TW202245836A - 重組ｂ型腦膜炎球菌疫苗 - Google Patents

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Abstract

本揭示文本涉及一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含腦膜炎球菌抗原的組合，所述組合包含至少一種H因子結合蛋白（fHBP）A蛋白、至少一種fHBP B蛋白、至少一種奈瑟氏菌黏附素A（NadA）蛋白和至少一種清潔劑提取的外膜囊泡（dOMV）。腦膜炎球菌抗原可來自腦膜炎奈瑟氏菌血清群B。所述抗原的組合提供了細菌菌株的廣泛覆蓋度。另外，本揭示文本涉及免疫原性組合物在引發免疫反應的方法中的用途。

Description

重組B型腦膜炎球菌疫苗
本揭示文本涉及疫苗領域。本揭示文本涉及用於預防腦膜炎球菌感染如腦膜炎奈瑟氏菌（ Neisseria meningitidis）（ N. meningitidis或 Nm）血清群B（MenB）感染的免疫原性組合物和疫苗。
腦膜炎奈瑟氏菌是革蘭氏陰性雙球菌，人是其唯一已知的自然宿主。腦膜炎奈瑟氏菌是人鼻咽部和口咽部的常見定植菌，但也可發現於身體的其他區域，如肛門黏膜、結膜和泌尿生殖道（Rouphael等人, Methods Mol Biol. 2012;799:1-20；Stephens, Vaccine. 2009;27 增刊2:B71-7；Batista等人, Asian Pac J Trop Med. 2017;10(11):1019-29）。
根據莢膜多糖（PS）的免疫化學，至少已經劃分了12種不同的腦膜炎球菌血清群。一些菌株比其他菌株更可能引起感染。在世界範圍內，大多數腦膜炎球菌病病例是由血清群A、B、C、W、X和Y引起的。血清群B是地方病和一些暴發的原因（Harrison等人 ,[編] Orenstein WA, Offit PA, Edwards KM Plotkin SA. Vaccines. 7. Philadelphia (PA): Elsevier; 2018. p. 619-43；Borrow等人, Expert Rev Vaccines. 2017;16(4):313-28；Harrison等人, Emerg Infect Dis. 2013;19(4):566-73, Pollard, Pediatr Infect Dis J. 2004;23(12增刊):S274-9；Kvalsvig等人, J Clin Pathol. 2003;56(6):417-22）。
腦膜炎奈瑟氏菌血清群B是呼吸道傳播細菌（藉由飛沫），其無法在環境中生存，需要密切和長時間接觸或直接身體接觸（如親吻）才能有效傳播。無症狀攜帶者存在於低於2%的低於5歲的兒童和20%-25%的青少年和年輕成人中，是病原體傳播途徑中和其在自然界中保持的主要因素，甚至在流行期期間也是如此（Christensen等人, Lancet Infect Dis.2010;10(12):853-61；Batista等人, Asian Pac J Trop Med. 2017;10(11):1019-29）。
一般來說，攜帶發生率最高的年齡組是青少年和年輕成人，他們易於從事被認為是攜帶和最終出現侵襲性腦膜炎球菌病（IMD）的危險因素的行為（Christensen等人, Lancet Infect Dis.2010;10(12):853-61；Stephens, Vaccine. 2009;27增刊 2:B71-7；Bruce等人, JAMA. 2001;286(6):688-93；Germinario等人, Hum Vaccin. 2010;6(12):1025-7；MacLennan等人, Emerg Infect Dis. 2006;12(6):950-7）。因此，這些年齡組的疫苗接種有可能影響其他年齡組的IMD發生率，這已在許多歐洲國家得到證明，這些國家的血清群C接合疫苗的疫苗接種活動已導致未接種疫苗年齡組的群體保護（Maiden等人, J Infect Dis. 2008;197(5):737-43；Trotter等人, Lancet. 2004;364(9431):365-7；Bijlsma等人, Clin Infect Dis.2014;59(9):1216-21）。
侵襲性腦膜炎球菌病（IMD）是由腦膜炎奈瑟氏菌（包括腦膜炎奈瑟氏菌血清群B）引起的嚴重疾患，並且症狀可包括劇烈頭痛、發燒、噁心、嘔吐、畏光、頸硬、嗜睡、肌痛和特徵性瘀點皮疹（Harrison等人, [編] Orenstein WA, Offit PA, Edwards KM Plotkin SA. Vaccines. 7. Philadelphia (PA): Elsevier; 2018. p. 619-43）。IMD可導致腦膜炎球菌性腦膜腦炎和腦膜炎球菌血症。腦膜炎球菌血症可能是對人最快速致命的傳染病症，據報導約有90%的死亡發生在住院治療的前2天內。由於主要由莢膜多糖、特異性免疫球蛋白和補體成分C3構成的抗原-抗體複合物的沈積，6%-15%的IMD患者可能出現炎症症候群。這些反應通常發生在疾病發作後4至12天，並且包括關節炎（主要是單關節炎（7%-14%的患者））、皮膚血管炎、虹膜炎、鞏膜外層炎、胸膜炎和心包炎。同時可出現再次發熱、白細胞增多和血清C反應蛋白升高。IMD患者中可能發生的其他併發症包括單純皰疹感染啟動、遠端對稱性壞死、血管炎外觀形貌上的廣泛潰瘍、消化道出血、硬腦膜下積液、心肌炎、橫紋肌溶解、成人型呼吸窘迫症候群、酸鹼和電解質紊亂、腦梗塞和顱內化膿。
IMD倖存者可能會出現後遺症。神經系統後遺症發生的風險為7%-12%（與肺炎球菌性腦膜炎相比比率較低），主要發生在嬰兒中。聽力損失（持續性或暫時性）是最常見的併發症，發生在大約4%的病例中。其他後遺症包括：視覺缺損、腦積水、共濟失調、言語障礙、運動缺陷、發育遲緩、關節炎、痙攣、抽搐、腎衰竭、骨壞死、萎縮性疤痕、四肢部分喪失、學習障礙和行為障礙等（Batista等人, Asian Pac J Trop Med. 2017;10(11):1019-29；Stephens等人, Neisseria meningitidis. [編] J.E. Bennett, R. Dolin和M.J. Blaser. Philadelphia: Elsevier Saunders; 2015. p. 2425-45；Campsall等人, Crit Care Clin. 2013;29(3):393-409；Pace等人, Vaccine. 2012;30增刊2:B3-9）。
血清群B是地方病的重要原因，並導致幾個工業化國家的多種長期流行病（Vuocolo等人, Hum Vaccin Immunother.2018;14(5):1203-15），包括古巴（Rodriguez等人, Mem Inst Oswaldo Cruz.1999;94(4):433-40）、挪威（Fredriksen等人, NIPH Ann.1991;14(2):67-79; 討論 -80）和紐西蘭（Martin等人, J Infect Dis. 1998;177(2):497-500；Dyet等人, Epidemiol Infect. 2006;134(2):377-83）。在諸如法國（從2000年到2003年）（Grodet等人, Microbiol Infect. 2004;10(9):845-8；Caron等人, Lancet Infect Dis. 2011;11(6):455-63）和美國（從2013年到2017年）等其他國家也報告了由單一菌株引起的較小爆發，其中一些與學院和大學有關（Folaranmi等人, 2015. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 2015;64(22):608-12；Atkinson等人, Pharmacotherapy. 2016;36(8):880-92）。
兩種靶向腦膜炎奈瑟氏菌B群的基於蛋白質的廣泛保護性疫苗最近獲得了許可：1) 4組分MenB蛋白質疫苗（4CMenB；來自GlaxoSmithKline公司[GSK]的BEXSERO ®疫苗）在美國（US）被許可作為10-25歲個體的兩劑方案，並在歐洲、澳大利亞、加拿大和南美洲的一些國家用於從2月齡上至50歲的個體；2) 基於二價重組fHBP蛋白（rLP2086）的疫苗（來自Pfizer的TRUMENBA ®疫苗）在美國和歐洲被許可作為10-25歲個體的2劑或3劑方案。
這兩種許可疫苗的臨床試驗揭示，發燒是兒科人群特別關注的不良事件。據報導，在接受BEXSERO疫苗和常規疫苗的嬰兒中，高達70%的嬰兒發生＞ 38ºC的發燒（6%-12%中＞ 39ºC的發燒），因此建議在BEXSERO疫苗免疫時（和在疫苗接種後的前24小時內）使用預防性對乙醯胺基酚。在一項針對兒科人群的TRUMENBA疫苗I/IIb期研究期間，在接受20或60 μg rLP2086劑量的參與者中分別報告了64%和90%的發燒（多數＜ 39.0ºC），並且該研究提前終止（Martinon-Torres等人, Vaccine. 2014;32(40):5206-11）。
用這些疫苗免疫的人會產生補體介導的血清殺細菌抗體（SBA）反應。然而，對於TRUMENBA和BEXSERO疫苗，證實了針對一些MenB菌株的低的fHBP相關SBA活性和覆蓋度，尤其是在學步兒童和嬰兒中如此（Brunelli等人, Vaccine. 2011;29(5):1072-81；Marshall等人, Pediatr Infect Dis J.2012;31(10):1061-8）。已經證實，宿主分子與疫苗抗原的結合可以藉由覆蓋重要表位或減少疫苗攝取（這可導致抗原加工和呈遞減少）來降低免疫原性（Meri等人, Vaccine. 2008;26增刊8:I113-7）。臨床前研究證實，H因子（fH）與野生型重組fHBP抗原的結合會損害人fH轉基因小鼠和幼恒河猴的保護性血清抗fHBP抗體反應（Costa等人, mBio. 2014;5(5):e01625-14；Granoff等人, Clin Vaccine Immunol. 2013;20(8):1099-107）。
因此，顯現出仍然需要針對腦膜炎奈瑟氏菌（如MenB）的在細菌菌株方面具有較大覆蓋度的免疫原性組合物，如疫苗。
需要具有比BEXSERO或TRUMENBA更廣泛的MenB菌株覆蓋度的免疫原性組合物。
還需要具有良好反應原性特徵的免疫原性組合物。
需要具有用於嬰兒和兒科用途的具有良好反應原性和安全性特徵的免疫原性組合物。
另外，需要與TRUMENBA相比具有改善的反應原性特徵的免疫原性組合物。
需要與BEXSERO相比具有改善的反應原性特徵的免疫原性組合物。
此外，需要可以易於與其他抗原組合的針對MenB的免疫原性組合物，所述其他抗原如腦膜炎奈瑟氏菌ACWY抗原，例如與白喉或破傷風類毒素接合的ACWY多糖。
本揭示文本旨在滿足所有或部分這些需求。
在一態樣，揭示了一種多組分腦膜炎球菌免疫原性組合物，其包含至少4種抗原並且旨在提供針對腦膜炎球菌感染（例如由MenB引起的侵襲性腦膜炎球菌病（IMD））的具有可接受的嬰兒適應症安全性的廣泛保護。它由基於在腦膜炎奈瑟氏菌致病機制中的關鍵作用以及誘導針對同源和異源MenB菌株的血清殺細菌抗體（SBA）的能力而選擇的3種主要的表面暴露的重組奈瑟氏菌屬蛋白構成（Pizza等人, Science. 2000;287(5459):1816-20）：來自亞家族A和B的2種非脂化H因子結合蛋白（fHBP）以及一種奈瑟氏菌黏附素A（NadA）蛋白。為了改善多組分MenB疫苗的免疫原性和潛在的菌株覆蓋度，將藉由清潔劑提取獲得的外膜囊泡（OMV）（清潔劑提取的OMV，dOMV，也稱為外膜蛋白複合物（OMPC））添加至配製品中。dOMV來自MenB菌株，例如表現PorA蛋白如PorA VR2 P1.2的菌株。dOMV功效與主要針對同源PorA的殺細菌抗體有關，所述同源PorA在細菌表面上非常豐富。
出乎意料地，諸位發明人已觀察到如本文揭示的免疫原性組合物中的MenB抗原的組合賦予組合物在免疫反應可針對其被引發的MenB菌株方面廣泛的覆蓋度，同時誘導低的反應原性和促炎性作用。
實際上，如 實例部分所示，本揭示文本的免疫原性組合物如疫苗允許達到比TRUMENBA或BEXSERO更廣泛的MenB菌株覆蓋度。值得注意的是，本文揭示的免疫原性組合物引發了針對未由BEXSERO覆蓋的6種MenB菌株的保護性免疫反應。
有利地，本文揭示的免疫原性組合物的抗原提供流行的引起IMD的MenB菌株之間的交叉保護。
有利地，本文揭示的免疫原性組合物包括2種非脂化fHBP重組抗原：A05（根據Pfizer分類，Novartis命名法中又名變異體3.45，或根據PubMLST命名法為肽ID45）和B01（根據Pfizer分類，Novartis命名法中又名變異體1.55，或根據PubMLST命名法為肽ID55），它們代表來自fHBP的2種遺傳上和免疫學上不同的亞家族中各自的1種變異體抗原，這允許確保針對所有MenB菌株的廣泛保護並允許從六週起的嬰兒適應症。
另一個優點是本文揭示的免疫原性組合物包含dOMV，所述dOMV可以誘導針對表現同源PorA的菌株（如PorA VR2菌株並且例如PorA VR2 P1.2菌株）的特異性保護性反應以及針對異源菌株的保護性交叉反應性。
本文揭示的免疫原性組合物的另一個優點是它們引發針對來自ST-41/44、ST-32、ST-269、ST-213、ST-35、ST-461、ST-11和ST-461選殖複合物的MenB菌株的免疫反應。另一個優點是本文揭示的免疫原性組合物引發對新興超毒力選殖複合物ST-11選殖複合物的免疫反應。
另外，如 實例部分所示，本文揭示的免疫原性組合物呈現與BEXSERO的反應原性特徵可比並甚至總體反應原性更小的反應原性特徵，BEXSERO相比於TRUMENBA有改善（即反應原性更小）。值得注意的是，所揭示的免疫原性組合物呈現出與TRUMENBA相比更弱的促炎性細胞介素反應。此外，它們對細胞活力具有最小的影響。
根據其一態樣，本揭示文本涉及一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含腦膜炎球菌抗原的組合，所述組合包含至少一種H因子結合蛋白（fHBP）A蛋白、至少一種fHBP B蛋白、至少一種奈瑟氏菌黏附素A（NadA）蛋白和至少一種清潔劑提取的外膜囊泡（dOMV）。抗原以免疫有效量存在。
在一個實施例中，腦膜炎球菌抗原可以來自腦膜炎奈瑟氏菌血清群B。
根據其另一態樣，本揭示文本涉及一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含腦膜炎奈瑟氏菌血清群B抗原的組合，所述組合包含至少一種H因子結合蛋白（fHBP）A蛋白、至少一種fHBP B蛋白、至少一種奈瑟氏菌黏附素A（NadA）蛋白和至少一種清潔劑提取的外膜囊泡（dOMV）。所述fHBP A蛋白和/或所述fHBP B蛋白可以是非脂化的。
在另一個實施例中，所述fHBP A蛋白可以是脂化或非脂化蛋白，並且例如是非脂化蛋白。
在另一個實施例中，所述fHBP B蛋白可以是脂化或非脂化蛋白，並且例如是非脂化蛋白。
在另一個實施例中，所述fHBP A蛋白和/或fHBP B蛋白可以是非脂化的。在一個實施例中，fHBP A蛋白和fHBP B蛋白二者均可以是非脂化的。
在一個實施例中，fHBP A蛋白可以是非天然存在的fHBP。
在一個實施例中，fHBP B蛋白可以是非天然存在的fHBP。
在一個實施例中，fHBP A和/或fHBP B蛋白可以是非天然存在的fHBP。
在一個實施例中，fHBP A和/或fHBP B蛋白可以是突變的fHBP。在一個實施例中，fHBP A和/或fHBP B蛋白可以是突變的非脂化fHBP。
在一個實施例中，fHBP A蛋白可以是包含與SEQ ID NO: 1至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%、或至少約99.5%的同一性的突變蛋白。
在另一個實施例中，fHBP A蛋白基於SEQ ID NO: 6的編號可以包含選自以下中至少一者的至少一個胺基酸取代：a) 在胺基酸115處的天門冬醯胺酸（N115）的胺基酸取代；b) 在胺基酸121處的天門冬胺酸（D121）的胺基酸取代；c) 在胺基酸128處的絲胺酸（S128）的胺基酸取代；d) 在胺基酸130處的白胺酸（L130）的胺基酸取代；e) 在位置131處的纈胺酸（V131）的胺基酸取代；f) 在位置133處的甘胺酸（G133）的胺基酸取代；g) 在位置219處的離胺酸（K219）的胺基酸取代；以及h) 在位置220處的甘胺酸（G220）的胺基酸取代。
在一個實施例中，fHBP A蛋白可以是如下突變蛋白，其包含與SEQ ID NO: 1至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或至少約99.5%的同一性並且基於SEQ ID NO: 6的編號包含選自以下中至少一者的至少一個胺基酸取代：a) 在胺基酸115處的天門冬醯胺酸（N115）的胺基酸取代；b) 在胺基酸121處的天門冬胺酸（D121）的胺基酸取代；c) 在胺基酸128處的絲胺酸（S128）的胺基酸取代；d) 在胺基酸130處的白胺酸（L130）的胺基酸取代；e) 在位置131處的纈胺酸（V131）的胺基酸取代；f) 在位置133處的甘胺酸（G133）的胺基酸取代；g) 在位置219處的離胺酸（K219）的胺基酸取代；以及h) 在位置220處的甘胺酸（G220）的胺基酸取代。
在一個實施例中，fHBP A蛋白基於SEQ ID NO: 6的編號可以至少包含胺基酸取代G220S。fHBP A蛋白可以是如下非脂化蛋白，其包含與SEQ ID NO: 1至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或至少約99.5%的同一性並且基於SEQ ID NO: 6的編號至少包含胺基酸取代G220S。
在一個實施例中，fHBP A蛋白基於SEQ ID NO: 6的編號可以至少包含選自G220S、L130R和G133D的三個胺基酸取代。在另一個實施例中，fHBP A蛋白基於SEQ ID NO: 6的編號可以僅包含三個胺基酸取代G220S、L130R和G133D。fHBP A蛋白可以是如下突變蛋白，其包含與SEQ ID NO: 1至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或至少約99.5%的同一性並且基於SEQ ID NO: 6的編號至少包含或僅包含選自G220S、L130R和G133D的三個胺基酸取代。
在另一個實施例中，fHBP A蛋白可以包含SEQ ID NO: 2或由其組成。
在一個實施例中，fHBP B蛋白可以是包含與SEQ ID NO: 3至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%、或至少約99.5%的同一性的突變蛋白。
在另一個實施例中，fHBP B蛋白基於SEQ ID NO: 6的編號可包含選自以下中至少一者的至少一個胺基酸取代：a) 在胺基酸38處的麩醯胺酸（Q38）的胺基酸取代；b) 在胺基酸92處的麩胺酸（E92）的胺基酸取代；c) 在胺基酸130處的精胺酸（R130）的胺基酸取代；d) 在胺基酸223處的絲胺酸（S223）的胺基酸取代；和e) 在胺基酸248處的組胺酸（H248）的胺基酸取代。
在一個實施例中，fHBP B蛋白可以是突變蛋白，其包含與SEQ ID NO: 3至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或至少約99.5%的同一性並且基於SEQ ID NO: 6的編號包含選自以下中至少一者的至少一個胺基酸取代：a) 在胺基酸38處的麩醯胺酸（Q38）的胺基酸取代；b) 在胺基酸92處的麩胺酸（E92）的胺基酸取代；c) 在胺基酸130處的精胺酸（R130）的胺基酸取代；d) 在胺基酸223處的絲胺酸（S223）的胺基酸取代；和e) 在胺基酸248處的組胺酸（H248）的胺基酸取代。
在另一個實施例中，fHBP B蛋白基於SEQ ID NO: 6的編號可以至少包含胺基酸取代H248L。在另一個實施例中，fHBP B蛋白基於SEQ ID NO: 6的編號可以僅包含胺基酸取代H248L。fHBP B蛋白可以是突變蛋白，其包含與SEQ ID NO: 3至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或至少約99.5%的同一性並且基於SEQ ID NO: 6的編號至少包含或僅包含胺基酸取代H248L。
在另一個實施例中，fHBP B蛋白可包含SEQ ID NO: 4或由其組成。
在一個實施例中，fHBP A蛋白和/或fHBP B可以範圍為約20 μg/劑量至約200 μg/劑量、或約25 μg/劑量至約180 μg/劑量、或約40 μg/劑量至約140 μg/劑量、或約50 μg/劑量至約120 μg/劑量、或約75 μg/劑量至約100 μg/劑量或為約25 μg/劑量、或約50 μg/劑量或為約100 µg/劑量的量存在。
如本文所用，術語“ 劑量”是指投予個體的組合物的總量或總體積。劑量的範圍可為約0.1 ml至約1 ml，例如約0.2 ml至約0.8 ml、約0.4 ml至約0.6 ml，或可為約0.5 ml。
在一個實施例中，NadA蛋白可以是NadA1蛋白。
在另一個實施例中，NadA蛋白可包含與SEQ ID NO: 5至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或至少約99.5%的同一性。在另一個實施例中，NadA蛋白可以包含SEQ ID NO: 5或由其組成。
在一個實施例中，NadA蛋白可以範圍為約20 µg/劑量至約200 µg/劑量、或約25 µg/劑量至約180 µg/劑量、或約40 µg/劑量至約140 µg/劑量、或約50 µg/劑量至約120 µg/劑量、或約75 µg/劑量至約100 µg/劑量或為約25 µg/劑量、或約50 µg/劑量、或為約100 µg/劑量的量存在。在一個實施例中，NadA蛋白可以以約50 μg/劑量的量存在。
在一個實施例中，dOMV可包含外膜蛋白孔蛋白A（PorA）。在一個實施例中，dOMV可以包含外膜蛋白孔蛋白B（PorB）。在另一個實施例中，dOMV可以包含外膜蛋白孔蛋白A（PorA）和外膜蛋白孔蛋白B（PorB）。
在另一個實施例中，dOMV可包含外膜蛋白孔蛋白A（PorA）和/或外膜蛋白孔蛋白B（PorB）。dOMV可以包含孔蛋白A（血清亞型PorA VR2 P1.2）、孔蛋白B（血清型PorB P2.2a）和任選地免疫型LOS L3,7。PorA和PorB可代表約50%的dOMV蛋白質。
相對於所述dOMV中存在的總蛋白，PorA可以範圍為約3%至約15%的量、或以約5%至約9%或約10%的量存在。相對於所述dOMV中存在的總蛋白，PorB可以以範圍為約30%至約70%、或約35%至約65%、或約38%至約58%的量存在。
在一個實施例中，dOMV可以包含孔蛋白A（PorA）。在一個實施例中，PorA可以是VR2家族的PorA。在一個例子中，dOMV可以包括PorA VR2 P1.2亞型。
在一個實施例中，可以從表現PorA VR2, P1.2的MenB菌株99M獲得dOMV。
在一個實施例中，dOMV可以包括PorA VR2 P1.2和PorB P2.2a。
在一個實施例中，可以用使用至少一個去氧膽酸鹽處理步驟的清潔劑提取方法獲得dOMV。
在一個實施例中，dOMV可以以範圍為約5 µg/劑量至約400 µg/劑量、或約10 µg/劑量至約300 µg/劑量、或約25 µg/劑量至約250 µg/劑量、或約35 µg/劑量至約225 µg/劑量、或約50 µg/劑量至約200 µg/劑量、或約75 µg/劑量至約180 µg/劑量、或約100 µg/劑量至約150 µg/劑量、或約110 µg/劑量至約125 µg/劑量或為約25 µg/劑量、或約50 µg/劑量、或約125 µg/劑量的量存在。
在另一個實施例中，如本文揭示的組合物還可包含佐劑。在一個實施例中，佐劑可以是鋁基佐劑。在一個實施例中，鋁基佐劑可以是選自包含以下的組的鋁基佐劑：氫氧化鋁佐劑、磷酸鋁佐劑、硫酸鋁鹽佐劑、羥基磷酸鋁硫酸鹽佐劑、硫酸鋁鉀佐劑、羥基碳酸鋁、氫氧化鋁和氫氧化鎂的組合、以及它們的混合物。在一個實施例中，佐劑可以是磷酸鋁佐劑。
在另一個實施例中，如本文揭示的組合物還可包含醫藥上可接受的賦形劑。
在另一個實施例中，如本文揭示的組合物還可包含緩衝液。在一個實施例中，緩衝液可以選自包含以下的組：Tris緩衝液、乙酸鹽緩衝液、檸檬酸鹽緩衝液、磷酸鹽緩衝液、HEPES緩衝液或組胺酸緩衝液。在一個實施例中，緩衝液可以是乙酸鹽緩衝液。在一個實施例中，乙酸鹽緩衝液可以是乙酸鈉緩衝液。在一個實施例中，乙酸鈉緩衝液可以範圍為約10 mM至約300 mM、或範圍為約10 mM至約250 mM、或範圍為約20 mM至約250 mM、或範圍為約20 mM至約150 mM、或約20 mM至約130 mM、或約30 mM至約120 mM、或約40 mM至約100 mM、或約50 mM至約80 mM、或約50 mM至約60 mM的濃度，或例如以約50 mM的濃度存在。
在另一個實施例中，如本文揭示的組合物還可包含鹽，如鈉鹽、鈣鹽或鎂鹽。鈉鹽可以是例如選自包含以下的群組的鈉鹽：氯化鈉、磷酸鈉。在一個實施例中，鈉鹽可以是氯化鈉。鈣鹽可以是氯化鈣鹽。鎂鹽可以是氯化鎂鹽。在一個實施例中，鈉鹽可以以範圍為約10 mM至約300 mM、或約30 mM至約280 mM、或約50 mM至約250 mM、或約60 mM至約220 mM、或約80 mM至約200 mM、或約100 mM至約180 mM、或約120 mM至約160 mM的濃度存在，或可以是例如約150 mM的濃度。鈣鹽或鎂鹽可以範圍為約1 mM至約15 mM、或約5 mM至約10 mM的量存在。
在另一個實施例中，如本文揭示的組合物可以具有約4.0至約9.0範圍內的pH。在一個實施例中，如本文揭示的組合物的pH範圍可以為約4.5至約8.5、或約4.8至約8.2、或約5.0至約8.0、或約5.2至約7.5、或約5.4至約7.0、或約5.5至約6.8、或約5.7至約6.5、或約5.8至約6.2，或者可以為約6.0。在另一個實施例中，如本文揭示的組合物可包含以下或由以下組成：包含SEQ ID NO: 2或由其組成的非脂化fHBP A蛋白、包含SEQ ID NO: 4或由其組成的非脂化fHBP B蛋白、NadA蛋白、和來自表現PorA蛋白的MenB的dOMV。在所述組合物中，NadA可以是NadA1或可以包含與SEQ ID NO: 5至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%、至少約99.5%或約100%的胺基酸序列同一性或由SEQ ID NO: 5組成，和/或dOMV可以包含PorA VR2亞型或PorA VR2 P1.2以及任選地PorB P2.2a，或可以從MenB菌株99M獲得。如本文揭示的組合物可以包含磷酸鋁佐劑。如本文揭示的組合物可以包含50 mM乙酸鹽緩衝液和pH 6.0。
在另一個實施例中，如本文揭示的組合物可包含以下或由以下組成：包含與SEQ ID NO: 1至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%、或至少約99.5%的同一性的非脂化突變fHBP A蛋白，包含與SEQ ID NO: 3至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%、或至少約99.5%的同一性的非脂化突變fHBP B蛋白，NadA蛋白，和來自表現PorA蛋白的MenB的dOMV。在所述組合物中，NadA可以是NadA1或可以包含與SEQ ID NO: 5至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%、至少約99.5%或約100%的胺基酸序列同一性或由SEQ ID NO: 5組成，和/或dOMV可以包含PorA VR2亞型或PorA VR2 P1.2以及任選地PorB P2.2a，或可以從MenB菌株99M獲得。如本文揭示的組合物可以包含磷酸鋁佐劑。如本文揭示的組合物可以包含50 mM乙酸鹽緩衝液和pH 6.0。
