CN101353659A - 制备可溶高活性重组人表皮生长因子的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因重组技术领域，具体为一种制备可溶高活性重组人表皮生长因子的方法，解决现有利用化学合成法和生物提取法分别存在各自不同的缺点以及利用基因重组方法获得的人表皮生长因子的纯度较低、产量及活性都较低的问题，包括构建人表皮生长因子基因克隆，并替换掉大肠杆菌不利表达的密码子获得优化的基因序列，再加入PDI的分子伴侣帮助目的基因在大肠杆菌中高效表达，在序列中内嵌入HIS标签和蛋白酶切位点帮助目的蛋白高效提纯，以及生物活性的鉴定。这样得到的人表皮生长因子产品纯度高，产量高，活性高，成本低，生产工艺简单，产品质量稳定。产物可以制作药物或者美容化妆用品，利于向大众推广。
Description
技术领域
本发明涉及基因重组技术领域，具体为一种制备可溶高活性重组人表皮生长因子的方法。
背景技术
人表皮生长因子(human epidermal growth factor，hEGF)是较早被分离鉴定的一种生长因子，因具有促进表皮增厚及角质化而得名。它是一种由53个氨基酸组成、分子量为5400Da的耐热单链低分子多肽，三维结构已经解出。在人体内，它主要由领下腺、肾脏、胰腺、十二指肠等腺体分泌，几乎存在于所有体液、分泌物及大多数组织中。
作为一种强有力的细胞分裂促进因子，hEGF具有多种生物学活性，分为以下几个方面：1、促进细胞的增殖。hEGF是一个广谱促分裂剂，能促进细胞内DNA、RNA、蛋白质以及细胞外大分子的合成，加速皮肤、角膜上皮、气管上皮、乳腺上皮等组织的增殖和分化。应用精制的重组人表皮生长因子可以促进创面愈合，对烧伤浅II、深II度(尤其是后者)慢性创面、供皮区等具有不同程度的加速愈合的作用。目前，已有用于治疗消化性溃疡和烧伤等的hEGF制剂出现。2、增加物质的转运和糖代谢。hEGF能促进钾离子的转运和H-Na离子交换，还能导致肝细胞的钙离子扩浓度增加，能激活糖酵解和糖的异生。3、增加前列腺素的合成和释放。hEGF能激活磷脂酶A2，从而促进上皮细胞膜释放花生四烯酸，也能直接通过调节环加氧酶和脂加氧酶的含量或活性来影响前列腺素的合成。4、对骨和钙代谢的影响。hEGF能通过多个环节，如影响胃肠对钙的吸收以影响破骨细胞和成骨细胞的活性，调节骨和钙的代谢。
80年代以来，潜在的巨大经济效益吸引了国内外许多研究机构和企业进行其系列产品的开发。迄今为止，hEGF的生产方法主要包括三种。第一，化学合成法。hEGF是由53个氨基酸组成的多肽，采用固相合成法可实现hEGF的全合成。1988年，Marchi等首先采用固相合成法完成了hEGF的全合成，但由于hEGF分子中存在3对二硫键及其他多种官能团，因而合成的产物纯度及产率都无法满足工业化生产要求。第二，生物提取法。机体中的主要由腮腺、领下腺、胰腺细胞分泌。hEGF也见于正常生理状态下的几乎所有体液中。一般认为正常人体液中肾内尿液尤其是孕妇尿、胰腺、甲状腺等处含量较高。从这些体液中分离是十分困难的，原因在于一方面含量极微，另一方面是常与人表皮生长因子受体结合形成复合物。因此，从人体液中分离得到主要仅限于发现之初的理论研究。第三，基因重组生产。随着基因重组技术的发展，人们开始进行重组hEGF大规模生产的尝试。目前，该基因已在多种宿主系统中得到克隆、表达与分泌。包括重组大肠杆菌、重组短芽孢杆菌、重组酿酒酵母和巴氏毕赤酵母、重组植物细胞以及哺乳动物细胞。然而这里面产量最有潜力成为工业化生产的首推重组大肠杆菌发酵。但是目前，利用基因重组方法获得的hEGF纯度低、产量及活性都较低，推广利用价值较低。
发明内容
本发明为了解决现有利用化学合成法和生物提取法分别存在各自不同的缺点以及利用基因重组方法获得的人表皮生长因子的纯度较低、产量及活性都较低的问题，提供一种制备可溶高活性重组人表皮生长因子的方法。
