da vacina. A figura 2 fornece gráficos de determinação da PIT para as formulações de vacina dos experimentos 3 e 4 em vários dias após a produção (estudo de estabilidade anual); A figura 3 fornece gráficos de determinação da PIT para as formulações de vacina dos experimentos 5 e 6 em vários dias após a produção (estudo de estabilidade anual); A figura 4 fornece gráficos de determinação da PIT para as formulações de vacina dos experimentos 7 e 8 em vários dias após a produção (estudo de estabilidade anual); A figura 5 fornece um gráfico de determinação da PIT para as formulações de vacina do experimento 9 em vários dias após a produção (estudo de estabilidade anual); A figura 6 fornece gráficos de determinação da PIT para as formulações de vacina dos experimentos (1-9) produzidas de acordo com a presente invenção, e armazenados durante 36 meses; A figura 7 fornece um gráfico que indica que as alterações dependem do tempo na temperatura retal de porcos tratados de acordo com os materiais e métodos descritos no Exemplo 6; A figura 8 fornece um gráfico que indica a alteração da temperatura máxima observada para os porcos tratados de acordo com os materiais e métodos revelados no Exemplo 6; A figura 9 fornece um gráfico que indica a potência da xcekpc *RF72+ xgtuwu ectic *μg) para porcos tratados de acordo com os materiais e métodos revelados no Exemplo 7.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Outros objetivos, características e aspectos da presente invenção são revelados ou são óbvios a partir da Descrição Detalhada que se segue. Deve ser entendido por um versado na técnica que a presente revelação é apenas uma descrição de formas de realização exemplares e não se destina a limitar os aspectos mais gerais da presente invenção, esses aspectos mais amplos sendo incorporados na construção exemplar. De fato, será evidente aos versados na técnica que várias modificações e variações podem ser realizadas na presente invenção sem se afastar do âmbito ou do espírito da invenção. Por exemplo, aspectos ilustrados e descritos como parte de uma modalidade podem ser utilizados em outra modalidade para se obter uma modalidade ainda mais. Pretende-se que a presente invenção inclua tais modificações e variações como se encontram no âmbito das reivindicações anexas e seus equivalentes. O conteúdo de todas as referências, patentes publicadas e patentes citadas ao longo do presente pedido é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
Por conveniência, determinados termos empregados no Relatório Descritivo, Exemplos e Reivindicações anexas são utilizados no presente documento.
Tal como empregado no presente documento, o termo "animal" inclui todos os animais vertebrados, incluindo os seres humanos. O mesmo também inclui um indivíduo animal em todas as fases de desenvolvimento, incluindo estágios embrionários e fetais. Especificamente, o termo "animal vertebrado" inclui, mas não se limita aos seres humanos, caninos (por exemplo, cães), felinos (por exemplo, gatos); equinos (por exemplo, cavalos), bovinos (por exemplo, vacas, gado), suínos (por exemplo, porcos), bem como aves. Tal como empregado no presente documento, o termo "vaca" ou "gado" é empregado geralmente para se referir a um animal de origem bovina, de qualquer idade. Termos intercambiáveis incluem "bovino", "bezerro", "novilho castrado", "touro, "novilha", "vaca" e semelhantes. Termos intercambiáveis incluem "leitão", "porca" e similares. O termo "aviário" tal como empregado no presente documento se refere a qualquer espécie ou subespécie da classe taxonômica ava, tal como, mas não limitado às galinhas (reprodutoras, frangos e poedeiras), perus, patos, gansos, codornas, faisões, papagaios, tentilhões, gaviões, corvos e aves corredoras, incluindo avestruz, emu e casuar. O termo "porco" ou "leitão" significa um animal de origem suína, enquanto "porca" se refere a uma fêmea em idade reprodutiva e capaz.
Tal como empregado no presente documento, o termo "virulento" significa um isolado que mantém a sua capacidade de ser infeccioso em um animal hospedeiro.
Tal como empregado no presente documento, o termo "vacina inativada" designa uma composição de vacina contendo um organismo infeccioso ou o agente patogênico que já não é capaz de replicação ou de crescimento. O agente patogênico pode ser de origem bacteriana, viral, fúngica ou protozoária. A inativação pode ser realizada por uma variedade de métodos incluindo congelamento- tratamento com formalina), sonicação, radiação, calor ou qualquer outro meio convencional suficiente para prevenir a replicação ou crescimento do organismo, mantendo a sua imunogenicidade.
Tal como empregado no presente documento, o termo "imunogenicidade" significa capaz de produzir uma resposta imune em um animal hospedeiro contra um antígeno ou antígenos. Esta resposta imune constitui a base da imunidade protetora promovida por uma vacina contra um organismo infeccioso específico.
Tal como empregado no presente documento, o termo "resposta imune" se refere a uma resposta produzida em um animal. Uma resposta imune pode se referir à imunidade celular (CMI); imunidade humoral ou pode envolver ambos. A presente invenção também contempla uma resposta limitada a uma parte do sistema imune. Por exemplo, uma composição de vacina da presente invenção pode especificamente induzir uma resposta interferon gama aumentada.
Tal como empregado no presente documento, o termo "antígeno" ou "imunógeno" significa uma substância que induz uma resposta imune específica em um animal hospedeiro. O antígeno pode compreender um organismo inteiro, morto, atenuado ou vivo; uma subunidade ou porção de um organismo; um vetor recombinante contendo inserção com propriedades imunogênicas; uma porção ou fragmento de DNA capaz de induzir uma resposta imune quando da apresentação a um animal hospedeiro; uma proteína, um polipeptídeo, um peptídeo, um epítopo, um hapteno, ou qualquer combinação destes. Alternativamente, o imunógeno ou antígeno pode compreender uma toxina ou antitoxina.
Tal como empregado no presente documento, o termo "multivalente" significa uma vacina contendo mais que um antígeno se da mesma espécie (isto é, diferentes isolados de sorotipos do vírus da febre aftosa), a partir de uma espécie diferente (isto é, isolados de ambos Pasteurella hemolytica e Pasteurella multocida), ou uma vacina contendo uma combinação de antígenos de gêneros diferentes (por exemplo, uma vacina compreendendo antígenos de Pasteurella multocida, Salmonella, Escherichia coli, Haemophilus somnus e Clostridium).
Tal como empregado no presente documento, o termo "adjuvante" significa uma substância adicionada a uma vacina para aumentar a imunogenicidade da vacina. O mecanismo de como um adjuvante opera não é inteiramente conhecido. Acredita-se que alguns adjuvantes reforçam a resposta imunológica ao liberar lentamente o antígeno, enquanto que outros adjuvantes são forte e propriamente imunogênicos e acredita-se que funcionam sinergicamente.
Adjuvantes de vacinas conhecidas incluem, mas não estão limitados às emulsões de óleo e água (por exemplo, adjuvante de Freund completo e adjuvante de Freund incompleto), Corynebacterium parvum, Bacilo de Calmette Guerin, hidróxido de alumínio, glicano, sulfato de dextrano, óxido de ferro, alginato de sódio, Bacto- Adjuvante, determinados polímeros sintéticos, tais como, poliaminoácidos e copolímeros de aminoácidos, saponina, "REGRESSIN" (Vetrepharm, Athens, Georgia), "AVRIDINE" (N,N- dioctadecil-N',N'-bi(2-hidroxietil)propanodiamina), óleo de parafina, dipeptídeo de muramila e semelhantes.
Tal como empregado no presente documento, o termo "emulsão" se refere a uma combinação de pelo menos duas substâncias, em que uma primeira substância é dispersa em uma segunda substância, onde a primeira substância é insolúvel. Um exemplo de uma emulsão da presente invenção é uma fase oleosa dispersa em uma fase aquosa.
Tal como empregado no presente documento, o termo "emulsão incompleta" se refere a uma composição a qual pelo menos um componente adicional deve ser adicionado para tornar a "emulsão completa". Como empregado no presente documento, o termo "emulsão completa" pode ser considerado equivalente à composição imunológica "pronta para uso" da presente invenção. Um exemplo de uma emulsão completa é uma composição imunológica de acordo com a presente invenção, que está pronta para ser administrada a um animal de acordo com os métodos da presente invenção.
Tal como empregado no presente documento, os termos "transportador farmaceuticamente aceitável" e "veículo farmaceuticamente aceitável" são intermutáveis e se referem a um veículo fluido para vacinas contendo antígenos que podem ser injetadas em um hospedeiro sem efeitos adversos. Veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados conhecidos na técnica incluem, mas não estão limitados à água estéril, solução salina, glicose, dextrose ou soluções tamponadas. Os veículos podem incluir agentes auxiliares, incluindo, mas não limitado aos diluentes, estabilizadores (isto é, os açúcares e aminoácidos), conservantes, agentes umectantes, agentes emulsionantes, agentes de tamponamento de pH, aditivos de melhora da viscosidade, corantes e semelhantes.
