DE202005022108U1

DE202005022108U1 - Influenza-Virus-Impfstoffe

Info

Publication number: DE202005022108U1
Application number: DE202005022108U
Authority: DE
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 2004-03-09
Filing date: 2005-03-09
Publication date: 2013-11-12
Anticipated expiration: 2015-03-10
Also published as: WO2005107797A1; US20190167780A1; US20080254065A1; JP2007528411A; JP2016026230A; CA2559371C; JP2014167028A; JP5600375B2; EP1722815A1; CA2559371A1

Abstract

Impfstoff, der Folgendes umfasst: (i) ein Antigen von einem Vogel-Influenza-Stamm, der eine hochpathogene Vogel-Influenza verursachen kann, wobei das Antigen in Form eines gereinigten viralen Proteins, eines Spaltvirus oder eines inaktivierten Gesamt-Virus vorliegt, und (ii) ein Adjuvans, wobei das Adjuvans ein Aluminiumsalz oder eine Submikron-Squalen/Wasser-Öl-in-Wasser-Emulsion ist, zum Schutz eines humanen Patienten gegen eine Infektion mit einem aufkommenden, künftigen, humanen, pandemischen Influenza-Virus-Stamm, wobei der aufkommende, künftige, humane, pandemische Influenza-Virus-Stamm vom gleichen Hämagglutinin-Typ ist, jedoch antigenisch nicht mit dem pathogenen Vogel-Influenza-Stamm eng verwandt ist.

Description

Alle vorliegend zitierten Dokumente sind durch Bezugnahme vollumfänglich in die vorliegende Offenbarung eingeschlossen.
TECHNISCHES GEBIET
Diese Erfindung betrifft das Gebiet der Impfung gegen Influenza-Virus, und insbesondere die Impfung gegen pandemische Stämme des Influenza-Virus.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Im Jahr 1997, 2003 und dann wieder im Jahr 2004 tauchten antigenisch unterschiedliche Vogel-H5N1-Influenza-Viren als pandemische Bedrohungen für den Menschen auf. Bei jedem dieser Ausbrüche gab es Bedenken, dass sich die Vogel-Viren anpassen könnten und dadurch von Mensch zu Mensch übertragbar würden. Der optimale Weg, um mit einem humanen pandemischen Virus umzugehen, besteht darin, einen klinisch zugelassenen passenden Impfstoff (d. h. der die Hämagglutinin- und Neuraminidase-Antigene des humanen pandemischen Stamms enthält) bereitzustellen, wobei dies nicht in einfacher Weise in einem angemessenen Zeitrahmen erreicht werden kann.
Ein Weg zur Bereitstellung eines wirksamen Impfstoffs gegen den neuen pandemischen Stamm besteht darin, Antigene von einem existierenden Stamm zu verwenden, der antigenisch mit dem neuen Stamm eng verwandt ist. Beispielsweise beschreiben Nicholson et al. (The Lancet (2001) 357: 1937–1943) die Verwendung von Antigenen aus dem nicht pathogenen A/Duck/Singapur/97(H5N3)-Vogelstamm zur Impfung gegen den antigenisch verwandten, jedoch pathogenen A/Hongkong/156/97(H5N1)-Stamm. Die Autoren waren in der Lage, neutralisierende Mengen an Antikörper in Menschen hervorzurufen, die gegen den pathogenen Vogelstamm immunisiert wurden.
Dieser im Stand der Technik beschriebene Ansatz zur Auswahl von Stämmen für eine Immunisierung beruht darauf, dass man Eigenschaften eines neuen Stamms, wie z. B. sein antigenisches Profil, kennt, da dieses Wissen erforderlich ist, um einen geeigneten Impfstoff-Stamm aus den bereits bekannten Stämmen auszuwählen. Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, weitere und bessere Wege bereitzustellen, um Impfstoffe gegen aufkommende, künftige, humane pandemische Influenza-Virus-Stämme bereitzustellen und insbesondere, um Wege bereitzustellen, die kein detailliertes Wissen bezüglich der antigenischen Eigenschaften von Stämmen, die als humanpathogene Erreger auftreten, erfordern.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Während der Stand der Technik bekannte, nicht pathogene Vogelstämme verwendet hat, um Antikörper in Menschen gegen bekannte pathogene Vogelstämme zu erzeugen, verwendet die Erfindung bekannte pathogene Vogel-Stämme, um gegen aufkommende pathogene humane Stämme zu schützen. Während der Stand der Technik ferner darauf bedacht war, eine große antigenische Übereinstimmung zwischen dem Impfstoff-Stamm und dem Ziel-Stamm zu erreichen, wählt die Erfindung Impfstoff-Stämme aufgrund ihrer Pathogenität aus, unabhängig von einer angenommenen engen antigenischen Beziehung zum Ziel-Stamm. Da die Erfindung kein detailliertes Wissen bezüglich des antigenischen Profils eines aufkommenden Stamms benötigt, kann ein Impfstoff im Voraus bereitgestellt werden, um das Risiko und die möglichen Folgen eines humanen pandemischen Ausbruchs zu verringern.
Somit stellt die Erfindung einen Impfstoff zum Schutz eines humanen Patienten gegen eine Infektion mit einem humanen Influenza-Virus-Stamm bereit, wobei der Impfstoff ein Antigen von einem Vogel-Influenza-Virus-Stamm umfasst, der eine hochpathogene Vogel-Influenza verursachen kann. Das Antigen kann eine Antikörper-Antwort in dem Patienten auslösen, die in der Lage ist, nicht nur den homologen Impfstoff-Stamm zu neutralisieren, sondern auch aufkommende, heterologe humane Influenza-Impfstoff-Stämme. Vorzugsweise wird der aufkommende, heterologe humane Influenza-Impfstoff vom selben Hämagglutinin-Typ sein (d. h. H5 oder H9) wie der pathogene Vogel-Influenza-Stamm.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren für die Herstellung eines Impfstoffs zum Schutz eines humanen Patienten gegen eine Infektion mit einem humanen Influenza-Virus-Stamm bereit, das einen Schritt umfasst, bei dem man ein Antigen von einem Vogel-Influenza-Virus-Stamm, welcher eine hochpathogene Vogel-Influenza verursachen kann, mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger mischt und wahlweise mit einem Adjuvans. Die Verabreichung des Impfstoffs an den Patienten löst eine Antikörper-Antwort aus, die in der Lage ist, den humanen Influenza-Virus-Stamm zu neutralisieren.
Die Erfindung stellt ferner die Verwendung eines Antigens aus einem Vogel-Influenza-Virus-Stamm, der hochpathogene Vogel-Influenza verursachen kann, bei der Herstellung eines Impfstoffs zum Schutz eines humanen Patienten gegen eine Infektion durch einen humanen Influenza-Virus-Stamm bereit. Das Antigen in dem Impfstoff kann eine Antikörper-Antwort in dem Patienten auslösen, die in der Lage ist, den humanen Influenza-Virus-Stamm zu neutralisieren.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Schutz eines humanen Patienten gegen eine Infektion mit einem humanen Influenza-Virus-Stamm bereit, das einen Schritt umfasst, bei dem man dem Patienten einen Impfstoff verabreicht, der ein Antigen von einem Vogel-Influenza-Virus-Stamm umfasst, welcher hochpathogene Vogel-Influenza verursachen kann.
Die Erfindung stellt ferner einen Impfstoff bereit, der (a) ein Antigen aus einem pathogenen Vogel-Influenza-Virus-Stamm umfasst, und wahlweise (b) (ein) Antigen(e) von einem oder von mehreren (d. h. 1, 2 oder 3) humanen, interpandemischen Influenza-Virus-Stämmen. Bestandteil (b) in diesem Impfstoff kann ein typischer jährlich erscheinender humaner Influenza-Impfstoff sein, d. h. die Erfindung stellt einen typischen jährlich erscheinenden Influenza-Impfstoff bereit, der mit einem Antigen von einem pathogenen Vogel-Influenza-Virus-Stamm supplementiert ist. Der Impfstoff kann ferner ein Adjuvans umfassen.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs bereit, bei dem man (a) ein Antigen von einem pathogenen Vogel-Influenza-Virus-Stamm mit (b) (einem) Antigen(en) von einem oder von mehreren (d. h. 1, 2, oder 3) humanen Influenza-Virus-Stamm/Stämmen mischt. Bestandteil (a) wird üblicherweise ein Adjuvans umfassen; Bestandteil (b) kann ein Adjuvans umfassen oder nicht. In ähnlicher Weise stellt die Erfindung ein Kit bereit, das Folgendes umfasst: (a) einen ersten Behälter, der ein Antigen aus einem pathogenen Vogel-Influenza-Virus-Stamm umfasst, und (b) einen zweiten Behälter, der (ein) Antigen(e) von einem oder von mehreren (d. h. 1, 2 oder 3) humanen Influenza-Virus-Stamm/Stämmen umfasst. Bestandteil (a) wird üblicherweise ein Adjuvans umfassen; Bestandteil (b) kann ein Adjuvans umfassen oder nicht.
Vogel-Antigene, die in den Impfstoffen der vorliegenden Erfindung enthalten sind, werden im Allgemeinen mit einem Adjuvans versetzt sein. Wie im Folgenden beschrieben wird, sind zwei bevorzugte Adjuvantien (a) Aluminiumsalze und (b) MF59.