在另一個實施例中，如本文揭示的組合物可包含以下或由以下組成：非脂化突變fHBP A蛋白、非脂化突變fHBP B蛋白、NadA蛋白、和來自表現PorA蛋白的MenB的dOMV，所述非脂化突變fHBP A蛋白包含與SEQ ID NO: 1至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%、或至少約99.5%的同一性並且基於SEQ ID NO: 6的編號包含選自以下中至少一者的至少一個胺基酸取代：a) 在胺基酸115處的天門冬醯胺酸（N115）的胺基酸取代；b) 在胺基酸121處的天門冬胺酸（D121）的胺基酸取代；c) 在胺基酸128處的絲胺酸（S128）的胺基酸取代；d) 在胺基酸130處的白胺酸（L130）的胺基酸取代；e) 在位置131處的纈胺酸（V131）的胺基酸取代；f) 在位置133處的甘胺酸（G133）的胺基酸取代；g) 在位置219處的離胺酸（K219）的胺基酸取代；和h) 在位置220處的甘胺酸（G220）的胺基酸取代，所述非脂化突變fHBP B蛋白包含與SEQ ID NO: 3至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%、或至少約99.5%的同一性並且基於SEQ ID NO: 6的編號包含選自以下中至少一者的至少一個胺基酸取代：a) 在胺基酸38處的麩醯胺酸（Q38）的胺基酸取代；b) 在胺基酸92處的麩胺酸（E92）的胺基酸取代；c) 在胺基酸130處的精胺酸（R130）的胺基酸取代；d) 在胺基酸223處的絲胺酸（S223）的胺基酸取代；和e) 在胺基酸248處的組胺酸（H248）的胺基酸取代。在所述組合物中，NadA可以是NadA1或可以包含與SEQ ID NO: 5至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%、至少約99.5%或約100%的胺基酸序列同一性或由SEQ ID NO: 5組成，和/或dOMV可以包含PorA VR2亞型或PorA VR2 P1.2以及任選地PorB P2.2a，或可以從MenB菌株99M獲得。如本文揭示的組合物可以包含磷酸鋁佐劑。如本文揭示的組合物可以包含50 mM乙酸鹽緩衝液和pH 6.0。
在另一個實施例中，如本文揭示的組合物可以包含以下或由以下組成：非脂化突變fHBP A蛋白、非脂化突變fHBP B蛋白、NadA蛋白、和來自表現PorA蛋白的MenB的dOMV，所述非脂化突變fHBP A蛋白包含與SEQ ID NO: 1至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%、或至少約99.5%的同一性並且基於SEQ ID NO: 6的編號包含選自以下的至少一個胺基酸取代：G220S、L130R和G133D，所述非脂化突變fHBP B蛋白包含與SEQ ID NO: 3至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%、或至少約99.5%的同一性並且基於SEQ ID NO: 6的編號至少包含胺基酸取代H248L。在所述組合物中，NadA可以是NadA1或可以包含與SEQ ID NO: 5至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%、至少約99.5%或約100%的胺基酸序列同一性或由SEQ ID NO: 5組成，和/或dOMV可以包含PorA VR2亞型或PorA VR2 P1.2以及任選地PorB P2.2a，或可以從MenB菌株99M獲得。如本文揭示的組合物可以包含磷酸鋁佐劑。如本文揭示的組合物可以包含50 mM乙酸鹽緩衝液和pH 6.0。
在另一個實施例中，如本文揭示的組合物可包含以下或由以下組成：非脂化突變fHBP A蛋白、非脂化突變fHBP B蛋白、NadA蛋白、和來自表現PorA蛋白的MenB的dOMV，所述非脂化突變fHBP A蛋白包含與SEQ ID NO: 1至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%、或至少約99.5%的同一性並且基於SEQ ID NO: 6的編號至少包含選自以下的三個胺基酸取代：G220S、L130R和G133D，所述非脂化突變fHBP B蛋白包含與SEQ ID NO: 3至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%、或至少約99.5%的同一性並且基於SEQ ID NO: 6的編號至少包含胺基酸取代H248L。在所述組合物中，NadA可以是NadA1或可以包含與SEQ ID NO: 5至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%、至少約99.5%或約100%的胺基酸序列同一性或由SEQ ID NO: 5組成，和/或dOMV可以包含PorA VR2亞型或PorA VR2 P1.2以及任選地PorB P2.2a，或可以從MenB菌株99M獲得。如本文揭示的組合物可以包含磷酸鋁佐劑。如本文揭示的組合物可以包含50 mM乙酸鹽緩衝液和pH 6.0。
在另一個實施例中，如本文揭示的組合物可包含以下或由以下組成：非脂化突變fHBP A蛋白、非脂化突變fHBP B蛋白、NadA蛋白、和來自表現PorA蛋白的MenB的dOMV，所述非脂化突變fHBP A蛋白包含與SEQ ID NO: 1至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%、或至少約99.5%的同一性並且基於SEQ ID NO: 6的編號包含選自以下的僅三個胺基酸取代：G220S、L130R和G133D，所述非脂化突變fHBP B蛋白包含與SEQ ID NO: 3至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%、或至少約99.5%的同一性並且基於SEQ ID NO: 6的編號僅包含胺基酸取代H248L。在所述組合物中，NadA可以是NadA1或可包含與SEQ ID NO: 5至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少99%、至少約99.5%或約100%的胺基酸序列同一性或由SEQ ID NO: 5組成，和/或dOMV可以包含PorA VR2亞型或PorA VR2 P1.2以及任選地PorB P2.2a，或可以從MenB菌株99M獲得。如本文揭示的組合物可包含磷酸鋁佐劑。如本文揭示的組合物可以包含50 mM乙酸鹽緩衝液和pH 6.0。
在另一個實施例中，如本文揭示的組合物可包含以下或由以下組成：包含SEQ ID NO: 2或由其組成的非脂化fHBP A蛋白、包含SEQ ID NO: 4或由其組成的非脂化fHBP B蛋白、包含SEQ ID NO: 5或由其組成的NadA蛋白、來自表現PorA VR2 P1.2和任選地PorB P2.2a的MenB的或從MenB菌株99M獲得的dOMV。如本文揭示的組合物可包含磷酸鋁佐劑。如本文揭示的組合物可以包含50 mM乙酸鹽緩衝液和pH 6.0。
在另一個實施例中，如本文揭示的組合物可包含以下或由以下組成：由SEQ ID NO: 2組成的非脂化fHBP A蛋白、由SEQ ID NO: 4組成的非脂化fHBP B蛋白、由SEQ ID NO: 5組成的NadA蛋白、和來自表現PorA VR2 P1.2和任選地PorB P2.2a的MenB的或從MenB菌株99M獲得的dOMV。如本文揭示的組合物可以包含磷酸鋁佐劑。
在另一個實施例中，如本文揭示的組合物可包含以下或由以下組成：由SEQ ID NO: 2組成的非脂化fHBP A蛋白、由SEQ ID NO: 4組成的非脂化fHBP B蛋白、由SEQ ID NO: 5組成的NadA蛋白、來自表現PorA VR2 P1.2和任選地PorB P2.2a的MenB的或從MenB菌株99M獲得的dOMV、磷酸鋁佐劑、50 mM乙酸鹽緩衝液和pH 6.0。
在另一個實施例中，如本文揭示的組合物可包含以下或由以下組成：編碼fHBP A蛋白的mRNA、編碼fHBP B蛋白的mRNA、編碼NadA蛋白的mRNA、和來自表現PorA的MenB的dOMV，所述fHBP A蛋白包含與SEQ ID NO: 2至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%、至少約99.5%或約100%的胺基酸序列同一性，所述fHBP B蛋白包含與SEQ ID NO: 4至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%、至少約99.5%或約100%的胺基酸序列同一性，所述NadA蛋白包含與SEQ ID NO: 5至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%、至少約99.5%或約100%的胺基酸序列同一性。PorA可以是PorA VR2亞型或PorA VR2 P1.2。
在另一個實施例中，如本文揭示的組合物可包含以下或由以下組成：約25至約100 μg/劑量的包含SEQ ID NO: 2的非脂化fHBP A蛋白、約25至約100 μg/劑量的包含SEQ ID NO: 4的非脂化fHBP B蛋白、約25至約100 µg/劑量的包含SEQ ID NO: 5的NadA蛋白、約20至約150 µg/劑量的來自表現PorA VR2 P1.2的MenB菌株的dOMV、約100至約600 µg/劑量的磷酸鋁佐劑、50 mM乙酸鹽緩衝液和pH 6.0。
在另一個實施例中，如本文揭示的組合物可包含以下或由以下組成：約25至約100 μg/劑量的由SEQ ID NO: 2組成的非脂化fHBP A蛋白、約25至約100 μg/劑量的由SEQ ID NO: 4組成的非脂化fHBP B蛋白、約25至約100 µg/劑量的由SEQ ID NO: 5組成的NadA蛋白、約20至約150 µg/劑量的來自表現PorA VR2 P1.2的MenB菌株的dOMV、約100至約600 µg/劑量的磷酸鋁佐劑、50 mM乙酸鹽緩衝液和pH 6.0。
在另一態樣，本揭示文本涉及包含如本文揭示的組合物的疫苗。
在另一態樣，本揭示文本涉及作為藥物、特別是作為疫苗的如本文揭示的組合物。
在另一態樣，本揭示文本涉及如本文揭示的組合物，其用於防止腦膜炎球菌感染，並且在一個示例性實施例中，用於防止腦膜炎奈瑟氏菌血清群B感染。
在另一態樣，本揭示文本涉及如本文揭示的組合物，其用於誘導針對腦膜炎球菌細菌的免疫反應，並且在一個示例性實施例中誘導針對腦膜炎奈瑟氏菌血清群B細菌的免疫反應。
在另一態樣，本揭示文本涉及如本文揭示的組合物，其用於誘導針對來自ST-41/44、ST-32、ST-269、ST-213、ST-35、ST-461、ST-11和/或ST-461選殖複合物的腦膜炎奈瑟氏菌血清群B細菌的免疫反應。
在另一態樣，本揭示文本涉及如本文揭示的組合物，其用於誘導針對來自ST-11選殖複合物的腦膜炎奈瑟氏菌血清群B細菌的免疫反應。
在另一態樣，本揭示文本涉及保護個體免受腦膜炎球菌感染並且在一個示例性實施例中免受腦膜炎奈瑟氏菌血清群B感染的方法，所述方法至少包括向所述個體投予如本文揭示的免疫原性組合物或如本文揭示的疫苗的步驟。
在另一態樣，本揭示文本涉及一種用於降低由個體中腦膜炎球菌感染並且在一個示例性實施例中由腦膜炎奈瑟氏菌血清群B感染引起的侵襲性腦膜炎球菌病的發生風險的方法，所述方法至少包括向所述個體投予如本文揭示的免疫原性組合物或如本文揭示的疫苗的步驟。
在另一態樣，本揭示文本涉及在個體中引發針對腦膜炎球菌細菌並且在一個示例性實施例中引發針對腦膜炎奈瑟氏菌血清群B細菌的免疫反應的方法，所述方法至少包括向所述個體投予如本文揭示的免疫原性組合物或如本文揭示的疫苗的步驟。
在另一態樣，本揭示文本涉及一種引發針對來自ST-41/44、ST-32、ST-269、ST-213、ST-35、ST-461、ST-11和/或ST-461選殖複合物的腦膜炎奈瑟氏菌血清群B細菌的免疫反應的方法，所述方法至少包括向所述個體投予如本文揭示的免疫原性組合物或如本文揭示的疫苗的步驟。
在另一態樣，本揭示文本涉及一種引發針對來自ST-11選殖複合物的腦膜炎奈瑟氏菌血清群B細菌的免疫反應的方法，所述方法至少包括向所述個體投予如本文揭示的免疫原性組合物或如本文揭示的疫苗的步驟。
在另一態樣，本揭示文本涉及一種製備如本文揭示的免疫原性組合物或如本文揭示的疫苗的方法，所述方法至少包括將腦膜炎球菌抗原和任選地鋁鹽混合的步驟，所述抗原包含至少一種H因子結合蛋白（fHBP）A蛋白、至少一種fHBP B蛋白、至少一種奈瑟氏菌黏附素A（NadA）蛋白和至少一種清潔劑提取的外膜囊泡（dOMV）。
在一個實施例中，混合的步驟可包括將任選地吸附在AlPO 4上的至少一種H因子結合蛋白（fHBP）A蛋白和任選地吸附在AlPO 4鹽上的至少一種fHBP B蛋白的第一混合物與任選地吸附在AlPO 4上的至少一種NadA蛋白和dOMV的第二混合物共混。
在一個實施例中，混合的步驟可包括將吸附在AlPO 4上的至少一種H因子結合蛋白（fHBP）A蛋白和吸附在AlPO 4鹽上的至少一種fHBP B蛋白的第一混合物與吸附在AlPO 4上的至少一種NadA蛋白和dOMV的第二混合物共混。
在另一個實施例中，用於如本文揭示的製備方法中的抗原和鋁鹽可於緩衝液中。
在另一態樣，本揭示文本涉及包含多個容器的多組分套組，其中每個所述容器包含至少一種腦膜炎球菌抗原或至少兩種腦膜炎球菌抗原的組合，所述抗原選自包含以下的組：fHBP A蛋白、fHBP B蛋白、NadA蛋白和清潔劑提取的外膜囊泡（dOMV）。
在一個實施例中，所述多組分套組的抗原中的至少一種可以處於乾燥形式。在一個實施例中，所述抗原中的至少一種可呈凍乾的或乾燥的微丸形式。在一個實施例中，套組可任選地包含含有生理學上可注射的媒劑的容器。
序列說明
SEQ ID NO: 1表示不具有負責脂化的信號肽的fHBP A05野生型序列。
CSSGSGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSISQNGTLTLSAQGAEKTFKVGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPSGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELASAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIREKVHEIGIAGKQ
SEQ ID NO: 2表示不具有負責脂化的信號肽並且具有突變G220S、L130R、G133D的突變fHBP A05序列（編號是關於序列SEQ ID NO: 6（fHBP B24）確定的）。
CSSGSGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSISQNGTLTLSAQGAEKTFKVGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFRVSDLGGEHTAFNQLPSGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELASAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKSTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIREKVHEIGIAGKQ
SEQ ID NO: 3表示不具有負責脂化的信號肽的fHBP B01野生型序列。
CSSGGGGSGGGGVTADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSISQNGTLTLSAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQEQDPEHSEKMVAKRRFRIGDIAGEHTSFDKLPKDVMATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNVDLAVAYIKPDEKHHAVISGSVLYNQDEKGSYSLGIFGEKAQEVAGSAEVETANGIHHIGLAAKQ
SEQ ID NO: 4表示不具有負責脂化的信號肽並且具有突變H248L的突變fHBP B01序列（編號是關於序列SEQ ID NO: 6（fHBP B24）確定的）。
CSSGGGGSGGGGVTADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSISQNGTLTLSAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQEQDPEHSEKMVAKRRFRIGDIAGEHTSFDKLPKDVMATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNVDLAVAYIKPDEKHHAVISGSVLYNQDEKGSYSLGIFGEKAQEVAGSAEVETANGIHLIGLAAKQ
SEQ ID NO: 5表示來自MenB MC58菌株的NadA1序列，其中N末端信號肽的23個胺基酸和C末端的最後55個胺基酸已缺失。
MTSDDDVKKAATVAIVAAYNNGQEINGFKAGETIYDIGEDGTITQKDATAADVEADDFKGLGLKKVVTNLTKTVNENKQNVDAKVKAAESEIEKLTTKLADTDAALADTDAALDETTNALNKLGENITTFAEETKTNIVKIDEKLEAVADTVDKHAEAFNDIADSLDETNTKADEAVKTANEAKQTAEETKQNVDAKVKAAETAAGKAEAAAGTANTAADKAEAVAAKVTDIKADIATNKADIAKNSARIDSLDKNVANLRKETRQGLAEQAALSGLFQPYNVG
SEQ ID NO: 6表示fHBP B24野生型序列，在此基礎上確定A05和B01中突變位置的編號。
CSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ
SEQ ID NO: 7表示來自MenB MC58菌株的野生型NadA1序列。
MKHFPSKVLTTAILATFCSGALAATSDDDVKKAATVAIVAAYNNGQEINGFKAGETIYDIGEDGTITQKDATAADVEADDFKGLGLKKVVTNLTKTVNENKQNVDAKVKAAESEIEKLTTKLADTDAALADTDAALDETTNALNKLGENITTFAEETKTNIVKIDEKLEAVADTVDKHAEAFNDIADSLDETNTKADEAVKTANEAKQTAEETKQNVDAKVKAAETAAGKAEAAAGTANTAADKAEAVAAKVTDIKADIATNKADIAKNSARIDSLDKNVANLRKETRQGLAEQAALSGLFQPYNVGRFNVTAAVGGYKSESAVAIGTGFRFTENFAAKAGVAVGTSSGSSAAYHVGVNYEW 定義
必須指出的是，除非上下文另外清楚地指出，否則如在本文以及在所附申請專利範圍中所用的，單數形式“ 一個 / 一種（ a ）”、“ 一個 / 一種（ an ）”以及“ 所述（ the ）”包括複數指示物。因此，例如對“ 抗原”的提及包括多種此類抗原，並且對“ 蛋白質”的提及包括對一種或多種蛋白質的提及，等等。
如本文所用的術語“ 約”或“ 大約”是指業內熟習此項技術者容易知道的相應值的常用誤差範圍。本文對“約”某一值或參數的提及包括（並描述）針對所述值或參數本身的實施例。在一些實施例中，術語“約”是指給定值的± 10%、± 9%、± 8%、± 7%、± 6%、± 5%、± 4%、± 3%、± 2%、± 1%。然而，只要所討論的值指代不可分割的物件，如分子或一旦細分就會失去其身份的其他物件，則“約”指代不可分割的物件的± 1。
術語“ 抗 原”包括任何分子，例如肽、蛋白質、多糖或糖接合物，其包含將引發免疫反應的至少一個表位和/或免疫反應針對其被引發的至少一個表位。例如，抗原是任選地在加工後誘導免疫反應的分子，所述免疫反應例如對抗原或表現抗原的細胞具有特異性。加工後，抗原可由MHC分子呈遞並與T淋巴細胞（T細胞）特異性反應。因此，抗原或其片段應是由T細胞受體可識別的，並且應能夠在適當的共刺激信號的存在下誘導攜帶特異性識別抗原或片段的T細胞受體的T細胞的選殖擴增，這導致針對抗原或表現抗原的細胞的免疫反應。根據本揭示文本，可以設想任何合適的作為用於免疫反應的候選者的抗原。抗原可對應於或可源自天然存在的抗原。
應理解，本文所述的本揭示文本的態樣和實施例包括“ 具有”、“ 包含”態樣和實施例，“ 由態樣和實施例 組成”以及“ 基本上由態樣和實施例 組成”。詞語“具有”和“包含”或諸如“具有”（“has”、“having”）、“包含”（“comprises”或“comprising”）等變體應理解為暗示包含一種或多種所述要素（如物質組合物或方法步驟），但不排除任何其他要素。術語“由……組成”暗示包含一種或多種所述要素，排除任何另外的要素。術語“基本上由……組成”暗示包含所述要素以及可能的一種或多種其他要素，其中所述一種或多種其他要素不會對本揭示文本的一種或多種基本和新穎特徵產生實質性影響。應理解，使用術語“包含”或等同術語的本揭示文本的不同實施例涵蓋了其中該術語被替換為“由……組成”或“基本上由……組成”的實施例。
短語“ 由腦膜炎奈瑟氏菌菌株引起的疾病”包括人感染腦膜炎奈瑟氏菌時存在的任何臨床症狀或臨床症狀組合 。這些症狀包括但不限於：上呼吸道（例如鼻咽和扁桃體的黏膜）被腦膜炎奈瑟氏菌的致病菌株定植、細菌滲入黏膜和黏膜下血管床、敗血症、膿毒性休克、炎症、出血性皮膚損傷、纖維蛋白溶解和凝血的啟動、器官功能障礙（如腎、肺和心力衰竭）、腎上腺出血和肌肉梗死、毛細血管滲漏、水腫、外周肢體缺血、呼吸窘迫症候群、心包炎和腦膜炎。
如本文所用，術語“ 個體”或“ 受試者”或“ 患者”可互換使用，並且旨在指代哺乳動物。哺乳動物包括但不限於家養動物（例如，牛、綿羊、貓、狗和馬）、靈長類動物（例如，人和非人靈長類動物，如猴）、兔和齧齒動物（例如，小鼠和大鼠）。在一些示例性實施例中，所述個體或受試者是人。
在本揭示文本的上下文中，表述“ 醫藥上可接受的載劑”是指如下載劑或媒劑，其對於投予哺乳動物如人是生理學上可接受的，同時保留如本文揭示的免疫原性組合物的生理活性，即其誘導具有低反應原性效應的免疫反應的能力。
如本文所用，關於疾病或障礙的術語“ 預防”（“ prevent”、“ preventing”）或“ 延遲進展”（及其語法變體）涉及例如在懷疑患有所述疾病或有患上所述疾病風險的個體中，對所述疾病或障礙的預防性處理。預防可包括但不限於預防或延遲疾病的發作或進展和/或將疾病或障礙的一種或多種症狀維持在期望水準或亞病理水準。術語“預防”不要求100%消除事件發生的可能或可能性。而是，它表示在存在如本文所述的組合物或方法的情況下，事件發生的可能性已降低。
術語“ 保護性 免疫”意味著投予哺乳動物的疫苗或免疫接種方案誘導免疫反應，所述免疫反應預防、延緩由腦膜炎奈瑟氏菌引起的疾病的發展或降低所述疾病的嚴重性，或減弱或完全消除所述疾病的症狀。保護性免疫可伴隨殺細菌抗體的產生。應注意，針對腦膜炎奈瑟氏菌的殺細菌抗體的產生在業內被接受作為對疫苗在人體內的保護作用的預測。（Goldschneider等人(1969) J. Exp. Med. 129:1307）。
在本揭示文本中，關於變化所使用的術語“ 顯著”旨在意指觀察到的變化是明顯的和/或它具有統計學意義。
在本揭示文本中，與本揭示文本的特徵結合使用的術語“ 基本上”旨在定義與該特徵相關的在很大程度上類似於該特徵但不完全類似於該特徵的一組實施例。與給定特徵相關的一組實施例與給定特徵之間的區別使得在該組實施例中，給定特徵的性質和功能沒有受到實質影響。
關於抗原或抗原與佐劑的組合所使用的短語“ 以足以引發免疫反應的量”或“ 免疫學有效量”旨在指代當投予受試者時有效引發針對抗原的免疫反應的量。該量可以根據各種因素而變化，所述各種因素如受試者的健康或身體狀況、年齡、受試者免疫系統產生抗體的能力、所需的保護程度、含有抗原的組合物的配製品、治療醫生對醫療狀況的評估。該量可以由熟習此項技術者已知的常規方法確定。免疫反應指標包括但不限於：抗體力價或特異性，如藉由諸如以下的測定所檢測的：酶聯免疫測定（ELISA）、殺細菌測定、流式細胞術、免疫沈澱、Ouchterlony免疫擴散；例如斑點、蛋白質印跡或抗原陣列的結合檢測測定；細胞毒性測定等。
如本文所用，在免疫反應引發的背景下，術語“ 治療”（“ treat”）、“ 治療”（“ treatment”）、“ 療法”（“ therapy”）等是指投予或消耗如本文揭示的組合物，其目的是治癒、癒合、緩解、減輕、改變、補救、改善、改進或影響疾病或障礙、病症的症狀，或預防或延遲症狀、併發症的發作，或以其他方式以統計學上顯著的方式阻止或抑制障礙的進一步發展。此外，如本文所用，在本揭示文本的上下文中，術語“ 治療”（“ treat”）、“ 治療”（“ treatment”）等是指減輕或緩解由腦膜炎奈瑟氏菌感染介導的病理過程 。在本揭示文本的上下文中，在涉及本文所述的任何其他病症時，術語“治療”（“treat”）、“治療”（“treatment”）等是指減輕或緩解與此類病症相關的一種或多種症狀。
如本文所用，術語“ 疫苗”旨在意指針對病原體的免疫原性組合物，其被投予受試者以誘導免疫反應，旨在保護或治療受試者免於病原體引起的疾患。如本文揭示的疫苗旨在用作預防（預防性）疫苗，以用於在感染之前投予受試者，旨在預防或降低初始（和/或復發性）感染發生的可能性。
如本文所用，術語“信使RNA”或“mRNA”是指編碼至少一種多肽的多核苷酸。如本文所用，mRNA包括經修飾的和未經修飾的RNA二者。mRNA可以包含一個或多個編碼區和非編碼區。編碼區可替代地稱為開放閱讀框（ORF）。mRNA中的非編碼區包含5'帽、5'非轉譯區（UTR）、3' UTR和聚(A)尾。mRNA可以從天然來源純化，使用重組表現系統（例如，體外轉錄）產生並且任選地純化，或化學合成。
本文揭示的mRNA可以是經修飾的或未經修飾的。在一些實施例中，mRNA包含至少一種化學修飾。在一些實施例中，本文揭示的mRNA可以包含一種或多種通常增強RNA穩定性的修飾。示例性修飾可以包括骨架修飾、糖修飾或鹼基修飾。在一些實施例中，所揭示的mRNA可以由天然存在的核苷酸和/或核苷酸類似物（經修飾的核苷酸）（包括但不限於嘌呤（腺嘌呤（A）和鳥嘌呤（G））或嘧啶（胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）和尿嘧啶（U）））合成。在某些實施例中，所揭示的mRNA可以由嘌呤和嘧啶的經修飾的核苷酸類似物或衍生物合成，所述類似物或衍生物例如像1-甲基-腺嘌呤、2-甲基-腺嘌呤、2-甲基硫代-N-6-異戊烯基-腺嘌呤、N6-甲基-腺嘌呤、N6-異戊烯基-腺嘌呤、2-硫代-胞嘧啶、3-甲基-胞嘧啶、4-乙醯基-胞嘧啶、5-甲基-胞嘧啶、2,6-二胺基嘌呤、1-甲基-鳥嘌呤、2-甲基-鳥嘌呤、2,2-二甲基-鳥嘌呤、7-甲基-鳥嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、假尿嘧啶（5-尿嘧啶）、二氫-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、4-硫代-尿嘧啶、5-羧基甲基胺基甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-(羧基羥基甲基)-尿嘧啶、5-氟-尿嘧啶、5-溴-尿嘧啶、5-羧基甲基胺基甲基-尿嘧啶、5-甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-甲基-尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、5-甲基胺基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基胺基甲基-2-硫代-尿嘧啶、5'-甲氧基羰基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基-尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸 (v)、1-甲基-假尿嘧啶、辮苷、β-D-甘露糖基-辮苷、胺基磷酸酯、硫代磷酸酯、肽核苷酸、甲基膦酸酯、7-去氮鳥苷、5-甲基胞嘧啶和肌苷。
在一些實施例中，所揭示的mRNA可包含至少一種化學修飾，包括但不限於假尿苷、N1-甲基假尿苷、2-硫代尿苷、4'-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-l-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫代-l-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮雜-尿苷、2-硫代-二氫假尿苷、2-硫代-二氫尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-l-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮雜-尿苷、二氫假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷和2'-O-甲基尿苷。
應理解，為了清晰起見，在單獨實施例的背景中描述的本發明的某些特徵也可以在單個實施例中組合提供。相反，為了簡潔起見，在單個實施例的背景中描述的本發明的多種特徵也可以單獨提供或以任何合適的子組合來提供。
