ES2262147T3 - Una vacuna multicomponente que contiene organismos clostridiales y no clostridiales en una dosis baja. - Google Patents
Una vacuna multicomponente que contiene organismos clostridiales y no clostridiales en una dosis baja.Info
- Publication number
- ES2262147T3 ES2262147T3 ES96104209T ES96104209T ES2262147T3 ES 2262147 T3 ES2262147 T3 ES 2262147T3 ES 96104209 T ES96104209 T ES 96104209T ES 96104209 T ES96104209 T ES 96104209T ES 2262147 T3 ES2262147 T3 ES 2262147T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- clostridial
- protective
- vaccine
- component
- adjuvant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/08—Clostridium, e.g. Clostridium tetani
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/102—Pasteurellales, e.g. Actinobacillus, Pasteurella; Haemophilus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
- A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Una vacuna multicomponente para rumiantes que comprende una combinación segura e inmunogénicamente eficaz de un componente antigénico protector procedente de un organismo clostridial, un componente antigénico protector procedente de un organismo no clostridial y un adyuvante, en la que la vacuna se encuentra en un volumen de dosis baja de 3, 0 ml o menos y en la que el adyuvante se selecciona del grupo compuesto por un polímero, un copolímero de bloque, un aceite en agua, un agua en aceite, Al(OH)3, AlPO3 y extracto de una pared celular bacteriana, un liposoma, Quil A y una combinación de los mismos.
Description
Una vacuna multicomponente que contiene
organismos clotridiales y no clostridiales en una dosis baja.
La presente invención se refiere a vacunas
multicomponente de dosis baja. Más específicamente, la invención se
refiere a vacunas multicomponente de dosis baja para rumiantes, que
comprenden una combinación segura e inmunogénicamente eficaz de al
menos un componente antigénico protector procedente de organismos
clostridiales, al menos un componente antigénico protector
procedente de un organismo no clostridial y un adyuvante
seleccionado del grupo compuesto por un polímero, un copolímero de
bloque, un aceite en agua, un agua en aceite,
Al(OH)_{3}, AlPO_{3} y extracto de una pared
celular bacteriana, un liposoma, Quil A y una combinación de los
mismos, donde la vacuna se encuentra en un volumen de 3,0 ml o
menos.
Históricamente, la preparación y formulación de
vacunas multicomponente se ha complicado con obstáculos físicos y
tecnológicos. Las vacunas multicomponente de interés son las vacunas
que contienen como componentes antigénicos esenciales: uno o más
antígenos protectores de uno o más organismos y un adyuvante. El
componente antigénico protector puede estar en forma de un cultivo
bacteriano entero, un cultivo vírico entero, un toxoide sin células,
un toxoide purificado o una subunidad.
Cuando se combinan cultivos enteros de
organismos (virus o bacterias) en una formulación de vacunas
multicomponente, la formulación contendría numerosos antígenos (de
cientos a miles). Algunos de estos son antígenos protectores como se
ha mencionado antes. Algunos de estos son antígenos son
perjudiciales para la protección de los animales o causan una
reacción en los animales ("antígenos perjudiciales"). Los
antígenos perjudiciales pueden interferir con los antígenos
protectores mediante bloqueo físico o químico de los sitios activos
de los antígenos protectores. La interferencia impide a los
antígenos protectores proteger a los animales. Asimismo, los
antígenos perjudiciales pueden producir respuestas negativas tales
como reacciones locales, reacciones sistémicas, anafilaxia y/o
inmunosupresión en los animales. Por tanto, el uso de combinaciones
de cultivos de organismos enteros puede causar problemas con
eficacia o con la reactividad del animal. La reactividad del animal
produce reacciones localizadas que tienen como resultado
tumefacciones o abscesos en los puntos de la inyección o una
respuesta sistémica tal como anafilaxia que puede producir la muerte
del animal.
Agravar la reactividad del animal es la
administración de vacunas multicomponente a animales grandes (p.
ej., ganado vacuno) a dosis elevadas. Históricamente, el intervalo
de dosis ha sido de aproximadamente 5 ml a 10 ml para permitir la
incorporación de todos los antígenos protectores en una
formulación.
A modo de ilustración, se pueden combinar hasta
siete cultivos o toxoides clostridiales enteros en una dosis de 5,0
ml de vacuna para la administración a ganado vacuno. Véanse, por
ejemplo, las páginas 319, 320, 321, 322 y 432 del Compendio de
Productos Veterinarios, Tercera Edición, 1995-1996).
Asimismo, se han combinado 6 cultivos o toxoides clostridiales
enteros con Hemophilus somnus en vacunas de dosis de 5,0 ml.
Véanse las páginas 191, 192, 319, 433, 490 y 1013 del Compendio de
Productos Veterinarios, Tercera Edición, 1995-1996).
De forma documentada, dichas vacunas demustran reactividad del
animal significativa.
La reactividad del animal que produce reacciones
localizadas (a menudo denominadas lesiones del punto de inyección o
manchas) se ha convertido en tema de preocupación significativa para
la industria cárnica. Desde 1991, muchos artículos científicos y
legos han abordado el problema de las lesiones en el punto de
inyección. Véase Stokka y col., J. Am. Vet. Med. Assoc., 1994, feb.
1, 204 (3): 415-9, Effertz, Beef Today, marzo 1991 y
Beef Today, septiembre de 1992, Dittmer, CALF News Cattle Feeder,
septiembre 1992; Smith, Feedstuffs, 24 de agosto de 1992 y Hrehocik
y col., septiembre de 1992. Durante los últimos años muchos
artículos científicos y legos han comunicado que las lesiones en el
punto de inyección son perjudiciales para la calidad de la carne.
Las lesiones en el punto de inyección deben separarse de la carne y
desecharse. Esto es la causa de significativas pérdidas monetarias
para los distribuidores, los envasadores de carne y los corrales de
alimentación. Se ha estimado que el 12-15% de los
cortes de carne selecta poseen algún tipo de lesión en el punto de
inyección que debe recortarse (Effertz, Beef Today, marzo 1999).
Este artículo atribuye la causa principal de las lesiones en el
punto de inyección a vacunas clostridiales 7valentes. Además, se han
producido informes de que hasta el 90% del ganado vacuno presenta
lesiones en el punto de inyección en sus cadáveres. Las lesiones en
el punto de inyección se han asociado con: (1) la presencia de
muchos antígenos o contaminantes perjudiciales que están presentes
en las vacunas de cultivos enteros, (2) los adyuvantes incorporados
en tales vacunas, (3) el procedimiento de administración de tales
vacunas, (4) el tamaño grande de la dosis de algunas vacunas
multicomponente
(5,0-10,0 ml) y (5) la reactividad del animal de los componentes antigénicos protectores de las vacunas.
(5,0-10,0 ml) y (5) la reactividad del animal de los componentes antigénicos protectores de las vacunas.
Típicamente, las vacunas clostridiales no están
altamente purificadas porque la purificación puede ser muy cara.
Como cabría darse cuenta, la producción de vacunas para animales
debe ser, necesariamente, rentable si las vacunas son para un uso
extendido. Por tanto, las vacunas animales altamente purificadas
tienen un coste prácticamente prohibitivo.
La técnica anterior algo relacionada implica a
dos vacunas que contienen seis cultivos o toxoides clostridiales
enteros administrados en un volumen de dosis de 2,0 ml. Véase el
Compendio de Productos Veterinarios, Tercera Edición,
1995-1996, páginas 133, 1183, 1184 y 1185 y el
manual depublicitario titulado
"ALPHA-7^{TM}-JUST ONCE". Sin
embargo, estas vacunas no incluyen ningún componente adicional tal
como: componente(s) clostridiales adicionales o uno o más
componente(s) no clostridiales.
En documento WO 94/22479 describe formulaciones
de vacunas multicomponente clostridiales usando adyuvantes de
saponina. Las vacunas clostridiales que contienen un adyuvante, en
especial tetramisol/levamisol, también se mencionan en el documento
GB-A 2 050 830. El documento US 3.925.544 describe
vacunas polivalentes eficaces en la inmunización de bovinos que
contienen virus de la rinotraqueítis bovina infecciosa (IBR), virus
de la diarrea vírica bovina (BVD), virus de la parainfluenza 3
(PI-3) y un adyuvante. Se ha sugerido una
dosificación de la vacuna entre 1 y 10 ml.
Normalmente los componentes antigénicos de las
vacunas clostridiales se obtenían mediante concentración de los
cultivos enteros de las bacterias. La concentración se llevaba a
cabo mediante precipitación de los cultivos enteros con sales de
amonio tales como sulfato amónico, o concentración de los cultivos
enteros a través de ultrafiltración. Ambos procedimientos son caros.
Además, estos procedimientos producen cantidades masivas de células
que tienen como resultado una elevada masa antigénica que permanece
como una masa antigénica de sólidos en el producto. Tal masa
antigénica elevada induciría reactividad animal, en particular
lesiones en el punto de inyección.
Existe un problema todavía mayor cuando se
combinan organismos clostridiales con organismos no clostridiales
tales como bacterias gramnegativas, p. ej., H. somnus y M.
bovis y Pasteurella spp. Muchos de estos organismos son,
en sí mismos, altamente reactivos y contienen niveles elevados de
endotoxinas que producen anafilaxia. Asimismo, supuestamente sus
componentes antigénicos causan interferencia. La dosis elevada de la
combinación conocida en la técnica de H. somnus y seis
componentes clostridiales, en concreto un volumen de dosis de 5,0
ml puede ser la fuente de reactividad del animal. En el caso de
formulaciones víricas no clostridiales, la adición de componentes
clostridiales a estas formulaciones puede afectar de forma adversa a
los epítopos virales. En consecuencia, los componentes virales de la
formulación pueden convertirse en ineficaces.
Dada la gravedad de las enfermedades
clostridiales y otros complejos de enfermedades descritos en la
presente memoria descriptiva, cada vez es más importante que los
terneros y el ganado vacuno joven que entren en los corrales de
alimentación así como las vacas gestantes se vacunen de forma
adecuada. Las vacunas deben contener antígenos protectores descritos
en la presente memoria descriptiva. Aunque se podría administrar
cada uno de los antígenos protectores en una vacuna monovalente,
este modo de administración requeriría varias vacunaciones para cada
animal. Esto no es práctico porque: 1) manejar los animales para
repetidas vacunaciones puede tener como resultado un estrés
innecesario y las consiguientes enfermedades; 2) el trabajo para
realizar tales vacunaciones es caro en comparación con el beneficio
obtenido de cada animal; 3) cuantos más puntos de inyección haya en
un animal, mayor es el potencial de que se produzcan reacciones en
el punto de inyección.
Por tanto, existe una clara necesidad de vacunas
multicomponente que contengan muchos antígenos protectores que no
contengan antígenos perjudiciales y que no produzcan reactividad del
animal. Mediante esta invención, se proporcionan vacunas
multicomponente de dosis baja que contienen: componentes antigénicos
protectores de un(os) organismo(s) clostridiales y al
menos un componente antigénico protector no clostridial y un
adyuvante, y los procedimientos para preparar y usar las
vacunas.
Esta invención se refiere a una vacuna
multicomponente para rumiantes que comprende: una combinación segura
e inmunogénicamente eficaz de componentes antigénicos protectores
procedentes de al menos un organismo clostridial, un componente
antigénico protector procedente de un organismo no clostridial y un
adyuvante seleccionado del grupo compuesto por un polímero, un
copolímero de bloque, un aceite en agua, un agua en aceite,
Al(OH)_{3}, AlPO_{3} y extracto de una pared
celular bacteriana, un liposoma, Quil A y una combinación de los
mismos, donde la vacuna se encuentra en un volumen de dosis bajo de
3,0 ml o menos. Por "dosis baja" se quiere decir volúmenes de
dosis, incluido el adyuvante, inferiores a 3,0 ml y que no afectan
de forma adversa a los componentes antigénicos protectores o al
animal tras la vacunación. En general, un antígeno es aquél que
produce una respuesta de anticuerpos contra el antígeno, donde la
respuesta no necesariamente es protectora. Por el término
"antígeno protector" se quiere decir un antígeno que produce
una respuesta inmunitaria y confiere protección al animal. Una
vacuna que contiene tal antígeno protector se caracteriza como
"inmunogénicamente eficaz".
Asimismo, abarcada en la invención existe una
vacuna multicomponente para rumiantes que comprende: una combinación
segura e inmunogénicamente eficaz de un componente antigénico
protector procedente de al menos dos y preferentemente seis a siete
organismos clostridiales; un componente antigénico protector
procedente de un organismo no clostridial y un adyuvante
seleccionado del grupo compuesto por un polímero, un copolímero de
bloque, un aceite en agua, un agua en aceite,
Al(OH)_{3}, AlPO_{3} y extracto de una pared
celular bacteriana, un liposoma, Quil A y una combinación de los
mismos, donde la vacuna se encuentra en un volumen de dosis baja de
3,0 ml o menos.
En la presente forma de realización de la
invención, la vacuna multicomponente comprende una combinación
segura e inmunogénicamente eficaz de un componente antigénico
procedente de uno o más organismos clostridiales; un componente
antigénico procedente de un organismo seleccionado del grupo
compuesto por un organismo gramnegativo, un organismo grampositivo,
un virus, un parásito y una rickettsia y un adyuvante seleccionado
del grupo compuesto por un polímero, un copolímero de bloque, un
aceite en agua, un agua en aceite, Al(OH)_{3},
AlPO_{3} y extracto de una pared celular bacteriana, un liposoma,
Quil A y una combinación de los mismos, donde la vacuna se encuentra
en un tamaño de dosis de 3,0 ml o menos.
En una forma de realización preferida de la
invención, la vacuna multicomponente para rumiantes comprende una
combinación segura e inmunogénicamente eficaz de un componente
antigénico procedente de seis organismos clostridiales, que son
Clostridium chauvoei, Clostridium septicum, Clostridium novyi,
Clostridium perfringens tipo C, Clostridium perfringens
tipo D y Clostridium sordellii, un componente antigénico
procedente de H. somnus o M. bovis y un adyuvante
seleccionado del grupo compuesto por un polímero, un copolímero de
bloque, un aceite en agua, un agua en aceite,
Al(OH)_{3}, AlPO_{3} y extracto de una pared
celular bacteriana, un liposoma, Quil A y una combinación de los
mismos, donde la vacuna se encuentra en un tamaño de dosis de 3,0 ml
o menos.
En otra forma de realización preferida de esta
invención, la vacuna multicomponente para rumiantes comprende: una
combinación segura e inmunogénicamente eficaz de un componente
antigénico protector procedente de siete organismos clostridiales,
que son Cl. chauvoei, Cl septicum, Cl. novyi, Cl. perfringens
tipo C, Cl. perfringens tipo D, Cl. sordellii y Cl.
haemolyticum; un componente antigénico procedente de
Haemophilus somnus o Moraxella bovis y un adyuvante
seleccionado del grupo compuesto por un polímero, un copolímero de
bloque, un aceite en agua, un agua en aceite,
Al(OH)_{3}, AlPO_{3} y extracto de una pared
celular bacteriana, un liposoma, Quil A y una combinación de los
mismos, donde la vacuna se encuentra en un tamaño de dosis de 3,0 ml
o menos.
