KR102049590B1

KR102049590B1 - 고순도의 재조합 인간상피세포 성장인자의 생산 및 정제방법

Info

Publication number: KR102049590B1
Application number: KR1020170184717A
Authority: KR
Inventors: 유환구; 김준수; 허우영
Original assignee: (주)비씨알엠
Priority date: 2017-12-29
Filing date: 2017-12-29
Publication date: 2020-01-07
Also published as: KR20190081880A

Abstract

본 발명은, 융합 단백질을 사용하지 않는 정제 공정을 통하여 rhEGF 발현 단백질의 순도를 높인 상태에서 크로마토그래피를 통하여 rhEGF를 고순도로 정제하는 고순도의 재조합 인간상피세포 성장인자의 생산 및 정제방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 방법은, 대장균 BL21(DE3)에 대한 형질전환을 통해 재조합 rhEGF를 발현한 상태에서 균주를 1차 세척, 파쇄 및 2차 세척하여 재조합 rhEGF가 고순도로 정제되는 것을 특징으로 한다.

Description

고순도의 재조합 인간상피세포 성장인자의 생산 및 정제방법{PRODUCTION AND PURIFICATION PROCESS OF HIGH PURITY RECOMBINANT HUMAN EPIDERMAL GROWTH FACTOR}

본 발명은 고순도의 재조합 인간상피세포 성장인자의 생산 및 정제방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 융합 단백질을 사용하지 않는 정제 공정을 통하여 rhEGF 발현 단백질의 순도를 높인 상태에서 크로마토그래피를 통하여 rhEGF를 고순도로 정제하는 고순도의 재조합 인간상피세포 성장인자의 생산 및 정제방법에 관한 것이다.

상피세포성장인자(Epidermal growth factor, EGF)는 1962년 Stanley Cohen에 의해 수컷 생쥐의 악하선에서 신경성장촉진인자를 분리하던 과정 중 처음으로 발견된 증식인자로 다양한 상피조직세포에 대해 강력한 세포 성장 촉진에 영향을 주는 단백질의 일종이다.

현재 EGF는 피부 미용에 탁월한 효능을 인정받아 대표적인 기능성 화장품의 주 원료로 사용되고 있으며 이외에도 각막회복에도 효능이 있어 실제 안과용 액제에서도 쓰이고 있다. 그밖에 참상 및 화상의 치료나 피부 인식 및 외과 수술시 절개 부위를 치료하는데 사용되는 국소 외용제로써 이용되기도 하고, 위산 분비를 억제한다는 사실과 위 점막을 보호하는 위궤양 치료제로 주목을 받는 등 여러 분야에서 다양하게 활용되고 있다.

EGF는 피부 표면에 존재하는 EGF 수용체(EGFR)와 결합함으로써 수용체의 프로테인 티로신 인산화효소(protein tyrosine kinase) 활성을 자극하게 되는데 활성화된 티로신 인산화효소는 세포 내 Ca² ⁺의 존재하에 다양한 생화학적 변화를 일으키고 다단계 폭포 반응을 통하여 해당 과정 및 단백질 합성을 증가시킴으로써 결과적으로 DNA 합성과 세포 증식에 영향을 주게 된다.

초기 EGF의 생산은 사람의 소변 등에서 직접 추출하여 정제하는 방식을 이용하였지만 수득율에서 분명한 한계점을 나타내으며, 현재는 분자생물학적 기술을 바탕으로 인간의 EGF 유전자를 재조합시키고 특이한 기능성을 가진 발현 벡터를 미생물에 형질전환하여 다량 발현 시스템과 단백질 정제 시스템이 적용된 recombinant human EGF (rhEGF)으로 생산되고 있다.

