CN103882047A - 重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域重组蛋白的制备方法，具体是一种重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的制备方法，其步骤为：①根据人酸性成纤维细胞生长因子haFGF全长序列设计引物克隆得到原始基因片段，并替换掉其中存在的大肠杆菌不利表达的密码子从而获得优化的haFGF基因，所述优化的haFGF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；克隆得到分子伴侣PDI的原始基因片段，并替换掉其中存在的大肠杆菌不利表达的密码子从而得到优化的PDI基因，所述优化的PDI基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；②优化的haFGF基因、优化的PDI基因、标签序列以及蛋白酶切位点序列连接后克隆进入载体，构建得到高效表达载体；或是先构建上述部分序列的备用载体，然后将其余序列连接于部分序列上。

Description

重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的制备方法

技术领域

    本发明涉及基因工程领域重组蛋白的制备方法，具体是一种重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的制备方法。

背景技术

20世纪30年代，科学家就发现在人的大脑和垂体的组织提取物中存在一种能够促进成纤维细胞生长的活性物质，到70年代，这种物质被分离提纯。鉴于这种物质的作用，它被命名为成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）。后来，又在多种器官组织中发现了这类因子，统称为FGFs家族成员。不同的FGFs作为细胞间的信号分子在人胚胎发育和分化过程中起重要作用。迄今为止，共有大约23种人FGFs被发现。多数的FGFs在其N端具有信号肽帮助成熟蛋白分泌到胞外，但是某些FGFs成员缺乏信号肽，也能正常分泌到胞外。

FGF1也被称为人酸性成纤维细胞生长因子(human acidic fibroblast growth factor，haFGF)，有广泛促分裂的作用，主要分布于脑、垂体、神经组织、视网膜、肾上腺、心脏和骨骼等器官或组织内，其他组织含量很少，在血清和体液中以极低的浓度存在。人的haFGF基因位于第4号染色体上，为单拷贝基因，由两个大的内含子和3个外显子组成。haFGF蛋白由154个氨基酸残基组成，等电点5～7，通过与其受体结合启动信号转导机制从而诱导多种细胞分化、增殖。

大量的研究表明，haFGF蛋白有刺激血管生长、加速创伤愈合和促进神经损伤修复等多种功能，外源性人酸性成纤维细胞生长因子蛋白有望成为临床上用于促进伤口愈合、胃溃疡、视神经萎缩、神经性耳聋、内脏缺血损伤等多种疾病治疗的有效药物。然而天然的haFGF蛋白含量很低，有必要开发基因工程重组haFGF，高效制备haFGF蛋白。

发明内容

本发明为了解决天然的haFGF含量很低不利于药物开发的问题，提供了一种重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的制备方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的制备方法，其步骤为：

①  根据人酸性成纤维细胞生长因子haFGF全长序列设计引物克隆得到原始基因片段，并替换掉其中存在的大肠杆菌不利表达的密码子从而获得优化的haFGF基因，所述优化的haFGF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；克隆得到分子伴侣PDI的原始基因片段，并替换掉其中存在的大肠杆菌不利表达的密码子从而得到优化的PDI基因，所述优化的PDI基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

②  优化的haFGF基因、优化的PDI基因、标签序列以及蛋白酶切位点序列连接后克隆进入载体，构建得到高效表达载体；或是先构建上述部分序列的备用载体，然后将其余序列连接于部分序列上，构建得到高效表达载体；

③  高效表达载体转化大肠杆菌BL21，用IPTG诱导重组基因的表达；同时将含有相应蛋白酶的质粒转入Rosseta菌株，一起诱导表达；随后将两种菌株以任意比例混合；

④  用Tris缓冲液重悬细菌，超声破碎，离心收集上清液；调整pH值，低温振荡使与蛋白酶切位点序列对应的蛋白酶酶切完全，释放出rhaFGF蛋白，得到高浓度的含有重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的溶液；

⑤将含有重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的溶液进行纯化处理，得到高纯度的rhaFGF蛋白，进行SDS-PAGE分析和含量测定。

本发明中未详细叙述“替换掉其中存在的大肠杆菌不利表达的密码子”，由于基因优化密码子的方法为本领域技术人员的公知常识，通常只需要给出最后优化后的全DNA序列即可，根据此序列本领域技术人员即可实现该方法的实现流程。

本发明中优化的PDI基因为分子伴侣，对于重组人酸性成纤维细胞生长因子的可溶性高效表达具有关键的辅助作用，与rhaFGF（重组haFGF）的相对位置是可变的。因此，步骤②中只要是载体上的优化的haFGF基因、优化的PDI基因、标签序列以及蛋白酶切位点序列连接在一起，无论一次克隆进入载体或是分次克隆进入载体，任意变换它们在载体上的前后顺序，均可实现haFGF的高效表达。且序列的连接以及克隆进入载体均是本领域公知常识，本发明不作过多的阐述。

