BR112020011019A2 - processo aprimorado para produzir vesículas de membrana externa - Google Patents

Abstract

A presente invenção se refere aos campos de microbiologia médica e vacinas. Em particular, a invenção se refere a um processo em que a liberação espontânea de vesículas de membrana externa bacteriana (OMV) de bactérias gram-negativas é estimulada pela aplicação de uma tensão de oxigênio dissolvido (DOT) que é mais alta do que uma DOT fisiológica. As OMVs assim produzidas são para o uso em vacinas. A invenção ainda se refere à OMV obtenível pelo dito processo, e a uma composição farmacêutica compreendendo tal OMV. A presente invenção ainda se refere ao uso de OMV da presente invenção como um medicamento em particular para o uso em um método para conseguir uma resposta imune.

Description

Relatório descritivo da Patente de invenção para:“PROCESSO APRIMORADO PARA PRODUZIR VESÍCULAS DE MEMBRANA EXTERNA” Campo da Invenção

[001] A presente invenção refere-se aos campos de microbiologia médica e vacinas. Em particular a invenção se refere a um processo para produzir vesículas de membrana externa espontâneas (OMVs) de bactérias gram-negativas para o uso em vacinas, para OMVs obteníveis pelo dito processo, e a uma composição farmacêutica compreendendo tais OMVs. A presente invenção ainda se refere ao uso de OMVs da presente invenção como um medicamento em particular para o uso em um método para conseguir uma resposta imune.

Fundamentos da Técnica

[002] As vesículas de membrana externa (OMVs) são naturalmente produzidas por bactérias gram-negativas e desempenham um papel em patogênese, comunicação célula a célula e respostas ao estresse (Kulp e Kuehn 2010). A formação de vesícula da membrana foi mostrada recentemente em bactérias gram-positivas e arqueia também (Ellen et al.

2009; Rivera et al. 2010). As OMVs são nanopartículas esféricas e a vesícula consiste em uma bicamada fosfoslipídica com proteínas e lipopolissacarídeo (LPS) e o lúmen da vesícula contém componentes periplásmicos da bactéria (Kulp e Kuehn 2010; Schwechheimer e Kuehn 2015).

[003] Visto que, as OMVs são altamente semelhantes à membrana externa das bactérias, não idênticas, e caracteristicamente cheias de padrões moleculares associados a patógeno, essas vesículas foram usadas com êxito como vacina (Gorringe e Pajon 2012; Holst et al.

2009). Essas vacinas foram produzidas por extração de vesículas a partir da membrana externa bacteriana. Desta forma, o LPS pode ser desintoxicado e vesículas são artificialmente formadas (Fredriksen et al. 1991; Zollinger et al. 1979). Entretanto, a extração de vesículas é desvantajosa, visto que, diferenças no proteoma de OMVs extraídas (eOMV) e OMVs espontâneas (sOMVs) foram encontradas (Lappann et al. 2013; van de Waterbeemd et al.

2013a). Além disso, os métodos de extração não são mais necessários para desintoxicação, visto que, a possibilidade de desintoxicação molecular (van der Ley et al. 2001), que é a base para o uso de OMVs liberados espontaneamente. O uso de vesículas liberadas espontaneamente simplifica a purificação de OMVs, visto que, obsoleta a etapa de extração no processamento a jusante do produto de vacina (Lappann et al. 2013; van de Waterbeemd et al. 2013a).

[004] A produção de sOMV viável não foi direta.

Apesar da pesquisa sobre OMVs nas últimas quatro décadas, o mecanismo exato que aciona a liberação de OMVs por uma bactéria permanece desconhecido. Como a composição das OMVs difere da membrana externa das bactérias, geralmente se pensa que a liberação de vesículas não é um processo estocástico (Schwechheimer et al. 2013). A biogênese das OMVs foi descrita por vários modelos, embora ainda não esteja claro se existe um mecanismo compartilhado. Pensa-se que a biogênese de OMV seja baseada no pequeno acúmulo de peptideoglicano no periplasma, menos ancoragem da membrana externa na camada de peptideoglicano ou repulsão da carga do antígeno O. Esses modelos são revisados em (Haurat et al. 2015) e (Schwechheimer e Kuehn 2015). A produção de sOMV por Neisseria meningitidis pode ser aumentada pela exclusão do gene rmpM que ancora a membrana externa na camada peptidoglicana (van de Waterbeemd et al. 2010). A redução da ligação entre a membrana externa e a camada peptideoglicana foi usada para aprimorar a produção de sOMV de E. coli (Bernadac et al., J Bacteriol.

1998,180(18):4872-8).

[005] Trabalho recente de Van de Waterbeemd et al.

(2013b) mostrou que a depleção de cisteína aciona a liberação de OMV por N. meningitidis. Van de Waterbeemd et al. mostrou que a liberação de OMVs acionou a depleção de cisteína é provavelmente mediada através de estresse oxidativo que é causado pela depleção de cisteína. De fato, o estresse oxidativo induzido pelas adições de pulsos de peróxido ao meio teve um efeito semelhante, mas transitório, visto que, sOMVs são liberadas temporariamente depois de cada adição de peróxido. A adição de peróxido de hidrogênio, entretanto, não é viável para processos de produção de OMV escalonáveis, visto que, adição de peróxido de hidrogênio a uma cultura bacteriana resultará em morte celular significativa e lise de bactérias.

[006] Portanto, ainda é necessário processos mais eficientes e escaláveis para a produção de sOMVs.

Sumário da Invenção

[007] Em um primeiro aspecto, a invenção se refere a um processo para produzir vesículas de membrana externa bacteriana liberadas espontaneamente (OMVs), em que o processo compreende as etapas de: a) cultivar uma população de uma bactéria gram-negativa, cujo cultivo compreende a estimulação da liberação de OMVs pela aplicação de uma tensão de oxigênio dissolvido (DOT) que é mais alta do que uma DOT fisiológica de 30% de saturação do ar medida a 35 °C; e, b) recuperar a OMV liberada em a), em que a recuperação pelo menos compreende a remoção das bactérias a partir da OMVs. Preferencialmente, no processo a DOT aplicada para estimular a liberação de OMVs é pelo menos 31, 32, 35, 40, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150 ou 200% de saturação do ar medida a 35 °C, e em que preferencialmente, a DOT aplicada para estimular a liberação de OMVs é menor do que 350, 325, 300, 275, 250, 225, 205 ou 185% de saturação do ar medida a 35 °C.

[008] Um processo da invenção preferencialmente é um processo em que cultivar a bactéria gram-negativa compreende um modo que emprega adicionar um meio de alimentação, em que o dito modo é selecionado a partir de modo de lote alimentado, modo semicontínuo, e modo contínuo. Com a maior preferência, o processo compreende: a) uma primeira fase em que a biomassa da bactéria gram- negativa é acumulada em uma primeira DOT; e, b) uma segunda fase em que a liberação de OMVs a partir da biomassa acumulada em a) é estimulada pela aplicação de uma segunda DOT que é mais alta do que a primeira DOT; em que preferencialmente, a primeira DOT é uma DOT fisiológica, preferencialmente uma DOT de menos do que 50, 40, 35 ou 32% de saturação do ar medida a 35 °C.

[009] Nos processos da invenção, a bactéria gram- negativa preferencialmente tem pelo menos um de: a) uma modificação genética que faz com que a bactéria produza um LPS com toxicidade reduzida, mas que LPS retenha pelo menos parte de sua atividade adjuvante; preferencialmente a dita modificação genética é uma modificação que diminui ou realiza knockout da expressão de um ou mais genes selecionados a partir dos genes lpxL1 e lpxL2 ou homólogos dos mesmos e o gene lpxK ou um homólogo do mesmo e/ou é uma modificação que afeta a expressão de um ou mais genes lpxE e/ou pagL; b) uma modificação genética que faz com que a bactéria sobreproduza OMVs em comparação com uma bactéria tipo selvagem correspondente sem a modificação genética, em que a modificação genética é uma modificação que atenua a atividade de ligação ao peptideoglicano de uma ou mais proteínas compreendendo um sítio associado ao peptideoglicano, preferencialmente a dita modificação genética é uma modificação que diminui ou realiza knockout da expressão de um ou mais genes selecionados a partir do grupo consistindo nos genes tolQ, tolR, tolA, tolB, tolRA,

rmpM e ompA; e, c) uma modificação genética que diminui ou realiza knockout da expressão de um produto genético,

preferencialmente, um produto genético selecionado a partir do grupo que consiste em cps, um produto genético de biossíntese de lipídio A, PorA, PorB e OpA.

