DE69128361T2

DE69128361T2 - Impfstoff gegen die pneumonie bei schweinen und verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE69128361T2
Application number: DE69128361T
Authority: DE
Inventors: Krishnaswamy Dayalu; Joseph Frantz; Richard Kemmy; Richard Peetz; David Roberts; Leroy Swearingin
Original assignee: American Cyanamid Co
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 1990-05-29
Filing date: 1991-05-24
Publication date: 1998-07-16
Anticipated expiration: 2011-05-25
Also published as: ES2112274T5; EP0597852A4; AU1766295A; EP0597852A1; DK0597852T3; AU7907891A; GR3025937T3; WO1991018627A1; DK0597852T4; ES2112274T3; JPH05507484A; JP3187419B2; CA2082155A1; EP0597852B1; ATE160699T1; EP0597852B2; DE69128361D1; DE69128361T3; AU657907B2; CA2082155C

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Impfstoffe gegen durch Pathogene der Gattung Mycoplasma verursachte Infektionen, insbesondere Bacterine, die sich als prophylaktische Mittel zur Hemmung einer Infektion durch Mycoplasma, insbesondere Mycoplasma hyopneumoniae, eignen.

Technischer Hintergrund

Mycoplasma hyopneumoniae ist ein sehr verbreitetes Schweine-Atemwegs-Pathogen, das Mycoplasmapneumonie beim Schwein (MPS) verursacht. MPS tritt weltweit auf und wird als eine der häufigsten und ökonomisch bedeutendsten Schweinekrankheiten angesehen. Die Übertragung von M. hyopneumoniae erfolgt offensichtlich durch direkten Kontakt mit infizierten Ausscheidungen oder feinteiligen Tröpfchen des Atemwegs. Der Mikroorganismus ist als Primärpathogen im enzootischen Pneumonie-Komplex identifiziert worden. Nach Schätzungen verursacht diese Krankheit Kosten, die jährlich 100 Millionen $ übersteigen, hauptsächlich aufgrund ihrer nachteiligen Wirkungen auf die betroffenen Tiere.
Eine M. hyopneumoniae-Infektion führt zu einer chronischen Infektion, die einen bleibenden Husten ohne Auswurf und verkümmertes Wachstum verursacht, was bei Schweinen im "Wachstums- und Reife-Stadium", d.h. 6 Wochen oder älter, zu sichtbaren Krankheitssymptomen führt. Im Alter von 4 bis 6 Monaten kann bei dem infizierten Tier eine schwere Lungenschädigung und/oder der Tod eintreten. Da die meisten natürlich auftretenden MPS-Fälle Mischinfektionen sind, die Mycoplasmen, Bakterien, Viren und Parasiten umfassen, ist der Tod des Tieres meistens auf sekundäre bakterielle, virale oder andere pathogene Infektionen zurückzuführen.
In den 25 Jahren seit der 1965 gemachten Entdeckung, daß Mycoplasmen die Erreger der enzootischen Pneumonie sind, haben die Forscher verschiedene Möglichkeiten zur Bekämpfung und Behandlung dieser Krankheit sowie zur Entwicklung eines risikolosen und wirksamen Impfstoffes gegen Mycoplasma hyopneumoniae untersucht. Ein durch potentielle Impfstoffe bewirkter Schutz vor einer Infektion wird vorzugsweise durch die Verringerung der Anzahl von Läsionen aufweisenden Lungenlappen, die Verringerung des prozentualen Anteils von Läsionen aufweisenden Lungenlappen, die Verringerung der durchschnittlichen ermittelten Anzahl von Lungenläsionen, die Verringerung der ermittelten Anzahl mikroskopischer Läsionen und die Linderung einer M. hyopneumoniae-Infektion, die mit Hilfe eines Fluoreszenz-Antikörper-Tests ermittelt wird, bestimmt.
Mehrere untersuchte Impfstoffe haben keine optimalen Ergebnisse gezeitigt. Untersuchungen haben gezeigt, daß sich im Verlauf einer experimentell hervorgerufenen MPS eine starke Immunität entwickelte. Bei Verabreichung von pneumonischem Lungengewebe als Antigen werden die Tiere jedoch noch empfänglicher fur eine Infizierung. Es hat sich gezeigt, daß mit Formalin behandelte M. hyopneumoniae-Kulturen keine Schutzwirkug ausüben [vgl. z.B. auch C. A. Brandly et al. (Herausgeber), "Advances in Veterinary Science and Comparative Medicine", Bd. 17 (1973), Academic Press, NY, und darin aufgeführte Literaturstellen; R.F.W. Goodwin et al., A. Hyg. Camb. 67 (1969), 465). Es hat sich gezeigt, daß M. hyopneumoniae-Extrakte in Ether oder Natriumdodecylsulfat (SDS) und ein einem wiederholten Einfrierungs-Auftauungs- Vorgang unterworfenes Produkt signifikanten Schutz gegen eine Infizierung mit Lungenhomogenat bieten [K.M. Lam et al., Am. J. Vet. Res. 32 (1971), 1737].
G. Christianson et al., (Chemical Abstracts (1980), Abstract-Nr. 199756) offenbaren, daß es nicht durchweg gelang, mit binärem Ethylenimin Mycoplasma-Verunreinigungen in Seren zu inaktivieren. FR-A-2 073 358 offenbart polyvalente Impfstoffe und Verfahren für ihre Herstellung. Im Stand der Technik einschließlich FR-A-2 073 358 und Chemical Abstracts (1980), Abstract-Nr. 19975p ist kein Impfstoff-Bestandteil offenbart, der mit binärem Ethylenimin inaktiviertes M. hyopneumoniae in einer Dosierung von mindestens 5 x 10&sup8; CCU umfaßt, und in einem gegen M. hyopneumoniae geimpften Schwein eine Immunreaktion hervorrufen kann.
Bei Injektion in die Brustdrüse führten mit Ultraschall behandelte M. hyopneumoniae-Zellen in Tween 80 und Paraffinöl zu guten indirekten Hämagglutinations(IHA)-Titern in Blut, Kolostrum und in der Milch [S. Durisic et al., Acta Vet. Beograd) 25 (4) (1975), 189-194]. Es hat sich gezeigt, daß Präparate aus ganzen Zellen und zellfreie Überstände nur eine teilweise Schutzwirkung ausüben [R.F. Ross et al., Am. J. Vet. Res. 45 (10) (1984), 1899]. Plasmamembranen aus mittels Ultraschall aufgeschlossenen Zellen, denen Al&sub2;(OH)&sub3; oder Agarose als Adjuvans zugegeben worden war, boten guten passiven Schutz [M. Kobisch et al., Ann. Inst. Pasteur/Immunol. 138 (1987), 693-705].
Es zeigte sich auch, daß ein lebender avirulenter LKR-Stamm von M. hyopneumoniae bei Schweinen guten Schutz gegen eine Infektion mit einem virulenten M. hyopneumoniae-Stamm bot [L. C. Lloyd et al., Abstract 4593 in: Bacteriology und Bacterial Diseases, aus Australian Vet. J. 66 (1) (1989), 9-12].
Eine M. hyopneumoniae-Infektion wird derzeit z.T. mit verschiedenen Antibiotika-Klassen, wie Teracyclin. Lincomycin und Tiamulin, bekämpft. Antibiotika besitzen jedoch nur beschränkten therapeutischen Wert, weil sie die Etablierung einer Infektion nicht verhindern und sich nach Beendigung der Behandlung Lungenläsionen entwickeln können. Die Auswahl eines geeigneten Antibiotikums wird auch durch das Vorhandensein sekundärer Pathogene erschwert [R. Landon, Topics in Vet. Med. 1(1) (1990), 14-21].
Andere Verfarhensweisen, die derzeit zur Verminderung der Auswirkungen chronischer durch M. hyopneumoniae verursachte Atemwegskrankheiten verwendet werden, sind die Minimalkrankheits-Systeme, wie das schwedische System und das britische System und der ausschließliche Einsatz älterer Muttertiere zur Fortpflanzung. Empfohlen werden die Minimierung von Streß, optimale Betriebsbedingungen und Produktionssysteme, die die vollständige Zugabe und die vollständige Entnahme umfassen (all-in, all-out systems of produation).
Auf dem Fachgebiet besteht ein Bedarf an einem wirksamen Impfstoff gegen M. hyopneumoniae, der Schutz gegen eine M. hyopneumoniae-Infektion verleiht und die Erkrankungshäufigkeit und Sterblichkeit durch sekundäre Atemwegs- Pathogene, wie Pasteurella multocida, vermindert.

