CN114317414B - 非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株及其应用。本发明的非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株已于2021年10月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23098。本发明采用非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株生产猪乙型脑炎病毒抗原，较传统转瓶培养工艺、较大的简化了生产工艺，降低了生产成本。

Description

非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株及其应用

技术领域

本发明涉及兽用生物制品领域，尤其涉及非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株及其应用。

背景技术

乙型脑炎又称日本脑炎(Japanese encephalitis，JE)，简称乙型脑炎，是由乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis Virus，JEV)引起的一种人畜共患传染病，我国将猪乙型脑炎归为二类动物疫病，猪乙型脑炎病毒归为第三类动物病原微生物。本病经由蚊虫媒介而传播，有严格的季节性，流行于6～10月，集中于7、8、9三个月。同时蚊虫也是本病毒的长期储存宿主，猪为最主要的增殖宿主和传染源，人群中以儿童感染发病率较高。动物感染发病症状表现为发病急，高温高热，流产，死胎，病死率较高。在该病流行期间，猪对乙型脑炎病毒感染率几乎可达100％，但很多时候处于隐形感染状态，成为人乙型脑炎感染的主要来源。

目前，已有4种不同类型的JEV疫苗：鼠脑灭活疫苗、细胞培养灭活疫苗、细胞培养减毒活疫苗和基因工程减毒活疫苗。兽用乙型脑炎疫苗主要为鼠脑灭活疫苗和地鼠肾细胞乙型脑炎活疫苗。现有的猪乙型脑炎疫苗均存在一定的问题，如由鼠脑制备的疫苗存在成本高、杂蛋白多和易导致过敏反应等弊端，地鼠肾细胞活疫苗存在成本高，操作复杂，批间存在差异等弊端。

Vero细胞来源于非洲绿猴肾传代细胞，其优点是易于大规模培养，胞核学稳定，无外源因子污染，无致瘤性，是WHO推荐使用的人用疫苗生产基质，适用于大规模疫苗生产用的细胞源。此外，国内商品化猪乙型脑炎疫苗均采用传统转瓶培养方式，存在细胞易污染、劳动强度大等缺点。与转瓶培养工艺相比，反应器悬浮培养采用无血清培养，获得的细胞密度、病毒效价、产品质量均明显提高，无血清性外源病毒污染，生产能耗大幅降低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株。

本发明所提供的非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株，命名为Vero-zm，已于2021年10月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.23098。

本发明的的非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株可用于病毒生产中，还可以用于生产疫苗中。

本发明的另一个目的是提供一种制备猪乙型脑炎病毒抗原的方法。

本发明所提供的制备猪乙型脑炎病毒抗原的方法，包括：

采用非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株生产猪乙型脑炎病毒；

收获所述猪乙型脑炎病毒液，添加硫酸鱼精蛋白，经离心、过滤、浓缩、分子筛凝胶层析，得到猪乙型脑炎病毒抗原。

其中，所述非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株在V-SFM培养基上进行复苏和扩大培养。

其中，所述硫酸鱼精蛋白的终浓度1-2mg/ml。

其中，所述猪乙型脑炎病毒为猪乙型脑炎病毒SA14-14-2。

其中，在采用所述非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株生产猪乙型脑炎病毒中，所述病毒接种后孵育阶段的生物反应器的参数为：温度36～37℃，pH值7.2±0.1，溶氧40～60％，搅拌速度40～80rpm，通气量0.1～0.5SPLM。

其中，在采用所述非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株生产猪乙型脑炎病毒中，所述病毒孵育后的培养阶段的生物反应器的参数为：温度33～35℃，pH值7.4～7.8，溶氧40～60％，搅拌速度80～120rpm，通气量0.1～0.5SPLM。

其中，所述非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株的扩大培养阶段的生物反应器培养的参数为：溶氧20～60％，pH 7.0～7.4，搅拌转速80～120rpm/min，通气量0.1～0.5SPLM，温度35-37℃。