En otra forma de realización preferida de esta
invención, la vacuna multicomponente para rumiantes comprende: una
combinación segura e inmunogénicamente eficaz de un componente
antigénico procedente de al menos dos organismos clostridiales tales
como Cl. perfringens tipo C y Cl. perfringens tipo D;
un componente antigénico procedente de un virus tal como el virus
de la rinotraqueítis bovina infecciosa (IBRV) y un adyuvante
seleccionado del grupo compuesto por un polímero, un copolímero de
bloque, un aceite en agua, un agua en aceite,
Al(OH)_{3}, AlPO_{3} y extracto de una pared
celular bacteriana, un liposoma, Quil A y una combinación de los
mismos, donde la vacuna se encuentra en un tamaño de dosis de 3,0 ml
o menos.
Una forma de realización particularmente
preferida de esta invención incluye una vacuna multicomponente para
rumiantes que comprende: una combinación segura e inmunogénicamente
eficaz de un componente antigénico protector procedente de más de
dos organismos clostridiales seleccionados del grupo compuesto por
Cl. chauvoei, Cl. septicum, Cl. novyi, Cl. perfringens tipo
C, Cl. perfringens tipo D, Cl. sordellii y Cl.
haemolyticum; componentes antigénicos protectores procedentes de
virus que se seleccionan del grupo constituido por un virus de la
rinotraqueítis bovina infecciosa (IBRV), un virus de la
parainfluenza de tipo 3 (PI_{3}V), un virus de la diarrea vírica
bovina (BVDV) y un virus sincitial respiratorio bovino (BRSV) y un
adyuvante seleccionado del grupo compuesto por un polímero, un
copolímero de bloque, un aceite en agua, un agua en aceite,
Al(OH)_{3}, AlPO_{3} y extracto de una pared
celular bacteriana, un liposoma, Quil A y una combinación de los
mismos, donde la vacuna se encuentra en un tamaño de dosis de 3,0 ml
o menos.
En otra forma de realización particularmente
preferida de la invención, la vacuna multicomponente comprende: una
combinación segura e inmunogénicamente eficaz de un componente
antigénico protector procedente de al menos seis organismos
clostridiales; un componente antigénico protector procedente de una
pluralidad de virus y un adyuvante seleccionado del grupo compuesto
por un polímero, un copolímero de bloque, un aceite en agua, un agua
en aceite, Al(OH)_{3}, AlPO_{3} y extracto de una
pared celular bacteriana, un liposoma, Quil A y una combinación de
los mismos, donde la vacuna se encuentra en un tamaño de dosis de
3,0 ml o menos.
La forma de realización más preferida de la
invención es una vacuna multicomponente que comprende: una
combinación segura e inmunogénicamente eficaz de un componente
antigénico protector procedente de al menos siete organismos
clostridiales; componentes antigénicos protectores procedentes de al
menos cuatro virus y un adyuvante seleccionado del grupo compuesto
por un polímero, un copolímero de bloque, un aceite en agua, un agua
en aceite, Al(OH)_{3}, AlPO_{3} y extracto de una
pared celular bacteriana, un liposoma, Quil A y una combinación de
los mismos, donde la vacuna se encuentra en un tamaño de dosis de
3,0 ml o menos.
Además, la invención abarca un procedimiento
para producir una vacuna multicomponente que comprende: una
combinación segura e inmunogénicamente eficaz de componentes
antigénicos protectores procedentes de organismos clostridiales y un
componente antigénico protector procedentes de un organismo no
clostridial y un adyuvante seleccionado del grupo compuesto por un
polímero, un copolímero de bloque, un aceite en agua, un agua en
aceite, Al(OH)_{3},
AlPO_{3} y extracto de una pared celular bacteriana, un liposoma, Quil A y una combinación de los mismos, donde la vacuna se encuentra en un tamaño de dosis de 3,0 ml o menos, comprendiendo dicho procedimiento: 1) identificar el componente antigénico protector de cada organismo a través de procedimientos in vivo o in vitro; 2) cuantificar los componentes antigénicos protectores usando ensayos de cuantificación de antígeno para proporcionar el componente antigénico protector en una cantidad suficiente para producir una vacuna protectora con la menor masa antigénica; 3) identificar los componentes de los organismos que contienen antígenos perjudiciales usando los ensayos de cuantificación de antígeno y pruebas de reactividad del animal; 4) purificar los componentes antigénicos protectores que contienen antígenos perjudiciales para eliminar los antígenos perjudiciales; 5) seleccionar para cada organismo que requiere inactivación, un agente de inactivación eficaz que mata al organismo sin desnaturalizar el componente antigénico protector; 6) seleccionar un adyuvante eficaz que produce potenciación de la respuesta inmunitaria sin causar reactividad inaceptable del animal para cada componente; 7) adyuvar los componentes antigénicos protectores sensibles a los efectos de los organismos antigénicos perjudiciales de forma individual; 8) mezclar todos los componentes antigénicos protectores.
AlPO_{3} y extracto de una pared celular bacteriana, un liposoma, Quil A y una combinación de los mismos, donde la vacuna se encuentra en un tamaño de dosis de 3,0 ml o menos, comprendiendo dicho procedimiento: 1) identificar el componente antigénico protector de cada organismo a través de procedimientos in vivo o in vitro; 2) cuantificar los componentes antigénicos protectores usando ensayos de cuantificación de antígeno para proporcionar el componente antigénico protector en una cantidad suficiente para producir una vacuna protectora con la menor masa antigénica; 3) identificar los componentes de los organismos que contienen antígenos perjudiciales usando los ensayos de cuantificación de antígeno y pruebas de reactividad del animal; 4) purificar los componentes antigénicos protectores que contienen antígenos perjudiciales para eliminar los antígenos perjudiciales; 5) seleccionar para cada organismo que requiere inactivación, un agente de inactivación eficaz que mata al organismo sin desnaturalizar el componente antigénico protector; 6) seleccionar un adyuvante eficaz que produce potenciación de la respuesta inmunitaria sin causar reactividad inaceptable del animal para cada componente; 7) adyuvar los componentes antigénicos protectores sensibles a los efectos de los organismos antigénicos perjudiciales de forma individual; 8) mezclar todos los componentes antigénicos protectores.
Mediante la presente invención se ha demostrado
que existe una diferencia significativa en el tamaño de las lesiones
en el punto de inyección en ganado vacuno vacunado con: (1) una
dosis de 5,0 ml de producto multicomponente clostridial convencional
y (2) la dosis baja (2,0 ml) de la vacuna multicomponente de esta
invención. El área de la lesión del punto de inyección producida por
la vacuna a dosis baja es significativamente menor, tras la
inyección, que la lesión producida por la vacuna convencional a una
dosis de 5,0 ml. La vacuna multicomponente a dosis baja produjo
lesiones en el punto de inyección en un número insignificante de
ganado vacuno en comparación con la vacuna convencional.
De acuerdo con la invención se ha descubierto
que en la preparación de vacunas multicomponente tales como las que
contienen siete organismos clostridiales se puede: identificar y
reducir la masa antigénica requerida y combinarla con un adyuvante
compatible para producir una vacuna de dosis baja, segura e
inmunolgénicamente eficaz. Este descubrimiento es la base del
concepto de la invención descrito en la presente memoria
descriptiva. De acuerdo con este concepto de la invención, el
experto en la técnica puede combinar: componentes antigénicos
protectores procedentes de los organismos clostridiales y de
organismos no clostridiales y un adyuvante en un volumen de dosis
baja, y administrarla de forma segura a los rumiantes con el fin de
protegerlos contra las enfermedades descritas con más profundidad
más adelante en el presente documento.
Más específicamente, la invención se refiere a
una vacuna multicomponente para rumiantes que comprende una
combinación segura e inmunogénicamente eficaz de: un componente
antigénico procedente de uno o más organismos clostridiales; un
componente antigénico procedente de un organismo no clostridial
seleccionado del grupo compuesto por un organismo gramnegativo, un
organismo grampositivo, un virus, un parásito y una rickettsia y un
adyuvante seleccionado del grupo compuesto por un polímero, un
copolímero de bloque, un aceite en agua, un agua en aceite,
Al(OH)_{3}, AlPO_{3} y extracto de una pared
celular bacteriana, un liposoma, Quil A y una combinación de los
mismos, donde la vacuna se encuentra en un volumen de 3,0 ml o
menos. Ejemplos no limitantes de los organismos clostridiales y
enfermedades en rumiantes son los siguientes:
Clostridium chauvoei causa la enfermedad
carbunco. Este organismo, como todos los organismos clostridiales,
produce esporas que pueden sobrevivir en el suelo durante años y,
durante este tiempo, pueden infectar a los animales susceptibles
(ganado vacuno y ovino) que las ingieran. El carbunco es una
enfermedad aguda, infecciosa pero no contagiosa del ganado vacuno y
ovino que se caracteriza por tumefacción tisular gaseosa,
normalmente en los músculos pesados. El organismo entra en el ganado
vacuno u ovino a través de los alimentos o cortes o mediante
esquileo, cortes de colas o castración. El inicio de la enfermedad
es bastante repentino. La temperatura corporal aumenta con rapidez
y predominan la rigidez muscular, la depresión y la reluctancia a
moverse.
Cuando la infección es extensa, la muerte suele
producirse en 16-72 horas. El tratamiento de los
animales enfermos es fútil ya que a menudo el daño producido a su
carne es permanente.
Clostridium septicum causa la enfermedad
del edema maligno, o gangrena gaseosa, una tumefacción edematosa de
rápida extensión, en los tejidos subcutáneos del ganado vacuno. La
enfermedad se caracteriza por la presencia de gangrena y tumefacción
gaseosa alrededor de una herida. La incidencia de la enfermedad a
menudo sigue a la castración, la descornación, heridas por punción
accidental y laceraciones, abortos y vacunación con agujas que no
están limpias. El periodo de incubación es corto y la muerte se
produce en 12-48 horas. Principalmente, la muerte se
produce por toxinas liberadas por organismos en multiplicación
después de que se produzca la infección. Como ocurre con Cl.
chauvoei, no es práctico tratar a los animales.
Cl. novyi causa el trastorno de la
enfermedad negra o hepatitis necrótica infecciosa, que es una
enfermedad infecciosa aguda del ganado vacuno y ovino. El organismo
formador de esporas causante puede entrar en el ganado vacuno a
través del tracto digestivo, los pulmones o heridas. En zonas donde
las duelas hepáticas son endémicos, Cl. novyi es
especialmente peligroso porque el organismo se multiplicará en zonas
dañadas como resultado de la migración de duelas hepáticas. El
organismo se multiplica con rapidez y produce una exotoxina
altamente letal que causa toxemia y muerte. La muerte suele ser
repentina sin que existan signos bien definidos. Dada la rapidez de
la muerte, el tratamiento no es práctico.
Clostridium sordellii causa una
enfermedad similar a Cl. novyi y Cl. septicum. El
organismo es un habitante del suelo y del intestino animal. La
mayoría de las infecciones producidas por los organismos están
asociadas con heridas o duelas hepáticas. Las lesiones en el punto
de la infección progresan con rapidez, seguidas de fiebre, depresión
y edema similar al producido en las infecciones de Cl. novyi.
En los tejidos enfermos se detecta un olor a rancio. La muerte
también es repentina, lo que indica que el tratamiento no es
práctico.
Los tipos B, C y D de Clostridium
perfringens se encuentran como esporas en el suelo, pero también
son parte de la flora intestinal normal de animales sanos. En
condiciones favorables, tales como cuando los animales están siendo
alimentados con dietas ricas en proteínas en los corrales de
alimentación, los organismos se multiplican con rapidez en el
intestino. Producen toxinas letales que matan a los animales
infectados. El tipo B de Clostridium perfringens causa
muerte repentina en el ganado vacuno y corderos. El tipo C de
Clostridium perfringens produce una enteritis hemorrágica
aguda en terneros, corderos, lechones y ganado vacuno y bovino más
viejo alimentados con dietas ricas en energía. El tipo D de
Clostridium perfringens causa enfermedad de sobrealimentación
en ganado vacuno de corral de alimentación no acostumbrado a
raciones con altas concentraciones de energía. Todos los síndromes
producidos por los diversos tipos de Clostridium perfringens
presentan un inicio rápido y tienen como resultado la muerte antes
de que los animales puedan tratarse de forma eficaz.
Clostridium tetani causa el tétanos, que
puede afectar a todos los mamíferos. La enfermedad es el resultado
de la entrada de organismos en su cuerpo a través de heridas de
punción. A medida que los organismos se multiplican se producen
toxinas que afectan al sistema nervioso central. Los animales
infectados están rígidos, tienen dificultad para deglutir y respirar
y se ven afectados por contracciones espasmódicas de la musculatura.
Aunque el tratamiento con antitoxina es viable, es extremadamente
caro y no rentable.
Como se ha indicado anteriormente, el organismo
no clostridial se puede seleccionar del grupo compuesto por: un
organismo gramnegativo, un organismo grampositivo, un virus, un
parásito y una rickettsia. Lo siguiente es una ilustración no
limitante de los organismos gramnegativos.
Haemophilus somnus (H. somnus) es
un organismo que causa un complejo de trastornos patológicos que se
encuentran principalmente en ganado vacuno de corral de
alimentación. La enfermedad también se encuentra en ganado vacuno
lechero y de pasto. Este organismo puede causar una
meningoencefalitis tromboembólica (TEME), una enfermedad del tracto
respiratorio, enfermedades reproductoras y una septicemia general.
Es una bacteria no móvil con forma de bacilo, que es difícil de
aislar y con mayor probabilidad se disemina mediante secreciones y
exudados respiratorios. Su periodo de incubación es de dos a siete
días. Los animales infectados se pueden tratar con éxito con
antibióticos si se tratan lo suficientemente pronto en el curso de
la enfermedad. Por desgracia, una vez que la infección se convierte
en sistémica, la eficacia del antibiótico disminuye. La vacunación
es el mejor procedimiento para proteger un rebaño de ganado vacuno
de estas enfermedades inducidas por H. somnus. El hecho de
que H. somnus es un organismo gramnegativo y, por tanto,
contiene endotoxina, hace que la formulación de una vacuna no
reactiva sea difícil.
Moraxella bovis (M. bovis) es un
organismo gramnegativo que causa el ojo rosa en ganado vacuno. Esta
enfermedad suele ser crónica en rebaños de ganado vacuno y causa que
el ganado vacuno desarrolle queratoconjuntivitis, con ceguera como
secuela, tras un periodo de tiempo. El tratamiento es caro, ya que
debe continuar durante periodos prolongados de tiempo. M.
bovis posee el potencial de causar anafilaxia y/o reacciones
locales graves.
Campylobacter fetus es un organismo
gramnegativo que causa una enfermedad venérea que se transmite
durante la crianza. Aunque la enfermedad suele ser subclínica, causa
infertilidad temporal, ciclos de estro irregular, retraso de la
concepción y, en ocasiones, abortos en vacas.