Tal como empregado no presente documento o termo "composição de vacina" inclui, pelo menos, um antígeno ou imunógeno em um veículo farmaceuticamente aceitável útil para induzir uma resposta imune em um hospedeiro. Composições de vacina podem ser administradas em dosagens e por técnicas bem conhecidas dos versados na técnica médica ou veterinária, levando-se em consideração fatores, tais como, idade, sexo, peso, espécie e condição do animal receptor e a via de administração. A via de administração pode ser percutânea, através da administração da mucosa (por exemplo, oral, nasal, anal, vaginal) ou através de uma via parentérica (intradérmica, intramuscular, subcutânea, intravenosa, ou intraperitoneal). Composições de vacina podem ser administradas isoladamente ou podem ser coadministradas ou sequencialmente administradas com outros tratamentos ou terapias. As formas de administração podem incluir suspensões, xaropes ou elixires e preparações para administração parentérica, subcutânea, intradérmica, intramuscular ou intravenosa (por exemplo, administração injetável), tais como suspensões estéreis ou emulsões. Composições de vacina podem ser administradas como uma aspersão ou misturadas em alimentos e/ou água ou liberadas em mistura com um veículo adequado, diluente, ou excipiente tal como água estéril, soro fisiológico, glicose ou semelhante. As composições podem conter substâncias auxiliares tais como, agentes umectantes ou emulsionantes, agentes de tamponamento de pH, adjuvantes, gelificantes ou aditivos que melhoram a viscosidade, conservantes, agentes aromatizantes, corantes e semelhantes, dependendo da via de administração e da preparação desejada. Textos Pharmaceutical Sciences", 1990 podem ser consultados para obter preparações apropriadas, sem experimentação indevida.
O termo "purificado", como empregado no presente documento não exige pureza absoluta, mas sim, deve ser entendido como um termo relativo. Assim, por exemplo, uma preparação de imunógeno purificado, tal como a proteína ou o vírus inativado, é aquele em que o imunógeno é mais enriquecido que o imunógeno é no seu ambiente natural. Uma preparação imunógena é amplamente referida no presente documento como "purificada" tal que o imunógeno representa pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou, pelo menos, 98%, do teor de imunógeno total da preparação. O termo "preparação bruta", que representa o menor grau de purificação pode conter tão pouco como menos de 60%, menos de 20%, menos de 10%, menos de 5%, ou menos de 1% de componentes imunogênicos.
O termo "altamente purificada" como empregado no presente documento se destina a sugerir um "grau maior de pureza", em comparação ao termo "moderadamente purificada". Esse "grau maior de pureza" pode incluir, mas não se limita às percentagens reduzidas de contaminantes, em uma preparação imunológica que foi "altamente purificada" versus uma preparação imunológica que foi "moderadamente preparações imunológicas "altamente purificadas" apresentarão as porcentagens mais baixas até as indetectáveis de contaminantes que podem causar: resposta imune desejada reduzida, resposta imune indesejada aumentada (por exemplo, reação de hipersensibilidade) ou estabilidade da formulação reduzida. Da mesma forma, uma preparação imunológica que foi "moderadamente purificada" contém porcentagens relativamente reduzidas dos contaminantes versus uma preparação imunológica que foi "minimamente purificada", o que da mesma forma, reduziu percentuais de contaminantes versus uma preparação denominada como uma "preparação bruta".
Contaminantes em uma preparação imunológica podem incluir, mas não são limitados às substâncias que contribuem negativamente para uma composição imunológica de acordo com a presente invenção. Um dos vários exemplos de contaminante que contribui negativamente seria um contaminante que reduz a capacidade de uma composição imunológica da presente invenção de promover uma resposta imune em animais.
Níveis variados de pureza (por exemplo, "altamente purificada", "moderadamente purificada" e semelhantes) podem ser conseguidos utilizando vários métodos. Por exemplo, uma combinação de cromatografia e filtração em gel de exclusão de tamanho pode resultar em preparações imunológicas "altamente purificada" ou "moderadamente purificada". Diferenças na fonte/tipo de imunógenos, bem como ligeiras variações em processos de purificação podem afetar significativamente o grau final de pureza do imunógeno. Em geral, conforme empregado no presente documento, preparações imunológicas apresentando da menor à maior percentagem de contaminantes serão descritas como: 1) "altamente purificada, 2) "moderadamente purificada", 3) "minimamente purificada", 4) "preparação bruta", respectivamente. Uma preparação "altamente purificada" terá o nível mais baixo de todos os tipos de contaminantes. Uma preparação "moderadamente purificada" terá níveis relativamente baixos da maioria dos tipos de contaminantes, mas pode apresentar um tipo de contaminante em maior abundância em relação ao que seria observado por uma preparação "altamente purificada" comparável. Da mesma forma, uma "preparação minimamente purificada" terá níveis relativamente baixos de alguns tipos de contaminantes, mas pode ter mais de um tipo de contaminante em maior abundância comparável a uma preparação "moderadamente purificada". Como esperado, uma "preparação bruta" tem o maior nível de contaminantes, de todos os tipos de contaminantes, quando comparada com os outros tipos de preparações revelados no presente documento.
A presente invenção provê uma nova emulsão de óleo em água (O/W) compreendendo: (1) uma solução aquosa compreendendo um antígeno de vacina ou imunógeno capaz de induzir uma resposta imune no hospedeiro; (2) uma solução aquosa compreendendo um tensoativo iônico; (3) um tensoativo hidrofílico não-iônico; (4) um óleo mineral;
Em uma modalidade, a nova emulsão de óleo-em-água (O/W) compreende: (1) uma solução aquosa compreendendo um antígeno de vacina ou imunógeno capaz de induzir uma resposta imune no hospedeiro; (2) uma solução aquosa compreendendo um tensoativo iônico, tal como saponina; (3) um tensoativo hidrofílico não-iônico apresentando um valor de equilíbrio hidrofílico-lipofílico elevado (HLB) maior que 13 e menor que 40 (HLB > 13, especificamente HLB > 13,5 e, de preferência HLB > 14); (4) um óleo mineral; (5) um tensoativo lipofílico não-iônico; e (6) um tensoativo hidrofílico não-iônico apresentando um valor de HLB baixo (valor de HLB entre 9 e 13).
Em outra modalidade a presente invenção provê uma nova emulsão de óleo em água (O/W) compreendendo: (1) uma solução aquosa compreendendo um antígeno de vacina ou imunógeno capaz de induzir uma resposta imune no hospedeiro; (2) uma solução aquosa compreendendo um tensoativo iônico, tal como saponina; (3) uma solução aquosa opcional compreendendo hidróxido de alumínio; (4) um tensoativo hidrófilo não-iônico apresentando um valor de equilíbrio hidrofílico-lipofílico elevado (HLB) maior que 13 e menor que 40, (HLB > 13, especificamente, HLB > 13,5 e de preferência HLB > 14); (5) um óleo mineral; (6) um tensoativo lipofílico não-iônico; e (7) um tensoativo hidrofílico não-iônico apresentando um valor de HLB baixo (valor de HLB entre 9 e 13).
Algumas emulsões obtidas de acordo com a presente invenção se baseiam em uma combinação de pelo menos quatro (4) tensoativos escolhidos entre os membros de quatro grupos diferentes de tensoativos, e é possível utilizar um ou mais tensoativos pertencentes a destes grupos incluem tensoativos não-iônicos e um (1) destes grupos compreende tensoativos iônicos, por exemplo, saponinas.
Em uma das várias modalidades, a concentração do tensoativo iônico (2) na emulsão (no presente relatório descritivo, isto significa a emulsão final com todos os ingredientes, a menos que indicado de outra forma) é de cerca de 0,01% a cerca de 10%.
Em uma das várias modalidades, a concentração do tensoativo hidrofílico não-iônico (7) na emulsão (no presente relatório descritivo, isto significa a emulsão final com todos os ingredientes, a menos que indicado de outra forma) é de 1% a 8%, especificamente a partir de 1,5% a 6%, de preferência de 2% a 5%, mais preferivelmente de 2,5% a 4%, expresso como uma percentagem em peso por volume de emulsão (p/v).
Este grupo de tensoativos compreende tensoativos hidrofílicos não-iônicos possuindo um valor de HLB baixo (valor de HLB entre 9 e 13). Este grupo inclui, mas não está limitado ao monoéster de ácido graxo de sorbitano etoxilado (especificamente grupos 5 etoxila) (por exemplo, monooleato de sorbitano etoxilado, tal como TWEEN 81®, diésteres de ácido graxo de sorbitano etoxilados, triésteres de ácido graxo de sorbitano etoxilados (em especial de grupos 20 etoxila) (por exemplo, trioleato de sorbitano etoxilado, tal como TWEEN 85®, triestearato de sorbitano etoxilado, tal como TWEEN 65®, alcoóis graxos etoxilados (especificamente grupos 5-10 etoxila) (por exemplo, BRIJ 76®, BRIJ 56®, BRIJ 96®), ácidos graxos etoxilados (especificamente grupos 5-10 etoxila) (por exemplo, Simulson 2599®, MYRJ 45®), óleo de rícino etoxilado (especificamente grupos 25-35 etoxila) (por exemplo, ARLATONE 650®, ARLATONE G®) e suas combinações.
Diésteres de ácido graxo de sorbitano etoxilados e triésteres etoxilados de ácidos graxos de sorbitano são preferidos, bem como combinações de ambas as espécies. O ácido graxo é de preferência selecionado entre o grupo consistindo em oleato, palmitato, estearato, laurato isoestearato e as suas combinações. Triéster de ácido graxo de sorbitano etoxilado preferido compreende trioleato de sorbitano etoxilado, tais como TWEEN 85® ou triestearato de sorbitano etoxilado, tal como TWEEN 65®.
Em uma das várias modalidades, a concentração de tensoativo hidrofílico não-iônico (4) é geralmente de 0,1% a 1,5%, especificamente de 0,2% a 1,4%, preferivelmente de 0,3% a 1,3%, mais preferivelmente de 0,4% a 1,2%, expressa como uma percentagem em peso por volume de emulsão (p/v).
