CN109554311B - 一种鼠伤寒沙门氏菌外膜囊泡的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种鼠伤寒沙门氏菌外膜囊泡的提取方法，包括下述步骤：(1)将沙门氏菌菌液，进行10,000×g，4℃，15min离心；(2)回收上清，不要将菌液沉淀倒出，进行13,000×g，4℃，15min离心；(3)回收上清，用PVDF膜滤器进行过滤2次；(4)将过滤的上清进行40,000×g，4℃，2h；弃去上清。本发明应用的高速离心的方案，用40,000×g的离心力成功的对鼠伤寒沙门氏菌的OMVs进行了提取。本发明还解决了鞭毛在OMVs提取物种大量存在的问题，本发明通过应用基因靶向编辑技术对鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛基因进行敲除，从而获得高纯度的OMVs。

Description

一种鼠伤寒沙门氏菌外膜囊泡的提取方法
技术领域
本发明涉及一种鼠伤寒沙门氏菌外膜囊泡的提取方法。
背景技术
外膜囊泡(Outer membrane vesicles，OMVs)具有脂质双分子层的纳米级膜结构，大小在20-250nm之间，由革兰氏阴性菌天然产生。致病菌及非致病菌均能产生OMVs，含有菌体的大量成分，其中包含脂多糖(LPS)，周质及膜相关蛋白，酶类，毒素，DNA，RNA及肽聚糖。形成方式主要是由于蛋白错误折叠或外膜结构的破坏，外膜形成凸起，以出芽的形式输出。由于其产生与细菌的耐药，致病，生物被膜形成等相关，而且可以作为新兴的生物载体，因此，近些年来对其研究成为热点。
对于OMVs的研究的首要问题是如何简便的获取高质量的OMVs，目前对OMVs的提取的方法最主要的为超速离心法和密度梯度离心法。但这两种方法都需要用到超速离心机，超速离心时的转速在150,000×g左右，而超速离心机的容量是有限的并不适合大规模的提取，同时对于像鼠伤寒沙门氏菌这种具有丰富鞭毛成分的菌株，以上方法是无法对其进行有效的去除的，因此如何较为方便的获取纯度高的OMVs就成为一个难题。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种鼠伤寒沙门氏菌外膜囊泡的提取方法，解决了超速离心的问题，本发明应用的高速离心的方案，用40,000×g的离心力成功的对鼠伤寒沙门氏菌的OMVs进行了提取。
本发明提供一种鼠伤寒沙门氏菌外膜囊泡的提取方法，包括下述步骤：
(1)将沙门氏菌菌液，进行10,000×g，4℃，15min离心；
(2)回收上清，不要将菌液沉淀倒出，进行13,000×g，4℃，15min离心；
(3)回收上清，用PVDF膜滤器进行过滤2次；
(4)将过滤的上清进行40,000×g，4℃，2h；弃去上清。
作为优选，步骤(3)中，所述PVDF膜滤器的规格为0.45μm。
作为优选，步骤(4)中，将弃去上清的沉淀物用0.01M的PBS进行重悬。
进一步优选，将弃去上清的沉淀物用0.01M的PBS进行重悬后，再用0.45μm PVDF滤器过滤，取滤液，进行40,000×g，4℃，2h的离心，弃去上清，用PBS进行重悬。
作为优选，步骤(1)中，所述沙门氏菌为敲除鞭毛基因的鼠伤寒沙门氏菌。
本发明还解决了鞭毛在OMVs提取物种大量存在的问题，本发明通过应用基因靶向编辑技术对鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛基因进行敲除，从而获得高纯度的OMVs。
作为优选，步骤(1)中，所述沙门氏菌为敲除fliC基因的鼠伤寒沙门氏菌。
作为优选，步骤(1)中，所述敲除fliC基因是通过Red同源基因重组技术敲除的。
本发明提供鼠伤寒沙门氏菌外膜囊泡fliC基因缺失株，其制备过程如下：
(1)设计引物：
FliC-H1P1：GCAACAGCCCAATAACATCAAGTTGTAATTGATAAGGAAAAGATCgtgtaggctggagctgc ttc；
FliC-H2P2：CGCTGCCTTGATTGTGTACCACGTGTCGGTGAATCAATCGCCGGAcatatgaatatcctcctt ag；
(2)线性打靶片段的制备：用fliC-H1P1/fliC-H2P2，以pKD4质粒为模板，扩增两侧带有FRT位点的Kan的fliC打靶片段；
(3)FliC基因被Kan抗性基因替换：将打靶片段导入到含有pkD46的CVCC541的感受态中，利用Red同源重组技术敲除CVCC541基因组FliC基因片段；
(4)Kan的消除：将编码FLP重组酶的pCP20质粒导入到CVCC541fliC::Kan感受态中，诱导Kan的消除。
本发明实现了在高速离心情况下对提取高纯度鼠伤寒伤寒沙门氏菌OMVs的方法。为鼠伤寒沙门氏菌OMVs研究奠定了重要的作用。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为提取的CVCC541菌株OMVs的粒径大小分布情况。