本发明采用Vero-zm生产猪乙型脑炎病毒抗原，较传统转瓶培养工艺、较大的简化了生产工艺，降低了生产成本。利用生物反应器的悬浮培养工艺生产猪乙型脑炎病毒SA14-14-2可以实现生物反应器的逐级放大，可获得高效价病毒抗原，减少批间差异，提升产品品质。采用Vero-zm生产的猪乙型脑炎病毒SA14-14-2，收获病毒液后，利用病毒蚀斑测定病毒含量达10^7.5PFU/ml以上。

具体实施方式

在下面的描述中，出于解释的目的，阐述了具体细节以便提供对本公开的理解。

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

如无特殊说明，本文提及的百分含量为质量百分含量。

实施例1、Vero全悬浮细胞株的制备

将适应乙型脑炎病毒SA14-14-2株的贴壁培养Vero细胞，作为候选悬浮驯化细胞。贴壁Vero细胞经过逐级悬浮专用培养基驯化及降血清适应两个阶段，制备成为全悬浮适应细胞株。

1、逐级悬浮驯化过程

将贴壁培养Vero细胞用胰蛋白酶消化后，以细胞1～2×10⁶细胞/ml密度，按8％～10％浓度添加新生牛血清接种悬浮细胞瓶，置于恒温振荡器中，37℃，120rpm/min，5％的二氧化碳浓度下培养。分别以原培养基(DMEM)与悬浮专用培养基比例为75％：25％、50％：50％、25％：75％和0：100％的四种培养基比例进行驯化，以每种培养基配比传代细胞3代以上，达正常悬浮适应状态(细胞达到正常倍增速率，活率达90％以上)，进行下一个配比细胞传代，直至细胞完全适应悬浮专用培养基培养，并可稳定传代。

2、低血清悬浮驯化过程

通过逐级降低血清的方式驯化上述在8％～10％浓度新生牛血清的悬浮专用培养基中培养的悬浮细胞。逐步降低(分别为8％、6％、4％、2％)悬浮传代细胞的牛血清用量，每种血清浓度细胞稳定传代3代以上，达到细胞正常悬浮适应状态(细胞达到正常倍增速率，活率达90％以上)，进行下一个血清浓度细胞传代，直至细胞完全适应低血清悬浮培养，并可稳定传代。将适应低血清的Vero全悬浮细胞株命名为Vero-zm。

Vero-zm已于2021年10月26日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.23098。

Vero-zm对不同培养基的适应性

从市面上挑选四种国产商品化的Vero悬浮培养专用培养基(A、B、C、D)进行Vero全悬浮细胞株的适应性对比试验。

Vero悬浮培养专用培养基A：Vero602(浙江壹生科生物技术有限公司，产品代码：Y1131)；

Vero悬浮培养专用培养基B：V-SFM培养基(沃美生物技术有限公司，商品编号M21216101-2)；

Vero悬浮培养专用培养基C：CD培养基(gibco公司，商品编号为：A16277-03)；

Vero悬浮培养专用培养基D：CDPK15(健顺生物，商品编号为：10701)。

按照下述方法进行细胞复苏及细胞传代，在细胞在对应培养基中传代3代后，以相同条件接种猪乙型脑炎SA14-14-2种毒，在接毒后通过细胞染色计数(0.4％台盼蓝染色)，待细胞活率低于20％后，收获病毒液，并取样，采用病毒蚀斑试验进行疫苗病毒含量的测定。

1.细胞复苏

从液氮中取出冻存的Vero-zm，将其置于37℃水浴迅速解冻。解冻后的细胞转移至离心管中，添加新鲜的Vero悬浮培养专用培养基(A、B、C或D)，静置5min后，800rpm离心5min，弃上清，用新鲜的Vero悬浮培养专用培养基重悬。以初始密度0.8×10⁶个细胞/ml接种于250ml细胞摇瓶中的总体积为50ml的添加有新生牛血清4％的悬浮培养专用培养基中，置于恒温振荡器中，37℃，120rpm/min，5％的二氧化碳浓度下培养。细胞每日取样计数，分析细胞活率及细胞倍增速率。细胞正常培养48h，达到正常倍增速率3～6×10⁶个细胞/ml，细胞活率达95％以上。

