CN102573900B - 包含含有皂苷的佐剂的新疫苗制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供在细菌或病毒悬浮液，尤其浓缩的及非‑纯化的(粗产物提取物)或最低限度纯化的那些的存在下具有增加的稳定性的新水包油(O/W)乳剂。本发明的乳剂可发挥用于递送包含至少一种免疫原的药物组合物的媒质的作用，且所述免疫原尤其是选自下列的免疫原：灭活的病原体，减毒的病原体，亚基，重组表达载体，及质粒或其组合。
Description
【技术领域】
本发明涉及水包油乳剂，它们作为佐剂的使用，及包含所述乳剂的药学，免疫学或疫苗组合物。
【援引加入】
本申请要求2009年9月10日提交的美国临时专利申请No.61/241,171的优先权，且还参考下列专利申请：2008年2月7日提交的美国专利申请No.12/027,776，2004年7月26日提交的美国专利申请No.10/899,181，现在授权的美国专利7,371,395，及2003年7月24日提交的美国临时专利申请No.60/490,345。上述申请，及它们中或它们的审查期间引用的全部文献(“申请人引用的文献”)和申请人引用的文献中引用的或参考的全部文献，及本文引用的或参考的全部文献(“本文引用的文献”)，及本文引用的文献中引用的或参考的全部文献，以及本文或通过引用并入本文的任何文献中提及的任何产品的任何制造商的使用说明，描述，产物说明书，及产物印刷品均通过引用并入本文，且可在本发明的实践中采用。
【背景技术】
熟知疫苗中佐剂的使用。佐剂是当与疫苗抗原组合时，相比由疫苗抗原单独诱导的应答，增加对疫苗抗原的免疫应答的化合物。促进抗原免疫原性的策略之中尤其是：致使疫苗抗原成粒子的策略，多聚化或乳化疫苗抗原的策略，包裹疫苗抗原的方法，增加宿主先天性细胞因子应答的方式，及使疫苗抗原靶向抗原呈递细胞的方法(Nossal，1999，In：Fundamental Immunology.Paul(Ed.)，Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia，Pa.；Vogel和Powell，1995，In：Vaccine Design.The Subunit and AdiuvantApproach.Powell和Newman(Eds.)，Plenum Press，NY，N.Y.p.141)。因为佐剂在改善疫苗抗原的免疫原性中起到必要的作用，疫苗制剂中佐剂的使用已实际上是普遍存在的(Nossal，1999，见上；Vogel和Powell，1995，见上；也见PCT公开WO 97/18837，将它们的教导通过引用并入本文)。本领域中熟知的常规佐剂性质多样。它们可，例如，由水不溶性无机盐，脂质体，微团或乳剂组成，即弗氏佐剂。其他佐剂可见于以上提及的Vogel和Powell，1995。尽管无佐剂作用的单一机理，必要的特征是它们相比由疫苗抗原单独诱导的应答显著增加对疫苗抗原的免疫应答的能力(Nossal，1999，见上；Vogel和Powell，1995，见上)。在这点上，一些佐剂在增加体液免疫应答中更有效；其他佐剂在增加细胞-介导的免疫应答中更有效(Vogel 和Powell，1995，见上)；及再一组的佐剂增加针对疫苗抗原的体液和细胞-介导的免疫应答(Vogel和Powell，1995，见上)。
一般而言，疫苗制剂中使用的乳剂包含油，水溶液和表面活性剂的混合物。一些乳剂合并亲脂性表面活性剂诸如SPAN和亲水表面活性剂诸如TWEEN
但是，可用作为疫苗佐剂使用的乳剂观察到稳定性问题，尤其是存储或运输期间。当这些组合物含有浓缩的免疫原，尤其非-纯化的浓缩的免疫原时尤其如此。一般而言，这是在灭活的(杀的)疫苗中使用的佐剂的情况。此问题在多价疫苗组合物中甚至更显著，因为免疫原在相同体积的稀释剂中更浓缩。
佐剂使用的另一问题与不利的事件诸如毒性或在注射位点处局部发炎的风险关联。例如，可在注射之后产生局部炎性应答和/或肉芽肿。为了限制该不利的反应，可减少乳剂中的表面活性剂和其他组分；但是，所述减小可然后导致疫苗组合物的稳定性的降低。因此，有对含有该具有增加的安全性和稳定性的佐剂的新佐剂和疫苗组合物的需求。
【发明概述】
在第1实施方式中，本发明提供在细菌或病毒悬浮液，尤其浓缩的及非-纯化的或弱地纯化的那些的存在下具有增加的稳定性的新水包油(O/W)乳剂。
本发明的另一实施方式提供稳定的，安全和容易可施用的，尤其是可注射的，作为用于包含至少一种活性成分的药物组合物的递送的媒质的O/W乳剂，所述活性成分可为，更具体而言，免疫原。
本发明的再一实施方式提供稳定的，安全和可注射的作为用于增加由免疫原诱导的免疫应答的佐剂的O/W乳剂。尤其是，本发明提供当在含有免疫原的疫苗组合物中使用时，增加受疫苗接种者的对于免疫原的细胞免疫应答，体液免疫应答或，优选二者的新佐剂。
本发明的再一实施方式提供包含O/W乳剂的稳定的，安全和免疫原性组合物或疫苗。
本发明的进一步实施方式提供使用本发明的佐剂制造疫苗组合物的方法；由此获得的疫苗组合物；及使用所述疫苗组合物的方法。
本发明的再一实施方式提供包含一或更多瓶的试剂盒。在一实施方式中，试剂盒包含含有本发明的佐剂和免疫原或其他药物产物的1瓶。在再一实施方式中，试剂盒在第1瓶包含免疫原或其他药物产物，及在第2瓶包含根据本发明制备的佐剂，佐剂被设计为在使用之前与免疫原或其他疫苗产物混合。
在一实施方式中，本发明提供可注射的水包油(O/W)乳剂，其包含：
(1)包含免疫原的水溶液；
(2)包含亲水离子表面活性剂诸如皂苷的水溶液
(3)包含氢氧化铝的任选的水溶液
(4)矿物油；
(5)非-离子亲脂性表面活性剂；
(6)包含乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸二酯的具有低HLB值的非-离子亲水表面活性剂(通常具有11和13之间的HLB值)。
在另一实施方式中，本发明提供可注射的水包油(O/W)乳剂，其包含：
(1)包含免疫原的水溶液；
(2)包含亲水离子表面活性剂诸如皂苷的水溶液
(3)矿物油；
(4)非-离子亲脂性表面活性剂；
(5)包含乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸二酯的具有低HLB值的非-离子亲水表面活性剂(通常具有11和13之间的HLB值)。
在另一实施方式中，本发明提供可注射的水包油(O/W)乳剂，其包含：
(1)包含免疫原的水溶液；
(2)包含亲水离子表面活性剂诸如皂苷的水溶液
(3)包含氢氧化铝的任选的水溶液
(4)具有大于13和小于40，尤其是HLB≥13.5，及优选HLB≥14的高亲水-亲脂性平衡(HLB)值的非-离子亲水表面活性剂；
(5)矿物油；
(6)非-离子亲脂性表面活性剂；
(7)具有低HLB值(约9～约13的HLB值)的非-离子亲水表面活性剂。
在另一实施方式中，本发明提供可注射的水包油(O/W)乳剂，其包含：
(1)包含免疫原的水溶液；
(2)包含亲水离子表面活性剂诸如皂苷的水溶液
(3)具有大于13和小于40，尤其是HLB≥13.5，及优选HLB≥14的高亲水-亲脂性平衡(HLB)值的非-离子亲水表面活性剂；
(4)矿物油；
(5)非-离子亲脂性表面活性剂；
(6)具有低HLB值(约9～约13的HLB值)的非-离子亲水表面活性剂。
在再一实施方式中，本发明提供包含含有适合于在受疫苗接种者中引发免疫学应答的至少一种免疫原的新乳剂的疫苗组合物。本发明还提供乳剂作为用于增加由免疫原诱导的免疫应答，尤其是，用于增加细胞应答，体液应答或优选二者的佐剂的组合物。
在另一实施方式中，本发明提供制造疫苗组合物的方法，其中将免疫原，尤其干形式的免疫原，其可例如，通过冷冻干燥或通过玻璃化获得，或在水溶液中的免疫原，尤其其中所述干形式或所述水溶液额外地包含离子表面活性剂，例如皂苷，及任选地额外地包含氢氧化铝，与本发明的佐剂混合。免疫原可选自：灭活的病原体，减毒的病原体，亚-单元抗原，纯化的抗原，未纯化的抗原或使用细菌，酵母，植物，昆虫或动物细胞，包括质粒的表达载体，等重组产生的抗原。抗原可通过本领域中熟知的手段纯化，包括但不限于超滤，超速离心，大小排阻凝胶-过滤，离子-交换层析，及PEG-纯化。病原体可源于细菌，病毒，原生动物或真菌，或免疫原可构成抗毒素。
在另一实施方式中，本发明提供在受疫苗接种者中诱导针对病原体的免疫应答的方法，包括给受疫苗接种者施用本发明的疫苗组合物。
在另一实施方式中，本发明提供包含含有纯化的本发明的免疫原和乳剂的单个瓶的试剂盒。在一该实施方式中，单个瓶之内含有的免疫原包含纯化的FMD病毒抗原。