本发明是采用如下技术方案实现的：制备可溶高活性重组人表皮生长因子的方法，包括以下步骤：(1)根据人表皮生长因子hEGF全长序列设计引物，并替换掉大肠杆菌不利表达的密码子以获得优化的基因序列nhEGF；在nhEGF基因序列的3`末端增加HIS标签序列HIS6，再将nhEGF基因序列加HIS标签序列的基因克隆进入pET-21b载体；接着再将分子伴侣PDI的全长基因序列与nhEGF基因序列连接；然后在PDI基因序列的前端加入Prescission Protease蛋白酶切位点序列pp，这样即重组成表达载体pET-21b-nhEGF-HIS6-pp-PDI，简称21b-nhEGF；相应表达出的重组蛋白为hEGF-HIS6-pp-PDI；(2)将步骤(1)中构建好的表达载体pET-21b-nhEGF-HIS6-pp-PDI转化至大肠杆菌Rosseta，用IPTG储液诱导重组基因的表达，离心收集菌体；同时将含有Prescission Protease(简称PPase)的质粒转入Rosseta菌株，同样用IPTG储液诱导表达，离心收集菌体；然后将两种菌体混合在一起；(3)用Tris缓冲液重悬得到的菌体，超声破碎，离心收集上清液；调整PH值为7.0-8.0，低温振荡使Prescission Protease将重组蛋白酶切完全，释放出hEGF蛋白，得到含有人表皮生长因子的溶液；(4)将含有人表皮生长因子的溶液进行纯化处理，得到含有人表皮生长因子的精品。上述hEGF基因表达载体的构建过程如说明书附图1、2所示。
上述步骤中，替换掉人表皮生长因子hEGF全序列中大肠杆菌不利表达的密码子的方法是本领域的普通技术人员熟知的，所得到的优化基因序列nhEGF如序列表中记载的序列1；所述HIS标签序列HIS6即为六个连续的组氨酸，其序列也是本领域的普通技术人员公知的；分子伴侣PDI的全长基因序列以及蛋白酶切位点序列pp也是公知的，其中分子伴侣PDI的全长基因序列如序列表中记载的序列2；对于将含有人表皮生长因子的溶液进行纯化处理的方法，在现有技术中有很多中，但是大都存在纯化率低、纯化工序复杂等缺点，本发明提供一种最简单的、纯化率较高的最佳方法，具体如下：
所述步骤(4)中对含有人表皮生长因子的溶液进行纯化的具体步骤为，调整上述溶液的PH值为7.0-8.0，然后上镍离子亲和柱，用Tris缓冲溶液上柱，50mM咪唑洗脱杂蛋白，300mM咪唑洗脱目的蛋白；透析过夜，即得到高纯度高活性人表皮生长因子的精品。
PDI伴侣分子对于hEGF的可溶性表达具有关键的辅助作用，而它们和hEGF的相对位置是可变的，所以伴侣分子PDI和nhEGF最终的重组蛋白包含nhEGF-PDI或PDI-nhEGF或HIS6-nhEGF-PDI或HIS6-PDI-nhEGF中的任意一种，均可以提高hEGF的可溶性表达。
与现有技术相比，利用本发明的基因重组表达方法，包括构建人表皮生长因子基因克隆，并替换掉大肠杆菌不利表达的密码子获得优化的基因序列，再加入PDI的分子伴侣帮助目的基因在大肠杆菌中高效表达，使得PDI辅助hEGF保持可溶解高活性的正确折叠状态，比包涵体的形式更保持了蛋白酶的活性；同时在序列中内嵌入HIS标签和蛋白酶切位点帮助目的蛋白高效提纯，大幅度简化了纯化的步骤，这样制得的hEGF纯度高，产量高，活性高，成本低，生产工艺简单，产品质量稳定。产物可以制作药物或者美容化妆用品，利于向大众推广。
附图说明
图1为pET-21b的质粒示意图谱
图2为图1的展开构建示意图，显示pET-21b-nhEGF-HIS-pp-PDI的质粒构建方法
图3为基因21b-nhEGF经Nde I和EcoR I双酶切后的酶切鉴定电泳图
图4为提纯产物中hEGF含量和纯度的SDS-PAGE结果示意图
图5为提纯产物活性的ELISA法检测结果示意图
图6为提纯产物活性的细胞增值实验结果示意图
具体实施方式
实施例一：hEGF基因表达载体的构建及表达：
人表皮生长因子(human epidermal growth factor，简称hEGF)全长序列如下所示：
AATAGTGACTCTGAATGTCCCCTGTCCCACGATGGGTACTGCCTCCATGATGGTGTGTGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTATGCATGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGGGAGCGATGTCAGTACCGAGACCTGAAGTGGTGGGAACTGCGC
