ES2112274T5 - Vacuna contra la pneumonia en cerdos y metodo para la preparacion de la misma. - Google Patents

Abstract

EN LA INVENCION SE PRESENTAN COMPONENTES Y COMPOSICIONES PARA VACUNAS UTILES PARA VACUNAR A LOS CERDOS CONTRA LA MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE E INFECCIONES PATOGENICAS SECUNDARIAS.

Description

Vacuna contra la pneumonía en cerdos y método para la preparación de la misma.

Campo de la invención

Esta invención hace referencia a las vacunas contra la infección causada por los agentes patógenos del género Mycoplasma y más particularmente, por las bacterias útiles como agentes profilácticos para inhibir la infección causada por la Mycoplasma, en particular la Mycoplasma hyopneumoniae.

Fundamento de la invención

La Mycoplasma hyopneumoniae es un agente patógeno respiratorio ubicuo en el cerdo que causa la neumonía micoplasmal en el mismo (MPS). La MPS tiene lugar en el mundo entero y se considera como una de las enfermedades más frecuentes y más importantes desde el punto de vista económico, que afecta al cerdo. La transmisión de M. Hyopneumoniae se produce aparentemente a través del contacto directo con secreciones infectadas del tracto respiratorio o bien gotitas de aerosol. Se ha identificado como el patógeno primario en el complejo enzoótico de la neumonía. Se cree que esta enfermedad tiene un coste superior a los 100 millones de dólares anuales, debido principalmente a sus efectos adversos en los animales afectados.

La infección por M. Hyopneumoniae da lugar a una infección crónica que causa una tos seca persistente y un crecimiento mal desarrollado, provocando síntomas claros de enfermedad en la "etapa de crecimiento y en la etapa final", es decir, a las 6 semanas de edad o bien más tarde, en los cerdos. Puede darse una lesión seria del pulmón en el animal infectado, y/o puede aparecer la muerte a los 4 hasta los 6 meses de edad. Puesto que los casos de aparición natural de la MPS son infecciones mixtas en las que intervienen micoplasmas, bacterias, virus y parásitos, la muerte del animal se debe frecuentemente a infecciones bacterianas secundarias, víricas o causadas por otras infecciones patogénicas.

En los veinticinco años desde el descubrimiento del micoplasma como el causante de la neumonía enzoótica en 1965, los investigadores han estudiado una diversidad de medios para controlar y tratar esta enfermedad y desarrollar una vacuna segura y eficaz contra la Mycoplasma hyopneumoniae. La protección contra la infección inducida por los candidatos de la vacuna se mide preferiblemente por, la reducción del número de lóbulos pulmonares con lesiones, la reducción del porcentaje de lóbulos pulmonares con lesiones, la reducción de las cifras medias de lesión pulmonar, la reducción de los valores de la lesión microscópica y la reducción de la gravedad de la infección de la M. Hyopneumoniae de acuerdo con una prueba de anticuerpos fluorescentes.

Varias vacunas experimentales han dado lugar a unos resultados que no llegan a ser óptimos. Los estudios han demostrado que se desarrollaba una fuerte inmunidad durante el transcurso de la MPS inducida experimentalmente. Sin embargo, si se administra el tejido pulmonar neumónico como un antígeno, los animales son incluso más susceptibles al estímulo. Los cultivos formalinizados de M. Hyopneumoniae han demostrado ser no protectores. [Ver, también p.ej. C.A. Brandly y cols, eds., "Avances en la Ciencia Veterinaria y Medicina Comparativa", vol. 17, Academic Press, NY (1973) y referencias citadas allí, R.F.W. Goodwin y cols. A. Hyg. Camb., 67:465 (1969)]. Los extractos de M. Hyopneumoniae en éter o dodecilsulfato sódico (SDS), y un producto repetido de congelación y deshielo han demostrado dar una protección significativa contra el estímulo del homogenado pulmonar [K.M. Lam y cols, Am. J. Vet. Res., 32:1737 (1971)].

G. Christianson y cols. (Chemical Abstracts, 1980, Abstract Number 199756) revelan que la etilenimina binaria no era suficientemente satisfactoria para inactivar los contaminantes del micoplasma en suero. La FR-A 2.073.358 informa sobre las vacunas multivalentes y sus métodos de preparación. En particular, el tipo inicial que incluye la FR-A-2.073.358 y el Chemical Abstracts, 1980, Abstract Number 19975p no habla sobre un componente de la vacuna que comprenda la M. Hyopneumoniae inactivada con etilenimina binaria a un nivel de dosificación de al menos 5 x 10^{8} CCU, siendo dicho componente capaz de inducir una respuesta inmunológica en el cerdo vacunado contra la M. Hyopneumoniae.

Las células sonicadas de M. Hyopneumoniae en Tween 80 y aceite de parafina daban lugar a unos buenos títulos de hemaglutinación indirecta (IHA) en la sangre, colostro y leche cuando se inyectaban en la glándula mamaria (S. Durisic et al, Acta Vet. (Beograd), 25(4): 189-194 (1975)). Las preparaciones de célula entera y los sobrenadantes sin células han demostrado tener únicamente un carácter parcialmente protector [R.F. Ross y cols., Am J. Vet. Res., 45(10): 1899 (1984)]. Las membranas del plasma de células descompuestas sónicamente, reforzadas con Al_{2}(OH)_{3} o agarosa, daban una buena protección pasiva [M. Kobisch y cols, Ann. Inst. Pasteur/Immonoi., 138: 693-705 (1987)].