Este segundo grupo de tensoativos compreende tensoativos não-iônicos hidrofílicos apresentando um valor de equilíbrio hidrofílico-lipofílico elevado (HLB>13, especificamente HLB > 13,5 e de preferência HLB > 14). Este grupo compreende monoésteres de ácidos graxos de sorbitano etoxilados (especificamente de 20 grupos etoxila) (por exemplo, monolaurato de sorbitano etoxilado, tal como TWEEN 20®, monopalmitato de sorbitano etoxilado, tal como TWEEN 40®, monoestearato de sorbitano etoxilado (tal como TWEEN 60®, monooleato de sorbitano etoxilado, tal como TWEEN 80®, alcoóis graxos etoxilados (especificamente 15-30 grupos etoxila) (por exemplo, BRIJ 78®, BRIJ 98®, BRIJ 721®), ácidos graxos etoxilados (especificamente 15-30 grupos etoxila) (por exemplo, MYRJ49®, MYRJ 51®, MYRJ52®, MYRJ53®), blocos de copolímeros não-iônicos (por exemplo, copolímero de polioxietileno/polioxipropileno (POE-POP), tal como, LUTROL F127®, LUTROL F68®) e suas combinações.
Para blocos de copolímeros não-iônicos as percentagens pode ser menores e, especificamente, de 0,1% a 0,5%, mais especificamente de 0,2% a 0,4% (peso por volume de emulsão (p/v)). Tensoativos preferidos (4) compreendem monoésteres etoxilados de ácidos graxos de sorbitano, tais como os descritos acima.
Em uma das várias modalidades, a concentração de tensoativo lipofílico não-iônico (6) é de 0,1% a 2,5%, especificamente de 0,2% a 2%, de preferência de 0,2% a 1,5%, mais preferivelmente de 0,2% a 1,2%, expressa como uma percentagem em peso por volume de emulsão (p/v).
Este grupo de tensoativos compreende ésteres de ácidos graxos de sorbitano (por exemplo, monolaurato de sorbitano, como SPAN 20®, monopalmitato de sorbitano, tal como o SPAN 40® monoestearato de sorbitano, tal como SPAN 60®, triesterato de sorbitano, tal como SPAN 65®, monooleato de sorbitano, tal como SPAN 80®, trioleato de sorbitano, tal como SPAN 85®, monoisoestearato de sorbitano, tal como Arlacel 987®, isoestearato de sorbitano, tal como CRILL 6®, ésteres de ácidos graxos de manida (por exemplo, MONTANIDE 80®, monooleato de manida (tal como, ARLACEL A®), dioleato de manida, trioleato de manida, tetraoleato de manida), ésteres de ácido graxo etoxilados de manida (2, 3 ou 4 grupos etoxila) (por exemplo, MONTANIDE 888®, MONTANIDE 103®, monooleato de manida etoxilada, dioleato de manida etoxilado, trioleato de manida etoxilado, tetraoleato de manida etoxilado) e suas combinações.
O ácido graxo é de preferência selecionado dentre o grupo consistindo em oleato, palmitato, estearato, isoestearato, laurato e combinações dos mesmos.
Os tensoativos preferidos (6) compreendem os ésteres de ácidos graxos de sorbitano, especificamente, aqueles descritos acima, e suas combinações.
Os tensoativos da presente invenção podem apresentar ácidos graxos de origem animal ou vegetal. A alteração de uma origem para outra (por exemplo, de TWEEN 80® animal para TWEEN 80® vegetal) poderia ser feita simplesmente apenas com um pequeno ajuste na formulação da emulsão.
Uma emulsão de acordo com a invenção pode apresentar uma concentração global de tensoativos, em peso por volume de emulsão, de 1,2% a 10%, especificamente de 2% a 8%, preferivelmente de 3% a 7%, mais preferivelmente de 4% a 6%.
Geralmente, a emulsão de acordo com a invenção pode apresentar uma temperatura de inversão de fase (PIT), que é > 33°C em intervalos específicos de 33°C a 65°C, mais especificamente de 36°C a 60°C, preferivelmente de 37°C a 55°C e, mais preferivelmente, de 38°C a 50°C.
A PIT é a temperatura na qual uma emulsão de água-em- óleo muda para uma emulsão de óleo-em-água ou separa as fases (ruptura da emulsão e separação em 2 fases). O valor da PIT pode ser medido por vários meios, como por exemplo, por aparência visual (por exemplo, vide exemplo 2) ou por condutividade. A emulsão é colocada a uma temperatura abaixo da PIT da emulsão, por exemplo, de cerca de 25°C em banho-maria. A temperatura é progressivamente aumentada. A mudança do aspecto visual da emulsão é observada em comparação com uma emulsão de controle, nomeadamente a fluidez, a viscosidade, a separação em duas fases, a alteração do aspecto da superfície devido à migração da fase oleosa para a superfície. A temperatura, para a qual esta mudança de aspecto visual foi observada, é o valor PIT da emulsão. Alternativamente, a PIT é determinada pela passagem rápida de um valor de condutividade de cerca de 58 miliSiemens/centímetro (mS/cm) (emulsão de óleo-em-água) para um valor de cerca de 0 mS/cm (emulsão de água-em-óleo) medido por uma sonda colocada na emulsão, perto da sua superfície. A temperatura, na qual a transição foi observada é o valor PIT da emulsão. Um versado na técnica será capaz de determinar as combinações de tensoativos e óleo, incluindo as suas respectivas concentrações, a fim de produzir emulsões de acordo com a invenção, e em particular emulsões que apresentam um valor PIT dentro das faixas definidas acima sem experimentação indevida.
De modo geral, as emulsões de acordo com a presente invenção podem conter, em volume por volume de emulsão, de 3% a 55% de óleo, especificamente de 5% a 50% de óleo, de preferência de 10% a 40% de óleo e, mais preferencialmente, de 20% a 40% de óleo. Por definição, faixas de valores no presente relatório descritivo incluem sempre o limite da faixa, a menos que indicado em contrário.
O óleo empregado pode ser um óleo mineral, incluindo, mas não se limitado ao óleo de parafina, tal como óleo isoparafínico e/ou óleo naftênico, esqualano, pristano, óleo de poliisobuteno, óleo de poliisobuteno hidrogenado, óleo de polideceno, óleo de poliisopreno, óleo de poliisopropeno e semelhantes. Um óleo mineral vantajosamente útil na presente invenção pode incluir um óleo compreendendo uma cadeia de carbono linear ou ramificada apresentando um número de átomos de carbono superior a 15, preferivelmente de 15 a 32, e isento de compostos aromáticos. Tais óleos podem ser, por exemplo, aqueles comercializados sob a denominação "MARCOL 52®" ou "MARCOL 82®" (produzidos pela Esso, França) ou "DRAKEOL 6VR®" ou "DRAKEOL 5®" e "DRAKEOL 7®" (produzidos pela Penreco, EUA), "CLEAROL®" (produzido pela Sonneborn, EUA), "Paraffin Oil Codex AAB2®" (produzido pela Aiglon, França), BLANDOL (produzido pela Sonneborn, EUA), ONDINA 915 (produzido pela Shell, Reino Unido).
O óleo também pode ser uma mistura de óleos que compreendem pelo menos 2 óleos selecionados dentre os óleos descritos no presente documento e, em qualquer proporção. A mistura de óleos pode compreender também pelo menos um óleo selecionado entre os óleos acima descritos, e pelo menos um óleo vegetal, e este óleo vegetal representa entre cerca de 0,1% a cerca de 33% da fase oleosa, de preferência cerca de 10% a cerca de 25% v/v. Estes óleos vegetais são os óleos insaturados ricos em ácido oléico que são biodegradáveis e, de preferência líquidos à temperatura de armazenamento (cerca de +4 °C) ou pelo menos, tornam possível fornecer emulsões que são líquidas a esta temperatura. Por exemplo, o óleo vegetal pode ser óleo de amendoim, óleo de noz, óleo de girassol, óleo de açafrão, óleo de soja, óleo de onagro e semelhantes.
Em uma das várias modalidades, tensoativos hidrofílicos (4) e (7) incluem, de preferência, tensoativos que apresentam a mesma parte hidrofílica das moléculas. Por exemplo, é feito uso de ésteres etoxilados de ácidos graxos de sorbitano para cada um dos tensoativos hidrofílicos (4) e (7). Por exemplo, se TWEEN 85® é escolhido como tensoativo hidrofílico não-iônico apresentando um valor de HLB baixo, o tensoativo hidrofílico não-iônico apresentando um valor de HLB elevado apresentará vantajosamente uma parte hidrofílica constituída por um sorbitano etoxilado, tal como TWEEN 80®.
De modo geral, a presente invenção prevê o uso de uma solução aquosa compreendendo um veículo adequado veterinária ou farmaceuticamente aceitável, excipiente ou diluente, incluindo, porém não limitado a água estéril, soro fisiológico, glicose, tampão e semelhantes. O veículo, excipiente ou diluente pode incluir também polióis, glicídeos ou agentes de tamponamento de pH. O veículo, excipiente ou diluente pode também incluir, por exemplo, aminoácidos, peptídeos, antioxidantes, bactericidas e compostos bacteriostáticos. A solução aquosa é adicionada ao óleo e aos tensoativos em quantidade de modo obter 100% do volume da emulsão de acordo com a invenção.
O equilíbrio hidrofílico-lipofílico (HLB) de uma emulsão permite a estimativa da força hidrofílica ou lipofílica de um tensoativo. O HLB de uma molécula anfifílica é geralmente calculado como se segue:
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O HLB pode apresentar molécula mais lipofílica) hidrófila). De acordo com tensoativo (nomeadamente, por exemplo, a adição de grupos etoxila ou de óxidos de alceno), esta estimativa pode alterar e o domínio do valor de HLB pode aumentar (por exemplo, o Lutrol F68® apresenta um HLB de 29). Com uma mistura de tensoativos, o HLB da mistura é a adição do HLB de cada tensoativo, equilibrada por sua proporção em peso:
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Em uma modalidade de uma emulsão fabricada de acordo com a presente invenção, o HLB final da emulsão é de cerca de 9 a cerca de 12, preferivelmente de cerca de 9,5 a cerca de 11,5 e mais preferivelmente de cerca de 10 a cerca de 11,5.