在另一实施方式中，本发明提供包含至少2个瓶的试剂盒，在第1瓶中，免疫原，尤其干形式或在水性介质中的溶液中的免疫原，尤其其中所述干形式或所述水溶液额外地包含离子表面活性剂，有利地皂苷和任选地额外地包含氢氧化铝，且在第2瓶中是本发明的佐剂或乳剂。包含至少2个瓶的试剂盒的使用在离散组分的组合(即至少2个瓶的内容物混合到单个瓶中)会导致减小的稳定性的疫苗制剂的情况中特别有效。
需知，在本公开和特别在权利要求中，术语诸如“包含(comprises)”，“包含(comprised)”，“包含(comprising)”等可具有美国专利法中该术语的含义；例如，它们可表示“包括(includes)”，“包括(included)”，“包括(including)”，等；且术语诸如“基本上由...组成(consisting essentially of)”和“基本上由...组成(consists essentiallyof)”具有美国专利法中规定的含义，例如，它们允许未明确地叙述的要素，但排除见于现有技术或影响本发明的基本或新特征的要素。
这些和其他实施方式被下列详述公开或通过下列详述显而易见及被下列详述包括。
【附图说明】
本发明的全部及可能公开，包括其对本领域普通技术人员的最佳模式，更特别在以下说明书，包括参照附图说明，其中：
图1提供在第7，22，121和330天(1年稳定性研究)，对试验1&2的疫苗制剂的转相温度(PIT)确定(通过导电率测量的)的图。PIT确定是疫苗制剂稳定性的一个量度。
图2提供在产生后多天(1年稳定性研究)对试验3&4的疫苗制剂的PIT确定的图；
图3提供在产生后多天(1年稳定性研究)对试验5&6的疫苗制剂的PIT确定的图；
图4提供在产生后多天(1年稳定性研究)对试验7&8的疫苗制剂的PIT确定的图；
图5提供在产生后多天(1年稳定性研究)对试验9的疫苗制剂的PIT确定的图；
图6提供对根据本发明产生，及存储36个月的疫苗制剂(试验1～9)的PIT确定的图；
图7提供显示根据在实施例6中公开的材料和方法处理的猪的直肠温度的时间-依赖性变化的图；
图8提供显示对根据在实施例6中公开的材料和方法处理的猪观察的最大温度变化的图；
图9提供显示根据在实施例7中公开的材料和方法处理的猪的疫苗效力(PD50)对比净荷(μg)的图。
【发明详述】
本发明的其他目的，特征和方面公开于下列详述，或自下列详述显而易见。本领域普通技术人员明白，本文仅描述例示实施方式，且不旨在限制本发明的更广方面，该更广方面在例示实施方式中具体化。实际上，本领域技术人员明白，可在本发明中进行各种修饰和变异而不离开本发明的范围或精神。例如，作为一实施方式的部分例证的或描述的特征可用于另一实施方式中，以产生再进一步实施方式。期望本发明含盖该修饰和变异在随附的权利要求和它们的相当体的范围之内。将贯穿本申请引用的全部参考文献，出版的专利和专利的内容通过引用整体并入本文。
为了便利，将说明书，实施例和随附的权利要求中采用的特定术语收集于此。
如本文所用，术语“动物”包括全部脊椎动物，包括人。其也包括全部发育阶段，包括胚胎和胚胎阶段的个体动物。尤其是，术语“脊椎动物”包括但不限于人，狗(例如，狗)，猫(例如，猫)；马(例如，马)，牛(例如，牛(cow)，牛(cattle))，猪(例如，猪)，以及禽。如本文所用，术语“牛(cow)”或“牛(cattle)”通常用于指称任何龄的牛来源的动物。可互换的术语包括“牛”，“牛犊”，“食用牛”，“公牛”，“小母牛”，“牛”等。可互换的术语包括“小猪”，“母猪”等。本文所用的术语“禽”指称分类学类ava的任何物种或亚种，诸如但不限于鸡(种鸡，肉鸡和产蛋鸡)，火鸡，鸭，鹅，鹌鹑，雉鸡，鹦鹉，雀，鹰，乌鸦和包括鸵鸟，鸸鹋和鹤鸵的平胸鸟。术语“猪”或“小猪”是指猪来源的动物，而“母猪”指称在育龄和有生殖能力的雌性。
如本文所用，术语“强毒”是指保留其在动物宿主中的感染性的能力的分离物。
如本文所用，术语“灭活的疫苗”是指含有不再能复制或生长的感染性生物或病原体的疫苗组合物。病原体可为细菌，病毒，原生动物或真菌来源。灭活可通过各种方法实现，包括冻融，化学处理(例如，用福尔马林处理)，超声处理，辐射，加热或足以防止生物复制或生长而维持其免疫原性的任何其他常规手段。
如本文所用，术语“免疫原性”是指能在宿主动物中产生针对抗原的免疫应答。此免疫应答形成由针对特定感染性生物的疫苗引发的保护性免疫的基础。
如本文所用，术语“免疫应答”指称在动物中引发的应答。免疫应答可指称细胞免疫(CMI)；体液免疫或可涉及二者。本发明也涵盖限于一部分免疫系统的应答。例如，本发明的疫苗组合物可特别诱导增加的γ干扰素应答。
如本文所用，术语“抗原”或“免疫原”是指在宿主动物中诱导特定免疫应答的物质。抗原可包含全生物，杀死的，减毒的或活的；生物的亚基或部分；含有具有免疫原性性质的插入物的重组载体；呈递到宿主动物后能诱导免疫应答的DNA的碎片或片段；蛋白，多肽，肽，表位，半抗原，或其任何组合。替代性地，免疫原或抗原可包含毒素或抗毒素。
如本文所用，术语“多价”是指含有多于一种无论来自相同的物种(即，FMD病毒血清型的不同分离物)，还是来自不同物种(即，分离自溶血性巴斯德菌(Pasteurellahemotylica)及多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida))的抗原的疫苗，或含有来自不同属的抗原的组合的疫苗(例如，包含来自多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)，沙门氏菌属(Salmonella)，大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，睡眠嗜血杆菌(Haemophilussomnus)及梭菌属(Clostridium)的抗原的疫苗)。
如本文所用，术语“佐剂”是指添加到疫苗而增加疫苗的免疫原性的物质。不完全知道佐剂如何作用的机理。一些佐剂被认为通过缓慢释放抗原来增强免疫应答，而其他佐剂是它们自身就强烈免疫原性，且被认为协同发挥功能。知道的疫苗佐剂包括，但不限于，油和水乳剂(例如，完全弗氏佐剂和不完全的弗氏佐剂)，短小棒杆菌(corynebacteriumparvum)，卡介苗，氢氧化铝，葡聚糖，硫酸葡聚糖，氧化铁，藻酸钠，细菌佐剂，特定合成聚合物诸如聚氨基酸，以及氨基酸的共聚物，皂苷，″REGRESSIN″(Vetrepharm，Athens，Ga.)，″阿夫立定″(N，N-二-十八烷基-N′，N′-双(2-羟乙基)-丙烷二胺)，石蜡油，胞壁酰二肽等。
如本文所用，术语“乳剂”指称至少2种物质的组合，其中第1物质分散到第1物质不溶的第2物质中。本发明的乳剂的一例是分散到水相的油相。
如本文所用，术语“不完全的乳剂”指称必需加入至少一种额外的组分来制造“完全乳剂”的组合物。如本文所用，术语“完全乳剂”可被认为相当于本发明的“即用”免疫学组合物。完全乳剂的一例是根据本发明的方法容易施用于动物的本发明的免疫学组合物。
如本文所用，术语“药学可接受的载体”和“药学可接受的媒质”可互换且指称含有可无不利效果地注入宿主的疫苗抗原的流体媒质。本领域知道的适合的药学可接受的载体包括，但不限于，无菌水，盐水，葡萄糖，右旋糖或缓冲溶液。载体可包括辅助剂包括但不限于稀释剂，稳定剂(即，糖和氨基酸)，防腐剂，润湿剂，乳化剂，pH缓冲剂，粘度增强添加剂，颜料等。
如本文所用，术语“疫苗组合物”包括在宿主中诱导免疫应答中有用的药学可接受的媒质中的至少一种抗原或免疫原。疫苗组合物可以剂量及通过医疗或兽医学领域熟练的技术人员熟知的技术，考虑因素如受者动物的龄，性别，重量，物种和情况，及施用途径来施用。施用途径可为经皮，经粘膜施用(例如，口腔，鼻，肛门，阴道)或经肠胃外途径(真皮内，肌内，皮下，静脉内或腹膜内)。疫苗组合物可单独施用，或可与其他治疗或治疗共施用或依次施用。施用形式可包括悬浮液，糖浆或酏剂，及肠胃外，皮下，真皮内，肌内或静脉内施用制剂(例如，可注射的施用)诸如无菌悬浮液或乳剂。疫苗组合物可作为喷雾剂施用或混合进食品和/或水或递送到与适合的载体，稀释剂或赋形剂诸如无菌水，生理学盐水，葡萄糖，等的混合物中。组合物可含有辅助物质诸如润湿或乳化剂，pH缓冲剂，佐剂，胶凝或粘度增强添加剂，防腐剂，调味剂，颜料，等，依赖于施用途径和期望的制剂。可谘询标准物药学教科书，诸如“Remington′s Pharmaceutical Sciences”，1990来制备适合的制剂，无需过度实验。
本文所用的术语“纯化的”不需要绝对纯度；其旨在表示相对术语。由此，例如，纯化的免疫原制剂，诸如蛋白或灭活的病毒，是免疫原相比天然的环境中的免疫原更富集的免疫原制剂。免疫原制剂在本文广泛地指称为“纯化的”使得免疫原表示制剂总免疫原含量的至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，或至少98％。“粗制剂”，其代表最低程度的纯化，可含有少至小于60％，小于20％，小于10％，小于5％，或小于1％的免疫原性组分。