A bactéria gram-negativa preferencialmente pertence a um gênero selecionado a partir do grupo consistindo nos gêneros

Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Salmonella, Vibrio,

Shigella, Haemophilus, Pseudomonas, Escherichia, Moraxella,

Klebsiella e Acinetobacter preferencialmente a bactéria é de uma espécie selecionada a partir do grupo que consiste em Neisseria meningitidis, Neisseria lactamica, Neisseria gonorrhoeae, Helicobacter pylori, Salmonella typhi,

Salmonella typhimurium, Vibrio cholerae, Shigella spp.,

Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Pseudomonas aeruginosa, Escherischia coli, Moraxella catarrhalis,

Klebsiella pneumoniae e Acinetobacter baumannii. Em uma modalidade, a bactéria gram-negativa expressa um antígeno estranho à dita bactéria gram-negativa. Em uma outra modalidade, a bactéria gram-negativa expressa vários antígenos, em que preferencialmente os diferentes antígenos são escolhidos de modo que as principais variantes do antígeno sejam incluídas para aprimorar a cobertura da vacina.

[010] Preferencialmente, em um processo de acordo com a invenção, as OMVs são esterilizadas, preferencialmente por esterilização por filtro, preferencialmente usando um filtro com poros de menos do que cerca de 0,3 micrômetro.

[011] Um processo de acordo com a invenção pode ainda compreender a etapa de combinação a OMVs com um excipiente farmaceuticamente aceito e, opcionalmente, um adjuvante.

[012] Em um processo de acordo com a invenção as OMVs são preferencialmente para o uso em vacinas.

[013] Em um segundo aspecto, a invenção pertence as OMVs obteníveis pelo processo da invenção.

[014] Em um terceiro aspecto, a invenção pertence a uma composição farmacêutica compreendendo OMVs de acordo com, ou produzidas em um processo da invenção e um excipiente farmaceuticamente aceito e, opcionalmente, um adjuvante.

[015] Em um quarto aspecto, a invenção pertence às ditas OMVs ou a dita composição farmacêutica para o uso como um medicamento, preferencialmente no tratamento de meningite.

Descrição da Invenção

[016] Surpreendentemente, descobrimos que um parâmetro de controle comum de cultivos de biorreator pode ser usado de maneira direta e confiável para acionar a liberação de vesículas de membrana externa espontâneas (OMV).

[017] Em um primeiro aspecto, a invenção se refere a um processo para produzir vesículas de membrana externa bacteriana liberadas espontaneamente. Preferencialmente, o processo compreende a etapa de: a) cultivar uma população de uma bactéria gram-negativa, cujo cultivo compreende a estimulação da liberação de OMV pela aplicação de uma tensão de oxigênio dissolvido (DOT) que é mais alta do que uma DOT fisiológica de 30%. O método ainda preferencialmente compreende a etapa de: b) recuperar a OMV liberada em a), em que preferencialmente, a recuperação pelo menos compreende a remoção das bactérias a partir da OMV.

[018] Como usado aqui o termo OMVs para “Vesículas de membrana externa” denota esferas liberadas de membrana externa com conteúdo periplásmico que contêm moléculas biologicamente ativas (toxinas, proteínas, DNA) produzidas a partir da membrana externa de bactérias gram-negativas.

As OMVs são algumas vezes também denominados como “bolhas”.

Essas vesículas estão frequentemente envolvidas em processos patogênicos, visto que, contribuem para a liberação a longa distância de fatores de virulência bacteriana, promovem inflamação e estimulam resposta imune do hospedeiro. As OMVs formadas por bactérias também podem mediar eventos de troca intercelular incluindo sinalização célula a célula, troca de proteína e DNA (consultar, por exemplo, Berleman J et al., 2013).

[019] O cultivo de uma população de uma bactéria gram-negativa em um processo de acordo com a invenção pode ser realizado por qualquer método conhecido pelos técnicos no assunto. Um meio preferido para o cultivo é um meio definido quimicamente, por exemplo, como descrito em Baart et al., 2003. A temperatura pode ser variada em qualquer temperatura como entre cerca de 30 °C e cerca de 40 °C. O pH pode ser variado em qualquer pH como a um pH de cerca de 5,5 a cerca de 8,5. Condições de cultura preferidas compreendem cultura a cerca de 35 °C a pH 7,2.

[020] Uma população de uma bactéria é aqui definida como pelo menos duas bactérias, preferencialmente do mesmo gênero e espécie.

[021] O método da invenção compreende a aplicação de uma DOT aumentada para estimular a liberação de OMVs. A DOT que é aplicada para estimular a liberação de OMVs preferencialmente é uma DOT que induz (extracelular) estresse oxidativo na bactéria, como pode ser determinado pelo perfil proteômico das bactérias. Preferencialmente, a DOT que é aplicada para estimular a liberação de OMV é mais alta do que uma DOT fisiológica para a bactéria, que usualmente é uma DOT de cerca de 30%. A tensão de oxigênio dissolvido é aqui expressa como porcentagem de saturação do ar quando medido a 35 °C. A DOT pode ser medida, e monitorada durante a fermentação, usando um sensor de DOT (isto é, oxigênio) como é conhecido na técnica. O parâmetro de DOT é calculado por meio de um eletrodo de oxigênio e técnicas laboratoriais convencionais. Assim, 100% de saturação do ar correspondem a uma solução que é saturada com ar, enquanto 0% corresponde a uma solução que foi completamente purgada com um gás inerte como nitrogênio. A calibração é realizada sob condições de pressão de padrão atmosférico, e com ar convencional compreendendo aproximadamente 21% de oxigênio.

[022] Durante a fermentação, a DOT pode ser controlada por meios conhecidos na técnica por si, incluindo por exemplo, velocidade de agitação, taxa de aeração, fração de oxigênio no fornecimento e/ou pressão do ar. Preferencialmente, nos métodos da invenção, a DOT não é aumentada pelas adições (pulsadas) de peróxido de hidrogênio. Em um processo preferido, a DOT aplicada para estimular a liberação de OMV é pelo menos 31, 32, 35, 40, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150 ou 200%.

Preferencialmente, a DOT aplicada para estimular a liberação de OMV é menor do que 350, 325, 300, 275, 250, 225, 205 ou 185%. Preferencialmente, no método da invenção, a DOT aplicada para estimular a liberação de OMV é aplicada por pelo menos 10, 20, 40 ou 60 minutos, com a maior preferência por pelo menos 2, 3, 4 ou 6 horas.

[023] Em um processo preferido, o dito cultivo compreende um modo que emprega adicionar um meio de alimentação, em que o dito modo é selecionado a partir de modo de lote alimentado, modo semicontínuo, e modo contínuo. Preferencialmente, esses modos empregam um regime de alimentação em que a liberação espontânea de OMV é otimamente explorada.

[024] Um processo em lote é um modo de cultivo em que todos os nutrientes necessários para o cultivo das células estão contidos no meio de cultura inicial, sem fornecimento adicional de nutrientes adicionais durante a fermentação. Em um processo de lote alimentado, depois de uma fase descontínua, um fase de alimentação ocorre em que um ou mais nutrientes são fornecidos à cultura por alimentação. Um propósito de alimentação de nutriente pode ser aumentar a quantidade de biomassa (assim chamado “Processo de cultivo de alta densidade celular” ou “HCDC”) de modo a aumentar o rendimento de OMVs liberadas também.

Embora na maioria dos processos de cultivo o modo de alimentação seja crítico e importante, a presente invenção não é restrita em relação a um certo modo de alimentação.

[025] A alimentação de nutrientes pode ser feita em um modo contínuo ou de lote de acordo com os métodos conhecidos na técnica. O modo de alimentação pode ser predefinido (isto é, a alimentação é adicionada independentemente de parâmetros de processo reais), por exemplo, constante linear, aumento linear, aumento gradual ou seguindo uma função matemática, por exemplo, alimentação exponencial.

[026] Um processo de cultivo semicontínuo no significado da invenção é um processo que é operado em sua primeira fase como um processo de lote alimentado (isto é, uma fase descontínua seguida por uma fase de alimentação).

Depois que um certo volume ou biomassa foi obtido (isto é, usualmente quando o limite superior de volume do fermentador é obtido), uma parte significativa de caldo celular contendo as OMVs é removida a partir do biorreator.

Subsequentemente, a alimentação é iniciada novamente até a biomassa ou volume de caldo de cultura tenha novamente atingido um certo valor. Este método (drenagem de caldo de cultura e repreenchimento pela alimentação) pode ser realizado pelo menos uma vez, e teoricamente indefinidas vezes.