Zusammenfassung der Erfindung

Ein Aspekt der Erfindung betrifft eine Zusammensetzung, die sich zur Impfung von Schweinen gegen Mycoplasma hyopneumoniae eignet. Diese Zusammensetzung umfaßt inaktivierte M. hyopneumoniae-Organismen in einem pharmazeutisch verträglichen Medium, wobei die Organismen in einer Menge vorhanden sind, die ausreicht, in Schweinen eine immunologische Reaktion auszulösen, die Schutz gegen eine M. hyopneumoniae-Infektion bietet.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer Impfstoff-Zusammensetzung, die die vorstehend erwähnte inaktivierte M. hyopneumoniae-Zusammensetzuung in Kombination mit weiteren Impfstoff-Bestandteilen einschließlich eines oder mehrerer Bestandteile umfaßt, die nach Infektion mit P. multocida oder anderen für das Schwein infektiösen Erregern Schutz gegen Rhinitis atrophica bieten können. Solche Impfstoffe können immunogene Mengen eines oder mehrerer der folgenden Impfstoff-Bestandteile umfassen: ein stabiles, lösliches, zellfreies Toxoid von P. multocida, ein ganzes Pasteurella multocida-Bacterin mit zellgebundenem Toxoid, ein B. bronchiseptica-Bacterin oder einen Erysipelothrix rhusiopathiae-Bacterinextrakt, ein Actinobacillus pleuropneumoniae-Bacterin, ein Haemophilus parasuis-Bacterin und/ader virale Impfstoff-Bestandteile, wie von einem Pseudorabies-Virus. Den erfindungsgemäßen Impfstoff-Zusammensetzungen können auch andere herkömmliche Impfstoff-Bestandteile zugegeben werden. Noch ein anderer Aspekt der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Produktion der vorstehend beschriebenen Impfstoff-Bestandteile. Der M. hyopneumoniae-Impfstoffbestandteil wird über eine Reihe von Schritten hergestellt, umfassend die Vorbehandlung des Kulturmediums mit Ionenaustauscherharzen, wie Amberlite-Harz, die Erhöhung des Gehaltes der beimpften Kultur an gelöstem Sauerstoff auf 20 % bis 40 % und die Inaktivierung der Kultur mit einem ausgewählten Inaktivierungsmittel.
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Verfahren zur Erhöhung der Resistenz des Schweines gegen eine M. hyopneumoniae-Infektion, das die Verabreichung einer wirksamen Menge der erfindungsgemäßen Impfstoff- Zusammensetzungen an Schweine umfaßt.
Noch ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Verfahren zum Schutz von Schweinen gegen eine M. hyopneumoniae-Infektion und andere pathogene Infektionen, das die aufeinanderfolgende oder gleichzeitige Verabreichung einer wirksamen Menge des M. hyopneumoniae-Impfstoffes und eines oder mehrerer Impfstoffe umfaßt, die ein weiteres, z.B. aus den vorstehend genannten Pathogenen stammendes Antigen, enthalten.
Andere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung sind in der folgenden genauen Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beschrieben.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt Impfstoff-Bestandteile, Impfstoff-Formulierungen und Verfahren zu ihrer. Herstellung und Verwendung bei Schweinen zur Unterstützung bei der Vorbeugung einer M. hyopneumoniae-Infektion bereit. Die erfindungsgemäßen Impfstoff-Bestandteile und Impfstoffe verleihen Schutz gegen eine Infektion sowohl durch einen Wildtyp-Stamm als auch durch andere bekannte virulente Stämme von M. hyopneumoniae. Erfindungsgemäße Ausführungsformen können auch die durch sekundäre Atemwegs-Pathogene, wie Pasteurella multocida, hervorgerufene Erkrankungshäufigkeit und Sterblichkeit verringern.
Mycoplasma hyopneumoniae-Stämme, die sich zur Herstellung der erfindungsgemäßen Impfstoffe eignen, können aus Schweinen isoliert werden, die mit einem Wildtyp-Stamm oder anderen bekannten Stämmen infiziert sind, die beim Schwein Mycoplasmapneumonie verursachen. Für die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können sich auch andere bekannte, sowohl virulente als auch nicht-virulente M. hyopneumoniae-Stämme eignen. Nützliche Stämme können aus kommerziellen oder wissenschaftlichen Sammlungen, wie der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland, USA, bezogen werden.
Ein erfindungsgemäßer Impfstoff-Bestandteil kann hergestellt werden, indem ein ausgewählter M. hyopneumoniae-Anzuchtstamm in ein Medium überimpft wird, das das Wachstum von Mycoplasma, insbesondere M. hyopneumoniae, unterstützen kann. Ein ausgewähltes Kulturmedium kann Medien umfassen, die dem Fachmann zur Vermehrung von Mycoplasma bekannt sind, wie das in Freundt (vorstehend zitiert) beschriebene Medium und andere im Stand der Technik beschriebene Medien. Eine besonders wünschenswerte Formulierung für Medien zur Züchtung von M. hyopneumoniae ist nachstehend in Beispiel 1 beschrieben und umfaßt PPLO-Nährlösung, Hefe-Extrakt, hitzeinaktiviertes Serum, Cysteinhydrochlorid, Dextrose, ein Antibiotikum zur Hemmung von bakteriellem Wachstum und ein fakultatives Mittel, das Wachstum anzeigt und einer übermäßigen Veränderung des pH-Wertes vorbeugt, z.B. Phenolrot.