本文所用的术语“高度纯化的”旨在表示相比术语“中度纯化的”的“更高程度的纯度”。此“更高程度的纯度”可包括，但不以任何方式限于，已“高度纯化的”免疫学制剂对比已“中度纯化的”免疫学制剂中减少的百分率的污染物。如本文所述，“高度纯化的”免疫学制剂会具有最低到不可检测的百分率的污染物，其可导致：减少的期望的免疫应答，增加的不期望的免疫应答(例如超敏反应)，或减少的制剂稳定性。类似地，已“中度纯化的”免疫学制剂对比已“最低限度纯化的”免疫学制剂含有相对减少的百分率的污染物，其如同，对比称之为“粗制剂”的制剂减少了百分率的污染物。
免疫学制剂中的污染物可包括，但不以任何方式限于，负面地贡献于本发明的免疫学组合物的物质。负面地贡献的污染物的几例之一是减少本发明的免疫学组合物在动物中引发免疫应答的能力的污染物。
可使用各种方法达到改变水平的纯度(例如“高度纯化的”，“中度纯化的”等)。例如，层析和大小排阻凝胶过滤的组合可导致“高度纯化的”或″中度纯化的″免疫学制剂。免疫原的源/类型差异，以及纯化过程的轻微变化可显著影响免疫原纯度的最终程度。一般而言，如本文所用，具有最低到最高百分率的污染物的免疫学制剂会分别描述为(1)“高度纯化的，(2)“中度纯化的”，(3)“最低限度纯化的”，(4)“粗制剂”。“高度纯化的”制剂会全部类型的污染物都具有最低水平。“中度纯化的”制剂会具有相对低水平的多数类型的污染物，但可具有相比会在可比较的“高度纯化的”制剂观察的更高丰度的一种类型的污染物。同样，“最低限度纯化的制剂”会具有相对低水平的一些类型的污染物，但可具有相比可比较的“中度纯化的”制剂更高丰度的多于一种类型的污染物。如所预期，“粗制剂”相比本文讨论的其他类型的制剂，全部污染物类型都具有最高水平的污染物。
本发明提供新水包油(O/W)乳剂，其包含：
(1)包含能在宿主中诱导免疫应答的疫苗抗原或免疫原的水溶液；
(2)包含离子表面活性剂的水溶液；
(3)非-离子亲水表面活性剂；
(4)矿物油；
在一实施方式中，新水包油(O/W)乳剂包含：
(1)包含能在宿主中诱导免疫应答的疫苗抗原或免疫原的水溶液；
(2)包含离子表面活性剂诸如皂苷的水溶液；
(3)具有大于13和小于40(HLB＞13，尤其是HLB≥13.5，及优选HLB≥14)的亲水-亲脂性平衡(HLB)值的非-离子亲水表面活性剂；
(4)矿物油；
(5)非-离子亲脂性表面活性剂；以及
(6)具有低HLB值(9和13之间的HLB值)的非-离子亲水表面活性剂。
在另一实施方式中，本发明提供新水包油(O/W)乳剂，其包含：
(1)包含能在宿主中诱导免疫应答的疫苗抗原或免疫原的水溶液；
(2)包含离子表面活性剂诸如皂苷的水溶液
(3)包含氢氧化铝的任选的水溶液
(4)具有大于13和小于40(HLB＞13，尤其是HLB≥13.5，及优选HLB≥14)的亲水-亲脂性平衡(HLB)值的非-离子亲水表面活性剂；
(5)矿物油；
(6)非-离子亲脂性表面活性剂；以及
(7)具有低HLB值(9和13之间的HLB值)的非-离子亲水表面活性剂。
一些根据本发明制备的乳剂基于从4个不同组的表面活性剂的成员之中选择的至少4种表面活性剂的组合，且可能使用属于各组的一种或更多表面活性剂。这些组中的3组包含非-离子表面活性剂，这些组之一包含离子表面活性剂，例如皂苷。
在几个实施方式之一，乳剂(除非另外说明，在本说明书中，这是指包含全部成分的最终乳剂)中离子表面活性剂(2)的浓度是约0.01％～约10％。
在几个实施方式之一，乳剂(除非另外说明，在本说明书中，这是指包含全部成分的最终乳剂)中非-离子亲水表面活性剂(7)的浓度是1％～8％，尤其是1.5％～6％，优选2％～5％，更优选2.5％～4％，以重量比乳剂体积(w/v)的百分率表示。
此组表面活性剂包含具有低HLB值(9和13之间的HLB值)的非-离子亲水表面活性剂。此组包括但不限于乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸单酯(尤其是5个乙氧基)(例如乙氧基化的山梨糖醇酐单油酸酯诸如TWEEN乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸二酯，乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸三酯(尤其是20个乙氧基)(例如乙氧基化的山梨糖醇酐三油酸酯诸如TWEEN)，乙氧基化的山梨糖醇酐三硬脂酸酯诸如TWEEN乙氧基化的脂肪醇(尤其是5～10个乙氧基)(例如BRIJBRIJBRIJ)，乙氧基化的脂肪酸(尤其是5～10个乙氧基)(例如SimulsolMYRJ)，乙氧基化的蓖麻油(尤其是25～35个乙氧基)(例如ARLATONEARLATONE)和其组合。
优选乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸二酯及乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸三酯，以及两种物质的组合。脂肪酸优选选自：油酸，棕榈酸，硬酯酸，异硬脂酸，月桂酸和其组合。优选的乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸三酯包含乙氧基化的山梨糖醇酐三油酸酯，诸如TWEEN或乙氧基化的山梨糖醇酐三硬脂酸酯，诸如TWEEN
在几个实施方式之一，非-离子亲水表面活性剂(4)的浓度通常是0.1％～1.5％，尤其是0.2％～1.4％，优选0.3％～1.3％，更优选0.4％～1.2％，以重量比乳剂体积(w/v)的百分率表示。
此第2组表面活性剂包含具有高亲水-亲脂性平衡(HLB)值(HLB＞13，尤其是HLB≥13.5，及优选HLB≥14)的非-离子亲水表面活性剂。此组包含乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸单酯(尤其是20个乙氧基)(例如乙氧基化的山梨糖醇酐单月桂酸酯，诸如TWEEN乙氧基化的山梨糖醇酐单棕榈酸酯，诸如TWEEN乙氧基化的山梨糖醇酐单硬脂酸酯，诸如TWEEN乙氧基化的山梨糖醇酐单油酸酯，诸如TWEEN乙氧基化的脂肪醇(尤其是15～30个乙氧基)(例如BRIJBRIJBRIJ)，乙氧基化的脂肪酸(尤其是15～30个乙氧基)(例如MYRJMYRJMYRJMYRJ)，非-离子嵌段共聚物(例如聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物(POE-POP)，诸如LUTROLLUTROL)和其组合。
对于非-离子嵌段共聚物，百分率可更低，且尤其是0.1％～0.5％，更特别是0.2％～0.4％(重量比乳剂体积(w/v))。
优选的表面活性剂(4)包含乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸单酯，诸如上述那些。
在几个实施方式之一，非-离子亲脂性表面活性剂(6)的浓度是0.1％～2.5％，尤其是0.2％～2％，优选0.2％～1.5％，更优选0.2％～1.2％，以重量比乳剂体积(w/v)的百分率表示。
此组表面活性剂包含山梨糖醇酐脂肪酸酯(例如山梨糖醇酐单月桂酸酯，如SPAN山梨糖醇酐单棕榈酸酯，诸如SPAN山梨糖醇酐单硬脂酸酯，诸如SPAN山梨糖醇酐三硬脂酸酯，诸如SPAN山梨糖醇酐单油酸酯，如SPAN山梨糖醇酐三油酸酯，如SPAN山梨糖醇酐单异硬脂酸酯，诸如ARLACEL山梨糖醇酐异硬脂酸酯，诸如CRILL)，二缩甘露醇脂肪酸酯(例如MONTANIDE二缩甘露醇单油酸酯(诸如ARLACEL)，二缩甘露醇二油酸酯，二缩甘露醇三油酸酯，二缩甘露醇四油酸酯)，乙氧基化的二缩甘露醇脂肪酸酯(2，3或4个乙氧基)(例如MONTANIDEMONTANIDE乙氧基化的二缩甘露醇单油酸酯，乙氧基化的二缩甘露醇二油酸酯，乙氧基化的二缩甘露醇三油酸酯，乙氧基化的二缩甘露醇四油酸酯)，及其组合。
脂肪酸优选选自：油酸，棕榈酸，硬酯酸，异硬脂酸，月桂酸和其组合。
优选的表面活性剂(6)包含山梨糖醇酐脂肪酸酯，尤其是上述那些，及其组合。
本发明的表面活性剂可具有来自动物或植物来源的脂肪酸。一种来源到另一来源的变化(例如动物TWEEN到植物TWEEN)可用仅乳剂制剂中的微小调节来简单进行。
根据本发明的乳剂可具有总体浓度的表面活性剂，以重量/乳剂体积计，1.2％～10％，尤其是2％～8％，优选3％～7％，更优选4％～6％。
一般而言，根据本发明的乳剂可具有转相温度(PIT)，其为≥33℃，尤其是33℃～65℃，更特别是36℃～60℃，优选37℃～55℃，及更优选38℃～50℃。
