KR20200136361A - 외막 소포의 생성을 위한 개선된 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 의학 미생물학 및 백신의 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 그람 음성 박테리아의 박테리아 외막 소포 (OMV)의 자발적인 방출은 생리적 DOT보다 더 높은 용존 산소 분압 (DOT)의 적용에 의해 자극되는 방법에 관한 것이다. 이에 따라 생성된 OMV는 백신에 사용하기 위한 것이다. 본 발명은 추가로 상기 방법에 의해 획득 가능한 OMV, 및 이러한 OMV를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 특히 면역 반응의 유발을 위한 방법에 사용하기 위한 의약으로서 본 발명의 OMV의 용도에 관한 것이다.

Description

외막 소포의 생성을 위한 개선된 방법

본 발명은 의학 미생물학 및 백신의 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 백신에서 사용하기 위한 그람 음성 박테리아의 자발적 외막 소포 (OMV)의 생성을 위한 방법, 상기 방법에 의해 획득 가능한 OMV, 및 이러한 OMV를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 특히 면역 반응의 유발을 위한 방법에 사용하기 위한 의약으로서 본 발명의 OMV의 용도에 관한 것이다.

외막 소포 (OMV)는 그람 음성 박테리아에 의해 자연적으로 생성되며, 병원, 세포 간 통신 및 스트레스 반응에 관여한다 (문헌[Kulp and Kuehn 2010]). 막 소포 형성은 그람 양성 박테리아 및 고세균에서 또한 최근에 밝혀졌다 (문헌[Ellen et al. 2009; Rivera et al. 2010]). OMV는 구형 나노입자이고, 소포는 단백질 및 지질다당류 (LPS)를 갖는 인지질 이중층으로 구성되고, 소포의 내강은 박테리아의 주변 세포질 성분을 포함한다 (문헌[Kulp and Kuehn 2010; Schwechheimer and Kuehn 2015]).

OMV는 박테리아의 외막과 매우 유사하고, 비 복제성이며, 특징적으로 병원체 관련 분자 패턴이 다량 존재하기 때문에, 이들 소포는 백신으로서 성공적으로 사용되어 왔다 (문헌[Gorringe and Pajon 2012; Holst et al. 2009]). 이 백신은 박테리아 외막에서 소포를 추출하여 생성되었다. 이러한 방식으로, LPS를 해독시킬 수 있고, 소포를 인공적으로 형성시킬 수 있다 (문헌[Fredriksen et al. 1991; Zollinger et al. 1979]). 그러나, 추출된 OMV (eOMV) 및 자발적 OMV (sOMV)의 단백체의 차이가 발견되었기 때문에 소포의 추출은 불리한 면이 있다 (문헌[Lappann et al. 2013; van de Waterbeemd et al. 2013a]). 더욱이, 자발적으로 방출되는 OMV의 사용의 기반이 되는 분자 해독 가능성으로 인해, 이 추출 방법은 더 이상 해독에 필요하지 않다 (문헌[van der Ley et al. 2001]). 자발적으로 방출되는 소포를 사용하면 백신 산물의 하류 처리에서 추출 단계가 제외되기 때문에 OMV의 정제가 간단해진다 (문헌[Lappann et al. 2013; van de Waterbeemd et al. 2013a]).

실현 가능한 sOMV 생성은 간단하지 않았다. 지난 40년 동안 OMV에 대한 연구에도 불구하고, 박테리아에 의한 OMV의 방출을 유발하는 정확한 메커니즘은 알려져 있지 않다. OMV의 조성은 박테리아의 외막과 다르기 때문에 일반적으로 소포의 방출은 추정적 과정이 아니라고 생각된다 (문헌[Schwechheimer et al. 2013]). OMV의 생합성은 공유 메커니즘이 존재하는지 확실하지 않지만 여러 모델에 의해 기재되었다. OMV 생물 발생은 주변 세포질에서의 소형 펩티도글리칸 축적, 펩티도글리칸 층에 대한 외막의 고정이 적은 경우 또는 O-항원 전하 반발에 기초한 것으로 가정된다. 이러한 모델은 (문헌[Haurat et al. 2015]) 및 (문헌[Schwechheimer and Kuehn 2015])에 검토되어 있다. 베이세리아 메닝기티디스 (Neisseria meningitidis)에 의한 sOMV 생성은 펩티도글리칸 층에 외막을 고정시키는 rmpM 유전자를 결실시킴으로써 증가될 수 있다 (문헌[van de Waterbeemd et al. 2010]). 외막과 펩티도글리칸 층 사이의 연결을 감소시키는 단계는 E. 콜라이의 sOMV 생성을 향상시키는 데 사용되었다 (문헌[Bernadac et al., J Bacteriol. 1998, 180(18): 4872-8]).

문헌[Van de Waterbeemd et al. (2013b)]의 최근 연구는 시스테인 고갈이 N. 메닝기티디스에 의한 OMV 방출을 유발한다는 것을 보여주었다. Van de Waterbeemd 등은 OMV의 시스테인 고갈 유발 방출은 예상되기로는 시스테인 고갈로 인한 산화 스트레스를 통해 매개되는 것으로 나타났다. 실제로, 배지에 과산화물을 간헐적으로 첨가함으로써 유도되는 산화 스트레스는 유사하지만, 각 과산화물 첨가 후 sOMV가 일시적으로 방출되기 때문에 일시적 효과를 나타낸다. 그러나, 과산화수소의 첨가는 박테리아 배양에 과산화수소의 첨가가 유의한 세포 사멸 및 박테리아의 용해를 초래할 수 있기 때문에 확장 가능한 OMV 생성 방법에 적합하지 않다.

따라서, sOMV를 생성하기 위한 더욱 효율적이고 확장 가능한 방법에 대한 필요성이 여전히 존재한다.

제1 양상에서, 본 발명은 자발적으로 방출되는 박테리아 외막 소포 (OMV)를 생성하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 a) 그람 음성 박테리아의 집단을 배양하는 단계로서, 35℃에서 측정되는 경우, 30% 공기 포화도의 생리적 DOT보다 더 높은 용존 산소 분압 (DOT)의 적용에 의한 OMV 방출의 자극을 포함하는 단계; 및, b) a)에서 방출되는 OMV를 회수하는 단계로서, 상기 회수는 적어도 OMV로부터 박테리아의 제거를 포함하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 이 방법에서 OMV의 방출을 자극하기 위해 적용되는 DOT는 35℃에서 측정되는 경우, 적어도 31, 32, 35, 40, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150 또는 200% 공기 포화도이고, 바람직하게는, OMV의 방출을 자극하기 위해 적용되는 DOT는 35℃에서 측정되는 경우, 350, 325, 300, 275, 250, 225, 205 또는 185% 미만의 공기 포화도이다.

본 발명의 방법은 바람직하게는 그람 음성 박테리아의 배양은 공급 배지를 첨가하는 단계를 사용하는 모드를 포함하고, 상기 모드는 유가식 모드, 반연속식 모드 및 연속식 모드로부터 선택되는 방법이다. 더욱 바람직하게는, 상기 방법은 a) 그람 음성 박테리아의 바이오매스는 제1 DOT에 축적되는 제1 단계; 및, b) a)에서 축적된 바이오매스로부터의 OMV의 방출이 제1 DOT보다 더 높은 제2 DOT의 적용에 의해 자극되는 제2 단계를 포함하고; 바람직하게는, 제1 DOT는 35℃에서 측정되는 경우, 생리적 DOT, 바람직하게는 50, 40, 35 또는 32% 미만의 공기 포화도의 DOT이다.

본 발명의 방법에서, 그람 음성 박테리아는 바람직하게는 a) 박테리아가 독성이 감소된 LPS를 생성하지만, LPS가 그의 애주번트 (adjuvant) 활성의 적어도 일부를 유지하게 하는 유전자 변형으로서; 바람직하게는 상기 유전자 변형은 lpxL1 및 lpxL2 유전자 또는 그의 상동체 및 lpxK 유전자 또는 그의 상동체로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현을 감소시키거나 녹아웃 (knock-out)시키는 변형이고/거나, 하나 이상의 lpxE 및/또는 pagL의 유전자의 발현에 영향을 미치는 변형인 유전자 변형; b) 박테리아가, 유전자 변형의 부재 하의 상응하는 야생형 박테리아와 비교하여 OMV를 과생성하게 하는 유전자 변형으로서, 상기 유전자 변형은 펩티도글리칸 연관 부위를 포함하는 하나 이상의 단백질의 펩티도글리칸-결합 활성을 약화시키는 변형이고, 바람직하게는 상기 유전자 변형은 tolQ, tolR, tolA, tolB, tolRA, rmpM 및 ompA 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현을 감소시키거나 녹아웃시키는 변형인 유전자 변형; 및 c) 유전자 산물, 바람직하게는 cps, 지질 A 생합성 유전자 산물, PorA, PorB 및 OpA로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 산물의 발현을 감소시키거나 녹아웃시키는 유전자 변형 중 적어도 하나를 포함한다. 그람 음성 박테리아는 바람직하게는 네이세리아 (Neisseria), 보르데텔라 (Bordetella), 헬리코박터 (Helicobacter), 살모넬라 (Salmonella), 비브리오 (Vibrio), 쉬겔라 (Shigella), 하에모필루스 (Haemophilus), 슈도모나스 (Pseudomonas), 에세리키아 (Escherichia), 모락셀라 (Moraxella), 클레브시엘라 (Klebsiella) 및 아시네토박터 (Acinetobacter) 속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 속에 속하고, 바람직하게는 박테리아는 베이세리아 메닝기티디스, 네이세리아 락타미카 (Neisseria lactamica), 네이세리아 고노르호에아에 (Neisseria gonorrhoeae), 헬리코박터 필로리 (Helicobacter pylori), 살모넬라 타이피 (Salmonella typhi), 살모넬라 타이피무리움 (Salmonella typhimurium), 비브리오 콜레아에 (Vibrio cholerae), 쉬겔라 종 (Shigella spp.), 하에모필루스 인플루엔자에 (Haemophilus influenzae), 보르데텔라 페르투시스 (Bordetella pertussis), 슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa), 에세리키아 콜라이 (Escherischia coli), 모락셀라 카타르할리스 (Moraxella catarrhalis), 클레브시엘라 네우모니아에 (Klebsiella pneumoniae) 및 아시네토박터 바우만니이 (Acinetobacter baumannii)로 이루어진 군으로부터 선택되는 종의 것이다. 일 실시형태에서, 그람 음성 박테리아는 상기 그람 음성 박테리아에 대해 외인성인 항원을 발현한다. 또 다른 실시형태에서, 그람 음성 박테리아는 다수의 항원을 발현하고, 바람직하게는 백신 적용 범위를 개선하기 위해 주요 항원 변이체가 포함되도록 상이한 항원이 선택된다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 방법에서 OMV는 바람직하게는 필터 멸균에 의해, 바람직하게는 약 0.3 마이크로미터 미만의 기공을 갖는 필터를 사용하여 멸균된다.