Vorzugsweise wird das ausgewählte Medium mit einem Anionen-Austauscherharz wie Amberlite (Chlorid-Form)-Harz vorbehandelt. Man nimmt an, daß dieser Schritt das Wachstum der Organismen verbessert, indem Hemmstoffe entfernt werden. Andere herkömmliche Verfahren wie Gelfiltration können sich in diesem Vorbehandlungsschritt auch als nützlich erweisen. Dieser Vorbehandlungsschritt wird vorzugsweise bei der Nährlösung angewandt, bevor andere Medienbestandteile zugegeben werden und die Beimpfung erfolgt. Die Behandlung mit dem Ionen-Austauscherharz kann ein bis vier Stunden in einer Menge von 500 g/10 Liter Nährlösung erfolgen.
Sobald das Medium vorbehandelt ist, wird es mit einer Suspension des ausgewählten M. hyopneumoniae-Stammes beimpft, vorzugsweise in einer Animpfdichte von 5 % - 20 %. Danach wird die Kultur bei einer Temperatur von etwa 30ºC bis 40ºC inkubiert. Bevorzugter ist ein Temperaturbereich von 35ºC bis 38ºC, wobei 37ºC besonders bevorzugt sind.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird der Gehalt der Kultur an gelöstem Sauerstoff auf eine Konzentration von 20 % bis 40 % Sättigung angehoben. Ein bevorzugter Sauerstoff-Gehalt der Kultur während der Inkubation liegt bei etwa 25 %. Kulturen, deren Gehalt an gelöstem O&sub2; größer als 20 % ist, erzeugen höhere Titer der Organismen. Eine Erhöhung des Gehaltes an gelöstem Sauerstoff wird mit Hilfe von auf dem Fachgebiet üblichen Mitteln erreicht, wie Belüftung mit steriler Luft und Rühren. Man nimmt an, daß durch diesen bestimmten Schritt bei der Züchtung des Impfstoff-Bestandteils die M. hyopneumoniae-Titer erhöht werden.
Der pH-Wert der Kultur wird bei einem neutralen bis schwach alkalischen Wert gehalten. Wünschenswerterweise wird der pH-Wert der Kultur bei 6,2 bis 7,9 gehalten. Ein bevorzugterer pH-Bereich liegt bei 7,0 ± 0,5. Der gewünschte pH- Wert kann im Bedarfsfall durch Zugabe von sterilem NaOH aufrechterhalten werden.
Die Kulturen werden 36 bis 168 Stunden inkubiert. vorzugsweise dauert der Inkubationszeitraum 36 bis 96 Stunden, bis ein Mindesttiter von 1 x 10&sup8; farbverändernden Einheiten (CCU) in flüssigem Titrationsmedium [A. W. Rodwell und R. H. Whitcomb, in: Methods in Mycoplasmology (Herausgeber Shmuel Razin und Joseph G. Tolley), Bd. 1, Abschnitt 14 (1983)] erreicht ist. Bevorzugter beträgt der Titer mindestens 5 x 10&sup8; CCU/ml und kann bis zu 5 x 10¹&sup0; CCU/ml betragen, wie mittels eines CCU- oder ELISA-Testes bestimmt.
Am Ende des Züchtungszeitraumes werden die Organismen durch Zugabe eines bekannten inaktivierenden Mittels inaktiviert. Ein solches bevorzugtes inaktivierendes Mittel ist binäres Ethylenimin (BEI). Andere inaktivierende Mittel können beispielsweise Formaldehyd oder Glutaraldehyd sein. Das inaktivierende Mittel wird in einer Menge von etwa 4,0 mM zugesetzt. Sobald das inaktivierende Mittel zugesetzt ist, wird die Kultur wiederum unter Rühren mindestens 24 Stunden inkubiert.
Das inaktivierende Mittel kann mit Hilfe herkömmlicher Mittel entfernt oder neutralisiert werden. Die Kultur wird wiederum mindestens 24 Stunden inkubiert, um die Neutralisierung des inaktivierenden Mittels abzuschließen. Sobald der Impfstoff-Bestandteil inaktiviert ist, kann er als Impfstoff zur Verabreichung an Tiere formuliert werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Impfstoff-Bestandteile, die sich in Kombination mit dem vorstehend beschriebenen M. hyopneumoniae-Impfstoff-Bestandteil verwenden lassen. Impfstoff-Bestandteile einschließlich inaktivierter Bacterine oder aufgereinigter Toxoide von einem oder mehreren Pathogenen, wie Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis und Ascaris-Larven, können auch zusammen mit den vorstehend beschriebenen Impfstoff-Bestandteilen in Kombinations-Impfstoffen oder bei therapeutischen Verfahren eingesetzt werden, die eine schrittweise oder gleichzeitige gemeinsame Verabreichung umfassen. Ein solcher Kombinations-Impfstoff kann durch Mischen einer immunogenen Menge des vorstehend beschriebenen inaktivierten M. hyopneumoniae und einer immunogenen Menge eines Bacterins oder Toxoids eines anderen Fathogens mit geeigneten Adjuvantien und physiologischen Vehikeln zur Verabreichung per injektionemn an Säuger hergestellt werden. Bei einer Therapie, die eine gemeinsame Verabreichung von Impfstoffen umfaßt, können ein oder mehrere der vorstehend erwähnten Antigene eingesetzt werden, die als einzelne Impfstoffe formuliert sind. Der M. hyopneumoniae-Impfstoff und weitere ausgewählte Impfstoffe können über die gleichen Verabreichungswege verabfolgt werden, wobei zur Verabreichung unterschiedliche Stellen verwendet werden. Die Verabreichung kann schrittweise oder gleichzeitig erfolgen.