并替换掉大肠杆菌不利表达的密码子获得优化的基因序列nhEGF：
AACTCAGATTCCGAATGTCCGCTGTCGCATGATGGGTACTGCCTGCATGATGGTGTCTGCATGTACATCGAAGCGCTGGATAAATATGCCTGCAATTGTGTCGTGGGTTACATCGGGGAACGCTGCCAATATCGTGATCTGAAATGGTGGGAATTGCGC
针对nhEGF序列设计全套引物，全部从5`-3`排列如下所示：
hEGF-P1：GCATGATGGGTACTGCCTGCATGATGGTGTCTGCATGTACATCGAAGCGCTGGAT
hEGF-P2：TTCCCCGATGTAACCCACGACACAATTGCAGGCATATTTATCCAGCGCTTCGATG
hEGF-P3：CAT GGATCC AACTCAGATTCCGAATGTCCGCTGTCGCATGATGGGTACTGCCTGC
hEGF-P4：GCGCAATTCCCACCATTTCAGATCACGATATTGGCAGCGTTCCCCGATGTAACCC
hEGF-P5：GAGATATA CATATG AACTCAGATTCCGAATGTCC
hEGF-P6：CCG GAATTC GTGATGATGGTGGTGGTG GCGCAATTCCCACCATTTC
引物稀释成50pmol/ul待用。然后利用热启动PCR的方法逐步将hEGF-HIS6基因克隆出来，PCR的顺序为：利用hEGF-P1和hEGF-P2为上下游引物，且互为模版，PCR得到产物P12；将P12稀释50倍再作为模版，利用hEGF-P3和hEGF-P4作为上下游引物，PCR得到产物P34；将P34稀释50倍再作为模版，利用hEGF-P5和hEGF-P6再作为上下游引物，PCR得到完整序列nhEGF。
PCR反应体系50ul：
ddH2O： 40ul
10*PCR BUFFER 5ul
dNTP 1ul
模板： 1ul
上/下游引物： 1ul
pfu酶 1ul
PCR反应条件：
94℃ 8min
94℃ 30s
65℃ 30s
72℃ 30s 20循环
94℃ 30s
55℃ 30s
72℃ 30s 20循环
72℃ 10min
反应结束之后，取PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，紫外检测为与150bp-200bp之间位置处的一条亮带即为目的基因(hEGF-HIS6)的大小，凝胶回收目的基因，用限制性内切酶NdeI和EcoRI将其切成粘性末端，如图3所示，左边为碱基标准长度对照，右边为21b-nhEGF载体利用NdeI/EcoRI双酶切产物的条带。图示显示载体释放出来符合nhEGF长度大小的条带，证明载体构建成功。
2)用步骤1)中的方法同样处理pET-21b载体，加入T4DNA连接酶，4℃连接12小时，转化大肠杆菌DH5α。用氨苄青霉素钠-LB平板筛选挑出白斑克隆，利用分子克隆的碱裂解法或者煮沸法提取质粒，利用酶切和PCR的方法鉴定正确，然后核苷酸序序列分析含有正确的基因序列阅读框架，构建成功pET-21b-nhEGF-HIS6载体。
设计PDI的引物，包含酶切位点：
上游引物：PDI-PPs：5`-3`TA GAATTC CTGGAAGTTCTGTTCC
AGGGGCCC ATGCTGCGCCGCGC
下游引物：PDI-PPa：5`-3`CT GTCGACTTACAGTTCATCTTTCACAG
PCR反应条件(Tag酶)：
94℃ 8min
94℃ 30s
65℃ 30s
72℃ 1min 30循环
72℃ 10min