본 발명에 따른 방법은 약제학적으로 허용 가능한 부형제 및 선택적으로 애주번트와 OMV를 조합하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 방법에서 OMV는 바람직하게는 백신에 사용하기 위한 것이다.

제2 양상에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 획득 가능한 OMV에 관한 것이다.

제3 양상에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 따르거나 본 발명에서 생성되는 OMV 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제 및 선택적으로 애주번트를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

제4 양상에서, 본 발명은 바람직하게는 수막염의 치료에서 의약으로서 사용하기 위한 상기 OMV 또는 상기 약제학적 조성물에 관한 것이다.

놀랍게도, 본 발명자들은 생물반응기 배양의 공통 제어 매개변수가 자발적 외막 소포 (OMV)의 방출을 유발하기 위해 직접적이고 확실하게 사용될 수 있음을 발견하였다.

제1 양상에서, 본 발명은 자발적으로 방출되는 박테리아 외막 소포를 생성하기 위한 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 방법은 a) 그람 음성 박테리아의 집단을 배양하는 단계로서, 35℃에서 측정되는 경우, 30% 공기 포화도의 생리적 DOT보다 더 높은 용존 산소 분압 (DOT)의 적용에 의한 OMV 방출의 자극을 포함하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 바람직하게는 a)에서 방출된 OMV를 회수하는 단계로서, 바람직하게는, 상기 회수는 적어도 OMV로부터 박테리아의 제거를 포함하는 단계를 추가로 포함한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "외막 소포"에 대한 용어 OMV는 그람 음성 박테리아의 외막으로부터 생성된 생물학적 활성 분자 (독소, 단백질, DNA)를 포함하는 주변 세포질 내용물을 갖는 것으로, 방출되는 외막의 구체를 나타낸다. OMV는 때때로 "수포"로 지칭된다. 이 소포는 박테리아 병독성 인자의 원거리 전달에 관여하고, 염증을 촉진하며, 숙주 면역 반응을 자극하기 때문에 종종 병원성 과정에 관여한다. 박테리아에 의해 형성된 OMV는 또한 세포-세포 신호전달, 단백질 및 DNA 교환을 포함하는 세포간 교환 사건을 매개할 수 있다 (예를 들어, 문헌[Berleman J et al., 2013] 참조).

본 발명에 따른 방법에서 그람 음성 박테리아 집단의 배양은 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 배양을 위한 바람직한 배지는 예를 들어, 문헌[Baart et al., 2003]에 기재된 바와 같은 화학적으로 규정된 배지이다. 온도는 약 30℃ 내지 약 40℃와 같은 임의의 온도에서 변동될 수 있다. pH는 약 5.5 내지 약 8.5의 pH와 같은 임의의 pH에서 변동될 수 있다. 바람직한 배양 조건은 pH 7.2에서 약 35℃에서 배양하는 단계를 포함한다.

박테리아의 집단은 본 명세서에서 바람직하게는 동일한 속 및 종의 적어도 2종의 박테리아로 규정된다.

본 발명의 방법은 OMV의 방출을 자극하기 위해 증가된 DOT의 적용을 포함한다. OMV의 방출을 자극하기 위해 적용되는 DOT는 바람직하게는 박테리아에서 (세포외) 산화 스트레스를 유도하는 DOT이며, 이는 박테리아의 단백질 프로파일링에 의해 결정될 수 있는 바와 같다. 바람직하게는, OMV의 방출을 자극하기 위해 적용되는 DOT는 박테리아의 생리적 DOT를 초과하며, 일반적으로 약 30%의 DOT이다. 용존 산소 분압은 본 명세서에서 35℃에서 측정되는 경우, 공기 포화도의 백분율로 표시된다. DOT는 당 업계에 공지된 바와 같이, DOT (즉, 산소) 센서를 사용하여 발효 동안 측정 및 모니터링될 수 있다. DOT 매개변수는 산소 전극 및 통상적인 실험 기술에 의해 계산된다. 따라서, 100% 공기 포화도는 공기로 포화된 용액에 해당하며, 0%는 질소와 같은 비활성 기체로 완전히 퍼징된 용액에 해당한다. 보정은 표준 대기압 조건 하에서, 대략 21% 산소를 포함하는 통상적인 공기로 수행된다.

발효 동안 DOT는 예를 들어, 교반기 속도, 폭기 속도, 공기 공급 하의 산소 분율 및/또는 압력을 포함하여, 당 업계에 공지된 수단에 의해 제어될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에서, DOT는 과산화수소의 (간헐적) 첨가에 의해 증가되지 않는다. 바람직한 방법에서 OMV의 방출을 자극하기 위해 적용되는 DOT는 적어도 31, 32, 35, 40, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150 또는 200%이다. 바람직하게는 OMV의 방출을 자극하기 위해 적용되는 DOT는 350, 325, 300, 275, 250, 225, 205 또는 185% 미만이다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에서 OMV의 방출을 자극하기 위해 적용되는 DOT는 적어도 10, 20, 40 또는 60분 동안, 더욱 바람직하게는 적어도 2, 3, 4 또는 6시간 동안 적용된다.

바람직한 방법에서 상기 배양은 공급 배지를 첨가하는 단계를 사용하는 모드를 포함하고, 상기 모드는 유가식 모드, 반연속식 모드 및 연속식 모드로부터 선택된다. 바람직하게는, 이들 모드는 OMV의 자발적 방출이 최적으로 이용되는 공급 체제를 사용한다.

회분식 과정은 발효 동안 추가 영양소를 추가로 공급하지 않고 세포 배양에 필요한 모든 영양소가 초기 배양 배지에 포함되는 배양 모드이다. 유가식 과정에서, 회분 단계 후에, 공급 단계는 하나 이상의 영양소가 공급에 의해 배양물에 공급되는 공급 단계가 이루어진다. 영양소 공급의 한 가지 목적은 또한 방출되는 OMV의 수율을 증가시키기 위해 바이오매스의 양을 증가시키는 것 (이른바 "고 세포 밀도 배양 과정" 또는 "HCDC")일 수 있다. 대부분의 배양 과정에서 공급 모드가 중요하고 주요하지만, 본 발명은 특정 공급 모드와 관련하여 제한되지는 않는다.

영양소의 공급은 당 업계에 공지된 방법에 따라 연속적 또는 불연속적 모드로 수행될 수 있다. 공급 모드는 사전 규정된 (즉, 공급은 실제 과정 매개변수와 독립적으로 첨가됨) 선형 상수, 선형 증가, 단계적 증가 또는 수학적 함수, 예를 들어, 지수 공급에 따라 이루어질 수 있다.

본 발명의 의미에서 반 연속 배양 과정은 제1 단계에서 유가식 과정 (즉, 회분식 단계 후 공급 단계)으로 작동하는 과정이다. 특정 부피 또는 바이오매스가 획득된 후 (즉, 일반적으로 발효기 부피의 상한이 획득되는 경우), OMV를 포함하는 세포 부용물의 상당 부분이 생물반응기로부터 제거된다. 그 후, 바이오매스 또는 배양 부용액의 부피가 다시 특정 값에 도달할 때까지 공급을 다시 개시한다. 이 방법 (배양 부용액의 배수 및 공급에 의한 재충전)은 적어도 한 번, 이론적으로는 무한 횟수로 진행될 수 있다.

바람직한 방법에서, 공급 배지는 성장 배지에서 박테리아의 최대 비 성장률 (μ_max)의 1.0 내지 0.05의 비 성장률을 달성하는 속도로 공급된다. 예를 들어, 성장률은 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1 또는 0.05 μ_max일 수 있다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 비 성장률이 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1 또는 0.05 μ_max 이하인 단계를 포함하고, 비 성장률이 바람직하게는 전술한 속도로 제한되는 단계는 생성 단계 동안 고 DOT를 촉진하기 위해 OMV가 방출되는 생성 단계이다. 생성 단계 동안 OMV 수율이 더 높은 경우 무성장 또는 심지어 음의 성장의 관찰이 가능할 수 있으므로, 생성 단계 동안 최소 양의 비 성장률을 적용할 필요는 없다.