除非另外定義，否則本文所用的所有技術和科技術語均具有與本發明所屬領域的一般技術者通常所理解的相同含義。但是與本文所述的類似或等同的任何方法和材料也可以用於實踐或測試本發明。將本文提及的所有出版物均藉由引用併入本文，以揭示和描述與引用出版物相關的方法和/或材料。
列出了如下文所述的來源、成分和組分的清單，它們的組合和混合物也被考慮並且在本文的範圍內。
應理解在本說明書通篇中給出的每一個最大數值限包括每一個較低數值限，如同此類較低數值限被明確地書寫在本文中一樣。在本說明書通篇中給出的每一個最小數值限將包括每一個較高數值限，如同此類較高數值限被明確地書寫在本文中一樣。在本說明書通篇中給出的每一個數值範圍將包括落在這種較寬的數值範圍內的每一個較窄數值範圍，如同此類較窄數值範圍都被明確地書寫在本文中一樣。
所有項列表，例如成分列表，旨在並且應解釋為馬庫西(Markush)群組。因此，所有列表都可以被閱讀和解釋為“選自項的列表”的項“及其組合和混合物”。
本文引用的可以是包括在本揭示文本中使用的各種成分的組分的商品名。本文的諸位發明人不意圖受到任何特定商品名下的材料的限制。與以商品名引用的材料等同的材料（例如，以不同名稱或參考編號從不同來源獲得的材料）可以在本文的描述中被取代和使用。 抗原
如本文揭示的免疫原性組合物至少包含腦膜炎球菌抗原的組合。抗原的組合可包含至少一種H因子結合蛋白（fHBP）A蛋白、至少一種fHBP B蛋白、至少一種奈瑟氏菌黏附素A（NadA）蛋白和至少一種清潔劑提取的外膜囊泡（dOMV）。
在一個實施例中，腦膜炎球菌抗原可以來自腦膜炎奈瑟氏菌血清群B。 fHBP
腦膜炎球菌fHBP在業內也稱為脂蛋白2086（LP2086）、ORF2086、源自基因組的奈瑟氏菌抗原（GNA）1870或“741”，是在幾乎所有侵襲性腦膜炎球菌分離株的細菌表面表現的脂蛋白。fHBP是一種重要的毒力因子，因為它與人補體因子H（fH）結合，後者是補體旁路的負調節因子（Seib等人, Expert Rev Vaccines. 2015;14(6):841-59）。fHBP與人fH的結合使得病原體能夠逃脫宿主先天免疫系統的替代性補體介導的殺傷，並在人血清和血液中存活。
已經描述了三種主要的遺傳學和免疫學fHBP變異體：對應於亞家族B的變異體1，以及均劃分在亞家族A中的變異體2和3（Seib等人, Expert Rev Vaccines. 2015;14(6):841-59）。除了Pfizer（fHBP A和B）和Novartis（變異體1、2和3）提供的命名法之外，fHBP在PubMLST資料庫中使用唯一的ID號進行標識。儘管fHBP亞家族A與B之間存在顯著的抗原變異性，但在不同菌株中，一個亞家族內的蛋白質序列是高度保守的，具有＞ 86%的序列同一性。根據neisseria.org或pubmlst.org/neisseria/ fHBP/網站，每個在腦膜炎奈瑟氏菌中發現的獨特fHBP也被分配了fHBP肽ID。因為變異體2（v.2）fHBP蛋白（來自菌株8047，fHBP ID 77）和變異體3（v.3）fHBP（來自菌株M1239，fHBP ID 28）的長度與MC58（fHBP ID 1）的長度相比差異分別為-1和+7個胺基酸殘基，用於指代v.2和v.3 fHBP蛋白的殘基的編號不同於基於這些蛋白質的實際胺基酸序列的編號。因此，例如，對在v.2或v.3 fHBP序列的位置166處的白胺酸殘基（L）的提及指代在v.2蛋白的位置165處和在v.3蛋白的位置173處的殘基。變異體1、2和3的成員分別存在於大約65%、25%和10%的導致侵襲性疾病的MenB臨床分離株中。在全球MenB菌株群體中呈現的十種最流行的fHBP變異體占美國和歐洲總計的侵襲致病菌株的大約80%（Bambini等人, Vaccine. 2009;27(21):2794-803；Chang, J Infect2019;S0163-4453(19):30272-5；Lucidarme, Clin Vaccine Immunol2010;17(6):919-29；以及Murphy等人, The Journal of infectious diseases. 2009;200(3):379-89；Wang等人, Vaccine. 2011;29(29-30):4739-44）。
有待根據本揭示文本使用的fHBP可以是野生型（或天然存在的）多肽或可以藉由胺基酸取代、插入或缺失進行修飾（非天然存在的），只要所述多肽可以引發免疫反應即可。
有待根據本揭示文本使用的fHBP可以是脂化或非脂化fHBP。脂化蛋白通常在其N末端序列包含用於脂化的特定肽序列。該序列可在蛋白質的成熟階段被切割。那些脂化信號肽特定於每種蛋白質和產生所述蛋白質的宿主的細胞。
ORF2086多肽在腦膜炎奈瑟氏菌中表現為具有脂蛋白信號基序(motif)的前體蛋白。在加工期間，所述基序被切割留下N末端半胱胺酸殘基，該殘基被共轉譯修飾為具有將蛋白質拴系至奈瑟氏菌外膜的脂質錨定物（McNeil等人 (2013) MMBR 77(2):234-252）。
為了避免重組蛋白的脂化，可以使用業內已知的各種技術。作為例子，有可能使脂化肽信號缺失或用不會被產生蛋白質的細胞識別的另一肽信號替代脂化肽信號。US 10,300,122 B2描述了這種技術用於ORF 2086的用途。
此外，可以用編碼另一胺基酸的密碼子取代編碼N末端半胱胺酸的密碼子，或者去除編碼N末端半胱胺酸的密碼子。例如，關於fHBP，US 10,300,122 B2描述了ATG（甲硫胺酸）密碼子直接向編碼成熟多肽的ORF2086的第二5’末端密碼子的融合，導致缺失半胱胺酸脂化位點（或用甲硫胺酸取代半胱胺酸）。此外，例如，US 9,724,402 B2或US 11,077,180 B2揭示獲得了其中N末端Cys被不是Cys殘基的胺基酸取代的非脂化fHBP。
有待根據本揭示文本使用的fHBP可以是天然存在或非天然存在的蛋白質。非天然存在的蛋白質是指“人造蛋白”，並包括與天然存在的蛋白質不同的未在自然界中發現的具有異源組分的fHBP。非天然存在的蛋白質可以是嵌合蛋白或突變蛋白。在本揭示文本的上下文中，“嵌合蛋白”旨在指代包含兩種或更多種不同組分的蛋白質，各組分源自不同fHBP（例如，變異體1、2或3）。在突變蛋白中的突變可以包括胺基酸取代、插入或缺失。在一個實施例中，突變是胺基酸取代。
適用於如本文揭示的免疫原性組合物的非天然存在的fHBP仍然能夠引發針對fHBP的免疫反應。在一個實施例中，有待根據本揭示文本使用的非天然存在的fHBP可以是突變的fHBP。可以引入突變，如胺基酸取代，以減少或抑制fHBP抗原與正常存在於個體血液中的凝血因子H（fH）的結合。因此，防止fH與本揭示文本的免疫原性組合物中使用的fHBP抗原結合可以增加可接近免疫系統的抗原的量，並提高針對那些抗原的免疫反應的功效和效率。有利地，突變的fHBP可以引發針對fH結合位點內的fHBP表位的抗fHBP抗體庫，所述抗體庫導致與由靶向在fH結合位點之外的fHBP表位的野生型（WT）fHBP抗原引發的抗體相比更強的保護性補體沈積活性。
考慮用於如本文揭示的免疫原性組合物的非天然存在的fHBP可以呈現出與相應的天然存在的fHBP相比降低的對fH的親和力或改善的熱穩定性。對fH蛋白的親和力和熱穩定性可以如WO 2016/014719 A1中揭示的進行測量（如在本檔的實例1或3中）。
為方便和清楚起見，除非另有特別說明，否則選擇具有序列SEQ ID NO: 6的fHBP B24（或腦膜炎奈瑟氏菌菌株MC58的fHBP ID 1或v.1 fHBP）的天然或天然存在的胺基酸序列作為本文中所有天然存在和非天然存在的fHBP胺基酸序列的參考序列。因此，在提及fHBP中的胺基酸殘基位置時，本文使用的位置編號對應於SEQ ID NO: 6（fHBP B24）的胺基酸殘基編號。因此，位置編號1指代SEQ ID NO: 6中所示的第一個胺基酸殘基，它是半胱胺酸。即使在SEQ ID NO: 6的N末端，在該半胱胺酸之前添加另外的胺基酸的情況下，這仍然是正確的。
在一個實施例中，可以在有待在本揭示文本中使用的fHBP A或B抗原中引入的突變（例如胺基酸取代）可以是如WO 2011/126863 A1、WO 2015/017817 A1或WO 2016/014719 A1中揭示的。
如本文揭示的免疫原性組合物可包含非天然存在的fHBP，其在胺基酸序列方面與野生型腦膜炎奈瑟氏菌fHBP的差異為1至10個胺基酸（例如，差異為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸）、10個胺基酸至15個胺基酸、15個胺基酸至20個胺基酸、20個胺基酸至30個胺基酸、30個胺基酸至40個胺基酸、或40個胺基酸至50個胺基酸。
在一些實施例中，fHBP可以 包含與參考fHBP序列具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或至少約99.5%胺基酸序列同一性的胺基酸序列。
同一性（例如，同源性百分比）可以使用各種已知的序列比較工具來確定，例如，如藉由使用默認參數計算成對序列比對的任何同源性比較軟體，包括例如國家生物技術資訊中心（NCBI）的Blast軟體。同一性是全域同一性，即整個胺基酸或核酸序列上的同一性，而不是其部分上的同一性。成對全域對齊由Needleman等人, Journal of Molecular Biology, 1970, 第443-53頁, 48卷)定義。例如，當從多肽序列開始並與其他多肽序列進行比較時，EMBOSS-6.0.1 Needleman-Wunsch演算法（可獲得於http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/needle.html）可用於找到兩個序列沿其整個長度的最佳比對-“全域比對”。
可如WO 2016/014719 A1中揭示的獲得用於本文揭示的免疫原性組合物中的fHBP抗原。fHBP可以作為重組蛋白從轉染到用於生產的宿主細胞（例如大腸桿菌菌株）中的重組表現載體（或構建體）獲得。用於轉移和表現編碼fHBP的核酸的合適載體在組成方面可不同。整合載體可以是條件複製型或自殺質體、噬菌體等。
構建體可以包括各種元件，所述各種元件包括例如啟動子、選擇性遺傳標記（例如，賦予抗生素（例如康黴素、紅黴素、氯黴素或健他黴素）抗性的基因）、複製起點（以促進宿主細胞例如細菌宿主細胞中的複製）等。載體的選擇將取決於各種因素，如需要在其中增殖的細胞類型和增殖目的。某些載體可用於擴增和製造大量所需的DNA序列。其他載體適用於在培養的細胞中表現。適當載體的選擇完全在業內的技術範圍內。許多此類載體是可商購的。
在一個例子中，載體可以是基於游離型質體的表現載體，其包含選擇性耐藥性標記和提供在不同宿主細胞（例如，在大腸桿菌和腦膜炎奈瑟氏菌二者中）中自主複製的元件。這種“穿梭載體”的一個例子是質體pFPIO（Pagotto等人(2000) Gene 244: 13-19）。載體可以提供用於在宿主細胞中的染色體外保持或可以提供用於整合到宿主細胞基因組中。載體在業內熟習此項技術者熟知的眾多出版物中得到充分描述，包括例如Short Protocols in Molecular Biology, (1999) F. Ausubel, 等人, 編, Wiley & Sons。載體可以提供用於編碼主題fHBP的核酸的表現，可以提供用於主題核酸的增殖，或二者。
可以使用的載體的例子包括但不限於源自重組噬菌體DNA、質體DNA或黏粒DNA的那些。例如，可以使用質體載體如pBR322、pUC 19/18、pUC 118、119和M13 mp系列的載體。pET21也是一種可以使用的表現載體。噬菌體載體可包括λgtl0、λgtl l、λgtl8-23、λZAP/R和EMBL系列的噬菌體載體。可以使用的另外的載體包括但不限於pJB8、pCV 103、pCV 107、pCV 108、pTM、pMCS、pNNL、pHSG274、COS202、COS203、pWE15、pWE16和卡隆粒9系列的載體。
重組表現載體可以包含與轉錄控制元件例如啟動子可操作地連接的編碼fHBP的核苷酸序列。啟動子可以是組成型的或誘導型的。啟動子可被改造以在原核宿主細胞或真核宿主細胞中使用。
表現載體提供轉錄和轉譯調節序列，並且可以提供用於誘導型或組成型表現，其中編碼區在轉錄起始區和轉錄和轉譯終止區的轉錄控制下可操作地連接。這些控制區可以是衍生主題fHBP的fHBP的天然區域，或者可以源自外源來源。總體上，轉錄和轉譯調節序列可包括但不限於啟動子序列、核糖體結合位點、轉錄起始和終止序列、轉譯起始和終止序列以及增強子或啟動子序列。啟動子可以是組成型或誘導型的，並且可以是強組成型啟動子（例如，T7等）。
表現載體通常具有位於啟動子序列附近的便利的限制位點，以提供編碼目的蛋白質的核酸序列的插入。構建體（重組載體）可以藉由例如將目的多核苷酸插入構建體主鏈中（通常藉由DNA連接酶附接至載體中切割的限制性酶位點）來製備。可替代地，可以藉由同源重組或位點特異性重組插入所需的核苷酸序列。通常，同源重組可以藉由將同源區在所需核苷酸序列側翼附接至載體上來完成，而位點特異性重組可以藉由使用促進位點特異性重組的序列（例如cre-lox、att位點等）來完成。可以藉由例如寡核苷酸的連接或藉由使用包含同源區和所需核苷酸序列的一部分的引子進行的聚合酶鏈式反應來添加包含此類序列的核酸。
此外，表現構建體可以包含另外的元件。例如，表現載體可以具有一個或兩個複製系統，從而使其能夠維持在生物體中，例如在哺乳動物或昆蟲細胞中進行表現，並在原核宿主中進行選殖和擴增。此外，表現構建體可以包含選擇性標記基因以允許選擇轉化的宿主細胞。選擇基因是業內熟知的，並且將隨著所用宿主細胞而變化。
可以藉由業內已知的任何技術在fHBP核苷酸序列中引入胺基酸取代。例如，可以如WO 2011/126863 A1、WO 2015/017817 A1或WO 2016/014719 A1中揭示的獲得胺基酸取代。在其他示例性實施例中，可以如WO 2015/128480、WO 2010/046715、WO 2016/008960、WO 2020/030782或WO 2011/051893中揭示的獲得胺基酸取代。
可以藉由業內已知的任何純化方法從培養物中獲得純化形式的重組fHBP，如例如在 實例部分中描述的。
在一個實施例中，fHBP A蛋白和/或fHBP B可以以約20 μg/劑量至約200 μg/劑量、或約25 μg/劑量至約180 μg/劑量、或約40 μg/劑量至約140 μg/劑量、或約50 μg/劑量至約120 μg/劑量、或約75 μg/劑量至約100 μg/劑量的量存在於如本文揭示的免疫原性組合物中。在一個實施例中，fHBP A蛋白和/或fHBP B可以以約25 μg/劑量、或約50 μg/劑量、或約100 μg/劑量的量存在。 fHBP A
在一個實施例中，如本文揭示的免疫原性組合物可以包含至少一種fHBP A變異體抗原。至少一種fHBP A蛋白可以是脂化或非脂化蛋白。在一個示例性實施例中，fHBP A蛋白可以是非脂化蛋白。
在一個實施例中，fHBP A蛋白可以是天然存在或非天然存在的fHBP。在一個實施例中，fHBP A蛋白可以是天然存在的fHBP。在另一個實施例中，fHBP A蛋白可以是非天然存在的fHBP。
在一個實施例中，fHBP A蛋白可以是包含與SEQ ID NO: 1至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%、至少約99.5%或約100%的胺基酸序列同一性之蛋白質。至少一種fHBP A蛋白可以是脂化或非脂化蛋白和/或可以是天然或非天然存在的fHBP（非天然存在的fHBP A05蛋白與fHBP A05或SEQ ID NO: 1不是100%相同的）。
非天然存在的fHBP A蛋白可以是如WO 2011/126863 A1或WO 2015/017817 A1中揭示的嵌合蛋白或如WO 2016/014719 A1、WO 2011/051893、WO 2016/008960或WO 2015/128480中揭示的突變fHBP A蛋白。在一個示例性實施例中，fHBP A蛋白可以是突變蛋白。
在一個示例性實施例中，非天然存在的fHBP A蛋白可以是突變蛋白。非天然存在的fHBP A蛋白可以是非脂化蛋白。在一個示例性實施例中，fHBP A蛋白可以是非天然存在的，如突變的、非脂化的fHBP A蛋白。
在一個實施例中，非天然存在的fHBP A蛋白與野生型腦膜炎奈瑟氏菌fHBP A蛋白如fHBP A05的胺基酸序列的差異可為1至10個胺基酸（例如，差異為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸）、10個胺基酸至15個胺基酸、15個胺基酸至20個胺基酸、20個胺基酸至30個胺基酸、30個胺基酸至40個胺基酸、或40個胺基酸至50個胺基酸。
在一個實施例中，非天然存在的fHBP A蛋白可以是包含與SEQ ID NO: 1至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、或至少約99%、或至少約99.5%的胺基酸序列同一性的突變蛋白。非天然存在的fHBP A05蛋白與fHBP A05或SEQ ID NO: 1不是100%相同的。
在另一個實施例中，非天然存在的或突變的fHBP A蛋白基於SEQ ID NO: 6的編號可以包含選自以下中至少一者的至少一個胺基酸取代：a) 在胺基酸115處的天門冬醯胺酸（N115）的胺基酸取代；b) 在胺基酸121處的天門冬胺酸（D121）的胺基酸取代；c) 在胺基酸128處的絲胺酸（S128）的胺基酸取代；d) 在胺基酸130處的白胺酸（L130）的胺基酸取代；e) 在位置131處的纈胺酸（V131）的胺基酸取代；f) 在位置133處的甘胺酸（G133）的胺基酸取代；g) 在位置219處的離胺酸（K219）的胺基酸取代；以及h) 在位置220處的甘胺酸（G220）的胺基酸取代。
在另一個實施例中，非天然存在的或突變的fHBP A蛋白關於如在WO 2011/051893中鑑定為SEQ ID NO: 5的fHBP序列（fHBP A19的成熟脂蛋白形式）的編號可以包含如在WO 2011/051893中揭示的以下位置中的任一個處的至少一個胺基酸缺失或取代：D37、K45、T56、E83、E95、E112、S122、I124、R127、T139、F141、N142、Q143、L197、D210、R212、K218、N43、N116、K119、T220和/或240。在一個實施例中，胺基酸缺失或取代如WO 2011/051893中揭示的。
在另一個實施例中，非天然存在的或突變的fHBP A蛋白關於如在WO 2016/008960中鑑定為SEQ ID NO: 17的fHBP序列（A124或變異體3.28或ID28）的編號可以包含如在WO 2016/008960中揭示的以下位置中的任一個處的至少一個胺基酸缺失或取代：S32、L126和/或E243。可以缺失一個、兩個或三個殘基。可替代地，它們可以被不同的胺基酸取代。例如，Leu-126可以被其他19種天然存在的胺基酸中的任一種取代。當進行取代時，在一些實施例中替代胺基酸可以是簡單的胺基酸，如甘胺酸或丙胺酸。在其他實施例中，替代胺基酸是保守取代，例如，它在以下四組內進行：(1) 酸性的，即天門冬胺酸、麩胺酸；(2) 鹼性的，即離胺酸、精胺酸、組胺酸；(3) 非極性的，即丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸；和 (4) 不帶電荷的極性的，即甘胺酸、天門冬醯胺酸、麩醯胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸。在其他實施例中，取代是非保守的。在一個實施例中，指定殘基處的取代如下：S32V；L126R；和/或E243A。
在另一個實施例中，非天然存在的或突變的fHBP A蛋白關於如在WO 2016/008960中鑑定為SEQ ID NO: 5的fHBP序列（成熟脂蛋白形式）的編號可以包含如在WO 2016/008960中揭示的以下位置中的任一個處的至少一個胺基酸缺失或取代：S32、L123和/或E240。可以缺失一個、兩個或三個殘基。可替代地，它們可以被不同的胺基酸取代。例如，Leu-123可以被其他19種天然存在的胺基酸中的任一種取代。當進行取代時，在一些實施例中替代胺基酸可以是簡單的胺基酸，如甘胺酸或丙胺酸。在其他情況下，替代胺基酸是保守取代，例如，它在以下四組內進行：(1) 酸性的，即天門冬胺酸、麩胺酸；(2) 鹼性的，即離胺酸、精胺酸、組胺酸；(3) 非極性的，即丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸；和 (4) 不帶電荷的極性的，即甘胺酸、天門冬醯胺酸、麩醯胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸。在其他實施例中，取代是非保守的。在一個實施例中，指定殘基處的取代可以如下：S32V；L123R；和/或E240A。
在另一個實施例中，非天然存在的或突變的fHBP A蛋白關於如在WO 2015/128480中鑑定為SEQ ID NO: 5的fHBP序列（fHBP A19或v2.16或ID16）的編號可以包含如在WO 2015/128480中揭示的以下位置中的任一個處的至少一個胺基酸缺失或取代：S32、V33、L39、L41、F69、V100、1113、F122、L123、V124、S125、G126、L127、G128、S151、H239和/或E240。在一個實施例中，突變的殘基可以是S32、V100、L123、V124、S125、G126、L127、G128、H239和/或E240。與野生型fHBP A相比，在這些殘基處的突變產生具有良好穩定性的蛋白質。在一個實施例中，突變的殘基可以是S32、L123、V124、S125、G126、L127和/或G128。在一個實施例中，突變的殘基可以是S32、L123、V124、S125、G126、L127和/或G128。在另一個實施例中，殘基S32和/或L123可以發生突變，例如S32V和/或L123。在V100、S125和/或G126中的一個或多個發生突變的情況下，也可以引入該三者之外的殘基的突變。
指定的殘基可以缺失，但較佳被不同的胺基酸取代。例如，Ser-32可以被其他19種天然存在的胺基酸中的任一種取代。當進行取代時，在一些實施例中替代胺基酸可以是簡單的胺基酸，如甘胺酸或丙胺酸。在其他實施例中，替代胺基酸是保守取代，例如，它在以下四組內進行：(1) 酸性的，即天門冬胺酸、麩胺酸；(2) 鹼性的，即離胺酸、精胺酸、組胺酸；(3) 非極性的，即丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸；和 (4) 不帶電荷的極性的，即甘胺酸、天門冬醯胺酸、麩醯胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸。在其他實施例中，取代是非保守的。在一些實施例中，取代不使用丙胺酸。
例如，在指定殘基處的取代可以如下：S32V；V33C；L39C；L41C；F69C；V100T；I113S；F122C；L123R；V124I；S125G或S125T；G126D；L127I；G128A；S151C；H239R；或E240H。
在另一個實施例中，非天然存在的或突變的fHBP A蛋白關於如在WO 2015/128480中鑑定為SEQ ID NO: 17的fHBP序列（A124或變異體3.28或ID28）的編號可以包含如在WO 2015/128480中揭示的以下位置中的任一個處的至少一個胺基酸缺失或取代：S32、V33、L39、L41、F72、V103、T116、F125、L126、V127、S128、G129、L130、G131、S154、H242和/或E243。在一個實施例中，突變的殘基可以是S32、V103、L126、V127、S128、G129、L130、G131、H242和/或E243。在一個實施例中，突變的殘基可以是S32、L126、V127、S128、G129、L130和/或G131。在另一個實施例中，殘基S32、L126、V127、S128、G129、L130和/或G131可以發生突變，例如殘基S32和/或L126，例如S32V和/或L126R。
指定的殘基可以缺失，但較佳被不同的胺基酸取代。例如，Ser-32可以被其他19種天然存在的胺基酸中的任一種取代。當進行取代時，在一些實施例中替代胺基酸可以是簡單的胺基酸，如甘胺酸或丙胺酸。在其他實施例中，替代胺基酸是保守取代，例如，它在以下四組內進行：(1) 酸性的，即天門冬胺酸、麩胺酸；(2) 鹼性的，即離胺酸、精胺酸、組胺酸；(3) 非極性的，即丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸；和 (4) 不帶電荷的極性的，即甘胺酸、天門冬醯胺酸、麩醯胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸。在其他實施例中，取代是非保守的。在一些實施例中，取代不使用丙胺酸。
例如，在指定殘基處的取代可以如下：S32V；I33C；L39C；L41C；F72C；V103T；T116S；F125C；L126R；V127I；S128G或S128T；G129D；L130I；G131A；S154C；H242R；E243H。
在胺基酸115處的天門冬醯胺酸（N115）的胺基酸取代可以是N115I取代（I：異白胺酸）。具有非極性、帶正電荷或芳香側鏈的其他胺基酸，如纈胺酸、白胺酸、離胺酸、精胺酸、組胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸，也可以在該位置處取代。因此，在一些情況下，fHBP可以包含N115V取代、N115L取代、N115K取代、N115R取代、N115H取代、N115F取代、N115Y取代或N115W取代。
在胺基酸121處的天門冬胺酸（D121）的胺基酸取代可以是D121G取代（G：甘胺酸）。具有非極性、帶正電荷或芳香側鏈的其他胺基酸，如白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、離胺酸、精胺酸、組胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸，也可以在該位置處取代。因此，例如，在一些情況下，fHBP變異體可包含D121L取代、D121I取代、D121V取代、D121K取代、D121R取代、D121H取代、D121F取代、D121Y取代或D121W取代。
在胺基酸128處的絲胺酸（S128）的胺基酸取代可以是S128T取代（T：蘇胺酸）。具有極性、帶電荷或芳香側鏈的其他胺基酸，如甲硫胺酸、天門冬醯胺酸、麩醯胺酸、天門冬胺酸、麩胺酸、離胺酸、精胺酸、組胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸，也可以在該位置處取代。因此，例如，在一些情況下，fHBP變異體可包含S128M取代、S128N取代、S128D取代、S128E取代、S128K取代、S128R取代、S128H取代、S128F取代、S128Y取代或S128W取代。
fHBP A可包含在胺基酸130處的白胺酸（L130）的胺基酸取代。在胺基酸130處的白胺酸（L130）的胺基酸取代可以是L130R取代（R：精胺酸）。
fHBP A可包含在胺基酸131處的纈胺酸（V131）的胺基酸取代。具有帶電荷或芳香側鏈的其他胺基酸，如麩胺酸、離胺酸、精胺酸、組胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸，也可以在該位置處取代。因此，例如，在一些情況下，fHBP可包含V131E取代、V131K取代、V131R取代、V131H取代、V131F取代、V131Y取代或V131W取代。
fHBP A可包含在胺基酸133處的甘胺酸（G133）的胺基酸取代。在胺基酸133處的甘胺酸（G133）的胺基酸取代可以是G133D取代（D：天門冬胺酸）。
fHBP A可包含在位置219處的離胺酸（K219）的胺基酸取代。具有極性、帶負電荷或芳香側鏈的其他胺基酸，如麩醯胺酸、天門冬胺酸、麩胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸，也可以在該位置處取代。因此，例如，在一些情況下，fHBP可包含K219Q取代、K219D取代、K219E取代、K219F取代、K219Y取代或K219W取代。
在胺基酸220處的甘胺酸（G220）的胺基酸取代可以是G220S取代（S：絲胺酸）。具有極性、帶電荷或芳香側鏈的其他胺基酸，如天門冬醯胺酸、麩醯胺酸、天門冬胺酸、麩胺酸、離胺酸、精胺酸、組胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸，也可以在該位置處取代。因此，例如，在一些情況下，fHBP可以包含G220N取代、G220Q取代、G220D取代、G220E取代、G220K取代、G220R取代、G220H取代、G220F取代、G220Y取代或G220W取代。