Der humane Influenza-Virus-Stamm
Die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung verwenden ein Vogel-Antigen, um Patienten gegen eine Infektion mit einem Influenza-Virus-Stamm zu schützen, der in der Lage ist, von Mensch zu Mensch übertragen zu werden, d. h. einem Stamm, der sich innerhalb einer bestehenden Humanpopulation geometrisch oder exponentiell ausbreitet, ohne dass dies einen physikalischen Kontakt voraussetzen würde. Der Patient kann ferner gegen Stämme geschützt sein, die Menschen infizieren und in diesen eine Krankheit verursachen, wobei die Ansteckung jedoch durch Vögel erfolgt und nicht durch andere Menschen.
Die Erfindung ist insbesondere nützlich, um gegen eine Infektion mit pandemischen, aufkommenden pandemischen und zukünftig pandemischen humanen Stämmen zu schützen, z. B. um gegen H5-Influenza-Subtypen zu schützen. Abhängig von der jeweiligen Jahreszeit und der Art des Antigens, das im Impfstoff enthalten ist, kann die Erfindung jedoch gegen andere Hämagglutinin-Subtypen schützen, einschließlich H1, H2, H3, H4, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 oder H16.
Die Eigenschaften eines Influenza-Stamms, die diesem die Fähigkeit verleihen, einen pandemischen Ausbruch zu verursachen, sind die folgenden: (a) es enthält im Vergleich zu den Hämagglutininen in gegenwärtig im Umlauf befindlichen humanen Stämmen ein neues Hämagglutinin, d. h. ein solches, das in der humanen Population für mehr als ein Jahrzehnt nicht sichtbar war (z. B. H2) oder das zuvor noch nie in der humanen Population beobachtet wurde (z. B. H5, H6 oder H9, die im Allgemeinen nur in Vogelpopulationen gefunden wurden), sodass die humane Population immunologisch naiv in Bezug auf das Hämagglutinin des Stammes ist; (b) es ist in der Lage, sich in der humanen Population horizontal auszubreiten; und (c) es ist für Menschen pathogen.
Da die Erfindung gegen einen Stamm schützt, der in der Lage ist, von Mensch zu Mensch übertragen zu werden, wird das Genom des Stammes im Allgemeinen mindestens ein RNA-Segment umfassen, dass aus einem Säugetier(z. B. einem Menschen)-Influenza-Virus stammt. Viren, bei denen alle Segmente von Vogel-Viren abstammen, sind tendenziell nicht in der Lage, von Mensch zu Mensch übertragen zu werden.
Der Vogel-Influenza-Virus-Stamm
Die Impfstoffe der Erfindung umfassen ein Antigen von einem Vogel-Influenza-Virus-Stamm. Dieser Stamm ist typischerweise ein solcher, der in der Lage ist, eine hochpathogene Vogel-Influenza (highly pathogenic avian influenza; HPAI) zu verursachen. Die HPAI ist ein gut beschriebener Zustand (Alexander Avian Dis (2003) 47(3Suppl): 976–81), der durch einen plötzlichen Beginn, einen schweren Erkrankungsverlauf und einen schnellen Tod der betroffenen Vögel/Schwärme gekennzeichnet ist, mit einer Mortalitätsrate, die annähernd 100% betragen kann. Stämme mit geringer Pathogenität (LPAI) und solche mit hoher Pathogenität können problemlos unterschieden werden (z. B. zeigen van der Goot et al. (Epidemiol Infect (2003) 131(2): 1003–13) eine vergleichende Studie zu den Übertragungseigenschaften von H5N2-Vogel-Stämmen mit geringer und hoher Pathogenität.

Für die Saison 2004 sind Beispiele für HPAI-Stämme H5N1-Influenza-A-Viren, z. B. der Stamm A/Vietnam/1196/04 (auch bekannt als A/Vietnam/3028/2004 oder A/Vietnam/3028/04). Vor dem Jahr 2004 führt die Weltgesundheitsbehörde (WHO) HPAI-Stämme wie folgt auf:

Jahr	Land/Region	Betroffene einheimische Vögel	Stamm
1959	Schottland	Huhn	H5N1
1963	England	Truthahn	H7N3
1966	Ontario (Kanada)	Truthahn	H5N9
1976	Victoria (Australien)	Huhn	H7N7
1979	Deutschland	Huhn	H7N7
1979	England	Truthahn	H7N7
1983–1985	Pennsylvania (USA)	Huhn, Truthahn	H5N2
1983	Irland	Truthahn	H5N8
1985	Victoria (Australien)	Huhn	H7N7
1991	England	Truthahn	H5N1
1992	Victoria (Australien)	Huhn	H7N3
1994	Queensland (Australien)	Huhn	H7N3
1994–1995	Mexiko	Huhn	H5N2
1994	Pakistan	Huhn	H7N3
1997	New South Wales (Australien)	Huhn	H7N4
1997	Hongkong (China)	Huhn	H5N1
1997	Italien	Huhn	H5N2
1999–2000	Italien	Truthahn	H7N1
2002	Hongkong (China)	Huhn	H5N1
2002	Chile	Huhn	H7N3
2003	Niederlande	Huhn	H7N7

Der Fachmann wird somit in der Lage sein, künftige HPAI-Stämme bei deren Aufkommen zu identifizieren.
Stämme, wie z. B. A/Duck/Singapore/97 (H5N3) sind keine HPAI-Stämme.
Die Vogel-Influenza-Stämme können jeden geeigneten Hämagglutinin-Subtypen aufweisen, einschließlich H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 oder H16.
Die Impfstoffe der Erfindung können zwei oder mehrere (d. h. 2, 3, 4 oder 5) Vogel-Influenza-Stämme umfassen. Solche Vogel-Influenza-Stämme können den gleichen oder verschiedene Hämagglutinin-Subtypen umfassen.
Das Vogel-Virus ist nicht in der Lage, von Mensch zu Mensch übertragen zu werden.
Das Antigen
Impfstoffe der vorliegenden Erfindung umfassen ein Antigen von einem pathogenen Vogel-Stamm. Das Antigen wird im Allgemeinen in einer Subvirion-Form vorliegen, z. B. in Form eines Spaltvirus, bei dem die virale Lipidhülle aufgelöst oder zerstört worden ist, oder in Form von einem oder mehreren gereinigten viralen Proteinen. Die Impfstoff-Zusammensetzung wird eine ausreichende Menge des Antigens/der Antigene umfassen, um eine immunologische Antwort in dem Patienten zu erzeugen.
Verfahren zum Aufspalten von Influenza-Viren sind im Stand der Technik hinreichend bekannt, siehe z. B. WO 02/28422 , WO 02/067983 , WO 02/074336 , WO 01/21151 , usw. Das Aufspalten des Virus wird durchgeführt, indem man entweder infektiöses (Wildtyp oder abgeschwächtes) oder nicht-infektiöses (z. B. inaktiviertes) Gesamt-Virus mit einer zerstörend wirkenden Konzentration eines Spaltmittels zerstört oder fragmentiert. Die Zerstörung führt zu einer vollständigen oder partiellen Solubilisierung der Virus-Proteine, was die Integrität des Virus verändert. Bevorzugte Spaltmittel sind nicht-ionische und ionische (z. B. kationische) Tenside, z. B. Alkylglykoside, Alkylthioglykoside, Acylzucker, Sulfobetaine, Betaine, Polyoxyethylenalkylether, N,N-Dialkylglucamide, Hecameg, Alkylphenoxypolyethoxyethanole, quartäre Ammoniumverbindungen, Sarkosyl, CTABs (Cetyltrimethylammoniumbromide), Tri-N-Butylphosphat, Cetavlon, Myristyltrimethylammoniumsalze, Lipofectin, Lipofectamin, und DOT-MA, die Octyl- oder Nonylphenoxy-Polyoxyethanole (z. B. die Triton-Tenside, wie z. B. Triton X-100 oder Triton N101), Polyoxyethylen-Sorbitanester (die Tween-Tenside), Polyoxyethylenether, Polyoxyethylenester, usw. Die Produkte BEGRIVAC^TM, FLUARIX^TM, FLUZONE^TM und FLUESHIELD^TM sind Spalt-Impfstoffe.
Verfahren zur Reinigung von einzelnen Proteinen aus Influenza-Viren sind hinreichend bekannt. Impfstoffe, die auf gereinigten viralen Proteinen basieren, umfassen üblicherweise das Hämagglutinin(HA)-Protein, und sie umfassen häufig auch das Neuraminidase(N)-Protein. Verfahren zur Herstellung dieser Proteine in gereinigter Form sind im Stand der Technik hinreichend bekannt. Die Produkte FLUVIRIN^TM, AGRIPPAL^TM und INFLUVAC^TM sind Subunit-Impfstoffe.