[027] Em um processo preferido, o meio de alimentação é alimentado a uma taxa resultante em uma taxa de crescimento específica que é entre 1,0 e 0,05 da taxa de crescimento específica máxima da bactéria (µmax) no meio de crescimento. Por exemplo, a taxa de crescimento pode ser 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1 ou 0,05 µmax. Em uma modalidade, o processo compreende uma fase durante a qual a taxa de crescimento específica não é mais do que 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1 ou 0,05 µmax, em que preferencialmente a fase durante a qual a taxa de crescimento específica é limitada às taxas anteriormente mencionadas é a fase de produção durante a qual as OMVs são liberadas de modo a facilitar uma DOT alta durante a fase de produção. Durante a fase de produção não existe necessidade de aplicar uma taxa de crescimento específica positiva mínima porque nenhum crescimento, ou mesmo um taxa de crescimento negativa observada, durante a fase de produção pode ser viável se isso resultar em um rendimento de OMV maior.

[028] Em um processo preferido da invenção, o processo compreende: a) uma primeira fase em que a biomassa da bactéria gram-negativa é acumulada em uma primeira DOT; e, b) uma segunda fase em que a liberação de OMVs a partir da biomassa acumulada em a) é estimulada pela aplicação de uma segunda DOT que é mais alta do que a primeira DOT.

Preferencialmente, na primeira fase a DOT é controlada a um nível que suporta o crescimento da bactéria. Com a maior preferência, a primeira DOT aplicada na primeira fase suporta acúmulo de biomassa bom ou ótimo da bactéria. A primeira DOT aplicada na primeira fase, portanto, preferencialmente é uma DOT fisiológica. Preferencialmente, a primeira DOT é uma DOT de 100% ou menos, preferencialmente uma DOT de menos do que 75%, 50, 40, 35 ou 32% de saturação do ar medida a 35 °C. A segunda fase do processo compreende um estágio em que uma segunda DOT é aplicada que é mais alta do que a primeira DOT para estimular a liberação de OMVs a partir da biomassa acumulada na primeira fase. A segunda DOT pode, portanto, ser uma DOT aplicada para estimular a liberação de OMVs como descrito aqui acima. Preferencialmente, a segunda DOT é pelo menos um fator 1,05, 1,1, 1,2, 1,5, 2, 5, ou 10 mais alto do que a primeira DOT.

[029] Preferencialmente, em qualquer um dos processos de acordo com a invenção a bactéria gram-negativa tem uma modificação genética que faz com que a bactéria produza um LPS com toxicidade reduzida mas que LPS retenha pelo menos parte de sua atividade adjuvante; preferencialmente a dita modificação genética é uma modificação que diminui ou realiza knockout da expressão de um ou mais genes selecionados a partir dos genes lpxL1 e lpxL2 ou homólogos dos mesmos e o gene lpxK ou um homólogo do mesmo e/ou é uma modificação que afeta a expressão de um ou mais genes lpxE e/ou pagL. Preferencialmente, a bactéria gram-negativa tem pelo menos mutações para diminuir ou realizar knockout da expressão de um gene lpxL1 que codifica uma sequência de aminoácido tendo pelo menos cerca de 30% de identidade de sequência, com a maior preferência pelo menos cerca de 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1.

[030] Um LPS que é modificado para ter menos toxicidade é aqui entendido como um LPS que é modificado para ter menos toxicidade do que a toxicidade de um LPS tipo selvagem correspondente. Preferencialmente, o LPS modificado tem menos do que cerca de 90, 80, 60, 40, 20, 10, 5, 2, 1, 0,5 ou 0,2% da toxicidade do LPS tipo selvagem correspondente. As toxicidades de tipo selvagem e vários LPSs modificados com toxicidade reduzida podem ser determinados em qualquer ensaio adequado conhecido pelos técnicos no assunto. Um ensaio preferido para determinar a toxicidade, isto é, a atividade biológica do LPS é o teste WEHI para a indução de TNF-alfa na linha celular de macrófago MM6 (Espevik e Niessen, 1986, J. Immunol. Methods 95:99-105; Ziegler- Heitbrock et al., 1988 Int.J. Cancer 41:456-461). Embora seja preferido que o LPS da bactéria gram-negativa (ou sua Porção lipídica A) tenha toxicidade reduzida, é ainda preferido que o LPS retenha pelo menos parte de sua atividade imunoestimuladora, isto é, atividade adjuvante. Assim, o LPS com toxicidade reduzida da bactéria gram-negativa a ser usada na invenção preferencialmente tem pelo menos cerca de 10, 20, 40, 80, 90 ou 100% da atividade imunoestimuladora do LPS tipo selvagem correspondente, pelo que a atividade imunoestimuladora é determinada medindo-se a produção de pelo menos uma citocina ou a expressão de pelo menos uma molécula coestimulatória após o cocultivo de células dendríticas (DC).

[031] A expressão heteróloga de pagL em N.

meningitidis resulta em uma estrutura de LPS penta-acilada atenuada diferente, que é ainda capaz de induzir ativação de TLR4 e induz uma produção de citocina polarizada de TRIF em uma linha celular monocítica humana (Pupo et al., 2014, J. Biol. Chem. 289:8668-8680).

[032] Preferencialmente, em qualquer um dos processos de acordo com a invenção a bactéria gram-negativa tem uma modificação genética que faz com que a bactéria sobreproduza as OMVs em comparação com uma bactéria tipo selvagem correspondente sem a modificação genética, em que a modificação genética é uma modificação que atenua a atividade de ligação ao peptideoglicano de uma ou mais proteínas compreendendo um sítio associado ao peptideoglicano, preferencialmente a dita modificação genética é uma modificação que diminui ou realiza knockout da expressão de um ou mais genes selecionados a partir do grupo consistindo nos genes tolQ, tolR, tolA, tolB, tolRA, rmpM e ompA. Uma modificação genética preferida que aumenta a produção de OMV é uma modificação genética que reduz ou elimina a expressão de um gene que codifica uma proteína âncora entre membrana externa e peptideoglicano de modo a aumentar a formação de vesícula e, desse modo, aumentar rendimento de OMV. Uma modificação genética adequada para este propósito, por exemplo, reduz ou elimina a expressão de um homólogo de OmpA, que são comumente encontrados em bactérias gram-negativas, por exemplo, a proteína RmpM em Neisseria spp. (Steeghs et al., 2002 Cell Microbiol, 4:599- 611; van de Waterbeemd et al., 2010 Vaccine, 28:4810- 4816)). Assim, preferencialmente, a bactéria geneticamente modificada tem uma modificação genética que reduz ou elimina expressão de um gene rmpM ou um homólogo do mesmo.

Preferencialmente, o gene rpmM ou homólogo do mesmo codifica uma sequência de aminoácido tendo pelo menos cerca de 30% de identidade de sequência, com a maior preferência pelo menos cerca de 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2.

[033] Preferencialmente, em qualquer um dos processos de acordo com a invenção, a bactéria gram- negativa pertence a um gênero selecionado a partir do grupo consistindo nos gêneros Neisseria, Bordetella, Helicoibacter, Salmonella, Vibrio, Shigella, Haemophilus, Pseudomonas, Escherichia Moraxella, Klebsiella e Acinetobacter. Com a maior preferência, a bactéria é de uma espécie selecionada a partir do grupo que consiste em Neisseria meningitidis, Neisseria lactamica, Neisseria gonorrhoeae, Helicobacter pylori, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Vibrio cholerae, Shigella spp., Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e Moraxella catarrhalis. Com a maior preferência, a bactéria gram-negativa é uma cepa Neisseria meningitidis que é uma réplica ou derivado de H44/76 isolado do sorogrupo B de N. meningitidis (Holten et al., 1979, J Clin Microbiol, 9(2): 186-188; van den Dobbelsteen et al., 2007, Vaccine, 25(13):2491-6).

[034] Preferencialmente, em qualquer um dos processos de acordo com a invenção, a bactéria gram-

negativa tem uma ou mais mutações para diminuir ou realizar knockout da expressão de um produto genético preferencialmente, um produto genético selecionado a partir do grupo que consiste em cps, porA, porB e opA; muitas dessas mutações são revisadas em WO02/09746.

[035] Para diminuir ou realizar knockout da expressão um produto genético definido aqui, os técnicos no assunto tem um tem uma infinidade de ferramentas conhecidas disponíveis. É prática rotineira para os técnicos no assunto escolher uma estratégia adequada para introduzir uma modificação adequada em um polinucleotídeo, a fim de diminuir ou realizar knockout da expressão de um produto genético funcional. Por exemplo, métodos para mutagênese in vitro são descritos em Sambrook et al. (Clonagem molecular, A laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, EUA, 1989). Os métodos correspondentes também estão disponíveis comercialmente na forma de kits (por exemplo, kit de mutagênese direcionada ao sítio Quikchange por Stratagene, La Jolla, EUA). A exclusão de um polinucleotídeo pode, por exemplo, ser realizada pela tecnologia de substituição gênica que é bem conhecida pelos técnicos no assunto.

