JP2020078330A - エラーを最少限に抑える核酸分子の合成のための材料及び方法 - Google Patents
エラーを最少限に抑える核酸分子の合成のための材料及び方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2020078330A JP2020078330A JP2020023979A JP2020023979A JP2020078330A JP 2020078330 A JP2020078330 A JP 2020078330A JP 2020023979 A JP2020023979 A JP 2020023979A JP 2020023979 A JP2020023979 A JP 2020023979A JP 2020078330 A JP2020078330 A JP 2020078330A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- nucleic acid
- endonuclease
- molecule
- mismatch
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 279
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 220
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 220
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 139
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 title claims description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 title abstract description 6
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 claims abstract description 232
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 claims abstract description 231
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 137
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 137
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 127
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 claims abstract description 90
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 claims abstract description 89
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 72
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 51
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 117
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 113
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 112
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 109
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 77
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 75
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 52
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 52
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 40
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 35
- 108010052305 exodeoxyribonuclease III Proteins 0.000 claims description 33
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 27
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 27
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 26
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 23
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 22
- 108010082610 Deoxyribonuclease (Pyrimidine Dimer) Proteins 0.000 claims description 16
- 101000889812 Enterobacteria phage T4 Endonuclease Proteins 0.000 claims description 15
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims description 14
- 230000001915 proofreading effect Effects 0.000 claims description 8
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 7
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims description 6
- 108010055863 gene b exonuclease Proteins 0.000 claims description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 4
- 108010038447 Chromogranin A Proteins 0.000 claims description 3
- 102100031186 Chromogranin-A Human genes 0.000 claims description 3
- 108010046100 endodeoxyribonuclease SP Proteins 0.000 claims description 3