Als weitere Alternative kann der Impfstoff ein Gesamt-Virus umfassen, z. B. ein lebendes, abgeschwächtes Gesamt-Virus oder vorzugsweise ein inaktiviertes Gesamt-Virus. Vorzugsweise wird das Gesamt-Virus nicht von dem pathogenen Vogel-Stamm selbst stammen, insbesondere wenn Kulturen in Eiern verwendet werden, sondern es wird sich um ein chimäres Virus handeln, das anstelle von einem seiner eigenen RNA-Segmente ein RNA-Segment umfasst, welches für das Vogel-Antigen kodiert. Die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung können somit ein chimäres Gesamt-Virus umfassen, in dem mindestens eines der viralen Proteine (z. B. das HA) von einem pathogenen Vogel-Stamm stammt. Verfahren zur Inaktivierung oder Abtötung von Viren, um deren Fähigkeit zu zerstören, menschliche Zellen zu infizieren, sind im Stand der Technik bekannt. Solche Verfahren umfassen sowohl chemische als physikalische Mittel. Chemische Mittel zur Inaktivierung eines Virus umfassen die Behandlung mit einer wirksamen Menge von einem oder mehrere der folgenden Mittel: Detergenzien, Formaldehyd, Formalin, Beta-Propiolacton oder UV-Licht. Zusätzliche chemische Mittel zur Inaktivierung umfassen die Behandlung mit Methylenblau, Psoralen, Carboxyfulleren (C60) oder einer Kombination derselben. Andere Verfahren der viralen Inaktivierung sind im Stand der Technik bekannt, z. B. binäres Ethylamin, Acetylethylenimin oder Gammabestrahlung. Das Produkt INFLEXAL^TM ist ein inaktivierter Gesamtzell-Impfstoff.
In allen Typen von Impfstoffen ist die Dosis üblicherweise auf 15 μg HA pro Stamm pro Dosis normalisiert, wobei jedoch geringere Dosen ebenfalls verwendet werden können (siehe unten). Die Normalisierung von Dosen wird üblicherweise durch Messung der Konzentrationen unter Verwendung eines Einzelradialimmundiffusions(single radial immunodiffusion, SRID)-Assays gemessen.
Weitere Details zu Influenza-Impfstoff-Antigenen können in den Kapiteln 17 und 18 von Vaccines (Hrsg. Plotkin & Orenstein, 4. Auflage, 2004, ISBN 0-7216-9688-0) gefunden werden.
Virales Wachstum für die Antigen-Herstellung
Die Herstellung von Impfstoffen der vorliegenden Erfindung erfordert das Wachstum von Influenza-Virus, wobei Antigene von den angezüchteten Viren präpariert werden. Es gibt zwei allgemeine Verfahren, die gegenwärtig verwendet werden, um Influenza-Virus herzustellen: (1) Wachstum von Viren in Eiern; (2) Wachstum von Viren in Zellkultur. Jedes dieser Wachstumsverfahren kann gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Das Wachstum in embryonierten Hühner-Eiern, gefolgt von der Aufreinigung der Viren aus Allantoisflüssigkeit ist das Verfahren, mit dem Influenza-Virus traditionell für die Impfstoff-Herstellung angezüchtet wurde. Vor Kurzem sind Viren in kultivierten Zelllinien angezüchtet worden, was es unnötig macht, Virus-Stämme herzustellen, die an das Wachstum in Eiern angepasst sind, und eine Kontamination des finalen Impfstoffs mit Protein aus dem Ei vermeidet. Das Wachstum in Zellkultur ist ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Impfstoffe. Die Zellen für das Virus-Wachstum können in Suspension oder unter adhärenten Bedingungen kultiviert werden.
Zelllinien, die für das Wachstum von Influenza-Virus geeignet sind, stammen vorzugsweise von Säugetieren und umfassen (sind jedoch nicht beschränkt auf): humane oder nicht-humane Primaten-Zellen (z. B. MRC-5 (ATCC CCL-171), WI-38(ATCC CCL-75), humane embryonische Nierenzellen (293-Zellen, üblicherweise mit fragmentierter DNA von Adenovirus Typ 5 transformiert), Vero-Zellen von Affen-Nieren), Zellen von Pferd, Kuh (z. B. MDBK-Zellen), Schaf, Hund (z. B. MDCK-Zellen von Hundenieren, ATCC CCL34 MDCK (NBL2) oder MDCK 33016, Hinterlegungsnummer DSM ACC 2219 wie in WO 97/37001 beschrieben), Katze und Nagetier (z. B. Hamster-Zellen, wie z. B. BHK21-F, HKCC-Zellen oder Eierstockzellen aus dem chinesischen Hamster (CHO-Zellen)), und die Zellen können von einer Vielzahl von Entwicklungsstadien erhalten werden, einschließlich z. B. adulte, neonatale, fötale und embryonische Zellen. In einigen Ausführungsformen sind die Zellen immortalisiert (z. B. PERC.6-Zellen, wie sie in WO 01/38362 und WO 02/40665 beschrieben sind und wie sie unter der ECACC Hinterlegungsnummer 96022940 hinterlegt wurden. In bevorzugten Ausführungsformen werden Säugetier-Zellen verwendet und diese können von einer oder von mehreren der folgenden nicht einschränkenden Zellarten ausgewählt und/oder abgeleitet sein: Fibroblasten-Zellen (z. B. dermal, Lunge), Endothel-Zellen (z. B. von der Aorta, koronare, pulmonale und vaskuläre, dermal-mikrovaskuläre, aus der Nabelschnur), Hepatozyten, Keratinozyten, Immunzellen (z. B. T-Zelle, B-Zelle, Makrophage, NK, dendritische Zelle), Zellen des Brustgewebes (z. B. epitheliale), glatte Muskelzellen (z. B. vaskuläre, von der Aorta, koronare, arterielle, vom Uterus, bronchiale, zervikale, retinale, Perizyten), Melanozyten, neurale Zellen (z. B. Astrozyten), Zellen der Prostata (z. B. epitheliale, glatte Muskelzellen), Zellen der Niere (z. B. epitheliale, mesangiale Zellen des proximalen Tubus), Skelettzellen (z. B. Chondrozyten, Osteoklast, Osteoblast), Muskelzellen (z. B. Myoblast, skelettale, glatte, bronchiale), Leberzellen, Retinoblasten und Stromazellen. WO 97/37000 und WO 97/37001 beschreiben die Herstellung von tierischen Zellen und Zelllinien, die in der Lage sind, in Suspension und in Serum-freien Medien zu wachsen und die für die Herstellung und die Replikation von Viren nützlich sind.
Kulturbedingungen für die obigen Zelltypen werden hinreichend in zahlreichen Publikationen beschrieben; oder alternative Kulturmedien, Supplemente und Bedingungen, wie sie z. B. im Katalog und in der zusätzlichen Literatur von Cambrex Bioproducts (Fast Rutherford, New Jersey) beschrieben werden, können kommerziell erhalten werden.
In bestimmten Ausführungsformen werden die in den vorliegenden Verfahren verwendeten Wirtszellen in Serum-freien und/oder Protein-freien Medien kultiviert. Ein Medium wird im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung als Serum-freies Medium bezeichnet, wenn in diesem keine Additive aus Serum von humanem oder tierischem Ursprung vorhanden sind. Unter Protein-frei sind solche Kulturen zu verstehen, in denen die Vermehrung der Zellen unter Ausschluss von Proteinen, Wachstumsfaktoren und anderen Protein-Additiven und Nicht-Serumproteinen erfolgt, wobei jedoch optional Proteine wie Trypsin oder andere Proteasen vorhanden sein können, die für das virale Wachstum erforderlich sein können. Die Zellen, die in solchen Kulturen wachsen, enthalten natürlicherweise selbst Proteine.
Bekannte Serum-freie Medien umfassen Iscove-Medium, Ultra-CHO-Medium (BioWhittaker) oder EX-CELL (JRH Bioscience). Gewöhnliche, Serum enthaltende Medien umfassen Eagle Basalmedium (BME) oder Minimum Essential Medium (MEM) (Eagle, Science 130, 432 (1959)) oder Dulbecco modifiziertes Eagle Medium (DMEM oder EDM), wobei diese gewöhnlich mit bis zu 10% fötalem Kälberserum oder ähnlichen Additiven verwendet werden. Optional können Minimum Essential Medium (MEM) (Eagle, Science 130, 432 (1959)) oder Dulbecco modifiziertes Eagle Medium (DMEM oder EDM) ohne Serum-haltige Supplemente verwendet werden. Protein-freie Medien, wie PF-CHO (JHR Bioscience), chemisch definierte Medien wie ProCHO 4CDM (BioWhittaker) oder SMIF 7 (Gibco/BRL Life Technologies) und mitogene Peptide wie Primactone, Pepticase oder HyPep^TM (alle von Quest International) oder Lactalbumin-Hydrolysat (Gibco und andere Hersteller) sind ebenfalls im Stand der Technik hinreichend bekannt. Die Medien-Additive, welche auf Pflanzen-Hydrolysaten basieren, haben den besonderen Vorteil, dass eine Kontamination mit Viren, Mikroplasmen oder unbekannten infektiösen Agenzien ausgeschlossen werden kann.
Zellkulturbedingungen (Temperatur, Zelldichte, pH-Wert, usw.) sind aufgrund der Eignung der erfindungsgemäß eingesetzten Zelllinie über einen großen Bereich hinweg variabel, und können an die Bedürfnisse des jeweiligen Influenza-Stamms angepasst werden.