A presente invenção contempla uma emulsão compreendendo um óleo de parafina (em especial a uma concentração de cerca de 10% a cerca de 40% e de preferência de cerca de 20% a cerca de 40%, expressa como volume por volume de emulsão (v/v)); um monoéster de ácido graxo de sorbitano (como tensoativo lipofílico não-iônico), um triéster etoxilado de ácido graxo de sorbitano (como tensoativo não-iônico hidrofílico apresentando um valor de HLB baixo); e um monoéster etoxilado de ácido graxo de apresentando um valor de HLB elevado). Especificamente, o monoéster de ácido graxo de sorbitano é um monooleato de sorbitano (especificamente, na concentração de 0,2% a 1,5%, de preferência de 0,2% a 1,2%, expressa como peso por volume de emulsão (p/v)), o triéster etoxilado do ácido graxo de sorbitano é um trioleato de sorbitano etoxilado (especificamente, na concentração de 2% a 5%, preferivelmente de 2,5% a 4% p/v)) e o monoéster etoxilado de ácido graxo de sorbitano é um monooleato de sorbitano etoxilado (especificamente na concentração de 0,3% a 1,3%, de preferência de 0,4% a 1,2% p/v). Por exemplo, a emulsão compreende o óleo de parafina a cerca de 29,3% em volume por volume de emulsão, o monooleato de sorbitano, 0,6% em peso por volume de emulsão, trioleato de sorbitano etoxilado em 3,4% em peso por volume da emulsão, e o monooleato de sorbitano etoxilado a 0,75% em peso por volume da emulsão.
Em uma segunda modalidade de acordo com a presente invenção, a emulsão compreende um óleo de parafina (especificamente a uma concentração de 10% a 40%, preferivelmente de 20% a 40% v/v), um monoéster de ácido graxo de sorbitano (como tensoativo lipofílico não-iônico), um triéster etoxilado de ácido graxo de sorbitano (como tensoativo hidrofílico não-iônico apresentando um valor de HLB baixo) e um bloco de copolímero não-iônico (como tensoativo hidrofílico não-iônico, apresentando um valor de HLB elevado). Especificamente, o monoéster de ácido graxo de sorbitano é um monooleato de sorbitano (especificamente, na concentração de 0,2% a 1,5%, de preferência de 0,2% a 1,2% p/v), o triéster etoxilado de ácido graxo de sorbitano é um trioleato de sorbitano etoxilado (especificamente, na concentração de 2% a 5%, preferivelmente de 2,5% a 4% p/v) e o bloco de copolímero não-iônico é um polímero de polioxietileno/polioxipropileno (POE-POP) (especificamente, na concentração de 0,1 % a 0,5%, de preferência de 0,2% a 0,4% p/v). Por exemplo, a emulsão compreende o óleo de parafina a cerca de 29,3% v/v, o monooleato de sorbitano a 0,6% p/v, o trioleato de sorbitano etoxilado a 3,4% p/v, e o monooleato de sorbitano etoxilado a 0,25% p/v.
Em uma modalidade específica, a invenção contempla uma emulsão de óleo-em-água (O/W) injetável compreendendo: (1) uma solução aquosa compreendendo um ingrediente ativo, tal como um medicamento ou um imunógeno, de preferência um imunógeno; (2) uma solução aquosa compreendendo saponina; (3) um óleo mineral; (4) um tensoativo lipofílico não-iônico; e (5) um tensoativo hidrofílico não-iônico apresentando um valor de HLB baixo, que compreende um diéster de ácido graxo de sorbitano etoxilado (que pode apresentar um valor de HLB entre 11 e 13).
Em outra modalidade específica, a invenção contempla uma emulsão de óleo-em-água (O/W) injetável compreendendo: (1) uma solução aquosa compreendendo um ingrediente ativo, tal como um medicamento ou um imunógeno, de preferência um imunógeno; (2) uma solução aquosa compreendendo saponina; (3) uma solução aquosa compreendendo hidróxido de alumínio; (4) um óleo mineral; (5) um tensoativo lipofílico não-iônico; e (6) um tensoativo hidrofílico não-iônico apresentando um valor de HLB baixo, que compreende um diéster de ácido graxo de sorbitano etoxilado (que pode apresentar um valor de HLB entre 11 e 13).
Uma emulsão de acordo com esta modalidade compreende diésteres de ácido graxo de sorbitano etoxilados que podem conter até 20 grupos etóxi. Os ácidos graxos podem ser de origem animal ou vegetal e podem ser selecionados do grupo consistindo em oleato, palmitato, estearato, isoestearato, laurato e combinações dos mesmos. Em uma modalidade, o ácido graxo etoxilado é, de preferência oleato. Os outros ingredientes, bem como as propriedades gerais da emulsão, tais como PIT, podem apresentar as mesmas características que as descritas acima.
De preferência, o tensoativo (6) compreende diésteres de ácido graxo de sorbitano etoxilados, tais como dioleato de sorbitano etoxilado, diestearato de sorbitano etoxilado ou diisostearato de sorbitano etoxilado, dipalmitato de sorbitano etoxilado, dilaurato de sorbitano etoxilado e combinações dos mesmos. Opcionalmente outros compostos podem ser adicionados como coadjuvantes à emulsão, incluindo, mas não limitado ao alume; oligonucleotídeos CpG (ODN), especificamente, ODN 2006, 2007, 2059 ou 2135 (Pontarollo R.A. e cols. , Vet. Immunol. Immunopath, 2002, 84: 84: 43-59; Wernette C.M. e cols., Vet. Immunol. Immunopath, 2002, 84: 223-236; Mutwiri G. e cols., Vet. Immunol. Immunopath, 2003, 91:89-103); poliA-polyU ("Vaccine Design The Subunit and Adjuvant Approach", editado por Michael F. Powell e Mark J. Newman, Pharmaceutical Biotechnology, 6: 03); brometo de dimetildioctadecilamônio (DDA) ("Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach" editado por F. Michael Powell e J. Mark Newman, Pharmaceutical Biotechnology, hidroxietil)propanodiamina) (tal como AVRIDINE®) (Ibid, p. 148), carbômero, quitosana (vide Patente US número de série 5.980.912 por exemplo).
A presente invenção também fornece um método para obtenção de uma composição de vacina ou composição imunológica que compreende pelo menos um antígeno ou composição de imunógeno e um adjuvante ou uma emulsão obtida de acordo com a presente invenção. A composição de antígeno ou imunógeno pode ser incorporada durante a formação da emulsão ou, em uma modalidade alternativa, a composição de antígeno ou imunógeno, de preferência, adicionalmente, compreendendo a saponina e, opcional e adicionalmente compreendendo o hidróxido de alumínio, pode ser adicionada à emulsão mais tarde, como, por exemplo, imediatamente antes do uso.
A quantidade total da solução aquosa utilizada pode estar presente na emulsão produzida pela primeira vez. Ou pode ser que apenas uma parte desta solução aquosa seja usada para formar a emulsão, e a quantidade restante de solução aquosa é adicionada após a incorporação do imunógeno. O imunógeno ou antígeno pode estar em uma forma seca ou presente em alguma outra forma sólida apropriada e em seguida misturada com a emulsão, ou, alternativamente, o antígeno pode estar em solução, especificamente em uma solução aquosa, e esta solução é misturada com a emulsão.
Os tensoativos são de preferência adicionados ao óleo ou a solução aquosa de acordo com a sua solubilidade. Por exemplo, os tensoativos lipofílicos não-iônicos são adicionados ao óleo de acordo com a invenção, enquanto tensoativos não-iônicos hidrofílicos possuindo um valor de HLB elevado são adicionados à solução aquosa.
A emulsificação pode ser preparada de acordo com métodos convencionais conhecidos de um versado na técnica. Por exemplo, em uma modalidade da presente invenção, a emulsão pode ser preparada a uma temperatura abaixo da PIT da emulsão, especificamente à temperatura ambiente, por exemplo, a cerca de 25°C. A fase aquosa e a fase oleosa são misturadas por agitação mecânica, por exemplo, com uma turbina equipada com um rotor-estator capaz de criar uma força de cisalhamento elevado. De preferência, a agitação começa a uma velocidade de rotação baixa e aumenta lentamente em relação à adição progressiva geralmente da solução aquosa no óleo. De preferência, a solução aquosa é progressivamente adicionada ao óleo. A razão da solução de óleo/água pode ser adaptada para se obter uma emulsão de água-em-óleo (W/O), por exemplo, a uma concentração de cerca de 40% a cerca de 55% de óleo (v/v). Quando a agitação é interrompida, a emulsão muda progressivamente para emulsão de O/W (inversão de fase). Após a inversão e, se necessário, a emulsão é diluída por adição de uma solução aquosa para se obter a concentração desejada de óleo na emulsão final. A emulsão pode ser armazenada a cerca de 5°C.
Em outra modalidade, a emulsão pode ser preparada a uma temperatura superior a PIT da emulsão. Em uma primeira etapa, a fase aquosa e a fase oleosa são misturadas em conjunto a uma temperatura superior a PIT da emulsão. De preferência, a solução aquosa é progressivamente adicionada ao óleo. A razão de solução óleo/água pode ser adaptada para obter uma emulsão de água-em-óleo (W/O), por exemplo a uma concentração de cerca de 40% a cerca de 55% de óleo (v/v). A emulsificação pode ser obtida por uma agitação com pouca ou nenhuma força de cisalhamento, por exemplo, com um misturador estático ou uma hélice marítima ou com uma turbina a uma velocidade de rotação muito baixa. A emulsão obtida é uma emulsão de água-em-óleo (W/O). Em uma segunda etapa, a emulsão é resfriada progressivamente abaixo da PIT. Durante essa etapa, a emulsão altera para uma emulsão O/W (inversão de fase). Após a inversão e, se necessário, a emulsão é diluída por adição de uma solução aquosa para se obter a concentração desejada de óleo na emulsão final. A emulsão pode ser armazenada a cerca de 5°C.