Bevorzugte Ausführungsformen solcher Kombinations impfstoffe oder solcher Therapien, die die gemeinsame Verabreichung von Impfstoffen beinhalten, umfassen immunogene Mengen eines oder mehrerer der folgenden Impfstoff-Bestandteile: ein stabiles, lösliches, zellfreies Toxoid von P. multocida, ein ganzes Pasteurella multocida-Bacterin mit zellgebundenem Toxoid, ganze P. multocida-Zellen vom Typ A und Typ D, ein B. bronchiseptica-Bacterin oder einen Erysipelothrix rhusiopathiae-Bacterinextrakt.
Zusätzliche Impfstoff-Kombinationen mit dem erfindungsgemäßen M. hyopneumoniae-Bestandteil können die Antigene Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis und Pseudorabies-Virus umfassen. Diese zusätzlichen Bestandteile eignen sich zur Impfstoff-Formulierung oder Therapie für entwöhnte Schweine, vorzugsweise zur Verabreichung frühestens im Alter von 3 bis 6 Wochen.
Beobachtungen im Falle von mindestens einer Infizierung ergaben, daß bei der gemeinsamen Verabreichung von einem den M. hyopneumoniae-Impfstoff-Bestandteil enthaltenden Impfstoff und einem zweiten Impfstoff, der einen vorstehend erwähnten p. multocida Impfstoff-Bestandteil enthielt, der M. hyopneumoniae-Impfstoff keine immunsupprimierenden Wirkungen bei den Tieren hervorrief, wie mittels Serokonversions-Reaktionen bestimmt.
Erfindungsgemäße Impfstoffe können als pharmazeutische Zusammensetzungen hergestellt werden, die eine wirksame immunogene Menge des inaktivierten Organismus als Wirkstoff in einem nicht-toxischen und sterilen pharmazeutisch verträglichen Träger enthalten. Ein solcher Impfstoff kann den vorstehend beschriebenen inaktivierten Impfstoff-Bestandteil umfassen, der mit Konservierungsmitteln und Emulgiermitteln nach eigener Wahl gemischt ist.
Alternativ oder zusätzlich kann inaktiviertes M. hyopneumoniae mit einem herkömmlichen Adjuvans gemischt oder daran adsorbiert werden. Das Adjuvans wird als nicht-spezifisches Reizmittel zur Anregung von Leukozyten oder zur Verbesserung einer Immunreaktion värwendet. Solche Adjuvantien umfassen u.a. Amphigen, Mineralöl und Lecithin, Aluminiumhydroxid, Muramyl-Dipeptid und Saponine wie Quil A.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Impfstoffes enthält eine wäßrige Suspension oder Lösung, die den inaktivierten M. hyopneumoniae-Stamm P-5722-3 enthält und vorzugsweise bei einem physiologischen pH-Wert gepuffert ist, und in einer zur Injektion fertigen Form vorliegt.
Vorzugsweise liegt der erfindungsgemäße Impfstoff in einem pharmazeutischen Präparat in Einheitsdosis-Formen vor. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung beträgt die gewünschte immunogene Menge inaktivierter Organismen bei Verabreichung als einziger Wirkstoff 5 x 10&sup8; CCU bis 5 x 10&sup9; CCU. Der erfindungsgemäße Impfstoff wird vorzugsweise in zwei 2 ml-Dosen verabreicht, wobei jede Dosis den gewünschten Titer enthält. Vorzugsweise werden die Dosen im Abstand von zwei Wochen verabreicht.
Eine Primärimmunisierung von Jungschweinen sollte im Alter von etwa einer Woche eingeleitet werden, wobei 2 Wochen später eine Auffrischungsdosis verabreicht wird. Zur Primärimmunisierung trächtiger Schweine werden zwei Dosen im Abstand von etwa vier Wochen empfohlen, wobei die letzte Dosis zwei Wochen vor dem Werfen verabreicht wird. Vor jedem nachfolgenden Werfen wird eine Auffrischungsdosis empfohlen. Bei Ebern wird eine halbjährliche Impfung empfohlen.
Vorzugsweise liegt der erfindungsgemäße Impfstoff in einem pharmazeutischen Präparat in Einheitsdosis-Formen vor. Die Dosierungsformen enthalten vorzugsweise etwa 2 ml. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung beträgt eine immunogene Menge von inaktiviertem M. hyopneumoniae bei Verabreichung als einziger Wirkstoff 5 x 10&sup8; CCU bis 5 x 10&sup9; CCU pro Dosis. Bei einer Impfstoff-Zusammensetzung, die weitere antigene Bestandteile enthält, kann die gleiche immunogene Menge oder eine geringere Menge von M. hyopneumoniae eingesetzt werden.
Auf der Basis der vorstehend erwähnten immunogenen Mengen, des zu behandelnden Zustandes und der physiologischen Merkmale des Tieres kann der Fachmann leicht andere geeignete therapeutisch wirksame Dosen ermitteln. In Gegenwart weiterer Wirkstoffe können diese Einheitsdosen leicht durch den Fachmann geändert werden. Ein gewünschtes Dosierungsschema umfaßt die Verabreichung von ein oder zwei Dosen einer gewünschten Impfstoff-Zusammensetzung, wobei der Antigen-Gehalt jeder Fraktion wünschenswerterweise so ist, wie vorstehend angegeben. Die Verabreichung kann natürlich im Bedarfsfall oder auf Wunsch in geeigneten Abständen wiederholt werden.
Die Verabreichung kann in jeder Darreichungsform erfolgen, durch die der Impfstoff in den Körper gelangt. Der Impfstoff wird jedoch vorzugsweise mittels intramuskulärer Injektion verabreicht. Andere Verabreichungsformen können auf Wunsch auch eingesetzt werden, wie die subkutane, intradermale, intraperitoneale oder intranasale Verabreichung.
Die folgenden erfindungsgemäßen Beispiele dienen nur zur Veranschaulichung und sollen die Erfindung nicht beschränken.

