CZ20021043A3 - Pouľití kombinace polyoxyethylensorbitanového esteru a oktoxynolu pro výrobu pomocného prostředku - Google Patents

Description

Použití kombinace polyoxyethylensorbitanového esteru a oktoxynolu pro výrobu pomocného prostředku

Oblast techniky

Vynález se týká použití kombinace polyoxyethylensorbitanového esteru a oktoxynolu pro výrobu pomocného prostředku pro vakcíny. Součást vynálezu tvoří rovněž vakcíny, které tyto prostředky obsahují a způsoby jejich výroby. Uvedené pomocné prostředky jsou zvláště vhodné pro použití na povrchy sliznic, podporují však také systemický účinek vakcín, zejména jde o vakcíny proti chřipkovému viru.

Dosavadní stav techniky

Kromě výhody, spočívající v tom, že ošetřovaná osoba se vyhne podávání injekcí, které obvykle vyvolávají negativní odezvu, je očkování sliznicí výhodné také z toho důvodu, že bylo prokázáno, že toto podání očkovacích materiálů u živočichů je obvykle účinnější při vyvolání ochranné odpovědi právě na povrchu sliznic, které jsou obvyklou vstupní cestou pro řadu patogenních organismů.

Mimo to je pravděpodobné, že očkování sliznicí, například nosní sliznicí, může vyvolat imunitu sliznice nejen v nose, nýbrž i na vzdálenějších sliznicích, například na sliznicí pohlavního ústrojí, jak bylo popsáno v publikacích Mestecký, 1987, Journal of Clinical Immunology, 7, 265-276, McGhee and Kiyono, Infectiuos Agents and Disease, 1993, 2, 55-73. Přes intenzivní výzkum v tomto oboru nejsou stále ještě k dispozici dostatečně bezpečné a účinné pomocné prostředky, které by

99

9 9

9 9 9

9 9999

9 9

9

9

99 9 9 9 9

9 9

99 a

• a • a • 9 9999 byly vhodné pro použití u člověka. Vynález si klade za úkol tento problém vyřešit.

Bylo již popsáno použití neiontových smáčedel v lékařství. Bylo například popsáno podání polyoxyethylensorbitanových esterů, polyoxyethylenetherů, žlučových solí a dalších látek, podporujících vstřebávání pro zlepšený příjem inzulínu nosní sliznicí podle publikace Hirai a další, 1981, International Journal of Pharmaceutics, 9, 165-172, Híraí a další 1981,

International Journal of Pharmaceutics, 9, 173-184.

Ve vakcínách byla použita také další neiontová smáčedla. Například v dokumentu WO 94/17827 byly popsány vakciny, které obsahovaly směs polyoxyethylenricinového oleje nebo směsi glyceridů kyseliny kaprilové a kaprínové s polyoxyethylensorbitanmonoestery a mimo to antigen, tyto vakciny byly schopné vyvolat systemickou odpověď imunitního systému po místním podání na sliznicí. Tato patentová přihláška popisuje kombinaci neiontového smáčedla Tween20™ (polyoxyethylensorbitanmonoester) a Imwitor742™ (glyceridy kyseliny kaprilové a kaprinové) nebo kombinaci Tween20™ a polyoxyethylenricinového oleje ke zvýšení systemické odpovědi imunitního systému po podání nosní sliznicí. Podrobnosti, týkající se účinnosti uvedeného prostředku na zvýšení imunitní odpovědi byly popsány v literatuře, například v publikacích Gizurarson a další, 1996. Vaccine Research, 5, 69-75, Aggerbeck a další, 1977, Vaccine, 15, 307-316, Tebbey a další, Viral Immunol, 1999, 12(1), 41-5. V příkladech, uvedených v dokumentu WO 94/17827, zvláště v příkladu 4, je potřebná koncentrace Tween 20™ pro zvýšení odpovědi imunitního systému velmi vysoká, 36 %, kdežto při koncentraci 28 % ·· · *· ·* ·* ·« • · · ··* «·«· • · · » · · ··* · · · • · ···& ·· · · ··· · · ··· ···· ··· »· · ·· ·< ·· ··*· nedochází ke zvýšení odpovědi imunitního systému ani v přítomnosti glyceridu kyseliny kaprylové a kaprinové.

Neiontová smáčedla byla také zpracovávána takovým způsobem, aby vznikaly vakuoly neiontového smáčedla, běžně označované jako NISV podle US 5679355. Takové prostředky s obsahem neiontových smáčedel, často v přítomnosti cholesterolu, vytvářejí dvouvrstevné lipidové vakuoly, které zachytí antigen ve své vnitřní vodné fázi nebo přímo ve dvojité vrstvě.

V mezinárodní patentové přihlášce WO 96/36352, která odpovídá dokumentu US 5653987, se popisuje kapalný farmaceutický prostředek, který obsahuje alespoň dvě látky, podporující vstřebávání a vodu. Prostředek je primárně určen pro perorální podávání inzulínu, přičemž množství každé látky, která podporuje vstřebávání, se pohybuje v koncentraci 1 až 10 % hmotnostních, vztaženo na hmotnost celého prostředku.

Smáčedla se běžně užívají v pomocných prostředcích typu olejových emulzí pro systemické podání, funkcí těchto látek je stabilizace olejových kapek. Například se užívají estery polyoxyethylensorbitanu (Tween™) nebo' estery sorbitanu s mastnými kyselinami (Spán™) ke stabilizaci oleje v emulzi ve vodě podle EP 0399843 B nebo WO 95/17210.

Vakciny proti chřipkovému viru jsou obvykle připravovány při použití prostředku Triton X-100 nebo při použití směsí prostředku Tween a etheru. Při klinickém srovnání systemické imunogenity obou typů prostředků jsou tyto prostředky srovnatelné podle publikace Gross a další • · · • · · · • · ··· • · · · • · ···· · • · ·

1981. J. Clin. Microbiol 14, 534-8. Byla rovněž sledována účinnost jiných smáčedel na imunogenitu složených vakcin. Při srovnávací studii parenterálních vakcin v publikaci Mukhlis a další 1984 Vaccine 2, 199-203 se prokázalo, že neporušený virus měl větší imunogenitu než virus, rozrušený smáčedlem, avšak při použití různých smáčedel byla smáčedla Triton X-100 a cetyltrimethylamoniumbromid CTAB výhodnější než například smáčedlo empígen.

Podstata vynálezu

Vynález je založen na překvapujícím zjištění, že estery polyoxyethylensorbitanu v kombinaci s oktoxynolem představují účinný pomocný prostředek pro vakcíny. Tyto prostředky se s výhodou podávají systemicky, mohou však vyvolat systemickou odpověď imunitního systému i v případě, že jsou podány na povrch sliznice. Odpověď imunitního systému, vyvolaná vakcínami podle vynálezu, může být stejně vysoká nebo alespoň srovnatelná s odpovědí, kterou je možno pozorovat po systemickém podání běžné vakcíny.

Součást podstaty vynálezu tedy tvoří bezpečný a účinný pomocný prostředek, který je možno snadno získat a je možno jej podávat na sliznici nebo systemicky.

Vakcina podle vynálezu bude obsahovat jako pomocný prostředek ester polyoxyethylensorbitanu a oktoxynol.

Uvedený pomocný prostředek bude obvykle ve vakcíně obsažen spolu s alespoň jedním antigenem.