- CPTIBDHUFVHUJK-NZYDNVMFSA-N mitopodozide Chemical compound C1([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@H](O)[C@@H](CO)[C@@H]2C(=O)NNCC)=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C1 CPTIBDHUFVHUJK-NZYDNVMFSA-N 0.000 claims description 3
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 claims description 3
- 102000004099 Deoxyribonuclease (Pyrimidine Dimer) Human genes 0.000 claims 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 abstract description 47
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 abstract description 3
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 70
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 59
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 59
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 59
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 44
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 43
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 39
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 36
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 32
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 24
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 23
- 241000486288 Mimulus <crab> Species 0.000 description 20
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 19
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 19
- 239000000047 product Substances 0.000 description 18
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 17
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 16
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 16
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 16
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 13
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 13
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 12
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 12
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 description 12
- 238000007039 two-step reaction Methods 0.000 description 12
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 102100037696 Endonuclease V Human genes 0.000 description 11
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 11
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 11
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 11
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 10
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 10
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 10
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 10
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- 108010068698 spleen exonuclease Proteins 0.000 description 10
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 9
- 101150039660 HA gene Proteins 0.000 description 9
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 9
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 9
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 8
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 7
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 7
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 7
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 description 7
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 7
- 230000009471 action Effects 0.000 description 7
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 7
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 7