2.细胞传代

细胞培养48h后取样计数，细胞密度达到3～6×10⁶个细胞/ml，细胞活率达95％以上。用Vero悬浮培养专用培养基稀释细胞，然后以细胞终浓度为0.8×10⁶个细胞/ml接种于250ml细胞摇瓶中的总体积为50ml的添加有新生牛血清4％的Vero悬浮培养专用培养基中，置于恒温振荡器中，37℃，120rpm/min，5％的二氧化碳浓度下进行培养。细胞每日取样计数，分析细胞活率及细胞倍增速率。

3.病毒接种孵育

病毒接种量为0.5M.O.I，接种病毒后，在60rpm/min低搅拌转速，温度37℃，pH值为7.2，溶氧(DO)50％，通气量为0.1～0.5SPLM的条件下在生物反应器中进行病毒吸附过程，吸附时间为60min。

4.测定病毒含量

将病毒进行10倍系列稀释，取10^-2、10^-3、10^-4 3个稀释度，分别接种于生长BHK-21细胞单层的12孔细胞板中，每个稀释度设3个重复孔，0.1mL/孔。病毒接种后于37℃吸附90min，加覆盖物(含1.5％甲基纤维素、2％小牛血清的DMEM)，5天后用结晶紫染色、固定30min，流水冲洗，干燥后计数各孔蚀斑数，进行病毒含量测定(LogPFU/mL)。分别记录细胞培养3代后的细胞生长形态、密度等参数。四种培养基的具体数据详见下表1：

表1.四种悬浮培养基在Vero-zm细胞株培养特性及产毒效果方面的结果

*备注：细胞活率测定通过0.4％台盼蓝细胞染色计数，判定细胞活率。

由上述试验结果可看出，对于四种商品化培养基，在细胞密度、形态以及猪乙型脑炎病毒SA14-14-2的产毒方面，Vero-zm细胞在Vero悬浮培养专用培养基B中培养均优于在其他3种培养基中培养。因此，优选Vero悬浮培养专用培养基B(V-SFM培养基(沃美生物技术有限公司，商品编号M21216101-2))作为用于制备猪乙型脑炎病毒抗原的候选培养基。

实施例2、猪乙型脑炎灭活疫苗组合物

Vero-zm细胞株复苏及传代培养

1.悬浮种细胞复苏

从液氮中取出冻存的Vero-zm细胞株，将其置于37℃水浴迅速解冻。解冻后的细胞转移至离心管中，添加新鲜的悬浮细胞专用培养基B，静置5min后，800rpm离心5min，弃上清，用新鲜的悬浮培养专用培养基重悬。以初始密度0.8×10⁶个细胞/ml接种于250ml细胞摇瓶中的总体积为50ml的添加有新生牛血清4％的悬浮培养专用培养基中，置于恒温振荡器中，37℃，120rpm/min，5％的二氧化碳浓度下培养。细胞每日取样计数，分析细胞活率及细胞倍增速率。细胞正常培养48h，达到正常倍增速率3～6×10⁶个细胞/ml，细胞活率达95％以上。

2.细胞传代

细胞培养48h后取样计数，细胞密度达到3～6×10⁶个细胞/ml，细胞活率达95％以上。用悬浮培养专用培养基稀释细胞，然后以细胞终浓度为0.8×10⁶个细胞/ml接种于250ml细胞摇瓶中的总体积为50ml的添加有新生牛血清4％的悬浮培养专用培养基中，置于恒温振荡器中，37℃，120rpm/min，5％的二氧化碳浓度下进行培养。细胞每日取样计数，分析细胞活率及细胞倍增速率。