Zvláště výhodná je vakcína, která obsahuje pomocný prostředek podle vynálezu, spolu s antigenem chřipkového viru a je určena pro podání na povrch sliznice, zvláště nosní sliznice. Možné jsou všaké také jiné způsoby podání, jak bude dále podrobněji popsáno.

Oktoxynoly a estery polyoxyethylensorbitanu jsou popsány v souhrnné publikaci Surfactant systems Eds: Attwood and Florence 1983, Chapman and Halí. Skupina oktoxynolů včetně terč.oktylfenoxypolyethoxyethanolu, prostředku Triton X-100 je popsána také v publikaci Merck Index, č. 6858, s. 1162, 12. vydání, Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, N. J. , USA ISBN 0911910-12-3. Estery polyoxyethylensorbitanu, například polyoxyethylensorbitanmonooleát, Tween 80 jsou rovněž popsány v publikaci Merck Index, č. 7742, s. 1308, 12. vydání, Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, N. J., USA ISBN 0911910-12-3. Oba typy smáčedel je možno získat způsoby, které jsou v publikacích popsány, mimo to se tyto látky běžně dodávají (například Sigma Inc.). Výhodnými oktoxynoly pro použití v pomocných prostředcích podle vynálezu jsou další neiontová smáčedla ze série Triton, jako Triton X-45, Triton X-102, Triton X-114, Triton X-165, Triton X-205, Triton X-305, Triton-57, Triton N-101 a Triton N-128, zvláště výhodnou látkou je Triton X-100, terč.oktylfenoxypolyethoxyethanol.

Pomocné prostředky podle vynálezu tedy obsahují ester polyoxyethylensorbitanu a oktoxynol. Výhodným oktoxynolem je terč.oktylfenoxypolyethoxyethanol, Triton X-100. Výhodným esterem polyoxyethylensorbitanu je polyoxyethylensorbitan monooleát, Tween 80.

• φ • φ

Pomocný prostředek podle vynálezu s výhodou dále obsahuje sůl žlučové kyseliny nebo derivát žlučové kyseliny.

Pomocný prostředek podle vynálezu tedy může obsahovat ester polyoxyethylensorbitanu, jako polyoxyethylensorbitanmonooleát, Tween 80, oktoxynol, jako terč.oktylfenoxypolyethoxyethanol, Triton X-100 a sůl žlučové kyseliny nebo její derivát, jako deoxycholát sodný nebo taurodeoxycholát. Ve výhodném provedeni obsahuje pomocný prostředek polyoxyethylenmonooleát,

Tween 80, terč.oktylfenoxypolyethoxyethanol, Triton X-100 a deoxycholát sodný.

Celková koncentrace neiontových smáčedel v pomocných prostředcích je nižší než 40 %, s výhodou až 20 %.

Výhodné rozmezí je 0,001 až 20, s výhodou 0,01 až 10 a zvláště přibližně 2 % (g/100 ml).

Jednotlivá neiontová smáčedla mají následující výhodné koncentrace ve výsledné vakcíné: oktyl- nebo nonylfenoxypolyethoxyethanoly, například Triton X-100 nebo jiná smáčedla Tritonové série 0,001 až 20, s výhodou 0,001 až 10, zvláště 0,001 až 1 a zvláště výhodně 0,005 až 0,1 % (g/100 ml), estery polyethylensorbitanu, například Tween 80 v rozmezí 0,01 až 1 a zvláště 0,0 % (g/100 ml).

Zvláště výhodné rozmezí koncentrací neiontových smáčedel je následující:

Tween 80: 0,01 až 1, zvláště výhodně 0,1 % (v/v)

Triton X-100: 0,001 až 0,1, zvláště výhodně 0,005 až 0,02 % (g/100 ml).

• · • · · · · ·

Součást podstaty vynálezu tvoří také vakcína, která obsahuje ester polyoxyethylen sorbitanu v kombinaci s oktoxynolem, přičemž antigen, který je ve vakcíně přítomen, není zachycen ve vakuole neiontového smáčedla.

Nejvýhodnější vakcíny pro vyvolání odpovědi imunitního systému jsou vakcíny, obsahující antigen chřipkového viru. Usmrcené viry a jejich deriváty je možno získat běžným pěstováním na kuřecích zárodcích nebo je možno je odvodit pomocí jakýchkoliv jiných nových postupů, při nichž se k pěstování viru používá tkáňová kultura. Vhodnými buněčnými substráty pro pěstování viru jsou například buňky psích ledvin, jako MDCK nebo buňky podobné buňkám MDCK, dále buňky opičích ledvin, například buňky AGMK včetně buněk Věro nebo jakékoliv jiné buňky, které jsou vhodné pro produkci chřipkového viru pro účely vakcíny. Vhodným buněčným substrátem jsou například také lidské buňky MRC-5. Vhodné buněčné substráty nejsou omezeny na buněčné linie. Je možno použít také primární buňky, například fibroblasty kuřecích zárodků.

Výhodné jsou vakcíny s obsahem antigenního prostředku z chřipkového viru, obsahující složený virus, který byl čištěn v řadě stupňů. Tento antigen je možno získat řadou průmyslově upravitelných postupů, například podle dokumentu DD 300 833 nebo DD 211 444. Běžně se dodává složená vakcína proti chřipkovému viru s názvem Fluarix™ (SmithKline Beecham).

Výhodná vakcína podle vynálezu obsahuje antigen chřipkového viru, vypěstovaného na vaječných zárodcích nebo ve tkáňové kultuře, s výhodou běží o složený ♦ « • · •· ·· ·· • · · · ···· · · · ······· · · · · · · · • ·· · · ······ antigen, mimo to vakcina obsahuje ester polyoxyethylensorbitanu a oktoxynol a popřípadě ještě sůl žlučové kyseliny nebo její derivát. Zvláště výhodně obsahuje vakcina složený antigen chřipkového viru, polyoxyethylensorbitanmonooleát, Tween 80, terč.oktylfenoxypolyethoxyethanol, Triton X-100 a deoxycholát sodný.

Vakcina proti chřipkovému viru podle vynálezu je s výhodou vícevalentní vakcina, obsahující materiál ze dvou nebo většího počtu kmenů chřipkového viru. S výhodou běží o trivalentní vakcínu s obsahem materiálu ze tří kmenů. Běžná vakcina obsahuje materiál ze dvou kmenů A a jednoho kmenu B. Vynález však zahrnuje vakciny, které jsou monovalentní, jsou použitelné například v případě pandemie a obsahují pouze materiál z jediného kmene, obvykle běží o antigen jediného kmene A.

Vakcínu podle vynálezu je možno použít jako ochranný prostředek u savců, kteří jsou ohroženi určitým onemocněním nebo jím trpí. Vakcínu je možno aplikovat na sliznici, například na sliznici dutiny ústní, na střevní sliznici, na poševní sliznici, sliznici konečnímu nebo na nosní sliznici. Vakcínu je možno podávat ve formě kapek, postřiku nebo suchého prášku. Do rozsahu vynálezu spadají rovněž vakciny, určené k rozprašování ve formě aerosolu. Součást vynálezu tvoří také enterosolventní prostředky, například kapsle, odolné proti působení žaludeční šťávy, granuláty pro perorální podání, čípky pro rektální nebo vaginální podání a podobně. Vakcínu podle vynálezu je možno použít ke zvýšení imunogenity antigenů, nanášených na pokožku, transdermálně nebo transkutánně. Mimo to je možno pomocné prostředky podle vynálezu podávat i • · • · · · ·· · a • · · · · · « • · · · · · * « • · · · · · · · • · · · · · · • · · · ·« ···· parenterálně, například nitrosvalově nebo podkožně. V případě použití na nosní sliznici jde s výhodou o vakcíny, které mají hemolytickou povahu.