본 발명의 바람직한 방법에서, 상기 방법은 a) 그람 음성 박테리아의 바이오매스는 제1 DOT에 축적되는 제1 단계; 및, b) a)에서 축적된 바이오매스로부터의 OMV의 방출이 제1 DOT보다 더 높은 제2 DOT의 적용에 의해 자극되는 제2 단계를 포함한다. 바람직하게는, 제1 단계에서 DOT는 박테리아의 성장을 지원하는 수준으로 제어된다. 더욱 바람직하게는, 제1 단계에 적용되는 제1 DOT는 박테리아의 양호하거나 최적의 바이오매스 축적을 지원한다. 따라서, 제1 단계에 적용되는 제1 DOT는 바람직하게는 생리적 DOT이다. 바람직하게는, 제1 DOT는 35℃에서 측정되는 경우, 100% 이하의 DOT, 바람직하게는 75%, 50, 40, 35 또는 32% 미만의 공기 포화도의 DOT이다. 방법의 제2 단계는 제1 단계에 축적된 바이오매스로부터 OMV의 방출을 자극하기 위해 제1 DOT보다 더 높은 제2 DOT가 적용되는 단계를 포함한다. 따라서, 제2 DOT는 전술한 바와 같이 OMV의 방출을 자극하기 위해 적용되는 DOT일 수 있다. 바람직하게는, 제2 DOT는 제1 DOT보다 적어도 1.05, 1.1, 1.2, 1.5, 2, 5, 또는 10배 더 높다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 임의의 방법에서, 그람 음성 박테리아는 박테리아가 독성이 감소된 LPS를 생성하지만 LPS는 그의 애주번트 활성의 적어도 일부를 유지하게 하는 유전자 변형을 가지며; 바람직하게는 상기 유전자 변형은 lpxL1 및 lpxL2 유전자 또는 그의 상동체 및 lpxK 유전자 또는 그의 상동체로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현을 감소시키거나 녹아웃시키는 변형 및/또는 하나 이상의 lpxE 및/또는 pagL 유전자의 발현에 영향을 미치는 변형이다. 바람직하게는, 그람 음성 박테리아는 적어도, SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열과 적어도 약 30% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 lpxL1 유전자의 발현을 감소시키거나 녹아웃시키는 돌연변이를 갖는다.

독성이 더 낮도록 변형된 LPS는 본 명세서에서 상응하는 야생형 LPS의 독성보다 독성이 더 낮도록 변형된 LPS로 이해된다. 바람직하게는 변형된 LPS는 상응하는 야생형 LPS의 독성의 약 90, 80, 60, 40, 20, 10, 5, 2, 1, 0.5 또는 0.2% 미만이다. 야생형 및 독성이 감소된다양한 변형 LPS의 독성은 당업자에게 공지된 임의의 적합한 분석으로 측정될 수 있다. 독성, 즉 LPS의 생물학적 활성을 결정하기 위한 바람직한 분석은 MM6 대식세포 세포주에서 TNF-알파 유도에 대한 WEHI 시험이다 (문헌[Espevik and Niessen, 1986, J. Immunol. Methods 95: 99-105; Ziegler-Heitbrock et al., 1988 Int.J. Cancer 41: 456-461]). 그람 음성 박테리아의 LPS (또는 그 지질 A 모이어티)가 독성을 감소시키는 것이 바람직하지만, LPS는 면역자극의 적어도 일부, 즉 애주번트 활성을 유지하는 것이 더욱 바람직하다. 따라서, 본 발명에 사용되는 그람 음성 박테리아의 독성을 감소시키는 LPS는 바람직하게는 상응하는 야생형 LPS의 면역자극 활성의 적어도 약 10, 20, 40, 80, 90 또는 100%를 가짐으로써, 면역자극 활성은 수지상 세포 (DC)의 공동 배양시 적어도 하나의 사이토카인의 생성 또는 적어도 하나의 공동자극 분자의 발현을 측정함으로써 결정된다.

N. 메닝기티디스에서 pagL의 이종성 발현은 약화된 상이한 펜타-아실화 LPS 구조를 야기하며, 이는 인간 단핵구 세포주에서 여전히 TLR4 활성화를 유도할 수 있고, TRIF-편중 시토카인 생성을 유도한다 (문헌[Pupo et al., 2014, J. Biol. Chem. 289: 8668-8680]).

바람직하게는, 본 발명에 따른 임의의 방법에서 그람 음성 박테리아는 박테리아가 유전자 변형되지 않은 상응하는 야생형 박테리아와 비교하여 박테리아가 OMV를 과생성하게 하는 유전자 변형을 가지고, 상기 유전자 변형은 펩티도글리칸 연관 부위를 포함하는 하나 이상의 단백질의 펩티도글리칸-결합 활성을 약화시키는 변형이고, 바람직하게는 상기 유전자 변형은 tolQ, tolR, tolA, tolB, tolRA, rmpM 및 ompA로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현을 감소시키거나 녹아웃시키는 변형이다. OMV 생성을 증가시키는 바람직한 유전자 변형은 소포 형성을 증가시킴으로써 OMV 수율을 증가시키기 위해 외막과 펩티도글리칸 사이에 고정 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현을 감소시키거나 제거하는 유전자 변형이다. 이 목적에 적합한 유전자 변형은 예를 들어, 그람 음성 박테리아에 일반적으로 존재하는 OmpA 상동체, 예를 들어, 네이세리아 종의 RmpM 단백질의 발현을 감소시키거나 제거한다 (문헌[Steeghs et al., 2002 Cell Microbiol, 4: 599-611; van de Waterbeemd et al., 2010 Vaccine, 28: 4810-4816]). 따라서, 바람직하게는, 유전자 변형 박테리아는 rmpM 유전자 또는 그의 상동체의 발현을 감소시키거나 제거하는 유전자 변형을 갖는다. 바람직하게는, rpmM 유전자 또는 그의 상동체는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열과 적어도 약 30% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩한다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 임의의 방법에서, 그람 음성 박테리아는 네이세리아, 보르데텔라, 헬리코박터, 살모넬라, 비브리오, 쉬겔라, 하에모필루스, 슈도모나스, 에세리키아, 모락셀라, 클레브시엘라 및 아시네토박터 속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 속에 속한다. 더욱 바람직하게는, 박테리아는 베이세리아 메닝기티디스, 네이세리아 락타미카, 네이세리아 고노르호에아에, 헬리코박터 필로리, 살모넬라 타이피, 살모넬라 타이피무리움, 비브리오 콜레아에, 쉬겔라 종, 하에모필루스 인플루엔자에, 보르데텔라 페르투시스, 슈도모나스 아에루기노사, 에세리키아 콜라이 및 모락셀라 카타르할리스로 이루어진 군으로부터 선택되는 종의 것이다. 가장 바람직하게는, 그람 음성 박테리아는 N. 메닝기티디스 혈청군 B 분리주 H44/76의 복제물 또는 유도체인 베이세리아 메닝기티디스 균주이다 (문헌[Holten et al., 1979, J Clin Microbiol, 9(2): 186-188; van den Dobbelsteen et al., 2007, Vaccine, 25(13): 2491-6]).

바람직하게는, 본 발명에 따른 임의의 방법에서 그람 음성 박테리아는 유전자 산물, 바람직하게는 cps, porA, porB 및 opA로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 산물의 발현을 감소시키거나 녹아웃시키기 위한 하나 이상의 돌연변이를 가지며; 이들 돌연변이 중 다수는 WO02/09746에서 검토되어 있다.

본 명세서에 규정된 유전자 산물의 발현을 감소시키거나 녹아웃시키기 위해, 당업자는 널리 공지된 다양한 도구를 이용할 수 있다. 기능적 유전자 산물의 발현을 감소시키거나 녹아웃시키기 위해 폴리뉴클레오타이드에 적합한 변형을 도입시키기 위한 적절한 전략을 선택하는 것은 당업자에게 통상적인 방법이다. 예를 들어, 시험관내 돌연변이 유발 방법은 (문헌[Sambrook et al. (Molecular cloning, A laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA, 1989])에 기재되어 있다. 해당 방법은 키트 (예를 들어, 미국 라호야의 Stratagene에 의한 Quikchange 부위-지정 돌연변이 유발 키트)의 형태의 시판되는 것을 이용할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드의 결실은 예를 들어, 당업자에게 널리 공지된 유전자 대체 기술에 의해 달성될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 임의의 방법에서 그람 음성 박테리아는 다수의 PorA 하위유형을 발현하며, 바람직하게는 상기 집단은 그람 음성 박테리아의 하나 초과의 균주를 포함하고, 각 균주는 상이한 PorA 하위유형을 발현한다. 바람직하게는, 그람 음성 박테리아의 집단은, 다중 혈청형의 항원이 발현되고 최종적으로 OMV 생성시 종료되는 다수의 종의 그람 음성 박테리아를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 그람 음성 박테리아 종은 다수의 혈청형의 항원을 발현한다. 박테리아 집단이 N. 메닝기티디스를 포함하는 경우, 상기 집단은 바람직하게는 다중 혈청형의 PorA 항원을 발현하는 N. 메닝기티디스를 포함하고; 더욱 바람직하게는, 박테리아 집단은 각각의 종이 다수의 혈청형의 PorA 항원을 발현하는 다수 종의 N. 메닝기티디스를 포함한다. 바람직하게는, 그람 음성 박테리아의 집단은 총 9개의 PorA 하위유형을 발현하는 3종의 3가 PorA N. 메닝기티디스 균주를 포함한다 (문헌[van der Ley et al, 1995, Vaccine, 13(4): 401-7; Claassen et al, 1996, Vaccine, 14(10): 1001-8; van den Dobbelsteen et al, 2007, supra]).

바람직하게는, 본 발명에 따른 임의의 방법에서, 그람 음성 박테리아는 상기 그람 음성 박테리아에 대해 외인성인 항원을 발현한다. 외인성 항원은 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 발현될 수 있으며; 바람직하게는 외인성 항원은 OMV를 표적화한다. 바람직하게는, 외인성 항원 또는 그의 일부는 N. 메닝기티디스 혈청군 B porA 또는 그의 일부에 융합되거나 그에 포함되거나, 또는 그람 음성 박테리아의 표면 노출 지질단백질의 N 말단 부분에 융합되며, 이는 예를 들어, WO2016/193370에 기재된 바와 같다. 외인성 항원은 병원체 (감염원) 및/또는 종양의 항원일 수 있다. 예를 들어, 항원은 병원체 및 감염원, 예컨대, 바이러스, 박테리아, 진균 및 원생동물로부터 유래될 수 있다.