Vero-zm悬浮细胞在生物反应器逐级放大培养

1.Vero-zm悬浮细胞10L生物反应器悬浮培养

细胞株在摇瓶中悬浮培养1～3代后，转移至10L生物反应器中，并补加悬浮培养基，使细胞浓度为0.6×10⁶个细胞/ml，添加4％新生牛血清，在37℃，pH值7.2，溶氧(DO)50％，搅拌速度100rpm，通气量0.1～0.3下进行培养，培养48h～72h，细胞每日取样计数，分析细胞活率及细胞倍增速率。培养48～72h后，细胞达到正常倍增速率3～6×10⁶cells/ml，细胞活率达95％以上，可进一步扩大培养。

2.Vero-zm悬浮细胞在10L-40L-100L生物反应器的连续放大培养

将10L生物反应器培养的Vero-zm悬浮细胞通过连接转移至40L生物反应器中，添加悬浮培养专用培养基调整细胞密度为0.6×10⁶个细胞/ml，添加新生牛血清4％进行，在37℃，pH值7.2，溶氧DO值50％，搅拌速度100rpm，通气量0.1～0.3下进行培养，培养48h～72h，细胞每日取样计数，分析细胞活率及细胞倍增速率。培养48～72h后，细胞达到正常倍增速率3～6×10⁶个细胞/ml，细胞活率达95％以上，细胞可进一步扩大培养。以此培养工艺，将细胞放大至100L生物反应器中进行培养。

猪乙型脑炎病毒SA14-14-2株的100L级反应器的生产

采用上述制备的100L悬浮培养细胞，经过细胞沉降换液阶段、病毒接种孵育阶段、病毒培养至收获阶段完成猪乙型脑炎病毒SA14-14-2株的生成：

1.细胞沉降换液阶段

将上述制备的100L悬浮培养细胞，经在10～20℃低温冷水浴中静止沉降4～8h后，细胞大部分沉降，通过反应器提清装置排出总体积一半的细胞生长液。

2.病毒接种孵育阶段

将上述细胞沉降换液后，接种猪乙型脑炎SA14-14-2种毒，病毒接种量为0.5M.O.I，接种病毒后，在60rpm/min低搅拌转速，温度37℃，pH值为7.2，溶氧(DO)50％，通气量为0.1～0.5SPLM的条件下在生物反应器中进行病毒吸附过程，吸附时间为60min。

3.病毒培养至收获阶段

在上述病毒接种孵育后，添加含有4％新生牛血清的悬浮细胞专用培养基B(pH7.8)至原培养体积，在反应器中，在温度35℃，溶氧(DO)50％，搅拌速度100rpm，通气量为0.1～0.5SPLM下继续培养。每日观察细胞并计数，监测细胞生长状态，同时根据pH值变化，利用碳酸氢钠7.5～10％(w/v)调节pH值；根据葡萄糖的消耗，利用葡萄糖浓缩液20～40％(w/v)适时补充培养液中的葡萄糖。培养至细胞活率低于20％，收获病毒液，冻融一次，取样检测病毒滴度，每mL病毒含量为10^7.5PFU。

猪乙型脑炎病毒SA14-14-2的浓缩纯化方法和工艺

1.病毒料液样品的处理：

收集猪乙型脑炎SA14-14-2病毒液，加入终浓度1mg/ml的硫酸鱼精蛋白，充分摇匀，4℃过夜。

2.病毒料液样品的离心：

采用高速连续离心的方法，猪乙型脑炎病毒在10000rpm离心30min，弃去沉淀，收集病毒上清液，4℃保存待用。

3.病毒料液样品超滤：

3.1系统预处理：将300KD中空纤维柱(仕必纯公司)/膜包密理博公司)安装到中空纤维/膜包控制设备系统(包括管路、泵和纤维/膜包)中，组装完成后用无菌注射用水冲洗整个系统20min，流速控制90L/min。

3.2系统完整性和水通量检测：无菌注射用水冲洗系统，室温下检测中空纤维柱/膜包水通量及系统是否漏液。

系统在线除菌和清洗：用无菌0.2mol/L NaOH溶液对系统进行循环灭菌处理30min，然后用无菌注射用水对超滤系统进行清洗，洗去残余NaOH溶液，直至pH达到7.0。

