KR970001508B1 - 재조합 인간 상피세포 성장인자의 정제방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

재조합 인간 상피세포 성장인자의 정제방법

제1도는 본 발명에 따라 단계별로 정제된 인간 상피세포 성장인자의 SDS-PAGE 결과를 나타내는 사진이다.

제2도는 본 발명에 따라 최종정제된 인간 상피세포 성장인자의 분자량 결정을 위해 SDS-PAGE를 수행한 결과를 나타내는 사진이다.

제3도는 본 발명에 따라 최종정제된 인간 상피세포 성장인자의 역상 크로마토그래피에 의한 순도분석 결과를 나타내는 크로마토그램이다.

제4도를 본 발명에 따라 최종정제된 인간 상피세포 성장인자의 등전점 분석(isoelectric focusing)결과를 니타내는 사진이다.

본 발명은 인간 상피세포 성장인자(human epidermal growth factor, 이하 'hEGF'라 함)를 정제하는 방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 대장균에서 발현된 재조합 인간 상피세포 성장인자(recombinant human epidermal growth factor, 이하 rhEGF라 함)를 각종 크로마토그래피를 순차적으로 적용시켜 고순도의 rhEGF를 정제하는 방법에 관한 것이다.

초기에 유로가스트론(urogastron)으로도 알려진(Heitz, P.V.et al., (1978) Gut 19, 408-413) hEGF는 분자량 약 6000달톤의 53개의 아미노산으로 구성된 단일 폴리펩티드이며, 생체내 각종 체액에 존재하여 다양한 생리작용을 나타내는 생리활성물질이다.

hEGF의 정제방법으로서는 사람의 뇨로부터 5단계 크로마토크래피법을 적용한 코헨(Cohen)등의 방법(Cohen, S Carpenter, G. (1975) Proc. Nall. Acad. Sci. USA 72, 1317-1321)이 최초로 공지되었지만, 이 방법은 정제수율이 약 20% 이하로 낮을 뿐만 아니라, 초기 정제단계에 겔여과 크로마토그래피법을 사용하기 때문에 많은 양의 시료를 처리하기에는 부적합하였으며, 시료의 침전 및 농축과정에 따르는 시간손실 및 수율이 낮아지는 단점이 있었다.

또한, 그레고리(Gregory)등은 12단계 과정의 복잡한 정제공정을 거쳐 사람의l 뇨 1000 1로 부터 약 1mg 이하의 hEGF를 회수하였는데, 그 수율은 3 내지 5%에 불과하였다(Gregory, H. et al., (1975) Hoppe-Selyer' sZ. Physiol. Chem. 356, 1765-1774).

그리고, 1981년에 공지된 새비지(savage)등의 방법(savage, C. R. et. al. (9181) Anal. Biochem. 111, 195-202)은 초기에 배치법으로 수행한 바이오렉스 70(Biorex 70)크로마토그래피, 에탄올 침전, DE-52, 바이오겔 P10(Bio-Gel P10) 및 DE-52 컬럼을 사용하여 정제하였으나 수율이 16% 이하이며, 정제과정 중에 침전 및 농축과정이 빈번하여 회수율이 낮고 대량생산 공정에는 적합하지 못하다는 단점이 있었다.

한편, 유전자 재조합된 형질전환 미생물로부터 rhEGF를 정제하는 방법도 공지되었는데, 효모에서 발현시켜 정제한 우데아(Urdea)등의 방법(Urdea, M. S. et. al.(1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 7461-7465)과 오카(Oka) 등의 방법(Oka, T. et. al.(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82,7212-7216)은 정제 초기 단계에 겔 여과 크로마토그래피 법을 적용함으로써, 많은 양의 단백질 시료를 컬럼에 주입하여 정제하기에는 부적합한 단점이 있었고, 각 정제단계 전후에 모두 농축과정을 적용하였으므로, 이에 따른 시간손실 및 정제수율이 낮아지는 단점이 있었다.

또한, 고초균에서 발현시켜 정제한 야마가타(Yamagata)등의 방법(Yamagata, H. et. al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 3539-3593)은 C₁₈역상 고속액체 크로마토그래피, TSK DEAE-5PW 고속액체 크로마토그래피그리고 다시 C₁₈역상 고속액체 크로마토그래피를 적용한 방법인데, 이 방법은 정제과정에 고속액체 크로마토그래피 컬럼을 적용함으로써 역시 대량생산을 위해서는 부적합한 방법이었다.