Beispiel 1

Vermehrung und Züchtung von M. hyopneumoniae

Der M. hyopneumoniae-Stamm P-5722-3 wurde freundlicherweise von Dr. Charles Armstrong, Purdue university, zur Verfügung gestellt. Der Stamm wurde bei American Type Culture Collection unter der Eingangs-Nr. 55052 hinterlegt. Dieser Stamm ist immunchemisch und biochemisch dadurch gekennzeichnet, daß er Mannose-positiv, Arginin-negativ und Urease-negativ ist. Der Stamm ist positiv hinsichtlich einer Wachstumshemmung durch gegen M. hyopneumoniae gerichtetes Antiserum und reagiert im direkten Fluoreszenz-Antikörper- Test mit einem gegen M. hyopneumoniae gerichteten Fluorescein-konjugierten Antikörper positiv. Dieser Stamm wurde vermehrt, wie nachstehend beschrieben.
Nach dem folgenden Verfahren wurde ein Kulturmedium hergestellt. Eine 83%ige PPLO-Nährlösung ohne Kristallviolett [Difco Laboratories, Detroit, Michigan] wurde durch ein- bis vierstündige Behandlung der Nährlösung mit einem Anionen-Austauscherharz [Amberlite , Sigma IRA400 - Chloridform] in einer Menge von 500 g Harz für jeweils zehn Liter Nährlösung konditioniert.
Durch Zugabe von 500 g aktiver Hefe-Körnchen zu drei Litern destilliertem oder deionisiertem Wasser unter Rühren bei Raumtemperatur wurde ein Hefe-Extrakt hergestellt. Nach gründlichem Mischen wurde die Suspension weitere 15 - 45 Minuten gerührt und danach wurden tröpfchenweise 16,2 ml 10 N NaOH zugegeben. Der Brei wurde danach 15 - 45 Minuten bei 121ºC autoklaviert. Der Überstand wurde in einen Behälter abgegossen und entweder mittels Zentrifugation oder mittels Mikrofiltration geklärt. Zu dem geklärten Überstand wurde 1 N NaCl in einer Menge von 2 ml pro 100 ml Extrakt zugegeben. Der Extrakt wurde mindestens 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und dann wie vorstehend beschrieben geklärt. Der geklärte Überstand wurde wie vorstehend beschrieben durch Autoklavieren oder durch Mikrofiltration sterilisiert.
Zu der vorbehandelten Nährlösung wurden die folgenden Medienbestandteile zugegeben: 0,01 % Thalliumacetat, 0,005 % Ampicillin, 0,0125 % Cysteinhydrochlorid, 6,25 % Hefe-Extrakt, 1 % Dextrose, 10 % hitzeinaktiviertes Schweine-Serum (Gibco) und gegebenenfalls 0,0026 % Phenolrot. Der pH-Wert des Kulturmediums wurde auf 7,5 ± 0,2 eingestellt und sterilfiltriert.
Zur Serienproduktion wurde eine eingefrorene M. hyopneumoniae-Anzuchtkultur aufgetaut und eine 5%ige - 20%ige Suspension wurde in 100 ml - 3000 ml vorstehend beschriebenes Kulturmedium überimpft. Die Kultur wurde 36 bis 168 Stunden bei 30ºC bis 39ºC inkubiert. Nach zufriedenstellendem Wachstum wurde die Kultur in einen Anzuchtbehälter mit frischem Medium überführt, wobei ein 5%iges - 20%iges Inokulum verwendet wurde. Diese Kultur wurde 36 bis 96 Stunden bei 37ºC ± 1ºC inkubiert.
Produktionskulturen von M. hyopneumoniae werden in Fermentatoren gezüchtet, wobei nach Beimpfung eine 36- bis 96-stündige Inkubation bei 37ºC ± 1ºC erfolgt. Der Gehalt der Kultur an gelösten Sauerstoff wird durch Belüftung mit steriler Luft und Rühren zwischen 20 % - 40 % gehalten. Zur Schaumkontrolle kann ein steriles Schaumverhütungsmittel verwendet werden.
Am Ende des Züchtungszeitraumes wurde der pH-Wert der Kultur auf 7,6 ± 0,2 erhöht und etwa eine Stunde in diesem Bereich gehalten. Zur Inaktivierung des Organismus wurde eine sterilfiltrierte wäßrige Lösung von 2-Bromethylaminhydrobromid (BEA) bis zu einer Endkonzentration von etwa 4,0 mM zugegeben. BEA wird bei dem erhöhten pH-Wert der Kultur in das inaktivierende Mittel binäres Ethylenimin (BEI) umgewandelt. Die Kultur wurde unter ständigem Rühren mindestens 24 Stunden bei 37ºC ± 1ºC inkubiert.
Nach der 24-stündigen Inkubation wurde eine sterilfiltrierte wäßrige Lösung von Natriumthiosulfat, einem Standard-Neutralisierungsmittel, bis zu einer Endkonzentration von etwa 4 mM zugegeben, um überschüssiges BEI zu neutralisieren. Die Kultur wurde weitere 24 Stunden bei 37ºC ± 1ºC inkubiert, um die Inaktivierung zum Abschluß zu bringen.

Beispiel 2

Herstellung eines Impfstoffes

Nach Inaktivierung des Impfstoff-Bestandteils von Beispiel 1 wurde ein Impfstoff formuliert, indem zu dem inaktivierten M. hyopneumoniae mehrere herkömmliche Impfstoff- Bestandteile zugegeben wurden. Eine ausreichende Menge inaktiviertes M. hyopneumoniae wurde mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung als verdünnungsmittel kombiniert, wobei eine Antigen-Minimal-Konzentration von 5 x 10&sup8; CCU und eine Maximalkonzentration von 5 x 10&sup9; CCU M. hyopneumoniae pro 2 ml- Dosis erhalten wurde. Als Konservierungsmittel wurden eine sterile 10%ige Merthiolat-Lösung und eine sterile 10%ige Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, Dinatrium- oder Tetranatriumsalz)-Lösung zugegeben. Als Adjuvans wurde steriles Mineralöl [Drakeol] zugegeben, das 5 Gew.-% bis 40 Gew.-% Lecithin (Central Soya) enthielt. Als Emulgiermittel wurden Tween 80 bis zu einer Endkonzen.tration von 0,7 % bis 3,2 % und Span bis zu einer Endkonzentration von 0,3 % bis 1,8 % zugegeben. Als zusätzliche Konservierungsmittel für das öl und die Emulgiermittel können ausgewählte Parabene (Methylp-hydroxylbenzoat, Propyl-p-hydroxylbenzoat, Butyl-p-hydroxybenzoat) zugegeben werden.