3.3系统平衡：用无菌0.01mol/L pH7.2 PBS溶液平衡10min，流速60L/min。离心后料液通过300KD中空纤维柱/膜包系统，进液端泵速控制在60L/min，透过端维持跨膜压1.5psi，收集回流端液体，待进液端料液剩余原体积的1/20，再补加的0.01mol/L PBS溶液至原体积，继续超滤，重复三次后，至达到原体积1/20，完成超滤过程。

4.分子筛层析凝胶纯化：

4.1层析填料装填及预处理：将4FF分子筛(GE公司)预装柱安装到位，柱效检测。

4.2用5～10个柱体积的无菌0.5mol/L NaOH处理分子筛凝胶层析柱，再用无菌注射水清洗至pH7.0，然后用5～10个柱体积的0.01mol/L 7.2PBS溶液平衡层析柱，电导率为15.45ms/cm，pH稳定在7.2，紫外UV280基线平稳。

4.5层析纯化：将超滤浓缩后的病毒样品上样，设定上样线性流速为10ml/min，压力控制小于2.0bar。上样量为10％柱体积，上样结束后，切换为0.01mol/L PBS缓冲液，UV280紫外检测吸光值，吸光值曲线呈上升趋势时，收集作为目的样品的出现的第一个峰，吸光值曲线的吸光值下降至最低处停止收集，对收集的峰值样品使用BCA Protein AssayKit(Thermo公司)进行蛋白去除率测定，蛋白去除率为98.7％。继续用5～10个柱体积的无菌0.5mol/L NaOH处理分子筛凝胶层析柱，再用无菌注射水清洗至pH7.0，获得浓缩纯化后的猪乙型脑炎病毒SA14-14-2抗原。

猪乙型脑炎灭活疫苗组合物的制备

1.猪乙型脑炎灭活抗原的制备

将β-丙内酯与猪乙型脑炎病毒SA14-14-2抗原按重量比1：4000于4℃搅拌灭活24小时，再于37℃水浴条件下水解2小时，制得猪乙型脑炎病毒灭活抗原。

2.动物疫苗油佐剂的制备

按重量百分比计以下述比例，称取定量的乳化剂和助剂，加入到称量好的埃克森美孚石油公司生产的注射用矿物油中，控制搅拌速度，进行物理混合，混合过程中采取加热助溶的方式，温度控制在80℃以下，混合均匀成液体后，经121℃灭菌30分钟，冷却至乳化温度即得所用动物疫苗油佐剂1-3。

油佐剂1由如下重量百分含量的组分组成：

油佐剂2由如下重量百分含量的组分组成：

油佐剂3由如下重量百分含量的组分组成：

3.猪乙型脑炎灭活疫苗组合物的制备

将灭菌冷却的所述动物疫苗油佐剂1-3分别添加到乳化罐中，搅拌混合均匀，控制搅拌速度为1000转/分，乳化温度为30℃；将与动物疫苗油佐剂等量的猪乙型脑炎病毒灭活抗原缓慢加入到制备的油佐剂中；添加完成后，进行预剪切乳化，控制剪切速度在3000转/分以下，预剪切乳化的过程为10分钟；预剪切完成后，控制转速8000转/分，进行剪切乳化，此过程为15分钟；乳化完成后，进行标记分装，获得猪乙型脑炎灭活疫苗组合物1-3。

猪乙型脑炎灭活疫苗组合物对小鼠的安全性试验

用12-14gICR小鼠进行安全性实验。实验分成4组(乙型脑炎灭活疫苗组合物1组、乙型脑炎灭活疫苗组合物2组、乙型脑炎灭活疫苗组合物3组和对照组)，每组10只小鼠。

在乙型脑炎灭活疫苗组合物1组、乙型脑炎灭活疫苗组合物2组、乙型脑炎灭活疫苗组合物3组中，每只小鼠脑内注射猪乙型脑炎灭活疫苗组合物0.03ml，3日内死亡数不得超过2只，其余小鼠连续观察14日，观察小鼠的精神、食欲及注射部位。