Leptospira spp. infecta y se localiza en
los riñones y se elimina por la orina. La infección con
Leptospira spp. puede producir anemia, sangre en orina,
fiebre, pérdida de apetito y postración en terneros. Normalmente, la
infección es subclínica en el ganado vacuno adulto. Sin embargo, las
vacas preñadas infectadas suelen abortar y las vacas lecheras pueden
exhibir una marcada reducción en la producción de leche. Existen al
menos seis serovariedades principales en la especie L.
interrogans (L. pomona, L. canicola, L. grippotyphosa, L.
icterohaemorrhagiae, L. hardjo y L. bratislava).
Pasteurella haemolytica y Pasteurella
multocida son agentes causantes de neumonía bovina en ganado
vacuno de corral de alimentación y terneros jóvenes. Son los
componentes más significativos del complejo de la fiebre del
transporte e inducen neumonía clínica en ganado vacuno que está
predispuesto a infecciones con: rinotraqueítis bovina infecciosa,
virus de la parainfluenza de tipo 3, virus sincitial respiratorio
bovino o virus de la diarrea vírica bovina.
El virus de la rinotraqueítis bovina infecciosa
causa una infección respiratoria grave del ganado vacuno,
específicamente en condiciones de corral de alimentación. La
enfermedad se caracteriza por: temperatura alta, secreción nasal
excesiva, conjuntivitis y secreción ocular, mucosa nasal inflamada,
incremento de la tasa de respiración, tos, pérdida de apetito,
depresión y/o fallo reproductor en el ganado vacuno. La infección
con este virus suele predisponer al ganado vacuno a infecciones
bacterianas que producen la muerte.
El virus de la parainfluenza de tipo 3
(PI_{3}) suele causar una infección localizada del tracto
respiratorio superior, que produce temperaturas elevadas y
secreciones nasal y ocular moderadas. Aunque los signos clínicos del
PI_{3} son normalmente leves, esta infección debilita las defensas
respiratorias y permite la replicación de otros patógenos, en
particular Pasteurella spp.
La diarrea vírica bovina (BVD) es una causa
principal de aborto, resorción fetal o malformación fetal congénita.
Si las vacas susceptibles se infectan con virus de la BVD no
citopático durante el primer trimestre del embarazo, sus terneros
pueden nacer infectados de forma persistente con el virus. La
exposición de dichos terneros a ciertas cepas de virus de BVD
citopáticas virulentas puede desencadenar la enfermedad BVD mucosal.
Los signos clínicos de esta enfermedad incluyen pérdida de apetito,
ulceraciones en la boca, salivación profusa, temperatura elevada,
diarrea, deshidratación y debilidad. Normalmente, la enfermedad
afecta al ganado vacuno de corral de alimentación.
El virus sincitial respiratorio bovino (BRSV)
infecta al ganado vacuno de todas las edades y causas: respiración
rápida, tos, pérdida de apetito, secreción de la nariz y los ojos,
fiebre y tumefacción en la zona cervical. En un brote agudo, la
muerte puede producirse 48 horas después del inicio de los
signos.
Lo siguiente es una ilustración no limitante de
los parásitos que se emplean en la presente memoria descriptiva.
Recientemente se ha aislado Neospora spp.
de fetos abortados. Estos organismos son parásitos que se han
propuesto como causa principal de aborto en vacas preñadas en todo
el mundo. Si se prueba que esto es correcto, en el futuro podría ser
un requerimiento una vacuna para la protección de ganado vacuno
preñado contra Neospora spp. De acuerdo con la invención, los
organismos clostridiales se pueden seleccionar del grupo compuesto
por: Cl. chauvoei, Cl. septicum, Cl. novyi, Cl. perfringens de
tipo C, Cl. perfringens de tipo D, Cl sordellii y Cl.
haemolyticum. Preferentemente, el antígeno protector del
componente clostridial deriva de seis a siete organismos
clostridia-
les.
les.
El componente antigénico protector no
clostridial se puede seleccionar del grupo compuesto por bacterias
gramnegativas, bacterias grampositivas, virus, parásitos, rickettsia
y una combinación de los mismos. Ejemplos no limitantes de los
organismos gramnegativos se pueden seleccionar del grupo compuesto
por: H. somnus, M. bovis, E. coli, Salmonella typhimurium,
Pasteurella hemolytica, Pasteurella multocida, Campylobacter fetus,
Leptospira spp y una combinación de los mismos. En la presente
memoria descriptiva se prefieren H. somnus y M.
bovis.
Ejemplos no limitantes de los organismos
grampositivos son Clostridium tetani, Bacillus anthracis,
Listeria monocytogenes, Actinomyces pyogenes y una combinación
de los mismos.
Ejemplos no limitantes de los virus se pueden
seleccionar del grupo compuesto por: rinotraqueítis bovina
infecciosa (IBRV), virus de la parainfluenza de tipo 3 (PI_{3}V),
virus de la diarrea vírica bovina (BVDV), virus sincitial
respiratorio bovino (BRSV) y una combinación de los mismos.
Ejemplos no limitantes de los parásitos son
Neospora spp., Tritrichimonas foetus, Cryptosporidia spp. y
una combinación de los mismos.
Un ejemplo no limitante de la rickettsia es
Ehrlichia bovis.
De acuerdo con la invención, los componentes
antigénicos protectores clostridiales y no clostridiales pueden
encontrarse en forma de: cultivos enteros vivos modificados o
inactivados, toxoides, toxoides sin células, toxoides purificados,
subunidades o combinaciones de los mismos.
Los adyuvantes útiles en la presente memoria
descriptiva son, por definición, compuestos químicos añadidos a las
vacunas para potenciar la producción de una respuesta inmunitaria
por parte del animal que recibe la vacuna. La mayoría de los
adyuvantes funcionan mediante: (1) la producción de una irritación
en el punto de la inyección que hace que los leucocitos (células
inmunitarias) se infiltren en la zona y/o (2) la producción de un
efecto de liberación prolongada que mantiene el/los antígenos en el
punto de inyección durante todo el tiempo posible. Si la
infiltración de los leucocitos en el punto de inyección es extensa
se producirán tumefacción y lesiones en el punto de inyección. Tales
leucocitos transportan los antígenos desde la vacuna a las células
en el sistema inmunitario ( del animal vacunado), que puede producir
una respuesta protectora. Algunos adyuvantes poliméricos más nuevos
funcionan mediante la encapsulación de antígenos y su liberación
lentamente durante un periodo de semanas o meses. Estos adyuvantes
más nuevos pueden ayudar en la protección frente a la interferencia
de los antígenos y, en general, es menos probable que causen
infiltración extensa de leucocitos en el punto de inyección. De
acuerdo con la invención, los adyuvantes se pueden seleccionar del
grupo compuesto por: aceite en agua, agua en aceite,
Al(OH)_{3}, AlPO_{4}, extractos de paredes
celulares bacterianas (Mycobacterium, Propionibacterium,
etc.) o Quil A), polímeros, incluidos copolímeros de bloque,
liposomas y combinaciones de los mismos. En la presente memoria
descriptiva se prefieren adyuvantes que funcionan mediante la
encapsulación de antígenos y su liberación lentamente durante un
periodo de semanas o meses. Preferentemente, los adyuvantes son
polímeros, incluidos copolímeros de bloque (denominados de forma
alternativa en la presente memoria descriptiva adyuvantes
poliméricos). Un ejemplo específico del adyuvante preferido es
carbopol. En general, cuanto más eficaz es el adyuvante, más
irritante es y es más probable que cause una reacción en el animal.
Es una característica clara de la invención que los adyuvantes
eficaces se pueden formular con los antígenos protectores para
producir vacunas que sean seguras y eficaces.
También es una característica clara de la
invención que una vacuna multicomponente para rumiantes incluiría
todos los componentes antigénicos protectores requeridos y
adyuvante, en una dosis baja. En esencia, se requerirían menos de
cinco antígenos protectores de cada organismo para que una vacuna
sea inmunogénicamente eficaz. Sin embargo, una vacuna que contiene
sólo los antígenos protectores sería esencialmente una vacuna muy
pura.
Dada la elevada pureza de los antígenos, sería
difícil adyuvarles con los adyuvantes usados habitualmente. El
antígeno puro requeriría adyuvantes que fueran diferentes de los
adyuvantes típicos. Por tanto, una producción a escala comercial de
las vacunas clostridiales que contengan componentes antigénicos
protectores muy puros sería técnicamente difícil. A cualquier tasa,
la preparación de una vacuna animal muy pura en una escala comercial
es prohibitiva por el coste de la purificación.
De acuerdo con la invención, los componentes
individuales de las vacunas multicomponente descritas en la presente
memoria descriptiva se pueden formular con los antígenos protectores
derivados de; bacterias de cultivos enteros, virus de cultivos
enteros, toxoides sin células, toxoides purificados y/o subunidades.
Los cultivos enteros contienen numerosos antígenos. Alguno de los
antígenos confieren protección (antígenos protectores), algunos
producen respuesta negativa (antígenos perjudiciales) y algunos son
esencialmente neutros (antígenos neutros). Las subunidades se pueden
obtener de los propios organismos mediante procedimientos
convencionales tales como: centrifugación, ultrafiltración y
extracción con detergentes o disolventes orgánicos. Como
alternativa, las subunidades se pueden producir mediante tecnología
recombinante y expresarse en vectores vivos u otros organismos, y
aislarse y purificarse. Debe entenderse que los componentes
antigénicos protectores pueden contener de pocos a muchos antígenos
al menos uno de los cuales es protector o inmunogénicamente
eficaz.
En la preparación de la vacuna de la invención
se puede incorporar componentes antigénicos protectores a partir de
una pluralidad de organismos. Esto ocasiona la probabilidad de que
un componente antigénico protector interfiera con otro. Esto es
particularmente el caso si los antígenos protectores derivan de
organismos clostridiales. La interferencia puede ser el resultado
de: (1) enmascaramiento físico o la ocultación de un sitio activo de
un componente antigénico protector por otro, (2) agregación o
aglomeración de uno o más componentes antigénicos protectores de
forma que uno o más sitios activos se ocultan del sistema
inmunitario, (3) interacción química en la que existe un cambio en
el sitio activo de un componente antigénico protector por otro. El
último cambio puede ser el resultado de un efecto tóxico, la unión
química o un cambio conformacional en una porción crucial de un
sitio activo.
Es una clara característica de la invención que
los efectos de los antígenos perjudiciales se pueden evitar mediante
el procedimiento de la invención. El procedimiento comprende: usar
procedimientos especializados para identificar los componentes
antigénicos protectores; cuantificar los componentes antigénicos
protectores; identificar los componentes antigénicos protectores que
contienen antígenos perjudiciales; purificar los componentes
antigénicos protectores que contienen antígenos perjudiciales para
eliminar tales antígenos perjudiciales; seleccionar adyuvantes que
producen la estimulación necesaria de la respuesta inmunitaria sin
causar una reactividad inaceptable y protegen contra la
interferencia; adyuvar de forma individual los componentes
antigénicos protectores que son sensibles a los efectos de los
antígenos perjudiciales; mezclar los diversos componentes
antigénicos protectores en una vacuna de volumen de dosis baja.
En la preparación de las vacunas
multicomponente, los inventores emplean adyuvante que protege los
sitios activos de los diversos componentes antigénicos protectores.
De hecho, los adyuvantes interaccionan con antígenos protectores
hacia los que están destinados y no con otros antígenos. Como cabría
esperar, la selección de un adyuvante es crucial. El adyuvante debe
ser uno que sea lo bastante potente como para producir una
estimulación significativa de la respuesta inmunitaria sin producir
reacciones sistémicas o locales inaceptables. El término "produce
estimulación significativa de la respuesta inmunitaria" hace
referencia a la estimulación del sistema inmunitario de forma que la
protección del animal huésped resulta de la vacunación. Además, el
adyuvante debe reducir o impedir la interferencia con los antígenos
protectores. Se prefiere un adyuvante que encapsule los antígenos.
Esta característica se suele asociar con adyuvantes de tipo polímero
o copolímero de bloque. El adyuvante preferido para esta invención
es uno que contenga "carbopol" o el equivalente del mismo.
Una parte integral de la invención es el uso de
un procedimiento de análisis especificado para la cuantificación
antigénica de los componentes antigénicos protectores. A modo de
ilustración, el procedimiento de análisis para la cuantificación de
un componente antigénico protector clostridial implica la inyección
en ratones de combinaciones de antígeno y antisuero específico. En
la presente memoria descriptiva el procedimiento de análisis se
denomina "análisis de potencia de la combinación". La medida
resultante del antígeno se designa "unidad de potencia de la
combinación" (UPC). El análisis UPC, desarrollado de acuerdo con
la invención, es una parte integral de la formulación de productos
clostridiales de combinación. El análisis comprende la adición de
volúmenes variables del material de análisis a una serie de tubos.
El volumen total del material de análisis de cada tubo se lleva a
1,0 ml usando diluyente cloruro sódico de peptona [8,5 g de cloruro
sódico y 10 g de bactona peptona/litro (PND)]. A cada tubo se añade
medio mililitro de PND que contiene una Unidad Internacional de
antitoxina, obtenida del organismo clostridial que se está
analizando, más suficiente antitoxina en exceso para neutralizar
aproximadamente 100 DLM de toxina. Se mezclan los tubos y ratones de
18-20 g se inoculan por vía intravenosa con 0,5 ml
de cada tubo. Los ratones se someten a observación durante 48 horas
y se registra la muerte. La UPC del material de análisis se calcula
del siguiente modo:
UPC/ml=
\frac{\text{recíproco de la dilución del toxoide X 2}}{\text{Volumen
más pequeño de la dilución anterior que mata el 100% de los ratones
inoculados}}
Otros procedimientos de análisis que producen
sustancialmente los mismos resultados que los descritos en la
presente memoria descriptiva se abarcan en la invención
reivindicada. Ejemplos no limitantes de otros procedimientos de
análisis pueden ser ensayos ELISA y cromatografía líquida, que
cuantifican antígenos directamente en las vacunas. De acuerdo con lo
anterior, el experto en la técnica puede emplear la UPC/ml requerida
o la unidad de cuantificación antigénica por ELISA equivalente para
determinar el valor de las cantidades de los componentes antigénicos
que son útiles en hacer y usar las vacunas de la invención.
Los inventores han descubierto de forma
inesperada que las vacunas multicomponente que contienen una
pluralidad de componentes antigénicos protectores clostridiales más
al menos un componente antigénico protector no clostridial y un
adyuvante en un volumen de dosis baja se pueden producir mediante:
identificación del componente antigénico protector de cada organismo
a través de procedimientos in vivo o in vitro; la
cuantificación de los componentes antigénicos protectores durante la
formulación y fabricación de la vacuna, usando ensayos de
cuantificación antigénica descritos anteriormente para proporcionar
el componente antigénico protector en una cantidad suficiente como
para producir una vacuna protectora con la menor masa antigénica; la
identificación de los componentes antigénicos de los organismos que
contienen antígenos perjudiciales mediante el uso de ensayos de
cuantificación antigénica y análisis de la reactividad del animal;
la purificación de los componentes antigénicos protectores que
contienen antígenos perjudiciales para eliminar tales antígenos; la
selección el agente de inactivación para cada organismo que requiere
inactivación de forma que se mata al organismo sin desnaturalizar el
componente antigénico protector; la selección de un adyuvante para
cada componente antigénico protector que requiere un adyuvante
mediante la evaluación de la capacidad del adyuvante para estimular
la respuesta inmunitaria al componente antigénico protector sin
causar reactividad animal inaceptable; adyuvar de forma individual
los componentes antigénicos protectores que requieren tal
adyuvación; la mezcla de los componentes antigénicos protectores en
una vacuna de dosis baja que confiere protección a los animales a
los que se administra la vacuna. Mediante este procedimiento se
puede producir una vacuna multicomponente segura, rentable,
comercialmente viable e inmunogénicamente eficaz.