Una cepa avirulenta, viva de LKR de M. Hyopneumoniae también daba una buena protección a los cerdos contra estímulos con una cepa virulenta de M. Hyopneumoniae (L.C. Lloyd y cols, Abstract 4593 en Bacteriology and Bacterial Diseades, del Australian Vet. J. 66 (1): 9-12 (1989)).

La infección por M. Hyopneumoniae actualmente se controla, en parte, con diversas clases de antibióticos, como la tetraciclina, lincomicina y tiamulina. Sin embargo, los antibióticos tienen un valor terapéutico limitado ya que no impiden el que aparezca una infección, y se pueden desarrollar lesiones pulmonares una vez finalizado el tratamiento. La presencia de patógenos secundarios también dificulta la selección de antibióticos apropiados (R. Landon, Topics in Vet. Med., 1 (1): 14-21 (1990)).

Otros métodos actualmente utilizados para reducir el impacto de las enfermedades respiratorias crónicas causadas por la M. Hyopneumoniae, son los sistemas mínimos contra la enfermedad como los sistemas británicos y suecos y la cochinera para cerdas mayores. Se recomienda la minimización del esfuerzo o carga, las condiciones óptimas de tratamiento y todos los sistemas globales internos y externos de producción.

Se necesita pues una vacuna eficaz contra la M. Hyopneumoniae, que proporcionaría protección contra el estímulo de la M. Hyopneumoniae y reduciría también de forma significativa la morbilidad y mortalidad de los patógenos respiratorios secundarios, como la Pasteurella multocida.

Resumen de la invención

En un aspecto, la invención hace referencia a una composición útil para vacunas cerdos contra la Mycoplasma hyopneumoniae. Esta composición comprende organismos inactivados de M. Hyopneumoniae en un medio aceptable desde el punto de vista farmacéutico, estando los organismos presentes en una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmunológica en los cerdos, de protección contra el estímulo de la M. Hyopneumoniae.

En otro aspecto, la presente invención aporta una composición de vacuna que comprende la composición inactivada de la M. Hyopneumoniae ya mencionada, en combinación con otros componentes adicionales de la vacuna, que incluyen uno o más componentes capaces de inducir protección contra la rinitis atrófica que sigue a la infección por P. multocida, y demás agentes infecciosos para el cerdo. Dichas vacunas pueden incluir cantidades inmunogénicas de uno o más de los siguientes componentes de las vacunas: un toxoide de P. multocida libre de células, soluble, estable, una bacterina entera de Pasteurella multocida con toxoide enlazado a la célula, una bacteria de B. Bronchiseptica o bien un extracto de bacteria Erysipelothrix rhusiopathiae, una bacterina Actinobacillus pleuropneumoniae, una bacterina Haemophilus parasuis, y/o componentes víricos de las vacunas, como procedentes de un virus Pseudorabies. Otros componentes convencionales de las vacunas pueden añadirse también a las composiciones de las vacunas de esta invención.

Como otro aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para fabricar los componentes de las vacunas, descritos con anterioridad. El componente de la vacuna M. Hyopneumoniae se prepara siguiendo una serie depasos que incluyen el pre-tratamiento del medio de cultivo con resinas de intercambio iónico, como la resina Amberlites, que aumenta el contenido de oxígeno disuelto del cultivo inoculado entre un 20 y un 40%, e inactiva el cultivo con un agente de inactivación seleccionado.

Otro de los aspectos de esta invención incluye un método para aumentar la resistencia de los cerdos o puercos a la infección causada por M. Hyopneumoniae, que comprende la administración de una cantidad eficaz de las composiciones de las vacunas de la presente invención a los cerdos.

Otro aspecto de esta invención incluye un método para proteger cerdos ante la infección por M. Hyopneumoniae y otras infecciones patogénicas que comprenden la administración secuencial o simultánea a un animal de una cantidad eficaz de la vacuna de M. Hyopneumoniae y una o más vacunas que contengan un antígeno adicional, p. ej., de patógenos como los identificados con anterioridad.

Otros aspectos y ventajas de la presente invención se describen en la siguiente detallada descripción de las estructuras preferidas de la presente invención.

Descripción detallada de la invención

La presente invención aporta los componentes de las vacunas, las formulaciones de las vacunas y los métodos para su preparación y uso en cerdos con una ayuda para prevenir la infección por M. Hyopneumoniae. Los componentes de las vacunas y las vacunas de esta invención proporcionan protección frente al estímulo de la M. Hyopneumoniae con una cepa tipo salvaje así como con otras cepas virulentas conocidas. La propia invención es también capaz de reducir de forma significativa la morbilidad y mortalidad de agentes patógenos respiratorios secundarios, como la Pasteurella multocida.

Las cepas de Micoplasma hyopneumoniae útiles para preparar las vacunas de la presente invención pueden ser aisladas del cerdo infectado con cepas tipo salvaje o bien otras cepas conocidas que causan neumonía micoplasmal en los cerdos. Otras cepas conocidas de M. Hyopneumoniae, tanto virulentas como no virulentas pueden ser útiles en las composiciones de esta invención. Las cepas útiles se pueden obtener de recopilaciones académicas o comerciales, como el American Type Culture Collection en Rockville, Maryland, U.S.A.