图2为CVCC541菌株OMVs提取的蛋白分布图。
图3为CVCC541提取的OMVs的扫描电镜图。
图4为密度梯度离心OMVs存在部位分析。
图5为密度梯度离心获得的OMVs透射电镜图。
图6为鼠伤寒沙门氏菌CVCC541菌株FliC鞭毛基因敲除株的构建流程。
图7为线性打靶片段的SDS电泳图。
图8为FliC基因被Kan抗性基因替换鉴定结果。
图9为Kan的消除鉴定结果。
图10为鞭毛基因敲除前后菌株透射电镜图。
图11为fliC敲除前后OMVs蛋白图谱。
图12为fliC缺失前后OMVs的透射电镜图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
实施例1
一、鼠伤寒沙门氏菌的OMVs的提取
1、将培养到稳定期前期的1L沙门氏菌CVCC541菌液，进行10,000×g，4℃，15min离心。
2、回收上清，注意不要将菌液沉淀倒出，可留一定液体，进行13,000×g，4℃，15min离心。
3、回收上清，用0.45μm的PVDF膜滤器进行过滤2次。
4、将过滤的上清进行40,000×g，4℃，2h。由于离心管的大小有限，可将1L的滤液进行多次离心。
5、弃去上清，用0.01M的PBS进行重悬，并稀释。并将其用0.45μm PVDF滤器过滤，并取1ml滤液进行涂板，鉴定菌体是否完全去除。
0.01M的PBS的配方为：8g NaCl，0.2g KCl，1.42g Na2HPO4和0.27g KH2PO4，溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L。保存于4℃冰箱中即可。
6、将得到的无菌体滤液进行40,000×g，4℃，2h的离心。
7、弃去上清，用500μl的0.01M的PBS进行重悬。
二、CVCC541菌株OMVs提取物的分析
1、步骤一中提取的CVCC541菌株OMVs的粒径大小分布情况
图1为提取的CVCC541菌株OMVs的粒径大小分布情况。
由图1可知，提取的CVCC541菌株OMVs的颗粒大小范围主要分布在100nm左右，符合OMVs的大小范围。
2、对步骤一中提取的CVCC541菌株OMVs进行SDS-PAGE，观察其蛋白存在的状态，观察OMVs标记蛋白的存在情况。
图2为CVCC541菌株OMVs提取的蛋白分布图；其中，1：CVCC541OMVs提取物，2:14-160kDa Blue
Figure BDA0001910029230000051
III Protein Marker；3：菌体总裂解物。
由图2可知，提取物中存在少量的标记蛋白，说明存在OMVs，但含量很少。说明应用步骤一的方法能够进行OMVs的提取，但是纯度较低。蛋白在鞭毛蛋白大小的位置处存在大量的蛋白，说明可能存在大量鞭毛成分。
3、为进一步确定步骤2中的猜测是否正确，对CVCC541菌株OMVs进行透射电镜观察。
图3为CVCC541提取的OMVs的扫描电镜图(左图：稀释10倍；右图：稀释50倍)。
由图3可知，OMVs提取物中存在大量的鞭毛成分，只有少量的OMVs成分存在于其网状结构中，与蛋白图谱的结果是一致的。
实施例2
为了消除实施例1获得的OMVs提取物中大量的鞭毛成分，提高OMVs的纯度，采用不同方法对其进行处理。
一、对获得的OMVs提取物进行密度梯度离心进一步纯化除去鞭毛
将实施例1提取的OMVs提取物加入到由下而上的45％，40％，35％，30％，25％，20％含量的Optiprep试剂中，进行10000g，4℃，16h的超速离心，对离心物进行从上而下的整体积的取出，并进行SDS-PAGE电泳进行蛋白电泳，观察纯化结果。结果见图4。
图4为密度梯度离心OMVs存在部位分析。从左到右依次为M和1-12泳道。其中，M:Marker；1,2:20％Optiprep；3,4:25％Optiprep；5,6:30％Optiprep；7,8:35％Optiprep；9,10:40％Optiprep；11,12:45％Optiprep。
由图4可知，蛋白主要集中在30％Optiprep处，且几乎全为鞭毛蛋白，而此密度正是OMVs的密度范围，说明密度梯度离心也无法将鞭毛成分去除掉。
为了进一步确定该结论，对此密度离心结果进行透射电镜观察，结果见图5。
图5为密度梯度离心获得的OMVs透射电镜图。
由图5可以更为直观的观察到密度梯度离心并不能去除鞭毛成分。
二、应用基因靶向编辑技术对其鞭毛基因进行敲除
1、鼠伤寒沙门氏菌CVCC541菌株FliC鞭毛基因敲除株的构建
应用red同源重组技术构建，构建流程如图6。
图6为鼠伤寒沙门氏菌CVCC541菌株FliC鞭毛基因敲除株的构建流程。
1.1引物设计
根据Genbank数据库公布的鼠伤寒沙门氏菌fliC基因的序列，用primer 5.0进行引物设计，如表1所示。