La vacuna multicomponente contiene una
combinación de: uno o más componentes antigénicos protectores
clostridiales con uno o más componentes antigénicos protectores no
clostridiales y un adyuvante seleccionado del grupo compuesto por un
polímero, un copolímero de bloque, un aceite en agua, un agua en
aceite, Al(OH)_{3}, AlPO_{3} y extracto de una
pared celular bacteriana, un liposoma, Quil A y una combinación de
los mismos a un volumen de dosis baja de 3,0 ml o menos. El uso de
vacunas multicomponente, es decir vacunas de esta infección a escala
comercial, no produce reacciones significativas en el punto de la
inyección tras la administración subcutánea o intramuscular.
Lo siguiente es una descripción específica de la
invención que se pretende que ayude a los expertos en la práctica de
la invención. Más específicamente, la descripción se refiere a la
caracterización de los componentes antigénicos y la manera en la que
se formulan, incluida la inactivación y adyuvación.
Los inventores han descubierto que los antígenos
protectores de Cl. chauvoei están asociados con células.
Estos antígenos protectores no se encuentran en el material
proteináceo excretado en el sobrenadante del cultivo mientras el
organismo crece en fermentadores. También se ha encontrado que el
componente antigénico protector de Cl. chauvoei no interfiere
con otros componentes antigénicos protectores en la vacuna
multicomponente clostridial. Por tanto se puede usar una bacterina
celular entera o un extracto celular. La bacterina celular entera o
el extracto celular se pueden inactivar con formaldehído
(0,05-1,5%), betapropriolactona (BPL) a
0,05-0,3% o etileneimina binaria (BEI) a
0,05-0,3%. Tras la inactivación, este componente
debe adyuvarse por separado. Si se usan BPL o BEI para la
inactivación deben neutralizarse antes de la adyuvación. Los
adyuvantes que estimulan este componente antigénico protector son
Al(OH)_{3}, aceites, Quil A, copolímeros de bloque y
polímeros tales como "carbopol". Se pueden usar adyuvantes
oleosos como coadyuvantes con polímeros. El carbopol es el más
preferido y se añade al cultivo entero inactivado a un pH bajo. A
continuación, el pH se ajusta de forma ascendente hasta
aproximadamente 7,0 con, digamos, hidróxido sódico (NaOH). Esta
etapa de ajuste de pH permite que los componentes antigénicos
protectores de Cl chauvoei queden encapsulados en el
adyuvante polimérico. Sin quedar anclado a ninguna teoría concreta
de la invención, se cree que los antígenos de Cl chauvoei se
liberan en un periodo de varias semanas. A causa de la lenta
liberación, estos antígenos no causan la típica reacción animal. La
liberación a largo plazo produce una respuesta inmunitaria
estimulada por parte del animal vacunado.
El componente antigénico protector de Cl.
septicum está asociado con la célula y con una toxina. La toxina
se secreta en un sobrenadante mientras el organismo crece. Por
tanto, este componente antigénico protector deriva de la célula y
del sobrenadante. Aparentemente, Cl. septicum no interfiere
con otros componentes antigénicos protectores en las vacunas
multicomponente clostridiales que contienen componentes antigénicos
protectores no clostridiales. La bacterina celular entera o el
extracto celular se puede inactivar con formaldehído
(0,05-1,5%), BPL (0,05-0,3%) o BEI
(0,05-0,3%). Tras la inactivación, este componente
antigénico protector debe adyuvarse por separado. Cuando se usa BPL
o BEI para la inactivación, deben neutralizarse antes de adyuvar.
Los adyuvantes que potencian este componente antigénico protector
pueden ser: Al(OH)_{3}, aceites, Quil A, copolímeros
de bloque y polímeros tales como "carbopol". Se pueden usar
adyuvantes oleosos si se combinan como coadyuvantes con polímeros.
El adyuvante preferido es el adyuvante polimérico. Preferentemente,
el adyuvante se añade al cultivo entero inactivado a un pH bajo. A
continuación, el pH se ajusta de forma ascendente hasta
aproximadamente 7,0 con NaOH. Esta etapa de ajuste de pH incrementa
el pH desde aproximadamente 5,0 a 7,0 durante lo cual los antígenos
de Cl septicum quedan encapsulados en el carbopol. La vacuna
resultante no causa la típica reacción animal pero libera los
antígenos de Cl septicum durante un periodo de varias
semanas. Este modo de liberación produce una respuesta inmunitaria
estimulada por parte del animal vacunado.
Los inventores creen que el componente
antigénico protector de Cl. novyi está asociado con una
proteína celular y una toxina que se secreta en un sobrenadante. Por
tanto, este componente antigénico protector deriva de la célula y
del sobrenadante, en forma concentrada o no concentrada.
Aparentemente, el componente antigénico protector de Cl.
novyi no interfiere con otros componentes antigénicos
protectores en las vacunas multicomponente clostridiales cuando se
combinan con componentes antigénicos protectores no clostridiales.
La bacterina celular entera o el extracto celular se puede
inactivar con formaldehído (0,05-1,5%), BPL
(0,05-0,3%) o BEI (0,05-0,3%) y debe
adyuvarse por separado. Cuando se usa BPL o BEI, deben neutralizarse
antes de adyuvar. Los adyuvantes que potencian este componente
antigénico protector son: Al(OH)_{3}, aceites, Quil
A, copolímeros de bloque y polímeros tales como "carbopol". Se
pueden usar adyuvantes oleosos si se combinan como coadyuvantes con
polímeros. Se prefieren los adyuvantes poliméricos carbopol. El
adyuvante polimérico se añade al cultivo entero inactivado a un pH
bajo. A continuación, el pH se ajusta de forma ascendente hasta
aproximadamente 7,0 con NaOH. Esta etapa de ajuste de pH incrementa
el pH desde aproximadamente 5,0 a 7,0 durante lo cual los antígenos
de Cl novyi quedan encapsulados en el polímero. La vacuna
resultante no causa la típica reacción animal pero libera los
antígenos de Cl novyi durante un periodo de varias semanas.
Esta liberación prolongada produce una respuesta inmunitaria
estimulada por parte del animal vacunado.
Se cree que el componente antigénico protector
de Cl. sordellii está asociado con una toxina que se secreta
en el sobrenadante a medida que el cultivo crece. Por tanto, este
componente antigénico protector deriva del sobrenadante.
Normalmente, este componente antigénico protector se concentra
mediante ultrafiltración a través de un cartucho de 10.000 dalton de
peso molecular (PM) antes de adyuvar. La toxina de Cl.
sordellii se puede inactivar con formaldehído
(0,05-1,5%), BPL (0,05-0,3%) o BEI
(0,05-0,3%) antes de adyuvar y debe adyuvarse por
separado. Cuando se usa BPL o BEI para la inactivación, deben
neutralizarse antes de adyuvar. Los adyuvantes que potencian este
componente antigénico protector son: Al(OH)_{3},
aceites, Quil A, copolímeros de bloque y polímeros tales como
carbopol. Se pueden usar adyuvantes oleosos si se combinan como
coadyuvantes con polímeros. Se prefiere el adyuvante polimérico. El
adyuvante polimérico carbopol se añade al cultivo entero inactivado
a un pH bajo. A continuación, el pH se ajusta de forma ascendente
hasta aproximadamente 7,0 con NaOH. Esta etapa de ajuste de pH
incrementa el pH desde aproximadamente 5,0 a 7,0 durante lo cual los
antígenos quedan encapsulados en el adyuvante polimérico. La vacuna
resultante no causa la típica reacción animal pero libera los
antígenos de Cl sordellii durante un periodo de varias
semanas. Esta liberación prolongada produce una respuesta
inmunitaria estimulada por parte del animal vacunado.
Se sabe que los componentes antigénicos
protectores de Cl. perfringens tipos C y D son toxoides que
excretan las células. Dado que proporcionan protección cruzada
contra Cl. perfringens tipo B, estos componentes antigénicos
protectores sólo necesitan contener sobrenadante sin células que
contenga toxina inactivada (toxoide). Se considera que estos dos
componentes representan 3 componentes (B, C y D). En las
formulaciones de una vacuna multicomponente clostridial, se pueden
usar los componentes antigénicos protectores de los tipos C y D de
Cl. perfringens que contienen células o en los que se han
eliminado las células (toxoide sin células). Antes de la eliminación
de las células, se recoge del fermentador todo el cultivo y se
inactiva con formaldehído (0,5-1,5%), BPL
(0,05-0,5%) o BEI (0,05-0,5%) antes
de adyuvar. Las células se pueden eliminar mediante, digamos,
filtración o centrifugación. En cualquier caso, los antígenos
respectivos se deben adyuvar por separado. Cuando se usa BPL o BEI
para la inactivación, deben neutralizarse antes de la eliminación de
las células. Los adyuvantes que potencian este componente antigénico
protector son Al(OH)_{3}, aceites, Quil A,
copolímeros de bloque y polímeros tales como carbopol. Se pueden
usar adyuvantes oleosos si se combinan como coadyuvantes con
polímeros. En la presente se prefiere el adyuvante polimérico. El
adyuvante polimérico carbopol se añade al cultivo entero inactivado
a un pH bajo. A continuación, el pH se ajusta de forma ascendente
hasta aproximadamente 7,0 con NaOH. Esta etapa de ajuste de pH
incrementa el pH desde aproximadamente 5,0 a 7,0. Durante este
incremento, los componentes antigénicos protectores de Cl.
perfringens quedan encapsulados en el adyuvante polimérico.
Se cree que el componente antigénico protector
de Cl. haemolyticum está asociado con la células y que se
excreta como toxina en el sobrenadante. Por tanto, este componente
antigénico protector contiene antígenos de las células y del
sobrenadante. A causa de esta elevada masa celular, este componente
antigénico protector puede causar interferencia con otros
componentes antigénicos protectores de una vacuna multicomponente
clostridial. Normalmente, este antígeno protector se concentra
mediante, digamos, ultrafiltración con un cartucho de 10.000 dalton
de peso molecular antes de adyuvar. El cultivo entero de Cl.
haemolyticum se puede inactivar con formaldehído
(0,05-1,5%). BPL (0,05-0,3%) o BEI
(0,05-0,3%) antes de concentrar. El material
concentrado inactivado debe adyuvarse por separado. Si se usa BPL o
BEI para la inactivación, debe neutralizarse antes de adyuvar.
Los adyuvantes que potencian este componente
antigénico protector son Al(OH)_{3}, aceites, Quil
A, copolímeros de bloque y polímeros tales como carbopol. Se pueden
usar adyuvantes oleosos si se combinan como coadyuvantes con
polímeros. En la presente se prefiere el adyuvante polimérico. El
adyuvante carbopol se añade al cultivo entero inactivado a un pH
bajo. A continuación, el pH se ajusta de forma ascendente hasta
aproximadamente 7,0 con NaOH. Esta etapa de ajuste de pH incrementa
el pH desde aproximadamente 5,0 a 7,0. Durante este incremento, los
componentes antigénicos protectores de Cl. haemolyticum
quedan encapsulados en el adyuvante polimérico. La vacuna resultante
no causa la típica reacción animal pero libera los antígenos de
Cl haemolyticum durante un periodo de varias semanas. Esta
liberación prolongada produce una respuesta inmunitaria estimulada
por parte del animal vacunado.
Con la descripción anterior y los ejemplos
siguientes, estaría dentro del ámbito del experto en la técnica
hacer y utilizar las vacunas multicomponentes de dosis baja de la
invención. En la práctica de la invención, se pueden administrar las
vacunas multicomponente de dosis baja por vía subcutánea o
intramuscular para proteger a los animales sin causar lesiones
significativas en el punto de la inyección.
Este y otros aspectos de la invención se
ilustran con detalle mediante los ejemplos siguientes no
limitantes.
\newpage
Ejemplo
1A
Este ejemplo ilustra la forma de realización de
esta invención, que comprende una combinación de componentes
antigénicos protectores procedentes de al menos 6 organismos
clostridiales con componentes antigénicos protectores procedentes de
al menos 1 componente no clostridial tal como un organismo
gramnegativo. Primero se formuló una bacterina multicomponente con
una combinación de componentes antigénicos protectores derivados de:
Cl. chauvoei, Cl. septicum, Cl. novyi, Cl. sordellii, Cl.
perfringens tipos C y D; un componente antigénico protector de
H. somnus y un adyuvante carbopol. El componente antigénico
protector de H. somnus se purificó bastante para impedir la
reactividad del animal pero no tanto como para convertirlo en no
rentable. En los experimentos se usaron dos aislamientos de H.
somnus. Un aislamiento se designó 8025T y el otro se designó
14767. Cada aislamiento se cultivó por separado en 160 l de medio
que contenía los siguientes componentes: Hidrolizado pancreático de
caseína, extracto de levadura, proteasa peptona, NaCl y
Na_{2}HPO_{4}. El medio de crecimiento se complementó con
dextrosa al 0,5% y suero de caballo al 10%. El oxígeno disuelto se
controló durante el ciclo de fermentación aproximadamente al 10%
(entre el 5% y el 20%). Los fermentadores se inocularon con 3,5% de
la siembra (aislamiento 14767) o 5% de la siembra (aislamiento
8025T). Los cultivos se incubaron a 37ºC, con control de pH entre
7,1 y 7,3 y se dejaron crecer hasta que las densidades ópticas
(Absorbancia a 540 nm) alcanzaron aproximadamente 1,20
(5-24 horas), tiempo tras el cual los cultivos se
inactivaron con formalina al 0,3%. La inactivación de H.
somnus se realizó con formaldehído (0,05-1,5%),
BPL (0,05-0,5%) o BEI (0,05-0,5%)
antes de concentrar y adyuvar. En el uso de BPL y BEI, se
neutralizaron antes de usarse para la inactivación. Al
cultivo entero inactivado se añadió carbopol a un pH bajo. A continuación, el pH se ajustó hasta 7,0 con NaOH.
cultivo entero inactivado se añadió carbopol a un pH bajo. A continuación, el pH se ajustó hasta 7,0 con NaOH.
Tras la inactivación, los cultivos bacterianos
enteros se concentraron 10X usando un cartucho de ultrafiltración de
0,1 micrómetros, seguido por diafiltración con 11 volúmenes de suero
salino tamponado con fosfato (PBS). A continuación los concentrados
lavados se centrifugaron a 7000 rpm usando una centrifugadora Sorval
RC5B refrigerada y los sedimentos se resuspendieron en 100 ml de PBS
enfriado. Los concentrados centrifugados se ajustaron a una
concentración 10X o 20X (sobre la base del volumen del cultivo
entero inicial) y se adyuvó con 10% v/v de adyuvante carbopol
modificado 10X. Este adyuvante estaba comprendido por: hasta el
0,25% de carbopol 934P, Tween 80, Span 20 y aceite de semilla de
algodón. Para experimentación adicional, una dosis 1X de H.
somnus 8025T consistió en 0,061 ml de concentrado adyuvado de
H. somnus 8025T 20X o 0,122 ml de concentrado adyuvado 10X.
Asimismo, una dosis de H. somnus 14767 consistía en 0,061 ml
de concentrado 20X adyuvado o de 0,122 ml de concentrado 10X
adyuvado. Estos volúmenes correspondían a la cantidad de antígeno
contenida en 1,0 ml de cultivo entero 14767 o 8025T, cada uno con
una densidad óptica de 1,3 a 540 nm.