在一個示例性實施例中，在胺基酸130處的白胺酸（L130）的胺基酸取代可以是L130R取代（R：精胺酸）。
在一個示例性實施例中，在胺基酸133處的甘胺酸（G133）的胺基酸取代可以是G133D取代（D：天門冬胺酸）。
在一個示例性實施例中，在位置220處的甘胺酸（G220）的胺基酸取代可以是G220S取代（S：絲胺酸）。
在另一個實施例中，非天然存在的或突變的fHBP A蛋白基於SEQ ID NO: 6的編號可以包含選自G220S、L130R和G133D的胺基酸取代中的至少一個。在另一個實施例中，非天然存在的fHBP A蛋白基於SEQ ID NO: 6的編號可以至少包含選自G220S、L130R和G133D的三個胺基酸取代。在另一個實施例中，fHBP A蛋白基於SEQ ID NO: 6的編號可以僅包含三個胺基酸取代G220S、L130R和G133D。
在一個實施例中，非天然存在的（或突變的）fHBP A蛋白可以是基於SEQ ID NO: 6的編號包含選自以下的胺基酸取代中的至少一個的非脂化突變fHBP A蛋白：a) 在胺基酸115處的天門冬醯胺酸（N115）的胺基酸取代；b) 在胺基酸121處的天門冬胺酸（D121）的胺基酸取代；c) 在胺基酸128處的絲胺酸（S128）的胺基酸取代；d) 在胺基酸130處的白胺酸（L130）的胺基酸取代；e) 在位置131處的纈胺酸（V131）的胺基酸取代；f) 在位置133處的甘胺酸（G133）的胺基酸取代；g) 在位置219處的離胺酸（K219）的胺基酸取代；以及h) 在位置220處的甘胺酸（G220）的胺基酸取代。
在另一個實施例中，非天然存在的（或突變的）fHBP A蛋白可以是基於SEQ ID NO: 6的編號包含選自以下的胺基酸取代中的至少一個的非脂化突變fHBP A蛋白：N115I取代、Ν115V取代、N115L取代、N115K取代、N115R取代、N115H取代、N115F取代、N115Y取代、N115W取代、D121G取代、D121L取代、D121I取代、D121V取代、D121K取代、D121R取代、D121H取代、D121F取代、D121Y取代、D121W取代、S128T取代、S128M取代、S128N取代、S128D取代、S128E取代、S128K取代、S128R取代、S128H取代、S128F取代、S128Y取代、S128W取代、L130R取代、V131E取代、V131K取代、V131R取代、V131H取代、V131F取代、V131Y取代、V131W取代、G133D取代、K219Q取代、K219D取代、K219E取代、K219F取代、K219Y取代、K219W取代、G220S取代、G220N取代、G220Q取代、G220D取代、G220E取代、G220K取代、G220R取代、G220H取代、G220F取代、G220Y取代或G220W取代。
在一個示例性實施例中，非天然存在的（或突變的）fHBP A蛋白可以是基於SEQ ID NO: 6的編號包含選自以下的胺基酸取代中的至少一個的非脂化突變fHBP A蛋白：G220S、L130R和G133D。在另一個實施例中，非天然存在的或突變的非脂化fHBP A蛋白基於SEQ ID NO: 6的編號可以至少包含選自G220S、L130R和G133D的三個胺基酸取代。在另一個示例性實施例中，非脂化突變fHBP A蛋白基於SEQ ID NO: 6的編號可以僅包含三個胺基酸取代G220S、L130R和G133D。
在一個示例性實施例中，fHBP A蛋白可以是如下非脂化的且突變的蛋白，其包含與SEQ ID NO: 1至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或至少約99.5%的胺基酸序列同一性，並且基於SEQ ID NO: 6的編號包含選自G220S、L130R和G133D的胺基酸取代中的至少一個。突變非脂化fHBP A蛋白基於SEQ ID NO: 6的編號可以至少包含選自G220S、L130R和G133D的三個胺基酸取代。在另一個示例性實施例中，非脂化突變fHBP A蛋白基於SEQ ID NO: 6的編號可以僅包含三個胺基酸取代G220S、L130R和G133D。
在一個實施例中，fHBP A蛋白可包含與SEQ ID NO: 2至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%、或至少約99.5%的胺基酸序列同一性。
在另一個實施例中，fHBP A蛋白可包含SEQ ID NO: 2或由其組成。
另一個實施例涉及編碼fHBP A蛋白的mRNA，所述fHBP A蛋白包含與SEQ ID NO: 2至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或至少約99.5%的胺基酸序列同一性。所述mRNA可以編碼包含SEQ ID NO: 1或由其組成的fHBP A蛋白，或編碼包含SEQ ID NO: 2或由其組成的fHBP A蛋白。
可以藉由業內已知的任何技術在fHBP A核苷酸序列中引入胺基酸取代。例如，可以如WO 2016/014719 A1中揭示的獲得胺基酸取代。
在一個實施例中，fHBP A蛋白可以約20 μg/劑量至約200 μg/劑量、或約25 μg/劑量至約180 μg/劑量、或約40 μg/劑量至約140 μg/劑量、或約50 μg/劑量至約120 μg/劑量、或約75 μg/劑量至約100 μg/劑量的量存在於如本文揭示的免疫原性組合物中。在一個實施例中，fHBP A蛋白和/或fHBP B可以約25 μg/劑量、或約50 μg/劑量、或約100 μg/劑量的量存在。 fHBP B
在一個實施例中，如本文揭示的免疫原性組合物可包含至少一種fHBP B變異體抗原。至少一種fHBP B蛋白可以是脂化或非脂化蛋白。在一個示例性實施例中，fHBP B蛋白可以是非脂化蛋白。
在一個實施例中，fHBP A和fHBP B蛋白可以是脂化的。在一個實施例中，fHBP A和fHBP B蛋白可以是非脂化的。或者，fHBP A蛋白可以是脂化的，而fHBP B蛋白可以是非脂化的。再可替代地，fHBP A蛋白可以是非脂化的，而fHBP B蛋白可以是脂化的。
在一個實施例中，fHBP B蛋白可以是天然存在或非天然存在的fHBP。在一個實施例中，fHBP B蛋白可以是天然存在的fHBP。在另一個實施例中，fHBP B蛋白可以是非天然存在的fHBP。
在一個實施例中，fHBP A和fHBP B蛋白可以是天然存在的fHBP。在一個實施例中，fHBP A和fHBP B蛋白可以是非天然存在的fHBP。可替代地，fHBP A蛋白可以是天然存在的fHBP，而fHBP B蛋白可以是非天然存在的fHBP。再可替代地，fHBP A蛋白可以是非天然存在的fHBP，而fHBP B蛋白可以是天然存在的fHBP。
在一個實施例中，fHBP B蛋白可以是包含與SEQ ID NO: 3至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%、至少約99.5%或約100%的胺基酸序列同一性之蛋白質。至少一種fHBP B蛋白可以是脂化或非脂化蛋白和/或可以是天然或非天然存在的fHBP（非天然存在的fHBP B01蛋白與fHBP B01或SEQ ID NO: 3不是100%相同的）。
非天然存在的fHBP B蛋白可以是如WO 2011/126863 A1或WO 2015/017817 A1中揭示的嵌合蛋白或如WO 2016/014719 A1、WO 2011/051893或WO 2020/030782中揭示的突變fHBP B蛋白。在一個示例性實施例中，fHBP B蛋白可以是突變蛋白。
在一個示例性實施例中，非天然存在的fHBP B蛋白可以是突變蛋白。非天然存在的fHBP B蛋白可以是非脂化蛋白。在一個示例性實施例中，fHBP B蛋白可以是非天然存在的，如突變的、非脂化的fHBP B蛋白。
在一個實施例中，非天然存在的fHBP B蛋白與野生型腦膜炎奈瑟氏菌fHBP B蛋白如fHBP B01的胺基酸序列的差異可為1至10個胺基酸（例如，差異為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸）、10個胺基酸至15個胺基酸、15個胺基酸至20個胺基酸、20個胺基酸至30個胺基酸、30個胺基酸至40個胺基酸、或40個胺基酸至50個胺基酸。
在一個實施例中，非天然存在的fHBP B蛋白可以是包含與SEQ ID NO: 3至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、或至少約99%、或至少約99.5%的胺基酸序列同一性的突變蛋白。非天然存在的fHBP B蛋白與fHBP B01或SEQ ID NO: 3不是100%相同的。
在另一個實施例中，非天然存在的或突變的fHBP B蛋白基於SEQ ID NO: 6的編號可包含選自以下中至少一者的至少一個胺基酸取代：a) 在胺基酸38處的麩醯胺酸（Q38）的胺基酸取代；b) 在胺基酸92處的麩胺酸（E92）的胺基酸取代；c) 在胺基酸130處的精胺酸（R130）的胺基酸取代；d) 在胺基酸223處的絲胺酸（S223）的胺基酸取代；和e) 在胺基酸248處的組胺酸（H248）的胺基酸取代。
在另一個實施例中，非天然存在的或突變的fHBP B蛋白關於如在WO 2011/051893中鑑定為SEQ ID NO: 4的fHBP序列（fHBP B24的成熟脂蛋白形式）的編號可以包含如在WO 2011/051893中揭示的以下位置中的任一個處的至少一個胺基酸缺失或取代：D37、K45、T56、E83、E95、E112、K122、V124、R127、T139、F141、D142、K143、I198、S211、L213、K219、N43、D116、H119、S221和K241。
在另一個實施例中，非天然存在的或突變的fHBP B蛋白關於如在WO 2020/030782中鑑定為SEQ ID NO: 2的fHBP序列（fHBP B09的成熟脂蛋白形式）的編號可包含如在WO 2020/030782中揭示的以下位置中的任一個處的至少一個胺基酸取代：E211、S216或E232。
在另一個實施例中，非天然存在的或突變的fHBP B蛋白關於如在WO 2020/030782中鑑定為SEQ ID NO: 2的fHBP序列（fHBP B09的成熟脂蛋白形式）的編號可包含如在WO 2020/030782中揭示的以下位置中的任一個處的以下胺基酸取代中的至少一個：E211A、S216R或E232A。
在另一個實施例中，非天然存在的或突變的fHBP B蛋白關於如在WO 2020/030782中鑑定為SEQ ID NO: 6的fHBP序列（fHBP B44的成熟脂蛋白形式）的編號可包含如在WO 2020/030782中揭示的以下位置中的任一個處的至少一個胺基酸取代：E214、S219或E235。
在另一個實施例中，非天然存在的或突變的fHBP B蛋白關於如在WO 2020/030782中鑑定為SEQ ID NO: 2的fHBP序列（fHBP B44的成熟脂蛋白形式）的編號可包含如在WO 2020/030782中揭示的以下位置中的任一個處的以下胺基酸取代中的至少一個：E214A、S219R或E235A。
在另一個實施例中，非天然存在的或突變的fHBP B蛋白關於如在WO 2010046715中鑑定為SEQ ID NO: 1的fHBP序列（fHBP 24的成熟脂蛋白形式）的編號可包含如在WO 2010046715中揭示的以下位置中的任一個處的以下胺基酸取代中的至少一個：103、106、107、108、109、145、147、149、150、154、156、157、180、181、182、183、184、185、191、193、194、195、196、199、262、264、266、267、268、272、274、283、285、286、288、289、302、304、306、311和313。在一個實施例中，在H因子結合蛋白中可改變的一種或多種胺基酸關於如在WO 2010046715中鑑定為SEQ ID NO: 1的fHBP序列的編號可選自包含以下的群組：胺基酸編號103、106、107、108、180、181、183、184、185、191、193、195、262、264、266、272、274、283、286、304和306。
在胺基酸38處的麩醯胺酸（Q38）的胺基酸取代可以是Q38R取代（R：精胺酸）。具有帶正電荷或芳香側鏈的其他胺基酸，如離胺酸、組胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸，也可以在該位置處取代。因此，在一些情況下，fHBP可包含Q38K取代、Q38H取代、Q38F取代、Q38Y取代或Q38W取代。
在胺基酸92處的麩胺酸（E92）的胺基酸取代可以是E92K取代。具有帶正電荷或芳香側鏈的其他胺基酸，如精胺酸、組胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸，也可以在該位置處取代。因此，例如，在一些情況下，fHBP變異體可包含E92R取代、E92H取代、E92F取代、E92Y取代或E92W取代。
在胺基酸130處的精胺酸（R130）的胺基酸取代可以是R130G取代（G：甘胺酸）。其他具有帶負電荷或芳香側鏈的胺基酸，如天門冬胺酸、麩胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸，也可以在R130處取代。因此，例如，在一些情況下，fHBP變異體可包含R130D取代、R130E取代、R130F取代、R130Y取代或R130W取代。
在胺基酸223處的絲胺酸（S223）的胺基酸取代可以是S223R取代（R：精胺酸）。具有帶正電荷或芳香側鏈的其他胺基酸，如離胺酸、組胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸，也可以在該位置處取代。因此，例如，在一些情況下，fHbp變異體包含S223K取代、S223H取代、S223F取代、S223Y取代或S223W取代。
在一個示例性實施例中，在胺基酸248處的組胺酸（H248）的胺基酸取代可以是H248L取代（L：白胺酸）。具有非極性、帶負電荷或芳香側鏈的其他胺基酸，如異白胺酸、纈胺酸、天門冬胺酸、麩胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸，也可以在H248處取代。因此，例如，在一些情況下，fHBP可包含H248I取代、H248V取代、H248D取代、H248E取代、H248F取代、H248Y取代或H248W取代。
在另一個實施例中，非天然存在的或突變的fHBP B蛋白可至少包含胺基酸取代H248L。在另一個實施例中，非天然存在的fHBP B蛋白基於SEQ ID NO: 6的編號可僅包含胺基酸取代H248L。
在一個實施例中，非天然存在的（或突變的）fHBP B蛋白可以是基於SEQ ID NO: 6的編號包含選自以下的胺基酸取代中的至少一個的非脂化突變fHBP B蛋白：a) 在胺基酸38處的麩醯胺酸（Q38）的胺基酸取代；b) 在胺基酸92處的麩胺酸（E92）的胺基酸取代；c) 在胺基酸130處的精胺酸（R130）的胺基酸取代；d) 在胺基酸223處的絲胺酸（S223）的胺基酸取代；和e) 在胺基酸248處的組胺酸（H248）的胺基酸取代。
在另一個實施例中，非天然存在的（或突變的）fHBP B蛋白可以是基於SEQ ID NO: 6的編號包含選自以下的胺基酸取代中的至少一個的非脂化突變fHBP B蛋白：Q38R取代、Q38K取代、Q38H取代、Q38F取代、Q38Y取代、Q38W取代、E92K取代、E92R取代、E92H取代、E92F取代、E92Y取代、E92W取代、R130G取代、R130D取代、R130E取代、R130F取代、R130Y取代、R130W取代、S223R取代、S223K取代、S223H取代、S223F取代、S223Y取代、S223W取代、H248L取代、H248I取代、H248V取代、H248D取代、H248E取代、H248F取代、H248Y取代或H248W取代。
在另一個示例性實施例中，非天然存在的或突變的fHBP B蛋白可以是基於SEQ ID NO: 6的編號至少包含胺基酸取代H248L的非脂化突變fHBP B蛋白。在另一個示例性實施例中，非脂化突變fHBP B蛋白基於SEQ ID NO: 6的編號可以僅包含胺基酸取代H248L。
在一個示例性實施例中，fHBP A蛋白可以是如下非脂化且突變的蛋白，其包含與SEQ ID NO: 3至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、或至少約99%的胺基酸序列同一性並且基於SEQ ID NO: 6的編號至少包含胺基酸取代H248L。非脂化突變fHBP B蛋白基於SEQ ID NO: 6的編號可以僅包含胺基酸取代H248L。
在一個實施例中，fHBP B蛋白可包含與SEQ ID NO: 4至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%、或至少約99.5%的胺基酸序列同一性。
在另一個實施例中，fHBP B蛋白可包含SEQ ID NO: 4或由其組成。
另一個實施例涉及編碼fHBP B蛋白的mRNA，所述fHBP B蛋白包含與SEQ ID NO: 4至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或至少約99.5%的胺基酸序列同一性。所述mRNA可以編碼包含SEQ ID NO: 3或由其組成的fHBP B蛋白，或編碼包含SEQ ID NO: 4或由其組成的fHBP A蛋白。
可以藉由業內已知的任何技術在fHBP B核苷酸序列中引入胺基酸取代。例如，可以如WO 2016/014719 A1中揭示的獲得胺基酸取代。
在一個實施例中，fHBP B蛋白可以約20 µg/劑量至約200 µg/劑量、或約25 µg/劑量至約180 µg/劑量、或約40 µg/劑量至約140 µg/劑量、或約50 µg/劑量至約120 µg/劑量、或約75 µg/劑量至約100 µg/劑量的量存在於如本文揭示的免疫原性組合物中。在一個實施例中，fHBP A蛋白和/或fHBP B可以以約25 μg/劑量、或約50 μg/劑量、或約100 μg/劑量的量存在。 NadA
奈瑟氏菌黏附素A（NadA，先前稱為GNA1994）是一種形成寡聚體的表面暴露的三聚體蛋白，其經由跨膜結構域錨定到外膜，並在黏附和侵襲至上皮細胞起關鍵作用（Capecchi等人, Mol. Microbiol.2005;55:(687-98)）。來自許多菌株的NadA抗原的序列已經公佈，並且該蛋白質作為奈瑟氏菌黏附素的活性已得到充分證明。nadA基因存在於大約50%的腦膜炎球菌分離株中。NadA展現出生長階段依賴性表現，在穩定生長階段具有最高水準。
NadA抗原作為基因NMB1994（GenBank登錄號GI:7227256）包含在腦膜炎球菌血清群B菌株MC58的已公佈基因組序列中。
根據本揭示文本使用的NadA多肽可以是野生型多肽，或者可以藉由胺基酸取代、插入或缺失進行修飾，只要所述多肽可以引發針對NadA的免疫反應即可。
在一些實施例中，待使用的NadA蛋白可以是N末端和/或C末端截短的NadA或包含胺基酸缺失或插入的NadA蛋白，例如如在參考文獻WO 01/64920、WO 01/64922或WO 03/020756中揭示的。
在一個實施例中，有待用於如本文揭示的免疫原性組合物中的重組NadA蛋白可以是NadA1變異體。如 實例中所示，NadA1顯示可誘導強烈的hSBA反應。
NadA1可以從MenB MC58菌株的NadA序列中獲得。
在一個實施例中，NadA蛋白可包含序列SEQ ID NO: 7或由其組成。
在一些實施例中，NadA蛋白可包含來自SEQ ID NO: 7的至少190個連續胺基酸，例如來自SEQ ID NO: 7的200或更多個、210或更多個、220或更多個、230或更多個、240或更多個、250或更多個連續胺基酸，例如來自SEQ ID NO: 7的260或更多個、或270或更多個、或280或更多個、或290或更多個、或300或更多個、或310或更多個、或320或更多個、或330或更多個、或340或更多個、或350或更多個、或360或更多個胺基酸。
在一些實施例中，NadA蛋白可缺少從例如SEQ ID NO: 7的C末端和/或N末端起的5至10個胺基酸，或10至15個、或15至20個、或25個、或30個或35個、或40個或45個、或50個或55個胺基酸。當N末端殘基缺失時，這種缺失不應去除NadA黏附至人上皮細胞的能力。
在一個實施例中，NadA蛋白可在N末端缺少信號肽。例如，NadA蛋白可在例如SEQ ID NO: 7的N末端缺少23個胺基酸。
在一個實施例中，NadA蛋白可在C末端缺少膜錨定肽。例如，NadA蛋白可在例如SEQ ID NO: 7的C末端缺少55個胺基酸。
NadA可以以單體或寡聚體形式使用，例如以三聚體形式使用。
例如，NadA蛋白可不具有其C末端膜錨定物（例如，菌株MC58（SEQ ID NO: 7）的殘基308-362缺失）。在大腸桿菌中表現不具有其膜錨定結構域的NadA可導致蛋白質分泌到培養上清液中，同時去除23個胺基酸的信號肽（例如，SEQ ID NO: 7的殘基2至24缺失，留下284個胺基酸的蛋白質-SEQ ID NO: 5）。
在一個實施例中，NadA蛋白可包含與SEQ ID NO: 5至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%、或至少約99.5%的胺基酸序列同一性。在另一個實施例中，NadA蛋白可包含或由SEQ ID NO: 5組成。
另一個實施例涉及編碼NadA蛋白的mRNA，所述NadA蛋白包含與SEQ ID NO: 5至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或至少約99.5%的胺基酸序列同一性。所述mRNA可以編碼包含SEQ ID NO: 5或由SEQ ID NO: 5組成的NadA蛋白。
可根據業內已知的任何重組技術獲得用於本文揭示的免疫原性組合物中的NadA蛋白，例如總體上如上文揭示的。NadA蛋白可以作為重組蛋白從轉染到用於生產的宿主細胞（例如大腸桿菌菌株）中的重組表現載體（或構建體）獲得。可以藉由業內已知的任何純化方法從培養物中獲得純化形式的重組NadA，如例如在 實例部分中描述的。
在一個實施例中，NadA蛋白可以範圍為約20 μg/劑量至約200 μg/劑量、或約25 μg/劑量至約180 μg/劑量、或約40 μg/劑量至約140 μg/劑量、或約50 µg/劑量至約120 µg/劑量、或約75 µg/劑量至約100 µg/劑量的量存在。在一個實施例中，NadA蛋白可以約50 μg/劑量的量存在。 dOMV
如本文揭示的免疫原性組合物包含清潔劑提取的外膜囊泡（dOMV），也稱為外膜蛋白複合物（OMPC）。通常，清潔劑提取的外膜囊泡在用作抗原時稱為dOMV或OMV。當用作蛋白質載體時，它們稱為OMPC。
OMPC用作磷酸多核糖基核糖醇（PRP）接合疫苗PedvaxHIB（b型流感嗜血桿菌疫苗）（Einhorn等人, Lancet(倫敦, 英格蘭). 1986;2(8502):299-302；Moro等人, The Journal of pediatrics. 2015;166(4):992-7）和VAXELIS（白喉、破傷風、百日咳、脊髓灰質炎、乙型肝炎和b型流感嗜血桿菌疫苗）（Syed, Paediatric drugs. 2017;19(1):69-80）的載體蛋白平臺。
dOMV是大的蛋白脂質囊泡，包含在細菌外膜中發現的整合外膜蛋白和殘餘脂寡糖（LOS）（Helting, Acta Pathol Microbiol Scand C, 1981;89(2):69-78）。在dOMV中可鑑定出超過300種蛋白質。dOMV的總蛋白含量的75%由10種最豐富的蛋白質代表，包括代表總蛋白高達50%的外膜蛋白孔蛋白A（PorA）和孔蛋白B（PorB）。
腦膜炎奈瑟氏菌孔蛋白（Por）是血清變型分型的抗原決定簇。鑑定了兩類孔蛋白PorA和PorB，以及每一類中由編碼表面暴露的環的por基因可變區（VR）中的序列變異引起的抗原性不同的變異體。
適用於本文揭示的免疫原性組合物的dOMV可從各種MenB菌株獲得。dOMV可以從MenB菌株的清潔劑提取物中分離出來。合適的MenB菌株可以是野生型MenB菌株或被工程化為過表現孔蛋白（如PorA或PorB蛋白，並且例如PorA蛋白）的MenB菌株。
在一個實施例中，dOMV可以從表現PorA蛋白的MenB菌株獲得。
在一個實施例中，dOMV可以從表現PorA VR2亞型的MenB菌株獲得。PorA VR2亞型可以是PorA VR2型P1.2、P1.4、P1.7、P1.10或P1.13蛋白。
在一個實施例中，dOMV可以從表現PorA VR2型P1.2蛋白的MenB菌株獲得。
在一個實施例中，dOMV可以從表現PorA VR2亞型和PorB P2.2a的MenB菌株獲得。dOMV可以從表現PorA VR2 P1.2和PorB P2.2a的MenB菌株獲得。
在一個實施例中，dOMV可以包含PorA VR2亞型和PorB P2.2a。dOMV可以包含PorA VR2 P1.2和PorB P2.2a。
在另一個實施例中，dOMV可以包含PorA VR2 P1.2和PorB P2.2a以及免疫型LOS L3,7。PorA和PorB可代表約50%的dOMV蛋白質。
在一些實施例中，dOMV可以從單個MenB菌株獲得，或從不同的MenB菌株獲得。在後一種情況下，MenB菌株可表現相同的PorA蛋白亞型，或不同的PorA蛋白亞型，或不同類型的孔蛋白，如PorA和PorB蛋白。
可以例如從PubMLST資料庫（https://pubmlst.org/）中鑑定出呈現所尋找的孔蛋白的dOMV的可用MenB菌株。例如，合適的MenB菌株可以藉由在這種資料庫中從流行病爆發中選擇MenB菌株、然後在這種子集中選擇具有編碼目的孔蛋白如PorA VR2 P1.2蛋白的基因的MenB菌株來獲得。然後，可以用業內已知的技術評價選擇的一種或多種菌株是否有效表現目的孔蛋白。
作為適合於根據本揭示文本獲得dOMV的MenB菌株的例子，可以提及以下菌株：NG H36、BZ 232、DK 353、B6116/77、BZ 163、0085/00、NG P20、0046/02、M11 40123、M12 240069、N5/99、99M或M07 240677。
在一個示例性實施例中，MenB菌株可以是表現PorA VR2 P1.2蛋白亞型的MenB菌株99M。
在一個實施例中，dOMV可包含孔蛋白A（PorA）VR2亞型P1.2。
在另一個實施例中，dOMV可包含外膜蛋白孔蛋白A（PorA）和/或外膜蛋白孔蛋白B（PorB）。相對於所述dOMV中存在的總蛋白，PorA可以範圍為約3%至約15%的量、或以約5%至約9%或10%的量存在。相對於所述dOMV中存在的總蛋白，PorB可以以範圍為約30%至約70%、或約35%至約65%、或約38%至約58%的量存在。
在一個實施例中，可以用使用至少一個去氧膽酸鹽處理步驟的清潔劑提取方法獲得dOMV。
獲得dOMV的合適方法可以如Helting等人（ Acta Pathol Microbiol Scand C. 1981年4月;89(2):69-78）或US 4,695,624的實例2中揭示的。例如，可以將細菌培養物離心以獲得沈澱，然後將沈澱在加熱下，例如從約50ºC至約60ºC或在約56ºC用清潔劑例如去氧膽酸鹽或十二烷基硫酸鈉（SDS）提取，持續範圍為約10至約20分鐘或為約15分鐘的時間。然後可以將得到的材料離心，並且可以將沈澱根據業內已知的任何方法進一步懸浮和純化。
在一個實施例中，dOMV可以範圍為約5 μg/劑量至約400 μg/劑量、或約10 µg/劑量至約300 µg/劑量、或約25 µg/劑量至約250 µg/劑量、或約35 µg/劑量至約225 µg/劑量、或約50 µg/劑量至約200 µg/劑量、或約75 µg/劑量至約180 µg/劑量、或約100 µg/劑量至約150 µg/劑量、或約110 µg/劑量至約125 µg/劑量的量存在。在一個實施例中，dOMV可以以約25 μg/劑量、或約 50μg/劑量、或約125 μg/劑量的量存在。 另外的抗原
在一個實施例中，如本文揭示的免疫原性組合物可包含除了如本文揭示的腦膜炎奈瑟氏菌抗原的組合之外的至少一種另外的抗原。
在示例性實施例中，另外的抗原可以是與載體蛋白接合的來自腦膜炎奈瑟氏菌血清群A、C、W135、Y和/或X的糖類抗原。在一個實施例中，另外的抗原可以是MenA、MenC、MenW-135和MenY莢膜多糖與載體蛋白的接合物的組合。
在示例性實施例中，另外的抗原可以是與載體蛋白接合的來自腦膜炎奈瑟氏菌血清群A、C、W135和/或Y的糖類抗原。在一個實施例中，另外的抗原可以是MenA、MenC、MenW-135和MenY莢膜多糖與載體蛋白的接合物的組合。