V závislosti na způsobu podání je možno k aplikaci použít řadu pomůcek. Například při aplikaci na nosní sliznici je možno použít rozstřikovač, například běžně dodávaný Accuspray™ (Becton Dickinson).

Výhodná zařízení pro použití k aplikaci na nosní sliznici jsou taková zařízení, která nejsou závislá na tlaku, který použije uživatel. Tato zařízení mají určitý práh, při němž dojde k uvolnění určité dávky z trysky. Dávka se uvolní pouze při překročení prahové hodnoty tlaku. Tato zařízení snadno dosahují pravidelný rozměr kapek. Tato zařízení jsou v oboru známa a byla popsána například v dokumentech WO 91/13281, EP 311863B a EP 516 636 B. Nyní se taková zařízení běžně dodávají (Pfeiffer GmbH).

Výhodná zařízení pro intranazální aplikaci produkují kapky ve vodě v rozmezí 1 až 200, s výhodou 10 až 120 gm. V případě menší velikosti kapek než 10 gm vzniká riziko inhalace, takže je žádoucí, aby nejvýš 5 % kapek mělo průměr nižší než 10 gm. Kapky s vyšším průměrem než 120 gm se nerozprašují tak dobře jako malé kapky, takže je žádoucí, aby nejvýš 5 % kapek mělo uvedený rozměr.

Výhodnou aplikací na nosní sliznici může být aplikace pomocí přístroje, který obsahuje vždy 2 poddávky jednotlivé dávky, z nichž každá se aplikuje do jedné nosní dírky. V souvislosti s tímto provedením se vynález • · ·· ·· ·· ♦· ·♦· 9 9 9 9

999 9 9999 · · · ······· ·9 999 9 9 týká také balíčku s obsahem takového zařízení pro aplikaci vakcíny na nosní sliznici. Obecně se obě části dávky nacházejí v jediné komoře a konstrukce přístroje dovoluje aplikaci poloviny dávky při jednom uvedení přístroje do chodu.

Vynález se rovněž týká balíčku, který obsahuje přístroj pro nanesení vakcíny na nosní sliznici, tak jak byl svrchu popsán. Ve výhodném provedení obsahuje přístroj vakcínu proti chřipkovému viru.

V některých případech může vakclna obsahovat ještě další složky. Pomocný prostředek podle vynálezu může obsahovat sůl žlučové kyseliny nebo její derivát. S výhodou je derivátem žlučové kyseliny sůl a zvláště sodná sůl. Jako příklad žlučových kyselin a jejich derivátů je možno uvést kyselinu žlučovou jako takovou, kyselinu deoxycholovou, taurodeoxycholát, kyselinu chenodeoxycholovou, lithocholovou, ursodeoxycholovou, hyodeoxycholovou a další deriváty jako glyko-, tauro-, amidopropyl-l-propansulfono-, amidopropyl-2-hydroxy-l-propansulfonové deriváty s vrchu uvedených žlučových kyselin, použitelný je také N,N-bis-(3D-glukonoamidopropyl)deoxycholamid. Zvláště výhodným případem je deoxycholát sodný NaDOC v konečné' vakcíně.

Pomocný prostředek podle vynálezu je výhodný ve formě vodného roztoku nebo suspenze bez obsahu vakuol. Prostředky tohoto typu se snadno reprodukovatelně připravují a snadno se sterilizují, užívá se obyčejně filtrace přes membránu s průměrem otvorů 450 nebo 220 nm. Tyto prostředky se také snadno podávají na nosní sliznici • · f • · · · ♦ ♦ ♦ • · · · · • · · ·· ·· • · · · ve formě postřiku, aniž by došlo k rozkladu složité fyzikální struktury prostředku.

Součást podstaty vynálezu tvoří rovněž způsob výroby vakcíny, který spočívá v tom, že se pomocný prostředek podle vynálezu smísí s antigenem.

Uvedeným způsobem je možno vyvolat nebo zesílit odpověď imunitního systému tak, že se směs antigenu a pomocného prostředku podle vynálezu podává, zejména na povrch sliznice.

Výhodným způsobem podání je tedy podání na povrch sliznice, zvláště na povrch nosní sliznice. V případě takového podání se vakcina s výhodou podává ve formě postřiku. Ve výhodném provedení se systemická odpověď vyvolává aplikací vakcíny na nosní sliznici. To znamená, že vakcina podle vynálezu, určená pro podání na povrch sliznice, je schopná vyvolat systemickou odpověď imunitního systému při tomto podání.

Vynález se dále týká použití esteru polyoxyethylensorbitanu a oktoxynolu pro výrobu pomocného prostředku, zvláště pro použití na povrch sliznice. Vynález se rovněž týká použití esteru polyoxyethylensorbitanu, oktoxynolu a antigenu pro výrobu vakcíny, zvláště určené pro aplikaci na sliznici. Antigenem je s výhodou antigen chřipkového viru. Zvláště výhodné jsou pomocné prostředky a vakcíny, určené pro podání na nosní sliznici.

Výhodným způsobem podání vakcíny podle vynálezu je způsob, při němž se základní očkování nebo přeočkování !

·· ♦ w· ·« • · w · · · • · · · · · · · 9 • ·♦···«· 9 9

9 9 9 9 9 ·· * 99 99 · 9

9 9

9999 podává na nosní sliznici, s výhodou jde o základní očkování nebo přeočkování proti chřipkovému viru při použití antigenu tohoto viru.

Vakcína podle vynálezu s výhodou obsahuje antigen nebo antigenní prostředek, schopný vyvolat odpověď imunitního systému proti lidskému patogenu, přičemž antigen nebo antigenní prostředek může být odvozen od HIV-1 (jako tat, nef, gpl20 nebo gpl60), od lidského herpetického viru, například gD nebo jeho derivátu nebo může jít o časný protein, jako ICP27 z HSV1 nebo HSV2, dále může jít o antigen cytomegaloviru (esp Human), jako gB nebo deriváty, antigen rotaviru včetně živého zeslabeného viru, viru Epstein Barr, jako gp350 nebo deriváty, viru Varicella Zoster, jako gpl, II a IE63 nebo viru hepatitidy, například viru hepatitidy B, například povrchového antigenu viru hepatitidy B nebo jeho derivátu, viru hepatitidy A, hepatitidy C a hepatitidy E nebo jiných vírových pathogenů, jako jsou paramyxoviry, virus Respirátory Syncytial (například proteiny F a G nebo jejich deriváty, virus parainfluenzy, spalniček, příušnic, lidský papillomavirus, jako HPV6, 11, 16, 18 a podobně), flavivirus, například virus žluté horečky, Dengue nebo klíšťové encafalitidy a japonské encefalitidy nebo chřipkový virus (živý nebo inaktivovaný neporušený virus, části viru, pěstované na vajíčkách nebo buňkách MDCK nebo Věro nebo může jít o chřipkové vírusomy, popsané v publikaci R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920, nebo čištěné nebo rekombinantní proteiny, jako HA, NP, NA nebo M nebo jejich kombinace) nebo může jít o antigeny, odvozené od bakteriálních pathogenů, jako jsou Neisseria spp. včetně N. gonorrhea a N. meningitidis (například kapsulární polysacharidy a jejich konjugáty, proteiny, • ·