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 7
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 7
- 235000002532 grape seed extract Nutrition 0.000 description 7
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 7
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 7
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 7
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 244000016966 Mimulus guttatus Species 0.000 description 5
- 235000002731 Mimulus guttatus Nutrition 0.000 description 5
- 235000013667 Mimulus langsdorfii Nutrition 0.000 description 5
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- 238000005580 one pot reaction Methods 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 5
- 240000007087 Apium graveolens Species 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 4
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 4
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IEQAICDLOKRSRL-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-dodecoxyethoxy)ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound CCCCCCCCCCCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO IEQAICDLOKRSRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000256844 Apis mellifera Species 0.000 description 3
- 235000015849 Apium graveolens Dulce Group Nutrition 0.000 description 3
- 235000010591 Appio Nutrition 0.000 description 3
- 101100496013 Arabidopsis thaliana CIPK13 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000201370 Autographa californica nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 3
- 102100021935 C-C motif chemokine 26 Human genes 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 101000897493 Homo sapiens C-C motif chemokine 26 Proteins 0.000 description 3
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 3
- 101150080862 NA gene Proteins 0.000 description 3
- 241000195974 Selaginella Species 0.000 description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- VDXZNPDIRNWWCW-JFTDCZMZSA-N melittin Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(N)=O)CC1=CNC2=CC=CC=C12 VDXZNPDIRNWWCW-JFTDCZMZSA-N 0.000 description 3
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 3
- 101150038538 pks10 gene Proteins 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- 241000208306 Apium Species 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 101710081048 Endonuclease III Proteins 0.000 description 2
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000219823 Medicago Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 241001452677 Ogataea methanolica Species 0.000 description 2
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 description 2
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 101710093543 Probable non-specific lipid-transfer protein Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- -1 4 to 50 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 241000228431 Acremonium chrysogenum Species 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589156 Agrobacterium rhizogenes Species 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 1
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102000000340 Glucosyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108010055629 Glucosyltransferases Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101900159346 Influenza A virus Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 108010060231 Insect Proteins Proteins 0.000 description 1