在对照组中，每只小鼠脑内注射培养基0.03ml，3日内死亡数不得超过2只，其余小鼠连续观察14日，观察小鼠的精神、食欲及注射部位。

注射猪乙型脑炎灭活疫苗组合物后，小鼠临床表现正常，精神状态良好、食欲正常，没有出现局部和全身不良反应，全部健活。结果见表2。

表2.ICR小鼠进行猪乙型脑炎灭活疫苗组合物安全性检验结果

猪乙型脑炎灭活疫苗组合物的对小鼠的免疫攻毒试验

用12-14g ICR小鼠进行小鼠免疫攻毒试验。实验分成5组(猪乙型脑炎灭活疫苗组合物1组、猪乙型脑炎灭活疫苗组合物2组、猪乙型脑炎灭活疫苗组合物3组、常规油佐剂猪乙型脑炎灭活疫苗对照组、攻毒对照组)，每组10只小鼠。

常规油佐剂猪乙型脑炎灭活疫苗对照组使用常规油佐剂(铝胶佐剂)猪乙型脑炎灭活疫苗，并按照下述方法制备：将灭菌冷却的常规油佐剂加入到乳化罐中，搅拌混合均匀，控制搅拌速度为1000转/分，乳化温度为30℃；将与常规油佐剂等量的上述制备的猪乙型脑炎病毒灭活抗原缓慢添加到常规油佐剂中；添加完成后，进行预剪切乳化，控制剪切速度在3000转/分以下，预剪切乳化的过程为10分钟；预剪切完成后，控制转速8000转/分，进行剪切乳化，此过程为15分钟；乳化完成后，进行标记分装，获得常规油佐剂猪乙型脑炎灭活疫苗。

攻毒对照组不免疫，在小鼠第2次接种疫苗后5日使用10⁵LD₅₀乙型脑炎P3强毒进行腹腔攻毒。

用pH 7.5的PBS以50倍、500倍和5000倍三个稀释度分别稀释猪乙型脑炎灭活疫苗组合物和常规油佐剂猪乙型脑炎灭活疫苗，每个稀释度分别经腹腔接种10-12g小鼠各10只，间隔7日作二次接种，每次0.5ml/只，同时取10只小鼠作为攻毒对照。全部小鼠于第2次接种后5日经腹腔攻击10⁵LD₅₀乙型脑炎P3强毒，每只0.3ml，并于腹腔攻击前每只小鼠脑内注射0.04ml病毒稀释液以破坏血脑屏障。攻毒后观察14天(3日内死亡不计)，攻毒对照组小鼠应出现不低于80％的死亡，14天后计算半数保护量(PD₅₀)。

通过小鼠的免疫攻毒试验，对猪乙型脑炎灭活疫苗组合物进行免疫原性评价。结果表明，常规油佐剂猪乙型脑炎灭活疫苗对照组PD₅₀为10^-2.03/0.3ml，猪乙型脑炎灭活疫苗组合物1组PD₅₀为10^-2.70/0.3ml，猪乙型脑炎灭活疫苗组合物2组PD₅₀为10^-2.60/0.3ml，猪乙型脑炎灭活疫苗组合物3组PD₅₀为10^-2.37/0.3ml。

由此可以看出，猪乙型脑炎灭活疫苗组合物1免疫原性最好，进行501倍稀释后，仍能使50％小鼠获得保护。猪乙型脑炎灭活疫苗组合物2进行398倍稀释后，仍能使50％小鼠获得保护。猪乙型脑炎灭活疫苗组合物3进行234倍稀释后，仍能使50％小鼠获得保护。采用常规油佐剂猪乙型脑炎灭活疫苗组免疫效果不佳，进行10⁷倍稀释后，能保护50％的小鼠，如表3所示。

表3.猪乙型脑炎灭活疫苗组合物半数保护量(PD₅₀)的测定

实施例3、猪乙型脑炎活疫苗组合物的制备

1.猪乙型脑炎活疫苗的制备

猪乙型脑炎病毒SA14-14-2抗原加入冻干保护剂(CN 103656661B所述的猪乙型脑炎活疫苗耐热冻干保护剂，具体地，实施例1的猪乙型脑炎活疫苗耐热冻干保护剂)经冷冻真空干燥制备猪乙型脑炎活疫苗。