4

4

4 44» 4 • · * · 4 4

4444 4 · • · 4 4«4

4 4 4 4 schopné vázat transferrin nebo laktoferrin, PiLC a adhesiny), S. pyogenes (například proteiny M nebo jejich fragmenty, proteáza C5A, kyseliny lipoteichové),

S. agalactiae, S. mutans, H. ducreyi, Moraxella spp, včetně M. catarrhalis, označovaná také jako Branhamella catarrhalis (například adhesiny a invasiny s vysokou a nízkou molekulovou hmotností, Bordetella spp. včetně

B. pertussis (například pertactin, toxin pertusse nebo jeho deriváty, vláknitý hemagglutinin, adenylátcykláza nebo fimbriae), B. parapertussis a B. bronchiseptica, Mycobacterium spp. včetně M. tuberculosis (například ESAT6, Antigen 85A, -B nebo -C) , M. bovis, M. leprae,

M. avium, M. paratuberculosís, M. smegmatís, Legionella spp. včetně L. pneumophila, Escherichia spp. včetně enterotoxické E. coli (například kolonizační faktory, toxin, labilní při působení tepla nebo jeho deriváty, toxin, stabilní za tepla nebo jeho deriváty), enterohemorragická E. coli, enteropathogenní E. coli (například toxin, podobný shigatoxinu nebo jeho deriváty), Vibrio spp. včetně V. cholerae (například cholerový toxin nebo jeho deriváty), Shigella spp. včetně S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexnerii, Yersinia spp. včetně Y. enterocolitica (například protein Yop),

Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Campylobacter spp. včetně C. jejuni (například toxiny, adhesiny a invasiny) a C. coli, Salmonella spp. včetně S. typhi, S. paratyphi, S. choleraesuis, S. enteritidis, Listeria spp. včetně L. monocytogenes, Helicobacter spp. včetně H. pylori (například uráza, kataláza, vakuolační toxin),

Pseudomonas spp. včetně P. aeruginosa, Staphylococcus spp. včetně S. aureus, S. epidermidis, Enterococcus spp. včetně E. faecalis, E. faecium, Clostridium spp. včetně

C. tetani (například tetanotoxin a jeho deriváty), • 4 · •944 · 9 • 4 44 ί · · *

I « 4

C. botulinum (například botulotoxin a jeho deriváty),

C. difficile (například toxin A a B a jeho deriváty), Bacillus spp. včetně B anthracis (například botulotoxin a jeho deriváty, Corynebacterium spp. včetně C. diphtheriae (například toxin záškrtu a jeho deriváty, Borrelia spp. včetně B. burgdorferí (například OspA, OspC, DbpA, DbpB),

B. garinii (například OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. afzelii (například OspA, OspC, DbpA, DbpB), B.andersonii (například OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. hermsii, Ehrlichia spp. včetně E. equi a činidla pro lidskou granulocytární ehrlichiózu, Rickettsia spp. včetně R. rickettsii, Chlamydia spp. včetně C. trachomatis (například MOMP a proteiny, které se váží na heparin), C. pneumoniae (například MOMP a proteiny, které se váží na heparin),

C. psittaci, Leptospira spp. včetně L. interrogans, Treponema spp. včetně T. pallidum (například vzácné proteiny zevní membrány), T. denticola,

T. hyodysenteriae, může jít také o antigeny, odvozené od parazitů, jako jsou Plasmodium spp. včetně P. falciparum, Toxoplasma spp. včetně T. gondii (například SAG2, SAG3, Tg34), Entamoeba spp. včetně E. histolytica, Babesia spp. včetně B. microti, Trypanosoma spp. včetně T. cruzi, Giardia spp. včetně G. lamblia, Leshmania spp. včetně L. major, Pneumocystis spp. včetně P. carinii,

Trichomonas spp. včetně T. vaginalis, Schistosoma spp. včetně S. mansoni nebo antigeny, odvozené od kvasinek, jako Candida spp. včetně C. albicans nebo Cryptococcus spp. včetně C. neoformans.

Výhodné bakteriální vakcíny obsahují antigeny, odvozené od Streptococcus spp. včetně S. pneumoniae (například kapsulární polysacharidy a jejich konjugáty, PsaA, PspA, streptolysin, protein, schopné vázat cholin) • 9 ·· *· ·· ·· * · 9 * « » • · ♦ ♦ · * » • · * » · · · • · 9 · 9 9 9 9 * 9 9 ·· 99 9 99 9 a proteinový anti.gen pneumolysin (Biochem Bíophys Acta,

1989, 67, 1007, Rubins a další, Microbial Pathogenesis,

25, 337-342) a také mutované detoxifikované deriváty tohoto antigenu, popsané v dokumentech WO 90/06951 a WO

99/03884. Další výhodné bakteriální vakcíny obsahují antigeny, odvozené od Haemophilus spp. včetně H.

influenzae typ B (například PRP a jeho konjugáty), H.

influenzae, u nějž není možno určit typ, například OMP26, adhesiny s vysokou molekulovou hmotností, P5, P6, protein D a lipoprotein D, fimbrin a peptidy, odvozené od fimbrínu podle US 5843464 nebo varianty ve vícenásobných kopiích a jejich fúzní proteiny. Další výhodné bakteriální vakcíny obsahují antigeny, odvozené od

Moraxella catarrhalis (včetně vesikulů vnější membrány a OMP106 podle WO 97/41731) a antigeny odvozené od Neisseria meningitidis B (včetně vesikulů vnější membrány a Nspa podle WO 96/29412) .

Deriváty povrchového antigenu hepatitidy B jsou v oboru známé a zahrnují mimo jiné antigeny PreSl a PreS2 S, popsané v evropských patentových spisech EP 414374,

EP 304578 a EP 198474. V jednom z výhodných provedení obsahuje vakcína podle vynálezu antigen HIV-1, gpl20, zvláště v případě exprese v buňkách CHO. Podle dalšího možného provedení obsahuje vakcína podle vynálezu gD2t ve svrchu uvedeném významu.

Ve výhodném provedení vakcíny podle vynálezu s obsahem pomocného prostředku podle vynálezu obsahuje vakcína antigen, odvozený od lidského papilomavirů HPV, který je příčinou vzniku genitálních bradavic, HPV 6, HPV 11 a další) a mimo to některé kmeny dávají vznik zhoubným nádorům děložního hrdla (HPV16, HPV18 a další).

• φ φφ φ · * · • φ « • · ·· φ φ · · φ • Φφφφ φφφ • ·· * · φφφφφφ

Φ *

9 9 ·9 99

Zvláště výhodné vakcíny pro prevenci nebo léčení genitálních bradavic obsahují částice LI nebo capsomery a fuzní proteiny, obsahující jeden nebo větší počet antigenů ze skupiny proteinů Εβ, E7, LI a L2 kmenů HPV 6 a HPV 11.

Nejvýhodnější formou fúzního proteinu je L2E7, popsaný v dokumentu WO 96/26277 a protein D (1/3)-E7, popsaný v GB 9717953.5 (PCT/EP98/05285).