Puede prepararse un componente de la vacuna de acuerdo con esta invención mediante la inoculación de un medio capaz de soportar el crecimiento del Micoplasma, en particular del M. Hyopneumoniae, con un almacén de semillas seleccionado de M. Hyopneumoniae. Un medio de cultivo seleccionado puede incluir medios conocidos por aquellos expertos en la tecnología de propagar el micoplasma, como los descritos en Freundt, citado anteriormente y otros anteriores. Una formulación de un medio particularmente deseable para el cultivo de la M. Hyopneumoniae se ha descrito en el ejemplo 1 siguiente e incluye el caldo PPLO, el extracto de levadura, el suero inactivado por el calor, el clorhidrato de cisteina, la dextrosa, un antibiótico para inhibir el crecimiento bacteriano y un agente opcional que indica el crecimiento y evita cambios excesivos de pH, p. ej., el fenol rojo (fenolsulfonftaleína).

Preferiblemente, el medio seleccionado se trata previamente con una resina de intercambio aniónico. Amberlite (forma clorada). Se cree que esta etapa aumenta el crecimiento de los organismos eliminando los agentes inhibidores. Otros métodos convencionales, como la filtración en gel, puede ser también útiles en esta etapa de pretratamiento. Esta etapa de pretratamiento se aplica preferiblemente al caldo de cultivo antes de la adición de otros componentes del medio y previamente a la inoculación. La exposición a la resina de intercambio iónico puede mantenerse entre una hasta cuatro horas a una velocidad de aproximadamente 500 gramos/10 litros de caldo de cultivo.

Una vez pretratado el medio, éste se inocula con una suspensión de la cepa seleccionada de M. Hyopneumoniae, preferiblemente a una inoculación del 5-20%. El cultivo se incuba luego a una temperatura comprendida entre aproximadamente 30ºC y 40ºC. Se prefiere un margen de temperatura entre 35ºC y 38ºC, siendo los 37ºC la temperatura particularmente preferida.

En una relación de la invención particularmente preferida, el contenido de oxígeno disuelto del cultivo se incrementa a un nivel entre 20% y un 40% de saturación. Un contenido de oxígeno preferido del cultivo durante la incubación es el de aproximadamente un 25%. Los cultivos que contienen un contenido de O_{2} disuelto superior al 20%, producen concentraciones superiores en el organismo. El aumento del contenido en oxígeno disuelto se consigue siguiendo un método tradicional, como el de la aireación con aire estéril y agitación. Este paso en especial del cultivo del componente de la vacuna se cree que proporciona elevadas concentraciones de M. Hyopneumoniae.

El pH del cultivo se mantiene neutro a ligeramente alcalino. Se desea que el pH del cultivo se mantenga entre 6,2 y 7,9. Un intervalo de pH más preferible es el de 7,0 \pm 0,5. El pH deseado se puede mantener añadiendo NaOH estéril cuando sea necesario.

Los cultivos se incuban durante 36 a 168 horas. Más preferiblemente, el periodo de incubación se sitúa entre las m 36 y 96 horas, hasta que se consigue un título mínimo de 1 x 10^{8} unidades de cambio de color (CCU) en el medio de valoración líquido (A.W. Rodwell y R.H. Whitcomb (1983) en Methods in Mycoplasmology, Vol. 1, Capítulo 14; Samuel Razin y Joseph G. Tulley, Eds.). Más preferiblemente, el título es de al menos 5 x 10^{8} CCU/ml, y puede ser de hasta 5 x 10^{10} CCU/ml determinado por CCU o por una ELISA.

Al final del periodo de cultivo, los organismos se inactivan mediante la adición de un conocido agente de inactivación. Dicho agente de inactivación preferido es la etilenimina binaria (CEI). Otros agentes de inactivación pueden incluir, por ejemplo, el formaldehído o gluta-raldehido. El agente de inactivación se añade en una cantidad aproximada de 4,0 mM. Una vez añadido el agente de inactivación, se incuba el cultivo de nuevo agitando durante al menos 24 horas.

El agente de inactivación puede ser retirado o neutralizado siguiendo métodos convencionales, y el cultivo puede ser incubado de nuevo durante al menos 24 horas para completar la neutralización del agente de inactivación. Una vez inactivado, puede formularse el componente de la vacuna en una vacuna para su administración a animales.

La presente invención también contempla los componentes de la vacuna para su uso en combinación con el componente de la vacuna M. Hyopneumoniae descrito con anterioridad. Los componentes de la vacuna, que incluyen las bacterinas inactivadas o bien los toxoides purificados, de uno o más patógenos, como la Pasteurella multocida, Streptococcum suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis y ascaris larva, también pueden emplearse junto con los componentes de las vacunas descritos con anterioridad en las vacunas de combinación o en los métodos terapéuticos que implican la co-administración secuencial o simultánea. Dicha vacuna de combinación se prepara mezclando una cantidad inmunogénica de M. Hyopneumoniae inactivada, tal como se ha descrito, y una cantidad inmunogénica de una bacteria o toxoide de otro patógeno con adyuvantes adecuados y vehículos fisiológicos para su inyección en mamíferos. Una terapia de co-administración puede emplear uno o más de los antígenos formulados con anterioridad en vacunas individuales. La vacuna M. Hyopneumoniae y la vacuna seleccionada adicionalmente pueden administrarse a través de las mismas vías de administración usando diferentes lugares para la administración. La administración puede ser secuencial o simultánea.