不同莢膜多糖的載體蛋白可以不同或相同。載體蛋白可以包括滅活的細菌毒素，如白喉類毒素、CRM197、破傷風類毒素、百日咳類毒素、大腸桿菌LT、大腸桿菌ST和來自銅綠假單胞菌的外毒素A。也可以使用細菌外膜蛋白，如孔蛋白、轉鐵蛋白結合蛋白、肺松解術（pneumolysis）、肺炎球菌表面蛋白A（PspA）或肺炎球菌黏附素蛋白（PsaA）。其他蛋白質，如卵清蛋白、鑰孔蟲戚血藍蛋白（KLH）、牛血清白蛋白（BSA）、或結核菌素的純化蛋白衍生物（PPD）也可以用作載體蛋白。它可以是CRM197蛋白、破傷風或白喉類毒素。在一個實施例中，它是破傷風類毒素。
接合物可以是包含分子量在700 kDa至1400 kDa或800 kDa至1300 kDa範圍內的分子的群體。
在每個劑量中，單獨糖類抗原以糖類品質測量的量可以在1-50 μg之間。例如，每劑量可投予總計40 μg的糖類。例如，可以投予10 μg的每種多糖和大約55 μg的載體蛋白（如破傷風類毒素蛋白）。
在一個實施例中，另外的抗原可以是各自接合至破傷風類毒素載體蛋白的MenA、MenC、MenW-135和MenY莢膜多糖的組合，其中MenA多糖經由己二酸二醯肼（ADH）接頭接合至破傷風類毒素載體，而MenC、MenW-135和MenY多糖各自直接接合至破傷風類毒素載體（TT）。
在一個實施例中，另外的抗原可以是MenA、MenC、MenW-135和MenY莢膜多糖與破傷風類毒素載體蛋白的接合物的組合。在示例性實施例中，來自腦膜炎奈瑟氏菌血清群A、C、W135和/或Y的接合糖類抗原可以如在WO 2018/045286 A1或WO 2002/058737 A2中揭示的。 在一個實施例中，另外的抗原是可商購的MenACYW-TT接合物疫苗MENQUADFI ®的抗原。 佐劑
在一個實施例中，如本文揭示的組合物還可包含佐劑。
在一個實施例中，佐劑可以是鋁基佐劑（或鋁鹽）。鋁基佐劑可以是氫氧化鋁佐劑（例如，羥基氧化鋁-AlOOH）、磷酸鋁佐劑（例如，羥基磷酸鋁-Al(OH)PO 4-或正磷酸鋁-AlPO 4）、硫酸鋁鹽佐劑、硫酸羥基磷酸鋁佐劑、硫酸鋁鉀佐劑、羥基碳酸鋁、氫氧化鋁和氫氧化鎂的組合（可商購為Imject® Alum）、或它們的混合物。在一個實施例中，鋁基佐劑可以是氫氧化鋁佐劑（例如，羥基氧化鋁-AlOOH）、磷酸鋁佐劑（例如，羥基磷酸鋁-Al(OH)PO 4-或正磷酸鋁-AlPO 4）、或它們的混合物。在一個實施例中，鋁基佐劑可以是磷酸鋁佐劑，如羥基磷酸鋁（Al(OH)PO 4）或正磷酸鋁-（AlPO 4），佐劑可以採取任何合適的形式，如凝膠、結晶、無定形物等。在一個實施例中，鋁基佐劑可以是無定形羥基磷酸鋁鹽。在一個實施例中，鋁基佐劑可以是正磷酸鋁鹽。在另一個實施例中，鋁基佐劑可以是結晶羥基氧化鋁鹽（水鋁石）。
羥基磷酸鋁或正磷酸鋁佐劑可以藉由在磷酸鹽的存在下沈澱羥基氧化鋁來獲得。沈澱反應過程中的反應條件和反應物濃度影響磷酸取代鹽中的羥基的程度。
羥基磷酸鋁或正磷酸鋁佐劑可具有0.3與0.99之間的PO/Al莫耳比率，並且例如0.8與0.95之間（例如，0.88+0.05）的比率。
羥基磷酸鋁[Al(OH)x(PO4)y]佐劑（其中每個陰離子的化合價之和乘以其莫耳分數為-3）可以藉由羥基的存在與AlPO 4區分開來。例如，3146 cm -1處的IR光譜帶（例如，當加熱到200ºC時）指示結構羥基的存在。
羥基氧化鋁[AIO(OH)]可以藉由IR光譜，特別是藉由在1070 cm -1處的吸收帶和在3090-3100 cm -1處的強肩峰的存在與Al(OH)3區分開來。
也可以使用不同鋁基佐劑的混合物。
在一個實施例中，佐劑可以是磷酸鋁佐劑。
在示例性實施例中，如本文揭示的免疫原性組合物可包含單一鋁基佐劑，即其可代表組合物中存在的鋁佐劑的超過90%、超過99%或甚至超過99.9%。可以存在鋁基佐劑以使得Al 3+的濃度可以是約0.5 mg/mL至約1.5 mg/mL的Al 3+，或約0.8至約1.2 mg/mL的Al 3+，或可以具有約1.00 mg/ml的Al 3+。
鋁基佐劑，如磷酸鋁佐劑，可以以範圍為約100 µg/劑量至約1000 µg/劑量、或約150 µg/劑量至約900 µg/劑量、或約200 µg/劑量至約800 µg/劑量、或約250 µg/劑量至約700 µg/劑量、或約300 µg/劑量至約600 µg/劑量、或約350 µg/劑量至約550 µg/劑量、或約400 µg/劑量至約500 µg/劑量、或約400 µg/劑量至約800 µg/劑量或為約400 µg/劑量、或約800 µg/劑量的量存在於本文揭示的組合物中。
除了（或替代）鋁基佐劑之外，組合物可包含其他佐劑。
合適的佐劑可包括但不限於：磷酸鈣佐劑、MF59（4.3% w/v 角鯊烯，0.5% w/v Tween 80™，0.5% w/v Span 85）、含CpG的核酸（其中胞嘧啶是非甲基化的）、QS21、MPL、3DMPL、來自Aquilla的提取物、ISCOMS、LT/CT突變體、聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)（PLG）微粒、Quil A、白細胞介素等。對於實驗動物，可以使用弗氏佐劑（不完全弗氏佐劑；完全弗氏佐劑）、N-乙醯基-胞壁醯-L-蘇胺醯-D-異麩醯胺酸（thr-MDP）、N-乙醯基-去甲胞壁醯-L-丙胺醯-D-異麩醯胺酸（CGP 11637，稱為去甲MDP）、N-乙醯基胞壁醯-L-丙胺醯-D-異麩醯胺酸醯-L-丙胺酸-2-(l'-2'-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-羥基磷醯氧基)-乙胺（CGP 19835A，稱為MTP-PE）和RIBI（其在2%角鯊烯/Tween 80乳液中包含從細菌提取的三種組分，即單磷醯脂質A、海藻糖二黴菌酸酯和細胞壁骨架（MPL+TDM+CWS））。佐劑的有效性可以藉由測量針對免疫原性抗原或其抗原表位的抗體的量來確定。
增強組合物有效性的其他示例性佐劑可以包括但不限於：(1) 水包油乳劑配製品（具有或不具有其他特異性免疫刺激劑，如胞壁醯肽（見下文）或細菌細胞壁組分），例如 (a) MF59（WO 90/14837），其包含5%角鯊烯、0.5% Tween 80和0.5% Span 85（任選地包含MTP-PE），使用微流化器被配製成亞微米顆粒，(b) SAF，其包含10%角鯊烷、0.4% Tween 80、5% pluronic嵌段聚合物L121和thr-MDP，微流化成亞微米乳劑或渦旋為產生更大細微性的乳劑，和 (c) RIBI佐劑系統（RAS）（Ribi Immunochem，漢米爾頓（Hamilton），Mont.），其包含2%角鯊烯、0.2% Tween 80和一種或多種細菌細胞壁組分（如單磷醯脂質A（MPL）、海藻糖二黴菌酸酯（TDM）和細胞壁骨架（CWS），例如MPL+CWS（Detox TM））；(2) 可以使用皂苷佐劑如QS21或Stimulon™（Cambridge Bioscience，伍斯特，麻塞諸塞州）或由其產生的顆粒如ISCOM（免疫刺激複合物），所述ISCOM可以不含另外的清潔劑，例如WO 00/07621；(3) 完全弗氏佐劑（CFA）或不完全弗氏佐劑（IF A）；(4) 細胞介素，如白細胞介素（例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12（W099/44636）等）、干擾素（例如γ干擾素）、巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）、腫瘤壞死因子（TNF）等；(5) 單磷醯脂質A（MPL）或3-O-去醯基化MPL（3dMPL），例如GB-2220221、EP-A- 0689454，當與肺炎球菌糖類一起使用時任選地在基本上不存在明礬的情況下如此，例如WO 00/56358；(6) 3dMPL與例如QS21和/或水包油乳劑的組合，例如EP-A-0835318、EP-A-0735898、EP-A-0761231；(7) 包含CpG基序的寡核苷酸（參見例如WO 98/52581），例如包含至少一個CG二核苷酸（其中胞嘧啶是非甲基化的）的寡核苷酸；(8) 聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯（參見例如WO 99/52549）；(9) 與辛苯聚醇組合的聚氧乙烯脫水山梨醇酯表面活性劑（WO 01/21207）或者與至少一種另外的非離子表面活性劑如辛苯聚醇組合的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性劑（WO 01/21152）；(10) 皂苷和免疫刺激性寡核苷酸（例如，CpG寡核苷酸）（WO 00/62800）；(11) 免疫刺激劑和金屬鹽顆粒，例如WO 00/23105；(12) 皂苷和水包油乳劑，例如WO 99/11241；(13) 皂苷（例如，QS21）+3dMPL+IM2（任選地+甾醇），例如WO 98/57659；(14) 作為免疫刺激劑以增強組合物功效的其他物質。胞壁醯肽包括N-乙醯基-胞壁醯-L-蘇胺醯-D-異麩醯胺酸（thr-MDP）、N-25 乙醯基-去甲胞壁醯-L-丙胺醯-D-異麩醯胺酸（nor-MDP）、N-乙醯基胞壁醯-L-丙胺醯-D-異麩醯胺酸醯-L-丙胺酸-2-(l'-2'-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-羥基磷醯氧基)-乙胺MTP-PE）等。
適合投予人的佐劑可以是鋁鹽佐劑（例如磷酸鋁或氫氧化鋁）。 免疫原性組合 物
本文揭示的免疫原性組合物可包含腦膜炎球菌抗原的組合，所述組合包含至少一種H因子結合蛋白（fHBP）A蛋白、至少一種fHBP B蛋白、至少一種奈瑟氏菌黏附素A（NadA）蛋白和至少一種清潔劑提取的外膜囊泡（dOMV）。
本文揭示的免疫原性組合物可包含腦膜炎奈瑟氏菌血清群B抗原的組合，所述組合包含至少一種H因子結合蛋白（fHBP）A蛋白、至少一種fHBP B蛋白、至少一種奈瑟氏菌黏附素A（NadA）蛋白和至少一種清潔劑提取的外膜囊泡（dOMV）。所述fHBP A蛋白和/或所述fHBP B蛋白可以是非脂化的。
所述fHBP A蛋白可以是包含與SEQ ID NO: 1至少約85%的同一性的突變蛋白，和/或所述fHBP B蛋白可以是包含與SEQ ID NO: 3至少約85%的同一性的突變蛋白。
所述fHBP A蛋白基於SEQ ID NO: 6的編號可包含選自以下中至少一者的至少一個胺基酸取代：a) 在胺基酸115處的天門冬醯胺酸（N115）的胺基酸取代；b) 在胺基酸121處的天門冬胺酸（D121）的胺基酸取代；c) 在胺基酸128處的絲胺酸（S128）的胺基酸取代；d) 在胺基酸130處的白胺酸（L130）的胺基酸取代；e) 在位置131處的纈胺酸（V131）的胺基酸取代；f) 在位置133處的甘胺酸（G133）的胺基酸取代；g) 在位置219處的離胺酸（K219）的胺基酸取代；和h) 在位置220處的甘胺酸（G220）的胺基酸取代，或包含SEQ ID NO: 2或由SEQ ID NO: 2組成，和/或所述fHBP B蛋白基於SEQ ID NO: 6的編號可包含選自以下中至少一者的至少一個胺基酸取代：a) 在胺基酸38處的麩醯胺酸（Q38）的胺基酸取代；b) 在胺基酸92處的麩胺酸（E92）的胺基酸取代；c) 在胺基酸130處的精胺酸（R130）的胺基酸取代；d) 在胺基酸223（S223）處的絲胺酸的胺基酸取代；和e) 在胺基酸248處的組胺酸（H248）的胺基酸取代，或包含SEQ ID NO: 4或由SEQ ID NO: 4組成。
所述fHBP A蛋白和/或所述fHBP B可以範圍為約20 µg/劑量至約200 µg/劑量、或約25 µg/劑量至約180 µg/劑量、或約40 µg/劑量至約140 µg/劑量、或約50 µg/劑量至約120 µg/劑量、或約75 µg/劑量至約100 µg/劑量或為約25 µg/劑量、或約50 µg/劑量或約100 µg/劑量的量存在。
NadA蛋白可以是NadA1蛋白或可包含與SEQ ID NO: 5至少約85%的同一性，或包含SEQ ID NO: 5或由SEQ ID NO: 5組成。
NadA蛋白可以範圍為約20 μg/劑量至約200 µg/劑量、或約25 µg/劑量至約180 µg/劑量、或約40 µg/劑量至約140 µg/劑量、或約50 µg/劑量至約120 µg/劑量、或約75 µg/劑量至約100 µg/劑量或為約50 µg/劑量的量存在。
dOMV可包含孔蛋白A（PorA）。
所述dOMV可以範圍為約5 µg/劑量至約400 µg/劑量、或約10 µg/劑量至約300 µg/劑量、或約25 µg/劑量至約250 µg/劑量、或約35 µg/劑量至約225 µg/劑量、或約50 µg/劑量至約200 µg/劑量、或約75 µg/劑量至約180 µg/劑量、或約100 µg/劑量至約150 µg/劑量、或約110 µg/劑量至約125 µg/劑量或為約25 µg/劑量、或約50 µg/劑量、或約125 µg/劑量的量存在。
所述組合物可包含佐劑，例如鋁基佐劑，例如選自包含以下的組的鋁基佐劑：氫氧化鋁佐劑、磷酸鋁佐劑、硫酸鋁鹽佐劑、羥基磷酸鋁硫酸鹽佐劑、硫酸鋁鉀佐劑、羥基碳酸鋁、氫氧化鋁和氫氧化鎂的組合、以及它們的混合物，例如是磷酸鋁佐劑。
所述組合物可包含以下或由以下組成：約25至約100 μg/劑量的包含SEQ ID NO: 2或由其組成的非脂化fHBP A蛋白、約25至約100 μg/劑量的包含SEQ ID NO: 4或由其組成的非脂化fHBP B蛋白、約25至約100 µg/劑量的包含SEQ ID NO: 5或由其組成的NadA蛋白、約20至約150 µg/劑量的來自表現PorA VR2 P1.2的MenB菌株的dOMV、約100至約600 µg/劑量的磷酸鋁佐劑、50 mM乙酸鹽緩衝液和pH 6.0。
所述組合物還可包含來自腦膜炎奈瑟氏菌血清群A、C、W135和/或Y中的一種或多種的至少一種接合莢膜糖。
還揭示了包含如本文所述的組合物的疫苗。
如本文揭示的組合物或疫苗可用於防止腦膜炎球菌感染或可用於誘導針對腦膜炎球菌細菌的免疫反應。
還揭示了一種組合物，所述組合物包含編碼fHBP A蛋白的mRNA、編碼fHBP B蛋白的mRNA、編碼NadA蛋白的mRNA、和來自表現PorA VR2 P1.2的MenB的dOMV，所述fHBP A蛋白包含與SEQ ID NO: 2至少約85%、至少約90%、至少95%、至少約98%、至少約99%、至少約99.5%或約100%的胺基酸序列同一性，所述fHBP B蛋白包含與SEQ ID NO: 4至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%、至少約99.5%或約100%的胺基酸序列同一性，所述NadA蛋白包含與SEQ ID NO: 5至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%、至少約99.5%或約100%的胺基酸序列同一性。 配製品
在另一態樣，本揭示文本涉及包含如本文揭示的組合物的疫苗。
如本文揭示的免疫原性組合物或疫苗組合物可以被配製成固體、半固體、液體形式的製劑，如片劑、膠囊、散劑、氣霧劑、溶液、混懸劑或乳劑。投予此類組合物的典型途徑包括而不限於口服、局部、透皮、吸入、腸胃外、舌下、頰、鼻內。如本文所用的術語腸胃外包括皮下注射、靜脈內、肌內、皮內、胸骨內注射或輸注技術。在一些實施例中，如本文揭示的疫苗組合物可藉由透皮、皮下、皮內或肌內途徑投予。本揭示文本的組合物基於遞送方式被配製，包括例如被配製用於經由腸胃外遞送（如肌內、皮內或皮下注射）遞送的組合物。
如本文揭示的免疫原性組合物可以經由任何合適的途徑投予，如藉由黏膜投予（例如，鼻內或舌下）、腸胃外投予（例如，肌內、皮下、經皮或皮內途徑）或口服投予。如業內熟習此項技術者所理解的，免疫原性組合物可以適合地被配製為與預期的投予途徑相容。在一個實施例中，如本文揭示的免疫原性組合物可以被配製為經由肌內途徑或皮內途徑或皮下途徑投予。在一個實施例中，免疫原性組合物可以被配製為經由肌內途徑投予。
如本文揭示的組合物被配製為使得其中包含的活性成分在組合物被投予受試者時是生物可利用的。
製備此類劑型的實際方法對於業內熟習此項技術者是已知的或將是清楚的；例如參見Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第20版 (Philadelphia College of Pharmacy and Science, 2000)。
如本文揭示的免疫原性組合物可以與任何醫藥上可接受的賦形劑一起配製。所述組合物可包含至少一種惰性稀釋劑或載劑。一種示例性的醫藥上可接受的媒劑是生理鹽水緩衝液。其他生理學上可接受的媒劑是業內熟習此項技術者已知的並且例如描述於Remington’s Pharmaceutical Sciences (第18版), 編輯 A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Company, 伊斯頓, 賓夕法尼亞州。如本文所述的免疫原性組合物可以任選地包含接近生理條件所需的醫藥上可接受的輔助物質，如pH調節劑和緩沖劑、張力調節劑、潤濕劑等，例如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、失水山梨醇單月桂酸酯、油酸三乙醇胺、人血清白蛋白、必需胺基酸、非必需胺基酸、L-精胺酸鹽酸鹽、蔗糖、D-海藻糖脫水物、山梨醇、三(羥甲基)胺基甲烷和/或尿素。此外，疫苗組合物可以任選地包含醫藥上可接受的添加劑，包括例如稀釋劑、黏合劑、穩定劑和防腐劑。
在一個實施例中，所述組合物可呈液體形式，例如溶液、乳液或懸浮液。液體可用於藉由注射遞送。旨在藉由注射投予的組合物可以包含以下中的至少一種：表面活性劑、防腐劑、潤濕劑、分散劑、助懸劑、緩衝液、穩定劑和等滲劑。如本文揭示的液體組合物可包含以下中的至少一種：無菌稀釋劑如注射用水、鹽水溶液，如生理鹽水、林格氏溶液、等滲氯化鈉；固定油，如可用作溶劑或懸浮介質的合成甘油單酯或甘油二酯、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他溶劑；抗細菌劑，如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，如乙二胺四乙酸；緩衝液，如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及用於調節張力的藥劑，如氯化鈉或右旋糖；作為冷凍保護劑的試劑，如蔗糖或海藻糖。
在另一個實施例中，如本文揭示的組合物可以具有約4.0至約9.0範圍內的pH。
本文所揭示的免疫原性組合物的pH範圍可為約4.5至約8.5、約4.8至約8.2、約5.0至約8.0、約5.2至約7.5、約5.4至約7.0、約5.5至約6.8、約5.7至約6.5、約5.8至約6.2。在一個實施例中，如本文揭示的組合物的pH可為約6.0。藉由使用緩衝液可維持穩定的pH。
在一個實施例中，如本文揭示的組合物還可包含緩衝液。可以列舉Tris緩衝液、乙酸鹽緩衝液、檸檬酸鹽緩衝液、磷酸鹽緩衝液、HEPES緩衝液或組胺酸緩衝液作為可能的可用緩衝液。
在示例性實施例中，如本文揭示的組合物可包含乙酸鈉緩衝液。乙酸鈉緩衝液可以以範圍為約10 mM至約300 mM，或範圍為約10 mM至約250 mM，或範圍為約20 mM至約250 mM，或範圍為約20 mM至約150 mM、或約20 mM至約130 mM、或約30 mM至約120 mM、或約40 mM至約100 mM、或約50 mM至約80 mM、或約50 mM至約60 mM的濃度，或例如以約50 mM的濃度存在。
免疫原性組合物對於哺乳動物如人可以是等滲的。
免疫原性組合物還可包含一種或幾種另外的鹽，如鈉鹽、鈣鹽或鎂鹽。在一個實施例中，鈉鹽可選自包含氯化鈉、磷酸鈉的組。在一個實施例中，鈉鹽可以是氯化鈉。鈣鹽可以是氯化鈣鹽。鎂鹽可以是氯化鎂鹽。在一個實施例中，鈉鹽可以範圍為約10 mM至約300 mM、或約30 mM至約280 mM、或約50 mM至約250 mM、或約60 mM至約220 mM、或約80 mM至約200 mM、或約100 mM至約180 mM、或約120 mM至約160 mM的濃度存在，或可以是例如約150 mM的濃度。鈣或鎂可以以範圍為約1 mM至約15 mM、或約5 mM至約10 mM的量存在。
可以將腸胃外製劑封裝在由玻璃或塑膠製成的安瓿、一次性注射器或多劑量小瓶中。可注射的組合物是例如無菌的。
如本文揭示的免疫原性組合物可以藉由常規滅菌技術（例如用UV或γ輻射）滅菌，或者可以進行無菌過濾。藉由對如本文揭示的液體免疫原性組合物無菌過濾得到的組合物可以液體形式包裝和儲存或凍乾。凍乾組合物可以在投予前用無菌水性載劑重構。乾組合物可以包含穩定劑，如甘露醇、蔗糖或十二烷基麥芽糖苷以及它們的混合物，例如乳糖/蔗糖混合物、蔗糖/甘露醇混合物等。
將如本文揭示的組合物以治療有效量投予，所述治療有效量將取決於多種因素，包括所使用的具體治療劑的活性；治療劑的代謝穩定性和作用時間；患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食；投予方式和時間；排泄率；藥物組合；具體障礙或病症的嚴重程度；和接受療法的受試者。
在一個實施例中，如本文揭示的組合物可以包含以下或由以下組成：包含SEQ ID NO: 2或由其組成的非脂化fHBP A蛋白、包含SEQ ID NO: 4或由其組成的非脂化fHBP B蛋白、包含SEQ ID NO: 5或由其組成的NadA蛋白、來自表現PorA VR2 P1.2的dOMV。所述組合物可包含磷酸鋁佐劑。所述組合物可以包含50 mM乙酸鹽緩衝液和pH 6.0
在一個實施例中，如本文揭示的組合物可包含以下或由以下組成：由SEQ ID NO: 2組成的非脂化fHBP A蛋白、由SEQ ID NO: 4組成的非脂化fHBP B蛋白、由SEQ ID NO: 5組成的NadA蛋白、來自表現PorA VR2 P1.2的dOMV、磷酸鋁佐劑、50 mM乙酸鹽緩衝液和pH 6.0。
在另一個實施例中，如本文揭示的組合物可包含以下或由以下組成：約25至約100 μg/劑量的由SEQ ID NO: 2組成的非脂化fHBP A蛋白、約25至約100 μg/劑量的由SEQ ID NO: 4組成的非脂化fHBP B蛋白、約25至約100 µg/劑量的由SEQ ID NO: 5組成的NadA蛋白、約20至約150 µg/劑量的來自表現PorA VR2 P1.2的MenB菌株的dOMV、約100至約800 µg/劑量的磷酸鋁佐劑、50 mM乙酸鹽緩衝液和pH 6.0。
在另一個實施例中，如本文揭示的組合物可包含以下或由以下組成：約25 µg/劑量的由SEQ ID NO: 2組成的非脂化fHBP A蛋白、約25 μg/劑量的由SEQ ID NO: 4組成的非脂化fHBP B蛋白、約25 µg/劑量的由SEQ ID NO: 5組成的NadA蛋白、約25 µg/劑量的來自表現PorA VR2 P1.2的MenB菌株的dOMV、約100 µg/劑量的磷酸鋁佐劑、50 mM乙酸鹽緩衝液和pH 6.0。
在另一個實施例中，如本文揭示的組合物可包含以下或由以下組成：約25 µg/劑量的由SEQ ID NO: 2組成的非脂化fHBP A蛋白、約25 μg/劑量的由SEQ ID NO: 4組成的非脂化fHBP B蛋白、約50 µg/劑量的由SEQ ID NO: 5組成的NadA蛋白、約50 µg/劑量的來自表現PorA VR2 P1.2的MenB菌株的dOMV、約400 µg/劑量的磷酸鋁佐劑、50 mM乙酸鹽緩衝液和pH 6.0。
在另一個實施例中，如本文揭示的組合物可包含以下或由以下組成：約50 µg/劑量的由SEQ ID NO: 2組成的非脂化fHBP A蛋白、約50 μg/劑量的由SEQ ID NO: 4組成的非脂化fHBP B蛋白、約50 µg/劑量的由SEQ ID NO: 5組成的NadA蛋白、約25 µg/劑量的來自表現PorA VR2 P1.2的MenB菌株的dOMV、約400 µg/劑量的磷酸鋁佐劑、50 mM乙酸鹽緩衝液和pH 6.0。
在另一個實施例中，如本文揭示的組合物可包含以下或由以下組成：約50 µg/劑量的由SEQ ID NO: 2組成的非脂化fHBP A蛋白、約50 μg/劑量的由SEQ ID NO: 4組成的非脂化fHBP B蛋白、約50 µg/劑量的由SEQ ID NO: 5組成的NadA蛋白、約50 µg/劑量的來自表現PorA VR2 P1.2的MenB菌株的dOMV、約400 µg/劑量的磷酸鋁佐劑、50 mM乙酸鹽緩衝液和pH 6.0。
在另一個實施例中，如本文揭示的組合物可包含以下或由以下組成：約50 µg/劑量的由SEQ ID NO: 2組成的非脂化fHBP A蛋白、約50 μg/劑量的由SEQ ID NO: 4組成的非脂化fHBP B蛋白、約50 µg/劑量的由SEQ ID NO: 5組成的NadA蛋白、約125 µg/劑量的來自表現PorA VR2 P1.2的MenB菌株的dOMV、約400 µg/劑量的磷酸鋁佐劑、50 mM乙酸鹽緩衝液和pH 6.0。
在另一個實施例中，如本文揭示的組合物可包含以下或由以下組成：約50 µg/劑量的由SEQ ID NO: 2組成的非脂化fHBP A蛋白、約50 μg/劑量的由SEQ ID NO: 4組成的非脂化fHBP B蛋白、約50 µg/劑量的由SEQ ID NO: 5組成的NadA蛋白、約50 µg/劑量的來自表現PorA VR2 P1.2的MenB菌株的dOMV、約200 µg/劑量的磷酸鋁佐劑、50 mM乙酸鹽緩衝液和pH 6.0。
在另一個實施例中，如本文揭示的組合物可包含以下或由以下組成：約75 µg/劑量的由SEQ ID NO: 2組成的非脂化fHBP A蛋白、約75 μg/劑量的由SEQ ID NO: 4組成的非脂化fHBP B蛋白、約75 µg/劑量的由SEQ ID NO: 5組成的NadA蛋白、約75 µg/劑量的來自表現PorA VR2 P1.2的MenB菌株的dOMV、約300 µg/劑量的磷酸鋁佐劑、50 mM乙酸鹽緩衝液和pH 6.0。
在另一個實施例中，如本文揭示的組合物可包含以下或由以下組成：約100 µg/劑量的由SEQ ID NO: 2組成的非脂化fHBP A蛋白、約100 μg/劑量的由SEQ ID NO: 4組成的非脂化fHBP B蛋白、約100 µg/劑量的由SEQ ID NO: 5組成的NadA蛋白、約125 µg/劑量的來自表現PorA VR2 P1.2的MenB菌株的dOMV、約400 µg/劑量的磷酸鋁佐劑、50 mM乙酸鹽緩衝液和pH 6.0。
在另一個實施例中，如本文揭示的組合物可包含以下或由以下組成：約100 µg/劑量的由SEQ ID NO: 2組成的非脂化fHBP A蛋白、約100 μg/劑量的由SEQ ID NO: 4組成的非脂化fHBP B蛋白、約50 µg/劑量的由SEQ ID NO: 5組成的NadA蛋白、約50 µg/劑量的來自表現PorA VR2 P1.2的MenB菌株的dOMV、約400 µg/劑量的磷酸鋁佐劑、50 mM乙酸鹽緩衝液和pH 6.0。
在另一個實施例中，如本文揭示的組合物可包含以下或由以下組成：約100 µg/劑量的由SEQ ID NO: 2組成的非脂化fHBP A蛋白、約100 μg/劑量的由SEQ ID NO: 4組成的非脂化fHBP B蛋白、約50 µg/劑量的由SEQ ID NO: 5組成的NadA蛋白、約50 µg/劑量的來自表現PorA VR2 P1.2的MenB菌株的dOMV、約800 µg/劑量的磷酸鋁佐劑、50 mM乙酸鹽緩衝液和pH 6.0。
在一個實施例中，本揭示文本涉及一種容器，所述容器包含如本文揭示的組合物。容器可以包含含有腦膜炎球菌抗原的組合的免疫原性組合物，所述組合包含至少一種H因子結合蛋白（fHBP）A蛋白、至少一種fHBP B蛋白、至少一種奈瑟氏菌黏附素A（NadA）蛋白和至少一種清潔劑提取的外膜囊泡（dOMV）。
另外，容器可包含組合物，所述組合物包含以下或由以下組成：約25至100 μg/劑量的由SEQ ID NO: 2組成的非脂化fHBP A蛋白、約25至100 μg/劑量的由SEQ ID NO: 4組成的非脂化fHBP B蛋白、約25至100 µg/劑量的由SEQ ID NO: 5組成的NadA蛋白、約20至150 µg/劑量的來自表現PorA VR2 P1.2的MenB菌株的dOMV、約100至800 µg/劑量的磷酸鋁佐劑、50 mM乙酸鹽緩衝液和pH 6.0。
容器可以是小瓶。小瓶可以是多劑量小瓶或可以是單劑量小瓶。合適的小瓶可以是用最合適的塞子和密封件密封的小玻璃或塑膠容器。
或者，容器可以是載藥注射器。載藥注射器可以包括儲存如本文揭示的液體組合物的注射器筒。墊片和柱塞插入注射器筒中。墊片以液密方式密封注射器筒以防止液體藥物洩漏，並且柱塞使墊片滑動。各種類型的載藥注射器在業內是已知的，如例如在US 10,625,025或WO 2013/046855中描述的。