La pureza relativa de las preparaciones de H.
somnus descritas anteriormente se demostró mediante comparación
de sus niveles de endotoxina tras las diversas etapas de
purificación. Estas preparaciones se compararon con los cultivos
enteros de H. somnus. Las muestras de los concentrados 10X de
H. somnus 8025T y 14767 se retiraron en diversas etapas en el
proceso de purificación y se diluyeron a 1X con pBS.
Los ensayos con endotoxinas se realizaron con
las muestras usando un aparato BioWhitaker automático y los
resultados se normalizaron frente a patrones de LPS de E.
coli preparados para que contengan un millón de unidades de
endotoxina por ml. Los resultados se muestran en la Tabla 1. Los
resultados muestran que los cultivos de H. somnus se pueden
purificar mediante centrifugación o una combinación de
ultrafiltración y diafiltración. Los cultivos resultantes
presentaban niveles de endotoxina que eran inferiores al 10% de los
observados en los cultivos enteros inactivados originales. Este
nivel de reducción de endotoxina es adecuado para eliminar la
reactividad animal significativa y es rentable.
Material analizado | Unidades de endotoxina/ml (X 1000) | |
Aislamiento 14767 | Aislamiento 8025T | |
Cultivo entero 1X inactivado | 5266 | 8705 |
Concentrado 10X, diafiltrado con 11 volúmenes | 681 | 1332 |
de PBS, reconst. hasta 1X | ||
Concentrado 10X, diafiltrado con 11 volúmenes | 422 | 397 |
de PBS, cent., reconst. hasta 1X | ||
Concentrado 10X, cent., reconst. hasta 1X | 408 | 397 |
Cultivo entero centrifugado, reconst. hasta 1X | 431 | 256 |
Este ejemplo ilustra que la inmunogenicidad se
mantiene cuando se usaron sólo las células para producir los
componentes antigénicos protectores. Tras la purificación de H.
somnus como se describe en el Ejemplo 1A, las preparaciones
celulares lavadas de los mismos se formularon a diversas
concentraciones del antígeno con una pluralidad de componentes
antigénicos protectores clostridiales y se analizaron como una dosis
de 2,0 ml o una dosis de 5,0 ml (control positivo) en una prueba de
vacunación/provocación de ratón [aprobado por el Servicio de
Inspección sanitaria de plantas y animales de EE.UU. (APHIS)]. El
análisis se realizó mediante la vacunación de ratones con una dosis
fraccionada del producto de prueba, el refuerzo de tales ratones con
la misma dosis a los 14 días de la vacunación y la provocación de
tales ratones con un cultivo de H. somnus virulento a
10-14 días de la vacuna de refuerzo. El cultivo de
la provocación se mezcló con un volumen igual de mucina gástrica al
7% antes de la inyección. La mezcla resultante era lo bastante
fuerte como para matar al 80% de los ratones control (16 de 20).
Para que la prueba sea satisfactoria deben sobrevivir al menos 14 de
20 ratones vacunados. Las fracciones clostridiales se produjeron del
siguiente
modo:
modo:
Aunque como componente antigénico protector se
podía usar cualquier cultivo bacteriano entero comercial de Cl.
chauvoei, para los fines de este experimento Cl. chauvoei
se cultivó en condiciones anaerobias estrictas en fermentadores a
gran escala en condiciones de control de pH entre 6,5 y 7,6, se
inactivó con 0,5% de formaldehído y se adyuvó con adyuvante carbopol
modificado como un cultivo bacteriano entero no concentrado
distinto. El adyuvante carbopol modificado fue el mismo que el que
se ha descrito en el Ejemplo 1A. El adyuvante se añadió en una
proporción v/v del 10% respecto al cultivo bacteriano entero de
Cl. chauvoei, se mezcló para permitir el contacto completo
con el adyuvante a un pH bajo, y después se ajustó el pH a
aproximadamente 7,0 con NaOH 5 ó 10N.
Aunque cabe esperar que como componente
antigénico protector se pueda usar cualquer cultivo bacteriano
entero comercial de Cl. septicum, para los fines de este
experimento Cl. septicum se cultivó en condiciones anaerobias
estrictas en fermentadores a gran escala con control de pH entre 6,5
y 7,6, se inactivó con 0,5% de formaldehído, se concentró
mínimamente usando un sistema de ultrafiltración de 10.000 dalton de
PM y se adyuvó con adyuvante carbopol modificado añadiendo el
adyuvante directamente al cultivo bacteriano entero concentrado de
Cl. septicum. El adyuvante carbopol modificado es el mismo
que el que se ha descrito previamente. El adyuvante se añadió en una
proporción v/v del 10% respecto al concentrado de Cl.
septicum, se mezcló para permitir el contacto completo con el
adyuvante a un pH bajo, y después se ajustó el pH a aproximadamente
7,0 con NaOH 5 ó 10N.
Cl. novyi se cultivó en condiciones
anaerobias estrictas en fermentadores a gran escala con control de
pH entre 6,5 y 7,6, se inactivó con 0,5% de formaldehído y se adyuvó
como un cultivo bacteriano entero no concentrado con el adyuvante
carbopol modificado como se ha descrito previamente. El adyuvante se
añadió en una proporción v/v del 10% respecto al cultivo bacteriano
entero de Cl. novyi, se mezcló para permitir el contacto
completo con el adyuvante a un pH bajo, y después se ajustó el pH a
aproximadamente 7,0 con NaOH 5 ó 10N. La Unidad de Potencia de
combinación (UPC) se midió, como se ha descrito antes, en el cultivo
después de la inactivación y después de la adyuvación. La UPC del
componente antigénico protector final se ajustó a 10 UPC/ml con PBS
adyuvado.
Cl. sordellii se cultivó en condiciones
anaerobias estrictas en fermentadores a gran escala con control de
pH entre 6,5 y 7,6. Al final de la fase de crecimiento, el cultivo
se mantuvo a un pH de aproximadamente 8,0 durante
8-10 horas para facilitar la lisis celular. A
continuación el cultivo lisado se inactivó con 0,5% de formaldehído
(toxoide lisado), se concentró usando un cartucho de
ultrafiltración de 10.000 dalton de PM y se adyuvó con el adyuvante
carbopol modificado descrito previamente. El adyuvante se añadió en
una proporción v/v del 10% respecto al toxoide lisado de Cl.
sordellii, se mezcló para permitir el contacto completo con el
adyuvante al pH bajo, y después se ajustó el pH a aproximadamente
7,0 con NaOH 5 ó 10N. Después de adyuvar, se midió la potencia de
combinación y el componente antigénico protector se ajustó a 100
UPC/ml mediante dilución con PBS adyuvado.
Los tipos C y D de Clostridium
perfringens. se cultivaron en condiciones anaerobias estrictas
en fermentadores a gran escala con control de pH entre 7,3 y 7,5
durante 4-8 horas. Los cultivos bacterianos enteros
se inactivaron con 0,5% de formaldehído. Para los fines de este
experimento, las células se eliminaron mediante centrifugación en
una centrífuga Sorvall a 7000 RPM. Los sobrenadantes restantes
contenían los toxoides C o D de Cl. perfringens. Los toxoides
se concentraron individualmente mediante ultrafiltración a través de
un cartucho de 10.000 dalton de PM y los concentrados se analizaron
para determinar su cantidad de componente antigénico protector
mediante el análisis de potencia de combinación descrito
anteriormente. Tras el ajuste de la concentración de antígeno (UPC),
cada componente antigénico protector se adyuvó de forma individual
usando el adyuvante carbopol modificado descrito anteriormente. El
adyuvante se añadió en una proporción v/v del 10% con respecto a los
toxoides individuales de Cl. perfringens (C o D), se mezcló
para permitir el contacto completo con el adyuvante al pH bajo, y
después se ajustó el pH a aproximadamente 7,0 con NaOH 5 ó 10N.
Cl. haemolyticum se cultivó en
condiciones anaerobias estrictas en fermentadores a gran escala con
control de pH entre 6,8 y 7,3. El cultivo se recolectó e inactivó
con 0,5% de formaldehído antes de la concentración. Para concentrar
el cultivo entero se usó un cartucho de ultrafiltración de 10.000
dalton de PM, y después se adyuvó con el adyuvante carbopol
modificado descrito en el Ejemplo 1A. El adyuvante se añadió en una
proporción v/v del 10% respecto al concentrado de cultivo de Cl.
haemolyticum, se mezcló para permitir el contacto completo con
el adyuvante al pH bajo, y después se ajustó el pH a aproximadamente
7,0 con NaOH 5 ó 10N.
H. somnus se preparó de acuerdo con la
descripción del Ejemplo 1A. Los componentes clostridiales
pre-adyuvados, como se ha descrito anteriormente, se
formularon en una combinación como se muestra en la Tabla 2. A esta
mezcla se añadió el componente de H. somnus adyuvado y PBS
adyuvado hasta igualar el tamaño de dosis que se está
analizando.
Se hicieron series experimentales con cantidades
variables de suspensión celular lavada de H. somnus, como se
ha descrito en el Ejemplo 1A, en combinación con 6 ó 7 componentes
antigénicos protectores clostridiales, con el fin de determinar si
la potencia de este componente se vio afectada de forma adversa por
el proceso de purificación o por la mezcla del H. somnus más
purificado con los componentes clostridiales. Se prepararon series
de producto que contenía 6 componentes antigénicos protectores
clostridiales más H. somnus o 7 componentes antigénicos
protectores clostridiales + H. somnus como se muestra en la
Tabla 2 y se analizaron para determinar la potencia del componente
antigénico protector de H. somnus de acuerdo con el análisis
del ratón descrito en el Ejemplo 1A. Se analizaron dosis animales
huésped de 5,0 ml y 2,0 ml. Los resultados de estos análisis se
muestran en la Tabla 3 junto con una lista del tamaño de dosis
analizado y de las cantidades de H. somnus por dosis.
Este experimento demuestra que los antígenos
protectores de H. somnus están asociados con las células y no
con el sobrenadante que contiene las endotoxinas. Además, la
suspensión celular lavada no pareció afectada adversamente por los 6
componentes antigénicos protectores clostridiales. El componente
antigénico protector de H. somnus todavía tenía potencia
cuando las células lavadas se resuspendieron hasta una concentración
igual a la mitad de la concentración del cultivo entero original y
se mezclaron con 6 componentes antigénicos protectores
clostridiales. Cuando se añadió Cl. haemolyticum a los 6
componentes antigénicos protectores clostridiales originales pareció
afectar de forma adversa al componente antigénico protector de H.
somnus sólo ligeramente, no suficiente como para requerir un
tamaño de dosis superior a 2,0 ml. Por tanto, es comercialmente
factible producir una vacuna con componentes antigénicos protectores
de 7 organismos clostridiales en combinación con un componente
antigénico protector de un organismo gramnegativo tal como H.
somnus.
\vskip1.000000\baselineskip
Organismo | Cantidad mínima | Volumen real del | Descripción |
del componente/dosis | componente/dosis | del antígeno | |
Cl. chauvoei | > 0,2 ml de CE* | 0,2 ml | CE no concentrado |
Cl. septicum | 0,11 ml de CE* | 0,11 ml | CE 7,4X concentrado |
Cl. novyi | 2,0 UPC | 0,2 ml a 10 UPC/ml | 2,0 UPC Toxoide + CE |
Cl. sordellii | 27,0 UPC | 0,27 ml a 100 UPC/ml | 27,0 UPC Toxoide + CE |
Cl. haemolyticum | 20 ml equivalentes de | 0,28 ml | 7,2X Conc Toxoide + CE |
cultivo entero | |||
Cl. perfringens tipo C | 600 UPC/dosis | 0,375 ml de cultivo | CE no concentrado |
entero= 600 UPC/dosis | purificado | ||
Cl. perfringens tipo D | 359 UPC/dosis | 0,39 ml de cultivo | CE no concentrado |
entero= 350 UPC/dosis | purificado | ||
PBS adyuvado | N/A | Cant. necesaria para llevar | N/A |
la dosis total hasta el | |||
volumen requerido | |||
*CE= cultivo entero |
Número | Tipo de | Tamaño | Cantidad de H. somnus | Resultado del | |
de serie | producto | de dosis (ml) | por dosis* | análisis de potencia | |
(ratones protegidos/ | |||||
total infectados) | |||||
Aislamiento | Aislamiento | ||||
8025T | 14767 | ||||
1093-1 | 6-VALENTE | 5,0 | 0,183 | 0,183 | 20/20 |
+ H. somnus | 1,5X | 1,5X | |||
1093-2 | 6-VALENTE | 5,0 | 0,122 | 0,122 | 20/20 |
+ H. somnus | 1,0X | 1,0X | |||
1093-3 | 6-VALENTE | 5,0 | 0,061 | 0,061 | 20/20 |
+ H. somnus | 0,5 | 1,0X | |||
1093-4 | 6-VALENTE | 2,0 | 0,183 | 0,183 | 20/20 |
+ H. somnus | 1,5X | 1,5X | |||
1093-5 | 6-VALENTE | 2,0 | 0,122 | 0,122 | 20/20 |
+ H. somnus | 1,0X | 1,0X | |||
1093-6 | 6-VALENTE | 2,0 | 0,061 | 0,061 | 19/20 |
+ H. somnus | 0,5X | 0,5X | |||
1093-7 | 1093-5 | 2,0 | 0,5X | 0,5X | 19/20 |
Diluido a 1:2 | |||||
1093-8 | 7-VALENTE | 2,0 | 0,061 | 0,061 | 20/20 |
+ H. somnus | 1,0x | 1,0x | |||
1093-9 | 6-VALENTE | 2,0 | 0,244 | Ninguno | 20/20 |
+ H. somnus | 1,5X | ||||
1093-10 | 6-VALENTE | 2,0 | Ninguno | 0,244 | 18/20 |
+ H. somnus | 1,0X | ||||
1093-11 | UNICAMENTE | 2,0 | 0,122 | 0,122 | 20/20 |
H. somnus | 1,0X | 1,0X | |||
* La cantidad designada por X indica la concentración en relación con el cultivo entero original. | |||||
\begin{minipage}[t]{155mm}Componentes 6-VALENTE= Cl. chauvoei, Cl. novyi, Cl. septicum, Cl. sordellii, Cl. perfringens, tipos C y D\end{minipage} | |||||
\begin{minipage}[t]{155mm}Componentes 7-VALENTE= Cl. chauvoei, Cl. novyi, Cl. septicum, Cl. sordellii, Cl. perfringens, tipos C y D, Cl. haemolyticum\end{minipage} | |||||
Cl. perfringens, tipo C contenía 600 UPC por dosis | |||||
Cl. perfringens, tipo D contenía 350 UPC por dosis |
Este ejemplo muestra el efecto de antígenos
perjudiciales sobre componentes antigénicos protectores
relativamente débiles tales como C. perfringens, tipos C y D.