기존 rhEGF를 포함한 재조합 단백질의 생산은 대량 발현 후 정제 공정의 편의성을 위하여 6x histidine 등 정제 특이성을 가진 단백질을 융합시키는 융합 단백질 형태로 발현이 이루어지고 있다. 하지만, 융합 단백질 발현은 크로마토그래피 공정을 통한 발현 단백질을 정제 후 단백질 분해 효소를 통해 융합 단백질과 목표 단백질을 분리하는 작업이 필요하고 이 후 또다시 크로마토그래피 공정을 통한 2차 정제 과정이 필요하다. 크로마토그래피를 통한 정제는 단백질 정제 공정의 필수적이지만 시간이 많이 걸리고 번거로우며, 충진제의 가격 또한 다른 시약과 비교하여 비싸기 때문에 공정의 효율성을 낮추는 원인이 될 수 있다.

또한 단백질 분해 효소를 통한 융합 단백질과 목표 단백질의 분리 과정은 단백질 분해 효소의 가격이 매우 비쌀 뿐만 아니라 절단 효율이 좋지 않고 효율에 따른 수득률의 감소가 매우 극심하다는 단점이 존재한다.

KR 10-1994-0024070 A1

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은, 융합 단백질을 사용하지 않는 정제 공정을 통하여 rhEGF 발현 단백질의 순도를 높인 상태에서 크로마토그래피를 통하여 rhEGF를 고순도로 정제하는 고순도의 재조합 인간상피세포 성장인자의 생산 및 정제방법을 제공하는 데 있다.

상기한 바와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 특징에 따르면, 본 발명은, 고순도의 재조합 인간상피세포 성장인자의 생산 및 정제방법에 관한 것으로, 대장균 BL21(DE3)에 대한 형질전환을 통해 재조합 rhEGF를 발현한 상태에서 균주를 1차 세척, 파쇄 및 2차 세척하여 재조합 rhEGF가 고순도로 정제된다.

상기 1차 세척공정은, 50 mM Tris, pH 8.0인 세척용액 1과 50 mM Tris, 10 mM CaCl₂, pH 8.0인 세척용액 2와 50 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0인 세척용액 3으로 상기 순서대로 2세트 세척을 실시하여 균주 파쇄 전 세포벽에 있는 불순 물질을 제거하고, 상기 파쇄공정은, 100 mM Tris, 10% glycerol, 100 mM NaCl, 5% glucose, 5 mM DTT인 파쇄용액으로 현탁시키고 초음파 파쇄기를 통하여 균주를 파쇄하며, 상기 2차 세척공정은, 상기 파쇄공정을 통해 파쇄된 균주를 16,000rpm에서 30분 동안 원심분리하여 수용성 단백질과 봉입체로 나눈 후 봉입체를 1.5 M Urea, 1% triton x-100, 20 mM Tris, pH 7.0인 세척 용액 4로 3회 세척한다.

그리고 상기 2차 세척공정을 통해 세척이 완료된 봉입체에 8 M Urea, 20 mM Sodium phosphate buffer, 500 mM NaCl, pH 7.8인 봉입체 용해 용액을 첨가한 후 1시간 동안 실온에 반응시켜 상기 봉입체를 완전히 용해하고 원심분리를 실시하여 cell debrid로부터 rhEGF 봉입체를 분리하는 분리공정이 더 포함될 수 있다.

또한 상기 분리공정을 통해 분리된 rhEGF 봉입체 단백질의 재접힘 반응을 위하여 rhEGF 발현 단백질의 봉입체를 증류수로 20배 희석시킨 후 0.25 mM의 β-머캡토에탄올과 5 mM L-cysteine, 5 mM L-cystine을 첨가하고 pH를 10.6으로 맞춘 후 4 ℃에서 48시간 동안 천천히 교반함으로서 rhEGF의 봉입체를 재접힘하는 재접힘공정이 더 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 고순도의 재조합 인간상피세포 성장인자의 생산 및 정제방법에 따르면, 융합 단백질을 사용하지 않는 정제 공정을 통하여 rhEGF 발현 단백질의 순도를 높인 상태에서 크로마토그래피를 통하여 rhEGF를 고순도로 정제할 수 있으므로, 기존 단백질 정제 과정에서 필요한 2번의 크로마토그래피 공정을 1번으로 줄일 뿐만 아니라 융합 단백질 절단 공정이 생략되어 보다 효율적인 rhEGF 생산이 가능해지는 효과가 있다.