Las preferencias en cuanto a dichas vacunas de combinación o bien a las terapias de co-administración de las vacunas incluyen cantidades inmunogénicas de uno o más de los siguientes componentes de las vacunas: un toxoide de P. multocida libre de células, soluble, estable, una bacterina entera de Pasteurella multocida con toxoide enlazado a la célula, la célula entera P. multocida, tipo A y tipo D, una bacterina B. Bronchiseptica o bien un extracto de bacterina Erysipelothrix rhusiopathiae.

Las combinaciones adicionales de las vacunas con el componente de M. Hyopneumoniae de esta invención pueden incluir el antígeno Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis, y el virus Pseudorabies. Estos componentes adicionales pueden ser útiles en una formulación de vacuna o en una terapia para cerdos destetados, preferiblemente para una administración tan prematura como la de 3 a 6 semanas de edad.

Basándose en al menos un estímulo, resulta que una co-administración de vacunas con una vacuna que contenga el componente de la vacuna M. Hyopneumoniae y una segunda vacuna que contenga un componente de la vacuna P. multocida al que se hace referencia, evidenciaba que por las respuestas de seroconversión no se determinaban efectos inmunosupresores debidos a la vacuna de M. Hyopneumoniae en los animales.

Las vacunas de la invención se pueden preparar como composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad inmunogénica eficaz del organismo inactivado, como ingredientes activos en un portador aceptable desde el punto de vista farmacéutico, estéril y no tóxico. Dicha vacuna puede comprender el componente inactivado de la vacuna descrito antes mezclado con conservantes opcionales y emulgentes.

De modo alternativo o adicional, la M. Hyopneumoniae inactivada puede ser absorbida o mezclarse con un adyuvante convencional. El adyuvante se utiliza como un irritando no específico para atraer a los leucocitos o incrementar una respuesta inmune. Dichos adyuvantes incluyen, entre otros, el anfigen, el aceite mineral y la lecitina, el hidróxido de aluminio, el dipéptido de muramilo y las saponinas como el Quil A.

Una relación preferida de la vacuna de la invención contiene una suspensión o solución acuosa que contiene la cepa inactivada P-5722-3. de M. Hyopneumoniae, preferiblemente tamponada a pH fisiológico, en una forma lista para su inyección.

Se prefiere que la vacuna de la invención, si se trata de una preparación farmacéutica, esté presente en las formas de dosificación unitarias. Para fines de esta invención, una cantidad inmunogénica deseable de organismo inactivado, si seadministra como el único principio activo se sitúa entre 5 x 10^{8} (CCU) y 5 x 10^{9} (CCU). La vacuna de la invención se administra preferiblemente en dos dosis de 2 ml, conteniendo cada dosis la concentración deseada.

La inmunización primaria de los cerditos debería iniciarse con aproximadamente una semana de edad con una dosis repetida dos semanas más tarde. Para la inmunización primaria del cerdo preñado, se recomiendan dos dosis aproximadamente a las cuatro semanas además de la última dosis administrada dos semanas antes de parir. Se recomienda una dosis repetida antes de cada parto subsiguiente. Se recomienda la vacunación semianual para los cerdos.

Se prefiere que la vacuna de la invención, en caso de una preparación farmacéutica, se encuentre presente en formas de dosificación unitarias. Las formas de dosificación contienen preferiblemente unos 2 ml. Para fines de esta invención, una cantidad inmunogénica de la M. Hyopneumoniae, inactivada se sitúa entre 5 x 10^{8} y 5 x 10^{9} CCU por dosis, si se administra como único principio activo. Es una composición de la vacuna que contiene componentes antigénicos adicionales, puede emplearse la misma cantidad o bien una cantidad reducida de M. Hyopneumoniae.

Otras dosis apropiadas eficaces desde el punto de vista terapéutico pueden ser determinadas fácilmente por aquellos especialistas en la materia basándose en las cantidades inmunogénicas indicadas, teniendo en cuenta el estado y las características fisiológicas del animal. En presencia de agentes activos adicionales, estas dosis unitarias pueden ajustarse fácilmente por los especialistas. Un régimen de dosificación deseable implica la administración de una o dos dosis de la composición de vacuna deseada, donde el contenido antigénico de cada fracción es deseable tal como se ha indicado antes. Naturalmente, si es preciso o deseable, la administración se puede repetir a intervalos apropiados.

El tipo de administración de las vacunas de invención puede ser cualquier vía apropiada que proporcione la vacuna al huésped. Sin embargo, la vacuna se administra preferiblemente a través de una inyección intramuscular. También se pueden emplear otras formas de administración, donde se desee, como la subcutánea, intradermal, intraperitoneal o intranasal.

Los ejemplos siguientes de la invención son solamente ilustrativos y no pretenden ser restrictivos.

Ejemplo 1 Propagación y cultivo de M. Hyopneumoniae

La cepa M. Hyopneumoniae P-5722-3 fue facilitada cortésmente por el Dr. Charles Armstrong, Purdue University, y depositada con la American Type Culture Collection con el nº de admisión 55052. Esta cepa tiene las características inmunoquímicas y bioquímicas de ser manosa positiva, arginina negativa y ureasa negativa. La cepa es positiva para la inhibición del crecimiento con antisuero anti-M. Hyopneumoniae y positiva por el ensayo directo de anticuerpos fluorescentes con anticuerpo conjugado de fluorescencia de antihyopneumoniae. Esta cepa se propagó tal como se ha descrito a continuación.