- 244000285963 Kluyveromyces fragilis Species 0.000 description 1
- 235000014663 Kluyveromyces fragilis Nutrition 0.000 description 1
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710141347 Major envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 1
- WAEMQWOKJMHJLA-UHFFFAOYSA-N Manganese(2+) Chemical compound [Mn+2] WAEMQWOKJMHJLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010036176 Melitten Proteins 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 description 1
- 241000088436 Neurospora sp. Species 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 229940008201 allegra Drugs 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 102000028861 calmodulin binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000084 calmodulin binding Proteins 0.000 description 1
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 1
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 150000005829 chemical entities Chemical class 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 235000015111 chews Nutrition 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 150000002061 ecdysteroids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- RWTNPBWLLIMQHL-UHFFFAOYSA-N fexofenadine Chemical compound C1=CC(C(C)(C(O)=O)C)=CC=C1C(O)CCCN1CCC(C(O)(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)CC1 RWTNPBWLLIMQHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N guanidine;isothiocyanic acid Chemical compound N=C=S.NC(N)=N YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003505 heat denaturation Methods 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001437 manganese ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000005332 obsidian Substances 0.000 description 1
- 238000010915 one-step procedure Methods 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 238000003419 tautomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1093—General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/11—Exodeoxyribonucleases producing 5'-phosphomonoesters (3.1.11)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/21—Endodeoxyribonucleases producing 5'-phosphomonoesters (3.1.21)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
- C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
本発明は一般に分子生物学及び遺伝学、並びに遺伝子及び他の核酸分子の合成に関する。
添付の配列表における物質は参照によって本出願に組み入れられる。SGI−XXX.XXPCT_配列表と名付けられた添付の配列表テキストファイルは、(日付)に創られ、XXKBである。ファイルはウインドウズOSを使用するコンピュータにてマイクロソフトワードを用いて評価することができる。
最近の分子生物学及び遺伝子操作では、核酸分子の使用を含む多数の分子技法は合成法による核酸分子の供給の生成を必要とすることが多い。たとえば、代謝工学又はゲノミクスの分野における仮説を調べるために、及び設計されたタンパク質や誂えのゲノムを持つ生物を合成するために、対象とするヌクレオチド配列に対して程度の高い忠実性を持つ核酸分子を合成するための費用効率の高い方法が必要とされることが多い。核酸合成、たとえば、二本鎖DNAの合成の共通方法には、ポリメラーゼ鎖反応法及びライゲーション鎖反応法が挙げられる。多くの場合、確かに合成DNA分子が正しいヌクレオチド配列を含有することは、必須ではないにしても、合成されたDNAが使用されるべきである分子技法の成功には重要である。たとえば、機能的なポリペプチドの遺伝子発現に使用するためのDNAコーディング配列の合成は、1つのヌクレオチドの置換、挿入又は欠失でさえ最終的に作出されるポリペプチドについて重大な結末を有し得るので、正確なDNA配列を必要とする。従って、合成DNA集団に由来する正しくないDNA配列を有するDNA分子を最少限に抑える方法は、デノボ遺伝子合成法によって作出されるエラーのない合成DNAを提供することにおいて必須であると広く考えられている。