本发明步骤②中的标签序列除了采用本发明提到的六个连续的组氨酸标签序列HIS₆，还可采用本领域常用的其它标签序列，例如Flag标签，HA标签，GST标签等等。

本发明步骤②中的蛋白酶切位点序列除了采用本发明提到的pp（Prescission Protease）蛋白酶切位点序列，还可采用本领域常用的其它蛋白酶切位点序列，例如Thrombin酶，Enterokinase酶，TEV酶等等。

本发明步骤②中的载体除了采用本发明提到的pET-26b，还可采用本领域常用的其它表达载体，例如pET-15,pET-21,pET28等等。

本发明步骤③中所述的相应蛋白酶指的是步骤②中的蛋白酶切位点序列所对应的蛋白酶。

进一步，步骤③中haFGF重组蛋白菌株与蛋白酶菌株的质量比为50:1。本发明步骤③中所述的两种菌株以任意比例混合，但是50:1的质量比为恰好蛋白酶能够酶切完全，且不造成浪费的质量比。若该比例小于50:1，含有蛋白酶的菌株过多，造成蛋白酶的浪费和杂蛋白的增多；若该比例大于50:1，蛋白酶含量过低，不能完全酶切完全，释放出的rhaFGF蛋白相对较少。

进一步，步骤⑤中的纯化处理为：将含有重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的溶液的pH值调整至8，然后上镍离子亲和柱，用Tris缓冲液上柱，15mM咪唑洗脱杂蛋白，250mM咪唑洗脱目的蛋白，透析过夜。

本发明步骤⑤中的纯化处理可以采用本领域常规使用的离子交换、亲和层析、液相色谱以及分子筛等手段来处理目的蛋白；但是本发明提供的纯化处理相对于常规手段，具有快速高效的特点。

利用本发明所述的重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的制备方法，使得PDI辅助rhaFGF保持可溶解高活性的正确折叠状态，SDS-PAGE分析纯化处理后的rhaFGF蛋白纯度在95%以上，浓度超过0.5mg/ml。制备方法简单，产品质量稳定，可以作为药物或保健用品，利于向大众推广。

附图说明

图1为pET-26b载体的图谱以及载体上的多克隆位点。

图2为haFGF基因在pET-26b-haFGF-HIS₆-pp-PDI的质粒构建图。

具体实施方式

实施例1

重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的制备方法：

1～2）构建pET-26b-PDI-pp的备用载体

设计PDI的引物，相应的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，需要包含酶切位点, 从5`-3`排列如下所示：

引物稀释成50pmol/μl,然后进行PCR步骤。

PCR反应体系50ul：

           ddH₂O：          40ul          

10*PCR BUFFER    5ul

      dNTP               1ul

模板：             1ul

      上/下游引物：    1ul

           pfu酶             1ul

PCR反应条件（Tag酶）：

           94℃    8min

           94℃    30s

           65℃    30s

           72℃    1min        30循环

           72℃  10min

琼脂糖凝胶电泳检测PDI条带位于1600bp左右，胶回收目的基因，用EcoRI和Xho I将基因酶切成粘性末端，同样处理pET-26b载体，加入T4 DNA连接酶，4℃连接12小时，转化大肠杆菌DH5α。用硫酸卡那霉素-LB平板筛选挑出白斑克隆，利用分子克隆的碱裂解法或者煮沸法提取质粒，利用酶切和PCR的方法鉴定正确，然后核苷酸序序列分析含有正确的基因序列阅读框架，构建成功pET-26b-pp-PDI载体。

人酸性成纤维细胞生长因子（human acidic fibroblast growth factor，简称haFGF）全长基因序列替换掉大肠杆菌不利表达的密码子获得优化的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

针对haFGF序列设计全套引物，全部从5`-3`排列如下所示：

引物稀释成50pmol/μl待用。然后利用PCR的方法将haFGF-HIS₆基因克隆出来。

        PCR反应条件：

           94℃  8min

           94℃  30s

           55℃  30s

           72℃  30s        30循环

           72℃  10min

反应结束之后，取PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，紫外检测为与460bp位置左右的一条亮带即为目的基因（haFGF-HIS₆）的大小。