[036] Preferencialmente, em qualquer um dos processos de acordo com a invenção, a bactéria gram- negativa expressa vários subtipos de PorA, em que preferencialmente a população compreende mais do que uma cepa da bactéria gram-negativa, e em que cada cepa expressa diferentes subtipos de PorA. Preferencialmente, a população de uma bactéria gram-negativa compreende várias espécies de bactérias gram-negativas de modo que vários sorotipos de antígeno são expressos e finalmente acabam na preparação de OMV. Com a maior preferência, uma espécie de bactérias gram-negativas expressa vários sorotipos de um antígeno.

Quando a população de bactérias compreende um N.

meningitidis, a população preferencialmente compreende um N. meningitidis que expressa vários sorotipos de antígeno de PorA; com a maior preferência, a população de bactérias compreende várias espécies de N. meningitidis, cada espécie expressando vários sorotipos de antígeno de PorA.

Preferencialmente, a população de uma bactéria gram- negativa compreende três cepas trivalentes de PorA de N.

meningitidis, expressando um total de 9 subtipos de PorA (van der Ley et al., 1995, Vaccine, 13 (4):401–7; Claassen et al. 1996, Vaccine, 14 (10):1001–8; van den Dobbelsteen et al., 2007, supra).

[037] Preferencialmente, em qualquer um dos processos de acordo com a invenção, a bactéria gram- negativa expressa um antígeno estranho à dita bactéria gram-negativa. O antígeno estranho pode ser expressado por qualquer meio conhecido pelos técnicos no assunto;

preferencialmente o antígeno estranho é direcionado à OMV.

Preferencialmente, o antígeno estranho ou uma parte do mesmo é fundido a ou compreendido em sorogrupo B no N.

meningitidis por porA ou uma parte do mesmo, ou é fundido à parte N-terminal de um lipoproteína exposta à superfície de uma bactéria gram-negativa, como por exemplo, descrito em WO2016/193370. O antígeno estranho pode ser um antígeno de um patógeno (agente infeccioso) e/ou de um tumor. Por exemplo, o antígeno pode ser de patógenos e agentes infecciosos como vírus, bactérias, fungos e protozoários.

[038] Dentro do escopo da invenção, é possível culturar ou de outro modo fornecer vários diferentes cepas da bactéria gram-negativa, cada cepa expressando um ou mais antígenos que diferem a partir dos antígenos expressados nas outras cepas, por exemplo, um único ou vários sorotipos de antígeno, e extrair OMVs simultaneamente de uma ou mais populações agrupadas do dito bactérias, de modo a produzir vacinas multivalentes. Também está dentro do escopo da presente invenção extrair as OMVs separadamente de diferentes populações de bactérias e, em seguida, preferencialmente reservar as preparações de OMVs. Está ainda dentro do escopo da invenção que diferentes espécies de bactérias gram-negativas são cultivadas juntas em uma única, população mista ou separadamente em populações individuais ou mesmo em uma combinação de populações individuais e mistas.

[039] Em um processo de acordo com a invenção, as recuperações das OMVs, podem ser realizadas por qualquer método conhecido pelos técnicos no assunto.

Preferencialmente, as recuperações das OMVs pelo menos compreendem a remoção das bactérias a partir das OMVs. Um método preferido para remoção de bactérias a partir das OMVs inclui uma ou mais etapas de filtração, opcionalmente incluindo etapa de filtração estéril. Alternativamente, as bactérias podem ser removidas a partir das OMVs por centrifugação, opcionalmente seguida por filtração estéril do sobrenadante.

[040] A preparação de OMV obtida por qualquer um dos processos de acordo com a presente invenção pode convenientemente ser armazenada para uso futuro, na forma liofilizada ou em solução, ou congelada em solução. Em qualquer um dos processos de acordo com a presente invenção, um ou vários compostos podem ser adicionados à preparação de OMV, como um estabilizador (coloidal), como sacarose, a fim de impedir a agregação e/ou um conservante como o tiomersal, a fim de impedir o crescimento microbiano.

[041] Preferencialmente, em qualquer um dos processos de acordo com a invenção, as OMVs são esterilizadas, preferencialmente por esterilização por filtro, preferencialmente usando um filtro com poros de menos do que cerca de 0,3 micrômetro. Preferencialmente, a esterilização é realizada durante a etapa b). A esterilização por filtro, também chamada de filtração estéril, é aqui definida como filtrar um composto de interesse através de um filtro, preferencialmente com poros entre cerca de 0,5 e 0,2 micrômetro, de modo que o filtrado compreendendo o composto de interesse não compreenda nenhum microorganismo ou que a quantidade de microrganismos no filtrado é reduzida para um nível aceitável baixo.

[042] Depois das recuperações ou simultaneamente com recuperações, a preparação de OMV pode ser purificada.

A purificação pode compreender quaisquer métodos conhecidos pelos técnicos no assunto. Preferencialmente, pelo menos um método a partir do seguinte grupo é aplicado: ultrafiltração como descrito anteriormente aqui e/ou diafiltração para trocar o meio, por exemplo, para remover o agente quelante de metal a partir do meio de extração e/ou para preparar a preparação de OMV; degradação de ácidos nucleicos como ácido deoxirribonucleico (DNA) e ácido ribonucleico (RNA), que pode ser realizado enzimaticamente usando uma ou mais nucleases adequadas, preferencialmente usando Benzonase® (Merck, Holanda); clarificação por filtração, preferencialmente usando um filtro com um tamanho de poro entre cerca de 0,5 µM e 1,0 µM; filtração em gel (como Cromatografia por Exclusão de Tamanho; material da coluna Sepharose 6 Fast Flow; OMVs são recuperados do volume vazio da coluna); filtração estéril como descrito anteriormente aqui. Preferencialmente, pelo menos a filtração estéril é aplicada. Preferencialmente, mais do que um método de purificação é aplicado.

Preferencialmente, os seguintes métodos são aplicados consecutivamente: ultrafiltração (por exemplo, corte de 100 ou 300 kDa), diafiltração (por exemplo, corte de 100 ou 300 kDa), degradação enzimática de ácidos nucleicos, clarificação, filtração em gel e filtração estéril, embora não necessariamente nesta ordem. Um processo preferido de acordo com a invenção não inclui ultracentrifugação.

[043] A degradação de ácidos nucleicos usando Benzonase® é preferencialmente realizada em um tampão de pH 8,4+/−0,4, compreendendo entre cerca de 0,1 a 10 U Benzonase®/ml e entre cerca de 1 a 10 mM de Mg2+, a 4 °C. a 37° C. por 1 a 20 horas.

[044] Preferencialmente, em qualquer um dos processos de acordo com a invenção a OMV são para o uso em vacinas. A vacina pode ser usada para imunização (elevando uma resposta imune) ou vacinação de um indivíduo, preferencialmente um mamífero, preferencialmente um ser humano. Na vacina, as OMVs podem ser combinadas com um outro antígeno para preparar uma vacina mista, por exemplo,

em combinação com vacinas contra Neisseria meningitidis sorogrupo A, C, W135, Y, doença pneumocócica, difteria, tosse convulsa, poliomielite, VSR, tétano e cólera.

[045] Preferencialmente, em qualquer um dos processos de acordo com a invenção, o volume da cultura em a) e/ou o volume do meio em b) é pelo menos cerca de 10 l, com a maior preferência pelo menos cerca de 1 l, 2 l, 5 l, 10 l, 20 l, 40 l, 60 l, 80 l, 100 l, 200 l, 300 l, 400 l, 500 l, 800 l, 1.500 l, 5.000 l, 10.000 l, 20.000 l ou

40.000 l.

[046] A cultura pode ser realizada em várias etapas, incluindo, entre outras, uma pré-cultura ou cultura de inóculos e uma cultura principal. A cultura pode ser realizada em qualquer escala, incluindo mas não se limitando ao cultivo em frascos agitadores, cultivo em pequena ou larga escala (incluindo cultivo contínuo, em lote, em lote alimentado, ou estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industriais.

[047] A presente invenção ainda fornece um processo que ainda compreende a etapa de combinar as OMVs com um excipiente farmaceuticamente aceito e, opcionalmente, um adjuvante. Os ‘carreadores farmaceuticamente aceitáveis’ típicos incluem qualquer carreador que não induza a produção de anticorpos prejudiciais ao indivíduo que recebe a composição. Os carreadores adequados são tipicamente macromoléculas grandes, de metabolismo lento, tais como proteínas, polissacarídeos, ácidos poliláticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos e agregados lipídicos (como gotículas de óleo ou lipossomas).