Beispiel 3

Immunisierungsexperimente mit Impfstoffen

Zur Beurteilung der Schutzfähigkeit eines mit einem Adjuvans versetzten inaktivierten M. hyopneumoniae-Impfstoffes beim Schwein wurden zwei getrennte Impfungsexperimente zum Zwecke einer Immunisierung durchgeführt.
33 gekreuzte, sechseinhalb Wochen alte Schweine aus einer geschlossenen, von Atemwegskrankheiten freien Herde wurden in eine nicht-geimpfte infizierte Kontrollgruppe (Gruppe 1), zwei geimpfte infizierte Gruppen (Gruppen 2 und 3) und eine nicht-geimpfte, nicht-infizierte Gruppe (Gruppe 4) aufgeteilt.
Die Tiere der Gruppe 2 erhielten den in Beispiel 1 beschriebenen Impfstoff, wobei allerdings die M. hyopneumoniae-Kultur nicht mit BEI sondern mit 0,3 % Formalin inaktiviert wurde, und die Tiere der Gruppe 3 erhielten den in Beispiel 1 beschriebenen Impfstoff 1 wobei in beiden Fällen eine intramuskuläre Verabreichung in 2 ml Dosen am Tag "0" und am Tag "14" erfolgte. Beide Impfstoffe enthielten inaktivierte ganze Zellen, die mit den gleichen Adjuvantien versetzt waren und sich nur hinsichtlich des verwendeten Inaktivierungsmittels unterschieden. Die Schweine in Gruppe 4 erhielten über den gleichen Verabreichungsweg 6 ml-Dosen von Friis-Mycoplasma-Nährlösung, die inkomplettes Freund-Adjuvans enthielt (Placebo).
Pneumonie wurde induziert, indem sieben Tage nach der zweiten Impfstoff-Dosis eine intratracheale Inokulation der Schweine [Bentley, O. E., und Farrington, D.O., Am. J. Vet. Bes. 41 (1980), 1870] mit einer einzelnen 10 ml-Dosis von Lungen-Rohhomogenat durchgeführt wurde, das den M. hyopneumoniae-Stamm 232 (stammt vom Stamm 11) enthielt. Den Schweinen der Gruppe 4 wurden 10 ml Friis-Mycoplasma-Nährlösung verabreicht.
Etwa 3 Wochen nach Verabreichung des infektiösen Materials wurde eine Nekropsie durchgeführt. Kriterien, die zur Bestimmung der Impfstoff-Wirksamkeit bei der Prophylaxe einer M. hyopneumoniae-Erkrankung verwendet wurden, waren (a) die Schwere klinischer Anzeichen, (b) makroskopische Pneumonie-Läsionen, (c) mikroskopische Lösionen, die typisch für die Krankheit sind, und (d) eine Infektion von Lungengewebe, die mittels Immunfluoreszenz ermittelt wurde [Amaneu, W. et al., Proceedings, IPVS-Kongreß, Kopenhagen, Dänemark, (1980), S. 223].
Wie nachstehend in den Tabellen 1 und 2 gezeigt, wiesen die Schweine in den Gruppen 1 und 2 gewöhnlich in etwas höherem Maße Husten auf als die Schwine in den Gruppen 3 und 4. Alle Schweine in der Gruppe 1 (Positivkontrolle) und die meisten Schweine in den Gruppen 2 und 3 (geimpft) wiesen Läsionen auf. Keines der Schweine in der Gruppe 4 wies Läsionen auf. Die Anzahl von Lungenlappen mit Läsionen war bei Schweinen in der Gruppe 3 wesentlich geringer als bei Schweinen in den Gruppen 1 und 2. Der wichtigste Befund war, daß der durchschnittliche prozentuale Anteil von Lungen mit Pneumonie und die durchschnittliche Häufigkeit von Lungen- Lasionen in der geimpften Gruppe 3 signifikant geringer war als in Gruppe 1. Zwischen der Gruppe 2 und Gruppe 1 gab es keine signifikanten Unterschiede bezüglich der Schwere der Pneumonie (Tabelle 1).
In allen Gruppen wiesen die meisten Schweine einige mikroskopische Läsionen auf. Die Schwere der mikroskopischen Läsionen war in den Gruppen 2, 3 und 4 signifikant geringer als in der Positivgruppe 1.
Eine Beurteilung der Lungen mittels Immunfluoreszenz offenbarte, daß 7 von 8 Schweinen in Gruppe 1 im Hinblick auf die Krankheit positiv waren. Nur vier von zehn Schweinen bzw. drei von neun Schweinen waren in den geimpften Gruppen 2 und 3 FA-positiv.
Alle Schweine in den Gruppen 2 und 3 hatten bis zum Zeitpunkt ihrer Infektion hohe Titer Komplement-bindender (CF) Antikörper gegen M. hyopneumoniae entwickelt. Bei Gruppe 2 wurde eine schnellere Entwicklung des positiven CF- Antikörper-Status beobachtet als bei Gruppe 3.
Zusammengefaßt bot der an die Schweine der Gruppe 3 verabreichte Impfstoff einen relativ starken Schutz gegen eine intratracheale Infektion mit einem M. hyopneumoniae- Lungenhomogenat. Der Schutz zeigte sich durch eine verringerte Anzahl von Lungenlappen mit Läsionen, einen verringerten prozentualen Anteil von Lungen mit Läsionen, ein verringertes Ausmaß der durchschnittlichen Lungenläsionen, ein verringertes Ausmaß mikroskopischer Läsionen und eine verringerte Anzahl von FA-positiven Schweinen. Tabelle 1
Im zweiten Experiment wurde die Wirksamkeit des inaktivierten Impfstoffes von Beispiel 1 bei Jungschweinen (in herkömmlicher Weise aufgezogen) bestätigt, die im Alter von 1 Wache und 3 Wochen geimpft wurden. Die experimentelle Vorgehensweise und die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Tabelle 2
* Verfahren von Goodwin und Whittlestone

Beispiel 4

Herstellung des Pasteurella multocida-Toxoids für einen Kombinations-Impfstoff

Ein weiterer Impfstoff-Bestandteil für einen erfindungsgemäßen Kombinations-Impfstoff kann das folgende P. multocida-Toxoid sein.

A. Züchtung von P. multocida

P. multicida Typ D (Stamm 8) [Dr. Ross Cowart, University of Illinais, Urbana, Illinais] wird einen Tag in einem modifizierten, chemisch definierten synthetischen Medium subkultiviert. Das Medium ist von Herriott et al. in J. Bact. 101 (1970), 513-516, beschrieben.
Der pH-Wert des fertigen Mediums wird mit sterilem NaOH auf 7,3 ± 0,2 eingestellt. Zellen aus dieser Kultur werden in frisches synthetisches Medium überführt und nach Züchtung wird diese Kultur mit einem Stabilisierungsmittel für tiefe Temperaturen kombiniert und bei -70ºC aufbewahrt. Produktionskulturen werden nach Inokulation 3 bis 24 Stunden bei etwa 36ºC ± 1ºC bis zur Ernte inkubiert. Der Gehalt der Kultur an gelöstem Sauerstoff wird durch Belüftung mit steriler Luft und durch Rühren aufrechterhalten. Eine sterile Lösung eines Schaumverhütungsmittels wird verwendet, um die Schaumbildung zu verringern. Der pH-Wert der Kultur wird bei 7,3 ± 0,2 aufrechterhalten.
Am Ende des Wachstumszyklus werden die P. multocida- Kulturen untersucht und die Zelldichte wird mittels Extinktion bei 650 nm bestimmt. Das Rühren wird dann vermindert und die Belüftung und die Kontrolle des pH-Wertes werden eingestellt.

B. Vorbehandlung zur Entgiftung

Nach Züchtung des Organismus wird der Kultur steriles Merthiolat in einer Menge zugegeben, die weniger als 0,01 % (Gew.-/Vol.) beträgt oder diesem Wert gleichkommt. Die Kulturflüssigkeiten können durch geschlossene Verbindungselemente aseptisch in einen sterilen geschlossenen Behälter überführt werden. Der Behälter ist durch geschlossene Anschlußstücke mit einer Vorrichtung verbunden, die zur physikalischen Lyse von Zellen und Freisetzung des Zellinhalts verwendet wird, z.B. einem "GAULIN"-laborhomogenisator Modell 15 M.
Bakterienzellen in der Kulturflüssigkeit werden durch kontinuierlichen Durchfluß durch die Druckkammer des Homogenisators lysiert. Dadurch werden die Zellen einem unmittelbaren Druckabfall vom Anfangsdruck von 13790 kPa (2000 Psi) bis 34475 kPa (5000 Psi) bis zum Umgebungsdruck von 103,4 kPa (15 Psi) unterworfen. Die lysierten Zellen werden aseptisch in einem anderen geschlossenen Behälter gelagert.
Das Lysat wird durch schrittweise Zentrifugation und/oder Filtration durch Mikroporen aufgereinigt. Die geklärten Lösungen können vor oder nach der Sterilfiltration konzentriert werden. Zur Verhinderung einer Zusammenlagerung der konzentrierten Proteine werden vor dem Konzentrieren und der Sterilfiltration Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in einer Menge bis zu einer Endkonzentration von 5 mM und Glycerin in einer Menge bis zu einer Endkonzentration von 1,0 % (Vol./Vol.) zugegeben.