O tamanho das gotículas na emulsão pode ser de cerca de 100 nm a cerca de 500 nm. A emulsão pode ser utilizada, por exemplo, como um adjuvante para formular uma composição de vacina ou uma composição farmacêutica. A emulsão pode também ser utilizada como um solvente para dissolver um produto seco, especialmente um produto seco contendo, por exemplo, os microorganismos atenuados ou vetores recombinantes vivos.
Em uma modalidade específica, uma pré-emulsão é produzida com apenas uma parte da solução aquosa. Essa pré- emulsão pode ser diluída por adição de uma suspensão de um ingrediente ativo, tal como um medicamento ou um imunógeno, de preferência um imunógeno, para se obter a composição final. Alternativamente, a pré-emulsão pode ser diluída com uma solução aquosa e usada para dissolver um produto seco tal como um produto seco.
O imunógeno ou antígeno adequado para uso na presente invenção pode ser selecionado dentre o grupo consistindo em patógenos inativados, patógenos atenuados, subunidades imunogênicas (por exemplo, proteínas, polipeptídeos, peptídeos, epítopos, haptenos) ou vetores de expressão recombinantes, incluindo plasmídeos, apresentando inserções imunogênicas. Em uma modalidade da presente invenção o imunógeno é um microorganismo inativado ou morto. Em outra modalidade da invenção, a composição de vacina compreende um imunógeno selecionado dentre o grupo de patógenos aviários, incluindo, porém não limitado a Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis. Vírus da Bronquite Infecciosa (IBV), vírus da Doença de Newcastle (NDV), vírus da síndrome da queda do ovo (do inglês Egg drop syndrome vírus - EDS), ou vírus da doença bursal infecciosa (IBDV), vírus da influenza aviária e semelhantes e suas combinações.
Alternativamente, a composição de vacina compreende um imunógeno selecionado de um patógeno felino, tal como, porém não limitam ao herpesvírus felino (FHV), calicivírus felino (FCV), vírus da leucemia felina (FeLV), vírus da imunodeficiência felina (FIV), vírus da raiva, e semelhantes, e suas combinações.
Ainda em outra modalidade, uma composição de vacina da presente invenção compreende um imunógeno selecionado de um patógeno canino, incluindo, porém não limitado ao vírus da raiva, herpesvírus canino (CHV), parvovírus canino (CPV), coronavírus canino, Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorragiae, Leptospira grippotyphosa, Borrelia burgdorferi, Bordetella bronchiseptica e semelhantes e suas combinações.
Ainda em outra modalidade da invenção, a composição compreende um imunógeno selecionado de um patógeno equino, tal como herpesvírus equino (tipo 1 ou tipo 4), vírus da influenza equina, tétano, vírus West Nile, e semelhantes, ou combinações dos mesmos.
Ainda em outra modalidade da invenção, a composição compreende um imunógeno selecionado de um patógeno bovino, tal como vírus da febre aftosa (FMDV), vírus da raiva, rotavirus bovino, vírus da parainfluenza bovina do tipo 3 (bPIV-3), coronavírus bovino, vírus da diarréia bovina viral (BVDV), vírus sincicial respiratório bovino (BRSV), vírus da rinotraqueíte infecciosa bovina (IBR), Escherichia coli, Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica e semelhantes e suas combinações.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, a composição compreende um imunógeno selecionado de um agente patogênico porcino, tal como, mas não limitado ao vírus da gripe porcina (SIV), circovírus porcino tipo 2 (PCV-2), vírus da síndrome respiratória reprodutiva Porcina (PRRS), vírus da pseudo-raiva (PRV), parvovírus porcino (PPV), FMDV, Mycoplasma hyopneumoniae, Erysipelothrix bronchiseptica, Escherichia coli e outros semelhantes além de combinações dos mesmos.
Outra modalidade da invenção provê composições de vacina compreendendo pelo menos um imunógeno e uma emulsão em um veículo farmaceuticamente aceitável. Imunógenos compreendendo os vírus, bactérias, fungos e semelhantes podem ser produzidos por métodos de cultura in vitro utilizando meio de cultura apropriado ou linhagens de células hospedeiras e os métodos convencionais bem conhecidos dos versados na técnica. Por exemplo, PRRS pode ser cultivado em uma linhagem apropriada de células tal como linhagem de células MA-104 (vide Patente US número de série 5.587.164; 5.866.401; 5.840.563; 6.251.404 entre outros). De um modo semelhante, PCV-2 pode ser cultivado usando linhagem de células PK-15 (vide Patente US número de série 6.391.314); SIV pode ser cultivado em ovos (Patente US número de série 6.048.537); e Mycoplasma hyopneumoniae pode ser cultivado em um meio de cultura apropriado (Patentes US números de série 5.968.525; US 5.338.543; Ross R. F. e cols., Adm. J. Vet. Res., 1984, 45: 1899-1905).
A fim de obter uma imunologia inativada, ou composição de vacina, o agente patogênico é, de preferência, inativado após a colheita e, opcionalmente, submetido à clarificação, através de um tratamento químico, utilizando, por exemplo, formalina ou formaldeído, beta-propiolactona, etilenoimina, etilenoimina binária (BEI), e/ou um tratamento físico (por exemplo, um tratamento térmico ou sonicação). Os métodos para a inativação são bem conhecidos dos versados na técnica. Por exemplo, o vírus da febre aftosa (FMD) pode ser inativado por etilenoimina (Cunliffe, RH, Applied Microbiology, 1973, p. 747-750) ou por alta pressão (Ishimaru e cols., Vaccine 22 (2004) 2334-2339), o vírus PRRS pode ser inativado por tratamento com betapropiolactona (Plana-Duran e cols., Vet. Microbiol, 1997, 55: 361-370) ou por tratamento BEI (Patente US número de série 5.587.164); inativação do vírus PCV-2 pode ser realizada utilizando o tratamento com etilenoimina ou tratamento com beta-propiolactona (Patente US número de série 6.391.314); o vírus da gripe porcina pode ser inativado com um detergente como Triton, ou com o tratamento com formaldeído (Patente US número de série 6.048.537); a bactéria Mycoplasma hyopneumoniae pode ser inativada por tratamento com formaldeído (Ross R.F. supra), por tratamento com etilenimina ou BEI (vide WO 91/18.627).
O agente patogênico inativado pode ser concentrado por meio de técnicas de concentração convencionais, especificamente por ultrafiltração, e/ou purificado por meios convencionais de purificação, especificamente, utilizando técnicas de cromatografia, incluindo, mas não limitado a filtração em gel, ultracentrifugação em gradiente de sacarose, ou precipitações seletivas, especificamente na presença de polietileno-glicol (PEG).
Os imunógenos úteis em composições de vacina de acordo com a presente invenção também incluem vetores de expressão. Tais vetores incluem, mas não estão limitados aos vetores de expressão recombinantes in vivo, tais como um vetor de polinucleotídeo ou um plasmídeo (EP-A2- 1.001.025; Chaudhuri P, Res. Vet. Sci. 2001, 70: 255-6), vetores de vírus, tais como, mas que não se limitam aos vetores de adenovírus, vetores poxvírus, tais como fowlpox (Patentes US números de Série 5.174.993; 5.505.941; e 5.766.599) ou vetores canarypox (Patente US número de Série 5.756.103) ou vetores bacterianos (Escherichia coli ou Salmonella sp.)
A presente invenção também engloba a formulação de composições imunológicas multivalentes ou composições de combinações de vacinas. Por exemplo, os antígenos úteis na combinação bacteriana bovina feita de acordo com a presente invenção incluem, mas não estão limitados ao Mycoplasma bovis, Pasteurella sp., especificamente P. multocida e P. haemolytica, Haemophilus sp., especificamente H. somnus, Streptococcus, Staphylococcus, Moraxella, E. coli e outros semelhantes.
A presente invenção provê ainda métodos para induzir uma resposta imune em um hospedeiro, por exemplo, um animal, compreendendo a administração ao hospedeiro de uma composição imunológica ou uma composição de vacina de acordo com a invenção. As respostas imunes provocadas desta maneira são notavelmente respostas imunes de anticorpo e/ou celulares e, especificamente, a resposta de um interferon gama.
Especificamente, a presente invenção provê métodos para imunizar, prevenir ou para reduzir os sintomas provocados por infecção de um animal com um organismo patogênico (por exemplo, infecção por um vírus, bactéria, fungo, ou parasita protozoário). O método da presente invenção é útil em animais vertebrados, incluindo, mas não limitado aos seres humanos, caninos (por exemplo, cães), felinos (por exemplo, gatos); equinos (por exemplo, cavalos), bovinos (por exemplo, gado) e porcinos (por exemplo, os porcos), bem como em aves incluindo, mas não limitado as galinhas, perus, patos, gansos, codornas, faisões, papagaios, tentilhões, falcões, corvos e aves corredoras (avestruz, ema, casuar e semelhantes).
Em um aspecto específico da invenção, esses métodos consistem na vacinação de fêmeas grávidas antes do parto por administração de uma composição de vacina feita de acordo com a invenção. Esses métodos incluem ainda a indução de anticorpos protetores promovida pelo protocolo de vacinação e a transferência desses anticorpos protetores das fêmeas grávidas vacinadas para as crias. A transferência de tais anticorpos maternos subsequentemente protege as crias da doença.