凝胶回收目的基因，用限制性内切酶NdeI和EcoR I将其切成粘性末端，用Nde I和EcoR I处理pET-26b-pp-PDI载体，加入T4DNA连接酶，4℃连接12小时，转化大肠杆菌DH5α。用硫酸卡那霉素-LB平板筛选挑出白斑克隆，利用分子克隆的碱裂解法或者煮沸法提取质粒，利用酶切和PCR的方法鉴定正确，然后核苷酸序序列分析含有正确的基因序列阅读框架，构建成功pET-26b-haFGF-HIS₆-pp-PDI载体（简写为26b-aFHpP）。

3）将正确的26b-aFHpP质粒转化大肠杆菌BL21，用硫酸卡那霉素-LB平板筛选出单斑克隆，在5mlLB培养基中培养过夜，按照1:100转接，在摇瓶中37℃培养至OD600为0.4-0.6，按照1:5000加入IPTG储液，30℃培养4-6小时（时间延长会显著提高产量），离心收集菌体，保存于-20℃或者立即进入下步纯化。

同时将含有PPase的质粒转入Rosseta菌株，同样操作挑选单斑克隆，在5mlLB培养基培养过夜，然后1:100转接，摇瓶培养37℃至OD为0.6，按照1:1000加入IPTG储液，30℃培养6小时，离心收集菌体，取适当与26b-aFHpP菌体混合（haFGF重组蛋白菌株与蛋白酶菌株的质量比为50:1）。

4）配制适合保存酶活的缓冲体系：

Tris：        6.057g/L

NaCl:         2.925g/L

甘油：        50ml/L

用缓冲液洗涤混合后的菌体沉淀，用20-40ml体积重悬约500ml菌液沉淀，用溶菌酶配合Triton X-100帮助裂解细菌，用冰水混合物环境下超声破菌（2s超声，5s间歇，全长45min，保护温度44℃），12000rpm/min离心20min，收集上清液。再次调整PH为7.0左右，振荡反应约4h（冰上操作有助于提高产物活性，需要延长作用时间至10h左右。这样重组蛋白基本被PPase酶切完全，释放出rhaFGF蛋白,此时所得溶液为高浓度的含有rhaFGF蛋白的溶液。

5）在含有rhaFGF蛋白的溶液中，调整其PH值到8.0。配制上柱缓冲液：

MCAC-15                                    MCAC-1000

20mM Tris盐酸 PH10.0              20mM Tris盐酸 PH10.0

0.5M NaCl                                    0.5M NaCl

10%(v/v) 甘油（可调整至20%）      10%（v/v）甘油

15mMol/L   咪唑                         1M 咪唑

用MCAC-15溶液清洗镍离子亲和柱（Ni-NTA His-Bind Resin）柱材，然后把柱材和rhaFGF溶液共育，室温（冰上更佳）轻摇30min。然后上柱，用MCAC-60洗脱杂蛋白，最后用MCAC-250洗脱目的蛋白。将所得产物透析过夜，即得到高纯度的rhaFGF蛋白。进行SDS-PAGE分析和浓度检测，检测rhaFGF含量超过0.5mg/ml。

实施例2

重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的制备方法，其步骤为：

①根据人酸性成纤维细胞生长因子haFGF全长序列设计引物克隆得到原始基因片段，并替换掉其中存在的大肠杆菌不利表达的密码子从而获得优化的haFGF基因，所述优化的haFGF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；克隆得到分子伴侣PDI的原始基因片段，并替换掉其中存在的大肠杆菌不利表达的密码子从而得到优化的PDI基因，所述优化的PDI基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

②优化的haFGF基因3`末端增加HIS<sub>6</sub>，构建得到基因片段haFGF- HIS<sub>6</sub>；优化的PDI基因5`末端加入pp蛋白酶切位点序列，构建得到基因片段pp-PDI；然后将基因片段pp-PDI接到基因片段haFGF- HIS₆的3`末端一起克隆进入pET-26b载体，构建得到高效表达载体pET-26b-haFGF- HIS₆-pp-PDI。；

③高效表达载体转化大肠杆菌BL21，用IPTG诱导重组基因的表达；同时将含有蛋白酶切位点序列的质粒转入Rosseta菌株，一起诱导表达；随后haFGF重组蛋白菌株与蛋白酶菌株以40:1的质量比混合；

④用Tris缓冲液重悬细菌，超声破碎，离心收集上清液；调整pH值，低温振荡使与蛋白酶切位点序列对应的蛋白酶酶切完全，释放出rhaFGF蛋白，得到高浓度的含有重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的溶液；

⑤将含有重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的溶液进行纯化处理，得到高纯度的rhaFGF蛋白，进行SDS-PAGE分析和含量测定。