琼脂糖凝胶电泳检测PDI条带位于1600bp左右，胶回收目的基因，用EcoRI和SalI将基因酶切成粘性末端，接入用EcoRI和XhoI酶切后的pET-21b-nhEGF-HIS6载体，加入T4DNA连接酶，4℃连接12小时，转化大肠杆菌DH5α。用氨苄青霉素钠-LB平板筛选挑出白斑克隆，利用分子克隆的碱裂解法或者煮沸法提取质粒，利用酶切和PCR的方法鉴定正确，然后核苷酸序序列分析含有正确的基因序列阅读框架，构建成功pET-21b-nhEGF-HIS6-pp-PDI高效表达载体(简写为21b-nhEGF)。上述hEGF基因表达载体的构建过程如说明书附图1、2所示，质粒pET-21b的图谱来自商业化的试剂盒，扩增的序列经过设计插入其中的多克隆位点中。
3)将正确的21b-nhEGF质粒转化大肠杆菌Rosseta，用氨苄青霉素钠-LB平板筛选出单斑克隆，在5mlLB培养基中培养过夜，按照1∶100转接，在摇瓶中37℃培养至OD600为0.4-0.6，按照1∶5000加入IPTG储液，30℃培养4-6小时(时间延长会显著提高产量)，离心收集菌体，保存于-20℃或者立即进入下步纯化；
同时将含有PPase的质粒转入Rosseta菌株，同样操作挑选单斑克隆，在5mlLB培养基培养过夜，然后1∶100转接，摇瓶培养37℃至OD为0.6，按照1∶1000加入IPTG储液，30℃培养6小时，离心收集菌体，取适当与21b-nhEGF菌体混合(菌体质量比值约为1∶50)。
4)配制适合保存酶活的缓冲体系：
Tris： 6.057g/L
NaCl： 2.925g/L
EDTA： 0.186g/L
甘油： 50ml/L
用Tris缓冲液洗涤混合后的菌体沉淀，用20-40ml体积重悬约500ml菌液沉淀，用溶菌酶配合Triton X-100帮助裂解细菌(可选)，用冰水混合物环境下超声破菌(2s超声，5s间歇，全长45min，保护温度44℃)，12000rpm/min离心20min，收集上清液。再次调整PH为7.0-8.0，振荡反应约4h(冰上操作有助于提高产物活性，需要延长作用时间至10h左右。这样重组蛋白基本被PPase酶切完全，释放出hEGF蛋白，此时所得溶液为高浓度的含有hEGF的溶液，该溶液也可用下述实施例3的方法对其浓度及活性进行鉴定。
实施例二：利用上述得到的hEGF原液经纯化后制备EGF精品
在高浓度的含有hEGF的溶液中，调整其PH值到7.0-8.0。配制上柱缓冲液：
MCAC-15 MCAC-1000
20mM Tris盐酸PH10.0 20mM Tris盐酸PH10.0
0.5M NaCl 0.5M NaCl
10％(v/v)甘油(可调整至20％) 10％(v/v)甘油
15mMol/L 咪唑 1M咪唑
用MCAC-15溶液清洗镍离子亲和柱(Ni-NTA His-Bind Resin)柱材，然后把柱材和hEGF溶液共育，室温(冰上更佳)轻摇30min。然后上柱，用MCAC-50洗脱杂蛋白，最后用MCAC-300洗脱目的蛋白。将所得产物透析过夜，即得到高纯度的hEGF精品。产物可以用于进一步制作成成品。
实施例三：纯化后EGF精品的鉴定
首先利用SDS-PAGE鉴定表达产物的浓度：
样品处理液：SDS 1g，Glycerol 5mL，溴酚蓝(BPB)固体痕量，二硫苏糖醇(DDT)2.5mL，B液25mL，加去离子水至50mL；
取酶切后hEGF溶液10ul，加入2ul样品处理液，至沸水浴5分钟，点样量为5ul/孔。标准蛋白分子量同样处理，用考马氏亮蓝R-250染色，然后利用SDS-PAGE鉴定浓度。结果如图4所示，最左边一道为标准蛋白质分子量对照，右边两道为不同时间精提纯的hEGF产品，显示样品纯度和浓度。
表达产物的活性鉴定：
利用ELISA法和MTT细胞增值法可以分别检测所得产物的体外活性和体内活性，这两种方法均为公知方法。
图5中：人表皮生长因子标准品hEGF-USA(美国peprotech公司，货号Catalog#：100-15 Lot#：010805)，产品活性为1×107units/mg，将100ug标准品溶解于1ml PBS中制成0.1mg/ml的标准品溶液或者等价于1×106units/ml的标准品溶液。人表皮生长因子特异性的抗体Anti-Human EGF antibody(美国peprotech公司，货号Catalog#：500-P45 Lot#：099CY05RB)。检测方法参照通常的ELISA检测方法。计算结果hEGF样品活性约为1×107units/ml，比活力高于0.9×107units/mg。