C. Entgiftung

Durch das folgende Verfahren wird eine Entgiftung erreicht. Dem sterilen Toxin wird steriles NaOH langsam und aseptisch zugegeben, wobei der pH-Wert von seinem Anfangswert von etwa 7,0 auf einen Wert von etwa 10,55 ± 0,10 erhöht wird. Der pH-Wert wird etwa 7 Stunden bei diesem Wert aufrechterhalten. Danach wird der pH-Wert durch langsame und aseptische Zugabe von 4 N steriler HCl auf 7,0 ± 0,2 eingestellt. Dieser pH-Wert der Flüssigkeiten wird 1 Stunde aufrechterhalten. Während des gesamten Verfahrens wird bei konstant aufrechterhaltener Temperatur mit kontinuierlicher Geschwindigkeit gerührt.
Dieses Entgiftungsverfahren wird vorzugsweise insgesamt dreimal innerhalb von 25 Stunden oder bis zum Abschluß der Entgiftung durchgeführt. Danach wird das mit anderen Bestandteilen kombinierte und in Impfstoff-Zusammensetzungen konfektionierte Toxoid bei 2ºC bis 7ºC aufbewahrt.
Jedesmal, wenn der pH-Wert etwa 7,0 ist, z.B. beim Ausgangs-pH-Wert und sobald der pH-Wert auf etwa 7 eingestellt wird, werden Aliquots entnommen. Die Rest-Toxizität von jedem Aliguot wird bestimmt und als Maus-LD&sub5;&sub0; pro ml angegeben. Nachdem der pH-Wert zuerst auf 10,55 eingestellt wurde, ist etwa 25 Stunden später ein Präparat das einen Anfangswert von fast 2500 LD&sub5;&sub0; pro ml aufwies, meistens vollständig entgiftet, ohne daß der bestimmbare Antigen-Gehalt nennenswert verringert ist.

Beispiel 5

Herstellung eines P. multocida-Bacterin-Toxoid-Impfstoffbestandteils

Ein erfindungsgemäßer Kombinations-Impfstoff kann ein Bacterin-Toxoid von P. multocida umfassen, wobei das Toxoid innerhalb der Bakterienzelle stabilisiert worden ist.
Eine Kultur vom P. multocida Typ D; Stamm 4677, wird in dem folgenden Medium gezüchtet: 30 g tryptische Sojabohnen-Nährlösung ohne Dextrose (Difco), 5 g Hefe-Extrakt (Difco), 4 g Dextrose, Auffüllen mit deionisiertem Wasser auf 1 Liter, pH-Wert etwa 7, Sterilisation durch Autoklavieren bei 121ºC.
Zur Aufrechterhaltung der Konzentration von gelöstem Sauerstoff bei etwa 35 % Sättigung wird die Kultur durch Rühren belüftet. Die Temperatur wird bei 37ºC aufrechtgehalten und der pH-Wert wird durch die Zugabe einer 10 N NaOH- Losung 3e nach Bedarf bei 7 gehalten. Gegen Ende des exponentiellen Wachstums wird die Belüftung abgebrochen und die Kultur wird durch Zugabe einer Formaldehyd-Lösung (USP) bis zu einer Endkonzentration von 0,5 % (Vol./Vol.) inaktiviert. Die Kultur wird dann vier Tage bei 37ºC gehalten. Anstelle von Formaldehyd können andere inaktivierende Mittel verwendet werden, wie beta-Propiolacton, Glutaraldehyd und binäres Ethylenimin.
Eine Probe wird entnommen, um zu testen, ob die Inaktivierung vollständig ist, indem die Probe Meerschweinchen verabreicht wird. 7 Tage nach einer subkutanen Injektion von 4 ml Kulturvolumen sollten die Meerschweinchen noch am Leben und gesund sein. Zu diesem Zeitpunkt ist das innerhalb der Zellen befindliche Toxin vollständig in ein Toxoid umgewandelt, das risikolos und sehr stabil ist und nach Injektion in Tiere die Produktion neutralisierender Antitoxine induzieren kann.
Die inaktivierte Kultur wird zentrifugiert. Die sedimentierten Bakterien werden in eine ausreichend große Flüssigkeitsmenge des Überstandes gegeben, wobei eine Suspension mit einem OD-Wert (optische Dichte bei 625 nm, in einem Spectronic 20-Spektrophotometer bestimmt) von 4,2 erhalten wird. Dann wird die Suspension an 25 % (Vol./Vol.) Al(OH)&sub3;- Gel adsorbiert, als Konservierungsmittel wird 0,01 % (Gew./Vol.) Thimerosol zugegeben und der pH-wert wird auf 6,5 ± 0,2 eingestellt.

Beispiel 6

Experimente zur gleichzeitigen Verabreichung von zwei Impfstoffen

Es wurde eine Untersuchung zur Bestimmung durchgeführt, ob sich der Impfstoff, der den inaktivierten M. hyopneumoniae-Bestandteil von Beispiel 1 enthält, nachteilig auf herkömmliche Schweine-Impfstoffe auswirkt, die Impfstoffe aus ganzen Zellen von Bordetella bronchiseptica, Erysipelothrix rhusipathiae und P. multocida Typ A und D enthalten. Beide Impfstoffe wurden gleichzeitig über den gleichen Darreichungsweg an unterschiedlichen Stellen verabreicht.
Der vorstehend erwähnte M. hyopneumoniae-Impfstoff zeigte weder eine immunsupprimierende Wirkung hinsichtlich der Reaktion der Tiere auf den anderen Impfstoff noch störte er diese negativ, wie mittels Serokonversion-Reaktionen bestimmt.
In einer anderen Ausführungsform kann das erfindungsgemäße M. hyopneumoniae-Bacterin in Impfstoff-Zusammensetzungen mit solchen anderen Impfstoff-Bestandteilen eingesetzt werden.
Die vorstehende genaue Beschreibung umfaßt zahlreiche Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung, die für den Fachmann wohl naheliegend sind. Beispielsweise kann der Fachmann nach Belieben andere geeignete M. hyopneumoniae-Stämme oder Stämme für Kombinations-Impfstoffe oder Impfstoff-Bestandteile, wie Adjuvantien, Konservierungsmittel und dergleichen einsetzen. Der Schutzumfang der angefügten Patentansprüche umfaßt solche Modifikationen und Veränderungen der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Verfahren.

Claims

1. Impfstoffbestandteil, der durch binäres Ethylenimin inaktivierten M. hyopneumoniae in einer Dosierung von mindestens 5 x 10&sup8; CCU umfaßt und zur Induktion einer immunologischen Antwort in einem geimpften Schwein gegen M. hyopneumoniae fähig ist.