Das Verfahren zur Vermehrung des Virus in kultivierten Zellen umfasst im Allgemeinen Schritte, bei denen die kultivierten Zellen mit dem zu kultivierenden Stamm inokuliert werden, die infizierten Zellen für einen gewünschten Zeitraum für die Virusvermehrung kultiviert werden, wie es z. B. durch den Virus-Titer oder die Antigen-Expression bestimmt wird (z. B. zwischen 24 und 168 Stunden nach der Inokulation), und das vermehrte Virus abgeerntet wird. Die kultivierten Zellen werden mit einem Virus bis zu einem Zell-Verhältnis von 1:500 bis 1:1, vorzugsweise von 1:100 bis 1:5, stärker bevorzugt von 1:50 bis 1:10 inokuliert (gemessen durch PFU oder TCID₅₀). Das Virus wird einer Suspension von Zellen zugesetzt, oder es wird auf einen Monolayer der Zellen appliziert, und das Virus wird für mindestens 60 Minuten, jedoch üblicherweise weniger als 300 Minuten, an die Zellen adsorbiert, vorzugsweise zwischen 90 und 240 Minuten bei 25 bis 40°C, vorzugsweise bei 28°C bis 37°C. Die infizierte Zellkultur (z. B. Monolayer) kann entweder durch Einfrieren/Auftauen oder durch enzymatische Einwirkung entfernt werden, um den Virus-Gehalt der geernteten Kultur-Überstände zu erhöhen. Die geernteten Flüssigkeiten werden anschließend entweder inaktiviert oder im gefrorenen Zustand gelagert. Kultivierte Zellen können bei einer Multiplizität der Infektion (multiplicity of infektion, ”m. o. i.”) von etwa 0,0001 bis 10, vorzugsweise von 0,002 bis 5, stärker bevorzugt von 0,001 bis 2, infiziert werden. Es ist noch stärker bevorzugt, dass die Zellen bei einer m. o. i. von etwa 0,01 infiziert werden. Die infizierten Zellen können 30 bis 60 Stunden nach der Infektion geerntet werden. Vorzugsweise werden die Zellen 34 bis 48 Stunden nach der Infektion geerntet. Es ist noch stärker bevorzugt, dass die Zellen 38 bis 40 Stunden nach der Infektion geerntet werden. Proteasen (üblicherweise Trypsin) werden im Allgemeinen während der Zellkultur zugesetzt, um die Freisetzung des Virus zu ermöglichen, und die Proteasen können zu jeder beliebigen Phase während der Kultur zugegeben werden.
Das Virus, welches angezüchtet wird, und von dem die Antigene zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Impfstoffen präpariert werden, umfasst ein Antigen (z. B. das HA-Protein) von einem pathogenen Vogel-Stamm, wobei dieses jedoch im Allgemeinen selbst kein pathogener Vogel-Stamm sein wird, um das virale Wachstum in Standardsystemen zu ermöglichen. Im Allgemeinen wird der Wachstumsstamm daher ein reassortiertes Virus sein, das aus zwei Quellen abgeleitet ist: (1) dem pathogenen Vogel-Stamm und (2) einem Stamm, der gut im ausgewählten Wachstums-System wächst. Beispielsweise werden die existierenden Impfstoffe, insbesondere solche, die mittels Wachstum in Eiern hergestellt wurden, oftmals von reassortierten Stämmen präpariert, die abgeleitet sind von: (1) dem antigenen Stamm von Interesse und (2) dem Stamm A/Puerto Rico/8/34 (H1N1).
Reassortierte Stämme können auf Zufallsbasis hergestellt werden, indem die Ursprungsviren co-kultiviert werden, oder sie können planmäßig hergestellt werden, wobei ”reverse genetische Verfahren” verwendet werden (siehe z. B. WO 91/03552 , US Patent 5166057 , Neumann & Kawaoka (2001) Virology 287(2): 243-50). Reverse genetische Verfahren umfassen die Expression von (a) DNA-Molekülen, welche für die gewünschten viralen RNA-Moleküle kodieren, z. B. ausgehend von polI-Promotoren, und (b) DNA-Moleküle, die für virale Proteine kodieren, z. B. ausgehend von polII-Promotoren, sodass die Expression von beiden Typen von DNA in einer Zelle zum Zusammenbau eines vollständigen, intakten, infektiösen Virions führt. Die DNA stellt vorzugsweise die gesamte virale RNA und alle viralen Proteine bereit, wobei es jedoch auch möglich ist, ein Helfer-Virus zu verwenden, um einen Teil der RNA oder einige der Proteine bereitzustellen. Auf Plasmiden basierende Verfahren, bei denen getrennte Plasmide für die Herstellung jeder viralen RNA verwendet werden, sind bevorzugt ( WO 00/60050 , WO 01/04333 , US Patent 6649372 ), und diese Verfahren werden auch die Verwendung von Plasmiden einschließen, um alle oder einige (z. B. nur die Proteine PB1, PB2, PA und NP) der viralen Proteine zu exprimieren. Ambisense-Verfahren sind ebenfalls veröffentlicht worden ( WO 00/53786 ) und anstelle einer Verwendung von getrennten Plasmiden, welche für eine bestimmte virale RNA und das korrespondierende virale Protein kodieren, ist es möglich, duale polI- und polII-Promotoren zu verwenden, um damit mit einer einzigen Matrize gleichzeitig für die viralen RNAs und für exprimierbare mRNAs zu kodieren ( WO 01/83794 ; Hoffmann et al. (2000) Virology 267(2): 310–7).
Die Antikörper-Antwort
Obwohl Impfstoffe der vorliegenden Erfindung Antigene von pathogenen Vogel-Stämmen umfassen, können sie Antikörper-Antworten auslösen, die in der Lage sind, Viren zu neutralisieren, die auf den Menschen übertragbar sind. Die Fähigkeit der pathogenen Vogel-Stämme, diese Kreuzprotektivität zu erreichen, war unerwartet.
Verfahren zur Bestimmung von Antikörper-Antworten, der Neutralisierungsfähigkeit und des Schutzes nach Influenza-Virus-Impfungen sind im Stand der Technik hinreichend bekannt. Humanstudien haben gezeigt, dass Antikörper-Titer gegen Hämagglutin des humanen Influenza-Virus mit dem Schutz korreliert sind (ein Inhibierungstiter für die Hämagglutination einer Serumprobe von etwa 30–40 erzeugt etwa 50% Schutz gegen Infektion durch ein homologes Virus) [Potter & Oxford (1979) Br Med Bull 35: 69–75]. Antikörper-Antworten werden üblicherweise durch Inhibierung der Hämagglutination, durch Mikroneutralisation, durch Einzelradial-Immundiffusion (SRID) und/oder durch Einzelradial-Hämolyse (single radial hemolysis; SRH) gemessen. Diese Assay-Methoden sind im Stand der Technik hinreichend bekannt.
Der Impfstoff
Jährlich verfügbare humane Influenza-Impfstoffe umfassen üblicherweise mehr als einen Influenza-Stamm, wobei trivalente Impfstoffe normal sind (z. B. zwei Influenza A-Virus Antigene und ein Influenza B-Virus-Antigen). In pandemischen Jahren jedoch kann ein einzelner monovalenter Stamm verwendet werden. Somit kann/können das/die oben beschriebene(n) pathogene(n) Vogel-Antigen(e) das/die einzige(n) Influenza-Antigen(e) in dem erfindungsgemäßen Impfstoff sein, oder der Impfstoff kann zusätzlich (ein) Antigen(e) von einem oder mehreren (1, 2, 3, 4 oder mehr) der jährlich auftretenden Influenza-Virus-Stämme umfassen. Spezifische Impfstoffe der Erfindung umfassen daher: (i) einen Impfstoff, der das/die pathogene(n) Vogel-Antigen(e) als einzige(s) Influenza-Antigen(e) umfasst; (ii) einen Impfstoff, der das/die pathogene(n) Vogel-Antigen(e) plus (ein) Antigen(e) von zwei weiteren Stämmen umfasst, vorzugsweise auf die Weise, dass die drei Stämme sowohl Influenza A als auch Influenza B-Viren abdecken, und stärker bevorzugt mit zwei A-Viren und einem B-Virus; (iii) einen Impfstoff, der das/die pathogene(n) Vogel-Antigen(e) plus (ein) Antigen(e) von drei weiteren Stämmen umfasst, wobei die drei weiteren Stämme zwei Influenza A-Stämme und ein Influenza B-Stamm sind.
Traditionelle humane Impfstoffe enthalten 15 μg HA pro Stamm pro Dosis, wobei gezeigt wurde, dass auch geringere Dosen wirksam sind (siehe z. B. WO 00/15251 , US Patent 6372223 , WO 01/22992 , Nicholson et al. (2001) The Lancet 357: 1937–1943, Treanor et al. (2002) Vaccine 20: 1099–1105), insbesondere, wenn ein Adjuvans verwendet wird. Daher können die erfindungsgemäßen Impfstoffe zwischen 0,1 und 25 μg oder 30 μg HA pro Stamm pro Dosis umfassen. Die Menge an HA für jeden Stamm ist vorzugsweise etwa gleich groß. Typische Mikrogramm-Mengen jedes HA für die Einbringung sind etwa 15, 10, 9, 8, 7,5, 7, 6,5, 6, 5,5, 5, 4,5, 4, 3,5, 3, 2,5, 2, 1,5, 1, 0,5, usw. Eine bevorzugte Gruppe von Impfstoffen umfasst einen Antigen-Gehalt von zwischen 0,1 und 5 μg HA pro Stamm pro Dosis.