A dosagem da composição de vacina feita de acordo com a presente invenção dependerá da espécie, raça, idade, tamanho, histórico de vacinação, e estado de saúde do animal a ser vacinado. Outros fatores como a concentração de antígeno, componentes de vacina adicionais e via de administração (ou seja, administração subcutânea, intradérmica, oral, intramuscular ou intravenosa) também terão impacto na eficiência de dosagem. A dosagem de vacina a ser administrada é facilmente determinada com base na concentração de antígeno da vacina, a via de administração, a idade e condição do animal a ser vacinado. Cada lote de antígeno pode ser calibrado individualmente. Alternativamente, os experimentos metódicos de imunogenicidade de diferentes dosagens, assim como estudos de LD50 e outros procedimentos de rastreamento podem ser utilizados para determinar a dosagem efetiva para uma composição de vacina de acordo com a presente invenção sem experimentação indevida. A partir dos exemplos apresentados a seguir, será facilmente evidente qual dosagem aproximada e qual volume aproximado seriam adequados para a utilização da composição de vacina descrita no presente documento. O fator principal é que a dosagem fornece, pelo menos, um efeito parcialmente protetor contra a infecção natural, conforme evidenciado por uma redução na mortalidade e morbidade associadas com a infecção natural. O volume apropriado é também facilmente determinado por um versado na técnica. Por exemplo, nas espécies aviárias, o volume de uma dose pode ser de cerca de 0,1 mL a cerca de 0,5 mL e, vantajosamente, entre cerca de 0,3 mL a cerca de 0,5 mL. Para as espécies de felinos, caninos e equinos, o volume de uma dose pode ser de cerca de 0,2 mL a cerca de 3,0 ml, vantajosamente desde cerca de 0,3 mL a cerca de 2,0 ml, e mais vantajosamente, entre cerca de 0,5 mL a cerca de 1,0 mL. Para as espécies bovina e porcina, o volume da dose pode ser de cerca de 0,2 mL a cerca de 5,0 mL, vantajosamente desde cerca de 0,3 mL a cerca de 3,0 mL, e mais vantajosamente de 0,5 mL a cerca de 2,0 mL.
Vacinações repetidas podem ser preferidas em intervalos de tempo periódicos para melhorar a resposta imune inicial ou quando um longo período de tempo decorreu desde a última dose. Em uma modalidade da presente invenção, a composição de vacina é administrada como uma injeção parentérica (isto é, por via subcutânea, intradérmica, ou por via intramuscular). A composição pode ser administrada como uma dose única ou, em modalidades alternativas, administrada em doses repetidas de cerca de duas a cerca de cinco doses administradas em intervalos de cerca de duas a cerca de seis semanas, de preferência de cerca de duas a cerca de cinco semanas. No entanto, um versado na técnica reconhecerá que o número de doses e o intervalo de tempo entre vacinações depende de inúmeros de fatores, incluindo, mas não limitado a idade do animal vacinado, a condição do animal; a via de imunização; quantidade de antígeno disponível por dose; e semelhantes. Para a vacinação inicial, o período será geralmente de mais de uma semana, e de preferência estará entre cerca de duas a cerca de cinco semanas. Para os animais previamente vacinados, uma vacinação de reforço, antes ou durante a gravidez, em um intervalo anual pode ser realizada.
A presente invenção também contempla a administração de uma composição de vacina utilizando um injetor isento de agulha, tal como, PIGJET®, AVIJET®, DERMOJET® ou BIOJECTOR® (Bioject, Oregon, USA). Um versado na técnica é capaz de ajustar as especificações do injetor conforme necessário com relação a fatores, tais como, as espécies de animal a serem vacinados, idade e peso do animal e semelhantes sem experimentação indevida.
Em uma modalidade da presente invenção, o método compreende uma única administração de uma composição de vacina formulada com uma emulsão de acordo com a invenção. Por exemplo, em uma modalidade, a composição de vacina é uma composição de vírus inativado da febre aftosa, FMD, enquanto uma modalidade alternativa provê uma vacina compreendendo uma composição de vírus inativado PCV2. Outras composições imunológicas ou vacinas são adequadas para utilização em um regime de dose única, incluindo, mas não limitado ao Mycoplasma hyopneumoniae inativado, PRRS e SIV.
A invenção diz ainda respeito a métodos para tratar um hospedeiro, por exemplo, um animal, compreendendo a administração ao hospedeiro de uma composição farmacêutica obtida de acordo com a invenção e que compreende pelo menos um imunógeno selecionado dentre o grupo consistindo em proteínas ou peptídeos, vírus inativado ou atenuado, anticorpos, alergenos, CpG ODN, fatores de crescimento, citocinas ou antibióticos e especificamente CpG ODN ou citocinas. Estas composições farmacêuticas podem ser utilizadas para melhorar o desempenho de crescimento em um animal, tal como um frango, porco, uma vaca ou gado.
A presente invenção ainda se refere a um kit compreendendo um único frasco contendo um ingrediente, tal como, um imunógeno purificado combinado com uma emulsão obtida de acordo com a presente invenção. O kit pode compreender, alternativamente, um primeiro frasco contendo um ingrediente, tal como, um imunógeno ou composição farmacêutica, combinado com saponina e hidróxido de alumínio, e um segundo frasco contendo uma emulsão obtida de acordo com a presente invenção. O imunógeno pode estar em uma forma seca, uma forma que foi seca ou em solução aquosa como descrito no presente documento.
A invenção será descrita adicionalmente por meio dos exemplos não limitativos que se seguem. Exemplo 1 Método de Fabricação de Emulsão
A emulsão foi preparada pelo método de inversão. Em uma primeira etapa, a fase aquosa e a fase oleosa foram misturadas em conjunto a 40°C. Em uma segunda etapa, a emulsão foi resfriada progressivamente abaixo da PIT a +5°C a fim de se obter uma emulsão O/W. Após a inversão, a emulsão final (isto é formulação de vacina) foi misturada e, subsequentemente, armazenada a +5°C (resumido na Tabela 1). Tabela 1
Figure img0003
* Faixas de Concentração/Quantidade - Hidróxido de alumínio - desde cerca de 0,0% a cerca de 1,0% (p/v), com relação ao volume da formulação de vacina; - Saponina - desde cerca de 0,1 mg a cerca de 2 mg por mL de formulação de vacina; - Antígenos - desde eetec fg 2.3 μi c cerca de 200 μi por mL de formulação de vacina; - M102 e fosfato para volume.
Monooleato de sorbitano (SPAN 80®) e trioleato de sorbitano (20 EO) (TWEEN 85®) foram introduzidos na fase oleosa. O monooleato de sorbitano (20 EO) (TWEEN 80®) não foi miscível no óleo de parafina. Uma solução a 20% (p/v) de Tween 80® foi preparada do mesmo tampão que a vacina, por exemplo, tampão isotônico 0,02M fosfato dissódico e fosfato monopotássio (pH 7,8). Quando a agitação parou, a emulsão alterou para uma emulsão de óleo-em-água. A emulsão foi colocada em uma câmara fria a 5°C durante pelo menos 4 horas. Nesta fase, a emulsão era uma pré-emulsão contendo 50% da fase oleosa. Segunda etapa: A fase aquosa # 2 foi preparada com 120 mL pré-emulsão conforme preparada na primeira etapa foi resfriada a cerca de 5°C, diluída com adição de metade do volume da fase aquosa # 2 na mesma temperatura e misturada por rotação de uma barra magnética por 1 minuto. A concentração final do tensoativo na emulsão TSAP foi de 4,75% (p/v).
Em geral, os componentes das formulações de vacina descritos no presente documento foram adicionados na seguinte ordem: 1) meio 102 a 5°C, 2) saponina, 3) hidróxido de alumínio, 4) antígenos e 5) emulsão incompleta (isto é, a combinação da Fase Oleosa mais a Fase Aquosa # 1). Tal como preparado no presente documento, as vacinas ETPA são estáveis durante até 36 meses a 5°C.
Usando o mesmo método de preparação, outras emulsões podem ser obtidas conforme descrito nos exemplos a seguir: Emulsão TSAP-2 alumínio e opcionalmente contendo imunógenos. A concentração final do tensoativo na emulsão TSAP-2 é de cerca de 4,25% p/v. Emulsão TSAP-3
A emulsão TSAP-3 é uma emulsão de O/W contendo 50% de uma fase oleosa. A fase oleosa (160 mL) contém MARCOL 82® a 92% v/v, SPAN 85® 1,8% p/v e BRIJ 96® a 6,2% p/v. A fase aquosa #1 (160 mL) contém tampão isotônico 0,02 M fosfato dissódico e fosfato monopotássio (pH 7,8) 98,5% v/v, e LUTROL F127® 0,5% p/v, saponina, hidróxido de alumínio e opcionalmente contendo imunógenos. A concentração final do tensoativo na emulsão TSAP-3 é de cerca de 4,25% p/v. Emulsão TSAP-4 para obter a emulsão TSAP-3. A concentração final do tensoativo na emulsão TSAP-4 é de 4,25% p/v. Exemplo 2 Determinação da Temperatura de Inversão de Fase (PIT) de uma Emulsão Estudo # 1: Estabilidade das Formulações de Vacinas Preparadas de Acordo com o Exemplo 1
Esta tabela indica a estabilidade (isto é, o tempo em meses que as formulações permanecem como emulsões de óleo em água) nas formulações de vacina preparadas de acordo com o método descrito no Exemplo 1. As formulações são compreendidas dos ingredientes constituintes indicados (vide formulações 1-13) e os antígenos utilizados para cada uma destas formulações compreendendo isolados de vírus da febre aftosa (FMD) inativados que foram considerados moderada a altamente purificados.