本発明は、核酸分子の複製及び増幅におけるエラー訂正のための方法及び材料を提供する。本発明の一実施形態では、ヌクレオチドミスマッチを有する第1の複数の二本鎖核酸分子が一方向性のミスマッチのエンドヌクレアーゼへの暴露によって断片化される。エンドヌクレアーゼによってミスマッチ部位にて又はその近傍で核酸分子が切断され、分子の末端又はその近傍でミスマッチを有する二本鎖核酸分子を残す。一実施形態では、次いで5'から3'又は3'から5'の方向にて一方向性の活性を有するエキソヌクレアーゼに核酸分子が暴露されて、ミスマッチであるヌクレオチドを取り除く。第2の複数の二本鎖核酸分子が、ミスマッチであるヌクレオチドが取り除かれた核酸から構築される。次いで欠けているヌクレオチドを、たとえば、DNAポリメラーゼの作用によって直接、又はその後の増幅工程にて埋めることができ、これらの工程を必要な回数だけ繰り返すことができる。結果は、第1の複数の核酸分子に対してヌクレオチドのミスマッチの頻度が少ない二本鎖の核酸分子である。
(a)少なくとも1つのヌクレオチドミスマッチを含む第1の複数の二本鎖核酸分子を得る工程と、
(b)ミスマッチを有する核酸分子を一方向性のミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有する少なくとも1つの分子と反応させることによって、ミスマッチを有する前記複数の二本鎖核酸分子を断片化する工程と、
(c)(b)のミスマッチを有する断片化二本鎖核酸分子と、(b)の一方向性ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性と同じ方向性の一方向性エキソヌクレアーゼ活性を有する少なくとも1つの分子とを反応させることによって、前記ヌクレオチドミスマッチを取り除いて、断片化したエラーがない二本鎖核酸分子を提供する工程と、
(d)(c)の断片化したエラーがない二本鎖核酸分子を含む第2の複数の二本鎖核酸分子を構築する工程であって、第2の複数の二本鎖核酸分子は第1の複数の二本鎖核酸分子に比べてヌクレオチドミスマッチの頻度が低い、工程と
を含む、核酸分子のエラー訂正の方法。
[本発明1002]
第1の複数の核酸分子が1つまたは複数の合成ヌクレオチド配列を含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
第1の複数の核酸分子が、1つまたは複数の天然に存在する遺伝子配列と1つまたは複数の合成のヌクレオチド配列との混合物を含む、本発明1001の方法。
[本発明1004]
第1の複数の核酸分子を得る工程が核酸分子を合成することを含む、本発明1001の方法。
[本発明1005]
第1の複数の核酸分子を得る工程が、サブセット及び/又はオリゴヌクレオチドから核酸分子を構築することを含む、本発明1001の方法。
[本発明1006]
工程(b)と工程(c)が別々の反応として実施される、本発明1001の方法。
[本発明1007]
工程(b)と工程(c)が1工程の同時反応として実施される、本発明1001の方法。
[本発明1008]
一方向性のミスマッチエンドヌクレアーゼ活性がミスマッチに対して5'を切断し、一方向性のエキソヌクレアーゼ活性が前記断片化された核酸分子の5'末端から前記ヌクレオチドミスマッチを取り除く、本発明1001の方法。
[本発明1009]
一方向性のミスマッチエンドヌクレアーゼ活性が前記ミスマッチに対して3'を切断し、一方向性のエキソヌクレアーゼ活性が前記断片化された核酸分子の3'末端から前記ヌクレオチドミスマッチを取り除く、本発明1001の方法。
[本発明1010]
一方向性のミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有する前記少なくとも1つの分子が、RES I、CEL I、CEL II、SPエンドヌクレアーゼ、SP I、T7エンドヌクレアーゼ、T4エンドヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼV、Mutタンパク質、それらのいずれかの変異体、及び上記の2以上の組み合わせから成る群から選択される、本発明1001の方法。
[本発明1011]
一方向性のミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有する前記少なくとも1つの分子が、CEL I、CEL II、それらのいずれかの変異体、及び上記の2以上の組み合わせから成る群から選択される、本発明1010の方法。
[本発明1012]
一方向性のミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有する前記少なくとも1つの分子が、
(a)SEQ ID NO:01、SEQ ID NO:03、SEQ ID NO:05、SEQ ID NO:07、SEQ ID NO:09、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、いずれかの相補体、及びいずれかの断片から成る群から選択される核酸配列と、低、中、又は高ストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸配列;
(b)SEQ ID NO:01、SEQ ID NO:03、SEQ ID NO:05、SEQ ID NO:07、SEQ ID NO:09、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、いずれかの相補体、及びいずれかの断片から成る群から選択される核酸配列に対して70%以上の同一性を示す核酸配列;並びに
(c)SEQ ID NO:02、SEQ ID NO:04、SEQ ID NO:06、SEQ ID NO:08、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、及びSEQ ID NO:29から成る群から選択されるアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を示すポリペプチドをコードする核酸配列
から成る群から選択される核酸配列によってコードされる、本発明1001の方法。
[本発明1013]
一方向性のエキソヌクレアーゼ活性を有する前記少なくとも1つの分子が、エキソヌクレアーゼIII、DNAポリメラーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、T7エキソヌクレアーゼ、T5エキソヌクレアーゼ、及びそのいずれかの変異体から成る群から選択される、本発明1001の方法。
[本発明1014]
一方向性のエキソヌクレアーゼ活性を有する前記少なくとも1つの分子が、校正活性を持つポリメラーゼである、本発明1001の方法。
[本発明1015]
校正活性を持つポリメラーゼが、T4ポリメラーゼ、T7ポリメラーゼ、及びphi29ポリメラーゼから成る群から選択される、本発明1014の方法。
[本発明1016]
一方向性のミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有する前記少なくとも1つの分子が、CEL I、CEL II、そのいずれかの変異体、及び上記の2以上の組み合わせから成る群から選択され、
一方向性のエキソヌクレアーゼ活性を有する前記少なくとも1つの分子が、エキソヌクレアーゼIII及びその変異体から成る群から選択される、
本発明1001の方法。
[本発明1017]
(a)SEQ ID NO:09、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、その相補体、若しくはいずれかの断片から成る群から選択される核酸配列と、低、中、又は高ストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸配列;又は