도 1은 중합효소연쇄반응을 통해 증폭한 인간상피세포성장인자 유전자의 아가로스 겔 전기영동 결과를 나타나는 도면,
도 2는 대장균 BL21(DE3)로부터 rhEGF의 발현에 대한 SDS-PAGE 분석 결과를 나타내는 도면,
도 3은 이온교환 크로마토그래피를 통해 단일 물질로 정제된 rhEGF에 대한 SDS-PAGE 분석 결과를 나타내는 도면,
도 4는 rhEGF의 정제를 위한 이온교환 크로마토그래피 과정에서의 크로마토그램이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 고순도의 재조합 인간상피세포 성장인자의 생산 및 정제방법의 구성을 자세히 설명한다.

1. 중합효소연쇄반응을 통한 rhEGF의 증폭

중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, 이하 'PCR'이라 칭함)을 실행하여 rhEGF 유전자를 획득하였다. 프라이머는 각각 pF:GGG AAT TCC ATA TGA ACA GCG ATA GCG AAT GC, PR:CGC GGA TCC TTA GCG CAG TTC CCA C이며, Taq polymearse (iNtRON, Korea, i-star Taq DNA polymerase)를 이용하였고 polymerase 0.5㎕ polymerase, 10x PCR buffer 5㎕, 2.5 mM dNTP 혼합물 5㎕, 10 nM/ul 정방향 프라이머(forward primer) 및 10 nM/ul 역방향 프라이머(revese primer)를 각각 1㎕, 주형은 2㎕를 넣은 PCR 반응용액이 50㎕가 되도록 증류수를 넣어 준 후 PCR을 수행하였다.

PCR 반응 조건은 94℃에서 10분간 전변성(predenaturation)시키고, 94℃에서 30초, 52℃에서 30초, 72℃에서 30초 조건으로 30회간 반복 반응하고 72℃에서 7분간 연장 반응을 유도하였다. 결과물은 아가로스 겔(Agarose gel) 전기영동을 통하여 크기 및 농도를 분석하였으며, 그 결과 도 1에 도시된 바와 같이, Lane 2-6에서 150 bp의 rhEGF 유전자가 증폭되었음을 확인할 수 있었다. 반응물 결과물은 추후 효소 반응을 위하여 DNA 단편 정제 키트(intron, Korea)으로 정제하였다. 참고로 도 1에서 Lane 1은 DNA Ladder를 나타내고 있다.

2. rhEGF 유전자가 삽입된 재조합 발현 벡터(pEGF) 구축

PCR을 통해 증폭된 rhEGF와 대장균 발현 벡터 pRSET_A를 제한효소인 Nde I과 BamH I으로 처리하고 DNA 단편 정제 키트로 정제한 후 절단된 벡터와 삽입 DNA를 1:3 비율로 혼합하고 T4 DNA 리가아제(intron, korea) 반응을 통하여 pRSET A와 rhEGF가 봉합된 재조합 벡터 pEGF를 구축하였다.

반응이 완료된 후 반응물을 대장균 DH5α에 형질전환하고 항생제 엠피실린 (100 ㎍/㎖)이 포함된 SOB 고체 배지에 배양하였다. Colony PCR 분석을 통해 재조합 발현 벡터(pEGF)를 선별한 후 다시 대장균 BL21(DE3)에 형질전환하였다.

여기서 대장균 DH5α에서는 재조합 발현 벡터를 구축하고, 대장균 BL21(DE3)에서는 재조합 발현 벡터가 구축된 후에 단백질 발현을 시도하는 용도로 사용된다. 즉, 대장균 DH5α에서는 재조합 발현 벡터는 구축될 수 있지만 단백질 발현은 되지 않으므로, 단백질 과발현의 특징을 가지고 있는 대장균 BL21(DE3)가 사용되는 것이다.