El efecto de los antígenos perjudiciales se evaluó en una vacuna
multicomponente que contiene componentes antigénicos protectores
procedentes de 6 organismos clostridiales y un componente antigénico
protector procedente de uno no clostridial. Los componentes
antigénicos protectores clostridiales se produjeron como se
describe en el Ejemplo 1B. Las series se formularon con niveles
variables de toxoides de C. perfringens, tipos C y D. Los
niveles de UPC para el tipo C se ajustaron a 600, 900, 1200 ó 1800
por dosis, mientras que los niveles de UPC de toxoide de tipo D se
ajustaron a 350, 500, 700 o 1000 por dosis.
Seis componentes antigénicos protectores
clostridiales se combinaron con dos componentes antigénicos
protectores de H. somnus en diversas formulaciones que
contienen diferentes concentraciones de los dos componentes
antigénicos protectores de Cl. perfringens. La Tabla 4
ilustra las cantidades de cada componente antigénico protector
añadido a las formulaciones, excluidos los tipos C y D de Cl.
perfringens.
Organismo | Cantidad mínima del | Volumen real del | Descripción del |
componente/dosis | componente/dosis | antígeno | |
Cl. chauvoei | > 0,2 ml de CE* | 0,2 ml | CE no concentrado |
Cl. septicum | 0,8 ml de CE* | 0,11 ml | CE 7,4X concentrado |
Cl. novyi | 2,0 UPC | 0,2 ml a 10 UPC/ml | 2,0 UPC Toxoide + CE |
Cl. sordellii | 27,0 UPC | 0,27 ml a 100 UPC/ml | 27,0 UPC Toxoide + CE |
H. somnus 8025T | Conc. equivalente a 1,0 ml | 0,122 ml | 10X Conc. Toxoide + CE |
de CE* en el momento de | |||
la recolección | |||
H. somnus 14767 | Conc. equivalente a 1,0 ml | 0,122 ml | 10X Conc. Células lavadas |
de CE* en el momento de | |||
la recolección | |||
Cl. haemolyticum | 2,0 ml equivalentes de | 0,28 ml | 7,2X Conc células lavadas |
cultivo entero | |||
PBS adyuvado | N/A | Cant. necesaria para | N/A |
llevar la dosis total | |||
hasta 2,0 ml | |||
*CE= cultivo entero |
Dado que en esta preparación experimental los
tipos C y D de Cl. perfringens eran toxoides más purificados,
era importante determinar si estos componentes antigénicos
protectores se verían afectados adversamente por los otros
componentes antigénicos protectores clostridiales o por un
componente antigénico protector no clostridial tal como H.
somnus. Por tanto, este experimento implicaba la preparación de
una vacuna clostridial combinada con H. somnus en un tamaño
de dosis de 2,0 ml e incluía variar las cantidades de los
componentes de Cl. perfringens tipos C y D. Los niveles de
UPC de los tipos C y D variaron de 600 a 1800 UPC por dosis para el
tipo C y de 350 a 1000 UPC por dosis para el tipo D. La Tabla 5
muestra los componentes de Cl. perfringens tipos C y D junto
con los resultados del análisis tras la inyección de animales.
Las cinco vacunas multicomponente clostridiales
y una vacuna que contenía una pluralidad de componentes antigénicos
protectores clostridiales combinados con H. somnus se
analizaron de acuerdo con procedimientos requeridos por el Servicio
de Inspección sanitaria de plantas y animales del gobierno de EE.UU.
(APHIS). Para el análisis se usaron cobayas, conejos o ratones. Para
los componentes clostridiales, las cobayas o los conejos se
vacunaron respectivamente con una dosis equivalente a 1/5 o ½ de la
dosis de campo. Estos animales se sometieron a refuerzo de 10 a 14
días después con la misma dosis de la vacuna. Las cobayas se
sometieron a provocación con organismos vivos de Cl. chauvoei
o Cl. haemolyticum. Para establecer una correlación con la
protección en ganado vacuno, al menos el 80% de las cobayas deben
sobrevivir a estas provocaciones. Los ratones se vacunaron,
sometieron a refuerzo y a provocación para demostrar que una vacuna
protegía contra H. somnus. La provocación era un cultivo
vivo de H. somnus que debe matar al menos el 80% de los
ratones control no vacunados. Una vacuna aceptable debe proteger a
de 14 de 20 ratones vacunados. Los conejos fueron vacunados,
sometidos a refuerzo y se les extrajo sangre para analizar los
títulos de anticuerpos contra Cl. septicum, Cl.
sordellii, Cl. novyi y Cl. perfringens tipos C y
D. La cuantificación de anticuerpos se llevó a cabo de acuerdo con
análisis del APHIS prescritos contra toxinas y antitoxinas patrón
conocidas.
Los resultados de los análisis en los animales
[comparación de las respuestas de antitoxinas de Cl.
perfringens tipos C y D, Cl. novyi y Cl. sordellii
obtenidas con cinco vacunas multicomponente que contenían
componentes antigénicos protectores de 7 organismos clostridiales
(7-valente) y una vacuna multicomponente que
contenía componentes antigénicos protectores de 7 organismos
clostridiales y un organismo gramnegativo (H. somnus)]
indican que son necesarias tan pocas UPC como 600 UPC de Cl.
perfringens tipo C y 350 UPC de Cl. perfringens tipo D
para proteger a los animales en una vacuna que contenía 7
componentes antigénicos protectores clostridiales. Aumentos de tres
veces en las cantidades de estos toxoides no interfería con otros
componentes antigénicos protectores de estas vacunas
multicomponente. Cuando a los 7 componentes antigénicos protectores
clostridiales se añadió H. somnus pareció producirse una
ligera depresión de la respuesta a los tipos C y D de Cl.
perfringens. Por tanto, las cantidades de estos componentes
antigénicos protectores clostridiales se incrementarían con el fin
de asegurar protección al animal huésped en una vacuna
multicomponente que contiene al menos un antígeno no clostridial. La
Tabla 5 (a continuación) muestra que niveles de UPC de 1200 para
Cl. perfringens tipo C y 700 para Cl. perfringens tipo
D compensan el efecto de H. somnus. Aparentemente, las
cantidades de Cl. sordellii y Cl. novyi se pueden
disminuir, ya que las cantidades de los mismos parecen ser
significativamente mayores que las necesarias para proteger a los
animales.
\vskip1.000000\baselineskip
Unidades de antitoxina* | |||||
Serie | UPC DE Cl. perfringens | Cl. perf. C | Cl. perf. D | Cl. novyi | Cl. sordellii |
3X1094-A | C= 600UPC | > 10,0 | 2,0 | 4-5 | > 8 |
7-VALENTE | D= 350UPC | ||||
3X1094-B | C= 900UPC | 10,0 | 2,0 | NA | NA |
7-VALENTE | D= 500UPC | ||||
3X1094-C | C= 1200UPC | 20,0 | 3,0 | 3,0 | > 8 |
7-VALENTE | D= 700UPC | ||||
3X1094-D | C= 1800UPC | 10,0 | 3,0 | NA | NA |
7-VALENTE | D= 1000UPC | ||||
3X1094-E | C= 1200UPC | 15,0 | 2,0 | 3,0 | 5-7 |
7-VALENTE | D= 700UPC | ||||
+ H. somnus | |||||
3X1094-F | C= 1200UPC | 20,0 | 2,0 | NA | NA |
7-VALENTE | (pH aj. a 6,0) | ||||
D= 700UPC | |||||
\hskip0.1cm * \begin{minipage}[t]{155mm} Necesario para la protección de los animales huésped: Cl. perf. C= 10 ua; Cl. perf. D= 2 ua; Cl. novyi= 0,5 ua; Cl. sordellii= 1,0 ua\end{minipage} | |||||
** NA= No analizado |
Este ejemplo muestra la incorporación de los
componentes antigénicos protectores procedentes de los organismos
clostridiales y H. somnus en una serie de tamaño comercial de
una vacuna y el análisis de la potencia de los componentes. Se
preparó un lote de 160 l de producto clostridial 6 valente que
contenía Cl. chauvoei, Cl septicum, Cl novyi, Cl
sordellii, Cl perfringens tipos C y D en las proporciones según
se indica en la Tabla 4 y se formuló como en el Ejemplo 2 con los
aislamientos de H. somnus 8025T y 14767 a una concentración
1X como se ha descrito en el Ejemplo 1A. Esta serie se analizó para
determinar la potencia de acuerdo con los requerimientos del APHIS
descritos anteriormente. Los resultados de estos análisis se
muestran en la Tabla 6. Todos los componentes antigénicos
protectores de la vacuna multicomponente clostridial
6-valente más H. somnus mostraron resultados
de potencia que superaron los requerimientos mínimos para la
protección de animales como determina el APHIS.
Organismo | Animal de prueba | Requerimiento para | Resultado de |
Tipo de prueba | una potencia satisfactoria | potencia (vivos/total) | |
Cl. chauvoei | Cobayas | Deben sobrevivir a la | 8/8 |
Provocación | provocación 7/8 cobayas | ||
Cl. septicum | Conejos | Deben sobrevivir a la | 8/8 |
Provocación | provocación 7/8 conejos | ||
Cl. novyi | Conejos | 0,5 unidades de antitoxina | 4,0 ua |
Serología | en el suero del conejo | ||
Cl. sordellii | Conejos | 1,0 unidades de antitoxina | > 10,0 ua |
Serología | en el suero del conejo | ||
Cl. perfringens tipo C | Conejos | 10,0 unidades de antitoxina | 25,0 ua |
Serología | en el suero del conejo | ||
Cl. perfringens tipo D | Conejos | 2,0 unidades de antitoxina | 3,0 ua |
Serología | en el suero del conejo | ||
H. somnus | Ratones | Deben sobrevivir a la | 20/20 |
Provocación | provocación 15 de 20 | ||
ratones |
Se combinaron siete componentes antigénicos
protectores clostridiales con el componente antigénico protector
procedente de H. somnus de acuerdo con los procedimientos
descritos en el Ejemplo 2 y analizados en los análisis de potencia
requeridos por el APHIS (como se ha descrito previamente) como una
dosis de 2,0 ml. Las especificaciones de la formulación real se
enumeran en la Tabla 7. Los resultados del análisis animal requerido
por el APHIS se muestran en la Tabla 8. Todos los componentes
antigénicos protectores superaron el análisis. Estos datos
demuestran que se pueden combinar 7 componentes antigénicos
protectores clostridiales con un componente antigénico protector
procedente de H. somnus o algún otro organismo no clostridial
para producir una vacuna que sea inmunogénicamente eficaz. De hecho,
existen pocas diferencias entre los resultados del análisis animal
producidos por la vacuna 6-valente más
H. somnus y los producidos por la vacuna 7-valente más H. somnus (compárense los resultados en las Tablas 6 y 8).
H. somnus y los producidos por la vacuna 7-valente más H. somnus (compárense los resultados en las Tablas 6 y 8).
Organismo | Cepa | Número de lote | Conc. | Cantidad por dosis de 2,0 ml |
Cl. chauvoei | 5677-2 | 264 | Ninguna | 0,400 ml |
Cl. septicum | 6750-2 | 296 | 6,6X | 0,121 ml |
Cl. novyi | 3047 | 165 | Ninguna | 0,167 ml |
Cl. sordellii | 4513 | 227 | Ninguna | 0,090 ml |
Cl. haemolyticum | 5982 | 194 | 7,15X | 0,280 ml |
Cl. perfringens tipo C/B | 3602 | 540 | Ninguna | 0,400 ml |
Cl. perfringens tipo D/B | 455E | 155 | Ninguna | 0,364 ml |
H. somnus | 8025T | N/A | 20X | 0,061 ml |
H. somnus | 14767 | N/A | 20X | 0,061 ml |
PBS adyuvado | N/A | N/A | N/A | 0,056 ml |
Organismo | Animal de prueba | Requerimiento para una | Resultado de potencia |
Tipo de prueba | potencia satisfactoria | 7-VALENTE + H. somnus | |
Cl. chauvoei | Cobayas | Deben sobrevivir a la | 8/8 |
Provocación | provocación 7/8 cobayas | Vivos/total | |
Cl. septicum | Conejos | Deben sobrevivir a la | 8/8 |
Provocación | provocación 7/8 conejos | Vivos/total | |
Cl. novyi | Conejos | 0,5 unidades de antitoxina | > 0,5 Unidades |
Serología | en el suero del conejo | de antitoxina | |
Cl. sordellii | Conejos | 1,0 unidades de antitoxina | > 1,0 Unidades |
Serología | en el suero del conejo | de antitoxina | |
Cl. perfringens tipo C | Conejos | 10,0 unidades de antitoxina | > 10,0 Unidades |
Serología | en el suero del conejo | de antitoxina | |
Cl. perfringens tipo D | Conejos | 2,0 unidades de antitoxina | > 2,0 Unidades |
Serología | en el suero del conejo | de antitoxina | |
Cl. haemolyticum | Cobayas | Deben sobrevivir a la | 8/8 |
Provocación | provocación 7/8 cobayas | Vivos/total | |
H. somnus | Ratones | Deben sobrevivir a la | 16/20 |
Provocación | provocación 14 de 20 | Vivos/total | |
ratones |
Este ejemplo ilustra las vacunas en las que los
virus se combinan con componentes clostridiales. El virus de la
rinotraqueítis infecciosa bovina vivo modificado (IBRV) se combinó
con una pluralidad de componentes antigénicos protectores
clostridiales (Cl. perfringens, tipos C y D).
Los componentes antigénicos protectores
clostridiales se prepararon y formularon de acuerdo con los
procedimientos comentados en el Ejemplo 1B. El IBRV utilizado para
este experimento fue uno que había sido modificado de forma que
produciría enfermedad si el virus vivo se inyectara en los animales.
Las vacunas preparadas a partir de tales virus se denominan vacunas
vivas modificadas. Dado que las vacunas vivas modificadas contienen
virus vivos como su componente antigénico protector, la eficacia de
tales vacunas depende de la cantidad de virus vivo contenido en
ellas. Mediante estudios de vacunación/provocación de ganado vacuno
se ha determinado que el virus de la rinotraqueítis infecciosa
bovina, cuando se prepara en una vacuna liofilizada, protege el
ganado vacuno si el título es de al menos 10^{4,2}DICT_{50}/ml.
El IRBV de referencia usado para este experimento se cultivó en
cultivo en frascos cilíndricos en células de riñón bovino, tras lo
cual los fluidos de recogida del IBRV se liofilizaron de forma que
el título posterior a la liofilización era 10^{7,0}/ml.