(b)SEQ ID NO:09、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、その相補体、若しくはいずれかの断片から成る群から選択される核酸配列に対して70%以上の同一性を示す核酸配列;又は
(d)SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、及びSEQ ID NO:29から成る群から選択されるアミノ酸配列に対して50%以上の同一性を示すポリペプチドをコードする核酸配列
を含む、単離された核酸分子。
[本発明1018]
前記核酸配列が、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有する分子をコードする、本発明1017の核酸分子。
[本発明1019]
異種核酸に操作可能に連結された本発明1017の核酸分子を含む組換え核酸構築物。
[本発明1020]
異種核酸が異種転写制御要素である、本発明1019の組換え核酸構築物。
[本発明1021]
異種核酸が、ポリペプチド配列をコードする核酸配列を含む、本発明1019の組換え核酸構築物。
[本発明1022]
前記ポリペプチド配列が分泌シグナル又はエピトープタグを含む、本発明1021の組換え核酸構築物。
[本発明1023]
本発明1019の核酸構築物を含む組換え宿主細胞。
[本発明1024]
昆虫細胞、哺乳類細胞、微生物細胞、又は植物細胞である、本発明1023の組換え宿主細胞。
[本発明1025]
宿主細胞に導入された本発明1017の核酸配列を含む核酸分子によって発現される、単離されたポリペプチド。
[本発明1026]
SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:11のアミノ酸残基1〜297、SEQ ID NO:11のアミノ酸残基22〜308、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:17のアミノ酸残基1〜320、及びSEQ ID NO:17のアミノ酸残基22〜331から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、本発明1025の単離されたポリペプチド。
[本発明1027]
(i)一方向性のミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有する分子と、(ii)(i)の一方向性のミスマッチエンドヌクレアーゼ活性と同じ方向性の一方向性のエキソヌクレアーゼ活性を有する分子とを含む、組成物。
[本発明1028]
(i)の分子が、RES I、CEL I、CEL II、T7エンドヌクレアーゼ、T4エンドヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼV、Mutタンパク質、そのいずれかの変異体、及び上記の2以上の組み合わせから成る群から選択され;(ii)の分子が、エキソヌクレアーゼIII、DNAポリメラーゼ、そのいずれかの変異体、及び上記の2以上の組み合わせから成る群から選択される、本発明1027の組成物。
[本発明1029]
(i)の分子が、CEL I、CEL II、そのいずれかの変異体、及び上記の2以上の組み合わせから成る群から選択され;(ii)の分子が、エキソヌクレアーゼIII及びその変異体から成る群から選択される、本発明1027の組成物。
[本発明1030]
(i)の分子が、RES I、CEL I、CEL II、T7エンドヌクレアーゼ、T4エンドヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼV、Mutタンパク質、そのいずれかの変異体、及び上記の2以上の組み合わせから成る群から選択され;(ii)の分子が、エキソヌクレアーゼIII又はその変異体である、本発明1027の組成物。
[本発明1031]
本発明1027の組成物を含むキット。
[本発明1032]
一方向性のミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有する分子が、RES I、CEL I、CEL II、T7エンドヌクレアーゼ、T4エンドヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼV、Mutタンパク質、そのいずれかの変異体、及び上記の2以上の組み合わせから成る群から選択され;一方向性のミスマッチエンドヌクレアーゼと同じ方向性の一方向性のエキソヌクレアーゼ活性を有する分子が、エキソヌクレアーゼIII、DNAポリメラーゼ、そのいずれかの変異体、及び上記の2以上の組み合わせから成る群から選択される、本発明1031のキット。
[本発明1033]
一方向性のミスマッチエンドヌクレアーゼ活性と同じ方向性の一方向性のエキソヌクレアーゼ活性を有する分子が、RES I、CEL I、CEL II、T7エンドヌクレアーゼ、T4エンドヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼV、Mutタンパク質、そのいずれかの変異体、及び上記の2以上の組み合わせから成る群から選択され;一方向性のミスマッチエンドヌクレアーゼと同じ方向性の一方向性のエキソヌクレアーゼ活性を有する分子が、エキソヌクレアーゼIII又はその変異体から成る群から選択される、本発明1032のキット。
本発明のこれらの及び他の目的、態様、及び特徴は、添付の図面と併せて以下の本発明の詳細な説明及びクレームの再検討の際、当業者にさらに完全に明らかになるであろう。
本出願は、エラーを最少限に抑えた核酸分子の作出に有用な組成物、方法及び関連する材料に関する。
本発明の態様の1つでは、本開示は、新規の単離された核酸分子、これらの核酸分子とハイブリッド形成する核酸分子(たとえば、相補体)、及びDNAコードの縮重のために同じタンパク質をコードする核酸分子を提供する。本出願の追加の実施形態はさらに、本発明の核酸分子によってコードされるポリペプチドを含む。
態様の1つでは、本発明の実施形態及び方法は核酸分子におけるエラー訂正の方法を提供する。エラーは核酸分子の複製、増幅及び/又は合成にて生じる。「エラー」は、核酸分子が、たとえば、複製及び/又は増幅及び/又は合成の手順の結果生じる所望の配列を有することを目的とするヌクレオチド配列からの逸脱である。エラーには、所望の配列からの欠失、それにおける置換、及びそれに対する付加が挙げられ、任意のメカニズムによって合成のどの時点でも生じ得る。
以前記載された(たとえば、米国特許出願番号2010/0035768を参照)ようにGibson Assembly(商標)(カリフォルニア州、サンディエゴのSynthetic Genomics Inc.)を用いて、その末端に重なり合う配列を持つ複数のオリゴヌクレオチドから合成遺伝子産物を構築した。遺伝子は、代表的な血球凝集素(HA)遺伝子と代表的なノイラミニダーゼ(NA)遺伝子を含んだ。
5×等温(ISO)緩衝液
5×ISO緩衝液は、25%のPEG8000、500mMのトリスHCl、pH8.0、50mMのMgCl2、50mMのDTT、それぞれ1mMの4種のdNTP及び5mMのNADを含有する。
以下
1MのトリスHCl、pH8.0を3mL
1MのMgCl2を300μL
10mMのdNTPを600μL
1MのDTT(dH2Oに1.54g溶解して10mLにした)を300μL
PEG8000を1.5g
100mMのNAD(Sigma、dH2Oに0.66g溶解して10mLにした;50℃に加熱することによって再懸濁し、その後連続的に撹拌した)を300μL
を混ぜ合わせて6mLのこの緩衝液を調製し、