Como a Tabela 2 indica, a presença de hidróxido de alumínio provê estabilidade aumentada à vacina, especialmente quando a concentração mais elevada de antígeno é empregada (comparar a estabilidade aumentada das formulações 9, 11 e 13 com a estabilidade relativamente reduzida em 12 meses das formulações 3, 5, e 7). Em média, a presença de hidróxido de alumínio nas formulações apresentando concentrações maiores de antígeno (isto é, as formulações 9, 11 e 13) aumenta o tempo de estabilidade de óleo/água de cerca de 3-6 meses (isto é, a estabilidade de óleo/água observada para as formulações 3, 5 e 7) para cerca de (12) meses (isto é, a estabilidade de óleo/água observada para as formulações 9, 11), ou mesmo até cerca de vinte e quatro (24) meses (isto é, a estabilidade do óleo/água observada para a formulação 13). Tabela 2
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Exemplo 4 Estudo #2: Estabilidade das Formulações de Vacina Preparadas de Acordo com o Exemplo 1
As formulações de vacinas foram preparadas conforme descrito no Exemplo 1 e de acordo com as quantidades de componentes indicadas na Tabela 3. Conforme descrito anteriormente, a ordem de adição dos componentes foi: 1) meio 102, 2) saponina, 3) hidróxido de alumínio, 4) antígenos purificados, e 5) emulsão incompleta (vide o Exemplo 1 onde a emulsão incompleta é definida como a fase oleosa mais a fase aquosa #1). Os antígenos purificados eram antígenos FMDV O1 Campos, A24 Cruzeiro e C3 Indaial. O volume total foi ajustado usando meio 102 (M102, receita indicada a seguir). Tabela 3
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Tabela 4
Figure img0006
A estabilidade da vacina foi determinada de acordo com a Tabela 5. Tabela 5
Figure img0007
* Para as vacinas sem alumina gel ** Controles realizados ao final do estudo de estabilidade Para cada formulação de vacina, a temperatura de inversão de fase (PIT) foi determinada como descrito no Exemplo 2. A quantidade de antígeno adicionado é indicada por "unidades de hemaglutinina" (UH) por dose de vacina. A Tabela 6 resume os dados da PIT e indica que a PIT geralmente permaneceu estável por até 36 meses. A Figura 6 apresenta gráficos da determinação da PIT por condutividade para as formulações de vacina dos Experimentos 1-10 (resumidos na Tabela 6). O aumento da PIT que é observado com as formulações com adjuvante saponina (isto é, experimentos 3, 4, 6, 7, 9 e 10), constitui por si só uma melhoria em relação à estabilidade das formulações sem adjuvante saponina (isto é, experimentos 2, 5 e 8). Tabela 6
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A distribuição de tamanho de partícula (Tabela 7) das emulsões permaneceu dentro da faixa estabelecida nos critérios do estudo durante o período de tempo de 36 meses. Tabela 7
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Exemplo 5
Resultados da Sorologia após a Administração de Doses Múltiplas de uma Vacina Contra Vírus da Febre Aftosa (FMD) Contendo Adjuvante de Emulsão TSAP - Estudo em Bovinos.
Materiais e Métodos: 90 cabeças de gado de 12 a 14 meses de idade que nunca foram vacinados e sem anticorpos contra febre aftosa (FMD) foram selecionadas, aleatoriamente, e distribuídas entre 10 grupos de 9 animais a serem vacinados. Os animais foram vacinados com as formulações de vacinas indicadas (9807-9814) no dia 1. Cada uma das formulações listadas nas Tabelas 8, 9, 10, e 11 foi preparada de acordo com o Exemplo 1 e compreende todos os componentes citados no Exemplo 1 com as quantidades de saponina e hidróxido de alumínio variando de acordo com o que se segue: a quantidade de saponina é tanto de 0, 0,7, 1,3, ou 2,7 mg/dose e da quantidade de hidróxido de alumínio Algel é de 0% ou 0,37%. Oito (8) grupos foram vacinados por via intramuscular (o grupo IM) e dois (2) grupos foram vacinados por via subcutânea (o grupo SC). Cada animal do grupo IM foi revacinado com a respectiva vacina no dia 56 por via intramuscular e no dia 84 por via subcutânea. Cada animal do grupo de SC foi revacinado com a respectiva vacina nos dias 56 e 84 por via subcutânea. A Tabela 8 resume a estabilidade das formulações de vacina. Tabela 8
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Não houve qualquer lesão após a primeira vacinação através da via intramuscular. Houve algumas lesões após a segunda vacinação por via intramuscular, porém todas essas lesões regrediram 28 dias após a segunda vacinação através da via intramuscular. A Tabela 9 resume a segurança das formulações de vacinas, conforme indicado pela medição do peso corporal dos animais nas datas especificadas. Tabela 9
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Resultados: A Tabela 10 resume os dados sorológicos coletados durante os ensaios experimentais. O1 Campos, A24 Cruzeiro e C3 Indaial são três sorotipos independentes do vírus da febre aftosa (FMD), e a presença dos anticorpos de O1, A24 e C3 é um indicador positivo de que a formulação da vacina induziu uma resposta imune nos vacinados. "G1" indica que a formulação da vacina foi administrada por via intramuscular e "G2" indica a formulação da vacina foi administrada por via subcutânea. Para a presente invenção, especificamente para os antígenos virais da febre aftosa, existe uma correlação, forte e direta entre o anticorpo título (isto é, níveis séricos de O1 Campos, A24 Cruzeiro, e C3 Indaia) e do número de Proteção da População
Equivalente (EPP). Em termos simples, quando os títulos dos anticorpos são elevados, os animais vacinados são correspondente e altamente protegidos contra a infecção viral.
Surpreendentemente, a presença de hidróxido de alumínio está associada a uma diferença significativa na resposta imune que depende da via de administração. Quando o hidróxido de alumínio está presente, como nas formulações 9812G1 e 9812G2, há um aumento significativo na resposta imune do vacinado, tal como medida pelas titulações dos anticorpos, quando a formulação da vacina é administrada por via subcutânea. Não há diferença semelhante e significativa na eficácia, devido à via de administração para as formulações de vacinas correspondentes que não contêm o hidróxido de alumínio, ou seja, 9811G1 e 9811G2.
A razão para esta resposta imune aumentada devido à presença de hidróxido de alumínio coincidente com a utilização da via de administração subcutânea não é conhecida até esse momento, porém uma modalidade eficaz da presente invenção pode incluir, mas não está limitada a variação da via de administração da vacina dependente dos dados da eficácia atuais e futuros (por exemplo, titulação do anticorpo).
Em comparação com as formulações de vacina de controle que não contém adjuvante saponina (isto é, 9807 e 9808), as formulações de vacina contendo adjuvantes saponina promovem nos animais de estudo uma resposta imune mais rápida para todos os três antígenos do vírus da febre aftosa (FMD), conforme indicado pelas maiores titulações médias de anticorpos para formulações contendo adjuvante de saponina no Dia 21. Em conjunto, essas evidências indicam que a presente invenção provê maior estabilidade e permite respostas imunes mais rápidas que as formulações que não contêm adjuvante saponina. Tabela 10
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G1 - formulação de vacina foi administrada por via intramuscular G2 - formulação de vacina foi administrada por via subcutânea Exemplo 6
Resultados da Sorologia após Administração de Duas Doses de Febre Aftosa (FMD) - Vacina contra vírus com adjuvante TSAP em Emulsão - Estudo em Suínos.
Materiais e Métodos: 57 porcos que nunca foram vacinados e sem anticorpos contra febre aftosa (FMD) foram selecionados aleatoriamente e distribuídos entre 9 grupos de 6 animais a ser vacinados e 1 grupo de 3 animais que não seriam vacinados (animais não vacinados). Os animais foram vacinados com cada uma das formulações de vacina indicadas (A-I) no dia 1. Cada uma das formulações listadas na Tabela 11 foi preparada de acordo com o Exemplo 1 e compreende todos os componentes citados no Exemplo 1 com a saponina e o hidróxido de alumínio variando de acordo com o que se segue: a quantidade de saponina é de 0, 0,7, 1,3, ou 2,7 mg/dose e da quantidade de hidróxido de alumínio Algel é de 0% ou 0,37%. A segurança da formulação da vacina foi avaliada através da medição de diversos parâmetros, incluindo temperatura retal e referências visuais da reação do animal a vacinação. Tabela 11
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Resultados: Todas as formulações de vacina que continham antígeno (formulações de B-I, descritas na Tabela 11) induziram nos animais de teste uma resposta de 5 anticorpos que era significativamente maior que aquela induzida pelo controle sem antígeno (formulação I, descrita na Tabela 11). As formulações que continham saponina induziram respostas de anticorpos relativamente maiores, em comparação com as formulações que não continham saponina. A Tabela 12 resume os dados de titulação de anticorpos, e redefine as quantidades de antígeno, saponina e hidróxido de alumínio para cada formulação. Especificamente, os dados de titulação de anticorpo indicam que a presença de saponina nas formulações de vacina entre mg/dose e cerca de 2,7 mg/dose aumenta a resposta de anticorpos, em relação às formulações de vacina que não contêm saponina. Tabela 12
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Exemplo 7 Determinação da Dose de Protecção de 50% (PD50) de Três Vacinas Experimentais Contra Febre Aftosa (FMD) em Suínos Visão geral. A finalidade do estudo foi testar a eficácia contra um desafio com vírus FMD em porcos de 3 formulações de vacina experimental contra FMD, de acordo com a presente invenção. Quatro vacinas (A, B, C e D) foram preparadas respectivamente sem Antígeno (A), e doses variáveis de antígeno FMD Manisa O1 purificado e inativado (vacinas B, C e D) formuladas com adjuvante de acordo com a presente invenção. As vacinas foram apresentadas em frascos de 30 mL com um volume preenchido de 25 mL e dosadas em 2 mL por dose. A cepa desafiante era FMD O1 Manisa, 449402 4D:911, 20-07-1994 (que havia sido originalmente isolada como O1 Manisa Turkey 1/78), e a titulação nas células renais secundárias de porcos foi de 7,67 log10 TCID50/mL. O diluente para a cepa desafiante foi Hanks MEM, soro fetal bovino a 2% (FBS) com antibióticos convencionais.