Die Impfstoffe der Erfindung können für verschiedene Verabreichungswege formuliert sein, z. B. durch intramuskuläre Injektion, durch subkutane Bereitstellung, durch intranasale Bereitstellung (z. B. WO 00/47222 , US Patent 6635246 , WO 01/21151 , INFLEXAL^TM, FLUMIST^TM), durch orale Bereitstellung (z. B. US Patent 6635246 ), durch intradermale Bereitstellung (siehe z. B. WO 02/074336 , WO 02/067983 , WO 02/087494 , WO 02/083214 , WO 2004/016281 ), durch transdermale Bereitstellung, durch transkutane Bereitstellung, durch topische Verabreichungswege, usw. Die Injektion kann eine Nadel (einschließlich einer Mikronadel) umfassen, oder sie kann ohne Nadel erfolgen. Die Immunisierung durch bestimmte Verabreichungswege kann durch die Verwendung von Adjuvantien verstärkt werden (nachfolgend diskutiert).
Impfstoffe der vorliegenden Erfindung enthalten vorzugsweise < 50 pg/Dosis DNA, die von dem Wachstums-Wirt stammt (z. B. aus Eiern oder aus der Wachstums-Zelllinie). Ein geeignetes Verfahren zur Verringerung der Wirtszell-DNA-Kontamination wird im europäischen Patent 0870508 und im US Patent 5948410 offenbart, wobei das Verfahren eine zweistufige Behandlung umfasst, bei der zunächst eine DNAse (z. B. Benzonase) verwendet wird und anschließend ein kationisches Detergenz (z. B. CTAB).
Die Impfstoffe der Erfindung können ein Antibiotikum oder ein anderes Konservierungsmittel umfassen. Bevorzugte Impfstoffe vermeiden die Verwendung von Quecksilber-Konservierungsstoffen, wie z. B. Thimerosal (das auch Merthiolat oder Thiomersal bekannt ist) und Thimerfonat. Die bevorzugten Impfstoffe sind im Wesentlichen frei (< 5 μg/ml) oder stärker bevorzugt insgesamt frei von Quecksilber-Konservierungsmitteln. (Multi-Dosis-Formulierungen enthalten jedoch vorzugsweise eine wirksame Menge eines Konservierungsmittels).
Adjuvantien
Die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung können gemeinsam mit anderen immunregulatorischen Mitteln verabreicht werden. Insbesondere werden die Zusammensetzungen ein Adjuvans umfassen. Adjuvantien zur Verwendung im Rahmen der Erfindung umfassen (sind jedoch nicht beschränkt auf) ein oder mehrere der im Folgenden aufgeführten Dinge:
A. Mineral-haltige Zusammensetzungen
Mineral-haltige Zusammensetzungen, die zur Verwendung als Adjuvantien im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen Mineralsalze, wie beispielsweise Aluminium-Salze und Calcium-Salze. Die Erfindung umfasst Mineralsalze, wie beispielsweise Hydroxide (z. B. Oxyhxdroxide), Phosphate (z. B. Hydroxyphosphate, Orthophosphate), Sulfate, usw. [siehe z. B. Kapitel 8 und 9 von Vaccine Design ... (1995) Hrsg. Powell & Newman. ISBN: 030644867X. Plenum.] oder Mischungen von verschiedenen Mineral-Verbindungen (z. B. eine Mischung eines Phosphats und eines Hydroxid-Adjuvans, wahlweise mit einem Überschuss an dem Phosphat), wobei die Verbindungen jede beliebige Form annehmen können (z. B. gelartig, kristallin, amorph, usw.), und wobei die Adsorption an das/die Salz(e) bevorzugt ist. Die Mineral-haltigen Zusammensetzungen können auch als Partikel eines Metall-Salzes formuliert sein ( WO 00/23105 ).
Aluminium-Salze können so in die erfindungsgemäßen Impfstoffe eingebracht werden, dass die Dosis an Al³⁺ zwischen 0,2 und 1,0 mg pro Dosis beträgt.
B. Öl-Emulsionen
Öl-Emulsions-Zusammensetzungen, die zur Verwendung als Adjuvantien im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen Squalen-Wasser-Emulsionen, wie beispielsweise MF59 (5% Squalen, 0,5% Tween 80 und 0,5% Span 85, unter Verwendung eines Mikrofluidizers in Submikron-Partikel formuliert). Siehe WO 90/14837 . Siehe auch Podda "The adjuvanted influenza vaccines with novel adjuvants: experience with the MF59-adjuvanted vaccine", Vaccine (2001) 19: 2673–2680. MF59 wird als Adjuvans in dem trivalenten Influenzavirus-Subunit-Impfstoff FLUAD^TM verwendet.
Besonders bevorzugte Adjuvantien zur Verwendung in den Zusammensetzungen sind Submikrometer-öl-in-Wasser-Emulsionen. Bevorzugte Submikron-Öl-in-Wasser-Emulsionen zur vorliegenden Verwendung sind Squalen/Wasser-Emulsionen, die gegebenenfalls verschiedene Mengen an MTP-PE enthalten, wie z. B. eine Submikron-Öl-in-Wasser-Emulsion, die 4–5% Gew./Vol. Squalen, 0,25–1,0% Gew./Vol. Tween 80^TM (Polyoxyethylensorbitanmonooleat) und/oder 0,25–1,0% Span 85^TM (Sorbitantrioleat) und gegebenenfalls N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1'-2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphophoryloxy)-ethylamin (MTP-PE) enthält, beispielsweise die Submikron-Öl-in-Wasser-Emulsion, die als ”MF59” bekannt ist (Internationale Veröffentlichung Nr. WO 90/14837 ; US-Patent Nrn. 6,299,884 und 6,451,325 , die vorliegend durch Bezugnahme vollumfänglich eingeschlossen sind; und Ott et al., "MF59 – Design and Evaluation of a Safe and Potent Adjuvant for Human Vaccines" in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (Powell, M. F. und Newman, M. J. Hrsg.) Plenum Press, New York, 1995, Seiten 277–296). MF59 enthält 4–5% Gew./Vol. Squalen (z. B. 4,3%), 0,25–0,5% Gew./Vol. Tween 80^TM und 0,5% Gew./Vol. Span 85^TM, und es enthält gegebenenfalls unterschiedliche Mengen MTP-PE und ist unter Verwendung eines Mikrofluidizers, wie eines Mikrofluidizers Modell 110Y (Microfluidics, Newton, MA, USA) zu Submikronpartikeln formuliert. MTP-PE kann beispielsweise in einer Menge von etwa 0–500 μg/Dosis, vorzugsweise von 0–250 μg/Dosis und am meisten bevorzugt von 0–100 μg/Dosis vorhanden sein. Der Begriff ”MF59-0” bezieht sich vorliegend auf die obige Submikron-Öl-in-Wasser-Emulsion, der MTP-PE fehlt, während der Begriff MF59-MTP eine Formulierung bezeichnet, die MTP-PE enthält. ”MF59-100” enthält beispielsweise 100 μg MTP-PE pro Dosis und so weiter. MF69, eine weitere Submikron-Öl-in-Wasser-Emulsion zur vorliegenden Verwendung, enthält 4,3% Gew./Vol. Squalen, 0,25% Gew./Vol. Tween 80^TM und 0,75% Gew./Vol. Span 85^TM und gegebenenfalls MTP-PE. Eine weitere Submikron-Öl-in-Wasser-Emulsion ist MF75, auch als SAF bekannt, die 10% Squalen, 0,4% Tween 80^TM, 5% Pluronic-geblocktes Polymer L121 und thr-MDP enthält und auch zu einer Submikron-Emulsion mikrofluidisiert ist. MF75-MTP bezeichnet eine MF75-Formulierung, die MTP umfasst, wie z. B. von 100–400 μg MTP-PE pro Dosis.
Submikron-Öl-in-Wasser-Emulsionen, Verfahren zu deren Herstellung und immunstimulierende Mittel, wie Muramylpeptide zur Verwendung in den Zusammensetzungen, sind detailliert in der internationalen Veröffentlichung Nr. WO 90/14837 und in den US-Patent Nrn. 6,299,884 und 6,451,325 beschrieben.
Komplettes Freund-Adjuvans (CFA) und inkomplettes Freund-Adjuvans (IFA) können ebenfalls als Adjuvantien im Rahmen der Erfindung verwendet werden.
C. Saponinformulierungen
Saponinformulierungen können ebenfalls als Adjuvantien im Rahmen der Erfindung verwendet werden. Saponine sind eine heterologe Gruppe von Sterolglycosiden und Triterpenoidglycosiden, die sich in der Rinde, den Blättern, Stielen/Stämmen, Wurzeln oder sogar Blüten eines weiten Bereichs von Pflanzenspezies finden. Aus der Rinde des Quillaia saponaria Molina-Baums isolierte Saponine sind weitverbreitet als Adjuvantien untersucht worden. Saponine können kommerziell auch von Smilax ornata (Sarsaprilla), Gypsophilla paniculata (rispiges Gipskraut) und Saponaria officinalis (Seifenwurzel) erhalten werden. Saponin-Adjuvans-Formulierungen umfassen gereinigte Formulierungen, wie QS21, sowie Lipid-Formulierungen, wie z. B. ISCOMs.