한편, 사람의 뇨 및 유전자 재조합된 미생물로부터 발현되어 세포밖으로 분비되는 hEGF의 역상 고속액체 크로마토그래피 분석 결과는 53개의 아미노산으로 구성된 완전환 hEGF로부터 C-말단의 아미노산 1내지 2개, 혹은 6개가 분해되어 없어지거나, 21번 위치의 메티오닌 잔기가 산화된 형태의 hEGF가 같이 존재하는 것으로 공지되어 있으나(Nishimura, et, al. (1985) Chem. Pharm. Bull. 33(9), 4037-4040; Hayashi, T. et. al. (1987) Anal. Sci. 3, 445-449; Nascimento, C. G. et. al. (1988) Biochemistry 27, 797-802), 기존의 어떤 정제방법도 이러한 변형된 형태의 hEFG가 완전히 제거된 순수한 53개 아미노산의 hEFG만을 대량정제해내는 방법을 제시하지 못하고 있었다.

이에 본 발명자들은 특히, 산화된 형태 및 C-말단이 분해된 형태가 포함되지 않은 고순도의 rhEFG를 대량 정제하기 위한 연속적인 크로마토그래피 방법을 개발하고자 주력한 결과, 전술한 정제 방법상의 문제점을 해결하여 의약품으로 이용하기에 적합합 rhEFG를 고수율로 정제할 수 있음을 알아내고, 본 발명을 완성하게 되었다. 특히, 본 발명은 본 출원인이 본원과 동일자에 출원하는 「인간 상피세포 성장인자(rhEGF)를 발현벡터 및 그를 이용한 hEGF의 제조방법」(대한민국 특허출원 제93-호)에 개시된 hEGF를 정제하기 위한 재료로서 rhEGF가 세포 밖으로 분비되도록 형질전환된 대장균(Escherichia coli JM 101; KCCM-10027)의 세포배양상등액을 사용하였다.

따라서, 기존의 세포내에서 단백질이 대량발현되도록 형질전환될 졍우, 빈번하게 나타나는 불용성 재조합 단백질로부터 정제하는 방법과는 달리, 세포 파괴공정 및 단백질 용해공정이 포함되지 않음으로 해서 기존의 내독소 문제나 세포내 불순 단백질의 오염을 감소시킴으로써, 더욱 효율적인 rhEGF의 정제를 가능케하였다. 아울러, 본 발명에서는 대장균에서 발현되어 배지치로 분비된 rhEGF를 앰버크롬 CG71 역상 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 1차 정제한 후, Q-세파로즈 음이온 교환수지를 이용하여 2차 정제하고, 최종단계로 방사압압측된 C₁₈컬럼을 이용한 역상 고속액체 크로마토그래피법을 이용하여 48% 이상의 정제수율과 98% 이상의 고순도로 rhEGF를 정제할 수 있었다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 정제 첫단계에 앰버크롬 CG71 역상크로마토그래피 수지를 사용하며, 이때 세포배양 상등액을 농축공정없이 직접 컬럼에 주입할 수 있게 함으로써, 농축과정의 시간손실이나 수율감소를 최소화하였다. 용출 pH 8.0으로 맞취진 40% 아세토니트릴을 포함하는 트리스 완충액을 사용하여 단계별 용출법으로 실시되었다. 음이온 교환수지에 의한 2차 정제에서는 Q-세파로즈 FF수지를 사용하는 것을 특징으로 하며, 용출시 염화나트륨 농도를 0M에서 0.5M까지 선형구배시켜 수행하였다. 그리고, 역상 고속액체 크로마토그래피 컬럼에 의한 최종정제는 방사압축된 C₁₈크로마토그래피 컬럼을 사용하여, pH 6.5로 맞추어진 10mM 인산완충액과 70% 아세토니트릴이 포함된 10mM 인산완충액을 사용하여 프로그램화된 선형농도구배 조건으로 용출시켜 최종정제하였다. 각 정제과정 중 rhEGF를 나타내는 분획을 확인을 효소면역측정법(Hayashi, T. et. al.(1989)J. Pharmacobio-Dyn. 12, 410-415)으로 실시하였다.