본 발명의 범위 내에서, 각각의 균주가 다른 균주에서 발현되는 항원과 상이한 하나 이상의 항원, 예를 들어, 단일 또는 다중 항원 혈청형을 발현하는 그람 음성 박테리아의 수 종의 상이한 균주를 배양하거나 달리는 제공할 수 있으며, 상기 박테리아의 하나 이상의 풀링된 집단으로부터 동시에 OMV를 추출하여, 다가 백신을 생성할 수 있다. 상이한 박테리아 집단으로부터 개별적으로 OMV를 추출한 다음 바람직하게는 OMV의 제조물을 풀링하는 단계가 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 또한, 상이한 종의 그람 음성 박테리아가 단일 혼합 집단 또는 별도의 개별 집단 또는 개별 집단 및 혼합 집단의 조합으로 함께 배양되는 단계가 본 발명의 범위 내에 있다.

본 발명에 따른 방법에서, OMV의 회수는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는, OMV의 회수는 적어도 OMV로부터 박테리아의 제거를 포함한다. OMV로부터 박테리아를 제거하기 위한 바람직한 방법은 임의로 멸균 여과 단계를 포함하는 하나 이상의 여과 단계를 포함한다. 대안적으로, 박테리아는 원심분리 후, 선택적으로 상청액의 멸균 여과에 의해 OMV로부터 제거될 수 있다.

본 발명에 따른 임의의 방법에 의해 획득된 OMV 제조물은 동결건조된 형태 또는 용액, 또는 용액 중 동결되어 향후 사용을 위해 간편하게 저장될 수 있다. 본 발명에 따른 임의의 방법에서, 응집을 방지하기 위한 (콜로이드성) 안정화제, 예컨대, 수크로스 및/또는 미생물 성장을 방지하기 위한 보존제, 예컨대, 티오머살과 같은 하나 또는 수종의 화합물을 OMV 제조물에 첨가할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 임의의 방법에서, OMV는 바람직하게는 약 0.3 마이크로미터 미만의 기공을 갖는 필터를 사용하여 바람직하게는 필터 멸균에 의해 멸균된다. 바람직하게는, 단계 b) 동안 멸균이 수행된다. 또한 멸균 여과로 지칭되는 필터 멸균은 본 명세서에서, 바람직하게는 약 0.5 내지 0.2 마이크로미터의 기공의 필터를 통해 대상 화합물을 여과하여, 대상 화합물을 포함하는 여과액이 임의의 미생물을 포함하지 않도록하거나 여과액 내의 미생물의 양이 허용 가능한 낮은 수준으로 감소되도록 하는 단계로서 규정된다.

회수 후 또는 회수와 동시에, OMV 제조물을 정제할 수 있다. 정제는 당업자에게 공지된 임의의 방법을 포함할 수 있다. 바람직하게는 하기 그룹으로부터의 적어도 하나의 방법이 적용된다: 배지를 교체하기 위해, 예를 들어, 추출 배지로부터 금속 킬레이트화제를 제거하기 위해 및/또는 OMV 제조물을 농축시키기 위한 본 명세서에서 전술한 바와 같은 한외여과 및/또는 정용여과; 하나 이상의 적합한 뉴클레아제를 사용하여, 바람직하게는 Benzonase^® (Merck, Netherlands)를 사용하여 효소에 의해 수행될 수 있는 데옥시리보핵산 (DNA) 및 리보핵산 (RNA)과 같은 핵산의 분해; 바람직하게는 약 0.5 μM 내지 1.0 μM의 기공 크기를 갖는 필터를 사용한 여과에 의한 정화; 겔 여과 (예컨대, 크기 배제 크로마토그래피; Sepharose 6 Fast Flow 칼럼 재료; OMV는 칼럼의 빈 부피로부터 회수됨); 본 명세서에서 전술된 바와 같은 멸균 여과. 바람직하게는, 적어도 멸균 여과가 적용된다. 바람직하게는 하나 초과의 정제 방법이 적용된다. 바람직하게는, 반드시 다음 순서로 이루어질 필요는 없으나, 다음 방법이 연속적으로 적용된다: 한외 여과 (예를 들어, 100 또는 300 kDa 컷오프), 정용여과 (예를 들어, 100 또는 300 kDa 컷오프), 핵산의 효소 분해, 정화, 겔 여과 및 멸균 여과. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 초원심분리를 포함하지 않는다.

Benzonase®를 사용한 핵산의 분해는 바람직하게는 약 0.1 내지 10 U Benzonase^®/ml 및 약 1 내지 10 mM의 Mg²⁺를 포함하는 pH 8.4+/-0.4의 완충액 중에서 4℃ 내지 37℃에서 1 내지 20시간 동안 수행된다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 임의의 방법에서, OMV는 백신에 사용하기 위한 것이다. 백신은 대상체, 바람직하게는 포유류, 바람직하게는 인간의 면역화 (면역 반응 유발) 또는 백신화에 사용될 수 있다. 백신에서, OMV는 혼합 백신을 제조하기 위해, 예를 들어, 베이세리아 메닝기티디스 혈청군 A, C, W135, Y, 폐렴구균성 질병, 디프테리아, 백일해, 소아마비, RSV, 파상풍 및 콜레라에 대한 백신과 조합하여, 다른 항원과 조합될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 임의의 방법에서, a)에서의 배양 부피 및/또는 b)에서의 배지 부피는 적어도 약 10L, 더욱 바람직하게는 적어도 약 1L, 2L, 5L, 10L, 20L, 40L, 60L 80L, 100L, 200L, 300L, 400L, 500L, 800L, 1500L, 5000L, 10.000L, 20.000L 또는 40.000L이다.

배양은 다음에 제한되는 것은 아니나, 예비 배양 또는 접종 배양 및 주 배양을 포함하는 여러 단계로 수행될 수 있다. 배양은 다음에 제한되는 것은 아니나, 실험실 또는 산업 발효기에서 진탕기 플라스크 배양, 소규모 또는 대규모 배양 (연속, 회분식, 유가식 또는 고상 배양 포함)을 포함하여 임의의 규모로 수행될 수 있다.

본 발명은 약제학적으로 허용 가능한 부형제 및 선택적으로 애주번트와 OMV를 조합하는 단계를 추가로 포함하는 과정을 추가로 제공한다. 통상적인 '약학적으로 허용 가능한 담체'는 조성물이 제공된 개체에게 유해한 항체의 생성을 자체적으로 유도하지 않는 임의의 담체를 포함한다. 적합한 담체는 통상적으로 단백질, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체 아미노산, 아미노산 공중합체 및 지질 응집체 (예컨대, 오일 액적 또는 리포좀)와 같은 천천히 대사되는 대형 거대 분자이다. 이러한 담체는 당업자에게 널리 공지되어 있다.

애주번트는 본 명세서에서, 대상체, 바람직하게는 포유류, 바람직하게는 인간을 면역화하기 위해 항원과 조합하여 사용되는 경우, 면역계를 자극함으로써, 항원에 대한 면역 반응을 증대시키거나 촉진하지 않고, 바람직하게는 애주번트 자체에 대한 특이적 면역 반응을 생성하지 않는 임의의 물질 또는 화합물을 포함하는 것으로 규정된다. 바람직한 애주번트는 소정의 항원에 대한 면역 반응을 동일한 조건이나 애주번트의 부재 하에서 항원에 대해 생성된 면역 반응과 비교하여, 적어도 1.5, 2, 2.5, 5, 10 또는 20배만큼 증대시킨다. 해당 대조군 그룹에 대해 동물 또는 인간 그룹에서 애주번트에 의해 생성된 소정의 항원에 대한 면역 반응의 통계적 평균 증대를 결정하기 위한 시험이 당 업계에 이용 가능하다. 애주번트는 바람직하게는 적어도 2개의 상이한 항원에 대한 면역 반응을 증대시킬 수 있다.

제2 양상에서, 본 발명은 본 발명의 제1 양상에 따른 방법 중 임의의 하나에 의해 획득 가능한 OMV를 제공한다. 바람직하게는, 상기 OMV는 본 발명의 제1 양상에 따른 방법 중 임의의 하나로부터 직접 획득되거나 유도된 산물이다.

본 발명에 따른 임의의 방법에 의해 획득 가능한 OMV 제조물은 의약, 바람직하게는 수막염 치료를 위한 의약의 제조에 간편하게 사용될 수 있으며, 바람직하게는 상기 의약은 N. 메닝기티디스 감염에 대한 백신이다. 바람직하게는, 상기 OMV 제조물은 본 발명의 제1 양상에 따른 방법 중 임의의 하나로부터 직접 획득되거나 유도된 산물이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 임의의 방법에 의해 획득 가능한 OMV를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. OMV에 더하여, 약제학적 조성물은 예를 들어, 본 명세서에 전술된 바와 같이, 약학적으로 허용 가능한 부형제, 예를 들어, 담체, 애주번트, 안정화제, 삼투제, 완충제 및/또는 분산제를 포함한다. 바람직하게는, 상기 약제학적 조성물은 본 발명에 따른 방법 중 임의의 하나로부터 직접 획득되거나 유도된 산물이다.

추가의 양상에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 임의의 방법에 의해 획득 가능한 OMV, 또는 이러한 OMV를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 의약은 감염성 질병 또는 종양의 치료에 사용하기 위한 것이다. 바람직하게는, 상기 의약은 N. 메닝기티디스 감염에 대한 백신이다.

본 발명은 대상체에서 면역 반응, 바람직하게는 감염성 질병을 유발하는 병원체, 예를 들어, N. 메닝기티디스 또는 종양 관련 항원에 대한 면역 반응을 유발하는 방법을 추가로 제공하며, 본 방법은 본 발명에 따른 임의의 방법에 의해 획득 가능한 유효량의 OMV를 상기 대상체에게 투여하거나, 상기 OMV를 포함하는 유효량의 약제학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 바람직하게는 약제학적 조성물은 백신, 바람직하게는 N. 메닝기티디스 감염에 대한 백신이다.