Para evitar la pérdida de eficacia de la vacuna,
la vacuna multicomponente que contiene los componentes antigénicos
protectores de Cl. perfringens, tipos C y D, y del IBRV se
formula en forma de una vacuna con dos recipientes. Un recipiente
contendrá el componente antigénico protector del IBRV vivo
modificado liofilizado y el segundo recipiente contendrá los
componentes antigénicos protectores de Cl. perfringens, tipos
C y D, líquidos adyuvados e inactivados. Al usar la vacuna, el
componente antigénico protector de Cl. perfringens, tipos C y
D, líquido se extrae de su recipiente con una jeringa y se inyecta
en el recipiente con el IBRV vivo modificado liofilizado, lo que
produce la rehidratación del IBRV liofilizado. Con el fin de
determinar sin un virus vivo modificado se ve negativamente afectado
por la rehidratación, se retitula la vacuna multicomponente
combinada. Si existe un efecto perjudicial (actividad viricida) de
la rehidratación del componente antigénico protector del virus,
será evidente en las primeras 2 horas tras la rehidratación. Por
tanto, todas estas vacunas vivas modificadas que se combinan con
componentes vivos no modificados se analizan y superan un análisis
de actividad virucida. El APHIS define la actividad viricida como la
pérdida de más de 0,7 logs del título vírico en 2 horas tras la
rehidratación del componente vírico. Por tanto se consideraría que
cualquier vacuna multicomponente en la que el componente antigénico
protector vírico pierda más de 0,7 logs del título vírico en 2 horas
tras la rehidratación mediante el diluyente no ha superado la prueba
de actividad viricida.
Se prepararon y formularon varias formulaciones
de la vacuna multicomponente de 3 –valente que contenían Cl.
perfringens tipos C y D y IBRV. En cada una de estas
formulaciones se llevó a cabo una prueba de actividad viricida
requerida por el APHIS. Las características específicas de la
formulación de las combinaciones y los resultados de las pruebas de
actividad viricida se muestran en la Tabla 9. Es evidente que todas
las formulaciones, incluso aquéllas que contienen Cl.
perfringens tipos C y D no purificados eran aceptables y no
mostraban actividad viricida. Por tanto, se ha demostrado que se
puede añadir una pluralidad de componentes antigénicos protectores
clostridiales a los componentes antigénicos protectores del virus
sin causar un efecto perjudicial cuando se prepara de acuerdo con
los procedimientos descritos en la presente memoria descriptiva. Más
específicamente, no se produjeron indicaciones contrarias a que los
componentes antigénicos protectores clostridiales o adyuvantes o
combinaciones de los mismos sean virucidas o a que existía una
interferencia entre los componentes antigénicos protectores
clostridiales y los componentes antigénicos protectores del
virus.
Nº de serie | Cl. perfringens tipo C | Cl.perfringens tipo D | Título de IBRV | IBRV (cambio | ||
Analizado como | tras la REHID. | log en el título) | ||||
una dosis de 20 ml | ||||||
Cantidad | UPC | Cantidad | UPC | |||
de purif. | de purif. | |||||
12X894-A | Toxoideno | 600 | Toxoide | 400 | 10^{7,5} | +0,5 |
sin células | sin células | |||||
purif. | no purif. | |||||
12X894-B | Toxoide | 1200 | Toxoide | 700 | 10^{7,0} | 0,0 |
sin células | sin células | |||||
no purif. | no purif. | |||||
12X894-C | Toxoide | 600 | Toxoide | 400 | 10^{7,0} | 0,0 |
sin células | sin células | |||||
purif. | purif. | |||||
12X894-D | Toxoide | 900 | Toxoide | 550 | 10^{6,9} | -0,1 |
sin células | sin células | |||||
purif. | purif. | |||||
12X894-E | Toxoide | 1200 | Toxoide | 700 | 10^{6,7} | -0,3 |
sin células | sin células | |||||
purif. | purif. | |||||
Nota: el título de referencia para el IBRV rehidratado con diluyente estéril fue 10^{7,0} |
Los tipos C y D de Cl. perfringens de las
vacunas multicomponente anteriores también se analizaron para
determinar la potencia con el fin de asegurar que el virus no poseía
un efecto perjudicial sobre los componentes antigénicos protectores
clostridiales. Los resultados del análisis clostridial se muestran
en la Tabla 10. Se encontró que los componentes antigénicos
protectores clostridiales no se veían afectados de forma perjudicial
por el componente vírico. Aparentemente, la purificación mejoró la
potencia de los componentes antigénicos protectores clostridiales,
como lo hace la adición de antígeno. Esto se puso de manifiesto por
UPC superiores que producían unidades de antitoxina en conejos más
elevadas. Este ejemplo muestra que los componentes antigénicos
protectores clostridiales y los componentes antigénicos protectores
víricos se pueden combinar con éxito para producir vacunas
multicomponente eficaces.
Nº de serie | Descripción | Cl. perf. tipo C | Cl. perf. tipo D | Conejos | |
UPC | UPC | ||||
Unidades | Antitoxina | ||||
Cl. perfringens | Cl. perfringens | ||||
tipo C | tipo D | ||||
12X894-A | Toxoide sin | 600 | 400 | 20-30 | 3-4 |
células no | |||||
purificado | |||||
12X894-B | Toxoide sin | 1200 | 700 | 20-30 | 4-5 |
células no | |||||
purificado | |||||
12X894-C | Toxoide sin | 600 | 400 | 30-40 | > 5 |
células | |||||
purificado | |||||
12X894-D | Toxoide sin | 900 | 550 | 40-60 | 5-6 |
células | |||||
purificado | |||||
12X894-E | Toxoide sin | 1200 | 700 | 30-40 | > 6 |
células | |||||
purificado |
Este ejemplo muestra que una combinación mayor
de componentes antigénicos protectores víricos y componentes
antigénicos protectores clostridiales podía prepararse con éxito en
una formulación de dosis baja. Se prepararon varias preparaciones de
componentes antigénicos protectores de Cl. perfringens tipos
C y D como se ha descrito en el Ejemplo 1B y se combinaron con IBRV
modificado vivo, el virus de la diarrea vírica bovina (BVDV) vivo
modificado, el virus de la parainfluenza tipo 3 (PI_{3}) vivo
modificado y el virus sincitial respiratorio bovino vivo modificado
(BRSV). Los cuatro componentes antigénicos protectores víricos vivos
modificados se prepararon mediante técnicas conocidas en la técnica.
Como parte de la preparación se determinó el efecto perjudicial de
los componentes antigénicos protectores clostridiales en cualquiera
de los componentes antigénicos protectores víricos vivos
modificados. Por tanto, la prueba de la actividad viricida requerida
por el APHIS se llevó a cabo en las diversas vacunas
multicomponente. Dado que las vacunas clostridiales históricamente
contienen formaldehído residual como conservante y dado que se sabe
que el formaldehído puede poseer un efecto perjudicial sobre los
virus vivos modificados, parte de este experimento implicaba añadir
a las formulaciones cantidades conocidas de formaldehído para
determinar las cantidades máximas permitidas de este conservante. La
Tabla 11 enumera las diferencias en la formulación y los resultados
de las pruebas de actividad viricida para los cuatro componentes
antigénicos protectores víricos. Los resultados indican que los
componentes antigénicos protectores clostridiales son algo
viricidas, en especial para el IBRV y el BVDV. Además,
concentraciones mayores de formaldehído reducen de forma
significativa los títulos de estos dos virus, mientras que el BRSV y
el PI_{3}V se ven afectados de forma adversa únicamente por el
nivel más elevado de formaldehído. No obstante, es evidente que tal
combinación de componentes antigénicos protectores clostridiales y
componentes antigénicos protectores víricos vivos modificados sería
comercialmente viable. Este experimento también demuestra que puede
no requerirse la purificación de los componentes antigénicos
protectores clostridiales.
Serie | Descripción | Título de IBRV/ | Título de BVDV/ | Título de PI3/ | Título de BRSV/ |
cambio log en | cambio log en | cambio log en | cambio log en | ||
el título | el título | el título | el título | ||
4X1594-A | Cl. perfringens | 10^{7,6} | 10^{6,6} | 10^{7,0} | 10^{5,9} |
tipos C y D, NO | -0,1* | -0,8 | -0,3* | -0,0* | |
PURIF. Form. al 0,1% | |||||
4X1594-B | Cl. perfringens | 10^{7,1} | 10^{6,9} | 10^{7,3} | 10^{5,8} |
tipos C y D, NO | -0,6* | -0,5* | -0,0* | -0,1* | |
PURIF. Form. al 0,1% | |||||
4X1594-C | Cl. perfringens | 10^{6,9} | 10^{6,0} | 10^{6,9} | 10^{5,7} |
tipos C y D, NO | -0,8 | -1,4 | -0,4* | -0,2* | |
PURIF. Form. al 0,17% | |||||
4X1594-D | Cl. perfringens | 10^{6,6} | 10^{5,7} | 10^{6,9} | 10^{5,7} |
tipos C y D, NO | -1,1 | -1,7 | -0,4* | -0,2* | |
PURIF. Form. al 0,25% | |||||
4X1594-E | Cl. perfringens | 10^{6,0} | 10^{5,9} | 10^{6,3} | 10^{5,2} |
tipos C y D, NO | -1,7 | -1,5 | -1,0 | -0,7* | |
PURIF. Form. al 0,32% | |||||
4X1594-F | Cl. perfringens | 10^{7,0} | 10^{6,8} | 10^{7,5} | 10^{5,7} |
tipos C y D, NO | -0,7* | -0,6* | +0,2* | -0,2* | |
PURIF. sin células | |||||
Form. al 0,05% | |||||
Títulos de los virus de referencia 10^{7,7} 10^{7,4} 10^{7,3} 10^{5,9} | |||||
FORM.= Formaldehído |
Este ejemplo ilustra la seguridad de las vacunas
de la invención. Con el fin de mostrar que las vacunas
multicomponente de dosis baja descritas son realmente más seguras
para animales y no producirían una reactividad animal significativa,
incluidas lesiones en el punto de inyección (como se suele observar
con los productos actuales de combinación clostridial de 5,0 ml de
dosis que existen en el mercado) se llevaron a cabo varios estudios
de seguridad en campo. EL primer estudio implicó una comparación de
puntos de inyección de ganado vacuno al que se había inyectado por
vía subcutánea una dosis de 5,0 ml de producto clostridial
convencional 6-valente o una dosis de 2,0 ml de
vacuna multicomponente que comprende componentes antigénicos
protectores procedentes de 6 organismos clostridiales (vacuna
clostridial 6-valente) preparados de acuerdo con los
procedimientos descritos en la presente memoria descriptiva.
Dos fuentes de ganado vacuno de un año se
asignaron al azar a grupos de tratamiento de 54 cabezas cada uno. A
un grupo se administró por vía subcutánea la vacuna clostridial
6-valente a una dosis de dos mililitros (formulada
como en el Ejemplo 2) y al otro grupo se administró por vía
subcutánea vacunas 6-valentes de 5,0 ml de dosis
formuladas mediante procedimientos convencionales pero que contenían
el adyuvante carbopol modificado. El ganado vacuno estuvo mezclado
durante todo el ensayo. Las evaluaciones de los sitios de inyección
se realizaron los días 7, 21, 49 y 95 días después de la inyección.
Los resultados se muestran en las Figuras 1 y 2. El día 7, todos los
animales presentaban una respuesta palpable en el punto de inyección
en ambos grupos. Los animales que recibieron la dosis de 2,0 ml de
vacuna multicomponente presentaban lesiones significativamente más
pequeñas que los animales que recibieron la dosis de 5,0 ml del
producto convencional (p= < 0,0001). Esta diferencia continuó los
días 21, 49 y 95. En el momento del sacrificio (95 días) había un
número significativamente menor (p= < 0,001) de vacunados con la
dosis de 2,0 ml con lesiones (3,5%) en comparación con los vacunados
con la dosis de 5,0 ml con lesiones (30%). Además, los vacunados con
la dosis de 2,0 ml presentaban lesiones consistentemente más
pequeñas en los puntos de inyección.
En el segundo estudio de seguridad en campo, los
terneros con una historia conocida de inyección se usaron para
evaluar la incidencia y la duración de las lesiones en el punto de
inyección en cadáveres de animales a los que se había inyectado por
vía intramuscular. Los terneros eran de edad de marcaje y de
destete. Para el estudio se seleccionaron cuarenta y dos terneros
machos y 42 terneros hembras, de historial conocido, localizado en
Colorado State University. Estos terneros no habían recibido
inyecciones antes del comienzo del ensayo y se identificaron
individualmente usando etiquetas de plástico en las orejas y se
asignaron al azar a un grupo de tratamiento con un producto.
Mediante una aguja de 2,54 cm, de calibre 18 se administró en el
momento del marcaje en el músculo semimembranoso (en la localización
en el interior del corte redondo entre la grupa y la pata) una dosis
de 5,0 ml de producto clostridial 6-valente
convencional o una dosis de 2,0 ml de vacuna multicomponente
clostridial 6-valente preparados mediante los
procedimientos de esta invención. Los animales se vacunaron con las
mismas vacunas en el momento del destete. Sin embargo, las
inyecciones se administraron en el bíceps femoral (parte superior y
los músculos medios del glúteo (localización la parte superior
superior del cuarto trasero) usando una aguja de 3,81 cm, de calibre
16. Los terneros se trataron desde el nacimiento hasta el
sacrificio. Tras el destete, los animales fueron alimentados con una
dieta de finalización típica. Los terneros se marcaron
aproximadamente a los 1,5 meses de edad, se destetaron a los 6,5
meses de edad y se sacrificaron a los 14 meses de edad. En el
momento del sacrificio, el 82,7% del ganado vacuno fue de calidad
choice o mejor. Tras la terminación de la fase de finalización, los
novillos se sacrificaron usando procedimientos convencionales. Tras
el proceso de sacrificio se recolectaron el corte desde la parte
superior del cuarto trasero y los cortes redondos internos
subprimales. De un total de 84 cabezas, tras el sacrificio y
fabricación en la planta de envasado se recolectaron 160 cortes
redondos internos y 159 de la parte superior de los cuartos
traseros. Los cortes se sometieron a evaluación, disección en tiras
de 2,54 cm y a observación para determinar la presencia de lesiones
en el punto de inyección. En las Tablas 12, 13 y 14 se presentan los
resultados que muestran la incidencia de las lesiones, la
distribución de las lesiones mediante puntuación y la cantidad de
recortes requerida para eliminar las lesiones.