Tais carreadores são bem conhecidos pelos técnicos no assunto.

[048] Os adjuvantes são aqui definidos para incluir qualquer substância ou composto que, quando usado em combinação com um antígeno, para imunizar um indivíduo, preferencialmente um mamífero, preferencialmente um ser humano, estimula o sistema imunológico, desse modo provocando, melhorando ou facilitando a resposta imune contra o antígeno, preferencialmente sem gerar uma resposta imune específica ao próprio adjuvante. Os adjuvantes preferidos melhoram a resposta imune contra um dado antígeno por pelo menos um fator de 1,5, 2, 2,5, 5, 10 ou 20, em comparação com a resposta imune gerada contra o antígeno sob as mesmas condições mas na ausência do adjuvante. Os testes para determinar o aumento médio estatístico da resposta imune contra um dado antígeno como produzido por um adjuvante em um grupo de animais ou seres humanos over um grupo de controle correspondente estão disponíveis na técnica. O adjuvante preferencialmente é capaz de melhorar a resposta imune contra pelo menos dois antígenos diferentes.

[049] Em um segundo aspecto, a presente invenção fornece OMVs obteníveis por qualquer um dos processos de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção.

Preferencialmente, a dita OMV é um produto diretamente obtido ou derivado de qualquer um dos processos de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção.

[050] A preparação de OMV obtenível por qualquer um dos processos de acordo com a presente invenção pode convenientemente ser usada para a preparação de um medicamento, preferencialmente um medicamento para o tratamento de meningite, preferencialmente o dito medicamento é uma vacina contra infecção por N.

meningitidis. Preferencialmente, a dita preparação de OMV é um produto diretamente obtido ou derivado de qualquer um dos processos de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção.

[051] A presente invenção ainda fornece uma composição farmacêutica compreendendo OMVs obteníveis por qualquer um dos processos de acordo com a presente invenção. Além das OMVs, a composição farmacêutica compreende um excipiente farmaceuticamente aceitável, como um carreador, um adjuvante, um agente estabilizante, um agente osmótico, um agente tamponante e/ou um agente dispersante, por exemplo, como descrito anteriormente aqui.

Preferencialmente, a dita composição farmacêutica é um produto diretamente obtido ou derivado de qualquer um dos processos de acordo com a presente invenção.

[052] Em um aspecto adicional, a presente invenção pertence a uma OMV obtenível por qualquer um dos processos de acordo com a presente invenção, ou a uma composição farmacêutica compreendendo tais OMVs, para o uso como um medicamento. Preferencialmente, o medicamento é para o uso no tratamento de uma doença infecciosa ou um tumor.

Preferencialmente, o dito medicamento é uma vacina contra infecção por N. meningitidis.

[053] A presente invenção ainda fornece um método para conseguir em uma resposta imune em um indivíduo, preferencialmente uma resposta imune contra um patógeno causando uma doença infecciosa, por exemplo, N.

meningitidis, ou contra um antígeno associado a tumor, o método compreendendo a etapa de administrar ao dito indivíduo uma quantidade eficaz de OMVs obteníveis por qualquer um dos processos de acordo com a presente invenção ou administrar ao dito indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo as ditas OMVs.

Preferencialmente a composição farmacêutica é uma vacina, preferencialmente uma vacina contra infecção por N.

meningitidis.

[054] A menos que estabelecido de outro modo, a prática da invenção utilizará métodos convencionais padrão de biologia molecular, virologia, microbiologia ou bioquímica. Tais técnicas são descritas em Sambrook et al.

(1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2ª edição), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press; em Sambrook e Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Terceira Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; nos volumes 1 e 2 de Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, EUA; e nos volumes I e II de Brown (1998) Molecular Biology LabFax, segunda edição, Academic Press (UK); Oligonucleotide Synthesis (editor de N. Gait); Nucleic Acid Hybridization (Hames e Higgins, eds.).

[055] Neste documento e em suas reivindicações, o verbo “compreender” e suas conjugações é usado em seu sentido não limitativo para significar que itens após a palavra estão incluídos, mas itens não mencionados especificamente não são excluídos. Além disso, a referência a um elemento pelo artigo indefinido “um” ou “uma” não exclui a possibilidade de mais de um elemento estar presente, a menos que o contexto exija claramente que exista um e apenas um dos elementos. O artigo indefinido “um” ou “uma” geralmente significa “pelo menos um”.

[056] A palavra “sobre” ou “aproximadamente” quando usada em associação com um valor numérico (por exemplo, cerca de 10) significa preferencialmente que o valor pode ser o valor fornecido (de 10) mais ou menos 0,1% do valor.

[057] Todas as referências de patentes e literatura citadas na presente especificação são aqui incorporadas por referência na sua totalidade.

[058] A presente invenção é ainda descrita pelos exemplos a seguir que não devem ser interpretados como limitativos do escopo da invenção.

Descrição das Figuras

[059] A Figura 1. Cultivo de acelerostato de N.

meningitidis. O gráfico A mostra o aumento da taxa de diluição (linha preta, aD de 0,0055 h-2), a taxa de diluição medida real (diamantes), e a taxa de evolução de dióxido de carbono no tempo (linha verde). O gráfico B mostra a produtividade de sOMV específica resultante em diferentes taxas de diluição para o acelerostato (preto) e quimiostato (cinza).

[060] A Figura 2. A influência de aumento de tensão de oxigênio dissolvido no crescimento de N.

meningitidis. O gráfico A mostra o controle do oxigênio dissolvido no changestat de DOT, onde o ponto de ajuste de DOT foi aumentado em 1% por hora. O efeito da DOT elevada no crescimento é mostrado no Gráfico B, enquanto ambas as bactérias são capazes de lidar com altos níveis de DOT.

Verificou-se que a liberação de vesículas aumenta com o aumento de DOT (Gráfico C).

[061] A Figura 3. Alta tensão de oxigênio dissolvido induz liberação de OMV em culturas descontínuas de N. meningitidis. As curvas de crescimento de culturas descontínuas de N. meningitidis controladas a 30% e 100% de saturação do ar mostram crescimento semelhante (Gráfico A).

O aumento da concentração de oxigênio mostrou induzir um nível mais alto de liberação de vesícula (Gráfico B). Os gráficos são a sobreposição de duas culturas replicadas para permitir praticamente pontos de dados suficientes durante 24h. A primeira réplica consiste em pontos de dados a 0h a 12h de cultivo e a 24h de cultivo, e a segunda réplica a 0h e 15h a 22h.

[062] A Figura 4. A DOT aciona a liberação de OMV em Escherichia coli e Bordetella pertussis. O changestat de DOT de E. coli (A) mostra crescimento nos níveis de DOT até 200% em um changestat de DOT com αDOT = 1,5%/h. A liberação de OMV é diretamente relacionado ao aumento de DOT. B.

pertussis (B) mostra crescimento até DOT de 180% em um experimento de changestat de DOT com αDOT = 1,0%/h, depois do qual as concentrações de dióxido de carbono no efluente gasoso mostraram diminuição.

Exemplos Exemplo 1

Materiais e Métodos Cepas Bacterianas

[063] Um derivado recombinante do H44/76 isolado do sorogrupo B de N. meningitidis (Holten 1979) foi usado neste estudo. A cepa selecionada foi um PorA sem derivado do H44/76 isolado. Esta cepa tem um fenótipo não encapsulado devido ao knockout de siaD, deleção de lpxL1 para atenuar toxicidade de LPS, deleção de rmpM para aprimorar a formação de vesícula (a menos que indicado de outro modo) e mutação de lgtB para promover interações com célula dendríticas (Steeghs et al. 2006; van de Waterbeemd et al. 2010). Esta cepa foi armazenada em glicerol como lotes de inóculos em funcionamento. Todos os cultivos foram realizados em meio de crescimento quimicamente definido (Baart et al. 2007b). O crescimento em sulfato foi realizado depois da adaptação, visto que, a cisteína é a fonte de enxofre preferida (Port et al. 1984). A adaptação foi realizada subcultivando-se a cepa em frascos agitadores com menor concentração de cisteína e crescimento subsequente em meio sem cisteína.

Cultivos de Biorreator

[064] Os cultivos em lotes foram realizados em biorreatores Applikon de fundo côncavo de 5 litros com uma razão H/D de 1,6 com base no volume total. Os cultivos foram operados com volume de trabalho de 3 litros em um controlador Pierre Guerin Trytoni. A temperatura foi controlada a 35 ± 0,5 °C e pH foi controlado a pH 7,2 ± 0,05 usando HCl 1M e NaOH 1M. A tensão de oxigênio dissolvido (DOT) foi controlada a 30% a menos que indicado de outro modo. O sensor de oxigênio amperométrico coberto por membrana (InPro 6850i, Mettler Toledo) foi calibrado a 100% em meio de cultura estéril com ar saturado de 35 °C.