Saponin-Zusammensetzungen wurden mit Hochleistungsdünnschichtchromatographie (HPDC) und Reverse Phase-Hochleistungsflüssigchromatographie (RP-HPLC) gereinigt. Speziell gereinigte Fraktionen wurden mit diesen Techniken identifiziert, einschließlich QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B und QH-C. Das Saponin ist vorzugsweise QS21. Ein Verfahren zur Produktion von QS21 ist in US-Patent Nr. 5,057,540 offenbart. Saponin-Formulierungen können auch ein Sterol umfassen, wie Cholesterol (siehe WO 96/33739 ).
Es können Kombinationen von Saponinen und Cholesterolen verwendet werden, um einzigartige Partikel zu bilden, die als immunstimulierende Komplexe (ISCOMs) bezeichnet werden. ISCOMs schließen typischerweise auch ein Phospholipid ein, wie Phosphatidylethanolamin oder Phosphatidylcholin. Jedes bekannte Saponin kann in ISCOMs verwendet werden. Das ISCOM umfasst vorzugsweise ein oder mehrere von folgendem: Quil A, QHA und QHC. ISCOMs werden in EP 0109942 , WO 96/11711 und WO 96/33739 weiter beschrieben. Die ISCOMs können gegebenenfalls frei von zusätzlichem Tensid/zusätzlichen Tensiden sein. Siehe WO 00/07621 .
Eine Übersicht hinsichtlich der Entwicklung von Adjuvantien auf Basis von Saponin findet sich in Barr et al., "ISCOMs and other saponin based adjuvants", Advanced Drug Delivery Reviews (1998) 32: 247–271. Siehe auch Sjolander et al., "Uptake and adjuvant activity of orally delivered saponin and ISCOM vaccines", Advanced Drug Delivery Reviews (1998) 32: 321–338.
D. Virosomen und virusartige Partikel (VLPs)
Virosomen und virusartige Partikel (VLPs) können ebenfalls als Adjuvantien im Rahmen der Erfindung verwendet werden. Diese Strukturen enthalten im Allgemeinen ein oder mehrere Proteine aus einem Virus, die gegebenenfalls mit einem Phospholipid kombiniert oder formuliert sind. Sie sind im Allgemeinen nicht-pathogen, nicht-replizierend und enthalten im Allgemeinen nichts von dem nativen viralen Genom. Die viralen Proteine können rekombinant produziert werden oder aus Gesamt-Viren isoliert werden. Diese viralen Proteine, die zur Verwendung in Virosomen oder VLPs geeignet sind, schließen Proteine ein, die vom Influenza-Virus (wie HA oder NA), Hepatitis B-Virus (wie Core- oder Kapsid-Proteine), Hepatitis E-Virus, Masernvirus, Sindbis-Virus, Rotavirus, Virus der Maul-und-Klauenseuche, Retrovirus, Norwalk-Virus, humanem Papillomavirus, HIV, RNA-Phagen, Qβ-Phage (wie z. B. die Proteine der Hülle), GA-Phage, fr-Phage, AP205-Phage und Ty (wie z. B. Retrotransposon-Ty-Proten-pl) abgeleitet sind. VLPs werden ferner in WO 03/024480 , WO 03/024481 und Niikura et al., "Chimeric Recombinant Hepatitis E Virus-Like Particles as an Oral Vaccine Vehicle Presenting Foreign Epitopes", Virology (2002) 293: 273–280; Lenz et al., "Papillomarivurs-Like Particles Induce Acute Activation of Dendritic Cells", Journal of Immunology (2001) 5246–5355; Pinto et al., "Cellular Immune Responses to Human Papillomavirus(HPV)-16 L1 Healthy Volunteers Immunized with Recombinant HPV-16 L1 Virus-Like Particles", Journal of Infectious Diseases (2003) 188: 327–338 und Gerber et al., "Human Papilloma virus Virus-Like Particles Are Efficient Oral Immunogens when Coadministered with Escherichia coli Heat-Labile Entertoxin Mutant R192G or CpG", Journal of Virology (2001) 75(10): 4752–4760 diskutiert. Virosomen werden beispielsweise auch in Gluck et al., "New Technology Platforms in the Development of Vaccines for the Future", Vaccine (2002) 20: 810–816 diskutiert. Immunpotenzierende rekonstituierte Influenza-Virosomen (IRIV) werden als Subunit-Antigen-Abgabesystem in dem intranasalen trivalenten Produkt INFLEXAL^TM {Mischler & Metcalfe (2002) Vaccine 20 Suppl 5: 817–23) und in dem Produkr INFLUVAC PLUS^TM Produkt verwendet.
E. Bakterielle oder mikrobielle Derivate
Adjuvantien, die zur Verwendung im Rahmen der Erfindung geeignet sind, umfassen bakterielle oder mikrobielle Derivate, wie beispielsweise:
(1) Nicht-toxische Derivate von enterobakteriellem Lipopolysaccharid (LPS)
Solche Derivate umfassen Monophosphoryllipid A (MPL) und 3-O-deacyliertes MPL (3dMPL). 3dMPL ist eine Mischung aus 3 De-O-acyliertem Monophosphoryllipid A mit 4, 5 oder 6 acylierten Ketten. Eine bevorzugte ”kleine Partikel”-Form von 3 De-O-acyliertem Monophosphoryllipid A wird in EP 0 689 454 offenbart. Solche ”kleinen Partikel” von 3dMPL sind klein genug, um durch eine 0,22 μm-Membran sterilfiltriert zu werden (siehe EP 0 689 454 ). Andere nicht-toxische LPS-Derivate umfassen Mimetika von Monophosphoryllipid A, wie Aminoalkylglucosaminidphosphat-Derivate, z. B. RC-529. Siehe Johnson et al. (1999) Bioorg Med Chem Lett 9: 2273–2278.
(2) Lipid A-Derivate
Lipid A-Derivate umfassen Derivate von Lipid A aus Escherichia coli, wie OM-174. OM-174 ist z. B. in Meraldi et al., "OM-174, a New Adjuvant with a Potential for Human Use, Induces a Protective Response with Administered with the Synthetic C-Terminal Fragment 242–310 from the circumsporozoite protein of Plasmodium berghei", Vaccine (2003) 21: 2485–2491; und in Pajak et al., "The Adjuvant OM-174 induces both the migration and maturation of murine dendritic cells in vivo", Vaccine (2003) 21: 836–842, beschrieben.
(3) Immunstimulierende Oligonukleotide
Immunstimulierende Oligonukleotide, die zur Verwendung als Adjuvantien im Rahmen der Erfindung geeignet sind, umfassen Nukleotidsequenzen, die das CpG-Motiv enthalten (eine Sequenz, die ein unmethyliertes Cytosin enthält, gefolgt von Guanosin und verknüpft durch eine Phosphatbindung). Es ist gezeigt worden, dass bakterielle doppelsträngige RNA oder Oligonukleotide, die palindromische oder Poly(dG)-Sequenzen enthalten, ebenfalls immunstimulierend sind.
Die CpGs können Nukleotidmodifikationen/Nukleotid-Analoga umfassen, wie z. B. Phosphorthioat-Modifikationen, und sie können doppelsträngig oder einzelsträngig sein. Das Guanosin kann gegebenenfalls durch ein Analogon ersetzt werden, wie z. B. 2'-Deoxy-7-deazaguanosin. Siehe Kandimalla et al., "Divergent synthetic nucleotide motif recognition pattern: design and development of potent immunomodulatory oligodeoxyribonucleotide agents with distinct cytokine induction profiles", Nucleic Acids Research (2003) 31(9): 2393–2400; WO 02/26757 und WO 99/62923 zu Beispielen für mögliche Analogsubstitutionen. Die Adjuvans-Wirkung der CpG-Oligonukleotide ist ferner erörtert in: Krieg, "CpG motifs: the active ingredient in bacterial extracts?", Nature Medicine (2003) 9(7): 831–835; McCluskie et al., "Parenteral and mucosal prime-boost immunization strategies in mice with hepatitis B surface antigen and CpG DNA", FEMS Immunology and Medical Microbiology (2002) 32: 179–185; WO 98/40100 ; US-Patent Nr. 6,207,646 ; US-Patent Nr. 6,239,116 und US-Patent Nr. 6,429,199 .
Die CpG-Sequenz kann auf TLR9 gerichtet sein, wie z. B. das Motiv GTCGTT oder TTCGTT. Siehe Kandimalla et al., "Toll-like receptor 9: modulation of recognition and cytokine induction by novel synthetic CpG DNAs", Biochemical Society Transactions (2003) 31 (Teil 3): 654–658. Die CpG-Sequenz kann spezifisch für die Induktion einer Th1-Immunreaktion sein, wie z. B. CpG-A ODN, oder sie kann spezifischer für die Induktion einer B-Zell-Antwort sein, wie CpG-B ODN. CpG-A und CpG-B ODNs werden in Blackwell et al., "CpG-A-Induced Monocyte IFN-gamma-Inducible Protein-10 Production is Regulated by Plasmacytoid Dendritic Cell Derived IFN-alpha", J. Immunol. (2003) 170(8): 4061–4068; Krieg, "From A to Z on CpG", TRENDS in Immunology (2002) 23(2): 64–65 und WO 01/95935 erörtert. Das CpG ist vorzugsweise ein CpG-A ODN.