역가측정을 위한 rhEGF 정량은 리만(Rieman, M. W.(1987) Peptides 8,877-855)과 디오거스틴(DiAugustine, R. P.(1985) J. Biol. CHem. 260,2807-2811)의 방법을 약간 수정하여 A431 세포주(ATCCCRL1555)를 이용한 수용체결합 측정법(RBA, receptor binding assay)에 의해 측정하였다. A431 세포를 10% 송아지혈청이 함유된 둘배코(DMEM) 배지에 희석하여 4×10⁵세포/웰 농도로 코스타 24웰 세포배양 플레이트에 접종하고, 37℃, 5% Co₂조건에서 이틀에 한번씩 배지를 교체하면서 6 내지 7일간 배양하였다. 그리하여 웰에 꽉 차게한후 배지를 제거하고 인산완충 식염수로 세척한 다음, 10% 포름알데히드 용액을 10분간 가하여 세포를 고정시켰다. 다시 각 웰을 인산완충 식염수로 충분히 세척하여 포름알데히드 성분을 완전히 제거하고, 1% 소혈청알부민, 0.2% 소디움아자이드 및 인산완충 식염수로 구성된 수용체결합 완충용액을 웰당 250㎕씩 가하였다. 그런 다음, 0.01내지 20ng/20㎕로 희석한 표준rhEGF(Amersham, ARN 5100, U.K.) 정제용액 및 30,000cpm/100㎕로 희석한¹²⁵I-EGF(Amersham, IM196, U.K.)를 순차적으로 가하고 상온에서 100rpm으로 흔들어 주면서 2시간 동안 반응시켰다. 그 후 RBA 결합 완충용액으로 각 웰을 충분히 세척해주고, 0.1N 수산화나트륨, 1% SDS로 구성된 세포파괴 용액을 웰당 250㎕씩 처리하여 세포를 웰로부터 떼어낸 다음,¹²⁵I-EGF가 세포에 결합한 정도를 감마계수기(Packard Cobra Ⅱ)로 측정하여 정제액의 rhEGF 농도를 정량하였다. 정제된 rhEGF의 순도분석은 하야시 등의 방법(Hayashi, T.et.al.(1987) Anal. Sci.3, 445-449)을 약간 수정하여 고속액체 크로마토그래피로 수행하였다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 오로지 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것이 아니라는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1 : 발효 공정

유전자 재조합 방법에 의하여 rhEGF를 세포밖으로 분비하도록 형질전환된 대장균(Escherichia coli JM101; KCCM-1027)을 0.5% 포도당과 12.5㎍/ml 테트라사이클린을 포함하는 4ml의 루리아(LB) 배지로 37℃에서 11시간 정도 배양한 후, 이것을 다시 상기 배지 100ml에 400㎕를 접종하고 11시간 정도 배양하여 종자배양액을 얻었다. 이 종자배양액을 L당 박토트립톤10g, 효모추출물 20g, KH₂PO₄3g, Na₂HPO₄8H₂O 4g, (NH₄)₂HPO₄2.5g, CaCl₂·2H₂O 0.01g, 시그마 안티폼 A 1ml, 포도당 5g 및 5mg의 테트라사이클린으로 구성된 생산배지 2L에 80ml를 접종하여 30℃로 배양하였다. 배양시각 4시간 후 최종농도 1mM이 되도록 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(1PTG : isopropyl-β-D-thiogalactopyrano-side)를 가하여 rhEGF의 생성을 유도한 후, 30℃ 에서 26시간 더 배양하였다.