Výhodná vakcína pro prevenci nebo léčení infekce nebo zhoubného nádoru děložního hrdla může obsahovat antigeny HPV 16 nebo 18. Jde například o monomery antigenů LI nebo L2, dále o antigeny LI nebo L2, přítomné společně jako částice VLP, podobné viru nebo může jít o samotný protein LI ve struktuře capsomeru nebo ve formě VLP. Tyto antigeny, částice podobné viru a capsomery jsou samy o sobě známé a byly popsány například v dokumentech WO 94/00152, WO 94/20137, WO 94/05792 a WO 93/02184.

Další časné proteiny mohou být ve vakcíně obsaženy jako takové nebo ve formě fúzních proteinů, jde například o E7, E2 nebo E5, ve zvláště výhodném provedení obsahuje vakcína VLP s obsahem fúzního proteinu L1E7 podle dokumentu WO 96/11272.

Zvláště výhodným antigenem HPV 16 jsou časné proteiny E6 nebo E7, spojené s proteinem D jako nosičem za vzniku fúzních proteinů D-E6 nebo D-E7 z kmene HPV 16 nebo kombinaci takových proteinů nebo kombinaci E6 nebo E7 s L2 podle WO 96/26277.

• Φ φ φ φ * φ φ φ · * φφφφφ • φ φ ·· · φφ

.. - φ φ φ φ φφφ φ φφφ φφ φφφφ φφ φφ φ φ φ • φφφφ φ φ φ φ φ • φ φ φ φ φ · φ ··

V dalším možném provedení mohou být časné bílkoviny HPV 16 nebo 18, E6 a E7 v jediné molekule, s výhodou jako fúzní protein D-E6/E7, Taková vakcína může popřípadě obsahovat proteiny E6 nebo E7 nebo oba tyto proteiny z HPV 18, s výhodou ve formě fúzního proteinu D-Εβ nebo D-E7 nebo D-E6/E7.

Vakcína podle vynálezu může mimo to obsahovat antigeny z jiných kmenů HPV, s výhodou jde o kmeny HPV 6, 11, 31, 33 nebo 45.

Vakcína podle vynálezu může dále obsahovat antigeny, odvozené od parazitů, vyvolávajících malárii. Například výhodnými antigeny Plasmodia falciparum jsou RTS,S a TRAP. RTS je hybridní protein, který obsahuje v podstatě celý C-konec circumsporozoitu (CS), jde o protein P. falciparum, vázaný čtyřmi aminokyselinami části preS2 povrchového antigenů hepatitidy B na povrchový antigen S viru hepatitidy B. Úplná struktura tohoto materiálu byla popsána v mezinárodní patentové přihlášce číslo PCT/EP92/02591, zveřejněné pod číslem WO 93/10152 s prioritou z britské přihlášky číslo 9124390.7. Při expresi v kvasinkách je RTS produkován jako částice lipoproteinu a při současné expresi s antigenem S z HBV vzniká smíšená částice, známá jako RTS,S. Antigeny TRAP jsou popsány v mezinárodní patentové přihlášce číslo PCT/GB89/00895, zveřejněné pod číslem WO 90/01496. Výhodným provedením je vakcína proti malárii, v níž je antigenem kombinace antigenů RTS,S a TRAP. Dalšími antigeny plasmodia, které mohou být zařazeny do vícevalentní vakcíny proti malárii jsou antigeny P. faciparum MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAPI, RAP2, sequestrin, PfEMPl, Pf332, LSAl, LSA3, STARP, SALSA, *

9

9 9

9999

9

9

9

9 9 9

9 9

9 · ·

PfEXPl, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfsl6, Pfs48/45, Pfs 230 a další analogy Plasmodium spp.

Vakcína podle vynálezu může také obsahovat protinádorový antigen a je možno ji využít pro imunotherapeutické léčení zhoubných nádorů. Pomocný prostředek je v tomto případě možno použít spolu s příslušnými antigeny zhoubných nádorů prostaty, mléčné žlázy, tlustého střeva a konečníku, plic, slinivky břišní, ledvin nebo s antigeny melanomu. Jako příklady takových antigenů je možno uvést MÁGE 1 a MÁGE 3 nebo jiné antigeny MÁGE v případě léčení melanomu, PRÁME, BAGE nebo GAGE podle publikací Robbins a Kawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8, s. 628-636, Van den Eynde a další, International Journal of Clinical & Laboratory Research, 1997, Correale a další, 1997,

Journal of the National Cancer Institute 89, s. 293. K expresi těchto antigenů dochází u široké škály nádorových typů, například u melanomu, plicního karcinomu, sarkomu a karcinomu močového měchýře. Je také možno použít další antigeny, specifické pro některé nádory, může jít například o antigen PSA, specifický pro prostatu, o antigeny Her-2/neu, KSA (GA733), MUC-1 a karcinoembryonální antigen CEA. Podle jednoho provedení vynálezu se vynález týká vakciny, která obsahuje pomocný prostředek podle vynálezu a protinádorový antigen.

Antigen může být sám o sobě peptidovým hormonem, může jít například o hormon, uvolňující gonadotropin s plnou délkou GnRH, WO 95/20600, o odvozený peptid s 10 zbytky aminokyselin, vakciny tohoto typu jsou rovněž vhodné k léčení řady zhoubných nádorů nebo pro imunokastraci.

«4 · • » ♦ • 4 4 ·

4*444 •44 ·

*» 44 • 4 4 • 4 4 ♦ 4 • 4 4 4 • 4 4 ·

44 • 4 4 • 4 • 4

44

4*44

Předpokládá se, že pomocné prostředky podle vynálezu budou použity také ve vakcínách, obsahujících antigeny, odvozené od Borrelia sp. Například mohou takovými antigeny být nukleové kyseliny, antigeny nebo antigenní prostředky, odvozené od pathogenního organismu, rekombinantní proteiny nebo peptidy a chimérní fúzní proteiny. Vhodným antigenem je například OspA. OspA může být úplný protein v lipidované formě, získaný z hostitelských buněk E. coli, označovaný Lipo-OspA nebo může jít o nelipidovaný derivát. Tyto nelipidované deriváty zahrnují nelipidovaný fúzní protein NSl-OspA, který zahrnuje prvních 81 N-terminálních aminokyselin nestrukturního proteinu NS1 chřipkového viru a úplný protein OspA, další fúzní protein MDP-OspA je nelipidovanou formou OspA, nesoucí 3 přídatné

N-terminální aminokyseliny.

Vakcíny podle vynálezu je možno použít k prevenci nebo k léčení alergií. Vakcíny tohoto typu budou obsahovat antigeny, specifické pro alergen, například Der pl a také antigeny nespecifické pro alergeny, například peptidy, odvozené od lidského IgE, zahrnující dekapeptid podle EP 477231 Bl.

Množství proteinu v každé dávce vakcíny se volí jako množství, které vyvolává imunoprotektivní odpověď bez značných nepříznivých vedlejších účinků. Toto množství se bude měnit v závislosti na použitém specifickém imunogenu a na způsobu podání. Obvykle se předpokládá, že jednotlivá dávka bude obsahovat 1 až 1000, s výhodou 1 až 500, zvláště 1 až 100 a nejvýhodněji 1 až 50 pg proteinu. Optimální množství vakcíny je možno ověřit standardními • ft ftft * · * · systému podávány ♦ ft ftftftft * · ♦ * Μ • » · ♦ : : ··:· · ♦ · ft pokusy, při nichž se pozoruje odpověď imunitního u různých subjektů. Po prvním očkování mohou být ještě další dávky v příslušném časovém odstupu.