PIT是油包水乳剂变化为水包油乳剂或退相(乳剂分层和2相分离)的温度。PIT值可通过各种手段，如例如通过目视现象(例如见实施例2)或通过导电率测量。乳剂放在乳剂PIT以下的温度，例如在水-浴中约25℃。将温度进行性地升高。对比对照乳剂观察乳剂的视觉方面的变化，明显的是，流动性，粘度，2相中的分离，由于油相向表面的迁移的表面方面的变化。观察此视觉方面的变化的温度是乳剂的PIT值。或者，PIT通过由放进乳剂，接近其表面的探针测量的约5～8milliSiemens/cm(mS/cm)的导电率值(水包油乳剂)到约0mS/cm的值(油包水乳剂)的快速转变来测定。观察转变的温度是乳剂的PIT值。本领域普通技术人员无需过度实验就能测定表面活性剂和油的组合，包括它们的相应浓度，以便产生本发明的乳剂，及尤其是具有以上定义的范围之内的PIT值的乳剂。
一般而言，根据本发明的乳剂可含有，以体积/乳剂体积计，3％～55％的油，尤其是5％～50％的油，优选10％～40％的油，及更优选地，20％～40％的油。通过定义，除非另外说明，在本说明书中的值的范围，总是包括范围的限值。
使用的油可为矿物油，包括但不限于石蜡油诸如异石蜡油和/或环烷油，角鲨烷，姥鲛烷，聚异丁烯油，氢化的聚异丁烯油，聚癸烯油，聚异戊烯油，聚异丙烯油等。在本发明中有用的一种有利的矿物油可包括包含线性或分支的具有大于15，优选15～32的碳原子数，且无芳族化合物的碳链的油。该油可为，例如，以名称″MARCOL″或“MARCOL”(产自Esso，法国)或″DRAKEOL″或″DRAKEOL″″DRAKEOL″(产自Penreco，USA)，(产自Sonneborn，USA)，“石蜡油Codex”(产自Aiglon，法国)，BLANDOL(产自Sonneborn，USA)，ONDINA915(产自Shell，UK)销售的那些。
油也可为包含在本文所述的油之中选择，且以任何比例的至少2种油的油混合物。油混合物也可包含至少一种在上述油之中选择的油和至少一种植物油，且此植物油占约0.1％～约33％的油相，优选约10％～约25％v/v。这些植物油是可生物降解且优选在存储温度(约+4℃)是液体或至少使提供在此温度是液体的乳剂成为可能的富含油酸的不饱和的油。例如植物油可为花生油，坚果油，葵花油，红花油，大豆油，橙油等。
在几个实施方式之一，亲水表面活性剂(4)和(7)优选包括具有分子的相同的亲水部分的表面活性剂。例如，使用用于各亲水表面活性剂(4)和(7)的乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸酯。例如如果选择TWEEN为具有低HLB值的非-离子亲水表面活性剂，具有高HLB值的非-离子亲水表面活性剂会有利地具有用乙氧基化的山梨糖醇酐，诸如TWEEN构成的亲水部分。
一般而言，本发明考虑使用水溶液，其包含适合的兽医学或药学可接受的媒质，赋形剂或稀释剂，其包括但不限于无菌水，生理学盐水，葡萄糖，缓冲剂等。媒质，赋形剂或稀释剂也可包括多元醇，糖族或pH缓冲剂。媒质，赋形剂或稀释剂也可，例如，包含氨基酸，肽，抗氧化剂，杀菌剂和抑菌剂化合物。以获得本发明的乳剂的100％的体积的量将水溶液加入油和表面活性剂。
乳剂的亲水-亲脂性平衡(HLB)允许表面活性剂的亲水或亲脂性力的估计。两性分子的HLB通常如下计算：
HLB可具有0(对于最亲脂性分子)～20(对于最亲水分子)的值。根据表面活性剂的化学组成(显著地例如乙氧基或烯氧化物的添加)，此估计可变化，且HLB值域可增加(例如，具有29的HLB的LUTROL)。随着表面活性剂的混合，混合物的HLB是各表面活性剂的HLB的累加，被其重量比平衡：
在根据本发明制备的乳剂的一实施方式中，乳剂的最终HLB是约9～约12，优选约9.5～约11.5和更优选约10～约11.5。
本发明涵盖乳剂，其包含：石蜡油(尤其是以约10％～约40％和优选约20％～约40％的浓度，以体积/乳剂体积(v/v)表示)；山梨糖醇酐脂肪酸单酯(作为非-离子亲脂性表面活性剂)，乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸三酯(作为具有低HLB值的非-离子亲水表面活性剂)；及乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸单酯(作为具有高HLB值的非-离子亲水表面活性剂)。尤其是山梨糖醇酐脂肪酸单酯是山梨糖醇酐单油酸酯(尤其是以0.2％～1.5％，优选0.2％～1.2％的浓度，以重量/乳剂体积(w/v)表示)，乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸三酯是乙氧基化的山梨糖醇酐三油酸酯(尤其是以2％～5％，优选2.5％～4％w/v的浓度)及乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸单酯是乙氧基化的山梨糖醇酐单油酸酯(尤其是以0.3％～1.3％，优选0.4％～1.2％w/v的浓度)。例如，乳剂包含：约29.3％以体积/乳剂体积计的石蜡油，0.6重量％/乳剂体积的山梨糖醇酐单油酸酯，3.4重量％/乳剂体积的乙氧基化的山梨糖醇酐三油酸酯，及0.75重量％/乳剂体积的乙氧基化的山梨糖醇酐单油酸酯。
在本发明的第2实施方式中，乳剂包含石蜡油(尤其是以10％～40％，优选20％～40％v/v的浓度)，山梨糖醇酐脂肪酸单酯(作为非-离子亲脂性表面活性剂)，乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸三酯(作为具有低HLB值的非-离子亲水表面活性剂)，及非-离子嵌段共聚物(作为具有高HLB值的非-离子亲水表面活性剂)。尤其是山梨糖醇酐脂肪酸单酯是山梨糖醇酐单油酸酯(尤其是以0.2％～1.5％，优选0.2％～1.2％w/v的浓度)，乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸三酯是乙氧基化的山梨糖醇酐三油酸酯(尤其是以2％～5％，优选2.5％～4％w/v的浓度)，非-离子嵌段共聚物是聚氧乙烯/聚氧丙烯聚合物(POE-POP)(尤其是以0.1％～0.5％，优选0.2％～0.4％w/v的浓度)。例如乳剂包含：约29.3％v/v的石蜡油，0.6％w/v的山梨糖醇酐单油酸酯，3.4％w/v的乙氧基化的山梨糖醇酐三油酸酯，及0.25％w/v的乙氧基化的山梨糖醇酐单油酸酯。
在特定实施方式中，本发明涵盖可注射的水包油(O/W)乳剂，其包含：
(1)包含活性成分诸如药物或免疫原，优选免疫原的水溶液；
(2)包含皂苷的水溶液
(3)矿物油；
(4)非-离子亲脂性表面活性剂；以及
(5)包含乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸二酯的具有低HLB值的非-离子亲水表面活性剂(其可具有11和13之间的HLB值)。
在另一特定实施方式中，本发明涵盖可注射的水包油(O/W)乳剂，其包含：
(1)包含活性成分诸如药物或免疫原，优选免疫原的水溶液；
(2)包含皂苷的水溶液
(3)包含氢氧化铝的水溶液
(4)矿物油；
(5)非-离子亲脂性表面活性剂；以及
(6)包含乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸二酯的具有低HLB值的非-离子亲水表面活性剂(其可具有11和13之间的HLB值)。
根据此实施方式的乳剂包含可含有达20个乙氧基的乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸二酯。脂肪酸可来自动物或植物来源，且可选自：油酸，棕榈酸，硬酯酸，异硬脂酸，月桂酸和其组合。在一实施方式中，乙氧基化的脂肪酸优选为油酸。其他成分，以及乳剂的一般性质，诸如PIT，可相比上述那些具有相同的特征。
优选地，表面活性剂(6)包含乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸二酯，诸如乙氧基化的山梨糖醇酐二油酸酯，乙氧基化的山梨糖醇酐二硬脂酸酯或乙氧基化的山梨糖醇酐二异硬脂酸酯，乙氧基化的山梨糖醇酐二棕榈酸酯，乙氧基化的山梨糖醇酐二月桂酸酯，及其组合。