3. 대장균 BL21(DE3)로부터 재조합 rhEGF의 발현

pEGF/BL21(DE3)의 colony를 취하여 엠피실린이 포함된 SOB broth에 접종한 후 37℃에서 대략 12시간 정도 배양한다. 배양이 완료된 균주를 다시 자가발현배지(트립톤 12g/l, 효모 추출물 24g/l, (NH₄)2SO₄ 3.3g/l, KH₂PO₄ 6.8g/l, Na₂HPO₄ 7.1 g/l, 포도당 0.5 g/l, 락토스 2.0 g/l)에 1:50 비율(v/v)로 본 배양을 실시하고 37℃에서 OD 값이 1.2가 되도록 배양하였다. 배양이 완료된 균주는 6000rpm에서 15분간 원심분리하여 배양액으로부터 균주만을 회수하였다.

그리고 도 2는 대장균 BL21(DE3)로부터 재조합 rhEGF의 발현에 대한 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것으로, Lane 1은 Protein Ladder, Lane 2는 BL21(DE3), Lane 3은 rhEGF가 발현된 BL21(DE3)의 Total cell, Lane 4는 rhEGF가 발현된 BL21(DE3)의 수용성 단백질, Lane 5, 6는 rhEGF가 발현된 BL21(DE3)의 봉입체(Inclusion body), Lane 7은 rhEGF가 발현된 BL21(DE3)의 Total cell으로서, BL21(DE3)로부터 재조합 rhEGF가 발현되었음을 확인할 수 있다.

4. 균주의 세척 및 파쇄

회수된 균주는 세척 용액 1(50 mM Tris, pH 8.0) 용액과 세척 용액 2(50 mM Tris, 10 mM CaCl2, pH 8.0), 세척 용액 3(50 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0)의 순서로 총 2회 세척하여 균주 파쇄 전 세포벽에 있는 불순 물질을 제거하고, 이후 파쇄 용액(100 mM Tris, 10% glycerol, 100 mM NaCl, 5% glucose, 5 mM DTT)으로 현탁시키고, 초음파 파쇄기를 통하여 균주를 파쇄하였다. 파쇄된 균주는 16,000rpm에서 30분 동안 원심분리하여 수용성 단백질과 봉입체로 나눈 후 상기 봉입체를 다시 세척 용액 4(1.5 M Urea, 1% triton x-100, 20 mM Tris, pH 7.0)으로 3번 세척하였다. 세척이 완료된 rhEGF 봉입체는 봉입체 용해 용액(8 M Urea, 20 mM Sodium phosphate buffer, 500 mM NaCl, pH 7.8)을 첨가한 후 1시간 동안 실온에 반응시켜 봉입체를 완전히 용해하고 원심분리를 실시하여 cell debrid로부터 rhEGF 봉입체를 분리하였다.

5. rhEGF 봉입체 단백질의 재접힘 반응

재접힘 반응은 Urea의 농도를 희석시키는 Dilution 방식으로 진행하였다. 재조합 EGF의 봉입체의 부피의 20배에 해당하는 증류수를 첨가한 후 0.25 mM의 β-머캡토에탄올과 5 mM L-cysteine, 5 mM L-cystine을 첨가하고 pH를 10.6으로 맞춘 후 4 ℃에서 48시간 동안 천천히 교반하여 구조 재접힘을 진행하였다.

6. 이온교환크로마토그래피를 통한 rhEGF의 정제

크로마토그래피에 사용된 충진제 Sepharose cl-6b를 컬럼에 충진시킨 후 20 mM Tris(pH 7.0)으로 평형화하고 이 후 NaCl를 최대 1 M까지 점진적으로 늘리면서 pI 값에 따라 단백질을 용출하였다. 각각의 분획된 단백질은 SDS-PAGE를 통하여 분석하였으며, 약 80 mM의 NaCl의 농도에서 rhEGF의 발현 단백질이 단일 물질로 분리 및 정제되었음을 확인하였다.