달리 언급되지 않는 한, 본 발명의 실시는 분자 생물학, 바이러스학, 미생물학 또는 생화학의 통상적인 표준 방법을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌[Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2^nd>edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press; in Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; in Volumes 1 and 2 of Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA; and in Volumes I and II of Brown (1998) Molecular Biology LabFax, Second Edition, Academic Press (UK); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait editor); Nucleic Acid Hybridization (Hames and Higgins, eds.)]에 기재되어 있다.

본 명세서 및 청구범위에서, "~를 포함하다"라는 동사 및 그 활용은 상기 단어 이후의 항목이 포함되나, 명시적으로 언급되지 않은 항목도 배제되지 않음을 의미하는 비 제한적인 의미로 사용된다. 또한, 단수형 "a" 또는 "an"에 의한 요소에 대한 언급은 문맥상 하나의 요소 및 요소들 중 단지 하나만이 존재하는 것으로 명시적으로 요구되지 않는한, 하나 초과의 요소가 존재할 가능성을 배제하지 않는다. 단수형 "a" 또는 "an"은 따라서 일반적으로 "적어도 하나"를 의미한다.

수치와 관련하여 사용되는 경우, "약" 또는 "대략"이라는 단어 (예를 들어, 약 10)는 바람직하게는 소정의 값 (10)의 0.1% 초과 또는 미만일 수 있음을 의미한다.

본 명세서에 인용된 모든 특허 및 참조문헌은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 기재되며, 이는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

도 1. N. 메닝기티디스의 가속 조절 배양. 그래프 A는 희석률 (흑색 선, 0.0055 h^-2의 aD)의 증가, 실제 측정된 희석률 (마름모형) 및 시간에 따른 이산화탄소 발생률 (회색 선)의 증가를 보여준다. 그래프 B는 가속 조절 (흑색) 및 화학물질 조절 (회색)에 대해 상이한 희석률에서 결과적인 특정 sOMV 생성성을 보여준다.
도 2. N. 메닝기티디스의 성장에 대한 증가된 용존 산소 분압의 영향. 그래프 A는 DOT-변화 조절시 DOT 설정점이 시간당 1% 증가한 용존 산소의 제어를 보여준다. 증가된 DOT의 성장에 대한 효과는 그래프 B에 도시되어 있지만, 두 박테리아 모두 높은 수준의 DOT를 처리할 수 있다. 소포의 방출은 DOT가 더 높을수록 증가하는 것으로 밝혀졌다 (그래프 C).
도 3. 높은 용존 산소 분압은 N. 메닝기티디스 회분식 배양에서 OMV 방출을 유도한다. 30% 및 100% 공기 포화도로 제어된 N. 메닝기티디스 회분식 배양의 성장 곡선은 유사한 성장을 나타낸다 (그래프 A). 증가된 산소 농도는 더 높은 수준의 소포 방출을 유도하는 것으로 나타났다 (그래프 B). 그래프는 24시간 동안 충분한 데이터 포인트가 실제로 가능할 수 있도록 2회의 이중반복실험 배양을 중복 실행한 것이다. 제1 이중반복실험은 0h 내지 12h 배양 및 24h 배양에서의 데이터 시점으로 구성되고, 제2 이중반복실험은 0h 및 15h 내지 22h에서의 데이터 시점으로 구성된다.
도 4. DOT는 에세리키아 콜라이 및 보르데텔라 페르투시스에서 OMV 방출을 촉발한다. E. 콜라이 (A)의 DOT 변화 조절은 α_DOT = 1.5%/h에서 DOT 수준에서 DOT 변화 조절의 최대 200%까지 성장을 보여준다. OMV 방출은 증가된 DOT와 직접 관련이 있다. B. 페르투시스 (B)는 배출 기체 중 이산화탄소 농도가 감소하는 것으로 나타난 이후의 α_DOT = 1.0%/h에서 DOT 변화 조절 실험에서 최대 180%의 DOT까지의 성장을 보여준다.

실시예

실시예 1

방법 재료 및 방법

박테리아 균주

N. 메닝기티디스 혈청군 B 분리주 H44/76 (Holten 1979)의 재조합 유도체를 본 연구에서 사용하였다. 선택된 균주는 H44/76 분리주의 유도체가 부재하는 PorA였다. 이 균주는 siaD 녹아웃, LPS-독성을 약화시키는 lpxL1 결실, (달리 지시되지 않는 한) 소포 형성을 개선하는 rmpM 결실 및 수지상 세포와의 상호작용을 촉진하는 lgtB 돌연변이로 인해 캡슐화되지 않은 표현형을 갖는다 (문헌[Steeghs et al. 2006; van de Waterbeemd et al. 2010]). 이 균주를 작업 종자항목으로서 글리세롤에 저장하였다. 모든 배양을 화학적으로 규정된 성장 배지에서 수행하였다 (문헌[Baart et al. 2007b]). 시스테인이 바람직한 황 공급원이기 때문에 적응 후 황산염에서 성장을 수행하였다 (문헌[Port et al. 1984]). 시스테인 농도가 더 낮은 진탕 플라스크에서 균주를 계대배양한 후, 시스테인 무함유 배지에서 성장시켜 적응을 수행하였다.

생물반응기 배양

총 부피를 기준으로 1.6의 H/D 비의 5 리터 원형 바닥 Applikon 생물반응기에서 회분식 배양을 수행하였다. Pierre Guerin Trytonⁱ 제어기에서 3 리터 작업 부피로 배양을 수행하였다. 온도를 35 ± 0.5℃에서 제어하고 1M HCl 및 1M NaOH를 사용하여 pH를 pH 7.2 ± 0.05에서 제어하였다. 달리 지시되지 않는 한, 용존 산소 분압 (DOT)을 30%로 제어하였다. 막 도포 전류 측정 산소 센서 (InPro 6850i, Mettler Toledo)를 35℃의 공기-포화 멸균 배양 배지에서 100%로 보정하였다. 배양의 제1 단계에서 교반 속도 (300 내지 1000 RPM)를 증가시켜 DOT를 제어한 후, 헤드 스페이스 폭기 (1 NL/분)에서 순수한 산소를 첨가하여 산소 분율을 증가시킨다. 100% DOT 배양의 교반 속도를 접종 직후 1000 RPM으로 설정한 후 헤드 스페이스에 순수한 산소를 첨가하여 DOT를 제어하였다. 광학 밀도 측정을 위해 샘플을 취하고, 멸균 여과 (0.22 μm) 후 4℃에서 저장 후 영양소 및 sOMV 측정에 사용하였다. Thermo Prima δb 과정 질량분석기로 배출 기체 조성물을 분석하였다.

연속 배양

회분식 배양 설정과 유사한 설정으로 연속 배양을 수행하였다. 5 리터 생물반응기의 작업 부피를 3.0 리터에서 2.0 리터로 감소시켜, 실험에 필요한 공급 배지를 감소시켰다. 용기에는 배지 유입구 및 2개의 유출구 파이프가 장착되어 있는데, 하나는 교반기의 높이에서 배양 부용액에 침지시키고 하나는 액체 기체 간기에서 직접 침지시킨다. 후자는 발포와 무관하게 일정한 최대 교반기 속도에서 작업 부피를 정확히 2.0 리터로 제어할 수 있었다. 생물반응기, 공급 배지 및 pH 적정 용액의 중량을 저울로 측정하고 희석률의 검증에 사용하였다. 광학 밀도 측정을 위해 샘플을 취하였고, 배출 기체 분석은 회분식 배양과 유사하였다. 회분식 반응기에서 사용된 것과 동일한 제어 루프로 생물반응기를 제어하였다. 8시간의 성장 후, 공급 및 유출 펌프를 개시시켜, 연속 배양을 개시하였다. 생물반응기 부피의 적어도 3배 희석에 대해 안정한 박테리아 밀도 값 및 안정한 이산화탄소 방출에 기반으로 하여 배양의 정상 상태를 가정하였다.

가속 조절 및 DOT-변화 조절 배양

D = 0.03 h^-1에서 정상 상태의 화학물질 조절 발효로부터 가속 조절을 개시하였으며, 이는 a _D = 0.0055 h^-2로 희석률을 선형적으로 증가시킴으로써, 이전 섹션에서 기재된 바와 같이 작동시켰다. 평균 유입 속도를 증가시키고 부용액 유출 속도를 동일하게 증가시킴으로써 희석률을 변경시켰다. 배양 부용액으로부터, 50 mL 샘플을 추출하여 sOMV를 정제하였다. 샘플을 4℃ 4000 x g에서 30분 동안 원심분리하고 멸균 여과 상청액 (Nalgene RapidFlow 0.2 μm PES 필터 단위)을 100 kDa 스핀 필터에서 농축시켰다. 농축된 sOMV를 TrisHCl (pH 7.4)에 의해 완충된 3% 수크로스로 세척하여 오염 단백질을 세척하였다. 이어서, 정용여과된 sOMV를 2시간 동안 125.000 x g에서 원심분리하였다. sOMV 포함 펠렛을 3% 수크로스와 함께 1 mL TrisHCl pH 7.4에 용해시켰다.