可将任选地其他化合物作为辅佐剂添加到乳剂，包括但不限于矾；CpG寡核苷酸(ODN)，尤其是ODN 2006，2007，2059或2135(Pontarollo R.A.et al.，Vet.Immunol.Immunopath，2002，84：43-59；Wernette C.M.et al.，Vet.Immunol.Immunopath，2002，84：223-236；Mutwiri G.et al.，Vet.Immunol.Immunopath，2003，91：89-103)；多聚A-多聚U(“Vaccine Design TheSubunit and Adjuvant Approach”，edited by Michael F.Powell and Mark J.Newman，Pharmaceutical Biotechnology，6：03)；二甲基二-十八烷基铵溴化物(DDA)(“VaccineDesign：The Subunit and Adjuvant Approach”，edited by Michael F.Powell and MarkJ.Newman，Pharmaceutical Biotechnology，volume6：157)，N，N-二-十八烷基-N’，N’-双(2-羟乙基)丙烷二胺(诸如阿夫立定)(Ibid，p.148)，卡波姆，壳聚糖(例如见美国专利系列No.5,980.912)。
本发明也提供制造包含至少一种抗原或免疫原组合物和根据本发明制备的佐剂或乳剂的疫苗组合物或免疫学组合物的方法。抗原或免疫原组合物可在乳剂形成期间合并，或在替代实施方式中，可将抗原或免疫原组合物，其优选额外地包含皂苷和任选地额外地包含氢氧化铝，在之后，例如，恰在使用之前加入乳剂。
使用的水溶液的整个量可存在于首先产生的乳剂中。或者，其可为仅一部分此水溶液用于形成乳剂，及余下量的水溶液在并合免疫原之后添加。免疫原或抗原可为干形式或以一些其他适当的固体形式存在，然后与乳剂混合或，交替，抗原可为溶液，尤其是以水溶液存在，且将此溶液与乳剂混合。
优选将表面活性剂根据它们的溶解度添加到油或水溶液。例如，将非-离子亲脂性表面活性剂加入根据本发明的油，而将具有高HLB值的非-离子亲水表面活性剂加入水溶液。
可根据本领域普通技术人员知道的常规方法制备乳化。例如，在本发明的一实施方式中，可在乳剂PIT以下的温度，尤其是于室温，例如于约25℃制备乳剂。将水相和油相通过机械搅拌，例如用装备能创建高剪力的转子-定子的涡轮混合在一起。优选以低旋转速度开始搅拌，并随着通常渐进地将水溶液添加进油而缓慢增加。优选将水溶液渐进地添加到油。可调整油/水溶液的比，以获得油包水(W/O)乳剂，例如，以约40％～约55％浓度的油(v/v)。当搅拌停止时，乳剂渐进地变化为O/W乳剂(转相)。转相之后，且如果需要，将乳剂通过添加以获得期望的浓度的油的水溶液来稀释为最终乳剂。可于约5℃存储乳剂。
在另一实施方式中，可于高于乳剂PIT的温度制备乳剂。在第1步骤中，将水相和油相于高于乳剂PIT的温度混合在一起。优选将水溶液渐进地添加到油。可调整油/水溶液比，以获得油包水(W/O)乳剂，例如以约40％～约55％浓度的油(v/v)。乳化可通过用低或无剪力，例如用静态混合器或海洋螺旋或用非常低旋转速度的涡轮搅拌来进行。获得的乳剂是油包水(W/O)乳剂。在第2步骤中，将乳剂渐进地冷却到PIT以下。此步骤期间，乳剂变化为O/W乳剂(转相)。转相之后，且如果需要，将乳剂通过添加以获得期望的浓度的油的水溶液来稀释为最终乳剂。可于约5℃存储乳剂。
乳剂中滴的尺寸可约100nm～约500nm。乳剂可，例如，作为佐剂使用，以配制疫苗组合物或药物组合物。也可将乳剂用作溶剂，以溶解干燥的产品，尤其是含有，例如，减毒的微生物或活重组载体的干产品。
在特定实施方式中，用仅一部分水溶液产生预制乳剂。此预制乳剂可通过添加活性成分诸如药物或免疫原，优选免疫原的悬浮液来稀释，以获得最终组合物。或者，预制乳剂可用水溶液稀释，及用于溶解干燥的产品诸如干产品。
适合于在本发明中使用的免疫原或抗原可选自：灭活的病原体，减毒的病原体，免疫原性亚-单元(例如蛋白，多肽，肽，表位，半抗原)或重组表达载体，包括具有免疫原性插入子的质粒。在本发明的一实施方式中，免疫原是灭活的或杀死的微生物。在本发明的另一实施方式中，疫苗组合物包含选自禽病原体的免疫原，所述病原体包括但不限于鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)，感染性支气管炎病毒(IBV)，新城疫病毒(NDV)，蛋产量下降综合征病毒(EDS)，或感染性法氏囊病病毒(IBDV)，禽流感病毒，等，及其组合。
替代性地，疫苗组合物包含选自猫病原体的免疫原，所述病原体诸如但不限于猫疱疹病毒(FHV)，猫杯状病毒(FCV)，猫白血病病毒(FeLV)，猫免疫缺陷病毒(FIV)，狂犬病病毒等，及其组合。
在再一实施方式中，本发明的疫苗组合物包含选自狗病原体的免疫原，所述病原体包括但不限于狂犬病病毒，狗疱疹病毒(CHV)，狗细小病毒(CPV)，狗冠状病毒，犬钩端螺旋体(Leptospira canicola)，黄疸出血型钩端螺旋体(Leptospiraicterohaemorrhagiae)，感冒伤寒型钩端螺旋体(Leptospira grippotyphosa)，博氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)，支气管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)等，及其组合。
在本发明的再一实施方式中，组合物包含选自马病原体的免疫原，所述病原体诸如马疱疹病毒(1型或4型)，马流感病毒，破伤风，西尼罗河病毒，等或其组合。
在本发明的再一实施方式中，组合物包含选自牛病原体的免疫原，所述病原体诸如口蹄疫病毒(FMDV)，狂犬病病毒，牛轮状病毒，3型牛副流感病毒(bPIV-3)，牛冠状病毒，牛病毒腹泻病毒(BVDV)，牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)，感染性牛鼻气管炎病毒(IBR)，大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)，溶血性巴斯德菌(Pasteurella haemolytica)等和其组合。
在本发明的再一实施方式中，组合物包含选自猪病原体的免疫原，所述病原体诸如但不限于猪流感病毒(SIV)，2型猪圆环病毒(PCV-2)，猪生殖呼吸性综合征病毒(PRRS)，假性狂犬病病毒(PRV)，猪细小病毒(PPV)，FMDV，猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae)，红班丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)，多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)，支气管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)，大肠埃希氏菌(Escherichia coli)等，及其组合。
本发明的另一实施方式提供包含药学可接受的媒质中的至少一种免疫原和乳剂的疫苗组合物。包含病毒，细菌，真菌等的免疫原可通过体外培养方法使用适当的培养基或宿主细胞系和本领域普通技术人员熟知的常规方法产生。例如，PRRS可在适当的细胞系，诸如MA-104细胞系中培养(尤其见美国专利系列No.5,587,164；5,866,401；5,840,563；6,251,404)。以类似方式，PCV-2可使用PK-15细胞系培养(见美国专利系列No.6,391,314)；SIV可培养于蛋(美国专利系列No.6.048.537)；及猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae)可培养于适当的培养基(美国专利系列No.5,968,525；US 5.338.543；Ross R.F.等人，Am.J.Vet.Res.，1984，45：1899-1905)。
为了获得灭活的免疫学，或疫苗组合物，病原体优选在收获之后灭活及，任选地，利用化学处理使用，例如，福尔马林或甲醛，β-丙内酯，乙烯亚胺，二元乙烯亚胺(BEI)，和/或物理处理(例如热处理或超声处理)来使经历澄清。本领域技术人员熟知灭活方法。例如，FMD病毒可通过乙烯亚胺(Cunliffe，HR，Applied Microbiology，1973，p.747-750)或通过高压(Ishimaru et al.，Vaccine 22(2004)2334-2339)灭活，PRRS病毒可通过β-丙内酯处理(Plana-Duran等人，Vet.Microbiol.，1997，55：361～370)或通过BEI处理(美国专利系列No.5,587,164)灭活；PCV-2病毒的灭活可使用乙烯亚胺处理或通过β-丙内酯处理来实现(美国专利系列No.6,391,314)；猪流感病毒可使用去污剂如Triton，或用甲醛处理来灭活(美国专利系列No.6,048,537)；猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)细菌可通过甲醛处理(Ross R.F.见上)，通过乙烯亚胺或BEI处理来灭活(见WO 91/18627)。