Das CpG-Oligonukleotid ist vorzugsweise so aufgebaut, dass das 5'-Ende für die Rezeptorerkennung zugänglich ist. Zwei CpG-Oligonukleotid-Sequenzen können gegebenenfalls über ihre 3'-Enden miteinander verbunden sein, um ”Immunomere” zu bilden. Siehe beispielsweise Kandimalla et al., "Secondary structures in CpG oligonucleotides affect immunostimulatory activity", BBRC (2003) 306: 948–953; Kandimalla et al., "Toll-like receptor 9: modulation of recognition and cytokine induction by novel synthetic GpG DNAs", Biochemical Society Transactions (2003) 31 (Teil 3): 664–658; Bhagat et al., "CpG penta- and hexadeoxyribonucleotides as potent immunomodulatory agents" BBRC (2003) 300: 853–861 und WO 03/035836 .
(4) ADP-ribosylierende Toxine und detoxifizierte Derivate davon
Bakterielle ADP-ribosylierende Toxine und detoxifizierte Derivate davon können als Adjuvantien im Rahmen der Erfindung verwendet werden. Das Protein ist vorzugsweise von E. coli (d. h. vom hitzelabilen Enterotoxin (”LT”) von E. coli), Cholera (”CT”) oder Pertussis (”PT”) abgeleitet. Die Verwendung von detoxifizierten ADP-ribosylierenden Toxinen als mucosale Adjuvantien ist in WO 95/17211 beschrieben, und die Verwendung als parenterale Adjuvantien ist in WO 98/42375 beschrieben. Das Adjuvans ist vorzugsweise eine detoxifizierte LT-Mutante, wie LT-K63, LT-R72 und LTR192G. Die Verwendung von ADP-ribosylierenden Toxinen und detoxifizierten Derivaten davon, insbesondere LT-K63 und LT-R72, als Adjuvantien findet sich in den folgenden Literaturzitaten, von denen jedes durch Bezugnahme vorliegend vollumfänglich eingeschlossen ist: Beignon et al., "The LTR72 Mutant of Heat-Labile Enterotoxin of Escherichia coli Enhances the Ability of Peptide Antigens to Elicit CD4+ T Cells and Secrete Gamma Interferon after Coapplication onto Bare Skin", Infection and Immunity (2002) 70(6): 3012–3019; Pizza et al., "Mucosal vaccines: non toxic derivatives of LT and CT as mucosal adjuvants", Vaccine (2001) 19: 2534–2541; Pizza et al., "LTK63 and LTR72, two mucosal adjuvants ready for clinical trials" Int. J. Med. Microbiol (2000) 290(4-5): 455–461; Scharton-Kersten et al., "Transcutaneous Immunization with Bacterial ADP-Ribosylating Exotoxins, Subunits and Unrelated Adjuvants", Infection and Immunity (2000) 68(9): 5306–5313; Ryan et al., "Mutants of Escherichia coli Heat-Labile Toxin Act as Effective Mucosal Adjuvants for Nasal Delivery of an Acellular Pertussis Vaccine: Differential Effects of the Nontoxic AB Complex and Enzyme Activity on Th1 and Th2 Cells" Infection and Immunity (1999) 67(12): 6270–6280; Partidos et al., "Heat-labile enterotoxin of Escherichia coli and its site-directed mutant LTK63 enhance the proliferative and cytotoxic T-cell responses to intranasally co-immunized synthetic peptides", Immunol. Lett. (1999) 67(3): 209–216; Peppoloni et al., "Mutants of the Escherichia coli heat-labile enterotoxin as safe and strong adjuvants for intranasal delivery of vaccines", Vaccines (2003) 2(2): 285–293; and Pine et al., (2002) "Intranasal immunization with influenza vaccine and a detoxified mutant of heat labile enterotoxin from Escherichia coli (LTK63)" J. Control Release (2002) 85(1–3): 263–270. Die numerische Bezugnahme bei Aminosäuresubstitutionen bezieht sich vorzugsweise auf die Alignments der A- und B-Untereinheiten von ADP-ribosylierenden Toxinen, die in Domenighini et al., Mol. Microbiol (1995) 15(6): 1165–1167 beschrieben ist.
F. Bioadhäsive und Mucoadhäsive
Bioadhäsive und Mucoadhäsive können ebenfalls als Adjuvantien im Rahmen der Erfindung verwendet werden. Geeignete Bioadhäsive umfassen veresterte Hyaluronsäure-Mikrokugeln (Singh et al. (2001) J. Cont. Rele. 70: 267–276) oder Mucoadhäsive, wie vernetzte Derivate von Poly(acrylsäure), Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Polysacchariden und Carboxymethylcellulose. Auch Chitosan und Derivate davon können als Adjuvantien im Rahmen der Erfindung verwendet werden, z. B. WO 99/27960 .
G. Mikropartikel
Mikropartikel können ebenfalls als Adjuvantien im Rahmen der Erfindung verwendet werden. Mikropartikel (d. h. Partikel mit einem Durchmesser von etwa 100 nm bis etwa 150 μm, insbesondere von etwa 200 nm bis etwa 30 μm Durchmesser und stärker bevorzugt von etwa 500 nm bis etwa 10 μm Durchmesser), die aus nicht-toxischen und biologisch abbaubaren Materialien gebildet sind (z. B. aus einer Poly(α-Hydroxysäure), einer Polyhydroxybuttersäure, einem Polyorthoester, einem Polyanhydrid, einem Polycaprolacton, usw.) mit Poly(laktid-co-glycolid) sind bevorzugt, wobei sie gegebenenfalls behandelt sind, um eine negativ geladene Oberfläche zu erhalten (z. B. mit SDS) oder eine positiv geladene Oberfläche (z. B. mit einem kationischen Tensid, wie CTAB).
H. Liposome
Beispiele für Liposomen-Formulierungen, die zur Verwendung als Adjuvantien geeignet sind, werden in US-Patent Nr. 6,090,406 , US-Patent Nr. 5,916,588 und in EP 0 626 169 beschrieben.
I. Polyoxyethylenether- und Polyoxyethylenester-Formulierungen
Adjuvantien, die zur erfindungsgemäßen Verwendung geeignet sind, umfassen Polyoxyethylenether und Polyoxyethylenester. WO 99/52549 . Solche Formulierungen umfassen ferner Polyoxyethylen-Sorbitanester-Tenside in Kombination mit einem Octoxynol ( WO 01/21207 ) sowie Polyoxyethylenalkylether oder -estertenside in Kombination mit mindestens einem weiteren nicht-ionischen Tensid, wie z. B. einem Octoxynol ( WO 01/21152 ).
Bevorzugte Polyethylenether sind aus der folgenden Gruppe ausgewählt: Polyoxyethylen-9-laurylether (Laureth 9), Polyoxyethylen-9-stearylether, Polyoxyethylen-8-stearylether, Polyoxyethylen-4-laurylether, Polyoxyethylen-35-laurylether und Polyoxyethylen-23-laurylether.
J. Polyphosphazen (PCPP)
PCPP-Formulierungen sind beispielsweise in Andrianov et al., "Preparation of hydrogel microspheres by coacervation of aqueous polyphophazene solutions", Biomaterials (1998) 19 (1–3): 109–115 und Payne et al., "Protein Release from Polyphosphazene Matrices", Adv. Drug. Delivery Review (1998) 31(3): 185–196, beschrieben.
K. Muramylpeptide
Beispiele für Muramylpeptide, die zur Verwendung als Adjuvantien im Rahmen der Erfindung geeignet sind, umfassen N-Acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamin (thr-MDP), N-Acetylnormuramyl-1-alanyl-d-isoglutamin (nor-MDP) und N-Acetylmuramyl-1-alanyl-d-isoglutaminyl-1-alanin-2-(1'–2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamin MTP-PE).
L. Imidazochinolin-Verbindungen
Beispiele für Imidazochinolin-Verbindungen, die als Adjuvantien zur Verwendung in der Erfindung geeignet sind, umfassen Imiquimod und dessen Analoga, die in Stanley, "Imiquimod and the imidazoquinolines: mechanism of action and therapeutic potential" Clin Exp Dermatol (2002) 27(7): 571–577 und Jones, "Resiquimod 3M", Curr Opin Investig Drugs (2003) 4(2): 214–218 weiterführend beschrieben sind.
Die Erfindung kann auch Kombinationen von Aspekten von einem oder mehreren der oben angegebenen Adjuvantien umfassen. Beispielsweise können die folgenden Adjuvans-Zusammensetzungen im Rahmen der Erfindung verwendet werden:

(1) ein Saponin und eine Öl-in-Wasser-Emulsion ( WO 99/11241 );
(2) ein Saponin (z. B. QS21) + ein nicht-toxisches LPS-Derivat (z. B. 3dMPL) (siehe WO 94/00153 );
(3) ein Saponin (z. B. QS21) + ein nicht-toxisches LPS-Derivat (z. B. 3dMPL) + ein Cholesterol;
(4) ein Saponin (z. B. QS21) + 3dMPL + IL-12 (optional + ein Sterol) ( WO 98/57659 );
(5) Kombinationen von 3dMPL mit beispielsweise QS21 und/oder Öl-in-Wasser-Emulsionen (siehe Europäische Patentanmeldungen 0835318 , 0735898 und 0761231 );
(6) SAF, das 10% Squalan, 0,4% Tween 80,5% Pluronicgeblocktes Polymer L121 und thr-MDP enthält, entweder zu einer Submikronemulsion mikrofluidisiert oder gevortext, um eine Emulsion mit größerer Partikelgröße zu erzeugen.