Vakciny podle vynálezu je také možno podávat perorálně. V takových případech mohou být přítomny další pomocné látky, například alkalické pufry nebo může být vakcína uložena do kapslí, rozpouštějících se až ve střevech nebo může být zpracována na mikrogranulát. Vakciny podle vynálezu je také možno podávat vaginálně. V takovém případě mohou pomocné látky zahrnovat emulgátory, polymery, jako Carbopol^R a další známé stabilizátory vaginálních krémů a čípků. Další možnou cestou podání je rektální způsob podání. V tomto případě je pomocnou látkou vosk nebo polymer pro výrobu čípku.

Vakciny podle vynálezu a pomocné prostředky podle vynálezu je možno použít pro léčebné i preventivní použití. Je tedy možno léčit savce, ohrožené nebo trpící infekčním onemocněním nebo zhoubným nádorem, alergií nebo autoimunitním onemocněním. Příprava vakcin obecně byla popsána v souhrnném materiálu New Trends and Developments in Vaccines, ed. Voliér a další, University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978.

V dalším možném provedení vynálezu je možno pomocný prostředek podle vynálezu kombinovat s jinými pomocnými prostředky včetně cholerového toxinu a jeho podjednotky B. Dále je možno použít monofosforyllipid A a jeho netoxický derivát, 3-O-deacylovaný monofosforyllipid A, 3D-NPL, popsaný v GB 2220211, dále jsou použitelné imunologicky účinné saponinové frakce, například Quil A, odvozené od kůry jihoamerického stromu Quillaja Saponaria ♦ · ·♦· · • to ·· to ·· ·

·· ·· · ·*·· to • ··· ···

Molina a jeho deriváty, například QS21 podle US 5057540 a také oligonukleotídový pomocný systém CpG, popsaný ve WO 96/02555, zvláště 5'-TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT-3' (SEQ ID NO. 1).

Vynález bude osvětlen následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu. V příkladové části přihlášky byl použit chřipkový virus, vypěstovaný na vaječných zárodcích a inaktivovaný formaldehydem nebo virus, zpracovaný kombinací prostředku Tween a etheru nebo působením NaDOC po doplnění prostředkem Triton X-100. Koncentrace prostředků Tween 80 a Triton X-100 jsou uvedeny v příkladové části přihlášky.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Způsob stanovení odpovědi ve formě protilátek (Ab) v krevním séru

ELISA pro měření specifických Ig Abs proti chřipce

Imunoplotny Maxisorp Nunc se povlékají přes noc při teplotě 4 °C tak, že se užije koncentrace 1 μρ/ιτιΐ HA chřipkového viru, inaktivovaného β-propiolaktonem BPL (SSD GmBH, Drážďany, SRN) v PBS, užije se 50 μΐ tohoto materiálu na jedno vyhloubení plotny. Volná místa na plotně se blokují (1 hodina, 37 °C) při použití saturačního pufru, kterým je PBS, obsahující 1 % BSA,

Μ · • · 9 • 0 9* • 0 9999 • 9 0

9 »* • S

9

9 0 ♦ 9 • 9 9 9

01 • 99 «0

0 0 ·

0 0 • 00 0 0 0 0

0009

0,1 % polyoxyethylensorbitanmonolaurátu, Tween 20. Pak se vytvoří sériové, vždy dvojnásobné ředění referenčního séra v saturačním pufru, které se užije v množství 50 μΐ na jedno vyhloubení a vytvoří se standardní křivka, jde o sérum, jehož střední bod titrace se vyjádří v jednotkách ELISA/ml a hodnoty se uloží do řady A. Mimo to se inkubují vzorky séra, počínaje ředěním 1/100 v řadách B až H, inkubace trvá 1 hodinu a 30 minut při teplotě 37 °C. Plotny se pak 3krát promyjí promývacím pufrem PBS s obsahem 0,1 % polyoxyethylensorbitanmonolaurátu, Tween 20. Pak se inkubuje biotinylovaný kozí Ig proti lidským tkáním (Amersham) v ředění 1/3000 v saturačním pufru v množství 50 μΐ/vyhloubení celkem 1 h a 30 minut při teplotě 37 °C. Po trojnásobném promytí a následném přidání konjugátu streptavidinu a peroxidázy z křenu (Amersham) se plotny ještě 5krát omyjí a pak se inkubují 20 minut při teplotě místnosti s 50 μΐ/vyhloubení vyvíjecího pufru (OPDA 0,4 mg/ml (Sigma) a H₂O₂ 0,03 % v 50 mM citrátového pufru o pH 4,5). Vyvíjení se zastaví tak, že se přidá 50 μΐ 2N H₂SO₄/vyhloubení. Optická hustota se odečítá při vlnové délce 492 a 630 nm při použití odečítacího zařízení Biorad 3550. Titr protilátek se vypočítává ze čtyř parametrů matematickým postupem při použití programu SoftMaxPro.

Inhibice hemaglutinační účinnosti HAI séra Abs, specifického proti chřipkovému viru u myší

Postupuje se tak, že se nejprve 25 μΐ séra 20 minut zpracovává při teplotě místnosti ve 100 μΐ 0,5 M boritanového pufru o pH 9 ve směsi se 125 μΐ kaolinu (Dade Behring). Po odstředění 30 minut při 3000 otáčkách ·» 00 • «0 ·

0 0

0·

0« • 0 «00« • * · * 0 » • 0 0 · * « 0 0

• 0 · za minutu nebo při 860 g se odebere 100 μΐ supernatantu, což odpovídá ředění séra 1/10 a materiál se inkubuje 1 hodinu při teplotě 4 °C spolu s 0,5 % kuřecích červených krvinek. Po odstředění 10 minut při 3200 otáčkách za minutu (970 g) se odebere supernatant. Oba uvedené postupy se provádějí k odstranění přírodních hemaglutinačních faktorů, obsažených v séru. Pak se 25 μΐ zpracovaného séra zředí 25 μΐ PBS (sériové ředění na dvojnásobek, počínaje od poměru 1/20) na Grinerových plotnách s 96 vyhloubeními. Pak se přidá do každého vyhoubení 25 μΐ inaktivovaného neporušeného viru BPL v koncentraci 4 hemaglutinační jednotky (jde o koncentraci, která je 4krát nižší než poslední koncentrace, která vyvolává shlukování červených krvinek), směs se inkubuje 30 minut při teplotě místnosti za míchání. Pak se přidají kuřecí červené krvinky v množství 25 μΐ/vyhloubení a směs se nechá stát 1 hodinu při teplotě místnosti. Nakonec se plotny nechají stát přes noc při teplotě 4 °C a pak se výsledek odečte. Vyjádří se titr HAI jako převrácená hodnota posledního ředění séra, které ještě vyvolá inhibici hemaglutinace, vyvolané působením viru.