灭活的病原体可通过常规浓度技术，尤其是通过超滤浓缩，和/或通过常规纯化手段纯化，尤其是使用层析技术包括但不限于凝胶-过滤，在蔗糖梯度上的超速离心，或选择性沉淀，尤其是在聚乙二醇(PEG)的存在下。
在根据本发明的疫苗组合物中有用的免疫原也包括表达载体。该载体包括，但不限于，体内重组表达载体诸如多核苷酸载体或质粒(EP-A2-1001025；Chaudhuri P，Res.Vet.Sci.2001，70：255-6)，病毒载体诸如但不限于腺病毒载体，痘病毒载体诸如鸡痘(美国专利系列No.5,174,993；5,505,941；及5,766,599)或金丝雀痘载体(美国专利系列No.5,756,103)或细菌载体(大肠埃希氏菌(Escherichia coli)或沙门氏菌属(Salmonellasp.))。
本发明也包括多价免疫学组合物或组合疫苗组合物的制剂。例如，根据本发明制备的组合牛细菌苗中有用的抗原包括，但不限于，牛支原体(Mycoplasma bovis)，巴斯德菌属(Pasteurella sp.)，特别多杀巴斯德菌(P.multocida)及溶血性巴斯德菌(P.haemolytica)，嗜血杆菌属(Haemophilus sp.)，特别睡眠嗜血杆菌(H.somnus)，梭菌属(Clostridium sp.)，沙门氏菌属(Salmonella)，棒杆菌属(Corynebacterium)，链球菌属(Streptococcus)，葡萄球菌属(Staphylococcus)，莫拉菌属(Moraxella)，大肠埃希氏菌(E.coli)等。
本发明还提供在宿主，例如，动物中诱导免疫应答的方法，包括给宿主施用本发明的免疫学组合物或疫苗组合物。以此方式引发的免疫应答显著地是抗体和/或细胞免疫应答，及尤其是，γ-干扰素应答。
尤其是，本发明提供针对，或防止或减少通过动物被病原性生物的感染(例如，通过病毒，细菌，真菌或原生动物寄生虫感染)导致的症状免疫的方法。本发明的方法在下列脊椎动物中有用，包括但不限于人，狗(例如，狗)，猫(例如，猫)；马(例如，马)，牛(例如，牛)和猪动物(例如，猪)，以及禽，包括但不限于鸡，火鸡，鸭，鹅，鹌鹑，雉鸡，鹦鹉，雀，鹰，乌鸦和平胸鸟(鸵鸟，鸸鹋，鹤鸵，等)。
在本发明的特定方面，这些方法由在分娩之前通过施用根据本发明制备的疫苗组合物给怀孕的雌性疫苗接种组成。这些方法还包括：通过疫苗接种流程引发的保护性抗体的诱导和这些保护性抗体从免疫接种的怀孕的雌性到它们的后代的转移。该母源抗体的转移随后保护后代免于疾病。
根据本发明制造的疫苗组合物的剂量会依赖于待免疫接种的动物的物种，品种，龄，尺寸，疫苗接种历史，及健康状态。其他因素如抗原浓度，额外的疫苗组分，及施用途径(即，皮下，真皮内，口腔，肌内或静脉内施用)也会影响有效剂量。待施用的疫苗剂量可基于疫苗的抗原浓度，施用途径，及待免疫接种的动物的龄和病情容易测定。各批的抗原可个别校准。或者，无需过度实验，不同剂量的系统免疫原性试验，以及LD50研究和其他筛选过程可用于测定根据本发明的疫苗组合物的有效剂量。从以下显示的实施例，容易得知何近似的剂量及和何近似的体积对于使用本文所述的疫苗组合物适当。关键因素是剂量提供至少部分针对天然的感染的保护性效应，如通过与天然的感染关联的死亡率和病态的减小所证明。适当的体积同样由本领域普通技术人员容易查明。例如，在禽物种中，剂量体积可约0.1ml～约0.5ml及，有利地，约0.3ml～约0.5ml。对于猫，狗和马物种，剂量体积可约0.2ml～约3.0ml，有利地约0.3ml～约2.0ml，及更有利地，约0.5ml～约1.0ml。对于牛和猪物种，剂量体积可约0.2ml～约5.0ml，有利地约0.3ml～约3.0ml，及更有利地0.5ml～约2.0ml。
重复的疫苗接种可优选为周期性时间间隔，以起初增强免疫应答或当自最后剂量起长时间逝去。在本发明的一实施方式中，作为肠胃外注射(即，皮下，真皮内或肌内)施用疫苗组合物。组合物可作为一个剂量施用，或在替代实施方式中，以约2～约6周，优选约2～约5周的间隔提供的约2～约5个剂量的重复的剂量施用。但是，本领域技术人员会真可，剂量数和疫苗接种之间的时间间隔依赖于许多因素，包括但不限于免疫接种的动物龄；动物情况；免疫途径；每剂量可利用的抗原量；等。对于初始疫苗接种，周期通常会相比1周更长，且优选会在约2～约5周之间。对于之前免疫接种的动物，追加疫苗接种，怀孕之前或期间，可以约每年间隔进行。
本发明也涵盖使用无针注射器诸如 或(Bioject，Oregon，USA)施用疫苗组合物。本领域普通技术人员能无需过度实验，关于因素诸如待免疫接种的动物的物种；动物的龄和重量，等需要调整注射器的规格。
在本发明的一实施方式中，方法包括用本发明的乳剂配制的疫苗组合物的单次施用。例如，在一实施方式中，疫苗组合物是灭活的FMD病毒组合物，而替代实施方式提供包含灭活的PCV2病毒组合物的疫苗。其他免疫学组合物或疫苗适合于在单剂量方案中使用，包括但不限于灭活的猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)，PRRS和SIV。
本发明还涉及治疗宿主，例如，动物的方法，包括给宿主施用根据本发明制备及包含至少一种选自下列的免疫原的药物组合物：蛋白或肽，灭活的或减毒的病毒，抗体，过敏原，CpG ODN，生长因子，细胞因子或抗生素，及尤其是CpG ODN或细胞因子。这些药物组合物可用于改善动物诸如鸡，猪，牛(cow)或牛(cattle)的生长性。
本发明还涉及试剂盒，起包含含有与根据本发明制备的乳剂组合的成分诸如纯化的免疫原的单个瓶。试剂盒可替代性地包含第1瓶，起含有与皂苷和氢氧化铝组合的成分诸如免疫原或药物组合物，及第2瓶，起含有根据本发明制备的乳剂。免疫原可为本文所述的干形式，干燥的形式或水溶液。
以下通过下列非限制性实施例的方式进一步描述本发明。
【实施例】
【实施例1：乳剂制备方法】
通过转相方法制备乳剂。在第1步骤中，将水相和油相于+40℃混合在一起。在第2步骤中，将乳剂渐进地冷却到+5℃PIT以下，以便获得O/W乳剂。转相之后，将最终乳剂(即疫苗制剂)混合及随后存储于+5℃(总结于表1)。
表1
＊浓度/量范围
○氢氧化铝-约0.0％～约1.0％(w/v)，相对于疫苗制剂体积
○皂苷-约0.1mg～约2mg/mL疫苗制剂
○抗原-约0.1μg～约200μg/mL疫苗制剂
○M102&磷酸盐到体积
将山梨糖醇酐单油酸酯(SPAN)和山梨糖醇酐三油酸酯(20OE)(TWEEN)引入油相。山梨糖醇酐单油酸酯(20OE)(TWEEN)在石蜡油中不混溶。在相同的缓冲剂(例如，磷酸二钠单钾0.02M等渗缓冲剂(pH7.8))中作为疫苗制备TWEEN的20％(w/v)溶液。当搅拌停止时，乳剂变化为水包油乳剂。将乳剂放入5℃的冷室至少4小时。在此阶段，乳剂是含有50％的油相的预制乳剂。
第2步骤：用含免疫原(灭活的FMDV，猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)免疫原，或PCV-2免疫原，以上描述的)，皂苷和氢氧化铝的120ml的磷酸二钠单钾0.02M等渗缓冲剂pH7.8制备水相#2。将在第1步骤中制备的预制乳剂冷却到约5℃，通过添加半体积的水相#2，于相同的温度稀释，及通过旋转磁条1分钟来混合。TSAP乳剂中的最终表面活性剂浓度是4.75％(w/v)。
一般而言，以下列顺序加入本文公开的疫苗制剂的组分：(1)介质102于5℃，(2)皂苷，(3)氧化铝氢氧化物，(4)抗原和(5)不完全的乳剂(即油相加水相#1的组合)。如本文制备，TSAP疫苗于5℃稳定达36个月。
使用相同的制备方法，其他乳剂可如以下预示例中描述获得：
【TSAP-2乳剂】
TSAP-2乳剂是含有33％的油相的O/W乳剂。油相(120ml)含有MARCOL88％v/v，SPAN1.8％w/v和TWEEN10.2％w/v。水相#1(120ml)含有磷酸二钠单钾0.02M等渗缓冲剂(pH7.8)97.75％v/v，及LUTROL0.75％w/v。水相#2(120ml)由磷酸二钠单钾0.02M等渗缓冲剂(pH7.8)，皂苷，氢氧化铝构成，及任选地含有免疫原。TSAP-2乳剂中的最终表面活性剂浓度是约4.25％w/v。
【TSAP-3乳剂】
TSAP-3乳剂是含有50％的油相的O/W乳剂。油相(160ml)含有MARCOL92％v/v，SPAN1.8％w/v和BRIJ6.2％w/v。水相#1(160ml)含有磷酸二钠单钾0.02M等渗缓冲剂(pH7.8)98.5％v/v，及LUTROL0.5％w/v，皂苷，氢氧化铝，及任选地含有免疫原。TSAP-3乳剂中的最终表面活性剂浓度是约4.25％w/v。