Na primeira fase do cultivo, a DOT é controlada aumentando- se a taxa de agitação (300 a 1.000 RPM) e, em seguida, a fração de oxigênio é aumentada na aeração de espaço livre (1 NL/min) pela adição de oxigênio puro. A taxa de agitação das culturas de 100% de DOT foi ajustada a 1.000 RPM diretamente depois da inoculação depois da qual a DOT foi controlada pela adição de oxigênio puro no espaço livre. As amostras foram tomadas para medições de densidade ópticas e usadas para medições de nutriente e sOMV depois de filtração estéril (0,22 µm) e armazenamento a 4 °C. A composição de efluente gasoso foi analisada por um espectrômetro de massa de processo Thermo Prima δb.

Cultivos Contínuos

[065] Os cultivos contínuos foram realizados em uma configuração semelhante como a configuração de cultivo em lote. O volume de trabalho do biorreator de 5 litros diminuiu de 3,0 litros para 2,0 litros para reduzir o meio de alimentação necessário para os experimentos. O recipiente foi equipado com uma entrada média e dois tubos de saída, um submerso no caldo de cultivo da altura do agitador e um diretamente na interfase de gás líquido. O último permitiu que o controle do volume de trabalho fosse exatamente 2,0 litros a uma velocidade de agitação máxima fixa, independente da formação de espuma. O peso do biorreator, o meio de alimentação e as soluções titulantes de pH foram medidos por balanças e usadas para verificação da taxa de diluição. As amostras foram tomadas por medições de densidade ópticas e análise de efluente gasoso foi semelhante ao cultivo em lote. O biorreator foi controlado com os mesmos laços de controle como usado nos cultivos em lotes. Depois de 8 horas de crescimento, as bombas de alimentação e de sangria foram iniciadas para iniciar uma cultura contínua. Estado estacionário da cultura foi considerado com base em valores de densidade bacteriana estáveis e emissão de dióxido de carbono estável para pelo menos 3 diluições do volume do biorreator.

Cultivo de Acelerostato e Changestat de DOT

[066] Um acelerostato foi iniciado de uma fermentação de quimiostato em estado estacionário a D = 0,03 h-1, operado como descrito na seção anterior, aumentando-se a taxa de diluição linearmente com aD = 0,0055 h-2. A taxa de diluição foi alterada aumentando-se a taxa de influxo média e aumentando igualmente a taxa de efluxo do caldo. A partir do caldo de cultura, as amostras de 50 ml foram coletadas para purificar sOMVs. A amostra foi centrifugada a 4.000 × g por 30 min a 4 °C e o sobrenadante filtrado estéril (unidade de filtro de PES 0,2 µm Nalgene RapidFlow) foi concentrado em 100 kDa filtros de rotação. As sOMVs concentradas foram lavadas com sacarose a 3% tamponada por TrisHCl (pH 7,4) para lavar as proteínas contaminantes. Em seguida, as sOMVs diafiltradas foram centrifugadas a 125.000 × g por 2 h. A sOMV contendo pelota foi dissolvido em TrisHCl de 1 ml a pH 7,4 com sacarose a 3%.

[067] O changestat de DOT foi iniciado de uma cultura de quimiostato. Para isso, uma cultura contínua em estado estacionário com µ = 0,04 h-1 foi obtida como descrito previamente. Durante esse estado estacionário, a DOT foi controlada a 30%, o ponto de partida para o changestat de DOT. Desde o início do changestat de DOT, a DOT foi aumentada linearmente com uma DOT = 1,0%/h.

Quantificação de sOMVs e Metabólitos

[068] As amostras de cultura foram filtradas esterilmente (0,22 µm) antes da medição das sOMVs. As sOMVs foram medidas com uma sonda específica para fosfolipídios FM 4-64 (SynaptoRed C2, Biotium) misturando 50 µl de amostras diluídas ou OMV com uma concentração conhecida com 50 µl de solução de corante (0,05 mM FM 4-64). A fluorescência foi medida diretamente após a mistura desta solução usando um fluorômetro de placa (Synergy MX, Biotek ex480, em650). A concentração de sOMVs nos sobrenadantes da cultura foi calculada a partir de uma curva de calibração que foi com base nas respostas dos padrões (sOMVs correspondentes a 0 a 2,5 mg/l de proteína total e eOMVs correspondentes a 0 a 10 mg/l de proteína total). Nos experimentos de changestat de DOT, a análise de rastreamento de nanopartículas (Malloy e Carr 2006) foi usada para quantificação de sOMV. As medidas estáticas (10 capturas de 30 segundos) foram feitas em um NanoSight NS500 com módulo laser de 488 nm e câmera de sCMOS, que foi calibrada com a atualização da concentração (Malvern Instruments 2015). A temperatura foi controlada a 25 ºC e as capturas foram analisadas com o software NTA 3.2 build

3.2.16. As medições automatizadas de fluxo foram feitas conforme descrito anteriormente (Gerritzen et al. 2017).

[069] O tamanho da OMV foi avaliada por espalhamento dinâmico de luz em um Zetasizer Nano-ZS com o software Zetasizer 7.11 (Malvern Instruments). As medições foram realizadas usando um POP que realiza três medições no modo de retroespalhamento, com duração de medição automática e “busca pela posição ideal” como configuração de posicionamento. A amostra foi considerada como proteína com um índice de refração de absorção de 1,450 e 0,001, em água como dispersante com uma viscosidade de 0,8872 cP e índice de refração de 1,330. Os dados foram processados com o modelo de análise normal.

Resultados Liberação de sOMV como uma Função de Taxa de Crescimento

[070] O aumento da produtividade das OMVs durante a fase estacionária de um cultivo em lote (van de Waterbeemd et al. 2013b) levantou a questão de saber qual era a influência direta da taxa de crescimento na liberação da OMV. Aqui, avaliamos a influência da taxa de crescimento na liberação de OMV em um acelerostato, aumentando lentamente a taxa de diluição de uma cultura de quimiostato de N. meningitidis. A mudança lenta em taxa de diluição (aD) deve manter a cultura em estado estacionário nesse método de acelerostato (Paalme et al. 1995). Neste acelerostato um aD de 0,0055 h-2 foi usado (Figura 1). A taxa de evolução de dióxido de carbono (CER) aumentada simultaneamente com a taxa de diluição até uma taxa de diluição de 0,18 h-1, indicando consequentemente taxa de crescimento aumentada. As OMVs foram produzidas em todo o acelerostato e estas eram semelhantes em tamanho e composição de proteína (dados não mostrados). A taxa de crescimento alterada de 0,03 h-1 a 0,18 h-1 mostrou não influenciar a produtividade de sOMV específica (Figura 1).

As culturas de quimiostato de N. meningitidis em três taxas de crescimento diferentes confirmaram esses resultados. A partir desses resultados, concluímos que reduzir a taxa de crescimento (por exemplo, de 0,18h-1 a 0,03h-1) não é um acionador para a liberação de OMV.

Influência de Estresse Oxidativo Avaliado por um Changestat de DOT

[071] Visto que, a taxa de crescimento reduzida por si só não era aplicável como acionador da liberação da sOMV, hipotetizamos que o estresse oxidativo poderia ser usado para induzir diretamente a liberação da sOMV.

Portanto, avaliamos o efeito do estresse oxidativo na liberação da sOMV. Já mostramos a liberação de vesículas sob adição de peróxido de hidrogênio (van de Waterbeemd et al. 2013b). Este método de adição de peróxido de hidrogênio, entretanto, não é viável para processos de produção escalonáveis de OMVs, uma vez que a adição local de peróxido de hidrogênio a uma cultura bacteriana resultará em morte celular significativa e lise de bactérias. Em seguida, testamos se o estresse oxidativo extracelular poderia ser induzido por altas concentrações de oxigênio dissolvido, que é um dos parâmetros controlados nos cultivos de biorreatores. A DOT é normalmente mantido baixa, para minimizar o estresse causado pela hiperóxia e para impedir a inibição do oxigênio (Haugaard 1968).