실시예 2 : 앰버크롬 CG71 역상 크로마토그래피

상기 실시예1로부터 얻어진 대장균 배양액 2L를 8000rpm으로 30분간 원심분리(Sorvall RC 28S)하여, 침전물은 버리고 상등액 만을 수집하였다. 2.5×40㎝ 크기의 컬럼에 앰버크롬 CG71 수지(토소하스사 제품) 100㎖를 미리 충진하고, pH 8.0의 20mM 트리스 완충용액으로 평형화시킨 후, 수집한 배양상등액을 주입하였다. 주입 완료 후, 상기 평형화 완충용액 1000㎖로 컬럼을 세척하였으며, 그 후 pH 8.0으로 적정된 20mM 트리스 완충용액과 40% 아세토니트릴로 구성된 용리액 500㎖를 사용하여 rhEGF 를 단계용리(step elution)시켰다. 용리rhEGF 분획은 350㎖로 0다음 공정을 위해 4℃에 보관하였다. 본 정제시의 유속은 60㎝/hr로서 배양액의 주입, 세척 및 용리과정 모두에 동일하게 적용하였다.

제1도는 본 발명의 정제방법에 따라, 앰버크롬 CG 71컬럼, Q-세파로즈 FF 컬럼 및 C₁₈역상 고속액체 크로마토그래피 컬럼에 의해 단계별로 정제된 인간 상피세포 성장인자의 SDS-PAGE(Schagger. H. et. al.(1987) Anal. Biochem. 166, 368-379) 결과를 나타내는 사진인데, 제1도에서 레인 A는 배양상등액을, 레인B는 상기 앰버크롬 CG71 역상 크로마토그래피 방법에 의해 정제된 rhEGF를 각각 나타낸다.

실시예 3 : Q-세파로즈 FF 음이온교환 크로마토그래피71 역상 크로마토그래피

2.5×40㎝ 크기의 컬럼에 Q-세파로즈 FF 수지(Pharmacia, U.S.A.) 100㎖를 미리 충진하고, pH 8.0의 20mM 트리스 완충용액으로 평형화시킨 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 상기 실시예 2에서 얻은 rhEGF분획 350㎖를 주입하였다. 주입이 완료된 후 상기 평형화 용액 500㎖로 컬럼을 세척하고, pH 8.0의 2mM 트리스 완충용액과 0.5M NaCl이 포함된 20mM 트리스 완충용액(pH 8.0)으로 OM에서 0.5M의 NaCl 농도구배에 의한 선형구배법(linear gradient)으로 rhEGF를 용리시켰다. 본 정제시의 유속은 55㎝/hr로서 1차 정제액의 주입, 세척 및 용리 과정 모두에 동일하게 적용하였다. 2차 정제결과 순도 80 내지 85%정도의 rhEGF가 316.4㎎ 얻어졌다.

제1도에서, 레인 C는 상기 Q-세파로스 FF 음이온교환 크로마토그래피로부터 용리된 rhEGF를 나타낸다.

실시예4 : 역상 고속액체 크로마토그래피

Q-세파로즈 FF 컬럼으로부터 얻은 rhEGF 분획으로부터 rhEGF의 최종 정제과정은 486 검출기를 포함하는 워터스사의 델타 프렙 4000(Waters Delts Prep 4000) 분취용 고속액체 크로마토그래피를 이용하여 실시하였다. 상기 실시예3으로부터 회수된 rhEGF 분획의 pH를 20% 인산용액으로 6.5까지 조정하여, 8×100㎜크기의 방사압축된 C₁₈카트리지 역상 고속액체 크로마토그래피 컬럼 2개를 직렬로 연결시켜, pH 6.5의 10mM 인산완충용액(Na₂HPO₄)으로 평형화시킨 컬럼에 분당 4㎖의 유속으로 주입하였다. 주입 완료 직후 pH 6.5의 10mM 인산완충용액(완충용액 A)과 70% 아세토니트릴이 포함된 10mM 인산완충용액(완충용액 B)을 사용하여 하기 표 1의 조건으로 rhEGF를 용리시켰다.

용리결과, 순도 98%이상으로서 완전한 형태의 rhEGF 분획은 29분 이후에 분리되었다. 제1도에서, 레인D는 상기의 역상 고속액체 크로마토그래피 방법으로 분리된 rhEGF 분획을 나타낸 것으로서, 순수한 형태의 단일밴드로서 분리.정제되었음을 보여주고 있다.

다음 표2는 본 발명에 따라 분리.정제된 rhEGF의 정제결과를 요약한 것으로, 총 수율 48% 이상으로 정제되었음을 나타내고 있다. 정제단계별 총단백질 양은 브래드포드(Bradford)의 방법(Bradford, M.,(1976)Anal. Biochem. 72, 248)에 따라 바이오래드 단백질 정량 키트(Biorad, #500-0006, U.S.A.)를 사용하여 측정하였다.