Dosis de vacuna | Incidencia de las lesiones | |||
6-VALENTE | ||||
Número | Marcaje | Número | Destete | |
5,0 ml | 38 de 41 | 92,7% | 31 de 39 | 79,5% |
2,0 ml | 29 de 40 | 72,5% | 19 de 41 | 46,3% |
\vskip1.000000\baselineskip
Tipo de lesión | 5,0 ml de dosis clostridial 6-VALENTE | 2,0 ml de dosis clostridial 6-VALENTE | ||
VAC. en el marcaje | Vac. en el destete | Vac. en el marcaje | Vac. en el destete | |
Lesión callosa | 33 | 27 | 22 | 19 |
Lesión limpia | 5 | 4 | 7 | 0 |
Lesión mineralizada | 0 | 0 | 0 | 0 |
Lesión con nódulos | 0 | 0 | 0 | 0 |
Lesiones con fluido | 0 | 0 | 0 | 0 |
VAC= Vacunación |
Dosis de vacuna | Cantidad de recortes para eliminar la lesión | |||
6-VALENTE | ||||
Número de | Lesiones cuando | Número de | Lesiones cuando | |
terneros | la vac. se realiza | terneros | la vac. se realiza | |
en el marcaje | en el destete | |||
5,0 ml | 38 | 86,0 | 31 | 69,4 |
de convencional | ||||
2,0 ml | 29 | 48,8 | 19 | 30,3 |
Estos resultados indican que una dosis de 2,0 ml
de la vacuna multicomponente clostridial 6-valente
de la invención era menos reactiva en ternero que una dosis de 5,0
ml de producto clostridial 6-valente de tecnología
convencional. La incidencia de lesiones fue significativamente menor
(p= <0,05) para el grupo tratado con 2,0 ml que para el grupo
tratado con 5,0 ml cuando la administración se produjo en los
momentos del marcaje y del destete. Las manchas resultantes del uso
de la vacuna de 5,0 ml del producto clostridial también necesitaron
más recortes (p= < 0,05) para eliminar las lesiones que en el
caso de aquéllas en el grupo tratado con 2,0 ml.
En el último ensayo de seguridad en campo, se
preparó una vacuna a dosis de 2,0 ml que contenía 6 componentes
antigénicos protectores clostridiales combinados con componentes
antigénicos protectores procedentes de H. somnus de acuerdo
con los procedimientos descritos en el Ejemplo 2 y seis veterinarios
la administraron a 1.528 terneros en cinco estados. El ensayo en
campo se realizó desde noviembre de 1994 hasta enero de 1995. La
vacuna se administró a través de las vías normales de administración
para el rebaño e incluyó las vías intramuscular y subcutánea. Se
pidió a los veterinarios que observaran a los terneros para
determinar la aparición de reacciones y/o lesiones en el punto de
la inyección. Al final del ensayo ninguno de los veterinarios
participantes observó reacciones locales o sistémicas desfavorables
significativas.
Como resultado de estos estudios de seguridad en
campo, en especial el estudio final que implicó una evaluación en
campo verdadera de una producción de tamaño comercial en serie, se
ha demostrado que se puede producir comercialmente a un volumen de
dosis inferior a 3,0 ml una vacuna multicomponente que contenga
componentes antigénicos protectores de al menos 6 organismos
clostridiales, componentes antigénicos protectores de al menos un
organismo no clostridial tal como una bacteria gramnegativa como
H. somnus y un adyuvante tal como carbopol, e inyectar con
seguridad para proteger al animal en condiciones de campo.
Claims (16)
1. Una vacuna multicomponente para
rumiantes que comprende una combinación segura e inmunogénicamente
eficaz de un componente antigénico protector procedente de un
organismo clostridial, un componente antigénico protector procedente
de un organismo no clostridial y un adyuvante, en la que la vacuna
se encuentra en un volumen de dosis baja de 3,0 ml o menos y en la
que el adyuvante se selecciona del grupo compuesto por un polímero,
un copolímero de bloque, un aceite en agua, un agua en aceite,
Al(OH)_{3}, AlPO_{3} y extracto de una pared
celular bacteriana, un liposoma, Quil A y una combinación de los
mismos.
2. La vacuna de acuerdo con la
reivindicación 1, en la que el organismo clostridial se selecciona
del grupo compuesto por Cl. chauvoei, Cl. septicum,
Cl. novyi, Cl. perfringens tipo C, Cl.
perfringens tipo D, Cl. sordellii, Cl.
haemolyticum y Cl. tetani.
3. La vacuna de acuerdo con la
reivindicación 1, en la que el organismo no clostridial se
selecciona del grupo compuesto por una bacteria gramnegativa, una
bacteria grampositiva, un virus, un parásito y una rickettsia.
4. La vacuna de acuerdo con la
reivindicación 3, en la que el organismo gramnegativo se selecciona
del grupo compuesto por H. somnus, M. bovis, P.
haemolytica, P. multocida, E. coli, S. Typhimurium, Leptospira
spp. y C. foetus.
5. La vacuna de acuerdo con la
reivindicación 4, en la que el organismo gramnegativo es H.
somnus.
6. La vacuna de acuerdo con la
reivindicación 4, en la que el organismo gramnegativo es M.
bovis.
7. La vacuna de acuerdo con la
reivindicación 3, en la que el virus se selecciona del grupo
compuesto por el virus de la rinotraqueítis bovina infecciosa, el
virus de la diarrea vírica bovina, el virus de la parainfluenza 3
(PI-3), el virus respiratorio sincitial bovino y una
combinación de los mismos.
8. La vacuna de acuerdo con la
reivindicación 3, en la que el parásito se selecciona del grupo
compuesto por Neospora spp., Tritrichimonas foetus y
Cryptosporidium bovis.
9. La vacuna de acuerdo con la
reivindicación 1, en la que el componente antigénico protector del
organismo clostridial o no clostridial deriva de un miembro
seleccionado del grupo compuesto por un cultivo bacteriano entero,
un cultivo vírico entero, un toxoide sin células, un toxoide
purificado y una subunidad.
10. La vacuna de acuerdo con la
reivindicación 1, en la que el adyuvante es un polímero o un
copolímero de bloque.
11. La vacuna de acuerdo con la
reivindicación 1, en la que el polímero es un carbopol
modificado.
12. La vacuna de acuerdo con la
reivindicación 1, en la que el componente antigénico protector
deriva de 6 organismos clostridiales.
13. La vacuna de acuerdo con la
reivindicación 12, en la que los 6 organismos clostridiales se
seleccionan del grupo compuesto por Cl. chauvoei, Cl.
septicum, Cl. novyi, Cl. perfringens tipo C,
Cl. perfringens tipo D, Cl. haemolyticum y Cl.
sordellii.
14. La vacuna de acuerdo con la
reivindicación 1, en la que el componente antigénico protector del
organismo clostridial deriva de 7 organismos clostridiales.
15. La vacuna de acuerdo con la
reivindicación 5, en la que los 7 organismos clostridiales se
seleccionan del grupo compuesto por Cl. chauvoei, Cl.
septicum, Cl. novyi, Cl. perfringens tipo C,
Cl. perfringens tipo D, Cl. sordellii, Cl.
haemolyticum y Cl. tetani.
16. Un procedimiento para preparar una
vacuna de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende las etapas
de:
i) identificar el componente antigénico
protector de cada uno de los organismos mediante procedimientos
in vivo o in vitro,
ii) cuantificar los componentes antigénicos
protectores usando ensayos de cuantificación de antígeno para
proporcionar el componente antigénico protector en una cantidad
suficiente para proporcionar una vacuna protectora con la menor masa
antigénica,
iii) identificar componentes de los organismos
que contienen antígenos perjudiciales mediante el uso de ensayos de
cuantificación de antígeno y pruebas de la reacción animal,
iv) purificar los componentes antigénicos
protectores que contienen antígenos perjudiciales para eliminar los
antígenos perjudiciales,
v) seleccionar para cada organismo que requiere
inactivación, un agente de inactivación eficaz que mata al organismo
sin desnaturalizar el componente antigénico protector,
vi) seleccionar un adyuvante eficaz para cada
componente antigénico que potencia la respuesta inmunitaria sin
causar reacción animal inaceptable,
vii) adyuvar individualmente los componentes
antigénicos protectores que requieren tal adyuvación individual,
y
viii) mezclar todos los componentes antigénicos
protectores en una serie.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US412676 | 1995-03-29 | ||
US08/412,676 US6743430B1 (en) | 1995-03-29 | 1995-03-29 | Multicomponent vaccine containing clostridial and non-clostridial organisms in a low dose |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2262147T3 true ES2262147T3 (es) | 2006-11-16 |
Family
ID=23633975
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES96104209T Expired - Lifetime ES2262147T3 (es) | 1995-03-29 | 1996-03-16 | Una vacuna multicomponente que contiene organismos clostridiales y no clostridiales en una dosis baja. |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US6743430B1 (es) |
EP (1) | EP0734731B1 (es) |
AR (1) | AR002725A1 (es) |
AU (1) | AU708878B2 (es) |
BR (1) | BR9601193A (es) |
CA (1) | CA2172180C (es) |
DE (1) | DE69636001T2 (es) |
ES (1) | ES2262147T3 (es) |
HU (1) | HUP9600781A3 (es) |
PT (1) | PT734731E (es) |
ZA (1) | ZA962479B (es) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6743430B1 (en) * | 1995-03-29 | 2004-06-01 | Richard E. Parizek | Multicomponent vaccine containing clostridial and non-clostridial organisms in a low dose |
DE69729839T2 (de) * | 1996-11-12 | 2005-07-21 | Pfizer Inc. | Attenuierter lebender Neospora Impfstoff |
BR9803232A (pt) | 1997-08-26 | 2000-01-11 | Pfizer Prod Inc | Vaicna de neospora. |
FR2768747B1 (fr) * | 1997-09-19 | 2000-12-01 | Pasteur Institut | Acides nucleiques, cellules recombinantes, et procede de preparation de compositions immunogenes |
EP0924295A3 (en) * | 1997-12-04 | 2001-05-16 | Pfizer Products Inc. | DNA encoding neospora dihydrofolate reductase-thymidylate synthase |
JP5014413B2 (ja) * | 2006-03-30 | 2012-08-29 | エンブレックス・インコーポレイテッド | 家禽のワクチン接種のための方法及び組成物 |
WO2011044576A2 (en) * | 2009-10-09 | 2011-04-14 | Children's Medical Center Corporation | Selectively disrupted whole-cell vaccine |
DK2493498T3 (en) | 2009-10-30 | 2017-05-08 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Purification of Staphylococcus aureus type 5 and type 8 capsule saccharides |
JP5917682B2 (ja) | 2011-04-22 | 2016-05-18 | ワイス・エルエルシー | 変異体クロストリジウム・ディフィシル毒素に関する組成物およびその方法 |
BR122016023101B1 (pt) | 2012-10-21 | 2022-03-22 | Pfizer Inc | Polipeptídeo, composição imunogênica que o compreende, bem como célula recombinante derivada de clostridium difficile |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3790665A (en) * | 1968-02-23 | 1974-02-05 | Haver Lockhart Labor Inc | Injectable adjuvant,method of preparing same and compositions including such adjuvant |
US3925544A (en) | 1971-07-12 | 1975-12-09 | Univ Southern Illinois | Bovine vaccines and methods of making and using same |
US3920811A (en) * | 1972-12-22 | 1975-11-18 | Cutter Lab | Adjuvant compositions |
SU627611A1 (ru) | 1977-09-30 | 1980-02-05 | В.П. Землякова | Вакцинный препарат в.п. земл ковой против клостридиозов животных и птиц |
ZA803063B (en) | 1979-05-31 | 1981-05-27 | Ici Australia Ltd | Process |
PT692974E (pt) * | 1993-03-29 | 2003-09-30 | Pfizer | Vacinas clostridiais com multiplos componentes usando adjuvantes de saponina |
US6743430B1 (en) * | 1995-03-29 | 2004-06-01 | Richard E. Parizek | Multicomponent vaccine containing clostridial and non-clostridial organisms in a low dose |
-
1995
- 1995-03-29 US US08/412,676 patent/US6743430B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-03-16 EP EP96104209A patent/EP0734731B1/en not_active Revoked
- 1996-03-16 ES ES96104209T patent/ES2262147T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-03-16 PT PT96104209T patent/PT734731E/pt unknown
- 1996-03-16 DE DE69636001T patent/DE69636001T2/de not_active Revoked
- 1996-03-20 CA CA2172180A patent/CA2172180C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-03-22 AU AU48259/96A patent/AU708878B2/en not_active Ceased
- 1996-03-26 AR ARP960101923A patent/AR002725A1/es unknown
- 1996-03-28 HU HU9600781A patent/HUP9600781A3/hu unknown
- 1996-03-28 ZA ZA962479A patent/ZA962479B/xx unknown
- 1996-03-29 BR BR9601193A patent/BR9601193A/pt not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-12-29 US US10/748,524 patent/US20040141986A1/en not_active Abandoned
-
2010
- 2010-01-08 US US12/684,335 patent/US20100111997A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
BR9601193A (pt) | 1998-01-06 |
CA2172180C (en) | 2012-02-21 |
EP0734731B1 (en) | 2006-04-05 |
HU9600781D0 (en) | 1996-05-28 |
EP0734731A2 (en) | 1996-10-02 |
AU4825996A (en) | 1996-10-10 |
PT734731E (pt) | 2006-07-31 |
US20100111997A1 (en) | 2010-05-06 |
US6743430B1 (en) | 2004-06-01 |
AR002725A1 (es) | 1998-04-29 |
DE69636001D1 (de) | 2006-05-18 |
DE69636001T2 (de) | 2006-10-26 |
ZA962479B (en) | 1996-10-03 |
US20040141986A1 (en) | 2004-07-22 |
HUP9600781A2 (en) | 1996-12-30 |
AU708878B2 (en) | 1999-08-12 |
HUP9600781A3 (en) | 2002-05-28 |
EP0734731A3 (en) | 1998-03-11 |
CA2172180A1 (en) | 1996-09-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2688922T3 (es) | Composiciones inmunogénicas que comprenden Lawsonia intercellularis | |
US20100111997A1 (en) | Multi component vaccine containing clostridial and non-clostridial organisms in a low dose | |
ES2112274T5 (es) | Vacuna contra la pneumonia en cerdos y metodo para la preparacion de la misma. | |
KR100874119B1 (ko) | 개선된 마이코플라스마 하이오뉴모니애 박테린 백신 | |
US10918711B2 (en) | Composition comprising antigens and a mucosal adjuvant and a method for using | |
US20210030862A1 (en) | A vaccine for protection against streptococcus suis | |
CA2390613A1 (en) | Vaccines for mycoplasma bovis and methods of use | |
US6022728A (en) | Method for producing a bacterial vaccine and novel vaccines produced thereby | |
CA3134948A1 (en) | A vaccine for protection against streptococcus suis | |
US11696944B2 (en) | Vaccine for protection against Streptococcus suis | |
Bellinzoni et al. | Efficacy of an inactivated oil-adjuvanted rotavirus vaccine in the control of calf diarrhoea in beef herds in Argentina | |
US20100062025A1 (en) | Use of Clostridium perfringens type C bacterium for the manufacture of a vaccine | |
JP3178720B2 (ja) | パスツレラ・ムルトシダのトキソイドワクチン | |
US20240197851A1 (en) | A vaccine for protection against streptococcus suis serotype 9, sequence type 16 | |
RU2462263C2 (ru) | Применение бактерии clostridium perfringens типа с для производства вакцины | |
Gough et al. | Lactogenic immunity to transmissible gastroenteritis virus induced by a subunit immunogen | |
RU2777065C1 (ru) | Комбинированная вакцина | |
US11154605B2 (en) | Vaccine comprising Clostridium toxoids | |
RU2112544C1 (ru) | Вакцина против сибирской язвы и эмфизематозного карбункула живая ассоциированная и способ профилактики этих заболеваний | |
CA3022006A1 (en) | A composition comprising antigens and a mucosal adjuvant and a method for using | |
ur REHMAN | HEMORRHAGIC SEPTICEMIA-MASTITIS VACCINE | |
WO2020043637A1 (en) | Combination vaccine |