表1鼠伤寒沙门氏菌fliC基因的引物
Figure BDA0001910029230000061
1.2线性打靶片段的制备、鉴定
用fliC-H1P1/fliC-H2P2，以pKD4质粒为模板，扩增两侧带有FRT位点的Kan的fliC打靶片段，将扩增片段进行SDS-PAGE电泳，结果见图7。
图7为线性打靶片段的核酸电泳图；其中，M：250ladder；1：fliC-H1P1/fliC-H2P2(1567bp)；2：空白对照。
由图7可知，应用上述方法扩增得到了线性打靶片段。
其中，扩增反应体系为：
Figure BDA0001910029230000071
Figure BDA0001910029230000072
1.3 FliC基因被Kan抗性基因替换及鉴定
将打靶片段导入到含有pkD46的CVCC541的感受态中，利用Red同源重组技术敲除CVCC541基因组FliC基因片段，并用fliC-F/fliC-R(2081bp)，K1/fliC-R(1233bp)，fliC-F/K2(1276bp)，K1/K2(471bp)对其进行鉴定，结果见图8。
图8为FliC基因被Kan抗性基因替换的鉴定结果；其中，M：DL2000；1：fliC-F/fliC-R；2：K1/fliC-R；3：fliC-F/K2；4：K1/K2。
由图8可知，成功构建CVCC541fliC：：Kan菌株。
1.4Kan的消除
将编码FLP重组酶的pCP20质粒导入到CVCC541fliC::Kan感受态中，在30℃培养过夜，然后在42℃中诱导Kan的消除，最终获得的菌株用引物fliC-F/fliC-R进行SDS-PAGE鉴定，结果见图9。
图9为Kan的消除鉴定结果。其中，M：DL2000；1，2：CVCC541fliC(644bp)；4：CVCC541(2081bp)；3：空白对照。
由图9可知，flic敲除前后获得了目的大小的片段，并对其进行PCR产物测序，结果与预期一致，说明CVCC541fliC构建成功。测序结果如下：
缺失前
GCAACAGCCCAATAACATCAAGTTGTAATTGATAAGGAAAAGATCatggcacaagtcattaatacaaacagcctgtcgctgttgacccagaataacctgaacaaatcccagtccgctctgggcaccgctatcgagcgtctgtcttccggtctgcgtatcaacagcgcgaaagacgatgcggcaggtcaggcgattgctaaccgttttaccgcgaacatcaaaggtctgactcaggcttcccgtaacgctaacgacggtatctccattgcgcagaccactgaaggcgcgctgaacgaaatcaacaacaacctgcagcgtgtgcgtgaactggcggttcagtctgctaacagcaccaactcccagtctgacctcgactccatccaggctgaaatcacccagcgcctgaacgaaatcgaccgtgtatccggccagactcagttcaacggcgtgaaagtcctggcgcaggacaacaccctgaccatccaggttggtgccaacgacggtgaaactatcgatatcgatctgaagcagatcaactctcagaccctgggtctggatacgctgaatgtgcaacaaaaatataaggtcagcgatacggctgcaactgttacaggatatgccgatactacgattgctttagacaatagtacttttaaagcctcggctactggtcttggtggtactgaccagaaaattgatggcgatttaaaatttgatgatacgactggaaaatattacgccaaagttaccgttacggggggaactggtaaagatggctattatgaagtttccgttgataagacgaacggtgaggtgactcttgctggcggtgcgacttccccgcttacaggtggactacctgcgacagcaactgaggatgtgaaaaatgtacaagttgcaaatgctgatttgacagaggctaaagccgcattgacagcagcaggtgttaccggcacagcatctgttgttaagatgtcttatactgataataacggtaaaactattgatggtggtttagcagttaaggtaggcgatgattactattctgcaactcaaaataaagatggttccataagtattaatactacgaaatacactgcagatgacggtacatccaaaactgcactaaacaaactgggtggcgcagacggcaaaaccgaagttgtttctattggtggtaaaacttacgctgcaagtaaagccgaaggtcacaactttaaagcacagcctgatctggcggaagcggctgctacaaccaccgaaaacccgctgcagaaaattgatgctgctttggcacaggttgacacgttacgttctgacctgggtgcggtacagaaccgtttcaactccgctattaccaacctgggcaacaccgtaaacaacctgacttctgcccgtagccgtatcgaagattccgactacgcgaccgaagtttccaacatgtctcgcgcgcagattctgcagcaggccggtacctccgttctggcgcaggcgaaccaggttccgcaaaacgtcctctctttactgcgttaaTCCGGCGATTGATTCACCGACACGTGGTACACAATCAAGGCAGCG
缺失后
gcaacagcccaataacatcaagttgtaattgataaggaaaagatcGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTAAGGAGGATATTCATATGtccggcgattgattcaccgacacgtggtacacaatcaaggcagcg
2、应用基因靶向编辑技术对其鞭毛基因进行敲除的结果测定
(1)图10为鞭毛基因敲除前后菌株透射电镜图。其中，A图为鼠伤寒沙门氏菌CVCC541，B图为鼠伤寒沙门氏菌CVCC541△flic缺失株。
(2)应用实施例1步骤一中的方法对OMVs进行提取，然后进行SDS-PAGE，观察其蛋白存在的状态，结果见图11。
图11为fliC敲除前后OMVs蛋白图谱；其中，M：蛋白预染Marker；1：OMVs(CVCC541△fliC)；2,3：OMVs(CVCC541)。
由图11可知，鞭毛敲除后OMVs标记性蛋白占主要比例，且无鞭毛蛋白成分，说明纯度有很大的提高。
(3)为了进一步确定该结论，应用实施例1步骤中的方法对OMVs进行提取，对提取物进行透射电镜观察，结果见图12。
图12为fliC缺失前后OMVs的透射电镜图；其中，A：鼠伤寒沙门氏菌CVCC541；B：鼠伤寒沙门氏菌CVCC541△fliC。
由图12可知，fliC基因的敲除，使提取的OMVs成分中不含有鞭毛成分，使OMVs纯度大大提高，同时可以看出提取的OMVs大多数以聚集的形式存在。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 一种鼠伤寒沙门氏菌外膜囊泡的提取方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1578
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcaacagccc aataacatca agttgtaatt gataaggaaa agatcatggc acaagtcatt 60
aatacaaaca gcctgtcgct gttgacccag aataacctga acaaatccca gtccgctctg 120
ggcaccgcta tcgagcgtct gtcttccggt ctgcgtatca acagcgcgaa agacgatgcg 180
gcaggtcagg cgattgctaa ccgttttacc gcgaacatca aaggtctgac tcaggcttcc 240
cgtaacgcta acgacggtat ctccattgcg cagaccactg aaggcgcgct gaacgaaatc 300
aacaacaacc tgcagcgtgt gcgtgaactg gcggttcagt ctgctaacag caccaactcc 360
cagtctgacc tcgactccat ccaggctgaa atcacccagc gcctgaacga aatcgaccgt 420
gtatccggcc agactcagtt caacggcgtg aaagtcctgg cgcaggacaa caccctgacc 480
atccaggttg gtgccaacga cggtgaaact atcgatatcg atctgaagca gatcaactct 540
cagaccctgg gtctggatac gctgaatgtg caacaaaaat ataaggtcag cgatacggct 600
gcaactgtta caggatatgc cgatactacg attgctttag acaatagtac ttttaaagcc 660
tcggctactg gtcttggtgg tactgaccag aaaattgatg gcgatttaaa atttgatgat 720
acgactggaa aatattacgc caaagttacc gttacggggg gaactggtaa agatggctat 780