图6中：采用促进Balb/c 3T3细胞增值的方法进行测定，并用MTT染色。分别将对照蛋白PDI、hEGF标准品、hEGF样品进行无菌处理并稀释到不同的浓度梯度待用。利用10％胎牛血清的1640培养基培养Balb/c 3T3细胞，在其对数生长期时接种于96孔板中，达到7000个每孔，继续培养24小时。换成无血清的1640培养基培养细胞，饥饿细胞24h，然后将各蛋白样品加入细胞孔中，每个稀释度作3个重复，正常培养48小时。每孔加入MTT溶液20ul(5mg/ml)，培养4小时后，加入DMSO裂解液150ul，室温放置30min后，检测570nm的吸光值。结果证实了ELISA法的结果，显示hEGF样品活性约为1×107units/ml，比活力高于0.9×107units/mg。
SEQUENCE LISTING
<110>杨霞
<120>制备可溶高活性重组人表皮生长因子的方法
<160>2
<210>1
<211>159
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>1
aactcagatt ccgaatgtcc gctgtcgcat gatgggtact gcctgcatga tggtgtctgc 60
atgtacatcg aagcgctgga taaatatgcc tgcaattgtg tcgtgggtta catcggggaa 120
cgctgccaatatcgtgatctgaaatggtgg gaattgcgc 159
<210>2
<211>1527
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>2
atgctgcgcc gcgctctgct gtgcctgccg tggcccgccc tggtgcgcgc cgacgccccc 60
gaggaggagg accacgtctt ggtgctgcgg aaaagcaact tcgcggaggc gctggcggcc 120
cacaagtacc cgccggtgga gttccatgcc ccctggtgtg gccactgcaa ggctctggcc 180
cctgagtatg ccaaagccgc tgggaagctg aaggcagaag gttccgagat caggttggcc 240
aaggtggacg ccacggagga gtctgaccta gcccagcagt acggcgtgcg cggctatccc 300
accatcaagt tcttcaggaa tggagacacg gcttccccca aggaatatac agctggcaga 360
gaggctgatg acatcgtgaa ctggctgaag aagcgcacgg gcccggctgc caccaccctg 420
cctgacggcg cagctgcaga gtccttggtg gagtccagcg aggtggccgt catcggcttc 480
ttcaaggacg tggagtcgga ctctgccaag cagtttttgc aggcagcaga ggccatcgat 540
gacataccat ttgggatcac ttccaacagt gacgtgttct ccaaatacca gctcgacaaa 600
gatggggttg tcctctttaa gaagtttgat gaaggccgga acaactttga aggggaggtc 660
accaaggaga acctgctgga ctttatcaaa cacaaccagc tgccccttgt catcgagttc 720
accgagcaga cagccccgaa gatttttgga ggtgaaatca agactcacat cctgctgttc 780
ttgcccaaga gtgtgtctga ctatgacggc aaactgagca acttcaaaac agcagccgag 840