DOT-변화 조절을 화학물질 조절 배양으로부터 개시시켰다. 이를 위해, 전술한 바와 같이 μ = 0.04 h^-1의 정상 상태에서 연속 배양을 획득하였다. 이 정상 상태 동안, DOT를 DOT-변화 조절의 개시점인 30%로 제어하였다. DOT 변화 조절의 개시시로부터, DOT를 DOT = 1.0%/h로 선형적으로 증가시켰다.

sOMV 및 대사산물의 정량화

배양 샘플을 멸균 여과 (0.22 μm)하고, sOMV를 측정하였다. 50 μL의 희석된 샘플 또는 OMV를 공지된 농도의 50 μL의 염료 용액 (0.05 mM FM 4-64)과 혼합하여 인지질 특이적 프로브 FM 4-64 (SynaptoRed C2, Biotium)로 sOMV를 측정하였다. 플레이트 형광계 (Synergy MX, Biotek ex480, em650)를 사용하여 이 용액을 혼합한 직후 형광을 측정하였다. 배양 상청액에서 sOMV의 농도를 표준 반응에 기반한 보정 곡선으로부터 계산하였다 (sOMV는 0 내지 2.5 mg/L 총 단백질에 해당하고, eOMV는 0 내지 10 mg/L 총 단백질에 해당함). DOT-변화 조절 실험에서 나노입자 추적 분석 (Malloy and Carr 2006)을 sOMV 정량에 사용하였다. 488 nm 레이저 모듈 및 sCMOS 카메라가 구비된 NanoSight NS500에서 정적 측정 (30 초의 10회 캡처)을 수행하여 농도 업그레이드 (MalvernInstruments 2015)로 보정하였다. 온도를 25℃에서 제어하였으며 NTA 3.2 소프트웨어 빌드 3.2.16으로 캡처한 것을 분석하였다. 자동 유량 측정을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (문헌[Gerritzen et al. 2017]).

Zetasizer 7.11 소프트웨어의 Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments)에서 동적 광 산란에 의해 OMV 크기를 평가하였다. 후방산란 모드에서 자동 측정 지속 시간 및 위치 설정으로 "최적 위치 탐색"으로 3회의 측정을 수행하는 SOP를 사용하여 측정을 수행하였다. 샘플은 0.8872 cP의 점도 및 1.330의 굴절률을 갖는 분산제로서 물에서 1.450의 굴절률 및 0.001 흡광도를 갖는 단백질인 것으로 가정되었다. 데이터를 일반 분석 모델로 처리하였다.

결과

성장률의 함수로서 sOMV 방출

회분식 배양의 정지 단계 동안 OMV의 생성성 증가 (문헌[van de Waterbeemd et al. 2013b])는 OMV 방출에 대한 성장률의 직접적인 영향이 무엇인지에 대한 의문을 제기하였다. 여기서 본 발명자들은 N. 메닝기티디스의 화학물질 조절 배양의 희석률을 서서히 증가 시켜, 가속 조절에서 OMV 방출에 대한 성장률의 영향을 평가한다. 희석률 (a _D )의 서서한 변화는 이러한 가속 조절 접근법에서 배양을 정상 상태로 유지시켜야 한다 (문헌[Paalme et al. 1995]). 이러한 가속 조절에서 0.0055 h^-2의 a _D 를 사용하였다 (도 1). 이산화탄소 발생률 (CER)이 증가함과 동시에, 희석률이 0.18 h^-1의 희석률까지 증가하였으며, 이는 이에 따라 증가된 성장률을 나타낸다. OMV는 가속 조절 전체에 걸쳐 생성되었으며, 이는 크기 및 단백질 조성이 유사하였다 (데이터 미제시). 0.03 h^-1에서 0.18 h^-1로 변경된 성장률은 특정 sOMV 생성성에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다 (도 1). 3개의 상이한 성장률에서 N. 메닝기티디스의 화학물질 조절 배양은 이러한 결과를 확인시켜 주었다. 이들 결과로부터, 본 발명자들은 성장률의 감소 (예를 들어, 0.18 h^-1에서 0.03 h^-1)가 sOMV 방출에 대한 촉발 요인이 아니라는 결론을 내렸다.

DOT-변화 조절에 의해 평가되는 산화 스트레스의 영향

감소된 성장률만으로는 sOMV 방출의 촉발 요인으로서 적용할 수 없었기 때문에, 본 발명자들은 산화 스트레스가 sOMV 방출을 직접 유도하기 위해 사용될 수 있다고 가정하였다. 따라서 본 발명자들은 sOMV 방출에 대한 산화 스트레스의 영향을 평가하였다. 본 발명자들은 과산화수소 첨가 하에 소포의 방출을 이전에 제시하였다 (문헌[van de Waterbeemd et al. 2013b]). 그러나, 박테리아 배양물에 국소 과산화수소 첨가가 유의한 세포 사멸 및 박테리아 용해를 초래할 것이기 때문에 과산화수소 첨가 방법은 OMV의 확장 가능한 생성 방법에는 적합하지 않다. 다음으로 본 발명자들은 생물반응기 배양에서 제어된 매개변수 중 하나로서, 세포외 산화 스트레스가 고농도의 용존 산소에 의해 유도될 수 있는지 시험하였다. DOT는 일반적으로 저산소로 인한 스트레스를 최소화하고 산소 억제를 방지하기 위해 낮게 유지된다 (문헌[Haugaard 1968]). 특히 조건부 혐기성 병원체의 경우 낮은 DOT로 배양을 설계하는 것이 표준 실시법이다. 예를 들어, Hexamen과 Nonamen 백신 개념에 대한 본 발명자들의 N. 메닝기티디스 배양은 30% 공기 포화도의 DOT 수준으로 설계되었다 (문헌[Baart et al. 2007a; Claassen et al. 1996]). 여기서 본 발명자들은 변화 조절 접근법으로 박테리아 성장 및 OMV 방출에 대한 증가된 DOT의 영향을 평가하였다. 이러한 DOT-변화 조절의 경우, 정상 상태 배양을 유지하기 위해 화학물질 조절 배양의 DOT를 선형적으로 증가시킨다 (도 2a). N. 메닝기티디스는 온라인 측정에 유의한 영향을 미치지 않으면서 최대 150% DOT까지 성장할 수 있는 것으로 나타났다 (도 2b). 더 높은 수준의 DOT는 세척 및 용해로 인해, 이산화탄소 생성의 급격한 감소 및 더 낮은 바이오매스 농도를 유발한다. 이산화탄소 생성은 DOT 220%까지 관찰된다. sOMV의 방출은 배양 부용액의 산소 농도와 선형적으로 연결된다 (도 2c). 높은 DOT에 의해 OMV 생성을 4배 증가시키면서, 박테리아의 성장을 유지시킬 수 있다. 실시예 2에서의 E. 콜라이 및 B. 페르투시스의 DOT- 변화 조절 실험은 증가된 DOT 수준에서 증가된 OMV 방출과 유사한 상관관계를 보여주었다 (도 4). 따라서 높은 DOT에서 OMV 생성의 유도는 일반적으로 그람 음성 박테리아에 적용할 수 있다.

증가된 산소 농도에서 회분식 배양의 생성성 향상

이어서, 높은 산소 농도를 회분식 배양에 적용하여 회분식 배양에서 증가된 sOMV 수율의 적합성을 평가하였다. 100% 공기 포화도의 용존 산소 분압을 사용하였으며, 이는 이 값이 OMV 방출 증가를 나타내면서도 변화 조절에서 30% 공기 포화도와 유사한 성장 특성을 유지하기 때문이다 (도 2). 정지 단계의 개시시부터 sOMV 방출을 촉발하는 화학적으로 규정된 배지에서 박테리아를 성장시켰다. 박테리아 성장 프로파일은 30% 및 100% 공기 포화도에서 회분식 배양에 대해 유사하였으며, 이는 N. 메닝기티디스가 더 높은 산소 농도를 처리하는 능력을 보여주었다 (도 3a). 산소 농도가 더 높을수록 소포의 방출이 증가하여 배양의 종료시 표준 수준인 30%와 비교하여 생성성이 3배 더 높아졌다 (도 3b). OMV의 크기는 배양 전반에 걸쳐 일정하게 유지되며 두 농도 사이에서 유사하다 (데이터 미제시). 높은 용존 산소 수준은 회분식 배양에서 sOMV 방출의 강력한 유도 요인인 것으로 나타났다.

실시예 2

재료 및 방법

에세리키아 콜라이

E. 콜라이 JC8031 (TolRA)을 E. 콜라이의 DOT-변화 조절에 사용하였다 (문헌[Espesset et al. 1994]). 10 μL의 동결 글리세롤 스톡 (-80℃)을 100 mL LB 배지 (대형 캡슐: 트립톤 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L, NaCl 10 g/L, MP Biomedicals)에 첨가함으로써, 진탕 플라스크 배양을 개시하여, 진탕 플라스크를 37℃에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 37℃에서 600 RPM의 최대 교반기 속도로 소포제의 부재 하에 LB 배지에서 생물반응기 배양을 수행하였다.

보르데텔라 페르투시스

B. 페르투시스 백신 균주 BP509를 본 연구에서 사용하였다 (문헌[van Hemert 1967]). 황산마그네슘 부재 하에 화학적으로 규정된 배지를 사용하였다 (문헌[Metz et al. 2017; Thalen et al. 1999]). DOT-변화 조절을 상기 기재된 N. 메닝기티디스 배양과 유사하게 개시하고, DOT-변화 조절의 희석률은 0.05 h^-1이었다. 5.4 L 작업 부피의 7 L Applikon 생물반응기를 총 부피를 기반으로 2.2의 H/D 비로 사용하였다.

결과

증가된 DOT 수준에 의한 OMV의 방출은 N. 메닝기티디스에 국한되지 않으며, 또한 다른 그람 음성 박테리아로 확장된다. 본 발명자들은 DOT-변화 조절 실험에서 산화 스트레스가 B. 페르투시스 및 E. 콜라이에 미치는 영향을 시험하였다 (도 4). 두 박테리아 모두 증가된 DOT 하에서 향상된 소포 형성을 나타냈다. E. 콜라이는 실험을 중단한 후 200% 이상의 DOT를 처리할 수 있었다. B. 페르투시스는 배양이 종료된 후, 180% 초과의 DOT에서 이산화탄소 발생률 감소를 나타내었다.