在如本文揭示的組合物要與另一種疫苗組合物（例如作為四價MenACWY接合組合物）一起混合並注射的情況下，兩種組合物均可以被包裝在作為單個小瓶或載藥注射器的一個容器中或被包裝在雙室注射器中。雙室注射器也稱為順序或旁路注射器，可包括由隔膜分隔成近側和遠側兩個隔室的單個筒。注射器柱塞的下壓迫使兩種疫苗組合物在遠側隔室中混合。各種類型的雙室注射器在業內是已知的，如例如在US 10,695,505中描述的。雙室注射器也可以在疫苗組合物被配製為乾燥形式如凍乾形式的情況下使用，並且與用於重構的液體媒劑一起儲存。在這種情況下，乾燥的疫苗儲存在一個室中，而用於重構和注射的液體儲存在第二室中。 製造方法
如本文揭示的組合物可以藉由製藥領域熟知的方法來製備。
在一個實施例中，本揭示文本涉及一種製備如本文揭示的免疫原性組合物或如本文揭示的疫苗的方法，所述方法至少包括將腦膜炎球菌抗原和任選地鋁鹽混合的步驟，所述抗原包含至少一種H因子結合蛋白（fHBP）A蛋白、至少一種fHBP B蛋白、至少一種奈瑟氏菌黏附素A（NadA）蛋白和至少一種清潔劑提取的外膜囊泡（dOMV）。
在一個實施例中，混合的步驟可包括將任選地吸附在AlPO 4上的至少一種H因子結合蛋白（fHBP）A蛋白和任選地吸附在AlPO 4鹽上的至少一種fHBP B蛋白的第一混合物與任選地吸附在AlPO 4上的至少一種NadA蛋白和至少一種dOMV的第二混合物共混。
在一個實施例中，混合的步驟可包括將吸附在AlPO 4上的至少一種H因子結合蛋白（fHBP）A蛋白和吸附在AlPO 4鹽上的至少一種fHBP B蛋白的第一混合物與吸附在AlPO 4上的至少一種NadA蛋白和至少一種dOMV的第二混合物共混。
抗原fHBP A和B以及NadA可以首先吸附於鋁基佐劑例如AlPO 4上，然後與dOMV混合在一起。混合可以按任何順序進行。可替代地，吸附於鋁基佐劑上的fHBP A和B可以在適當的緩衝液中混合在一起。吸附於鋁基佐劑上的NadA和dOMV可以在適當的緩衝液中混合在一起。然後將兩種混合物共混，以獲得如本文揭示的免疫原性組合物。
然後可以將另外的抗原如接合MenACWY多糖與如本文揭示的組合物混合。可以就在投予患者之前，將另外的抗原組合物如接合MenACWY多糖組合物與如本文揭示的免疫原性組合物任選地經由雙室注射器共混在一起，所述雙室注射器在投予之前將這兩種組合物混合在一起。
在另一個實施例中，將如本文所揭示的免疫原性組合物或疫苗與接合MenACWY多糖免疫原性組合物或疫苗共投予。可以與如本文揭示的免疫原性組合物或疫苗共投予的接合MenACWY多糖免疫原性組合物或疫苗可以是各自接合至破傷風類毒素載體蛋白的MenA、MenC、MenW-135和MenY莢膜多糖，任選地其中MenA多糖經由己二酸二醯肼（ADH）接頭接合至破傷風類毒素載體，而MenC、MenW-135和MenY多糖各自直接接合至破傷風類毒素載體。共投予的接合MenACWY多糖免疫原性組合物或疫苗可以是如在WO 2018/045286 A1或WO 2002/058737 A2中揭示的。共投予的接合MenACWY多糖免疫原性組合物或疫苗可以是可商購的MenACYW-TT接合物疫苗MENQUADFI ®。
在另一個實施例中，用於如本文揭示的製備方法中的抗原和鋁鹽可於緩衝液中。
如本文揭示的組合物可以液體或固體例如凍乾形式來製造。
在一個實施例中，如本文揭示的免疫原性組合物可以乾燥形式如凍乾組合物或作為藉由如WO 2009/109550中所述的造粒工藝獲得的微丸來包裝和儲存。在一個實施例中，組合物的不同組分（例如MenB抗原）以及可能的另外的抗原都可以存在於相同的微丸中。在另一個實施例中，如本文揭示的免疫原性組合物的組分可以各自處於不同的微丸中，即每個微丸一種組分；或所有組分或它們中的一些（在這種情況下，其他一種或多種組分可各自在不同的微丸中）可以成對或三聯劑（二價或三價配製品）組合在相同的微丸中（fHBP A+B和NadA+dOMV，fHBP A + NadA和fHBP B + dOMV，fHBP B + NadA和fHBP A + dOMV，fHBP A + NadA + fHBP B和dOMV，或fHBP A + dOMV + fHBP B和NadA等）。在這樣的實施例中，可以在投予受試者之前將單獨包含不同組分或至少兩種不同組分的任何組合的不同微丸混合。在一個實施例中，可以將它們在液體載劑中重構之前混合。在另一個實施例中，可以將它們在液體載劑中重構時藉由添加至一個體積的液體載劑中來混合。在另一個實施例中，首先可以將它們各自單獨添加至不同體積的液體載劑中，其次，可以然後將不同體積的液體載劑混合在一起以得到有待投予受試者的最終液體組合物。
在一個實施例中，四種抗原和AlPO 4處於同一個容器中。
在另一個實施例中，佐劑和抗原可以製備於至少兩種不同的組合物中。然後就在投予患者之前，可以任選地經由雙室注射器將不同的組合物共混在一起，所述雙室注射器在投予之前將兩種組合物混合在一起。在另一個實施例中，不同的組合物可以分開投予，即同時（實際上僅相隔幾秒或幾分鐘，例如少於5分鐘）但經由至少兩個不同的投予部位（如至少兩個不同的注射部位）投予。在另一個實施例中，不同的組合物可以依序投予，即在至少兩個不同的時間點，如相隔至少5分鐘，或最多相隔數小時或1天或2天投予。在這樣的實施例中，不同的組合物可以在相同的投予部位（如相同的注射部位）或在不同的投予部位（如不同的注射部位）投予。在這樣的實施例中，如本文揭示的組合物的不同組分中的至少一種可以作為多組分套組單獨提供。 多組分套組
在一個實施例中，本揭示文本涉及包含多個容器的多組分套組，其中每個所述容器包含至少一種腦膜炎球菌抗原或至少兩種腦膜炎球菌抗原的組合，所述抗原選自包含以下的組：fHBP A蛋白、fHBP B蛋白、NadA蛋白和清潔劑提取的外膜囊泡（dOMV）。
在一個實施例中，所述多組分套組的抗原中的至少一種可呈乾燥形式。在一個實施例中，所述抗原中的至少一種可呈凍乾的或乾燥的微丸形式。在一個實施例中，套組可任選地包含含有生理學上可注射的媒劑的容器。
在一個實施例中，如本文揭示的免疫原性組合物的不同抗原可以製備並儲存於單獨的容器或小瓶中。然後可以在投予個體時將它們混合。
在一個實施例中，抗原fHBP A、fHBP B、NadA和dOMV中的每一種可各自儲存於一個容器中。在另一個實施例中，抗原可以成對或按三聯劑（二價或三價配製品）組合。可以設想所有類型的組合：fHBP A+B和NadA+dOMV，fHBP A + NadA和fHBP B + dOMV，fHBP B + NadA和fHBP A + dOMV，fHBP A + NadA + fHBP B和dOMV，或fHBP A + dOMV + fHBP B和NadA等。
在一個實施例中，fHBP A和B抗原可以儲存於第一容器中，NadA抗原可以儲存於第二容器中，並且dOMV抗原可以儲存於第三容器中。在另一個實施例中，fHBP A和B抗原可以儲存於第一容器中，並且NadA抗原和dOMV抗原二者可以都儲存於第二容器中。
抗原可以液體配製品或乾燥形式儲存。當配製為乾燥形式時，可以添加補充容器以容納可注射液體載劑，以用於重懸浮和混合不同的抗原。合適的可注射液體載劑可以包括緩衝液。此外，它可以包含如上所指示的佐劑。佐劑可以是鋁基佐劑，如AlPO 4。
任選地，多組分套組可包含用於至少一種另外的抗原或多種另外的抗原的至少一個另外的容器或多個另外的容器。在一個實施例中，另外的抗原可以是接合MenACWY多糖。
在一個實施例中，多組分套組可包含含有如本文揭示的免疫原性組合物的第一容器和含有接合MenACWY多糖的第二容器。 用途和治療方法
在一個實施例中，本揭示文本涉及用作藥物、特別是用作疫苗的如本文揭示的組合物。
在另一態樣，本揭示文本涉及如本文揭示的組合物，其用於防止腦膜炎球菌感染，並且在一個示例性實施例中，用於防止腦膜炎奈瑟氏菌血清群B感染。
在另一態樣，本揭示文本涉及如本文揭示的組合物，其用於誘導針對腦膜炎球菌細菌的免疫反應，並且在一個示例性實施例中誘導針對腦膜炎奈瑟氏菌血清群B細菌的免疫反應。
在另一態樣，本揭示文本涉及如本文揭示的組合物，其用於誘導針對來自ST-41/44、ST-32、ST-269、ST-213、ST-35、ST-461、ST-11和/或ST-461選殖複合物的腦膜炎奈瑟氏菌血清群B細菌的免疫反應。
在另一態樣，本揭示文本涉及如本文揭示的組合物，其用於誘導針對來自ST-11選殖複合物的腦膜炎奈瑟氏菌血清群B細菌的免疫反應。
在另一態樣，本揭示文本涉及保護個體免受腦膜炎球菌感染並且在一個示例性實施例中免受腦膜炎奈瑟氏菌血清群B感染的方法，所述方法至少包括向所述個體投予如本文揭示的免疫原性組合物或如本文揭示的疫苗的步驟。
在另一態樣，本揭示文本涉及一種用於降低由個體中腦膜炎球菌感染並且在一個示例性實施例中由腦膜炎奈瑟氏菌血清群B感染引起的侵襲性腦膜炎球菌病的發生風險的方法，所述方法至少包括向所述個體投予如本文揭示的免疫原性組合物或如本文揭示的疫苗的步驟。
在另一態樣，本揭示文本涉及在個體中引發針對腦膜炎球菌細菌並且在一個示例性實施例中引發針對腦膜炎奈瑟氏菌血清群B細菌的免疫反應的方法，所述方法至少包括向所述個體投予如本文揭示的免疫原性組合物或如本文揭示的疫苗的步驟。
在另一態樣，本揭示文本涉及一種引發針對來自ST-41/44、ST-32、ST-269、ST-213、ST-35、ST-461、ST-11和/或ST-461選殖複合物的腦膜炎奈瑟氏菌血清群B細菌的免疫反應的方法，所述方法至少包括向所述個體投予如本文揭示的免疫原性組合物或如本文揭示的疫苗的步驟。
在另一態樣，本揭示文本涉及一種引發針對來自ST-11選殖複合物的腦膜炎奈瑟氏菌血清群B細菌的免疫反應的方法，所述方法至少包括向所述個體投予如本文揭示的免疫原性組合物或如本文揭示的疫苗的步驟。
在一個實施例中，如本文揭示的免疫原性組合物可用於在個體中引發針對腦膜炎奈瑟氏菌血清群B的免疫反應。相關個體可以是哺乳動物，例如人，並且例如嬰兒、學步兒童、兒童、青少年、年輕成人、成人和老年人。在一個實施例中，個體可以是從6週或更大、2個月或更大、或10歲或更大。作為示例性實施例，個體可以是6週至55歲或更大，例如2個月至55歲或更大，或例如10歲至55歲或更大。
所述方法總體上涉及向有需要的個體投予有效量的主題免疫原性組合物。用於治療用途的有效量將取決於例如抗原組合物、投予方式、患者的體重和一般健康狀況、以及處方醫師的判斷。根據患者所需和耐受的劑量和頻率以及投予途徑，可以投予單劑量或多劑量的抗原組合物。
可以將如本文揭示的免疫原性組合物以2、3、2+1或3+1劑方案投予。
在一個實施例中，可以將如本文揭示的免疫原性組合物以2劑或3劑投予。可以將後續劑與前一劑相隔約一個月、約兩個月、約三個月、約四個月、約五個月、約六個月、約七個月、約八個月、約九個月、約十個月、約十一個月、約十二個月、約十三個月、約十四個月、約十五個月、約十六個月、約十七個月、約十八個月、約十九個月或約二十個月投予。在一個實施例中，可以將後續劑與前一劑相隔約一個月、約兩個月、約五個月、約六個月、約八個月、約十個月、約十二個月、約十四個月或約十六個月投予。在一個實施例中，可以將後續劑與前一劑相隔約一個月、約兩個月、約五個月、約六個月或約八個月投予。在一個實施例中，可以將後續劑與前一劑相隔約30天、約60天或約180天投予。
在兩劑方案中，可以將第二劑在第一劑後約一個月、或在第一劑後約2個月或在第一劑後6個月投予。或者，在兩劑方案中，可以將第二劑在第一劑後約30天、或在第一劑後約60天或在第一劑後約180天投予。這種兩劑方案可適用於成人和/或青少年。
在兩劑方案中，可以將第二劑在第一劑後約2個月投予。或者，在兩劑方案中，可以將第二劑在第一劑後約60天投予。這種兩劑方案可適用於學步兒童。
在三劑方案中，可以將第二劑在第一劑後約一個月投予，並且可以將第三劑在第一劑後約6個月投予。或者，在三劑方案中，可以將第二劑在第一劑後約30天投予，並且可以將第三劑在第一劑後約180天投予。這種三劑方案可適用於成人和/或青少年。
在三劑方案中，可以將第二劑在第一劑後約兩個月投予，並且可以將第三劑在第一劑後約10個月投予。或者，在三劑方案中，可以將第二劑在第一劑後約60天投予，並且可以將第三劑在約12月齡時投予。這種三劑方案可適用於嬰兒。
在一個實施例中，除了2劑或3劑之外，可以投予第三劑或第四劑。該後續劑可以在2劑或3劑的最後一劑之後至少一年投予，例如在最後一劑之後16個月投予。在這種方案中，前兩劑或前三劑可定性為初免劑，並且隨後的一劑（+1）可定性為加強劑。
在一個實施例中，例如從6週或2月齡至2歲的嬰兒和學步兒童可以接受2+1或3+1劑方案。在另一個實施例中，例如從2歲至10歲的兒童可以接受2劑方案。在另一個實施例中，例如從10歲至55歲的青少年和成人可以接受2+1劑方案。
可以藉由任何合適的途徑投予如本文揭示的免疫原性組合物。例如，可以考慮藉由肌內途徑投予。
根據以下條款和實施例對本發明作進一步的描述。
根據實施例1，本發明涉及一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含腦膜炎奈瑟氏菌血清群B抗原的組合，所述組合包含至少一種H因子結合蛋白（fHBP）A蛋白、至少一種fHBP B蛋白、至少一種奈瑟氏菌黏附素A（NadA）蛋白和至少一種清潔劑提取的外膜囊泡（dOMV）。
根據實施例2，本發明涉及根據實施例1所述的組合物，其中所述fHBP A蛋白和/或所述fHBP B蛋白是非脂化的。
根據實施例3，本發明涉及根據實施例1或2所述的組合物，其中所述fHBP A蛋白是包含與SEQ ID NO: 1至少約85%的同一性的突變蛋白，和/或其中所述fHBP B蛋白是包含與SEQ ID NO: 3至少約85%的同一性的突變蛋白。
根據實施例4，本發明涉及根據實施例1至3中任一項所述的組合物，其中所述fHBP A蛋白基於SEQ ID NO: 6的編號包含選自以下中至少一者的至少一個胺基酸取代：a) 在胺基酸115處的天門冬醯胺酸（N115）的胺基酸取代；b) 在胺基酸121處的天門冬胺酸（D121）的胺基酸取代；c) 在胺基酸128處的絲胺酸（S128）的胺基酸取代；d) 在胺基酸130處的白胺酸（L130）的胺基酸取代；e) 在位置131處的纈胺酸（V131）的胺基酸取代；f) 在位置133處的甘胺酸（G133）的胺基酸取代；g) 在位置219處的離胺酸（K219）的胺基酸取代；和h) 在位置220處的甘胺酸（G220）的胺基酸取代，或包含SEQ ID NO: 2或由SEQ ID NO: 2組成，和/或其中所述fHBP B蛋白基於SEQ ID NO: 6的編號包含選自以下中至少一者的至少一個胺基酸取代：a) 在胺基酸38處的麩醯胺酸（Q38）的胺基酸取代；b) 在胺基酸92處的麩胺酸（E92）的胺基酸取代；c) 在胺基酸130處的精胺酸（R130）的胺基酸取代；d) 在胺基酸223（S223）處的絲胺酸的胺基酸取代；和e) 在胺基酸248處的組胺酸（H248）的胺基酸取代，或包含SEQ ID NO: 4或由SEQ ID NO: 4組成。
根據實施例5，本發明涉及根據實施例1至4中任一項所述的組合物，其中所述fHBP A蛋白和/或所述fHBP B以範圍為約20 μg/劑量至約200 µg/劑量、或約25 µg/劑量至約180 µg/劑量、或約40 µg/劑量至約140 µg/劑量、或約50 µg/劑量至約120 µg/劑量、或約75 µg/劑量至約100 µg/劑量或為約25 µg/劑量、或約50 µg/劑量、或約100 µg/劑量的量存在。
根據實施例6，本發明涉及根據實施例1至5中任一項所述的組合物，其中所述NadA蛋白是NadA1蛋白，或包含與SEQ ID NO: 5至少約85%的同一性，或包含SEQ ID NO: 5或由SEQ ID NO: 5組成。
根據實施例7，本發明涉及根據實施例1至6中任一項所述的組合物，其中所述NadA蛋白以範圍為約20 μg/劑量至約200 μg/劑量、或約25 μg/劑量至約180 μg/劑量、或約40 μg/劑量至約140 μg/劑量、或約50 μg/劑量至約120 μg/劑量、或約75 μg/劑量至約100 μg/劑量或為約50 μg/劑量的量存在。
根據實施例8，本發明涉及根據實施例1至7中任一項所述的組合物，其中所述dOMV包含孔蛋白A（PorA）。
根據實施例9，本發明涉及根據實施例1至8中任一項所述的組合物，其中所述dOMV以範圍為約5 µg/劑量至約400 µg/劑量、或約10 µg/劑量至約300 µg/劑量、或約25 µg/劑量至約250 µg/劑量、或約35 µg/劑量至約225 µg/劑量、或約50 µg/劑量至約200 µg/劑量、或約75 µg/劑量至約180 µg/劑量、或約100 µg/劑量至約150 µg/劑量、或約110 µg/劑量至約125 µg/劑量或為約25 µg/劑量、或約50 µg/劑量、或約125 µg/劑量的量存在。
根據實施例10，本發明涉及根據實施例1至9中任一項所述的組合物，所述組合物還包含佐劑，任選地鋁基佐劑，所述鋁基佐劑任選地選自氫氧化鋁佐劑、磷酸鋁佐劑、硫酸鋁鹽佐劑、羥基磷酸鋁硫酸鹽佐劑、硫酸鋁鉀佐劑、羥基碳酸鋁、氫氧化鋁和氫氧化鎂的組合、以及它們的混合物。
根據實施例11，本發明涉及根據實施例1至10中任一項所述的組合物，所述組合物包含以下或由以下組成：25至100 μg/劑量的由SEQ ID NO: 2組成的非脂化fHBP A蛋白、25至100 μg/劑量的由SEQ ID NO: 4組成的非脂化fHBP B蛋白、25至100 μg/劑量的由SEQ ID NO: 5組成的NadA蛋白、20至150 μg/劑量的來自表現PorA VR2 P1.2的MenB菌株的dOMV、100至600 μg/劑量的磷酸鋁佐劑、50 mM乙酸鹽緩衝液和pH 6.0。
根據實施例12，本發明涉及根據實施例1至11中任一項所述的組合物，所述組合物還包含來自腦膜炎奈瑟氏菌血清群A、C、W135和/或Y中的一種或多種的至少一種接合莢膜糖。
根據實施例13，本發明涉及包含根據實施例1至13中任一項所述的組合物的疫苗。
根據實施例14，本發明涉及根據實施例1至12中任一項所述的組合物或根據實施例12所述的疫苗，用於防止腦膜炎球菌感染或用於誘導針對腦膜炎球菌細菌的免疫反應。
根據實施例15，本發明涉及一種組合物，所述組合物包含編碼fHBP A蛋白的mRNA、編碼fHBP B蛋白的mRNA、編碼NadA蛋白的mRNA、和來自表現PorA VR2 P1.2的MenB的dOMV，所述fHBP A蛋白包含與SEQ ID NO: 2至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%、至少約99.5%或約100%的胺基酸序列同一性，所述fHBP B蛋白包含與SEQ ID NO: 4至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%、至少約99.5%或約100%的胺基酸序列同一性，所述NadA蛋白包含與SEQ ID NO: 5至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%、至少約99.5%或約100%的胺基酸序列同一性。
根據實施例16，本發明涉及一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含腦膜炎奈瑟氏菌血清群B抗原的組合，所述組合包含：含有與SEQ ID NO: 1至少約85%的同一性且基於SEQ ID NO: 6的編號至少包含胺基酸取代G220S的至少一種非脂化H因子結合蛋白（fHBP）A蛋白、至少一種非脂化fHBP B蛋白、至少一種奈瑟氏菌黏附素A（NadA）蛋白和至少一種清潔劑提取的外膜囊泡（dOMV）。
根據實施例17，本發明涉及根據實施例16所述的組合物，其中所述非脂化fHBP B蛋白是包含與SEQ ID NO: 3至少約85%的同一性的突變蛋白。
根據實施例18，本發明涉及根據實施例16或17所述的組合物，其中所述非脂化fHBP B蛋白基於SEQ ID NO: 6編號包含胺基酸取代H248L。
根據實施例19，本發明涉及根據實施例16至18中任一項所述的組合物，其中所述非脂化fHBP A蛋白包含SEQ ID NO: 4或由其組成。
根據實施例20，本發明涉及根據實施例16至19中任一項所述的組合物，其中所述非脂化fHBP A蛋白基於SEQ ID NO: 6的編號還包含胺基酸取代L130R和G133D。
根據實施例21，本發明涉及根據實施例16至20中任一項所述的組合物，其中所述非脂化fHBP A蛋白包含SEQ ID NO: 2或由其組成。
根據實施例22，本發明涉及根據實施例16至21中任一項所述的組合物，其中所述NadA蛋白是NadA1蛋白，或包含與SEQ ID NO: 5至少約85%的同一性，或包含SEQ ID NO: 5或由SEQ ID NO: 5組成。
根據實施例23，本發明涉及根據實施例16至22中任一項所述的組合物，其中所述dOMV包含PorA VR2亞型。
根據實施例24，本發明涉及根據實施例16至23中任一項所述的組合物，其中所述dOMV包含PorA VR2 P1.2。
根據實施例25，本發明涉及根據實施例16至24中任一項所述的組合物，所述組合物還包含佐劑，任選地鋁基佐劑，所述鋁基佐劑任選地選自氫氧化鋁佐劑、磷酸鋁佐劑、硫酸鋁鹽佐劑、羥基磷酸鋁硫酸鹽佐劑、硫酸鋁鉀佐劑、羥基碳酸鋁、氫氧化鋁和氫氧化鎂的組合、以及它們的混合物。
根據實施例26，本發明涉及根據實施例16至25中任一項所述的組合物，其中所述fHBP A蛋白和/或所述fHBP B以範圍為約20 µg/劑量至約200 µg/劑量、或約25 µg/劑量至約180 µg/劑量、或約40 µg/劑量至約140 µg/劑量、或約50 µg/劑量至約120 µg/劑量、或約75 µg/劑量至約100 µg/劑量或為約25 µg/劑量、或約50 µg/劑量、或約100 µg/劑量的量存在，所述NadA蛋白以範圍為約20 µg/劑量至約200 µg/劑量、或約25 µg/劑量至約180 µg/劑量、或約40 µg/劑量至約140 µg/劑量、或約50 µg/劑量至約120 µg/劑量、或約75 µg/劑量至約100 µg/劑量或為約50 µg/劑量的量存在，並且所述dOMV以範圍為約5 µg/劑量至約400 µg/劑量、或約10 µg/劑量至約300 µg/劑量、或約25 µg/劑量至約250 µg/劑量、或約35 µg/劑量至約225 µg/劑量、或約50 µg/劑量至約200 µg/劑量、或約75 µg/劑量至約180 µg/劑量、或約100 µg/劑量至約150 µg/劑量、或約110 µg/劑量至約125 µg/劑量或為約25 µg/劑量、或約50 µg/劑量或約125 µg/劑量的量存在。
根據實施例27，本發明涉及根據實施例16至26中任一項所述的組合物，所述組合物包含以下或由以下組成：25至100 μg/劑量的由SEQ ID NO: 2組成的非脂化fHBP A蛋白、25至100 μg/劑量的由SEQ ID NO: 4組成的非脂化fHBP B蛋白、25至100 μg/劑量的由SEQ ID NO: 5組成的NadA蛋白、20至150 μg/劑量的來自表現PorA VR2 P1.2的MenB菌株的dOMV、100至600 μg/劑量的磷酸鋁佐劑、50 mM乙酸鹽緩衝液和pH 6.0。
根據實施例28，本發明涉及根據實施例16至27中任一項所述的組合物，所述組合物還包含來自腦膜炎奈瑟氏菌血清群A、C、W135和/或Y中的一種或多種的至少一種接合莢膜糖。
根據實施例29，本發明涉及包含根據實施例16至28中任一項所述的組合物的疫苗。
根據實施例30，本發明涉及一種治療腦膜炎球菌感染或誘導針對腦膜炎球菌細菌的免疫反應的方法，所述方法包括向有需要的個體投予包含fHBP A蛋白、fHBP B蛋白、NadA蛋白和dOMV或由fHBP A蛋白、fHBP B蛋白、NadA蛋白和dOMV組成的組合物，所述fHBP A蛋白包含與SEQ ID NO: 2至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%、至少約99.5%或約100%的胺基酸序列同一性，所述fHBP B蛋白包含與SEQ ID NO: 4至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%、至少約99.5%或約100%的胺基酸序列同一性，所述NadA蛋白包含與SEQ ID NO: 5至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%、至少約99.5%或約100%的胺基酸序列同一性，所述dOMV來自表現PorA VR2 P1.2的MenB。
應理解，本揭示文本包括其中將來自所列申請專利範圍中至少一個的至少一個限制、要素、條款描述項等引入從屬於相同基礎請求項（或相關的任何其他請求項）的另一請求項中的所有變體、組合和排列，除非另有說明或除非業內一般技術者清楚會出現矛盾或不一致。在要素被呈現為列表，例如以馬庫什群組或類似形式的情況下，應理解還揭示了所述要素的每個子組，並且可以從所述群組中移除一種或多種任何要素。應理解，通常，在本揭示文本或本揭示文本的多態樣被稱為包括特定要素、特徵等的情況下，本揭示文本或本揭示文本的多態樣還包括由此類要素、特徵等組成或基本上由此類要素、特徵等組成的實施例。出於簡化的目的，這些實施例在本文的許多詞語中沒有在每一種情況下被明確闡述。還應理解，本揭示文本的任何實施例或態樣都可以明確地從申請專利範圍中排除，而不管在本說明書中是否敘述了特定的排除。將用於描述本揭示文本的背景並提供關於其實踐的其他細節的本文引用的出版物和其他參考材料特此藉由引用併入。
本說明書中揭示的序列作為參考。相同的序列也呈現於根據用於專利事務目的的標準要求格式化的序列表中。如與標準序列表有任何序列差異，以本說明書中描述的序列為准。
在不限制本揭示文本的情況下，下文出於說明的目的描述本揭示文本的多個實施例。 實例 實例 1 ：抗原製備和免疫原性組合物 1. MenB 抗原的製備和純化 1. 非脂化 突變 fHBP A05 （ A05tmN ）
為了製備非脂化A05tmN，將三個點突變（G220S、L130R和G133D，相對於SEQ ID NO: 6編號）引入野生型fHBP A05序列中，並且為了獲得非脂化蛋白，將在N末端錨定脂質部分的第一個半胱胺酸殘基用甲硫胺酸替代（非脂化A05tmN：SEQ ID NO: 2）。合成A05tmN的DNA序列，然後用於製備質體構建體。簡言之，在A05tmN序列的兩端添加了Xba1和Xho 1位點的DNA序列。為了產生表現質體，消化含有Xba1/Xho1的質體，並將得到的DNA片段連接至Xba1/Xho1消化的pET28a(+)中，並轉化到Top10感受態細胞中。藉由Xba l/Xho l消化確認陽性選殖體。將A05tmN質體轉化到大腸桿菌中，並且經過三輪菌落純化後製備細胞庫。
將用A05tmN轉化的大腸桿菌菌株在半組合培養基中在37ºC在攪拌下擴增（pH 6.8 - 溶解氧：20%）。藉由添加異丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）誘導抗原的表現。
將培養物作為未加工的大批量物質收穫，並藉由離心將細菌生物質與培養基分離。將所得細胞沈澱重懸浮於緩衝液（20 mM Tris-HCl，pH 8.5）中。藉由勻漿器處理重懸浮的沈澱以產生細胞勻漿。隨後將勻漿離心以收集沈澱部分。將勻漿沈澱重懸浮於緩衝液（20 mM Tris-HCl，pH 8.5）中並進行pH衝擊處理（pH 12，在室溫下伴混合持續1小時）。用85%的磷酸將pH降至8.5。離心後收集pH衝擊物質的上清液部分，然後過濾以獲得經過濾的上清液。
將上清液調節至pH 8.5和＜ 5.0 mS/cm電導率，並載入至捕獲柱GigaCap Q-650M上。將洗脫池調節至0.9 M硫酸銨（AmS），然後用中間層析Toyopearl Phenyl 600M進一步純化。在疏水相互作用層析之後，將洗脫的池調節至pH 8.5和＜ 8.0 mS/cm電導率，並藉由Nuvia aPrime 4A層析進一步純化。隨後為使用5 kDa再生纖維素切向流過濾（TFF）膜的最終超濾和滲濾，以及0.2 µm過濾。
A05tmN被吸附到AlPO 4上，在乙酸鹽緩衝液（50 mM 乙酸鈉，150 mM NaCl，pH 6.0）中限定為1.00 mg Al/mL AlPO 4。 2. 非脂化 突變 fHBP B01 （ B01smN ）
為了製備非脂化B01smN，將單個點突變引入野生型fHBP B01序列中，並且為了獲得非脂化蛋白，將在N末端錨定脂質部分的第一個半胱胺酸殘基用甲硫胺酸替代（非脂化B01smN：SEQ ID NO: 4）。合成B01smN的DNA序列，然後用於製備質體構建體。簡言之，在B01smN序列的兩端添加了Xba1和Xho 1位點的DNA序列。為了產生表現質體，消化含有Xba1/Xho1的質體，並將得到的DNA片段連接至Xba1/Xho1消化的pET28a(+)中，並轉化到Top10感受態細胞中。藉由Xba l/Xho l消化確認陽性選殖體。將B01smN質體轉化到大腸桿菌中，並且經過三輪菌落純化後製備細胞庫。
將用B01smN轉化的大腸桿菌菌株在半組合培養基中在37ºC在攪拌下擴增（pH 6.8 - 溶解氧：20%）。藉由添加異丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）誘導抗原的表現。