【TSAP-4乳剂】
TSAP-4乳剂是含有10％的油相的O/W乳剂。油相(120ml)含有MARCOL60％v/v，SPAN17.2％w/v和ARLATONE22.8％w/v。水相#1(120ml)含有磷酸二钠单钾0.02M等渗缓冲剂(pH7.8)97.5％v/v和TWEEN2.5％w/v。用400ml的磷酸二钠单钾0.02M等渗缓冲剂pH7.8，皂苷，氢氧化铝，及任选地含有免疫原的制备水相#2。将100ml的预制乳剂用400ml的水相#2稀释而获得TSAP-3乳剂。TSAP-4乳剂中的最终表面活性剂浓度是4.25％w/v。
【实施例2：乳剂的转相温度(PIT)的确定】
将10ml的TSAP乳剂放入在约25℃温度的水-浴中的玻璃管。TSAP乳剂是白色均质乳剂。水浴中的温度渐进地增加。视觉观察乳剂中的变化(乳剂由于黄-棕色油相向表面的迁移而成为2个分离的相)。此变化是乳剂分层的特征。观察到此变化的温度是乳剂的PIT值。对于TSAP乳剂，PIT是约36℃～46℃。图1～5提供对根据本发明制备的疫苗制剂的PIT确定图(1年稳定性研究)。图6提供对根据本发明制备及存储36个月的疫苗制剂的PIT确定图(3年稳定性研究)。
【实施例3：研究#1：根据实施例1制备的疫苗制剂的稳定性】
此表显示根据在实施例1中描述的方法制备的疫苗制剂的稳定性(即制剂保持水包油乳剂的以月计算的时间)。制剂包含指示的成分(见制剂1～13)，及用于各这些制剂的抗原包含被认为中度到高度纯化的灭活的FMD病毒分离物。
如表2显示，氢氧化铝的存在提供增加的疫苗稳定性，尤其当使用抗原的最高浓度时(将制剂9，11和13的增强的稳定性与在12个月的制剂3，5和7相对减少的稳定性比较)。平均起来，含有更高抗原的制剂(即制剂9，11和13)中氢氧化铝的存在增加油/水稳定性时间从约3～6个月(即对于制剂3，5和7观察到的油/水稳定性)到约12个月(即对制剂9，11观察到的油/水稳定性)，或甚至到约24个月(即对于制剂13观察到的油/水稳定性)。
表2
| 试验 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 |
| 抗原(μg/剂量) | 0 | 15 | 60 | 15 | 60 | 15 | 60 | 15 | 60 | 15 | 60 | 15 | 60 |
| 皂苷(mg/剂量) | 0 | 0 | 0 | 0.5 | 0.5 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0.5 | 0.5 | 1 | 1 |
| Al(OH)3(％最终) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | .3 | .3 | .3 | .3 | .3 |
| 数剂量 | 75 | 75 | 75 | 75 | 75 | 75 | 75 | 75 | 75 | 75 | 75 | 75 | 75 |
| T0Mos | O/W | O/W | O/W | O/W | O/W | O/W | O/W | O/W | O/W | O/W | O/W | O/W | O/W |
| T3Mos | O/W | O/W | O/W | O/W | O/W | O/W | O/W | O/W | O/W | O/W | O/W | O/W | O/W |
| T6Mos | O/W | O/W | W/O | O/W | W/O | O/W | O/W | O/W | O/W | O/W | O/W | O/W | O/W |
| T9Mos | O/W | O/W | W/O | O/W | W/O | O/W | W/O | O/W | O/W | O/W | O/W | O/W | O/W |
| T12Mos | O/W | O/W | W/O | O/W | W/O | O/W | W/O | O/W | O/W | O/W | O/W | O/W | O/W |
| T24Mos | O/W | O/W | W/O | O/W | W/O | OW/ | W/O | O/W | W/O | O/W | W/O | O/W | O/W |
【实施例4：研究#2：根据实施例1制备的疫苗制剂的稳定性】
如在实施例1中所述及根据表3中显示的组分量制备疫苗制剂。如前所述，组分的添加顺序是：(1)介质102，(2)皂苷，(3)氧化铝氢氧化物，(4)纯化的抗原，及(5)不完全的乳剂(在实施例1中，不完全的乳剂定义为油相加水相#1)。纯化的抗原是FMDV抗原O1Campos，A24Cruzeiro和C3Indaial。使用介质102(M102，以下显示的处方)调整总体积。
表3
表4
| 组分描述 | 1L的M102 | 浓储物溶液 |
| MgCl2 | 95 | 170mM |
| KCl | 190 | 400mM |
| CaCl2 | 238 | 260mM |
| CHCl3 | 5ml | 纯 |
| 丙氨酸 | 276g | - |
| 葡萄糖 | 1880 | 4500mM |
| 碳酸氢钠 | 2180 | 2540mM |
| 胨 | 3000g | - |
| 乳清蛋白水解产物 | 4000g | - |
根据表5测定疫苗稳定性。
表5
＊对于无氧化铝凝胶的疫苗
＊＊在稳定性研究结尾实施的对照
对于各疫苗制剂，如在实施例2中所述测定转相温度(PIT)。以“血红细胞凝集素单位”(UH)/疫苗剂量显示添加的抗原量。表6总结PIT数据及显示，PIT保持基本稳定达36个月。图6提供对试验1～10的疫苗制剂的通过导电率的PIT确定的图(总结于表6)。用皂苷-辅佐的制(即试验3，4，6，7，9和10)剂观察到的PIT的增加独自构成相对于非-皂苷-辅佐的制剂(即试验2，5和8)的稳定性的改善。
表6
乳剂的粒子粒度分布(表7)在36个月时期保持在研究标准设定的范围之内。
表7
【实施例5：在施用多剂量的用TSAP乳剂辅佐的口蹄疫(FMD)病毒疫苗之后的血清学结果-牛研究】
材料和方法：将12～14月龄，未免疫接种及无FMD抗体的90头牛选择，随机化及分配为待免疫接种的9只动物的10个组。将动物用指示的疫苗制剂(9807-9814)在第1天免疫接种。根据实施例1制备表8，9，10和11中列的各制剂，并包含在实施例1中提到的全部组分，如下改变皂苷和氢氧化铝量：皂苷的量为0，0.7，1.3或2.7mg/剂量，且Algel氢氧化铝的量为0％或0.37％。将8组通过肌内途径免疫接种(IM组)，将2组通过皮下途径免疫接种(SC组)。将IM组的各动物用相应疫苗在第56天通过肌内途径及在第84天通过皮下途径再疫苗接种。将SC组的各动物用相应疫苗在第56和84天通过皮下途径再疫苗接种。
表8总结疫苗制剂的稳定性。
表8
通过肌内途径第1疫苗接种之后无任何损伤。通过肌内途径第2疫苗接种之后有一些损伤，但全部这些损伤在通过肌内途径第2疫苗接种之后28天后退去。表9总结疫苗制剂的安全性，如在特定的日期通过动物体重测量显示。
表9
结果：表10总结实验试验期间收集的血清学数据。O1 Campos，A24 Cruzeiro和C3Indaial是FMD病毒的3个独立血清型，且O1，A24和C3抗体的存在是疫苗制剂在受疫苗接种者中引发免疫应答的阳性指示。“G1”表示肌内施用疫苗制剂，“G2”表示皮下施用疫苗制剂。对于本发明，特别对于FMD病毒抗原，有抗体滴度(即O1 Campos，A24Cruzeiro和C3Indaial的血清水平)和相当的群保护(EPP)数之间的强的，直接关联。简言之，当抗体滴度高时，免疫接种动物被相应地高度保护免于病毒感染。
意外地，氢氧化铝的存在相关于依赖于施用途径的免疫应答中的显著差异。当氢氧化铝存在时，如在制剂9812G1和9812G2中，当皮下施用疫苗制剂时，有受疫苗接种者免疫应答的显著增加，如通过抗体滴度测量。对于不含有氢氧化铝，即9811G1和9811G2的对应疫苗制剂，无由于施用途径的功效的类似显著差异。
目前不知道此由于氢氧化铝存在同时皮下施用途径的使用的增强的免疫应答的原因，但本发明的有效实施方式可包括，但不以任何方式限于，依赖于当前和未来功效(例如抗体滴度)数据改变疫苗施用途径。
相比非-皂苷-辅佐的对照疫苗制剂(即9807&9808)，皂苷-辅佐的疫苗制剂在研究动物中引发针对全部3种FMD病毒抗原的更快速免疫应答，如在第21天皂苷-辅佐的制剂的更高平均抗体滴度显示。总之，证据表明，本发明提供改善的稳定性及致使相比非-皂苷辅佐的制剂更快速免疫应答。
表10
G1-疫苗制剂肌内施用
G2-疫苗制剂皮下施用