또한, 두 배양물 모두의 바이오매스 농도는 더 높은 DOT에서 명백한 감소를 나타내었다. 이러한 관련성은 N. 메닝기티디스에서도 관찰되었다. 본 발명자들은 산화 스트레스 하에서 유지를 위해 상대적으로 더 많은 에너지가 필요하다고 가정하였다. 실험 설정은 일정한 영양 공급 및 희석률의 화학물질 조절이었기 때문에, 박테리아 성장에 이용 가능한 에너지가 더 적기 때문에 유지를 위한 증가된 에너지 요구는 바이오매스 농도의 감소로 나타난다.

B. 페르투시스 DOT 변화 조절 동안, 약 80% DOT의 DOT 설정점에서 실험 동안 pH 적정제의 차단에 의해 pH 제어에 영향을 발생시켰다. 이로 인해 3시간 내에 pH가 7.2에서 7.4로 선형으로 증가되었으며, 이후 산의 과잉 첨가로 인해 pH를 5.5로 급격히 하락시켰다. 이러한 급격한 감소 후, 제어기에 의해 pH 7.2의 설정점을 빠르게 다시 유지시켰다 (데이터 미제시). 놀랍게도 이 시점에서 높은 sOMV 농도가 관찰되었지만, 이러한 편차의 정확한 영향은 공지되어 있지 않다. 이러한 편차는 B. 페르투시스의 소포 방출에 대한 증가된 DOT 사이의 관계에 대한 결론에 영향을 미치지 않았는데, 그 효과는 이미 30% 내지 80% DOT에서 관찰되었기 때문이다.

실시예 1 및 2에 관한 논의

이 연구에서 본 발명자들은 OMV 형성을 유도하기 위해 외부 신호를 조사하였다. 결과는 0.03 h^-1 내지 0.18 h^-1의 성장률이 OMV의 생합성에 영향을 미치지 않음을 보여준다. 산화 스트레스는 이러한 배양물의 용존 산소 분압을 증가시켜 OMV 방출을 촉발했으며, 생물반응기 배양에 직접 적용될 수 있다. 산화 스트레스는 이들 배양물의 DOT를 증가시킴으로써 생물반응기 배양에 직접 적용될 수 있다. DOT-변화 조절 배양은 그람 음성 박테리아가 최대 200% 공기 포화도의 용존 산소 농도를 처리할 수 있음을 보여준다. 상승된 DOT는 OMV 방출을 직접 증가시켰다. OMV 생성성은 120% DOT의 DOT-변화 조절 배양에서 4배, 100% DOT에서 제어되는 회분식 배양에서 3배 증가하였다. E. 콜라이 및 B. 페르투시스에 증가된 DOT를 적용하면 OMV 방출이 유사하게 증가하여 이 방법이 그람 음성 박테리아에 광범위하게 적용될 수 있음을 나타낸다.

산화성 스트레스에 의한 OMV의 생성은 생물반응기에서 배양물 중 산소 농도를 제어함으로써 유발될 수 있다. 산화 스트레스 촉발은 증가된 OMV 형성에 대해 공지된 돌연변이 중 상위로서 OMV 방출을 촉발하는 것으로 관찰되었다 (문헌[Bernadac et al. 1998; Deatherage et al. 2009; van de Waterbeemd et al. 2010]). 이러한 돌연변이는 외막과 펩티도글리칸 층 사이의 연결을 감소시킨다. N. 메닝기티디스 DOT-변화 조절의 경우, 본 발명자들은 rmpM 녹아웃 균주를 사용하여 소포 방출에 대한 산소의 영향을 평가했지만, 또한 RmpM을 포함하는 관련 균주에서 높은 DOT의 영향을 시험하였다 (데이터 미제시). 배양물 리터당 OMV 수율이 rmpM 녹아웃 배양물보다 더 낮게 유지되었으나, DOT-변화 조절에서의 높은 DOT 수준은 또한 RmpM을 포함하는 N. 메닝기티디스에서 증가된 소포 방출을 촉발하였다.

산화 스트레스는 OMV 방출을 유도하기 위한 일반적인 메커니즘일 수 있다. 여기서 본 발명자들은 N. 메닝기티디스, E. 콜라이, B. 페르투시스의 경우 이러한 관계를 제시하였다. Sabra 등은 슈도모나스 아에루기노사는 무산소 (pO2 내지 0) 조건과 비교하여 극도의 산화 스트레스 (pO2 내지 350%의 공기 포화도) 조건에서 더 많은 소포를 형성한다는 것을 전자현미경 사진으로 제시하였다 (문헌[Sabra et al. 2003]). 생물학적으로 박테리아에 의한 OMV 형성 반응은 대식세포에 의한 식균 작용을 방지하기 위한 반응으로서 설명될 수 있다. 감염 동안, sOMV 방출은 예상컨대 전격성 수막염균 패혈증의 질병 진행 및 중증도에 관여한다 (문헌[Brandtzaeg et al. 1989; van Deuren et al. 1995]). N. 메닝기티디스는 식세포의 산화성 파열에 대해 산화적 스트레스에 직면한다 (문헌[Moslen 1994; Ng et al. 2004]). Lappann 등은 N. 메닝기티디스의 sOMV는 호중구 세포외 트랩 (NET)의 형성을 유도하고, OMV와 NET의 결합은 박테리아가 NET에 대한 결합을 우회하는 유인 역할을 한다고 제시하였다 (문헌[Lappann et al. 2013a]). 식세포와의 상호작용에서 OMV의 역할에 더 많은 관심을 가져야한다.

성장률은 산화 스트레스 반응에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 호흡 연쇄의 구성 요소가 산화됨에 따른 산화 스트레스 생성은 호기성 박테리아 성장의 특징이다 (문헌[Storz and Imlay 1999]). 네이세리아 종은 호흡 연쇄와 같은 미토콘드리아를 포함하는 산화효소 양성 병원체이다 (문헌[Bøvre 1984]). 네이세리아 종은 일반적으로 높은 수준의 호흡을 나타낸다 (문헌[Archibald and Duong 1986]). N. 메닝기티디스 게놈은 다수의 작은 c형 시토크롬 및 cbb3형의 단일 말단 시토크롬 산화효소를 인코딩한다 (문헌[Aspholm et al. 2010; Deeudom et al. 2008; Li et al. 2010; Seib et al. 2006]). Li 등은 네이세리아 종의 높은 호흡 용량 및 산소 환원에 대한 과용량은 내인성 반응성 산소 종 (ROS)에 대한 방어로서 작용한다 (문헌[Li et al. 2010]). SodA와 MntC는 네이세리아 종 산화 스트레스 반응에 포함되는 주요 효과 요인이다 (문헌[Seib et al. 2004; Tseng et al. 2001]. 이 연구의 가속 조절 실험에서, 성장률은 0.18 h^-1의 성장률까지 CER에 의해 선형적으로 증가한다. 더 높은 희석률에서, CER의 감소가 관찰되었으며, 본 실험을 중단하였다. 이 배지에서 N. 메닝기티디스의 최대 비 성장률은 0.5 h^-1이므로 (문헌[van de Waterbeemd et al. 2010]), 따라서 이 희석률에서는 세척 단계가 예상되지 않는다. 선택된 가속 속도는 적당히 높았고 (a _D = 0.0055 h^-2), 가능하게는, 증가된 성장률에 적응하기 위해 적응에 더 많은 시간이 필요하였다. 선택된 가속 속도는 예상컨대 더 높은 희석률의 효과의 과소 평가를 초래할 수 있다. 이러한 화학물질 조절은 탄소원 글루코스 및 글루타메이트의 고갈을 나타내었으며, 배양은 탄소 제한일 가능성이 있다. 감소된 성장률에서, 유지를 위해 증가된 에너지 요구에 의해 설명될 수 있는 더 낮은 박테리아 밀도가 관찰되었다.

본 발명자들의 초기 결과는 산화 스트레스가 박테리아에 손상을 줄 수 있지만 OMV 크기는 영향을 받지 않았다는 것을 보여준다. 일반적으로 상승된 산소 농도는 박테리아 성장 및 생물학적 화합물의 생성에 영향을 줄 수 있다 (문헌[Baez and Shiloach 2014]). 네이세리아 종은 반응성 산소 종이 호기성 호흡의 부산물로 축적되기 때문에 호흡계에 의해 유발되는 ROS 생성에 적합하며 (문헌[Imlay 2008; Korshunov and Imlay 2006]), ROS를 처리하는 수 개의 방법을 포함한다 (문헌[Seib et al. 2004; Seib et al. 2006]). DOT 변화 조절 실험은 증가된 DOT가 성장이 유지될 수 있도록 제어될 수 있음을 보여주었다. OMV에 효소를 첨가하는 것과 같은 응용 (문헌[Alves et al. 2015; Su et al. 2017])이 또한 이 생성 방법의 이점일 수 있다.

본 개시내용은 sOMV 생성성에 대한 정보를 확장시키고, 방법 제어를 향상시킨다. 본 발명자들은 박테리아 배양의 용존 산소 분압을 사용하여 산화 스트레스를 유도함으로써, 소포 방출에 대한 산화 스트레스의 영향을 시험하였다. 그러나, 조건부 호기성 미생물의 경우 높은 DOT의 발효 과정을 설계하는 것은 분명하지 않지만 (문헌[Hewitt et al. 2000]), 이는 외막 소포 형성을 유도하는 편리한 방법 매개변수인 것으로 나타났다. 대사를 변이시킴으로써 유도되는 산화 스트레스 이외에도, 증가된 DOT는 더욱 단순하고 더 우수하게 제어 가능한 접근법일 수 있다. 이 방법에 의하면, 많은 응용 분야에서 그람 음성 배양으로부터의 sOMV를 실현 가능하게 생성하는 것이 가능하게 될 것이다.