Se preparó un medio de cultivo de acuerdo con el procedimiento siguiente. Un caldo de PPLO del 83% sin cristal violeta (Difco Laboratories, Detroit, Michigan) se trataba de una resina de intercambio iónico (Amberlite®, Sigma IRA400-forma clorada) de una a cuatro horas, a la velocidad de 500 gramos de resina por cada diez litros de caldo.

El extracto de levadura se preparaba añadiendo quinientos gramos de gránulos de levadura activa a tres litros de agua destilada o desionizada, agitada a temperatura ambiente. Después de una mezcla intensa, la suspensión se agitaba durante unos 15-45 minutos adicionales después de los cuales se añadían 16,2 ml de NaOH 10 N, gota a gota. La mezcla se colocaba luego en un autoclave durante 15-45 minutos a 121ºC. Se decantaba el sobrenadante en un recipiente y se aclaraba en un recipiente y se aclaraba mediante centrifugación o microfiltración. Al sobrenadante aclarado, se añadía HCl 1N a una velocidad de 2 ml por 100 ml de extracto. El extracto se agitaba durante al menos quince minutos a temperatura ambiente y luego se aclaraba tal como se ha descrito antes. El extracto aclarado se esterilizaba en el autoclave tal como se ha descrito antes o bien por microfiltración.

Al caldo de cultivo pretratado se añadían los componentes del medio siguientes: 0,01% de acetato de talio; 0,005% de ampicilina; 0,0125% de clorhidrato de cisteina; 6,25% de extracto de levadura, 1% de dextrosa; 10% de suero bovino (Gibcco) inactivado por el calor; y opcionalmente, un 0,0026% de fenol rojo. El pH del medio de cultivo se ajustaba a pH 7,5 \pm 0,2 y se esterilizaba el filtro.

Para iniciar la producción, la semilla principal congelada de M. hyopneumoniae se descongelaba y se inoculaba una suspensión del 5-20% en 100-3000 ml del medio de cultivo descrito con anterioridad. El cultivo se incubaba a 30ºC hasta 39ºC durante 36 hasta 168 horas. Después de un crecimiento satisfactorio, el cultivo se transfería a un recipiente de inoculación con medio nuevo, usando un inóculo del 5-20%. Este cultivo se incubaba a 37ºC \pm 1ºC de 36 a 96 horas.

Los cultivos de producción de M. hyopneumoniae se colocan en fermentadores, se incuban a 37ºC \pm 1ºC durante 36 a 96 horas después de la inoculación. El contenido en oxígeno disuelto del cultivo se mantiene entre un 20-40% por aireación con aire estéril y agitación. Puede utilizarse antiespuma estéril para controlar la espuma.

Al final del periodo de crecimiento, el pH del cultivo se eleva a 7,6 \pm 0,2 y el pH se mantenía en este intervalo durante una hora. Para inactivar el organismo, se añadía una solución acuosa esterilizada por filtración, de 2-bromoetilaminahidrobromuro (BEA) a una concentración final de aprox. 4,0 mM. La BEA se transforma en el agente de inactivación, etilenimina binaria (BEI) cuando aumenta el pH del cultivo. El cultivo se incuba a 37ºC \pm 1ºC con una agitación constante durante un mínimo de 24 horas.

Después del período de incubación de 24 horas, una solución acuosa, esterilizada por filtración, de tiosulfato sódico, un agente neutralizante estándar, se añadía a una concentración final de aproximadamente 4 mM para neutralizar el exceso de BEI. El cultivo se incubaba durante un periodo adicional de 24 horas a 37ºC \pm 1ºC para completar la inactivación.

Ejemplo 2 Preparación de una vacuna

Después de la inactivación del componente de la vacuna del ejemplo 1, se formulaba una vacuna añadiendo a la M. hyopneumoniae inactivada varios componentes convencionales de las vacunas. Se combinaba una cantidad suficiente de M. hyopneumoniae inactivada con diluyente salino tamponado de fosfato para obtener una concentración de antígeno mínima de 5 x 10^{8} y CCU y una máxima de 5 x 10^{9} CCU de M. hyopneumoniae por una dosis de 2 ml. Se añadían soluciones estériles de mertiolato del 10% y de ácido etilendiamintetracéticol de 10% (EDTA, sal disódica o tetrasódica) como agente conservantes. El aceite mineral estéril (Drakeol) que contiene de 5% a un 40% en peso de licitina (Central Soya) se añadía como un adyuvante. La concentración final comprendida entre un 0,7% y un 3,2% de Tween 80 y un 0,3% hasta un 1,8% de Span se añadía como un emulgente. Para el aceite y los emulgentes se pueden añadir como conservantes adicionales los parabens seleccionados (p-hidroxilbenzoato de metilo, p-hidroxibenzoato de propilo, p-hidroxilbenzoato de butilo).

Ejemplo 3 Experimentos del estímulo de las vacunas

Se realizaban dos experimentos distintos sobre el estímulo de la vacunación para evaluar las capacidades protectoras de una vacuna de M. hyopneumoniae inactivada reforzada por el cerdo.

Se obtenían treinta y tres cerdos cruzados de seis semanas y media de edad, de una piara cerrada, sin enfermedades respiratorias y que correspondía a un grupo de control estimulado no vacunado (grupo 1), dos grupos estimulados vacunados (grupos 2 y 3), y un grupo de control no estimulado ni vacunado (grupo 4).