제2도는 본 발명의 방법에 따라 분리, 정제된 rhEGF의 분자량을 확인하기 위하여 정제된 rhEGF(레인 B)를 저(low) 분자량을 측정용 마커(Biorad, #161-0304 ; 레인 A)와 펩티드 마커(Sigma, #MW-SDS-17S ; 레인C)와 함께 15% SDS-PAGE를 수행한 결과를 나타낸 것으로서, 최종정제된 rhEGF의 분자량이 약 6000달톤임을 확인해 주고 있다.

제3도는 역상 고속액체 크로마토그래피 분석에 의해 최종정제된 rhEGF의 순도분석 결과를 나타낸 것으로, rhEGF가 순도 98% 이상으로 분리, 정제되었음을 보여주며, C-말단이 분해되거나 메티오닌 잔기가 산화된 형태의 rhEGF가 포함되어 있지 않음을 나타내고 있다.

제4도는 본 발명에 따라 최종정제된 rhEGF를 pH4 내지 6 앰폴라이트 범위에서 저(low) 캘리브레이션 등전점 분석 마커(Pharmacia, #17-0472-01;레인 A 및 D)와 함께 각각 2㎍(레인 B 및 C), 4㎍(레인 E)씩을 등전점 분석(Carfin, D. E. (1990) Methods ENzymol. 183, 459-475)한 것으로서, 역상 크로마토그래피 분석결과와 마찬가지로 이미 공지되어 있는 hEGF의 등전점(Gregory, H. (1975) Nature 257, 325-327)에 해당하는 pⅠ 4.55의 순수한 단일형태의 rhEGF만이 존재함을 재확인해 주고 있다.

내독소 검정

최종 정제물의 분석결과 순도 98%내지 99.7%의 rhEGF가 282.3㎎ 얻어졌으며, 정제액을 동결건조하여 내독소시험(limulus amebocyte lysate; Associates of Cape Code사 제품)을 수행한 결과, 정제된 rhEGF의 시료 중 오염되어 있는 내독소의 양은 rhEGF 1㎎당 0.36 EU 이하로 극히 적은 것으로 측정되었다. 따라서, 본 발명의 정제방법은 내독소를 포함한 세포내 불순 단백질의 오염을 감소시킴으로써, 효율적인 rhEGF의 정제 방법임을 확인할 수 있었다.

이상에서 상세히 설명하고 입증되었듯이, 본 발명은 대장균에서 발현된 재조합 인간 상피세포 성장인자를 각종 크로마토그래피를 순차적으로 적용시켜 고순도의 rhEGF를 정제하는 방법을 제공함은 물론, 그로부터 정제된 rhEGF는 내독소 등 오염물질이 존재하지 않으므로, 의약으로서의 rhEGF를 정하기 위해 유용한 방법을 제공한다.

Claims (6)

1. (ⅰ) rhEGF를 세포밖으로 분비하는 유전자 재조합 미생물의 배양액을 원심분리하여 상등액을 수확하는 공정; (ⅱ) 상기에서 얻어진 상등액을 역상 크로마토그래피하는 공정; (ⅲ) 상기에서 얻어진 활성분획을 음이온 교환 크로마토그래피하는 공정; 및 (ⅳ) 상기에서 얻어진 활성분획을 역상 고속액체 크로마토그래피하는 공정을 포함하는 유전자 재조합 대장균에서 발현 분비된 rhEGF의 정제방법.
2. 제1항에 있어서, 유전자 재조합 미생물은 대장균 JM101(Escherichia coli JM101 ; KCCM-10027)인 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 역상크로마토그래피 수지로서 앰버크롬 CG71 수지를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항에 있어서, 음이온 교환크로마토그래피 수지로서 Q-세파로즈 FF 수지를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법
5. 제1항에 있어서, 역상 크로마토그래피 컬럼으로서 방사압축된 C₁₈카트리지 고속액체 크로마토그래피 컬럼을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제1항의 방법에 의해, 유전자 재조합 미생물의 배양액으로부터 내독소를 제거하는 방법.