tatgaagttt ccgttgataa gacgaacggt gaggtgactc ttgctggcgg tgcgacttcc 840
ccgcttacag gtggactacc tgcgacagca actgaggatg tgaaaaatgt acaagttgca 900
aatgctgatt tgacagaggc taaagccgca ttgacagcag caggtgttac cggcacagca 960
tctgttgtta agatgtctta tactgataat aacggtaaaa ctattgatgg tggtttagca 1020
gttaaggtag gcgatgatta ctattctgca actcaaaata aagatggttc cataagtatt 1080
aatactacga aatacactgc agatgacggt acatccaaaa ctgcactaaa caaactgggt 1140
ggcgcagacg gcaaaaccga agttgtttct attggtggta aaacttacgc tgcaagtaaa 1200
gccgaaggtc acaactttaa agcacagcct gatctggcgg aagcggctgc tacaaccacc 1260
gaaaacccgc tgcagaaaat tgatgctgct ttggcacagg ttgacacgtt acgttctgac 1320
ctgggtgcgg tacagaaccg tttcaactcc gctattacca acctgggcaa caccgtaaac 1380
aacctgactt ctgcccgtag ccgtatcgaa gattccgact acgcgaccga agtttccaac 1440
atgtctcgcg cgcagattct gcagcaggcc ggtacctccg ttctggcgca ggcgaaccag 1500
gttccgcaaa acgtcctctc tttactgcgt taatccggcg attgattcac cgacacgtgg 1560
tacacaatca aggcagcg 1578
<210> 2
<211> 174
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcaacagccc aataacatca agttgtaatt gataaggaaa agatcgtgta ggctggagct 60
gcttcgaagt tcctatactt tctagagaat aggaacttcg gaataggaac taaggaggat 120
attcatatgt ccggcgattg attcaccgac acgtggtaca caatcaaggc agcg 174

Claims (3)

1.一种鼠伤寒沙门氏菌外膜囊泡的提取方法，其特征在于：包括下述步骤：
（1）将鼠伤寒沙门氏菌菌液，进行10,000×g，4℃，15min离心；所述鼠伤寒沙门氏菌为敲除fliC基因的鼠伤寒沙门氏菌CVCC541；
（2）回收上清，不要将菌液沉淀倒出，进行13,000×g，4℃，15min离心；
（3）回收上清，用0.45μm PVDF膜滤器进行过滤2次；
（4）将过滤的上清进行40,000×g，4℃，2h；弃去上清；将弃去上清的沉淀物用0.01M的PBS进行重悬，再用0.45μm PVDF滤器过滤，取滤液，进行40,000×g，4℃，2h的离心，弃去上清，用PBS进行重悬。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述敲除fliC基因是通过Red同源基因重组技术敲除的。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述敲除fliC基因的方法如下：
（1）设计引物：
FliC-H1P1：GCAACAGCCCAATAACATCAAGTTGTAATTGATAAGGAAAAGATCgtgtaggctggagctgcttc；
FliC-H2P2：CGCTGCCTTGATTGTGTACCACGTGTCGGTGAATCAATCGCCGGAcatatgaatatcctccttag；
（2）线性打靶片段的制备：用fliC-H1P1/fliC-H2P2，以pKD4质粒为模板，扩增两侧带有FRT位点的Kan的fliC打靶片段；
（3）FliC基因被Kan抗性基因替换：将打靶片段导入到含有pkD46的鼠伤寒沙门氏菌CVCC541的感受态中，利用Red同源重组技术敲除鼠伤寒沙门氏菌CVCC541基因组FliC基因片段；
（4）Kan的消除：将编码FLP重组酶的pCP20质粒导入到鼠伤寒沙门氏菌CVCC541fliC::Kan感受态中，诱导Kan的消除。
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