2.猪乙型脑炎活疫苗水性佐剂的制备

按比例称取下列量的助剂、聚合物组合，依次添加到称量好的注射用水溶液中，控制搅拌速度，进行混合，混合过程中可采取加热助溶的方式，温度控制在60℃以下，混合均匀成液体后，经121℃灭菌30分钟，冷却至室温，获得猪乙型脑炎活疫苗水性佐剂1-3。

猪乙型脑炎活疫苗水性佐剂1，由如下重量百分含量的组分组成：

注射用水溶液88％；

聚合物组合：

助剂：

油酸 3％

猪乙型脑炎活疫苗水性佐剂2，由如下重量百分含量的组分组成：

助剂：

油酸 1％

猪乙型脑炎活疫苗水性佐剂3，由如下重量百分含量的组分组成：

助剂：

油酸 4％

3.猪乙型脑炎活疫苗组合物的制备

将猪乙型脑炎活疫苗用稀释液(1/15mol/L磷酸缓冲盐水，pH7.4)稀释成1头份(病毒含量10^6.0PFU/ml)，加入体积比为20％的本发明所提供的猪乙型脑炎活疫苗水性佐剂1-3，摇匀后制备出猪乙型脑炎活疫苗组合物4-6组。

4.常规铝胶佐剂乙型脑炎活疫苗组合物的制备

将猪乙型脑炎活疫苗用稀释液(1/15mol/L磷酸缓冲盐水，pH7.4)稀释成1头份(病毒含量10^6.0PFU/ml)，添加体积比为20％的常规市售铝胶佐剂(购自Invivogen公司)，摇匀后制备出乙型脑炎活疫苗组合物。

猪乙型脑炎活疫苗组合物的对小鼠安全性试验

用12-14g ICR小鼠进行安全性实验。实验分成4组(猪乙型脑炎活疫苗组合物4组、猪乙型脑炎活疫苗组合物5组、猪乙型脑炎活疫苗组合物6组和对照组)，每组10只小鼠。

在猪乙型脑炎活疫苗组合物4组、猪乙型脑炎活疫苗组合物5组、猪乙型脑炎活疫苗组合物6组中，每只小鼠脑内注射猪乙型脑炎活疫苗组合物0.03ml，3日内死亡数不得超过2只，其余小鼠连续观察14日，观察小鼠的精神、食欲及注射部位。

在对照组中，每只小鼠脑内注射培养基0.03ml，3日内死亡数不得超过2只，其余小鼠连续观察14日，观察小鼠的精神、食欲及注射部位。

注射猪乙型脑炎活疫苗组合物4-6组后，小鼠临床表现正常，精神状态良好、食欲正常，没有出现局部和全身不良反应，全部健活。结果见表4。

表4ICR小鼠进行猪乙型脑炎活疫苗组合物安全性检验结果

猪乙型脑炎活疫苗组合物的对小鼠免疫攻毒试验

用12-14gICR小鼠进行小鼠免疫攻毒试验。实验分成6组(猪乙型脑炎活疫苗组合物4组、猪乙型脑炎活疫苗组合物5组、猪乙型脑炎活疫苗组合物6组、猪乙型脑炎活疫苗组、常规铝胶佐剂乙型脑炎活疫苗组合物组、攻毒对照组)，每组10只小鼠。

用DMEM以10倍系列稀释稀释猪乙型脑炎活疫苗组合物4-6组和猪乙型脑炎活疫苗。取10^-2、10^-3、10^-4 3个稀释度，分别皮下接种10-12g ICR小鼠10只，每只0.1ml，免疫后14日，连同条件相同的对照组小鼠10只，各腹腔注射乙型脑炎病毒强毒P3株0.3ml(含500LD₅₀)，连续观察14日。