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SEQUENCE LISTING <110> De Staat der Nederlanden, vert. door de minister van VWS, Ministerie van Volksgezondheid, Welzijn en Sport <120> An improved process for producing outer membrane vesicles <130> IPA200621-NL <150> EP17205138 <151> 2017-12-04 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 299 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 1 Met Pro Ser Glu Lys Lys Met Cys Ile Glu Met Lys Phe Ile Phe Phe 1 5 10 15 Val Leu Tyr Val Leu Gln Phe Leu Pro Phe Ala Leu Leu His Lys Ile 20 25 30 Ala Asp Leu Thr Gly Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Val Lys Pro Arg Arg 35 40 45 Arg Ile Gly Glu Ile Asn Leu Ala Lys Cys Phe Ser Glu Trp Ser Glu 50 55 60 Glu Lys Arg Lys Thr Val Leu Lys Gln His Phe Lys His Met Ala Lys 65 70 75 80 Leu Met Leu Glu Tyr Gly Leu Tyr Trp Tyr Ala Pro Ala Gly Arg Leu 85 90 95 Lys Ser Leu Val Arg Tyr Arg Asn Lys His Tyr Leu Asp Asp Ala Leu 100 105 110 Ala Ala Gly Glu Lys Val Ile Ile Leu Tyr Pro His Phe Thr Ala Phe 115 120 125 Glu Met Ala Val Tyr Ala Leu Asn Gln Asp Ile Pro Leu Ile Ser Met 130 135 140 Tyr Ser His Gln Lys Asn Lys Ile Leu Asp Glu Gln Ile Leu Lys Gly 145 150 155 160 Arg Asn Arg Tyr His Asn Val Phe Leu Ile Gly Arg Thr Glu Gly Leu 165 170 175 Arg Ala Leu Val Lys Gln Phe Arg Lys Ser Ser Ala Pro Phe Leu Tyr 180 185 190 Leu Pro Asp Gln Asp Phe Gly Arg Asn Asp Ser Val Phe Val Asp Phe 195 200 205 Phe Gly Ile Gln Thr Ala Thr Ile Thr Gly Leu Ser Arg Ile Ala Ala 210 215 220 Leu Ala Asn Ala Lys Val Ile Pro Ala Ile Pro Val Arg Glu Ala Asp 225 230 235 240 Asn Thr Val Thr Leu His Phe Tyr Pro Ala Trp Lys Ser Phe Pro Gly 245 250 255 Glu Asp Ala Lys Ala Asp Ala Gln Arg Met Asn Arg Phe Ile Glu Asp 260 265 270 Arg Val Arg Glu His Pro Glu Gln Tyr Phe Trp Leu His Lys Arg Phe 275 280 285 Lys Thr Arg Pro Glu Gly Ser Pro Asp Phe Tyr 290 295 <210> 2 <211> 242 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 2 Met Thr Lys Gln Leu Lys Leu Ser Ala Leu Phe Val Ala Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ser Gly Thr Ala Val Ala Gly Glu Ala Ser Val Gln Gly Tyr Thr Val 20 25 30 Ser Gly Gln Ser Asn Glu Ile Val Arg Asn Asn Tyr Gly Glu Cys Trp 35 40 45 Lys Asn Ala Tyr Phe Asp Lys Ala Ser Gln Gly Arg Val Glu Cys Gly 50 55 60 Asp Ala Val Ala Ala Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Ala Pro 65 70 75 80 Ala Pro Val Val Val Val Glu Gln Ala Pro Gln Tyr Val Asp Glu Thr 85 90 95 Ile Ser Leu Ser Ala Lys Thr Leu Phe Gly Phe Asp Lys Asp Ser Leu 100 105 110 Arg Ala Glu Ala Gln Asp Asn Leu Lys Val Leu Ala Gln Arg Leu Ser 115 120 125 Arg Thr Asn Val Gln Ser Val Arg Val Glu Gly His Thr Asp Phe Met 130 135 140 Gly Ser Asp Lys Tyr Asn Gln Ala Leu Ser Glu Arg Arg Ala Tyr Val 145 150 155 160 Val Ala Asn Asn Leu Val Ser Asn Gly Val Pro Val Ser Arg Ile Ser 165 170 175 Ala Val Gly Leu Gly Glu Ser Gln Ala Gln Met Thr Gln Val Cys Glu 180 185 190 Ala Glu Val Ala Lys Leu Gly Ala Lys Val Ser Lys Ala Lys Lys Arg 195 200 205 Glu Ala Leu Ile Ala Cys Ile Glu Pro Asp Arg Arg Val Asp Val Lys 210 215 220 Ile Arg Ser Ile Val Thr Arg Gln Val Val Pro Ala His Asn His His 225 230 235 240 Gln His

Claims (14)

1. 하기 단계를 포함하는, 자발적으로 방출되는 박테리아 외막 소포 (OMV)를 생성하는 방법:
   a) 그람 음성 박테리아의 집단을 배양하는 단계로서, 상기 배양은 35℃에서 측정되는 경우, 30% 공기 포화도의 생리적 DOT보다 더 높은 용존 산소 분압 (DOT)의 적용에 의한 OMV 방출의 자극을 포함하는 단계; 및,
   b) a)에서 방출되는 OMV를 회수하는 단계로서, 상기 회수는 적어도 OMV로부터 박테리아의 제거를 포함하는 단계.
2. 제1항에 있어서, OMV의 방출을 자극하기 위해 적용되는 DOT가 35℃에서 측정되는 경우, 적어도 31, 32, 35, 40, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150 또는 200% 공기 포화도이고, 바람직하게는, OMV의 방출을 자극하기 위해 적용되는 DOT가 35℃에서 측정되는 경우, 350, 325, 300, 275, 250, 225, 205 또는 185% 미만의 공기 포화도인, 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 배양은 공급 배지의 첨가를 사용하는 모드를 포함하고, 상기 모드는 유가식 모드, 반연속식 모드 및 연속식 모드로부터 선택되는, 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은
   a) 그람 음성 박테리아의 바이오매스가 제1 DOT에 축적되는 제1 단계; 및,
   b) a)에서 축적된 바이오매스로부터의 OMV의 방출이 제1 DOT보다 더 높은 제2 DOT의 적용에 의해 자극되는 제2 단계;
   를 포함하고;
   여기서, 바람직하게는, 제1 DOT가 35℃에서 측정되는 경우, 생리적 DOT, 바람직하게는 50, 40, 35 또는 32% 미만의 공기 포화도의 DOT인, 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 그람 음성 박테리아가
   a) 박테리아가 독성이 감소된 LPS를 생성하지만, LPS가 그의 애주번트 (adjuvant) 활성의 적어도 일부를 유지하게 하는 유전자 변형으로서; 바람직하게는 상기 유전자 변형은 lpxL1 및 lpxL2 유전자 또는 그의 상동체 및 lpxK 유전자 또는 그의 상동체로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현을 감소시키거나 녹아웃 (knock-out)시키는 변형이고/거나, 하나 이상의 lpxE 및/또는 pagL의 유전자의 발현에 영향을 미치는 변형인 유전자 변형;
   b) 박테리아가, 유전자 변형의 부재 하의 상응하는 야생형 박테리아와 비교하여 OMV를 과생성하게 하는 유전자 변형으로서, 상기 유전자 변형은 펩티도글리칸 연관 부위를 포함하는 하나 이상의 단백질의 펩티도글리칸-결합 활성을 약화시키는 변형이고, 바람직하게는 상기 유전자 변형은 tolQ, tolR, tolA, tolB, tolRA, rmpM 및 ompA 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현을 감소시키거나 녹아웃시키는 변형인 유전자 변형; 및
   c) 유전자 산물, 바람직하게는 cps, 지질 A 생합성 유전자 산물, PorA, PorB 및 OpA로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 산물의 발현을 감소시키거나 녹아웃시키는 유전자 변형
   중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 그람 음성 박테리아가 네이세리아 (Neisseria), 보르데텔라 (Bordetella), 헬리코박터 (Helicobacter), 살모넬라 (Salmonella), 비브리오 (Vibrio), 쉬겔라 (Shigella), 하에모필루스 (Haemophilus), 슈도모나스 (Pseudomonas), 에세리키아 (Escherichia), 모락셀라 (Moraxella), 클레브시엘라 (Klebsiella) 및 아시네토박터 (Acinetobacter) 속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 속에 속하고, 바람직하게는 박테리아가 베이세리아 메닝기티디스, 네이세리아 락타미카 (Neisseria lactamica), 네이세리아 고노르호에아에 (Neisseria gonorrhoeae), 헬리코박터 필로리 (Helicobacter pylori), 살모넬라 타이피 (Salmonella typhi), 살모넬라 타이피무리움 (Salmonella typhimurium), 비브리오 콜레아에 (Vibrio cholerae), 쉬겔라 종 (Shigella spp.), 하에모필루스 인플루엔자에 (Haemophilus influenzae), 보르데텔라 페르투시스 (Bordetella pertussis), 슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa), 에세리키아 콜라이 (Escherischia coli), 모락셀라 카타르할리스 (Moraxella catarrhalis), 클레브시엘라 네우모니아에 (Klebsiella pneumoniae) 및 아시네토박터 바우만니이 (Acinetobacter baumannii)로 이루어진 군으로부터 선택되는 종의 것인, 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 그람 음성 박테리아가 상기 그람 음성 박테리아에 대해 외인성인 항원을 발현하는, 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 그람 음성 박테리아가 다수의 항원을 발현하고, 바람직하게는 상기 집단은 그람 음성 박테리아의 하나 초과의 균주를 포함하고, 각 균주는 상이한 항원을 발현하는, 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, OMV가 바람직하게는 필터 멸균에 의해, 바람직하게는 약 0.3 마이크로미터 미만의 기공을 갖는 필터를 사용하여 멸균되는, 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 부형제 및 선택적으로 애주번트와 OMV를 조합하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, OMV는 백신에 사용하기 위한 것인, 방법.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 방법에 의해 획득되는 OMV.
13. 제12항에 따른 OMV 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제 및 선택적으로 애주번트를 포함하는 약제학적 조성물.
14. 바람직하게는 수막염의 치료에서 의약으로서 사용하기 위한 제12항에 따른 OMV 또는 제13항에 따른 약제학적 조성물.

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