(7) Ribi^TM Adjuvans-System (RAS), (Ribi Immunochem), das 2% Squalen, 0,2% Tween 80 und eine oder mehrere Komponenten von bakterieller Zellwand, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Monophosphorylipid A (MPL), Trehalosedimycolat (TDM) und Zellwandgerüst (CWS) enthält, vorzugsweise MPL + CWS (Detox^TM); und
(8) ein oder mehrere Mineralsalze (wie ein Aluminiumsalz) + ein nicht-toxisches Derivat von LPS (wie 3dPML).

M. Humane Immunmodulatoren
Humane Immunmodulatoren, die zur Verwendung als Adjuvantien im Rahmen der Erfindung geeignet sind, umfassen Zytokine, wie Interleukine (z. B. IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, usw.), Interferone (z. B. Interferon-γ), Makrophagen-Kolonie stimulierenden Faktor und Tumornekrosefaktor.
Aluminiumsalze und MF59 sind bevorzugte Adjuvantien zur Verwendung mit injizierbaren Influenza-Impfstoffen. Bakterielle Toxine und Bioadhäsive sind bevorzugte Adjuvantien zur Verwendung mit über die Schleimhaut abgegebenen Impfstoffen, wie nasalen Impfstoffen.
Patienten
Die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung sind üblicherweise zur Verwendung gegen pandemische Influenza-Virus-Stämme, und daher sind bevorzugte Patienten, die die Impfstoffe erhalten sollen, ältere Menschen (z. B. ≥ 50 Jahre alt, vorzugsweise ≥ 65 Jahre), jüngere Menschen (z. B. ≤ 5 Jahre alt), im Krankenhaus befindliche Patienten, Mitarbeiter des Gesundheitssystems, Personal der Streitkräfte und des Militärs, schwangere Frauen, chronisch Kranke und Menschen, die ins Ausland reisen. Die Impfstoffe sind jedoch nicht ausschließlich für diese Gruppen geeignet und können auch in allgemeinerer Form in der Bevölkerung verwendet werden.
Kinder im Alter von 0–3 Jahren erhalten im Allgemeinen geringere Influenza-Impfstoff-Dosen (z. B. eine halbe Dosis).
Definitionen
Der Begriff ”umfassen” bedeutet ”enthalten” sowie ”bestehen aus”; so kann z. B. eine Zusammensetzung, die X ”umfasst”, ausschließlich aus X bestehen oder noch etwas Zusätzliches enthalten, z. B. X + Y.
Der Begriff ”im Wesentlichen” schließt ”vollständig” nicht aus; zum Beispiel kann eine Zusammensetzung, die ”im Wesentlichen frei” von Y ist, vollständig frei von Y sein. Sofern erforderlich kann der Begriff ”im Wesentlichen” bei der Definition der Erfindung weggelassen werden.
Der Begriff ”etwa” in Verbindung mit einem Zahlenwert x bedeutet z. B. x ± 10%.
AUSFÜHRUNGSARTEN DER ERFINDUNG
Nicholson et al. (2001) The Lancet 357: 1937–1943 haben gezeigt, dass ein Impfstoff, der ausgehend von dem nicht-pathogenen Vogel-Stamm A/Duck/Singapore/97(H5N3) hergestellt wurde, in der Lage war, Antikörpermengen für den Kreuzschutz (cross-protection) gegen den antigenisch verwandten, pathogenen humanen Stamm A/Hong Kong/156/97 (H5N1) zu induzieren. Derselbe Vogelstamm ist in der Lage, Kreuzschutz gegen weiter entfernte Stämme an Patienten zu verleihen, was darauf hinweist, dass künftig aufkommende pandemische humane Stämme empfindlich gegenüber Antikörpern sein werden, die gegen pathogene Vogelstämme aus der vorherigen Saison erzeugt wurden. Vorzugsweise wird der aufkommende heterologe humane Influenz-Impfstoff vom gleichen Hämagglutinin-Typ (d. h. H5 oder H9) sein wie der pathogene Vogel-Influenza-Stamm.
Wenn ein humaner pandemischer Stamm auftritt, der sich durch Kontakt von Mensch zu Mensch durch die Population verbreitet, so kann dieser Stamm eingesammelt werden, und seine Antigene können charakterisiert werden. Statt jedoch auf diese Charakterisierung zu warten und anschließend auf die Herstellung von Impfstoff-Stämmen, das Anzüchten des Virus, die Formulierung des Impfstoffs und die Verbreitung des Impfstoffs zu warten, wendet sich das erfindungsgemäße Verfahren kürzlich aufgetretenen pathogenen Vogel-Stämmen zu, die sich durch die Vogel-Population verbreitet haben, es jedoch nicht geschafft haben, sich innerhalb der humanen Population zu verbreiten. Diese pathogenen Vogel-Stämme werden verwendet, um Stämme für die Impfstoffproduktion herzustellen, z. B. durch reverse genetische Verfahren, bei denen das HA-Antigen des pathogenen Vogel-Stamms in einen Ausgangsstamm für die Herstellung des Humanimpfstoffs zu überführen. Der resultierende Stamm wird anschließend auf normale Weise für die Herstellung des Humanimpfstoffs verwendet, und der Impfstoff wird verwendet, um eine humane Population zu impfen, für die ein Risiko durch den aufkommenden pandemischen Stamm besteht. Der Impfstoff ist in der Lage, Antikörper zu induzieren (insbesondere heterotypische Antikörper), die in der Lage sind, antigenisch unterschiedliche, neu auftretende humane Stämme zu neutralisieren.
Es wird verständlich sein, dass die Erfindung lediglich beispielhaft beschrieben wurde, und dass Modifikationen vorgenommen werden können, ohne den Bereich und die grundlegende Idee der Erfindung zu verlassen.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims

Impfstoff, der Folgendes umfasst: (i) ein Antigen von einem Vogel-Influenza-Stamm, der eine hochpathogene Vogel-Influenza verursachen kann, wobei das Antigen in Form eines gereinigten viralen Proteins, eines Spaltvirus oder eines inaktivierten Gesamt-Virus vorliegt, und (ii) ein Adjuvans, wobei das Adjuvans ein Aluminiumsalz oder eine Submikron-Squalen/Wasser-Öl-in-Wasser-Emulsion ist, zum Schutz eines humanen Patienten gegen eine Infektion mit einem aufkommenden, künftigen, humanen, pandemischen Influenza-Virus-Stamm, wobei der aufkommende, künftige, humane, pandemische Influenza-Virus-Stamm vom gleichen Hämagglutinin-Typ ist, jedoch antigenisch nicht mit dem pathogenen Vogel-Influenza-Stamm eng verwandt ist.
Impfstoff gemäß Anspruch 1, wobei der Hämagglutinin-Typ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H5 und H9.
Impfstoff gemäß einem der obigen Ansprüche, der ferner Antigene von einem oder von mehreren humanen Influenza-Virus-Stämmen umfasst.
Impfstoff gemäß einem der obigen Ansprüche, der ferner Antigene von einem oder von mehreren zusätzlichen Vogel-Influenza-Stämmen umfasst.
Impfstoff gemäß einem der obigen Ansprüche, wobei das Antigen in einer Subvirion-Form vorliegt.
Impfstoff gemäß einem der obigen Ansprüche, wobei der Impfstoff zwischen 0,1 μg und 25 μg HA pro Influenza-Virus-Stamm pro Dosis umfasst.
Impfstoff gemäß Anspruch 6, wobei der Impfstoff zwischen 0,1 μg und 5 μg HA pro Influenza-Virus-Stamm pro Dosis umfasst.
Impfstoff gemäß einem der obigen Ansprüche, wobei der Impfstoff ein Antibiotikum oder andere Konservierungsmittel umfasst.
Kit zum Schutz eines humanen Patienten gegen eine Infektion mit einem aufkommenden, künftigen, humanen, pandemischen Influenza-Virus-Stamm, das folgendes umfasst: (a) einen ersten Behälter, der ein Antigen von einem pathogenen Vogel-Influenza-Virus-Stamm umfasst, wobei das Antigen in Form eines gereinigten viralen Proteins, eines Spaltvirus oder eines inaktivierten Gesamt-Virus vorliegt, wobei der aufkommende, künftige, humane, pandemische Influenza-Virus-Stamm vom gleichen Hämagglutinin-Typ ist, jedoch antigenisch nicht mit dem pathogenen Vogel-Influenza-Stamm eng verwandt ist; und (b) einen zweiten Behälter, der Antigene von einem oder von mehreren humanen Influenza-Virus-Stämmen umfasst.
Kit gemäß Anspruch 9, wobei Behälter (a) ein Adjuvans umfasst.
Kit gemäß Anspruch 10, wobei Behälter (b) ein Adjuvans umfasst.
Kit gemäß Anspruch 10, wobei Behälter (b) kein Adjuvans umfasst.