通过小鼠的免疫攻毒试验，对猪乙型脑炎活疫苗组合物4-6组进行免疫原性评价。结果表明，猪乙型脑炎活疫苗组PD₅₀为10^-3.0/0.3ml；常规铝胶佐剂乙型脑炎活疫苗组合物组PD₅₀为10^-3.10/0.3ml；猪乙型脑炎活疫苗组合物4组PD₅₀为10^-3.50/0.3ml；猪乙型脑炎活疫苗组合物5组ED₅₀为10^-3.43/0.3ml；猪乙型脑炎活疫苗组合物6组PD₅₀为10^-3.29/0.3ml。

由此可以看出，猪乙型脑炎活疫苗组合物1免疫原性最好，进行3162倍稀释，仍能使50％小鼠获得保护；猪乙型脑炎活疫苗组免疫效果最不佳，进行1000倍稀释，能保护50％的小鼠，如表5所示。

表5猪乙型脑炎活疫苗组合物半数保护量(PD₅₀)的测定

Claims (8)

1.一种制备猪乙型脑炎灭活疫苗组合物的方法，包括：

采用非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株生产猪乙型脑炎病毒；

收获所述猪乙型脑炎病毒液，添加硫酸鱼精蛋白，经离心、过滤、浓缩、分子筛凝胶层析，得到猪乙型脑炎病毒抗原，制备猪乙型脑炎病毒灭活抗原后将其与动物疫苗油佐剂或动物疫苗水性佐剂混合，获得猪乙型脑炎灭活疫苗组合物；

所述非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株已于2021年10月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23098；

所述动物疫苗油佐剂由如下重量百分含量的组分组成：

注射用矿物油MARCOL 52 85%

木糖醇月桂酸单酯 2.5%

三聚甘油三油酸酯 10%

烷基糖苷APG0816 1.25 %

正癸醇 1.25 %；

所述动物疫苗水性佐剂由如下重量百分含量的组分组成：

注射用水溶液 88%；

聚合物组合：

甘露聚糖 3%；

聚乙烯吡咯烷酮K90 3%

羟甲基纤维素 1%

聚乳酸-羟乙酸PLGA 1%

泊洛沙姆F188 1%

助剂：

油酸 3%。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株在V-SFM培养基上进行复苏和扩大培养。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述硫酸鱼精蛋白的终浓度1-2mg/ml。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述猪乙型脑炎病毒为猪乙型脑炎病毒SA14-14-2。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在采用所述非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株生产猪乙型脑炎病毒中，病毒接种后孵育阶段的生物反应器的参数为：温度36～37℃，pH值7.2±0.1，溶氧40～60％，搅拌速度40～80rpm，通气量0.1～0.5SPLM。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在采用所述非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株生产猪乙型脑炎病毒中，病毒孵育后的培养阶段的生物反应器的参数为：温度33～35℃，pH值7.4～7.8，溶氧40～60％，搅拌速度80～120rpm，通气量0.1～0.5SPLM。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株的扩大培养阶段的生物反应器培养的参数为：溶氧20～60％，pH 7.0～7.4，搅拌转速80～120rpm/min，通气量0.1～0.5SPLM，温度35-37℃。

8.非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株在生产猪乙型脑炎灭活疫苗组合物中的应用，其特征在于：制备猪乙型脑炎病毒灭活抗原后将其与动物疫苗油佐剂或动物疫苗水性佐剂混合，获得猪乙型脑炎灭活疫苗组合物；

所述非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株已于2021年10月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.23098；

所述动物疫苗油佐剂由如下重量百分含量的组分组成：

注射用矿物油MARCOL 52 85%

木糖醇月桂酸单酯 2.5%

三聚甘油三油酸酯 10%

烷基糖苷APG0816 1.25 %

正癸醇 1.25 %；

所述动物疫苗水性佐剂由如下重量百分含量的组分组成：

注射用水溶液 88%；

聚合物组合：

甘露聚糖 3%；

聚乙烯吡咯烷酮K90 3%

羟甲基纤维素 1%

聚乳酸-羟乙酸PLGA 1%

泊洛沙姆F188 1%

助剂：

油酸 3%。