Příklad 2

Vliv prostředků Tween 80 a Triton na imunogenitu inaktivovaného neporušeného chřipkového viru při podání myším na nosní sliznici

Preklinické vyhodnocení chřipkových vakcín včetně vakcín, obsahujících pomocné prostředky, nebo vakcín na bázi DNA nebo vakcín, nanášených na povrch sliznice, se obvykle provádí na zvířatech, která se ještě s infekcí nesetkala. Slibné výsledky, získané při těchto pokusech, • 9 9

9 • 9 9

9

* 9 · · • ♦ * · · • · 9

9 9 9

99 • » • » však často nebylo možno potvrdit u člověka. Důvod spočíval pravděpodobně v tom, že většina dospělých se již před očkováním s přirozenou infekcí setkala na rozdíl od použitých pokusných zvířat. Nej lepším způsobem vyhodnocení vakcín proti chřipkovému viru na živočišném modelu by tedy byla možnost provádět zkoušky u zvířat, která již obdržela na nosní sliznicí základní dávku očkování. V následujících pokusech byl tímto způsobem zkoumán vliv prostředků Tween 80 a Triton X-100 na zvýšení imunitní odpovědi.

Základní očkování bylo provedeno u myších samic kmene Balb/c ve stáří 8 týdnů ve dni 0 tak, že v průběhu anestezie bylo pipetou naneseno do každé nosní dírky 2,5 μς HA chřipkového viru A/Beijing/262/95, inaktivovaného BPL a obsaženého v 10 μΐ PBS. Po 28 dnech bylo u myší ve skupinách, obsahujících vždy 6 zvířat provedeno přeočkování, rovněž na nosní sliznicí v průběhu anestezie, bylo podáno 20 μΐ roztoku, 10 μΐ do každé nosní dírky pomocí pipety. Očkovací materiál obsahoval 5 μρ HA chřipkového viru A/Beijing/262/95, inaktivovaného BPL za následujících podmínek: A: v PBS, B: v Tween 80 (0,11 %) plus Triton X-100 (0,074 %) .nebo C: nitrosvalově bylo podáno 1,5 μρ HA chřipkové vakciny. Antigeny byly získány od SSD GmBH (Dráždany, SRN). Odpověď typu HAI Ab byla měřena v séru způsobem podle příkladu 1. Jak je zřejmé z obr. 1, v případě přítomnosti prostředků Tween 80 a Triton vyvolával chřipkový virus, podaný na nosní sliznicí, zvýšení imunitní odpovědí po předchozím očkování stejně účinně jako klasická chřipková vakcina, podaná parenterálně. Avšak v případě, že tentýž antigen byl podán na nosní sliznicí bez současného použití • * · • 9 9 9 • 9 9 • » »4» » · *

• 9 9

9 9 · 9

9999 prostředku Tween 80 a Triton, byl vzestup imunogenity podstatně menší.

Příklad 3

Srovnání imunogenity složené vakcíny proti chřipkovému viru s obsahem prostředků Tween 80 a Triton X-100, určené k aplikaci na nosní sliznici s iraunogenitou běžné parenterální vakcíny Fluarix u zdravých dospělých

Prostředky, použité ve studii

Byly použity dva prostředky (A, B) antigenů chřipkového viru, odvozené od viru, pěstovaného na vaječných zárodcích. Prostředek A byl prostředek podle vynálezu pro aplikaci na nosní sliznici, prostředkem B byla běžná vakcína Fluaríx™/a-Rix^R podávaná nitrosvalově. Prostředky obsahovaly tři inaktivované virionové antigeny, připravené z kmenů, doporučených WHO pro období 1998/1999.

Vakcína byla nanášena na nosní sliznici při použití stříkačky Accuspray™ (Becton Dickinson). Do každé nosní dírky bylo naneseno 100 gl prostředku A.

Složení prostředku

Prostředek A, určený pro aplikaci na nosní sliznici obsahuje následující 3 inaktivované viriony:

1. 30 gg HA A/Beijing/262/95 (H1N1)

2. 30 gg HA A/Sydney/5/97 (H3N2)

3. 30 gg HA B/Harbin/7/94 •

4 ♦

*4 4 • · • 4 4

4444 4 » ·

4 • 444 • 4 • 4 »· 4 • 4

4 • 4

44 4 a mimo to roztok chloridu sodného s fosfátovým pufrem o pH 7,4 ± 0,1, doplněný 0,1 % Tween 80, 0,015 % Triton X-100, 0,0045 % deoxycholátu sodného a méně než 35 μρ/ιηΐ thiomersalu.

Objem pro jednu dávku vakcíny byl 200 μΐ (podíl 100 μΐ do každé nosní dírky).

Srovnávací vakcína Fluarix™/a-Rix^R (SmithKline Beecham Biologicals) je běžná inaktivovaná trivalentní protichřipková vakcína. Tato vakcína se podává nitrosvalově v dávce 500 μΐ.

Tato dávka obsahuje:

pg HA ze tří uvedených kmenů, Tween 80 v rozmezí 500 až 1000 μρ/ιηΐ (0,05 až 0,1 %), Triton X-100 v rozmezí 50 až 170 μς/ιηΐ (0,005 až 0,017 %), deoxycholát sodný v množství maximálně 100 μς/ιηΐ, thiomersal 100 μς/ιηΐ a roztok chloridu sodného s fosfátovým pufrem o pH v rozmezí 6,8 až 7,5.

Sledování imunogenity

Imunogenita z kombinované protichřipkové vakcíny, určené k nanášení na nosní sliznicí a obsahující prostředky Tween 80 a Triton X-100, byla srovnávána v otevřeném pokusu s náhodně vybranými subjekty s imunogenitou běžné parenterálně podávané vakcíny Fluarix™. 20 zdravých dospělých ve věku 18 až 40 let obdrželo jednu dávku vakcíny Fluarix, 10 dospělým byla podána jedna dávka vakcíny na nosní sliznicí. Vakcína, • · • · ·

• · · • 9

• · · » • · ···· « • · · ·· a

určená k podání na nosní sliznici, byla podávána v dávce 200 μΐ a obsahovala následující inaktivované viriony:

pg hemaglutininu A/Beijing/262/95 (H1N1), 30 μρ hemaglutininu A/Sydney/5/97 (H3N2) , 30 μς hemaglutininu B/Harbin/7/94 v roztoku chloridu sodného s fosfátovým pufrem o pH 7,4 ± 0,1. Vakcína mimo to obsahovala Tween 80 (0,1 %), Triton X-100 (0,015 %), deoxycholát sodný (0,0045 %) a thiomersal (< 35 μς/ιηΐ) .

Pokusné osoby byly sledovány 8 dnů na místní a celkové vedlejší příznaky, přičemž bylo prokázáno, že obě vakcíny byly bezpečné a byly dobře snášeny. Nebyly pozorovány žádné závažné vedlejší účinky, spojené s očkováním těmito vakcínami.

Imunogenita vakcín byla sledována stanovením titrů pro inhibici hemaglutinace (HI) v krevním séru, tak aby bylo možno stanovit serokonverzí (definovanou jako % očkovaných s alespoň 4násobným vzestupem titru HI v séru ve dni 21 ve srovnání se dnem 0 pro každý použitý kmen), faktor konverze (definovaný jako násobek vzestupu geometrického průměru titru HI v krevním séru (GMT) ve dni 21 ve srovnání se dnem 0 pro každý použitý kmen) a seroprotekci (definovanou jako % vakcinovaných s titrem HI v séru vyšší nebo rovnou 40 po očkování pro každý použitý kmen). Obvykle je zapotřební, aby vakcína měla serokonverzí vyšší nebo alespoň rovnou 40 %, seroprotekci vyšší nebo rovnou 70 % a faktor konverze vyšší nebo rovný 2,5 pro každý kmen, aby byly splněny běžné mezinárodně uznávané požadavky. Tyto požadavky se týkají dospělých v rozmezí 18 až 60 let, pro starší jedince jsou kritéria odlišná.