將培養物作為未加工的大批量物質收穫，並藉由離心將細菌生物質與培養基分離。將所得細胞沈澱重懸浮於緩衝液（20 mM Tris-HCl，pH 8.5）中。藉由勻漿器處理重懸浮的沈澱以產生細胞勻漿。隨後將勻漿離心以收集上清液部分。然後過濾上清液部分。
將經過濾的上清液調節至pH 8.5和＜ 5.0 mS/cm電導率，並載入至層析CaptoQ ImpRes上，並以結合和洗脫模式純化。然後將CaptoQ ImpRes洗脫池調節至1.8 M AmS，以便載入至第二層析苯基Sepharose HP上。洗脫後，使用5 kDa Ultracel TFF膜將材料濃縮並滲濾到乙酸鹽緩衝液（50 mM乙酸鈉，150 mM NaCl，pH 6.0）中，然後進行0.2-μm過濾。
B01smN被吸附到AlPO 4上，在乙酸鹽緩衝液（50 mM 乙酸鈉，150 mM NaCl，pH 6.0）中限定為1.00 mg Al/mL AlPO 4。 3.   NadA
從NadA_MC58製備NadA的截短形式。截短的NadA去除了NadA_MC58的前導序列（殘基1至23）和錨定結構域（殘基308至362）（截短NadA：SEQ ID NO: 5）。在NadA_MC58的截短序列中，前導序列之後的第一個胺基酸是丙胺酸，它被甲硫胺酸替代。合成NadA的DNA序列，然後用於製備質體構建體。在NadA序列的兩端添加了Xba1和Xho 1位點的DNA序列。為了產生表現質體，消化含有Xba1/Xho1的質體，並將得到的DNA片段連接至Xba1/Xho1消化的pET28a(+)中，並轉化到Top10感受態細胞中。藉由Xba l/Xho l消化確認陽性選殖體。將NadA質體轉化到大腸桿菌中，並且經過三輪菌落純化後製備細胞庫。
將用NadA1轉化的大腸桿菌菌株在半組合培養基中在37ºC在攪拌下擴增（pH 6.8 - 溶解氧：20%）。藉由添加異丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）誘導抗原的表現。
將培養物作為未加工的大批量物質收穫，並藉由離心將細菌生物質與培養基分離。將所得細胞沈澱重懸浮於緩衝液（20 mM Tris-HCl，pH 8.5）中。藉由勻漿器處理重懸浮的沈澱以產生細胞勻漿。隨後將勻漿離心以收集上清液部分。然後過濾上清液部分。
將上清液部分載入至Capto DEAE柱上。將Capto DEAE洗脫級分用粉末狀AmS調節，直到達到500 mM AmS的濃度。將經調節的Capto DEAE洗脫級分載入至Toyopearl Butyl-650M柱上。將Toyopearl Butyl-650M洗脫級分載入至CHT Type I 40 µm柱上，並使用30 kDa再生纖維素TFF膜濃縮CHT洗脫級分，隨後滲濾到50 mM乙酸鈉、150 mM NaCl（pH 6.0）中。在TFF之後，將產物經0.2-μm過濾以產生NadA抗原。
NadA被吸附到AlPO 4上，在乙酸鹽緩衝液（50 mM 乙酸鈉，150 mM NaCl，pH 6.0）中限定為1.00 mg Al/mL AlPO 4。 4.   dOMV
dOMV是從野生型腦膜炎奈瑟氏菌血清型B菌株99M中純化的，所述菌株由沃爾特·裡德陸軍研究所（Walter Reed Army Institute of Research，WRAIR）提供。
將 NmB 99M在Fu等人（ Biotechnology(N Y). 1995年2月;13(2):170-4）和US 5,494,808中所述的化學成分確定的培養基中在1 g/L的酵母提取物和Hepes 1 M的存在下，在37ºC、CO 25%下培養。
使用熱處理懸浮液的低速離心（55ºC持續2小時）進行培養物收穫，以回收濕細菌沈澱。用由清潔劑（去氧膽酸鈉）構成的提取緩衝液進行兩個連續的清潔劑介導的提取步驟（56ºC持續15分鐘），以從細菌外膜提取dOMV並耗盡脂寡糖（如Helting等人, Acta Pathol Microbiol Scand C. 1981年4月;89(2):69-78揭示）。去氧膽酸鈉和EDTA溶解細菌外膜，然後它們自身重組織為dOMV（囊泡和微粒）。藉由使用Ultra-Turrax（轉子-定子設備）將懸浮於提取緩衝液中的顆粒均質化來完成重懸浮。將dOMV上清液彙集，之後在MgCl 2的存在下用全能核酸酶處理（37ºC持續15分鐘）。
在dOMV提取之後，使用中空纖維在300 kDa的改性聚醚碸（mPES）中進行dOMV的濃縮。幾個超速離心步驟用於將dOMV從“可溶性”內容物（如核酸、胞質蛋白、提取的脂多糖或緩衝液組分）中分離出來。然後使用Ultra-Turrax（轉子-定子設備）以最低速度持續幾秒將所得沈澱重懸浮在提取緩衝液中。初次重懸浮後，使用高壓均質化將dOMV完全重懸浮在提取緩衝液中，並增加清潔劑對dOMV表面的可及性。
然後進行離心，之後用0.45/0.2-μm乙酸纖維素過濾器對上清液進行最終過濾。 5. 抗原的組合
多組分免疫原性組合物中的MenB抗原是純化的非脂化突變A05 fHBP（A05tmN）、非脂化突變fHBP（B01smN）、NadA和dOMV。A05tmN、B01smN和NadA抗原被吸附到磷酸鋁（AlPO 4）上。
媒劑由乙酸鹽緩衝液（50 mM乙酸鈉，150 mM NaCl，pH 6.0）和AlPO 4（1.00 mg AL 3+/mL）組成。
為了配製最終的免疫原性組合物配製品，將AlPO 4、吸附在AlPO 4上的B01smN、吸附在AlPO 4上的A05tmN和乙酸鹽緩衝液（50 mM乙酸鈉、150 mM NaCl、pH 6.0）共混在一起以獲得目標抗原和鋁濃度（對於B01smN為250 μg/mL，對於A05tmN為250 µg/mL，和1.00 mg Al/mL的AlPO 4）。藉由將dOMV與乙酸鹽緩衝液（50 mM乙酸鈉，150 mM NaCl，pH 6.0）和吸附在AlPO 4上的NadA共混來配製不同的NadA-dOMV組合物，以獲得下文測試的不同配製品（F1至F5）的不同抗原濃度。將僅fHBP的配製品在載劑中稀釋以獲得配製品F6。 2.   TRUMENBA ®
TRUMENBA ®是一種在無菌液體懸浮液中的MenB二價重組脂化fHBP（rLP2086）組合物，其由配製在10 mM組胺酸緩衝液pH 6.0、氯化鈉（NaCl）和0.5 mg/mL鋁（作為磷酸鋁，AlPO 4）和聚山梨醇酯80（PS80）中的60 µg/mL/亞家族的fHBP亞家族A（A05）和B（B01）蛋白構成。 3.   BEXSERO ®
BEXSERO ®含有：三種重組蛋白即50 µg/0.5 mL劑量的rp287-953（NHBA嵌合體）、rp936-741（50 µg/0.5 mL劑量的具有非脂化B24的fHBP嵌合體）和50 µg/0.5 mL劑量的rp961c（NadA）；25 µg/0.5 mL劑量的dOMV和1.5 mg/0.5 mL劑量的AlOOH（例如0.5 mg的Al），它們在包含0.776 mg/0.5 mL劑量的組胺酸、3.125 µg/0.5 mL劑量的氯化鈉、10 mg/0.5 mL劑量的蔗糖和水的緩衝液中。 4.   MENQUADFI ®
MENQUADFI ®是一種可商購的疫苗，其包含如WO 2018/045286 A1中揭示的獲得並與破傷風類毒素（TT）接合的ACWY多糖抗原。該配製品包含來自血清群A、C、Y和W135的腦膜炎奈瑟氏菌莢膜多糖，它們單獨與破傷風類毒素蛋白接合。目標活性成分濃度為每0.5 mL劑量10 µg每種多糖和大約55 µg破傷風類毒素蛋白。將抗原配製於含有30 mM乙酸鈉緩衝液（1.23 mg/劑量）和氯化鈉（0.67%，3.35 mg/劑量）的無菌水性溶液中。 5. 測試組合物
在以下研究中測試了如本文揭示的MenB多組分疫苗的六種配製品（F1-F5，以及與MENQUADFI共投予的F1），並與基準組合物BEXSERO、TRUMENBA和對比二價（fHBP A和fHBP B）組合物（F6）進行比較。測試組合物的不同抗原的不同量總結在下 表 1中。F1、F2、F4-F6以及與MENQUADFI共投予的F1每劑量包含0.4 mg AlPO 4，而F3每劑量包含0.8 mg AlPO 4。 表 1 ：測試的免疫原性組合物的配製品
抗原 F1 F2 F3 F4 F5 F6 與 MENQUADFI 共投予的 F1 Trumenba Bexsero
  每個注射劑量的 µg 量
fHBP A 50 25 100 50 50 50 50 60  
fHBP B 50 25 100 50 50 50 50 60 50
NadA 50 50 50 50 50   50   50
NHBA                 50
dOMV 50 50 50 25 125   50   25
MENQUADFI (ACWY)             4x10 + 55 µg TT    
每個配製品的以下體積用於 實例 2中的投予：
F1：400 µL
F2：400 µL
F3：800 µL
F4：400 µL
F5：400 µL
F6：400 µL
F1 + MENQUADFI：動物在D0、D28和D56接受400 µL F1。在第0天，它們還在對側大腿接受500 µl MENQUADFI。
TRUMENBA：500 µL
BEXSERO：500 µL 實例 2 ： MenB 疫苗免疫原性的臨床前評估：兔免疫原性研究 1. 材料與方法 1. 研究設計
七隻兔子的9個組（紐西蘭KBL-雌性-8週齡）在D0、D28和D56藉由IM途徑接受了三次免疫接種，每次接種七種配製品中的一種-在 實例 1的 表 1中稱為F1至F6和F1+MENQUADFI-或許可的基準疫苗TRUMENBA和BEXSERO（參見 實例 1）。還測試了與MENQUADFI共投予的配製品F1。第一次注射是在右大腿處，第二次注射是在左大腿處，並且最後一次注射是在右大腿處，經由IM途徑投予組合物。對於接受F1 + MENQUADFI的組，向動物共投予在D0在對側大腿處藉由IM途徑給予的MENQUADFI。
在免疫接種後4、24和48小時測量臨床體徵和體溫。在D0和第二次免疫接種（在D42）後兩週和在D63，將血液樣品收集在含有血塊啟動劑和血清分離器（BD Vacutainer SST II 8.5 mL，參考號366468A）的管中。將管以3500 rpm離心15 min，以將血清與血細胞分離。將血清轉移到4.5 mL NUNC管中，並在+56ºC下熱滅活30 min。將血清在-20ºC儲存，直到用於ELISA、純化和細菌殺傷測定。
第2劑後已達到抗體反應的平臺期，因此在第2劑後分析免疫原性。
藉由評估以ELISA測量的抗原（Ag）特異性IgG反應和針對一組七種或十八種MenB菌株的功能性血清殺細菌抗體活性（hSBA），在D42測量測試組合物的免疫原性。反應者顯示在D0與D42之間hSBA至少增加了4倍。
陽性反應的陽性閾值定義如下：
前（D0）：hSBA ＜ 8 - 後（D42）：如果hSBA ＞ 8則血清為陽性
前（D0）：hSBA ≥ 8 - 後（D42）：如果hSBA與D0時相比增加≥ 4倍則血清為陽性。
血清能夠誘導特異性hSBA的免疫動物數量大於觀察到的反應者的70%（即每種配製品5/7的動物）。 2. 藉由 ELISA 測定 IgG 抗體力價
在D0和D42從兔血清測量針對每種抗原產生的特異性IgG反應。對從每個免疫組收集的單獨血清進行ELISA分析。
簡而言之，將96孔微板每孔用100 μL的在碳酸鹽緩衝液 包被 溶液中的1 μg/mL特異性抗原包被，並在+4ºC下保持過夜。藉由板倒置去除包被溶液，隨後在紙巾上拍板。用150 μL緩衝液1（PBS/Tween20 0.05%/脫脂乳1%）封閉空位點，並在+37ºC下培育60 min時間段後，倒空板。以100 μL的體積將血清在微板中連續稀釋（12次）於緩衝液1中。將板在+37ºC下培育90 min，然後用緩衝液2（PBS/Tween20 0.05%）洗滌。然後，在每個孔中添加100 μL稀釋的抗兔IgG。在+37ºC培育90 min後，用緩衝液2洗滌板。藉由在每個孔中添加100 μL四甲基聯苯胺底物溶液來使反應顯色。在室溫下用HCl（1 N）處理30 min後反應以化學方式被終止，並在分光光度計（Versamax reader p248，Molecular Devices）上測量450-650 nm處的吸光度。使用機械手（robotic）ELISA的CODUNIT程式，藉由對應於OD = 1的稀釋度的倒數以任意ELISA單位/mL表示結果。 3. 用於 hSBA 測試的兔血清 IgG 純化
為避免在D0、D42由兔血清誘導的非特異性殺細菌殺傷，有必要純化IgG。使用RPROTEIN A GRAVTITRAP™柱（GE healthcare GE28-9852-54）和Ab緩衝液套組GE Healthycare參考號28-9030-59）進行兔血清的純化。在用結合緩衝液（磷酸鈉20 mM pH = 7）平衡柱的第一個步驟後，將用結合緩衝液（V/V）調節至中性pH的血清（2 mL）添加至柱上以進行IgG結合。將柱用結合緩衝液洗滌並用洗脫緩衝液（甘胺酸HCl 0.1 M pH 2.7）洗脫以收集IgG。為了保持IgG的活性，將中和緩衝液（Tris-HCl 1 M，pH 9.0）添加至洗脫級分中以獲得最終接近中性的pH。使用Slide-A-Lyser G2透析盒（Thermo Scientific 87730）對每個樣品進行透析，以將樣品轉換在PBS緩衝液中。藉由NANODROP進行IgG濃度的定量。 4.   hSBA 測試
使用人補體作為補體來源對血清殺細菌抗體的測量被廣泛接受為保護免於腦膜炎球菌病的替代標記（Borrow等人, Vaccine. 2005;23(17-18):2222-7；Borrow等人, Vaccine. 2006;24(24):5093-107；Frasch等人, Vaccine. 2009;27增刊2:B112-6；等人, J Exp Med. 1969;129(6):1307-26）。
SBA測定測量抗體在補體的存在下裂解和殺傷細菌的能力。補體的來源是人補體（Pel Freez IgG/IgM耗盡的批號13441）。簡而言之，將血清在+56ºC下熱滅活30 min，然後進行IgG純化。隨後將純化的IgG在96孔微板中在含有Ca++和Mg++）+ 0.2%明膠的Dulbecco PBS緩衝液（稀釋緩衝液）中以兩倍連續稀釋（9次）。
在+37ºC下在5% CO 2中，在Mueller Hinton瓊脂（培養皿）上進行細菌預培養18 h時，以獲得匯合的細菌生長。此後，將細菌在BHI懸浮液中生長，在λ 600 nm下的初始OD為約0.20，在+37ºC下振盪（100 rpm）培養2 h 30。培育後，將細菌稀釋5倍以獲得1.4.104 CFU/mL。將25 µL工作細菌懸浮液、50 µL預稀釋血清和25 µL稀釋人補體（15%終濃度）置於96孔微板中，並在+37ºC下振盪（100 rpm）培育1小時。Zephyr機器手應用程式自動地將每孔40 µL置於具有Mueller Hinton瓊脂的方形板上（40*40）。將瓊脂板在+37ºC和5% CO2下培育10 12小時。培育後，使用來自Microvision公司的Cybele軟體計算每孔的菌落數。
殺細菌力價定義為導致與補體對照孔相比，每mL細菌的菌落形成單位（CFU）減少50%的血清稀釋度。SBA力價是藉由在Soft Max Pro v6.5.1 GxP中藉由適應板計畫的用戶定義方案建模4參數曲線來計算的。如果建模不符合4參數曲線，則應用圍繞K50的趨勢函數和手動讀數；殺細菌力價定義為導致至少減少50%的最終血清稀釋度倒數。
陽性反應的陽性閾值定義如下：
前（D0）：hSBA ＜ 8 - 後（D42）：如果hSBA ＞ 8則血清為陽性
前（D0）：hSBA ≥ 8 - 後（D42）：如果hSBA與D0時相比增加≥ 4倍則血清為陽性。
血清能夠誘導特異性hSBA的免疫動物數量大於觀察到的反應者的70%（即每種配製品5/7的動物）。 5.   MenB 菌株
選擇了一組18種野生型血清群B腦膜炎奈瑟氏菌分離株，這些分離株是在不同的分離日期從地理上不同的位置分離出來的（大多數是最近的臨床分離株），並且代表了不同的MLST選殖複合物。選擇MenB菌株以評估免疫原性組合物的每種組分的免疫原性並評估覆蓋廣度。免疫原性是使用MenB菌株用SBA測量的，所述菌株被針對組合物的抗原之一但不匹配組合物的任何其他抗原的抗體選擇性識別。另外，進行選擇以確保一些所選擇的菌株代表了充分描述的fHBP序列多樣性以及在A和B亞家族之間的分佈。使用代表流行病學特徵（如選殖複合物（CC）分佈、地理來源、抗原流行性和多樣性）的MenB菌株評估覆蓋廣度。
所選擇的菌株的主要特徵列於 表 2中。 表 2 ：為測量對疫苗組分的抗原特異性 SBA 反應而選擇的菌株
MenB 菌株 nº 抗原譜     選殖複合物
fHBP 家族變異型 NadA 基因型 PorA VR2 P1.2 基因型  
1 A56 不存在 不匹配 ST-213
2 A22 不存在 不匹配 ST-41/44
3 B44 不存在 不匹配 ST-269
4 B24 不存在 不匹配 ST-32
5 A10 不存在 匹配 ST-11
6 B79 NadA1 不匹配 ST-32
7 A19 不存在 不匹配 ST-35
8 A05 NadA4/5 丟失 不匹配 ST-213
9 A12 不存在 不匹配 ST-41/44
10 A47 不存在 不匹配 ST-35
11 A06 不存在 不匹配 ST-461
12 A15 不存在 不匹配 ST-103
13 A10 NadA 2/3 匹配 ST-11
14 A07 NadA1 不匹配 ST-32
15 B16 不存在 不匹配 ST-41/44
16 B03 不存在 不匹配 ST-41/44
17 B09 NadA4/5 丟失 不匹配 ST-213
18 B24 NadA1 不匹配 ST-32
基於諸如選殖複合物分佈、選殖複合物的流行性和超毒力、地理來源、抗原流行性和多樣性等流行病學特徵選擇了18種菌株，並就抗原分佈進行了如下表徵：
- 11種菌株表現fHBP亞家族A（2種接近fHBP A05抗原 - nº1和8，9種遠離fHBP A05抗原 - nº2、5、7、9、10、11、12、13、14）以及
- 7種菌株表現fHBP亞家族B（1種接近fHBP B01抗原 - nº3，6種遠離fHBP B01抗原 - nº4、6、15、16、17、18）。
- 14種菌株不表現NadA（基因不存在或移碼NadA4/5丟失），並且4種菌株表現同源NadA1變異體（3種菌株）或異源NadA2/3變異體（1種菌株）；以及
- 2種菌株表現dOMV的匹配PorA VR2 P1.2，表現低水準的fHBP A，一種不表現NadA蛋白（nº5），而一種表現異源NadA蛋白（nº13）。 2. 結果 1.   ELISA 結果
藉由ELISA在D0對來自彙集血清的總IgG抗體（灰色）和在D42對來自從用各種配製品（F）、TRUMENBA或BEXSERO免疫的兔收集的單獨血清的總IgG抗體（藍色）進行定量。
無論ELISA反應如何，各組內的結果都是齊性的（所有p值 ≥ 0.061）。未檢測到異常動物。
ELISA結果顯示，所有F1-F5配製品和與MENQUADFI共投予的F1配製品均引發抗體反應，其中Ag特異性IgG力價範圍為4.05至4.99 Log 10，如 圖 1A 和圖 1B中對於fHBP特異性IgG反應所繪，以及 圖 2A 和 2B中對於NadA特異性IgG反應和dOMV特異性IgG反應所繪。
另外，如 圖 1A 和圖 1B 以及圖 2A 和圖 2B所繪，無論使用哪種配製品，與AlPO 4組合配製的四種MenB抗原各自的注射均使得在100%的動物中產生抗體，所述抗體具有針對fHBP A05 tmN、fHBP B01 smN、NadA蛋白和dOMV的中等至高力價。用50 μg A05tmN和B01smN fHBP Ag製備的配製品（F1 +/-MENQUADFI、F4、F5和F6）誘導fHBP特異性IgG反應，平均力價範圍分別為4.28 Log10至4.59 Log10和4.05 Log10至4.52 Log10。用50 μg NadA製備的配製品（F1至F5）誘導NadA特異性IgG反應，平均力價範圍為4.42 Log10至4.81 Log10。用50 μg dOMV製備的配製品（F1至F3）誘導dOMV特異性IgG反應，平均力價範圍為4.77 Log10至4.99 Log10。最後，關於各種劑量的fHBP蛋白（F2為25 μg，以及F3為100 μg）或dOMV（F4為25 μg，以及F5為125 µg），針對所有劑量測量出類似的平均力價。
TRUMENBA能夠誘導針對fHBP A05 tmN、fHBP B01 smN抗原的特異性IgG，平均力價分別為5.16和5.15 Log10。
BEXSERO能夠誘導針對NadA變異體1抗原的特異性IgG，平均力價為4.34 Log10。 2. 針對 7 種 MenB 菌株（ nº1 至 6 和 18 ）用不同的組合物 F1 至 F6 或 F1 + MENQUADFI 、 TRUMENBA 和 BEXSERO 獲得的 hSBA 結果
在第一組實驗中，針對7種MenB菌株（nº1至6和18）測定不同的組合物F1至F6或F1 + MENQUADFI、TRUMENBA和BEXSERO。
hSBA結果顯示，六種配製品F1-F5以及與MENQUADFI共投予的F1在兔中具有免疫原性。反應者的百分比是血清中測量到免疫接種後相比免疫接種前具有hSBA GMT的4倍增加（證實保護的替代標誌）的動物的百分比。
如 圖 3所繪，無論使用哪個免疫接種劑量（25 µg F2，50 µg F1、F4、F5、F6，和100 µg F3），與突變非脂化fHBP A05 tmN + NadA + dOMV組合的突變非脂化fHBP B01 smN均能夠在D42在100%的動物中誘導針對緊密相關的fHBP B44變異體菌株的殺細菌活性，GMT範圍為443至1147。
TRUMENBA和BEXSERO能夠在100%的動物中誘導針對表現緊密相關的fHBP B44變異體的MenB菌株的殺細菌活性，GMT分別為5773和646。
如 圖 4和 圖 5所繪，與突變非脂化fHBP A05tmN + NadA + dOMV組合的突變非脂化fHBP B01 smN能夠在43%至86%的動物中誘導針對表現相異fHBP B24變異體的第一MenB菌株的殺細菌活性（ 圖 4），並且在86%至100%的動物中誘導針對所測試的第二相異fHBPB24變異體菌株的殺細菌活性（ 圖 5），GMT範圍分別為5至18和28至219。
值得關注的是，針對第一異源B24變異體菌株，僅配製品F3中的突變非脂化fHBP B01smN在86%的動物中誘導hSBA反應，GMT為18。
TRUMENBA能夠在100%的動物中誘導針對兩種B24菌株的殺細菌活性，GMT分別為44和143。BEXSERO能夠在100%的動物中誘導針對兩種B24菌株的殺細菌活性，GMT分別為2274和2587。
另外，在25至100 µg B01 smN fHBP劑量之間沒有顯示出顯著的劑量效應（所有p值 ≥ 0.056）。
最後，當將MENQUADFI與配製品F1共投予時，關於突變非脂化B01 smN反應沒有顯示出顯著差異（所有MenB Ag為50 µg，所有p值 ≥ 0.339）。
如 圖 6和 圖 7所繪，無論使用哪個免疫劑量（25 µg F2，50 µg F1、F4、F5、F6，和100 µg F3），與突變非脂化fHBP B01smN + NadA + dOMV組合的突變非脂化fHBP A05 tmN均能夠在100%的動物中誘導針對緊密相關的fHBP A56變異體表現菌株（ 圖 6）以及針對相異fHBP A22變異體表現菌株（ 圖 7）的殺細菌活性，幾何平均力價（GMT）範圍分別為226至382和45至108。
TRUMENBA能夠在100%的動物中誘導針對fHBP A56和fHBP A22變異體表現菌株的殺細菌活性，GMT分別為2058和463。BEXSERO能夠在57%的動物中誘導針對fHBP A56變異體表現菌株和在100%的動物中誘導針對fHBP A22變異體表現菌株的殺細菌活性，GMT分別為7和331。
另外，在25至100 µg突變非脂化A05 tmN fHBP劑量之間沒有顯示出顯著的劑量效應（所有p值 ≥ 0.066）。
最後，當將MENQUADFI與配製品F1共投予時，關於針對A56菌株的突變非脂化A05 tmN反應沒有顯示出顯著差異（p值 = 0.281）。對於針對fHBP A22表現菌株的hSBA，用F1+MENQUADFI獲得的力價顯著低於單獨用F1獲得的力價（p = 0.020），但2.4倍降低沒有生物學相關性。
如 圖 8所繪，用50 µg NadA製備的配製品（F1至F5）能夠在100%的動物中誘導針對同源NadA變異體1菌株的殺細菌活性，GMT範圍為217至696。
TRUMENBA和BEXSERO能夠在86%和100%的動物中誘導針對同源NadA變異體1菌株的殺細菌活性，GMT分別為118和1191。
最後，當將MENQUADFI與多組分MenB疫苗共投予時，關於NadA反應沒有顯示出顯著差異（p值 = 0.688）。
如 圖 9所繪，無論是以25 µg F4，50 µg F1、F2、F3和125 µg F5用dOMV製備的哪種配製品，dOMV均能夠在100%的動物中誘導針對同源PorA_1.2菌株的殺細菌活性，GMT範圍為350至1324。
TRUMENBA和BEXSERO不能誘導針對這種dOMV菌株的殺細菌活性。
另外，沒有顯示出dOMV的顯著劑量效應（所有p值 ≥ 0.637）。
未觀察到NadA和dOMV抗原對fHBP A或B反應的顯著影響（所有p值 ≥ 0.208）。
在F1（50 µg）與F3（100 µg）配製品之間，與NadA/dOMV抗原組合的fHBP抗原的劑量的唯一顯著影響是對於NadA特異性hSBA反應。如 圖 8A所繪，用F3配製品獲得的力價高於用F1配製品獲得的力價（p = 0.004，增加3.2倍）。對於porA/dOMV特異性hSBA反應，所有配製品之間沒有顯示出顯著差異。
這項研究證明了用AlPO 4配製的組合在一起的以下四種選擇的MenB抗原中每一種的免疫原性，突變非脂化fHBP A05 tmL和B01 smL、NadA和dOMV。
新疫苗配製品中包含的所有抗原都能夠產生藉由針對Ag特異性MenB菌株的hSBA測量的Ag特異性殺細菌抗體反應。在兔模型中，對於fHBP沒有觀察到顯著的劑量效應。類似地，對於dOMV沒有觀察到顯著的劑量效應，並且在最低劑量（25 μg）下的dOMV提供了有效的hSBA反應。值得關注的是，配製品F3，即含有100 μg的fHBP、50 μg的NadA和50 μg/劑量的dOMV的配製品，傾向於提供最高的hSBA反應，並在超過71%的動物中誘導針對所有測試菌株的陽性反應。此外，沒有觀察到MenQuadfi共投予對MenB特異性hSBA反應的影響。在所有測試的配製品中，fHBP A05tmN疫苗Ag在100%的動物中誘導針對緊密相關的A56變異體菌株和異源A22變異體菌株的hSBA反應，幾何平均力價（GMT）範圍分別為226至382和45至108。在所有測試的配製品中，fHBP B01smN疫苗Ag在100%的動物中誘導針對緊密相關的B44變異體菌株的hSBA反應，GMT範圍為443至1147。在測試針對第一異源H44/76 B24變異體菌株的hSBA反應時，僅配製品F3中的fHBP B01smN在86%的動物中誘導陽性hSBA反應，GMT為18，而所有其他測試的配製品僅在29%至57%的動物中誘導hSBA反應，GMT範圍為5至10。相比之下，當在所有測試的配製品中使用第二異源B24菌株即菌株03S-0291時，fHBP B01smN在86%至100%的動物中誘導hSBA，GMT範圍為28至219。
在所有測試的配製品中，NadA疫苗Ag在100%的動物中誘導針對NadA1變異體菌株的hSBA，GMT範圍為217至696。
在所有測試的配製品中，dOMV在100%的動物中誘導針對PorA亞型VR2 P1.2菌株的hSBA，GMT範圍為350至1324。
總體而言，免疫原性結果顯示本文揭示的免疫原性組合物的六種配製品在兔中具有免疫原性。新疫苗中包含的所有抗原都能夠產生藉由針對Ag特異性MenB菌株的hSBA測量的Ag特異性殺細菌抗體反應。在兔模型中，對於fHBP沒有觀察到顯著的劑量效應，即使用100 μg fHBP製備的配製品也傾向於提供最高的hSBA反應，並且還在超過70%的動物中誘導針對所有測試菌株的反應。類似地，對於dOMV沒有觀察到顯著的劑量效應，並且最低的dOMV劑量（25 μg）足以誘導有效的hSBA反應。值得關注的是，沒有觀察到MENQUADFI共投予對MenB特異性hSBA反應的影響。
值得注意的是，在整個研究過程中，在動物中沒有觀察到溫度升高和重大發現（如紅斑……）。
總之，免疫原性結果顯示揭示的免疫原性組合物的六種配製品在兔中具有免疫原性。MenB多組分疫苗中包含的所有抗原都能夠產生藉由針對Ag特異性MenB菌株的hSBA測量的Ag特異性殺細菌抗體反應。 3. 針對 17 種 MenB 菌株（ nº1 至 17 ）用組合物 F1 、 F3 、 TRUMENBA 和 BEXSERO 獲得的 hSBA 結果