Los animales del grupo 2 recibían la vacuna descrita en el ejemplo 1 a excepción de que el cultivo de M. hyopneumoniae se inactivaba con un 0,3% de formalina en un lugar de BEI; y los animales del grupo 3 recibían la vacuna descrita en el ejemplo 1, en ambos casos administrada en dosis de 2 ml por vía intramuscular el día "0" y el día "14". Ambas vacunas contenían células enteras inactivadas reforzadas del mismo modo, que diferían únicamente con respecto al agente de inactivación utilizado. Los cerdos del grupo 4 recibían dosis de 6 ml de caldo de micoplasma Friis reforzado de Freund incompleto (placebo) por la misma vía.

La neumonía era inducida por inoculación intratraqueal de los cerdos (Bentley, O.E. y Farrington, D.O. 1980. Am. J. Vet. Res. 41:1870) siete días después de la segunda dosis de la vacuna con una dosis individual de 10 ml de homogenado pulmonar crudo que contenía cepa 232 de M. hyopneumoniae (derivada de la cepa11). Los cerdos del grupo 4 recibían 10 ml de caldo de micoplasma Friis.

La necropsia se realizaba aproximadamente 3 semanas después del estímulo. Los criterios utilizados para la determinación de la eficacia de las vacunas para la profilaxis de la enfermedad por M. hyopneumoniae eran a) gravedad de los signos clínicos; b) lesiones macroscópicas de neumonía; c) lesiones microscópicas típicas de la enfermedad; y d) infección del tejido pulmonar determinada por inmunofluorescencia (Amaneu, W y cols. Proceedings, IPVS Congress, Copenhagen, Denmark. p. 223 (1980).

Tal como se muestra en las tablas 1 y 2 a continuación, los cerdos de los grupos 1 y 2 tendían a tener valores de tos ligeramente superiores que los cerdos de los grupos 3 y 4. Todos los cerdos del grupo 1 (control positivo) y la mayoría de cerdos de los grupos 2 y 3 (vacunados) presentaban lesiones. Ninguno de los cerdos del grupo 4 presentaba lesiones. El número de lóbulos con lesiones era sustancialmente inferior en los cerdos del grupo 3 que en los cerdos de los grupos 1 y 2. Lo más importante, el porcentaje medio de pulmones con neumonía y de lesiones pulmonares era significativamente inferior en el grupo 3 vacunado que en el grupo 1. La gravedad de la neumonía en el grupo 2 no era significativamente distinta de la del grupo 1 (tabla 1).

La mayoría de cerdos de todos los grupos tenían algunas lesiones microscópicas. La gravedad de las lesiones microscópicas era significativamente inferior en los grupos 2, 3 y 4 que en el grupo 1 positivo.

La evaluación de los pulmones mediante inmuno-fluorescencia revelaba que 7 de los 8 cerdos del grupo 1 eran positivos para la enfermedad. Solamente cuatro de los diez cerdos y tres de los nueve cerdos daban Fa positivo en los grupos 2 y 3 vacunados, respectivamente.

Todos los cerdos de los grupos 2 y 3 habían desarrollado un elevado título de fijación del anticuerpo (CF) complementario a la M. hyopneumoniae en el momento de ser estimulados. Con el grupo 2 se observa un desarrollo más rápido del estado positivo del anticuerpo CF que con el grupo 3.

En resumen, la vacuna administrada a los cerdos del grupo 3 aportaba una protección relativamente fuerte contra el estímulo intratraqueal con homogenado pulmonar de M. hyopneumoniae. La protección se evidenciaba por el número reducido de lóbulos con lesiones, el porcentaje reducido de lóbulos con lesiones, el número medio reducido de lesiones pulmonares, la cifra reducida de lesiones microscópicas y el número reducido de cerdos FA positivos.

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TABLA 1

Grupos	1	2	3	4
Nº de cerdos	8	10	9	6
Vacuna	-	XMHP4	XMHP5	Placebo
Tos valor
Medio \pm D.S.	1,11 \pm 0,11	1,13 \pm 0,15	1,05 \pm 0,10	1,01 \pm 0,02
Lesiones graves
Nº de lesiones	8	7	6	0
Nº de lóbulos
positivo	35/56	23/70	12/63	0/42
Porcentaje medio de pulmones	7,93 \pm 4,5	6,80 \pm 7,73	1,9 \pm 3,39	0
con lesiones \pm D.S.
Lesiones microscópicas
Nº con lesiones	8	7	8	4
Cifras promedio	2,81 \pm 0,40	2,0 \pm 0,84	1,72 \pm 0,68	1,29 \pm 0,25
de lesiones \pm D.S.
Inmunofluorescencia
Nº positivo	7	4	3	0
Cifra media	0,63	0,28	0,18	0
Título de anti-cuerpo CF	<4	2521	474	<4
preestímulo

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En el segundo experimento, la eficacia de la vacuna inactivada del ejemplo 1 se confirmaba en los cerditos (convencionales elevados), vacunados a las 1 y 3 semanas de edad. El diseño experimental y los resultados se resumen en la tabla 2.