Especialmente para um patógeno anaeróbico facultativo, é prática padrão projetar o cultivo com DOT baixa. Por exemplo, nosso cultivo de N. meningitidis para os conceitos de vacina Hexamen e Nonamen foi projetado com níveis de DOT de 30% de saturação do ar (Baart et al. 2007a; Claassen et al. 1996). Aqui, avaliamos o impacto do aumento da DOT no crescimento bacteriano e na liberação da OMV com um método changestat. Para esse changestat de DOT, a DOT de uma cultura de quimiostato é linearmente aumentada para manter uma cultura de estado estacionário (Figura 2A). N.

meningitidis mostra ser capaz de crescer até 150% de DOT impacto sem significativo em medições online (Figura 2B).

Os níveis mais altos de DOT resultam em uma redução rápida de produção de dióxido de carbono e uma concentração de biomassa menor devido a lavagem e lise. A produção de dióxido de carbono é observada até uma DOT de 220%. A liberação de sOMVs é linearmente ligada à concentração de oxigênio no caldo de cultura (Figura 2C). A produção de OMV pode ser aumentada por um fator de 4 pela DOT alta, enquanto preserva o crescimento de bactérias. Os experimentos de changestat de DOT de E. coli e B. pertussis no exemplo 2 mostraram uma correlação semelhante de liberação aumentada de OMV em níveis aumentados de DOT (Figura 4). A indução da produção de OMV em DOT alta é assim aplicável às bactérias gram-negativas em geral.

Produtividade Aprimorada de Culturas Descontínuas em Concentrações de Oxigênio Aumentadas

[072] A alta concentração de oxigênio depois foi aplicada ao cultivo em lote para avaliar a viabilidade do aumento do rendimento de sOMV em uma cultura descontínua.

Uma tensão de oxigênio dissolvido de 100% de saturação do ar foi usado, visto que, esse valor mostrou liberação aumentada de OMV enquanto mantém características de crescimento semelhantes como a 30% de saturação do ar no changestat (Figura 2). As bactérias foram cultivadas em meio definido quimicamente que acionam a liberação de OMV a partir do início da fase estacionária. O perfil de crescimento bacteriano foi semelhante para as culturas descontínuas a 30% e 100% de saturação do ar, mostrando a capacidade de N. meningitidis de lidar com as concentrações de oxigênio mais altas (Figura 3A). A concentração de oxigênio mais alta acionou uma liberação aumentada de vesículas resultando em uma produtividade três vezes maior no final da cultura em comparação com o nível padrão de 30% (Figura 3B). O tamanho dos OMVs permanece constante em toda a cultura e é semelhante entre as duas concentrações (dados não mostrados). Os altos níveis de oxigênio dissolvido também mostraram ser um indutor potente de liberação de sOMV em culturas descontínuas.

Exemplo 2

Materiais e métodos Escherichia coli

[073] E. coli JC8031 (TolRA) foi usado para o changestat de DOT de E. coli (Espesset et al. 1994). Uma cultura de frasco agitador foi iniciada adicionando-se 10 µl de estoque de glicerol congelado (-80 °C) a 100 ml de meio de LB (Cápsulas Grandes: triptona 10 g/l, extrato de levedura 5 g/l, NaCl 10 g/l, MP Biomedicals) e incubar o frasco agitador a 37 °C por 16 horas. Os cultivos de biorreator foram realizados em meio de LB sem antiespumante com uma velocidade de agitação máxima de 600 RPM a 37 °C.

Bordetella pertussis

[074] A cepa de vacina de B. pertussis BP509 foi usada neste estudo (van Hemert 1967). Um meio definido quimicamente foi usado sem sulfato de magnésio (Metz et al.

2017; Thalen et al. 1999). O changestat de DOT foi iniciado de maneira semelhante ao cultivo de N. meningitidis descrito acima, com uma taxa de diluição do changestat de DOT de 0,05 h-1. Um biorreator Applikon de 7 l com volume de trabalho de 5,4 l foi usado com razão H/D de 2,2 com base no volume total.

Resultados

[075] A liberação de OMVs pelos níveis aumentados de DOT não é limitada a N. meningitidis, mas também se estende para outras bactérias gram-negativas. Testamos a influência de estresse oxidativo em B. pertussis e. coli em experimentos de changestat de DOT (Figura 4). Ambas as bactérias mostraram formação aprimorada de vesícula sob DOT aumentada. E. coli foi capaz de lidar com DOT acima de 200% depois de que o experimento foi interrompido. B. pertussis mostrou uma redução na taxa de evolução de dióxido de carbono na DOT acima de 180%, depois de que o cultivo foi concluído.

[076] Além disso, as concentrações de biomassa de ambas as culturas mostraram uma clara diminuição na DOT mais alta. Essa relação também foi observada para N.

meningitidis. Nossa hipótese é de que relativamente mais energia é necessária para manutenção sob estresse oxidativo. Como a configuração experimental era um quimiostato com um suprimento fixo de nutrientes e taxa de diluição, o aumento da necessidade de energia para manutenção é mostrado como uma diminuição na concentração de biomassa, pois menos energia está disponível para o crescimento bacteriano.

[077] Durante o changestat de DOT de B. pertussis, o controle do pH foi afetado pelo bloqueio dos titulares de pH durante o experimento no ponto de ajuste da DOT de cerca de 80% da DOT. Isso resultou em um aumento linear no pH de 7,2 para 7,4 dentro de 3 horas, seguido por uma rápida queda no pH para 5,5 devido à adição excessiva de ácido.

Após essa rápida redução, o ponto de ajuste de pH 7,2 foi rapidamente mantido novamente pelo controlador (dados não mostrados). Surpreendentemente, neste momento, uma alta concentração de sOMV foi observada, mas os efeitos exatos desse desvio são desconhecidos. Esse desvio não impactou a conclusão sobre a relação entre aumento do DOT na liberação da vesícula por B. pertussis, uma vez que o efeito já foi observado entre 30% e 80% da DOT.

Debate sobre os Exemplos 1 e 2

[078] Neste estudo, investigamos sinais externos para induzir a formação de OMV. Os resultados mostram que taxas de crescimento de 0,03 h-1 a 0,18 h-1 não influenciam a biogênese das OMVs. O estresse oxidativo acionou a liberação de OMV e pode ser aplicado diretamente às culturas de biorreatores, aumentando a tensão de oxigênio dissolvido dessas culturas. O estresse oxidativo pode ser aplicado diretamente às culturas de biorreatores, aumentando a DOT dessas culturas. As culturas de changestat de DOT mostram que as bactérias gram-negativas são capazes de lidar com concentrações de oxigênio dissolvido de até 200% de saturação de ar. A DOT elevada aumentou diretamente a liberação da OMV. A produtividade de OMV foi aumentada quatro vezes em uma cultura de mudança de DOT a 120% de DOT e três vezes em uma cultura descontínua controlada a 100% de DOT. A aplicação de DOT aumentado em E. coli e B.

pertussis resulta em aumentos semelhantes na liberação de OMV, indicando que esse método é amplamente aplicável a bactérias gram-negativas.

[079] A produção de OMVs por estresse oxidativo pode ser acionada no biorreator controlando-se a concentração de oxigênio no caldo de cultura. O acionador de estresse oxidativo foi observado para acionar a liberação de OMV além das mutações conhecidas sobre o aumento da formação de OMV (Bernadac et al. 1998; Deatherage et al. 2009; van de Waterbeemd et al. 2010).

Essas mutações reduzem a ligação entre a membrana externa e a camada peptidoglicana. Para o changestat de DOT de N.

meningitidis usamos uma cepa de knockout de rmpM para avaliar o efeito de oxigênio na liberação de vesícula, embora também testemos o efeito da DOT alta em uma cepa relacionada que continha rmpM (dados não mostrados). Os altos níveis de DOT em um changestat de DOT acionaram aumento na liberação de vesícula em N. meningitidis que continha rmpM também, embora o rendimento OMV por cultura de litro permanecesse menor do que nas culturas de knockout de rmpM.

[080] O estresse oxidativo pode ser um mecanismo geral para induzir a liberação de OMV. Aqui mostramos essa relação para N. meningitidis, E. coli e B. pertussis. Sabra et al. mostraram por micrografia eletrônica que Pseudomonas aeruginosa forma mais vesículas sob condições de estresse oxidativo extremo (pO2 ~ 350% de saturação do ar) em comparação com as condições anóxicas (pO2 ~ 0) (Sabra et al. 2003). Biologicamente, a resposta da formação de OMVs pela bactéria pode ser explicada como uma resposta para evitar a fagocitose por macrófagos. Durante a infecção, a liberação de sOMV provavelmente contribui para a progressão da doença e a gravidade da sepse meningocócica fulminante (Brandtzaeg et al. 1989; van Deuren et al. 1995). N.

meningitidis encontra estresse oxidativo sobre explosões oxidativas de fagócitos (Moslen 1994; Ng et al. 2004).