在第二組實驗中，針對11種另外的MenB菌株（包括上文測試的6種菌株在內的總計17種MenB菌株），對在前面的實驗中用組合物F1、F3、TRUMENBA和BEXSERO免疫接種後獲得的血清進行了測定。
總體結果總結在下 表 3中，代表不同測試組合物針對所選擇MenB菌株組的功效。 表 3 ：測試組合物針對 MenB 菌株組的 功效
組合物 F1 F3 Trumenba Bexsero
MenB 菌株 GMT %* GMT %* GMT %* GMT %*
1 2.5 100 2.6 100 3.3 100 0.8 57
2 2.0 100 2.0 100 2.7 100 1.5 100
3 2.9 100 3.1 100 3.8 100 2.8 100
4 0.9 57 1.3 86 1.6 71 3.4 100
5 3.0 100 2.8 100 0.3 0 0.3 0
6 2.3 100 2.8 100 3.1 86 3.1 100
7 2.3 86 2.8 100 3.4 100 2.1 57
8 2.2 100 2.2 100 2.9 100 0.5 14
9 1.7 100 2.0 100 2.6 100 1.1 43
10 2.3 86 2.5 100 3.1 100 3.1 100
11 1.5 100 1.8 100 1.2 86 0.6 29
12 1.5 100 2.0 100 2.6 100 1.5 100
13 2.2 100 2.7 100 2.6 100 2.2 100
14 3.4 100 3.5 100 2.4 100 3.0 100
15 1.6 100 1.8 100 3.1 100 3.4 100
16 2.1 100 2.1 100 3.4 100 2.9 100
17 1.4 86 1.9 100 2.8 100 2.3 100
*：反應者的百分比
結果顯示，菌株nº4和5被TRUMENBA較差覆蓋（＜ 71% 反應者）或未覆蓋（0%反應者）。而這些菌株在更大程度上或完全被F1和F3配製品覆蓋。
此外，結果顯示菌株nº1、5、7、8、9和11被BEXSERO較差覆蓋或未覆蓋，而它們傾向於被F1和F3配製品很好或完全覆蓋。
值得注意的是，菌株nº5一點也沒有被TRUMENBA或BEXSERO覆蓋。
表 3顯示，17種MenB菌株中的16種和17種MenB菌株中的17種被F1和F3組合物覆蓋。相比之下，TRUMENBA顯現覆蓋17種MenB菌株中的15種，而BEXSERO僅覆蓋17種MenB菌株中的11種。
如 圖 19所示，針對所有來自不同選殖複合物ST-41/44、ST-32、ST-269、ST-213、ST-35、ST-461、ST-11和ST-461的不同MenB菌株，測試的配製品F3能夠誘導保護。相比之下，由TRUMENBA和BEXSERO誘導的覆蓋度存在一些缺口。
總結資料，可以注意到本揭示文本的MenB多組分免疫原性組合物提供了良好的菌株覆蓋度，甚至針對fHBP低表現菌株和相異菌株也如此。F3配製品覆蓋17/17的MenB菌株，反應者 ＞ 71%，並且F1配製品覆蓋16/17的MenB菌株，反應者 ＞ 71%。
TRUMENBA覆蓋15/17的MenB菌株。未覆蓋的菌株（0%反應者）不表現fHBP A10，且屬於ST-11選殖複合物。被較差覆蓋的菌株（71%反應者）是B24表現菌株。
BEXSERO覆蓋11/17的MenB菌株。被較差覆蓋或未被覆蓋的6種菌株（0-57%反應者）表現fHBP A變異體。它們可代表高達29%的循環MenB菌株，且屬於流行的或超毒力的選殖複合物：ST-213；ST-11；ST-35；和ST-461。
新開發的疫苗組合物針對代表當前MenB分子流行病學的18種菌株提供了增加的保護廣度；所述菌株即來自最流行和超毒力的選殖複合物（CC）和最流行的抗原變異體的菌株。 實例 3 ：模擬 PTE 測定 1. 材料與方法 1. 測試組合物和實驗設計
在第一項研究中，在各使用20名供體的模擬成人和新生兒外周組織等效物（PTE）培養物（見下文）中，對可商購的疫苗BEXSERO和TRUMENBA進行了比較。TRUMENBA和BEXSERO疫苗組合物是如 實例 1中揭示的。
在第二項研究中，將模擬PTE培養物（見下文）用五種疫苗候選配製品F1、F2、F3、F4和F5（配製品如 實例 1的 表 1中所指示）以1:100至1:1000000的劑量範圍曲線（基於人劑量的10倍稀釋度）處理。F1被認為是標準配製品，因為它含有50 µg/劑量的各組分和標準劑量的AlPO4（0.4 mg/劑量）；F2配製品是低劑量fHBP（25 µg/劑量）和標準劑量的NadA和dOMV（50 µg/劑量）在0.4 mg/劑量AlPO 4中的組合；F3配製品是高劑量fHBP（100 µg/劑量）、標準劑量的NadA和dOMV（50 µg/劑量）和高劑量AlPO4（0.8 mg/劑量）的組合；F4配製品組合了標準劑量的fHBP和NadA（各自50 µg/劑量）、低劑量dOMV（25 µg/劑量）和標準劑量的AlPO4；並且F5配製品包含標準劑量的fHBP和NadA（50 µg/劑量）、高劑量dOMV（125 µg/劑量）和標準劑量的AlPO 4的組合。在這項研究中，基於dOMV的MenB疫苗BEXSERO用作基準參考對照。
類比或對照組合物為僅含有無血清培養基的無處理對照 。 2. 成人及新生兒模擬 PTE 測定
使用Ma等人（ Immunology, 2010, 130: 374-87）傳授的方法在機器手線路上組裝模擬PTE構建體（Higbee等人, Altern Lab Anim. 2009年9月;37增刊1:19-27）。
簡而言之，內皮細胞生長至匯合在膠原基質（Advanced Biomatrix，聖地牙哥，加利福尼亞州）上。此後，將從冷凍儲備物製備的供體PBMC（成人模擬PTE）或供體臍帶血（新生兒模擬PTE）施加至測定孔。培育90分鐘（成人形式）或3小時（臍帶血形式）之後，將非遷移的細胞洗掉，之後在最後的培育步驟中添加各種處理（ 實例 1的 表 1）保持48小時。在這些測定中將100 ng/mL LPS（來自銅綠假單胞菌，目錄號L8643，Millipore Sigma，伯靈頓，麻塞諸塞州）和10 μg/mL R848（目錄號TLRL-R848，InvivoGen，聖地牙哥，加利福尼亞州）的混合物用作陽性對照（測定對照）。48小時處理時間段後收穫逆向遷移的細胞，並使用流式細胞術針對細胞活力進行表型分析，而對在相同時間點收穫的培養物上清液藉由多重測定分析細胞介素/趨化介素。
在第一系列實驗中，將BEXSERO和TRUMENBA在一起進行比較。在第二系列實驗中，將本揭示文本的F1、F2、F3、F4和F5的免疫原性組合物與BEXSERO進行比較。
在48小時處理時間段後收穫培養物上清液，並藉由多重測定分析細胞介素/趨化介素。對在相同時間點收穫的細胞使用流式細胞術針對細胞活力進行表型分析。 3. 細胞介素 / 趨化介素分析
使用Milliplex人12-路多細胞介素檢測系統（Millipore）分析類比培養物上清液。套組包含IL-1β、IL-6、MIP-1β和TNFα。分析物濃度是使用Bio-Plex manager軟體基於相關標準曲線計算的（Luna等人 PloS One 卷號13,6 e0197478. 2018年6月6日）。
對於運行驗收標準，每種分析物的定量下限（LLOQ）和定量上限（ULOQ）是針對標準值的5參數邏輯（5PL）曲線擬合基於每個點的回收百分比（觀測值/預期值*100）確立的。80%-120%的回收百分比被認為是可接受的，因此落在此範圍內的值限定了標準曲線的下限和上限。審查了原始資料檔案的珠計數；當每個區域至少計數35個珠時，資料點被認為是有效的。 4. 流式細胞術
將MIMIC® PTE衍生的細胞用PBS洗滌並用Live-Dead Aqua（InvitroGen，卡爾斯巴德，加利福尼亞州）在冰上染色20 min以評估細胞活力。使用FlowJo軟體（Tree Star，阿什蘭，俄勒岡州）進行資料分析。對於流式門控，選擇單重態，然後選擇活細胞。 5. 資料分析和繪圖
資料被匯出到GraphPad Prism（GraphPad Software，聖地牙哥，加利福尼亞州，美國）用於圖形製作。細胞介素資料被匯出到excel資料庫中。超出範圍的高（＞ OOR）值（高於曲線最高點的值）被替代為ULOQ；超出範圍的低（＜ OOR）值被替代為1/2 LLOQ（定量下限）。 6. 統計分析
使用非劣效性模型進行統計分析。包括細胞活力、CD86、IL-6、IL-1b、TNF-a和MIP-1b在內的參數被用作該分析的終點。比較了不同抗原配製品與Bexsero®疫苗的幾何平均值（GM），並將δ = 2/3用作非劣效性的度量。此處描述的分析是使用SA程式PROC TTEST完成的，並以示出GM和95% CI範圍的點圖表示，如已公佈的文獻中所推薦的。 2. 結果 1. 成人和新生兒模擬 PTE 中的 BEXSERO 和 TRUMENBA
48小時後收穫來自未處理和經處理的成人和新生兒模擬PTE培養物的培養物上清液，並使用Millipore定制多重陣列分析細胞介素/趨化介素分泌。先天趨化介素/細胞介素IL-6、TNFα、MIP-1β和IL-1β包括在該分析中，因為它們對先天免疫活性至關重要，並且還可以驅動免疫細胞毒性。
獲得的結果（ 圖 10）顯示，TRUMENBA在成人類比PTE中展現出比BEXSERO更強的促炎性細胞介素特徵。此外，TRUMENBA在新生兒模擬PTE中展現出比BEXSERO更強的促炎性細胞介素特徵（ 圖 11）。
如 圖 12呈現的統計分析確認了如下觀察結果，即對於大多數細胞介素，TRUMENBA在成人和新生兒平臺中產生比BEXSERO更強的反應。事實上，如在成人和新生兒PTE中由BEXSERO觸發的細胞介素分泌相比於TRUMENBA情況下的幾何平均值森林圖比率（具有95%置信區間）所示，TRUMENBA優於BEXSERO。 2. 成人和新生兒模擬 PTE 中的 F1 、 F2 、 F3 、 F4 、 F5 和 BEXSERO
48小時後收穫來自未處理和經處理的成人和新生兒模擬PTE培養物的培養物上清液，並使用Millipore定制多重陣列分析細胞介素/趨化介素分泌。先天趨化介素/細胞介素IL-6、TNFα、MIP-1β和IL-1β包括在該分析中，因為它們對先天免疫活性至關重要，並且還可以驅動免疫細胞毒性。
在成人類比PTE系統中（參見 圖 13），在最高處理劑量（1:100、1:1000、1:10000）下，所有測試配製品與模擬對照（即不具有抗原）相比產生高約一個log的細胞介素分泌。在幾乎所有情況下，配製品跟隨等於或略低於BEXSERO。
在 圖 14A 、圖 14B 和圖 14C中，統計分析顯示，對於報告的所有細胞介素，與BEXSERO相比，F1、F2、F4和F5配製品在成人模擬PTE中產生的炎症反應更少。在成人類比PTE系統中，與Bexsero相比，F3配製品誘導的促炎性細胞介素分泌相似（TNF-α或IL-1β）或更少（IL6或MIP-1b）。
另外，在成人PTE模型中，所有配製品都以劑量依賴性方式以及與BEXSERO相似的範圍內展現出免疫細胞毒性。事實上，如 圖 15所示，在一些測試條件中，在最低處理劑量（1:100000和1:1000000稀釋度）下，細胞活力幾乎沒有受到影響，而在最高劑量（1:100稀釋度）下，細胞活力降低了高達大約50%。
此外，在新生兒模擬PTE中，F1、F2、F3、F4和F5配製品展現出與BEXSERO一致的促炎性細胞介素特徵（ 圖 16）。相對於模擬條件，所有配製品均產生高約4倍至一個log的細胞介素分泌。與BEXSERO相比，F1、F2、F3和F4配製品誘導的IL-6和TNF-α分泌相似或更少。與BEXSERO相比，F5配製品誘導的促炎性細胞介素分泌略高。
在 圖 17A 和 17B中，統計分析顯示，總體而言，F1、F2和F3配製品在新生兒模擬PTE中產生的炎症反應是與BEXSERO可比的。與BEXSERO相比，F5配製品在新生兒模擬PTE中傾向於產生略高的炎症反應，而與BEXSERO相比，F4配製品在新生兒模擬PTE中傾向於產生更弱的反應。
與成人類比PTE系統相似，所有配製品均展現出與BEXSERO相似的免疫細胞毒性特徵。事實上，如 圖 18所示，在一些測試條件中，在模擬新生兒PTE中，在最低處理劑量（1:100000和1000000稀釋度）下，細胞活力幾乎沒有受到影響，而在最高劑量（1:100稀釋度）下，細胞活力降低了高達約50%。 3. 結論
在成人和新生兒形式的模擬PTE中，與BEXSERO相比，TRUMENBA誘導更強的促炎性細胞介素反應。
與BEXSERO相比，F1、F2、F3、F4和F5配製品在成人模擬PTE構建體中產生相似或更少的促炎性細胞介素分泌。
總體而言，與BEXSERO相比，F5配製品在新生兒模擬PTE中誘導更多的促炎性細胞介素，而F1、F2、F3和F4配製品誘導相似或更低的細胞介素反應。
F1、F2、F3、F4和F5配製品對細胞活力的影響很小（除了在1:100稀釋度時，一些配製品誘導細胞活力降低約40%），並且趨勢與BEXSERO相似。 實例 4 ：總體結論
從以上呈現的結果，可以得出結論，所揭示的包含腦膜炎球菌抗原的組合的免疫原性組合物能夠誘導免疫原性保護反應，如hSBA結果所證明，所述腦膜炎球菌抗原的組合包含至少一種H因子結合蛋白（fHBP）A蛋白、至少一種fHBP B蛋白、至少一種奈瑟氏菌黏附素A（NadA）蛋白和至少一種清潔劑提取的外膜囊泡（dOMV）。這確認了這些組合物作為疫苗和誘導針對腦膜炎球菌感染的免疫原性保護反應的效用。
另外，資料顯示，與TRUMENBA和BEXSERO相比，流行和超毒力的MenB菌株覆蓋廣度更大，並且它可以填補這兩種疫苗留下的一些缺口。
最後，資料顯示，這些組合物呈現出良好的安全性，呈現出與BEXSERO相似或更低的反應性特徵，而BEXSERO的反應性已經低於TRUMENBA。 參考文獻Atkinson B, Gandhi A, Balmer P. History of Meningococcal Outbreaks in the United States: Implications for Vaccination and Disease Prevention. Pharmacotherapy. 2016;36(8):880-92. Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DM, Short Protocols in Molecular Biology : A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, ISBN: 047132938X; 4th edition (April 1999) Bambini S, Muzzi A, Olcen P, Rappuoli R, Pizza M, Comanducci M. Distribution and genetic variability of three vaccine components in a panel of strains representative of the diversity of serogroup B meningococcus. Vaccine. 2009;27(21):2794-803. Batista RS, Gomes AP, Dutra Gazineo JL, Balbino Miguel PS, Santana LA, Oliveira L, et al. Meningococcal disease, a clinical and epidemiological review. Asian Pac J Trop Med. 2017;10(11):1019-29. Bijlsma MW, Brouwer MC, Spanjaard L, van de Beek D, van der Ende A. 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無
圖 1A 和圖 1B表示在D0（空心/白色符號）和D42（實心/黑色符號）從在D0、D28和D56用TRUMENBA或用配製品F1至F6或者用與MENQUADFI一起共投予的F1免疫的兔收集的血清中藉由ELISA測量的特異性抗A05tmN（ 圖 1A）或抗B01smN（ 圖 1B）IgG力價（LLOQ意指定量下限）。
圖 2A 和圖 2B. 圖 2A表示在D0（空心/白色符號）和D42（實心/黑色符號）從在D0和D28用BEXSERO或用配製品F1-F5和用與MENQUADFI一起共投予的F1免疫的兔收集的血清中藉由ELISA測量的特異性抗NadA IgG力價。 圖 2B表示在D0和D42從在D0、D28和D56用配製品F1至F5和用與MENQUADFI一起共投予的F1免疫的兔收集的血清中藉由ELISA測量的特異性抗dOMV IgG。
圖 3表示在D0（空心/白色符號）和D42（實心/黑色符號）從在D0、D28和D56用TRUMENBA、BEXSERO或配製品F1至F6或用與MENQUADFI共投予的F1免疫的兔純化的IgG中測量的針對緊密相關MenB B44菌株（菌株nº3）的hSBA。
圖 4表示在D0（空心/白色符號）和D42（實心/黑色符號）從在D0、D28和D56用TRUMENBA、BEXSERO或配製品F1至F6或用與MENQUADFI共投予的F1免疫的兔純化的IgG中測量的針對異源MenB B24菌株（菌株nº4）的hSBA。
圖 5表示在D0（空心/白色符號）和D42（實心/黑色符號）從在D0、D28和D56用TRUMENBA、BEXSERO或配製品F1至F6或用與MENQUADFI共投予的F1免疫的兔純化的IgG中測量的針對異源MenB B24菌株（菌株nº18）的hSBA。
圖 6表示在D0（空心/白色符號）和D42（實心/黑色符號）從在D0、D28和D56用 TRUMENBA、BEXSERO或配製品F1至F6或用與MENQUADFI共投予的F1免疫的兔純化的IgG中測量的針對緊密相關MenB A56菌株（菌株nº1）的hSBA。
圖 7表示在D0（空心/白色符號）和D42（實心/黑色符號）從在D0、D28和D56用TRUMENBA、BEXSERO或配製品F1至F6或用與MENQUADFI共投予的F1免疫的兔純化的IgG中測量的針對異源MenB A22菌株（菌株nº2）的hSBA。
圖 8表示在D0（空心/白色符號）和D42（實心/黑色符號）從在D0、D28和D56用TRUMENBA、BEXSERO或配製品F1至F6或用與MENQUADFI共投予的F1免疫的兔純化的IgG中測量的針對MenB NadA1菌株（菌株nº6）的hSBA。
圖 9表示在D0（空心/白色符號）和D42（實心/黑色符號）從在D0、D28和D56用TRUMENBA、BEXSERO或配製品F1至F6或用與MENQUADFI共投予的F1免疫的兔純化的IgG中測量的針對MenB OMV PorA 1.2菌株（菌株nº5）的hSBA。
圖 10表示用不同劑量的BEXSERO和TRUMENBA處理的源自成人PTE的樹突細胞（DC）的細胞介素產生（IL-6、TNFα、MIP-1β和IL-1β）：處理後48小時收穫來自PTE的培養上清液，並使用多重陣列評價細胞介素分泌。圖表表示樹突細胞（DC）中IL-6、TNFα、IL-1β和MIP-1β的細胞介素產生的幾何平均值（GMV）。處理以人劑量的10倍稀釋度進行（n=20個供體）。N/A是沒有抗原的模擬物對照。
圖 11表示用不同劑量的BEXSERO和TRUMENBA處理的源自新生兒PTE的DC的細胞介素產生（IL-6、TNFα、MIP-1β和IL-1β）：處理後48小時收穫來自PTE的培養上清液，並使用多重陣列評價細胞介素分泌，圖表表示DC中IL-6、TNFα、IL-1β和MIP-1β的細胞介素產生的GMV。處理以人劑量的10倍稀釋度進行（n=20個供體）。
圖 12A 和圖 12B表示在1:10000稀釋度下由BEXSERO在成人和新生兒PTE中觸發的細胞介素分泌相比於TRUMENBA情況下的幾何平均值比率（具有95%置信區間）的森林圖。虛線設置為1的值，區間的值和置信度低於1意為TRUMENBA優於BEXSERO，而如果值和區間高於1，則BEXSERO優於TRUMENBA。
圖 13表示成人PTE模組中由F1-F5配製品誘導的細胞介素（IL-6、TNFα、MIP-1β和IL-1β）分泌。用不同劑量的F1-F5配製品和對照（BEXSERO）處理模擬成人PTE。此後，收集培養上清液並藉由多重陣列評價細胞介素的分泌。IL-6、TNFα、IL-1β和MIP-1β的平均值 ± 95% CI；n = 16至24。
圖 14A 、圖 14B 和圖 14C表示在成人PTE中在1:10000稀釋度下由BEXSERO誘導的細胞介素分泌相比於配製品F1、F2、F3、F4和F5情況下的幾何平均值比率（具有95%置信區間）的森林圖。虛線設置為1的值，區間的值和置信度低於1意為處理優於BEXSERO，而如果值和區間高於1，則BEXSERO優於處理。 圖 14A表示用F2和F3配製品獲得的結果，並且 圖 14B和 圖 14C表示用F1、F4和F5配製品獲得的結果。
圖 15表示在成人模擬PTE中用F1-F5配製品和BEXSERO處理後的免疫細胞毒性（或處理後活細胞的百分比）。
圖 16表示與新生兒PTE模組中的BEXSERO相比，F1-F5配製品的細胞介素（IL-6、TNFα、MIP-1β和IL-1β）分泌水準的增加。用不同劑量的F1-F5配製品和對照（BEXSERO）處理模擬新生兒PTE。此後，收集培養上清液並藉由多重陣列評價細胞介素的分泌。IL-6、TNFα、IL-1b和MIP-1b（n = 16至24）的平均值 ± 95% CI。N/A是沒有抗原的模擬物對照。
圖 17A 和圖 17B表示在新生兒PTE中在1:10000稀釋度下由BEXSERO誘導的細胞介素分泌相比於配製品F1、F2、F3、F4和F5情況下的幾何平均值比率（具有95%置信區間）的森林圖。虛線設置為1的值，區間的值和置信度低於1意為處理優於Bexsero®，而如果值和區間高於1，則Bexsero®優於處理。 圖 17A表示用F2和F3配製品獲得的結果，並且 圖 17B表示用F1、F4和F5配製品獲得的結果。
圖 18表示在新生兒模擬PTE中用F1-F5配製品和BEXSERO處理後的免疫細胞毒性（或處理後活細胞的百分比）。
圖 19表示 hSBA結果的總結，展示了由測試的以下不同配製品覆蓋或未覆蓋的不同選殖複合物：針對來自不同選殖複合物的18種MenB菌株的F3、TRUMENBA和BEXSERO。黑色圓弧：BEXSERO。虛線圓弧：TRUMENBA。灰色圓弧：F3配製品。圓弧內的數字表示對每種選殖複合物測試的MenB菌株總數中配製品所覆蓋的MenB菌株的數量。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006

Claims (15)

  1. 一種免疫原性組合物，其包含腦膜炎奈瑟氏菌血清群B抗原的組合，所述組合包含至少一種H因子結合蛋白（fHBP）A蛋白、至少一種fHBP B蛋白、至少一種奈瑟氏菌黏附素A（NadA）蛋白和至少一種清潔劑提取的外膜囊泡（dOMV）。
  2. 如請求項1所述的組合物，其中所述fHBP A蛋白和/或所述fHBP B蛋白是非脂化的。
  3. 如請求項1或2所述的組合物，其中所述fHBP A蛋白是包含與SEQ ID NO: 1至少約85%的同一性的突變蛋白，和/或其中所述fHBP B蛋白是包含與SEQ ID NO: 3至少約85%的同一性的突變蛋白。
  4. 如請求項1至3中任一項所述的組合物，其中所述fHBP A蛋白基於SEQ ID NO: 6的編號包含選自以下中至少一者的至少一個胺基酸取代：a) 在胺基酸115處的天門冬醯胺酸（N115）的胺基酸取代；b) 在胺基酸121處的天門冬胺酸（D121）的胺基酸取代；c) 在胺基酸128處的絲胺酸（S128）的胺基酸取代；d) 在胺基酸130處的白胺酸（L130）的胺基酸取代；e) 在位置131處的纈胺酸（V131）的胺基酸取代；f) 在位置133處的甘胺酸（G133）的胺基酸取代；g) 在位置219處的離胺酸（K219）的胺基酸取代；和h) 在位置220處的甘胺酸（G220）的胺基酸取代，或包含SEQ ID NO: 2或由SEQ ID NO: 2組成，和/或其中所述fHBP B蛋白基於SEQ ID NO: 6的編號包含選自以下中至少一者的至少一個胺基酸取代：a) 在胺基酸38處的麩醯胺酸（Q38）的胺基酸取代；b) 在胺基酸92處的麩胺酸（E92）的胺基酸取代；c) 在胺基酸130處的精胺酸（R130）的胺基酸取代；d) 在胺基酸223（S223）處的絲胺酸的胺基酸取代；和e) 在胺基酸248處的組胺酸（H248）的胺基酸取代，或包含SEQ ID NO: 4或由SEQ ID NO: 4組成。
  5. 如請求項1至4中任一項所述的組合物，其中所述fHBP A蛋白和/或所述fHBP B以範圍為約20 μg/劑量至約200 μg/劑量、或約25 μg/劑量至約180 μg/劑量、或約40 μg/劑量至約140 μg/劑量、或約50 μg/劑量至約120 μg/劑量、或約75 μg/劑量至約100 μg/劑量或為約25 μg/劑量、或約50 μg/劑量或約100 µg/劑量的量存在。
  6. 如請求項1至5中任一項所述的組合物，其中所述NadA蛋白是NadA1蛋白，或包含與SEQ ID NO: 5至少約85%的同一性，或包含SEQ ID NO: 5或由SEQ ID NO: 5組成。
  7. 如請求項1至6中任一項所述的組合物，其中所述NadA蛋白以範圍為約20 μg/劑量至約200 μg/劑量、或約25 μg/劑量至約180 μg/劑量、或約40 μg/劑量至約140 μg/劑量、或約50 μg/劑量至約120 μg/劑量、或約75 μg/劑量至約100 μg/劑量或為約50 μg/劑量的量存在。
  8. 如請求項1至7中任一項所述的組合物，其中所述dOMV包含孔蛋白A（PorA）。
  9. 如請求項1至8中任一項所述的組合物，其中所述dOMV以範圍為約5 µg/劑量至約400 µg/劑量、或約10 µg/劑量至約300 µg/劑量、或約25 µg/劑量至約250 µg/劑量、或約35 µg/劑量至約225 µg/劑量、或約50 µg/劑量至約200 µg/劑量、或約75 µg/劑量至約180 µg/劑量、或約100 µg/劑量至約150 µg/劑量、或約110 µg/劑量至約125 µg/劑量或為約25 µg/劑量、或約50 µg/劑量、或約125 µg/劑量的量存在。
  10. 如請求項1至9中任一項所述的組合物，其還包含佐劑，特別是鋁基佐劑，特別是選自包含以下的群組的鋁基佐劑：氫氧化鋁佐劑、磷酸鋁佐劑、硫酸鋁鹽佐劑、羥基磷酸鋁硫酸鹽佐劑、硫酸鋁鉀佐劑、羥基碳酸鋁、氫氧化鋁和氫氧化鎂的組合、以及它們的混合物，特別是磷酸鋁佐劑。
  11. 如請求項1至10中任一項所述的組合物，所述組合物包含以下或由以下組成：25至100 μg/劑量的由SEQ ID NO: 2組成的非脂化fHBP A蛋白、25至100 μg/劑量的由SEQ ID NO: 4組成的非脂化fHBP B蛋白、25至100 μg/劑量的由SEQ ID NO: 5組成的NadA蛋白、20至150 μg/劑量的來自表現PorA VR2 P1.2的MenB菌株的dOMV、100至600 μg/劑量的磷酸鋁佐劑、50 mM乙酸鹽緩衝液和pH 6.0。
  12. 如請求項1至11中任一項所述的組合物，其還包含來自腦膜炎奈瑟氏菌血清群A、C、W135和/或Y中的一種或多種的至少一種接合接合莢膜糖。
  13. 一種疫苗，所述疫苗包含如請求項1至12中任一項所述的組合物。
  14. 如請求項1至12中任一項所述的組合物或如請求項13所述的疫苗，用於防止腦膜炎球菌感染或用於誘導針對腦膜炎球菌細菌的免疫反應。
  15. 一種組合物，所述組合物包含編碼fHBP A蛋白的mRNA、編碼fHBP B蛋白的mRNA、編碼NadA蛋白的mRNA、和來自表現PorA VR2 P1.2的MenB的dOMV，所述fHBP A蛋白包含與SEQ ID NO: 2至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%、至少約99.5%或約100%的胺基酸序列同一性，所述fHBP B蛋白包含與SEQ ID NO: 4至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%、至少約99.5%或約100%的胺基酸序列同一性，所述NadA蛋白包含與SEQ ID NO: 5至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%、至少約99.5%或約100%的胺基酸序列同一性。
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