TABLA 2

	Estudio II Grupos	A	B
	Nº de cerdos	38	29
	Dosis/Vía	2 ml de vacuna IM	2 ml de placebo IM
	Estímulo	Intranasal	Intranasal
	Nº de cerdos	NL1042 25	23
	Estimulados con	ISU232 13	6
	% medio de lesiones	NL1042 4,98	27,91
	Método de Goodwin y Whittlestone	ISU232 1,82	19,24

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Ejemplo 4 Preparando el toxoide Pasteurella Multocida para una vacuna de combinación

Un componente adicional de la vacuna para una vacuna de combinación de esta invención puede incluir el siguiente toxoide P. multocida.

A. Cultivo del P. multocida

El P. multocida tipo D (cepa 8) Dr. Ross Cowart, University of Illinois, Urbana, Illinois), se subcultiva durante un día en un medio sintético definido químicamente modificado. El medio se ha descrito por Herriott y cols, J. Bact., 101:513-516 (1970).

El pH del medio obtenido se ajusta a 7,3 \pm 0,2 con NaOh estéril. Las células de este cultivo se transfieren a un medio sintético nuevo y este cultivo, cuando crece se combina con un crioconservante y se almacena a -70ºC. Los cultivos de producción se incuban a aproximadamente 36 \pm 1ºC entre 3 y 24 horas después de la inoculación. El contenido en oxígeno disuelto del cultivo se mantiene por aeración con aire estéril y por agitación. La solución estéril antiespumante se utiliza para controlar la espuma. El pH del cultivo se mantiene en 7,3 \pm 0,2.

Al final del ciclo de crecimiento, se examinan los cultivos de P. multocida y la densidad de la célula se determina mediante la absorbancia a 650 nm. Luego se reduce la agitación y se suspende el control del pH y la aireación.

B. Tratamiento pre-detoxificación

Después del crecimiento del organismo, se añade mertiolato estéril al cultivo en una cantidad inferior o igual al 0,01% en peso por volumen. Los fluidos del cultivo pueden ser transferidos asépticamente a través de conexiones cerradas a un recipiente cerrado estéril. El envase se conecta a través de unas piezas cerradas a un aparato utilizado para lisiar físicamente a las células y liberar el contenido celular, p. ej., un homogenizador de laboratorio 15 M modelo "GAULIN".

Las células bacterianas en el fluido del cultivo son lisiadas por el paso continuado a través de la cámara de presión del homogenizador. Este somete a las células a una caída de presión inmediata entre 13.790 kPa (2.000 psi) y 34.475 kPa (5.000 psi) a presión ambiental de 103,4 kPa (15 psi). Las células lisiadas son depositadas asépticamente en otro recipiente cerrado.

El producto lisiado se clarifica mediante etapas secuenciales de centrifugación y/o filtración microporosa. Las soluciones clarificadas pueden concentrarse antes o después de la esterilización del filtro. El ácido etilendiamintetracético (EDTA), en una cantidad de hasta una concentración final de 5 mM, y el glicerol, en una cantidad de hasta una concentración final de 1,0% (vol/vol), se añaden antes de la concentración y de la esterilización del filtro, para impedir la agregación de las proteínas concentradas.

C. Detoxificación

La detoxificación se consigue con el proceso siguiente. El NaOH 5 N estéril se añade rápidamente y lentamente a la toxina estéril para aumentar el pH desde su nivel inicial de un pH de aproximadamente 7,0 a un pH de aproximadamente 10,55 \pm 0,10. El pH se mantiene a este nivel durante aproximadamente 7 horas. Después, el pH se ajusta a 7,0 \pm 0,2 mediante una adición lenta y aséptica de HCl 4N estéril. Los fluidos se mantienen a este pH durante 1 hora. La agitación y la temperatura se mantienen a un nivel constante durante el proceso.

Preferiblemente, este proceso de detoxificación se realiza un total de 3 veces en 25 horas o bien hasta que la detoxificación es total. El toxoide se almacena luego a 2ºC hasta 7ºC hasta que se combina con otros componentes y juntos dan lugar a las composiciones de las vacunas.

Se toman partes alícuotas cada vez que el pH es de aproximadamente 7,0, p.ej. en el pH de partida y cuando el pH se ajusta a aproximadamente 7. Se mide la toxicidad residual de cada parte alícuota y se expresa en la DL_{50} del ratón por ml. Una preparación con un valor inicial de casi 2500 DL_{50} por ml se detoxifica generalmente por completo aproximadamente 25 horas después de que el pH se ajuste inicialmente a 10,55, sin un apreciable descenso en el contenido valorable de antígeno.

Ejemplo 5 Preparando un componente de vacuna toxoide-bacterina de P. multocida

Una vacuna de combinación de esta invención puede incluir una bacterina-toxoide de P. multocida en la cual el toxoide ha sido estabilizado dentro de la célula bacteriana.

Un cultivo de P. multocida, tipo D, cepa 4677, se incuba en el medio siguiente: Caldo de soja tríptico sin dextrosa (Difco) 30 g; Extracto de levadura (Difco) 5 g; Dextrosa 4 f; agua desionizada hasta 1 litro; pH de aproximadamente 7; esterilizado mediante autoclave a 121ºC.

El cultivo se airea con agitación para mantener la concentración de oxígeno disuelto a aproximadamente un 35% de saturación. La temperatura se mantiene a 37C y el pH en 7 añadiendo la solución de NaOH 10N necesaria. Hacia el final del crecimiento exponencial, se interrumpe la aireación y el cultivo se inactiva añadiendo solución de formaldehido (USP) hasta una concentración final de 0,5 V/V. Luego el cultivo se mantiene a 37ºC durante cuatro días. Otros agentes de inactivación, como la beta-propiolactona, el glutaraldehido, y la etilenamina binaria pueden utilizarse en lugar del formaldehido.