Lappann et al. mostrou que as sOMVs de N. meningitidis induziram a formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) e a ligação de OMVs a NETs serviu como chamariz para que as bactérias contornassem a ligação às NETs (Lappann et al. 2013a). O papel das OMVs na interação com os fagócitos deve ganhar mais interesse.

[081] A taxa de crescimento mostrou influenciar as respostas ao estresse oxidativo. A produção de estresse oxidativo é uma característica do crescimento bacteriano aeróbico à medida que os componentes da cadeia respiratória são oxidados (Storz e Imlay 1999). Neisseria spp. são patógenos positivos para oxidase contendo uma cadeia respiratória do tipo mitocondria (Bøvre 1984). A espécie Neisseria tipicamente mostra altos níveis de respiração

(Archibald e Duong 1986). O genoma N. meningitidis codifica vários pequenos citocromos do tipo c e uma citocromo oxidase terminal única do tipo cbb3 (Aspholm et al. 2010; Deeudom et al. 2008; Li et al. 2010; Seib et al. 2006). Li et al. a hipótese de que a alta capacidade respiratória de Neisseria spp. e o excesso de capacidade de redução de oxigênio atua como defesa contra espécies reativas endógenas de oxigênio (ROS) (Li et al. 2010). SodA e MntC são os principais efetores envolvidos na resposta oxidativa ao estresse Neisseria spp. (Seib et al. 2004; Tseng et al.

2001). Nos experimentos com acelerostatos deste estudo, a taxa de crescimento aumenta linearmente com o CER até uma taxa de crescimento de 0,18 h-1. A taxas de diluição mais altas, foi observada uma redução no RCE e o experimento foi interrompido. A taxa de crescimento específico máxima de N.

meningitidis neste meio é de 0,5 h-1 (van de Waterbeemd et al. 2010) e a lavagem não é, portanto, esperada a essa taxa de diluição. A taxa de aceleração escolhida foi moderadamente alta (aD = 0,0055 h-2) e possivelmente mais tempo para adaptação foi necessário para se adaptar às taxas de crescimento aumentadas. A taxa de aceleração escolhida possivelmente resultou em uma subestimação do efeito das maiores taxas de diluição. Estes quimiostatos mostraram depleção das fontes de carbono glicose e glutamato e as culturas eram provavelmente limitadas em carbono. Em taxas de crescimento mais baixas, foi observada uma densidade bacteriana mais baixa, que pode ser explicada pelo aumento da necessidade de energia para manutenção.

[082] Nossos resultados iniciais mostram que o tamanho da OMV não foi afetado, embora o estresse oxidativo possa causar danos às bactérias. Em geral, as concentrações elevadas de oxigênio podem afetar o crescimento bacteriano e a produção de compostos biológicos (Baez e Shiloach 2014). Neisseria spp. são adaptados à produção de EROs, causados pelo sistema respiratório, uma vez que espécies reativas de oxigênio se acumulam como subprodutos da respiração aeróbica (Imlay 2008; Korshunov e Imlay 2006) e contêm vários métodos para lidar com EROs (Seib et al.

2004; Seib et al. 2006). Os experimentos do changestat da DOT mostraram que o aumento da DOT pode ser controlado de modo que o crescimento permaneça possível. Aplicações, como a adição de enzimas em OMVs (Alves et al. 2015; Su et al.

2017), também podem se beneficiar desse método de produção.

[083] Esta divulgação expande o conhecimento sobre a produtividade da sOMV e aprimora o controle do processo.

Utilizamos a tensão de oxigênio dissolvido de cultivos bacterianos para induzir o estresse oxidativo para testar a influência do estresse oxidativo na liberação da vesícula.

No entanto, não é óbvio projetar um processo de fermentação com alto DOT para um microrganismo aeróbio facultativo

(Hewitt et al. 2000), mas mostrou ser um parâmetro de processo conveniente para induzir a formação de vesículas da membrana externa. Além do estresse oxidativo induzido pela alteração do metabolismo, o aumento da DOT pode ser um método mais simplista e melhor controlável. Com esse método, torna-se possível produzir sOMV de culturas gram- negativas para muitas aplicações.

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Claims (14)

REIVINDICAÇÕES

1. Processo para produzir vesículas de membrana externa bacteriana liberadas espontaneamente (OMV), sendo que o processo é caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) cultivar uma população de uma bactéria gram- negativa, cujo cultivo compreende a estimulação da liberação de OMV pela aplicação de uma tensão de oxigênio dissolvido (DOT) que é mais alta do que uma DOT fisiológica de 30% de saturação do ar medida a 35 °C; e, b) recuperar a OMV liberada em a), em que a recuperação pelo menos compreende a remoção das bactérias das OMV.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a DOT aplicada para estimular a liberação de OMV é pelo menos 31, 32, 35, 40, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150 ou 200% de saturação do ar medida a 35 °C e, em que preferencialmente, a DOT aplicada para estimular a liberação de OMV é menor do que 350, 325, 300, 275, 250, 225, 205 ou 185% de saturação do ar medida a 35 °C.

3. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o dito cultivo compreende um modo que emprega adicionar um meio de alimentação, em que o dito modo é selecionado a partir de modo de lote alimentado, modo semicontínuo, e modo contínuo.

4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, sendo que o processo é caracterizado pelo fato de que compreende: a) uma primeira fase em que a biomassa da bactéria gram-negativa é acumulada em uma primeira DOT; e, b) uma segunda fase em que a liberação de OMV a partir da biomassa acumulada em a) é estimulada pela aplicação de uma segunda DOT que é mais alta do que a primeira DOT; em que preferencialmente, a primeira DOT é uma DOT fisiológica, preferencialmente uma DOT de menos do que 50, 40, 35 ou 32% de saturação do ar medida a 35 °C.

5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a bactéria gram-negativa tem pelo menos um de: a) uma modificação genética que faz com que a bactéria produza um LPS com toxicidade reduzida mas que o LPS retenha pelo menos parte de sua atividade adjuvante; preferencialmente, a dita modificação genética é uma modificação que diminui ou realiza knockout da expressão de um ou mais genes selecionados a partir dos genes lpxL1 e lpxL2 ou homólogos dos mesmos e o gene lpxK ou um homólogo do mesmo e/ou é uma modificação que afeta a expressão de um ou mais genes lpxE e/ou pagL;

b) uma modificação genética que faz com que a bactéria sobreproduza OMV em comparação com uma bactéria tipo selvagem correspondente sem a modificação genética, em que a modificação genética é uma modificação que atenua a atividade de ligação ao peptideoglicano de uma ou mais proteínas compreendendo um sítio associado ao peptideoglicano, preferencialmente a dita modificação genética é uma modificação que diminui ou realiza knockout da expressão de um ou mais genes selecionados a partir do grupo consistindo nos genes tolQ, tolR, tolA, tolB, tolRA, rmpM e ompA; e, c) uma modificação genética que diminui ou realiza knockout da expressão de um produto genético, preferencialmente, um produto genético selecionado a partir do grupo que consiste em cps, um produto genético de biossíntese de lipídio A, PorA, PorB e OpA.

6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a bactéria gram-negativa pertence a um gênero selecionado a partir do grupo consistindo nos gêneros Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Salmonella, Vibrio, Shigella, Haemophilus, Pseudomonas, Escherichia, Moraxella, Klebsiella e Acinetobacter preferencialmente a bactéria é de uma espécie selecionada a partir do grupo que consiste em Neisseria meningitidis, Neisseria lactamica, Neisseria gonorrhoeae, Helicobacter pylori, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Vibrio cholerae, Shigella spp., Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Pseudomonas aeruginosa, Escherischia coli, Moraxella catarrhalis, Klebsiella pneumoniae e Acinetobacter baumannii.

7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a bactéria gram-negativa expressa um antígeno estranho à dita bactéria gram-negativa.

8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a bactéria gram-negativa expressa vários antígenos, em que preferencialmente a população compreende mais do que uma cepa da bactéria gram-negativa, e em que cada cepa expressa diferentes antígenos.

9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a OMV é esterilizada, preferencialmente por esterilização por filtração, preferencialmente usando um filtro com poros de menos do que cerca de 0,3 micrômetro.

10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a etapa de combinar a OMV com um excipiente farmaceuticamente aceito e, opcionalmente, um adjuvante.

11. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a OMV é para o uso em vacinas.

12. OMV caracterizada pelo fato de que é obtenível pelo processo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11.

13. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende OMV, conforme definido na reivindicação 12, e um excipiente farmaceuticamente aceito e, opcionalmente, um adjuvante.

14. OMV, de acordo com a reivindicação 12, ou uma composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que é para o uso como um medicamento, preferencialmente no tratamento de meningite.