즉, 도 3에 도시된 SDS-PAGE 분석결과에서, Lane 1은 Protein Ladder, Lane 2는 대장균 BL21(DE3), Lane 3은 rhEGF가 발현된 대장균 BL21(DE3)의 봉입체(Inclusion body)를 나타내며, Lane 5에서 단일 물질로 정제된 rhEGF 단백질을 확인할 수 있다.

또한 도 4에서 가로축은 시간(Time)을 나타내고, 좌-세로축은 흡광도(AU)를, 그리고 우-세로축은 염의 농도, 즉 NaCl의 농도를 나타내는데, 빨간색 선과 같이 염의 농도를 시간의 흐름에 따라 점진적으로 증가시켰을 때 파란색의 peak와 같이 단백질이 용출됨을 알 수 있고, 특히 화살표로 표시된 바와 같이, 목표 단백질인 정제된 rhEGF가 용출됨을 확인할 수 있다.

이상에서와 같이 본 발명의 권리는 위에서 설명된 실시예에 한정되지 않고 청구범위에 기재된 바에 의해 정의되며, 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 청구범위에 기재된 권리범위 내에서 다양한 변형과 개작을 할 수 있다는 것은 자명하다.

Claims

대장균 BL21(DE3)에 대한 형질전환을 통해 재조합 rhEGF를 발현한 상태에서 균주를 1차 세척, 파쇄 및 2차 세척하여 분리공정을 거치고 rhEGF 발현 단백질의 순도를 높인 상태에서 재접힘공정과 한 번의 크로마토그래피 공정을 통해 재조합 rhEGF 고순도로 정제하는 것을 특징으로 하고,
상기 1차 세척공정은, 50 mM Tris, pH 8.0인 세척용액 1과 50 mM Tris, 10 mM CaCl₂, pH 8.0인 세척용액 2와 50 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0인 세척용액 3으로 상기 순서대로 2세트 세척을 실시하여 균주 파쇄 전 세포벽에 있는 불순 물질을 제거하고,
상기 파쇄공정은, 100 mM Tris, 10% glycerol, 100 mM NaCl, 5% glucose, 5 mM DTT인 파쇄용액으로 현탁시키고 초음파 파쇄기를 통하여 균주를 파쇄하며,
상기 2차 세척공정은, 상기 파쇄공정을 통해 파쇄된 균주를 16,000rpm에서 30분 동안 원심분리하여 수용성 단백질과 봉입체로 나눈 후 봉입체를 1.5 M Urea, 1% triton x-100, 20 mM Tris, pH 7.0인 세척 용액 4로 3회 세척하는 것으로 이루어지고,
상기 분리공정은, 상기 2차 세척공정을 통해 세척이 완료된 봉입체에 8 M Urea, 20 mM Sodium phosphate buffer, 500 mM NaCl, pH 7.8인 봉입체 용해 용액을 첨가한 후 1시간 동안 실온에 반응시켜 상기 봉입체를 완전히 용해하고 원심분리를 실시하여 cell debrid로부터 rhEGF 봉입체를 분리하고,
상기 재접힘공정은, 상기 분리공정을 통해 분리된 rhEGF 봉입체 단백질의 재접힘 반응을 위하여 rhEGF 발현 단백질의 봉입체를 증류수로 20배 희석시킨 후 0.25 mM의 β-머캡토에탄올과 5 mM L-cysteine, 5 mM L-cystine을 첨가하고 pH를 10.6으로 맞춘 후 4 ℃에서 48시간 동안 천천히 교반함으로서 rhEGF의 봉입체를 재접힘하고,
상기 크로마토그래피 공정은, 충진제인 Sepharose cl-6b를 컬럼에 충진시킨 후 20mM Tris(pH 7.0)으로 평형화하고, NaCl을 최대 1M까지 점진적으로 늘리면서 pI 값에 따라 단백질을 용출하여 rhEGF를 정제하는 것을 특징으로 하는 고순도의 재조합 인간상피세포 성장인자의 생산 및 정제방법.
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