Se extrae una muestra para comprobar si la inactivación es completa administrando la muestra a cobayos. Los cobayos deberían estar vivos y sanos a los 7 días que siguen a la inyección subcutánea con volúmenes de 4 ml del cultivo. En este momento la toxina del interior de las células se convierte completamente en toxoide, que es seguro, muy estable y capaz de inducir la producción de antitoxinas neutralizantes en la inyección a animales.

Se centrifuga el cultivo inactivado. Las bacterias sedimentadas se dispersan en suficiente fluido sobrenadante para tener una suspensión con una DO (densidad óptica a 625 nm, tal como se determina en un espectrofotómetro Spectronic 20) de 4,2. La suspensión se adsorbe luego con gel de Al (OH)_{3}, 25% v/v, se añade timerosol (0,01% p/v) con un conservante y el pH se ajusta a 6,5 \pm 0,2.

Ejemplo 6 Experimentos de co-administración con dos vacunas

Para determinar si las vacunas de cerdo convencionales que contienen Bordetella bronchiseptica, Erysipelothrix rhusipathiae, y si las vacunas de célula entera de P. multocida, tipo A y D, se verían afectadas adversamente por la vacuna que contiene el componente inactivado de M. hyopneumoniae del ejemplo 1 se realizó un estudio. Ambas vacunas se administraban simultáneamente por la misma vía en zonas distintas.

La vacuna de M. hyopneumoniae a la que se hace referencia, demostraba que no se daban efectos inmunosupresores o bien alguna otra interferencia adversa en la respuesta de los animales a otras vacunas medidas por respuestas de seroconversión.

Alternativamente, la bacterina de M. hyopneumoniae de esta invención puede emplearse en las composiciones de vacunas con otros componentes de vacunas.

Numerosas modificaciones y variaciones de la presente invención se incluyen en la especificación ya identificada y se espera que sean obvias para un experto en la materia. Por ejemplo, el uso de otras cepas de M. hyopneumoniae o bien de cepas para las vacunas de combinación, y de los componentes de vacunas como los coadyuvantes, conservantes y similares, pueden ser seleccionados por un especialista. Se cree que dichas modificaciones y alteraciones en las composiciones y procesos de la presente invención se incluyen en el alcance de las reivindicaciones adjuntas a continuación.

Claims (10)

1. Un método para producir una vacuna capaz de inducir inmunidad frente a la M. hyopneumoniae en un mamífero sin serios efectos secundarios, que comprende combinar una cantidad vacunal de un componente de vacuna a base de M. hyopneumoniae inactiva con etilenimina binaria en una dosis de al menos 5 x 10^{8} CCU, siendo dicho componente capaz de inducir una respuesta inmunológica en el cerdo vacunado contra la M. hyopneumoniae y un adyuvante.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el componente comprende la M. hyopneumoniae inactivada en una concentración de 5 x 10^{8} hasta 5 x 10^{10} de unidades de cambio de color.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde se selecciona dicho adyuvante entre el grupo formado por: lecitina y aceite mineral, saponinas, hidróxido de aluminio.

4. Un método para la preparación de una vacuna para proteger animales mamíferos frente a la M. hyopneumoniae, que implica el tratamiento previo de un medio de cultivo capaz de mantener la M. hyopneumoniae por resina de intercambio iónico, la inoculación de dicho medio con M. hyopneumoniae, el aumento del contenido de oxígeno disuelto de dicho cultivo entre un 20 y un 40% de saturación, el cultivo del M. hyopneumoniae hasta una concentración de 1 x 10^{8} CCU, como mínimo, y la inactivación del cultivo mediante la adición de etilenimina binaria.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, donde dicha concentración se encuentra entre 5 x 10^{8} y 5 x 10^{10} unidades de cambio de color.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 4, donde dicha etapa del cultivo comprende el crecimiento del cultivo de M. hyopneumoniae a una temperatura entre 30º y 40ºC, a un pH neutro a ligeramente alcalino.

7. Un método para producir una composición de vacuna que comprenda la combinación de un componente de vacuna de M. hyopneumoniae inactivado y una cantidad inmunogénica de uno o más antígenos adicionales, donde se seleccionan dichos antígenos adicionales del grupo formado por una bacterina de Pasteurella multocida con un toxoide ligado a la célula, una bacterina de Bortadella bronchiseptica, un extracto de antígeno de Erysipelothrix rhusiopathiae, una célula soluble, libre de toxinas, de Pasteurella multocida tipo D, células enteras inactivadas de P. multocida tipo A o D, cultivos de Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis y virus Pseudorabies.

8. El método de la reivindicación 7 donde dicha composición de vacuna consiste en una M. hyopneumoniae inactivada, Bortedella bronchoseptica inactivada, P. multocida tipo A inactivada, P. multocida inactivada tipo D, célula P. multocida libre de toxinas, y extracto de antígeno de Erysipelothrix rhusiopathiae.

9. El método de la reivindicación 7 donde dicha composición de vacuna consiste en la M. hyopneumoniae inactivada y los componentes de vacuna de Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis y virus Pseudorabies.

10. El método de la reivindicación 7, donde la composición de la vacuna se ha de administrar a un animal de forma secuencial o simultánea.