·· • · • · · • ···· • · ·· • · ·· ·« • ♦ • · • · • · ·· «· ··· ♦· ·· ·* • · ····

Mimo to byly stanoveny titry slizničních protilátek IgA pomocí metody ELISA.

Seropozitivita ΗΊ, serokonverze a seroprotekce 21 dnů po jedné dávce vakcíny Fluarix™ nebo vakcíny podávané na nosní sliznici jsou shrnuty v následující tabulce 1.

Tabulka 1.

Kmen	Skupina	Čas den	N	Seropozi tivita	Titr n	HI O, 0	Vzestup titru HI
n	O 0	n	o o
A/Beij ing	Intranasální vakcína+ Tween 80 a Triton X-100	0 21	20 20	4 17	20,0 85,0	0 15	0, 0 75, 0	15	75,0
	Fluarix	0 21	19 19	4 19	21, 1 100, 0	3 18	15, 8 94,7	19	100, 0
A/Sydney	Intranasální vakcína+ Tween 80 a Triton X-100	0 21	20 20	13 20	65,0 100, 0	3 19	15, 0 95,0	15	75, 0
	Fluarix	0 21	19 19	14 19	73, 0 100, 0	1 18	5, 3 94,7	16	84,2
B/Harbin	Intranasální vakcína+ Tween 80 a Triton X-100	0 21	20 20	10 20	50,0 100, 0	7 18	35,0 90, 0	14	70, 0
	Fluarix	0 21	19 19	17 19	89, 5 100,0	11 19	57, 9 100,0	15	78, 9

Seropozitivita: počet a procentuální podíl osob s titrem > 10 • · ·· · · · · • · · · · · · • · · * · · · · • · · · · · · · • ·

Seroprotekce: počet a procentuální podíl osob s titrem HI > 40

Serokonverze: počet a procentuální podíl osob s alespoň čtyřnásobným vzestupem títru od dne 0 do dne 21.

Ve všech případech byl faktor konverze (násobek vzestupu HI GMT v séru po očkování) vyšší než 2,5, což je úroveň, požadovaná pro dobrou protichřipkovou vakcínu.

Procentuální podíl pokusných osob s dvojnásobným nebo čtyřnásobným vzestupem poměru specifických/slizničních protilátek IgA mezi dnem 21 a dnem 0 je shrnut v následující tabulce 2.

Tabulka 2.

Kmen	Skupina	N	2násob. vzestup %	4násob. vzestup %
A/Beij ing	Tween a Triton	20	55,0	30,0
	Fluarix	19	52,6	26, 3
A/Sydney	Tween a Triton	20	65,0	45,0
	Fluarix	19	47,4	5,3
B/Harbin	Tween a Triton	20	40, 0	30,0
	Fluarix	19	26, 3	5,3

·· ··

Souhrn

Výsledky zkoušek na imunogenitu, tak jak jsou svrchu uvedeny v tabulkách, prokazují, že při aplikaci vakcíny na nosní sliznici bylo dosaženo podobné úrovně seropozitivity, serokonverze a seroprotekce ve srovnání s běžnou parenterální vakcínou Fluarix 21 dnů po podání 1 dávky vakcíny. Vakcína, podávaná na nosní sliznici, obvykle vyvolávala lepší slizniční odpověď protilátek IgA po jedné dávce než běžná parenterální vakcína Fluarix.

Claims (18)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použití kombinace polyoxyethylensorbitanového esteru a oktoxynolu pro výrobu pomocného prostředku pro nanesení na povrch sliznice nemocného.
2. 2. Použití podle nároku 1, při němž se jako ester polyoxyethylensorbitanu použije polyoxyethylensorbitanmonooleát, Tween 80.
3. 3. Použití podle nároku 1 nebo 2, při němž se jako oktoxynol použije terč.oktylfenoxypolyethoxyethanol, Triton X-100.
4. 4. Použití podle některého z nároků 1 až 3, při němž se dále použije sůl žlučové kyseliny nebo její derivát.
5. 5. Použití pomocného prostředku podle některého z nároků 1 až 4 spolu s antigenem pro výrobu vakcíny, určené pro podání na sliznici.
6. 6. Použití podle nároku 5, při němž se antigen volí ze skupiny HIV, viru Varicella zoster, Herpes simplex typ 1, Herpes simplex typ 2, lidský cytomegalovirus, virus Dengue, Hepatitis A, B, C nebo E, Respirační syncytiální virus, lidský papilloma virus, chřipkový virus, Hib, virus meningitidy, Salmonella, Neisseria, Borrelia, Chlamydia, Bordetella, Streptococcus, Mycoplasma, Mycobacteria, Haemophilus, Plasmodium nebo Toxoplasma, decapeptid stanworth nebo antigeny, spojené s nádory (TMA), MÁGE, BAGE, GAGE, MUC-1, Her-2 neu, LnRH, CEA,

   PSA, KSA nebo PRÁME.
7. 7. Použití podle nároku 6, při němž se jako antigen užije antigen nebo antigenní prostředek z chřipkového viru.
8. 8. Použití podle nároku 7, při němž se jako antigenní prostředek použije kombinovaný prostředek z chřipkového viru.
9. 9. Použití podle nároku 7 nebo 8 při výrobě vakcíny pro ochranu proti chřipce.
10. 10. Použití podle některého z nároků 5 až 9 pro výrobu vakcíny pro použití v lékařství.
11. 11. Způsob výroby vakcíny, vyznačující se tím, že se smísí a) ester polyoxyethylensorbitanu,

    b) oktoxynol a c) antigen za získání vakcíny pro podání na povrch sliznice.
12. 12. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že se vakcina připraví v přístroji, určeném pro nanášení aerosolu nebo postřiku na nosní sliznici.
13. 13. Postřikovači přístroj, zvláště k uvolnění dvojité dávky, vyznačující se tím, že je naplněn vakcínou s obsahem esteru polyoxyethylensorbitanu, oktoxynolu a antigenu.
14. 14. Postřikovači přístroj nebo aerosolový přístroj podle nároku 13, vyznačující se tím, že jako antigen obsahuje antigen nebo antigenní prostředek z chřipkového viru.

    9 9
15. 15. Postřikovači přístroj nebo aerosolový přístroj podle nároku 14, vyznačující se tím, že jako antigenní prostředek obsahuje kombinovaný prostředek z chřipkového viru.
16. 16. Způsob léčení savců, trpících nebo ohrožených infekcí pathogenním organismem, zhoubným nádorem nebo alergií, vyznačující se tím, že se na sliznici savce podává bezpečné a účinné množství vakciny, obsahující ester polyoxyethylensorbitanu, oktoxynol a antigen.
17. 17. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že se vakcína podává na nosní sliznici.
18. 18. Způsob podle nároku 16 nebo 17, vyznačující se tím, že se jako vakcína použije vakcína proti chřipkovému viru, obsahující antigen chřipkového viru nebo antigenní prostředek, například kombinovaný prostředek z chřipkového viru.