【实施例6：在施用2剂量的用TSAP乳剂辅佐的口蹄疫(FMD)病毒疫苗之后的血清学结果-猪研究】
材料和方法：将未免疫接种及无FMD抗体的57头猪选择，随机化及分配为待免疫接种的6只动物的9个组及不待免疫接种的3只动物的1个组(非-免疫接种的动物)。将动物用指示的疫苗制剂(A-I)在第1天免疫接种。根据实施例1制备表11中列的各制剂，并包含在实施例1中提到的全部组分，皂苷和氢氧化铝如下改变：皂苷的量是0，0.7，1.3或2.7mg/剂量，Algel氢氧化铝的量是0％或0.37％。通过测量包括直肠温度和动物对疫苗接种的反应的视觉标志的几个参数来评定疫苗制剂安全性。
表11
结果：全部含有抗原的疫苗制剂(表11中描述的制剂B-I)在测试动物中诱导显著大于由无抗原对照(表11中描述的制剂I)诱导的抗体应答的抗体应答。含有皂苷的制剂相比不含有皂苷的制剂诱导相对更大抗体应答。表12总结抗体滴度数据，及重述各制剂的抗原，皂苷和氢氧化铝的量。尤其是，抗体滴度数据表明，相对于不含有皂苷的疫苗制剂，疫苗制剂中存在约0.7mg/剂量和约2.7mg/剂量之间的皂苷增加抗体应答。
表12
【实施例7：猪中3种实验FMD疫苗的保护性剂量50％(PD50)的确定】
概观.研究的目的是测试本发明的3种实验FMD疫苗制剂的在猪中针对FMD强毒攻击的功效。分别用无抗原(A)，及改变剂量的用本发明的佐剂配制的灭活的纯化的FMD O1Manisa抗原(疫苗B，C和D)制备4种疫苗(A，B，C和D)。疫苗提供为填充到25mL的30mL瓶，剂量是2mL/剂量。攻击株是FMD O1 Manisa，4494024D：911，20-07-1994(起已原本分离为O1Manisa Turkey 1/78)，且次级猪肾细胞中的滴度是7.67log10TCID50/mL。用于攻击株的稀释剂是含标准抗生素的Hanks MEM，2％胚胎牛血清(FBS)。
过程.将无FMDV及未之前针对FMD免疫接种的猪用于研究。在实验过程前将10周(加或减1周)龄的各47头猪习服至少24小时。将猪每室圈养2～3只动物，及饲喂标准颗粒饲料及使随意饮水。在第1天(D1)，将猪(无论性别)分配到3只动物的15个组和2只动物的1个组。将各组在一特定室内圈养，及在各室内，将动物用木板(1.5M)个别隔离免于攻击，直到完成研究。
在D0，将动物在左侧耳之后用个体注射器根据表13和14肌内免疫接种。疫苗接种之前，将疫苗瓶轻轻倒置约10次，以确保均质悬浮液。
表13-疫苗组合物
表14-疫苗接种总结
| 组 | 疫苗 | 剂量 | 注射的疫苗体积(mL) | #猪 |
| B1 | B | 剂量 | 2.0 | 3 |
| B2 | B | 1/2剂量 | 1 | 3 |
| B3 | B | 1/4剂量 | 0.5 | 3 |
| B4 | B | 1/8剂量 | 0.25 | 3 |
| B5 | B | 1/16剂量 | 0.13 | 3 |
| C1 | C | 剂量 | 2.0 | 3 |
| C2 | C | 1/2剂量 | 1 | 3 |
| C3 | C | 1/4剂量 | 0.5 | 3 |
| C4 | C | 1/8剂量 | 0.25 | 3 |
| C5 | C | 1/16剂量 | 0.13 | 3 |
| D1 | D | 剂量 | 2.0 | 3 |
| D2 | D | 1/2剂量 | 1 | 3 |
| D3 | D | 1/4剂量 | 0.5 | 3 |
| D4 | D | 1/8剂量 | 0.25 | 3 |
| D5 | D | 1/16剂量 | 0.13 | 3 |
| (对照) | 1 | 2 | 2 |
攻击.在D28，稀释O型FMD病毒以获得100,000TCID50/mL(将病毒浓储物稀释2.67log10，或468倍)。在同日，通过施用STRESSNIL(1mL/20kg)和氯胺酮(2mL/20kg)通过IM途径麻醉全部动物，及用10,000TCID50的病毒在0.1mL下通过真皮内途径攻击到左后足的外爪足跟小球内。从D0到D28每天检查动物的一般健康。注意任何临床观察和治疗。攻击之后，每天观察动物持续7天(D29～D35)。以相同的顺序进行观察，开始于有用最高剂量免疫接种的动物的室到有用最低剂量免疫接种的动物的室，及结束于对照(组A)。每天检查一般健康，特别注意鼻及足上的FMD的迹象。在疫苗接种前(在D1或D0)，攻击之前及在研究结束时D14和D28自各动物收集血。将样品热灭活(56℃持续30分钟)，并通过VN测试在全部血清中测定O型FMDV Ab滴度(MERIAL R&D，Lelystad)。
在D36(观察时期结束)，将动物安乐死(4～6mL/50kg IV T61)和紧密检查FMDV迹象。将用全剂量的疫苗免疫接种的组(组B1，C1或D1)中观察到的任何损伤采样及于-70℃冷冻而用于进一步病毒分型。在鼻，口和/或足(除了接种的足的主爪)上损伤的存在被认为是FMD的证据。由于符合标准，测试被认为有效，这显示两个对照猪必显示FMD临床体征。通过Spearman Karber方法计算各疫苗的PD50。
结果.效力对比净荷显示于图9，并将关联研究数据数值总结于以下表15和16。
表15
表16
| 使用逻辑回归的疫苗效力的计算 | ||||
| 疫苗 | 净荷(μg) | PD50 | IC95- | IC95+ |
| B | 0.4 | 3.594 | 1.6046 | 2.896 |
| C | 2 | 4.5821 | 1.7021 | 2.6979 |
| D | 10 | 11.7 | 9.533 | 51.55 |
Claims (6)
1.疫苗组合物，其包含可注射的水包油乳剂，其中包含：
(i)包含至少一种免疫原的水溶液，所述至少一种免疫原包括口蹄疫病毒；
(ii)包含皂苷的水溶液，其中皂苷的浓度为0.7mg/剂量至2.7mg/剂量；
(iii)包含氢氧化铝的水溶液，其中氢氧化铝的量为0.37％至0.42％(w/v)；
(iv)矿物油，其以20％～40％(v/v)的浓度存在；
(v)非-离子亲脂性表面活性剂，其中所述非-离子亲脂性表面活性剂以重量比乳剂体积(w/v)表示的0.1％～2.5％的浓度存在；
(vi)具有13和40之间的高亲水-亲脂性平衡值的非-离子亲水表面活性剂，所述非-离子亲水表面活性剂选自乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸单酯，乙氧基化的脂肪酸及其组合，其中所述高亲水-亲脂性平衡非-离子亲水表面活性剂以重量比乳剂体积(w/v)表示的0.1～1.5％的浓度存在；以及
(vii)具有9和13之间的低亲水-亲脂性平衡值的非-离子亲水表面活性剂，所述非-离子亲水表面活性剂选自乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸三酯，乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸二酯，乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸单酯，乙氧基化的脂肪酸，乙氧基化的蓖麻油和其组合，其中所述低亲水-亲脂性平衡非-离子亲水表面活性剂以重量比乳剂体积(w/v)表示的1％～8％的浓度存在；
其中表面活性剂的总体浓度以重量比乳剂体积(w/v)表示为4％～8％；
其中乳剂的最终亲水-亲脂性平衡是9～12，且
其中所述油由石蜡油组成；并且
其中乳剂具有33℃～46℃之间的转相温度。
2.权利要求1的组合物，其中低亲水-亲脂性平衡非-离子亲水表面活性剂选自：乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸三酯，且其中所述乙氧基化的脂肪酸酯的酯选自：油酸酯，棕榈酸酯，硬脂酸酯，异硬脂酸酯，月桂酸酯和其组合。
3.权利要求1的组合物，其中非-离子亲脂性表面活性剂选自：山梨糖醇酐脂肪酸酯，且其中脂肪酸酯的酯选自：油酸酯，棕榈酸酯，硬脂酸酯，异硬脂酸酯，月桂酸酯和其组合。
4.权利要求1的组合物，其中高亲水-亲脂性平衡非-离子亲水表面活性剂选自：乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸单酯，且其中乙氧基化的山梨糖醇酐单酯选自：乙氧基化的山梨糖醇酐单月桂酸酯，乙氧基化的山梨糖醇酐单棕榈酸酯，乙氧基化的山梨糖醇酐单硬脂酸酯，乙氧基化的山梨糖醇酐单油酸酯，及其组合。
5.权利要求1-4中任一项的组合物，其中免疫原是灭活的口蹄疫病毒。
6.权利要求1-5中任一项的组合物用于制备药物的用途，所述药物用于在动物中诱导针对病原体的免疫学应答。
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