<110>太原锦波生物医药科技有限公司

<120>重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的制备方法

<160>2

<210>1

<211>465

<212>DNA

<213> Homo sapiens

<400>

atggctgaag  gggaaatcac  caccttcaca  gccctgaccg  agaagtttaa     50

tctgccgccg  gggaattaca  agaagccgaa  acttctttac  tgtagcaacg    100

ggggccattt  cctgcgtatc   cttccggatg  gcacagtgga  tgggacacgt    150

gaccgtagcg  accagcatat  tcagctgcag  cttagtgcgg  aaagcgtggg     200

ggaggtgtat ataaagagta ccgagactgg  ccagtacttg   gccatggaca  250

ccgacgggct  tttatacggc  tcacagacac  cgaatgagga  atgtttgttc   300

ctggaacgtc  tggaggagaa ccattacaac   acctatatat    ctaagaagca  350

tgcagagaag  aattggtttg  ttggccttaa gaagaatggg    agctgcaaac  400

gcggtccgcg  tactcattat   ggccagaaag caatcttgtt  tcttccgctg   450

ccggtctctt   ctgat  465

 

 

<210>2

<211>1527

<212>DNA

<213> Homo sapiens

<400>

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ctctgccaag  cagtttttgc  aggcagcaga  ggccatcgat gacataccat 550

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tcgaggacct  cgaagaagca gaggagccag acatggagga agacgatgac 1500

cagaaagctg  tgaaagatga  actgtaa  1527

Claims (6)

1.重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的制备方法，其特征在于，其步骤为：

①根据人酸性成纤维细胞生长因子haFGF全长序列设计引物克隆得到原始基因片段，并替换掉其中存在的大肠杆菌不利表达的密码子从而获得优化的haFGF基因，所述优化的haFGF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；克隆得到分子伴侣PDI的原始基因片段，并替换掉其中存在的大肠杆菌不利表达的密码子从而得到优化的PDI基因，所述优化的PDI基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

②优化的haFGF基因、优化的PDI基因、标签序列以及蛋白酶切位点序列连接后克隆进入载体，构建得到高效表达载体；或是先构建上述部分序列的备用载体，然后将其余序列连接于部分序列上，构建得到高效表达载体；

③高效表达载体转化大肠杆菌BL21，用IPTG诱导重组基因的表达；同时将含有相应蛋白酶的质粒转入Rosseta菌株，一起诱导表达；随后将两种菌株以任意比例混合；

④用Tris缓冲液重悬细菌，超声破碎，离心收集上清液；调整pH值，低温振荡使与蛋白酶切位点序列对应的蛋白酶酶切完全，释放出rhaFGF蛋白，得到高浓度的含有重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的溶液；

⑤将含有重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的溶液进行纯化处理，得到高纯度的rhaFGF蛋白，进行SDS-PAGE分析和含量测定。

2.根据权利要求1所述的重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的制备方法，其特征在于，步骤②中的标签序列为六个连续的组氨酸标签序列HIS₆，蛋白酶切位点序列为pp蛋白酶切位点序列，载体为pET-26b；步骤③中的相应蛋白酶为pp蛋白酶。

3.根据权利要求2所述的重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的制备方法，其特征在于，所述的步骤②为：优化的haFGF基因3`末端增加HIS<sub>6</sub>，构建得到基因片段haFGF- HIS<sub>6</sub>；优化的PDI基因5`末端加入pp蛋白酶切位点序列，构建得到基因片段pp-PDI；然后将基因片段pp-PDI接到基因片段haFGF- HIS₆的3`末端一起克隆进入pET-26b载体，构建得到高效表达载体pET-26b-haFGF- HIS₆-pp-PDI。

4.根据权利要求2所述的重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的制备方法，其特征在于，所述的步骤②为：优化的PDI基因5`末端加入pp蛋白酶切位点序列，构建得到基因片段pp-PDI；基因片段pp-PDI克隆进入pET-26b载体，构建得到pET-26b- pp-PDI备用载体；优化的haFGF基因3`末端增加HIS₆，构建得到基因片段haFGF- HIS₆；基因片段haFGF- HIS₆克隆进入pET-26b- pp-PDI备用载体，构建得到高效表达载体pET-26b-haFGF- HIS₆-pp-PDI。

5.根据权利要求1至4的任一权利要求所述的重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的制备方法，其特征在于，步骤③中haFGF重组蛋白菌株与蛋白酶菌株的质量比为50:1。

6.根据权利要求1至4的任一权利要求所述的重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的制备方法，其特征在于，步骤⑤中的纯化处理为：将含有重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的溶液的pH值调整至8，然后上镍离子亲和柱，用Tris缓冲液上柱，15mM咪唑洗脱杂蛋白，250mM咪唑洗脱目的蛋白，透析过夜。

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