Procedimento. Porcos isentos de FMDV e não previamente vacinados contra a febre aftosa (FMD) foram usados para o estudo. Cada um dos 47 porcos com idade de 10 semanas (mais ou menos 1 semana) foi aclimatado durante pelo menos 24 horas antes dos procedimentos experimentais. Os porcos foram alojados em 2 a 3 animais por compartimento e foram alimentados com ração convencional e água a vontade. No Dia 1 (D1), os porcos (independente do sexo) foram distribuídos em 15 grupos de três animais e um grupo de dois animais.
Cada grupo foi alojado em um compartimento específico e em cada compartimento, os animais foram separados individualmente por tábuas de madeira (1,5 m) e desafiados até o término do estudo.
No dia 0, D0, os animais foram vacinados, por via intramuscular por trás da orelha, no lado esquerdo, com seringas individuais de acordo com Tabelas 13 e 14. Antes da vacinação, frascos de vacina foram brandamente invertidos cerca de 10 vezes para assegurar uma suspensão homogênea. Tabela 13 - Composição da vacina
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Tabela 14 - Resumo da vacinação
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Desafio. No D28, o vírus FMD do tipo O foi diluído para obter 100.000 TCID50 por mL (o estoque de vírus foi diluído 2,67 log10, ou 468 vezes). No mesmo dia, todos os animais foram anestesiados por administração de STRESSNIL (1 mL/20 kg) e KETAMINE (2 mL/20 kg) por via IM e desafiados com 10.000 TCID50 de vírus sob 0,1 mL por via intradérmica, no bulbo do casco da unha externa da pata esquerda posterior. O bem-estar geral dos animais foi avaliado diariamente, a partir de D0 ao D28. Quaisquer observações clínicas e os tratamentos foram observados. Após o desafio, os animais foram observados diariamente durante 7 dias (D29 ao D35). As observações foram realizadas na mesma ordem, começando pelos compartimentos com os animais vacinados com a mais elevada dose para aqueles com os animais vacinados com a dose mais baixa, e terminando com os controles (grupo A). O bem-estar geral foi avaliado diariamente, com especial atenção aos sinais de febre aftosa no focinho e nas patas. O sangue foi colhido de cada animal antes da vacinação (em D1 ou D0), D14, D28 antes do desafio e no final do estudo. As amostras foram inativadas pelo calor (56°C por 30 minutos) e titulação de FMDB Ab tipo O foi determinada em todos os soros pelo teste VN (MERIAL R&D, Lelystad).
No D36 (fim do período de observação), os animais foram sacrificados (4 a 6 mL por 50 kg IV T61) e completamente inspecionados quanto aos sinais de FMDV. Quaisquer lesões observadas nos grupos vacinados com uma dose completa de vacina (grupos B1, C1, ou D1) eram amostradas e congeladas a -70°C para tipagem de vírus posterior. A presença de lesões no focinho, boca e/ou patas (exceto na unha principal da pata inoculada) foram consideradas como evidência de FMD. O teste O foi considerado válido, uma vez que satisfez os critérios que estabeleciam que ambos os porcos de controle deveriam mostrar sinais clínicos de FMD. A PD50 de cada vacina foi calculada pelo método Spearman Karber. Resultados. Potência versus carga é apresentada na figura 9 e os dados do estudo relevantes são numericamente resumidos nas Tabelas 15 e 16 a seguir. Tabela 15
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Tabela 16
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Claims (14)

1. Composição vacinal veterinária compreendendo uma emulsão injetável óleo-em-água (O/A) caracterizada pelo fato de compreender: (I) uma solução aquosa compreendendo pelo menos um imunógeno, que é um vírus da doença da febre aftosa (FMD) inativado, um vírus de circovírus porcino de tipo 2 inativado (PCV-2) ou uma bactéria Mycoplasma hyopneumoniae inativada; (II) uma solução aquosa compreendendo uma saponina em uma quantidade de 0,35 mg/dose a 3,0 mg/dose; (III) uma solução aquosa compreendendo hidróxido de alumínio, em que a concentração de hidróxido de alumínio é entre 0,065% (p/v) e 1,0% (p/v); (IV) 20% a 40% (v/v) de um óleo mineral, em que o óleo mineral é selecionado a partir do grupo que consiste de óleo de parafina, esqualano, pristano, óleo de poliisobuteno, óleo hidrogenado de poliisobuteno, óleo de polideceno, óleo de poliisopreno, óleo de poliisopropeno e combinações do mesmos; (V) 0,1% a 2,5% (p/v) de um tensoativo lipofílico não iônico, em que o tensoativo lipofílico não iônico é selecionado a partir do grupo que consiste em ésteres de ácidos graxos de sorbitano, ésteres de ácidos graxos de manida, ésteres de ácidos graxos di-etoxilados de manida, ésteres de ácidos graxos tri-etoxilados de manida, ésteres de ácidos graxos tetra-etoxilados de manida e combinações do mesmos, e em que o éster dos ésteres de ácidos graxos é selecionado a partir do grupo consistindo em oleato, palmitato, estearato, laurato isoestearato e combinações dos mesmos; (VI) 0,1% a 1,5% (p/v) de um tensoativo hidrofílico não iônico tendo um equilíbrio hidrofílico-lipofílico (HLB) elevado, de valor entre 13 e 40, em que o tensoativo hidrofílico não iônico de HLB elevado é selecionado a partir do grupo que consiste em monoésteres etoxilados de ácidos graxos de sorbitano, álcoois graxos etoxilados, ácidos graxos etoxilados, bloco de copolímero não iônico e combinações dos mesmo, e em que o monoéster etoxilado de sorbitano é selecionado a partir do grupo consistindo em monolaurato de sorbitano etoxilado, monopalmitato de sorbitano etoxilado, monoestearato de sorbitano etoxilado, monooleato de sorbitano etoxilado, e combinações dos mesmos; e (VII) 1% a 8% (p/v) de um tensoativo hidrofílico não iônico tendo um equilíbrio hidrofílico-lipofílico (HLB) baixo, de valor compreendido entre 9 e 13, em que o tensoativo hidrofílico não iônico de HLB baixo é selecionado a partir do grupo consistindo de triésteres etoxilados de ácidos graxos de sorbitano, diésteres etoxilados de ácidos graxos de sorbitano, monoésteres etoxilados de ácidos graxos de sorbitano, álcoois graxos etoxilados, ácidos graxos etoxilados, óleo de rícino etoxilado e combinações dos mesmos, e em que o éster do referido éster de ácido graxo etoxilado é selecionado a partir do grupo consistindo em oleato, palmitato, estearato, laurato, isoestearato, e combinações dos mesmos, por meio da qual a emulsão possui estabilidade de 24 meses ou 36 meses e uma temperatura de inversão de fase (PIT) de 38°C a 50°C, e a vacina induz uma resposta à anticorpo relativamente maior quando comparada a formulações que não possuem saponina.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a concentração total dos tensoativos é de 4% a 8% em peso/volume de emulsão.
3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de compreender um óleo de parafina, um monoéster de ácido graxo de sorbitano como um tensoativo lipofílico não iônico, um triéster de ácido graxo etoxilado de sorbitano como um tensoativo hidrofílico não iônico de HLB baixo e um bloco de copolímero não iônico como um tensoativo hidrofílico não iônico de HLB elevado.
4. Composição, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o monoéster de ácido graxo de sorbitano é um monooleato de sorbitano, o triéster de ácido graxo etoxilado de sorbitano é um trioleato etoxilado de sorbitano e o bloco de copolímero não iônico é um polímero polioxietileno/polioxipropileno (POE-POP).
5. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a quantidade de saponina é de 0,7 mg/dose a 2,7 mg/dose.
6. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a quantidade de hidróxido de alumínio é 0,37% p/v.
7. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o tensoativo hidrofílico não iônico de HLB elevado está presente em uma concentração de 0,4% a 1,2% p/v.
8. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o tensoativo hidrofílico não iônico de HLB baixo está presente em uma concentração de 2,5% a 4,0% p/v.
9. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a quantidade de tensoativo lipofílico não iônico é de 0,1% p/v a 1,2% p/v.
10. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a quantidade de saponina é de 2,7 mg/dose.
11. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que a quantidade de saponina é de 1,3 mg/dose.
12. Composição, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o óleo de parafina está presente em uma concentração de 20% a 40% v/v, o monooleato de sorbitano está presente em uma concentração de 0,2% a 1,5% p/v, o trioleato de sorbitano etoxilado está presente em uma concentração de 2% a 5% p/v e o POE-POP está presente em uma concentração de 0,1% a 0,5% p/v.
13. Composição, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o óleo de parafina está presente em uma concentração de 29,3% v/v, o monooleato de sorbitano está presente em uma concentração de 0,6% p/v, o trioleato etoxilado de sorbitano está presente em uma concentração de 3,4% p/v e o POE-POP está presente em uma concentração de 0,25% p/v.
14. Uso de uma composição de vacina como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para induzir uma resposta imunológica ao referido animal contra um vírus da doença da febre aftosa (FMD), um vírus de circovírus porcino de tipo 2 (PCV-2) ou Mycoplasma hyopneumoniae.
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