2. Impfstoffbestandteil nach Anspruch 1, der hergestellt wird durch Vorbehandlung eines Kulturmediums, in dem M. hyopneumoniae gehalten werden kann, mit einem Anionenaustauschharz, Inokulation des vorbehandelten Mediums mit M. hyopneumoniae, Erhöhung des Gehalts der Kultur an gelöstem Sauerstoff auf 20 bis 40 % Sättigung, Züchtung von M. hyopneumoniae bis zu einem Titer von mindestens 1 x 10&sup8; CCU und Inaktivierung der Kultur durch Zugabe von binärem Ethylenimin.

3. Bestandteil nach Anspruch 2, der einen Titer von 5 x 10&sup8; bis 5 x 10&sup8; farbverändernden Einheiten umfaßt.

4. Bestandteil nach Anspruch 2, wobei der Züchtungsschritt das Wachstum der Kultur von M. hyopneumoniae bei einer Temperatur zwischen 30ºC und 40ºC bei neutralem bis schwach alkalischem pH-Wert umfaßt.

5. Impfstoff, der eine Immunität gegen M. hyopneumoniae in einem Säuger ohne ernste Nebeneffekte induzieren kann, umfassend eine zur Impfung geeignete Menge des Bestandteils von Anspruch 1 und ein Adjuvans zum Auslösen einer immunprotektiven Antwort in einem Schwein, wobei der Bestandteil eine immunogene Aktivität bei mindestens einer Menge aufweist, die zum Schutz des Tieres bei Exposition gegen M. hyopneumoniae ausreichend ist.

6. Impfstoff nach Anspruch 5, wobei der Bestandteil den inaktivierten M. hyopneumoniae in einem Titer von 5 x 10&sup8; bis 5 x 10¹&sup0; farbverändernden Einheiten umfaßt.

7. Impfstoff nach Anspruch 5, wobei das Adjuvans Lecithin und Mineralöl, Saponine oder Aluminiumhydroxid ist.

8. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes zum Schutz von Säugern gegen M. hyopneumoniae, umfassend die Vorbehandlung eines Kulturmediums, in dem M. hyopneumoniae gehalten werden kann, mit einem Anionenaustauschharz, die Inokulation des Mediums mit M. hyopneumoniae, die Erhöhung des Gehalts der Kultur an gelöstem Sauerstoff auf 20 bis 40 % Sättigung, die Züchtung von M. hyopneumoniae bis zu einem Titer von mindestens 1 x 10&sup8; CCU und die Inaktivierung der Kultur durch Zugabe von binärem Ethylenimin.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Titer zwischen 5 x 10&sup8; und 5 x 10¹&sup0; farbverändernden Einheiten ist.

10. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Züchtungsschritt das Wachstum der Kultur von M. hyopneumoniae bei einer Temperatur zwischen 30ºC und 40ºC bei neutralem bis schwach alkalischem pH-Wert umfaßt.

11. Verwendung einer zur Impfung geeigneten Menge eines Impfstoffbestandteils, umfassend den mit binärem Ethylenimin inaktivierten M. hyopneumoniae in einer Dosierung von mindestens 5 x 10&sup8; CCU, wobei der Bestandteil eine immunologische Antwort in einem geimpften Schwein gegen M. hyopneumoniae induzieren kann, und ein Adjuvans zur Herstellung eines Impfstoffes zur Impfung von Schweinen gegen M. hyopneumoniae.

12. Impfstoffzusammensetzung, die einen Impfstoffbestandteil aus inaktivertem M. hyopneumoniae und eine immunogene Menge von einem oder mehreren zusätzlichen Antigenen umfaßt.

13. Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei die zusätzlichen Antigene ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus einem Pasteurella multocida-Bacterin mit einem zellgebundenen Toxoid, einem Bordetella bronchiseptica-Bacterin, einem Erysipelothrix rhusiopathiae-Antigenextrakt, einem löslichen zelifreien Toxoid von Pasteurella multocida Typ D, inaktivierten ganzen Zellen von P. multocida Typ A oder D, Kulturen von Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis und Pseudorabies-Virus.

14. Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 12, die aus inaktiviertem M. hyopneumoniae, inaktiviertem Bordetella bronchiseptica, inaktiviertem p. multocida Typ A, inaktiviertem p. multocida Typ D, zellfreiem Toxoid von P. multocida und Antigenextrakt von Erysipelothrix rhusiopathiae besteht.

15. Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 12, die aus inaktiviertem M. hyopneumoniae und Impfstoffbestandteilen von Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis und Pseudorabies-Virus besteht.

16. Verwendung eines Impfstoffbestandteils aus inaktiviertem M. hyopneumoniae und einer immunogenen Menge von einem oder mehreren zusätzlichen Antigenen zur Herstellung eines Impfstoffes zur Impfung eines Schweins gegen M. hyopneumoniae und sekundäre bakterielle Infektionen.

17. Verwendung eines Impfstoffbestandteils aus inaktiviertem M. hyopneumoniae und einer immunogenen Menge von einem oder mehreren zusätzlichen Antigenen, wobei die zusätzlichen Antigene ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus einem Pasteurella multocida-Bacterin mit einem zellgebundenen Toxoid, einem Bordetella bronchiseptica- Baaterin, einem Erysipelothrix rhusiopathiae-Antigenex trakt, einem löslichen zelifreien Toxoid von Pasteurella multocida Typ D, inaktivierten ganzen Zellen von P. multocida Typ A oder D, Kulturen von Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis und Pseudorabies- Virus, zur Herstellung eines Impfstoffes zur Impfung eines Schweins gegen M. hyopneumoniae und sekundäre bakterielle Infektionen.

18. Verwendung von inaktiviertem M. hyopneumoniae, inaktiviertem Bordetella bronchiseptica, inaktiviertem P. multocida Typ A, inaktiviertem P. multocida Typ D, zellfreiem Toxoid von P. multocida und Antigenextrakt von Erysipelothrix rhusiopathiae zur Herstellung einer Impfstoffzusammensetzung zur Impfung eines Schweins gegen M. hyopneumoniae und sekundäre bakterielle Infektionen.

19. Verwendung von mit binärem Ethylenimin inaktiviertem M. hyopneumoniae in einer Dosierung von mindestens 5 x 10&sup8; CCU und einem Adjuvans zur Herstellung eines Impfstoffes und zusätzlichem Antigen zur Herstellung von einem oder mehreren Impfstoffen zum Schutz eines Schweins gegen eine M. hyopneumoniae-Infektion und andere pathogene Infektionen, wobei die Impfstoffe sequentiell oder gleichzeitig an ein Tier zu verabreichen sind.

20. Verwendung nach Anspruch 19, wobei das zusätzliche Antigen ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem Pasteurella multocida-Bacterin mit einem zellgebundenen Toxoid, einem Bordetella bronchiseptica-Bacterin, einem Antigenextrakt von Erysipelothrix rhusiopathiae, einem löslichen zellfreien Toxoid von Pasteurella multocida Typ D, inaktivierten ganzen Zellen von P. multocida Typ A oder D, Kulturen von Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis und pseudorabies-Virus, zur Herstellung eines Impfstoffes zur Itripfung eines Schweins gegen M. hyopneumoniae und sekundäre bakterielle Infektionen.