agcttcaagg gcaagatcct gttcatcttc atcgacagcg accacaccga caaccagcgc 900
atcctcgagt tctttggcct gaagaaggaa gagtgcccgg ccgtgcgcct catcaccttg 960
gaggaggagatgaccaagta caagcccgaa tcggaggagc tgacggcaga gaggatcaca 1020
gagttctgcc accgcttcct ggagggcaaa atcaagcccc acctgatgag ccaggagctg 1080
ccggaggact gggacaagca gcctgtcaag gtgcttgttg ggaagaactt tgaagacgtg 1140
gcttttgatg agaaaaaaaa cgtctttgtg gagttctatg ccccatggtg tggtcactgc 1200
aaacagttgg ctcccatttg ggataaactg ggagagacgt acaaggacca tgagaacatc 1260
gtcatcgcca agatggactc gactgccaac gaggtggagg ccgtcaaagt gcacggcttc 1320
cccacactcg ggttctttcc tgccagtgcc gacaggacgg tcattgatta caacggggaa 1380
cgcacgctgg atggttttaa gaaattccta gagagcggtg gccaagatgg ggcaggggat 1440
gttgacgacc tcgaggacct cgaagaagca gaggagccag acatggagga agacgatgac 1500
cagaaagctgtgaaagatgaactgtaa 1527
Claims (3)
1、一种制备可溶高活性重组人表皮生长因子的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)根据人表皮生长因子hEGF全长序列设计引物，并替换掉大肠杆菌不利表达的密码子以获得优化的基因序列nhEGF；在nhEGF基因序列的3`末端增加HIS标签序列HIS6，再将nhEGF基因序列加HIS标签序列的基因克隆进入pET-21b载体；接着再将分子伴侣PDI的全长基因序列与nhEGF基因序列连接；然后在PDI基因序列的前端加入Prescission Protease蛋白酶切位点序列pp，这样即重组成表达载体pET-21b-nhEGF-HIS6-pp-PDI；相应表达出的重组蛋白为hEGF-HIS6-pp-PDI；
(2)将步骤(1)中构建好的表达载体pET-21b-nhEGF-HIS6-pp-PDI转化至大肠杆菌Rosseta，用IPTG储液诱导重组基因的表达，离心收集菌体；同时将含有Prescission Protease的质粒转入Rosseta菌株，同样用IPTG储液诱导表达，离心收集菌体；然后将两种菌体混合在一起；
(3)用Tris缓冲液重悬得到的菌体，超声破碎，离心收集上清液；调整PH值为7.0-8.0，低温振荡使Prescission Protease将重组蛋白酶切完全，释放出hEGF蛋白，得到含有人表皮生长因子的溶液；
(4)将含有人表皮生长因子的溶液进行纯化处理，得到含有人表皮生长因子的精品。
2、根据权利要求1所述的制备可溶高活性重组人表皮生长因子的方法，其特征在于：步骤(4)中对含有人表皮生长因子的溶液进行纯化的具体步骤为，调整上述溶液的PH值为7.0-8.0，然后上镍离子亲和柱，用Tris缓冲溶液上柱，50mM咪唑洗脱杂蛋白，300mM咪唑洗脱目的蛋白；透析过夜，即得到人表皮生长因子的精品。
3、如权利要求1所述的制备可溶高活性重组人表皮生长因子的方法，其特征在于：伴侣分子PDI和nhEGF最终的重组蛋白包含nhEGF-PDI或PDI-nhEGF或HIS6-nhEGF-PDI或HIS6-PDI-nhEGF中的任意一种。
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