水を加えて6mLにして、1mLに等分し、−80℃で保存する。
2×構築マスターミックスは、ISO反応緩衝液及び成分オリゴヌクレオチドを遺伝子産物に構築するのに必要とされる酵素活性:5×等温(ISO)反応緩衝液)T5エンドヌクレアーゼ(エピセントレ)、PHUSION(登録商標)DNAポリメラーゼ(フィンランド、VantaaのFinnzymes Oy)及びTaqDNAリガーゼを含有する。
80回の反応に十分な800μLの2×構築マスターミックスは、以下:
上記で調製したような5×ISO緩衝液を320μL
1U/μLのT5exo(1×T5exo緩衝液における酵素ストックから1:10希釈した)を6.4μL
2U/μLのPHUSION(登録商標)ポリメラーゼ(フィンランド、VantaaのFinnzymes Oy)を20μL
40U/μLのTaqリガーゼを80μL
dH2Oを374μL
を混ぜ合わせることによって調製することができる。
よく混合し、−20℃で保存し、又は直ちに使用するのであれば氷上で保存する。
構築混合物は少なくとも1年−20℃で保存することができる。酵素は少なくとも10回の凍結融解サイクルの後、活性状態を維持する。混合物は20〜150bpの重なり合いを持つDNA分子の構築に申し分ない。
標準のオリゴヌクレオチドはそれぞれ10,000nMの濃度で購入した。52のオリゴヌクレオチド(オリゴ)を用いてHA遺伝子の全配列を網羅し、44のNAオリゴヌクレオチドを用いてNA遺伝子の全配列を網羅した。
構築反応のために、HAについてオリゴ(10,000nM/52)当たり192nMの濃度で、及びNAについてオリゴ(10,000nM/44)当たり227nMの濃度で各オリゴ10μLをプールした。オリゴの長さは30bpの重なり合いを伴って平均60塩基であった。
5μLの構築反応物
20μLの5×PHUSION(登録商標)HF緩衝液(フィンランド、VantaaのFinnzymes Oy)
2μLの10mMのdNTPs
71μLの水
1μLのホットスタートPHUSION(登録商標)ポリメラーゼ(フィンランド、VantaaのFinnzymes Oy)
0.5μLの100μMのRC−Univ−PKS10−Fプライマー(クローニングベクターのための汎用順行プライマー)
0.5μLの100μMのRC−Univ−PKS10−Rプライマー(クローニングベクターのための汎用逆行プライマー)
サイクル反応は以下のとおりだった:
98℃で1分間
98℃で10秒間、60℃で30秒間、72℃で1.5分間、
24回の追加サイクルを繰り返し、72℃で5分間、次いで4℃に保った。
構築した遺伝子産物をPKS10クローニングベクターにクローニングするために、プラスミドを先ずプライマーで増幅し、一致する重なり合った配列と構築した遺伝子産物とのその後の構築反応のための末端を創った。
クローニングベクターの調製
以下のようにPCRによって増幅した汎用PKS10クローニングベクター
20μLの5×PHUSION(登録商標)HFPCR緩衝液
2μLの10mMのdNTPs
75μLの水
1μLのホットスタートPHUSION(登録商標)ポリメラーゼ(フィンランド、VantaaのFinnzymes Oy)
6ng/μLのPKS10プラスミド鋳型を1μL
100μMのUniv−PKS10−Fプライマーを0.5μL
100μMのUniv−PKS10−Rプライマーを0.5μL
サイクル反応は以下のとおりだった:
98℃で30秒間
98℃で10秒間、60℃で30秒間、72℃で3分間、
29回の追加サイクルを繰り返し、72℃で5分間、次いで4℃に保った。
構築した合成遺伝子又はエラーを訂正した合成遺伝子のPCR産物をQIAGEN(登録商標)ゲル精製キットによってゲル精製し、以下のようなゲル精製した汎用PKS10ベクターのPCR産物との構築に使用した。
0.3μLのベクター
4.7μLのHA又はNA
5μLの2×構築マスターミックス
エンドヌクレアーゼ酵素とエキソヌクレアーゼ酵素の組み合わせを用いた種々のエラー訂正法に構築したHA及びNAの遺伝子を供し、主として構築された遺伝子産物に取り込まれたオリゴヌクレオチドの中での正しくない配列による内在するミスマッチを取り除いた。結果は、HA及びNAの遺伝子の簡単で、忠実性の高い、効率の良い遺伝子合成である。配列決定したクローンの数に合成したDNAの塩基対(bp)の数を乗じ、次いでこの数をエラーの総数で割ることによってエラー比率を決定した。
2工程反応においてエンドヌクレアーゼ酵素反応を先ず行い、その後エキソヌクレアーゼ酵素反応を行った。実施例1で示したような構築した遺伝子産物のPCRに続いて、以下の反応を実施した。
8μLのPCR産物を以下のように変性させ、アニールした:
98℃で2分間、2℃/秒にてゆっくりと85℃に冷却、85℃で2分間保持、0.1℃/秒でゆっくりと25℃に冷却、25℃で2分間保持、次いで10℃で保持。
2μLのSURVEYOR(登録商標)ヌクレアーゼ(ネブラスカ州、オマハのTransgenomic Inc.)(あらゆる型のミスマッチを切断する植物セロリに由来するミスマッチエンドヌクレアーゼ)を加え、42℃で1時間インキュベートした。
1μLのエキソヌクレアーゼIII(1×HF緩衝液で1:4000に希釈)を加え、37℃で1時間インキュベートした。
次いで2μLのこの反応ミックスを上述のようにPCRによって増幅した。
任意で工程1〜3を繰り返して(最終遺伝子産物におけるエラーをさらに減らすために)忠実性を高めた。
オリゴヌクレオチドから合成HA遺伝子を構築し、次いで、SURVEYOR(登録商標)ヌクレアーゼのみ、又は上記の2工程反応におけるSURVEYOR(登録商標)ヌクレアーゼとその後のエキソヌクレアーゼIIIを用いたエラー訂正に供した。得られたエラー比率は以下のとおりである。
反応は上記の2工程手順で行ったが、工程2におけるエンドヌクレアーゼ及び条件を以下のように変更した。
1工程反応では、エンドヌクレアーゼ酵素反応をエキソヌクレアーゼ酵素反応と同時に(同じ時間で同じ反応混合物にて)行った。実施例1で示したような構築された遺伝子産物のPCRに続いて以下の反応を行った。
8μLのPCR産物を以下のように変性させ、アニールした:
98℃で2分間、2℃/秒にてゆっくりと85℃に冷却、85℃で2分間保持、0.1℃/秒でゆっくりと25℃に冷却、25℃で2分間保持、次いで10℃で保持。
2μLのSURVEYOR(登録商標)ヌクレアーゼ(ネブラスカ州、オマハのTransgenomic Inc.)及び1μLのエキソヌクレアーゼIII(1×HF緩衝液で1:4000に希釈)を加え、42℃1時間インキュベートした。
次いで2μLのこの反応ミックスを上述のようにPCRによって増幅した。
オリゴヌクレオチドから合成HA遺伝子を構築し、次いで、上記の1工程反応にてエキソヌクレアーゼIIIと一緒にSURVEYOR(登録商標)ヌクレアーゼ(ネブラスカ州、オマハのTransgenomic Inc.)を用いたエラー訂正に供した。反応の後、成分を反応容器に加え、反応が終了するまで再び開けなかった。インキュベートの温度を4℃から50℃まで変化させ、エラー訂正に最適な反応条件を決定した。得られたエラー比率は以下のとおりであった。
構築したHA遺伝子産物を、種々のエンドヌクレアーゼのみを用いた、又はエキソヌクレアーゼ酵素又はエキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素とのエンドヌクレアーゼの組み合わせを用いた種々のエラー訂正法に供し、主として構築された遺伝子産物に取り込まれたオリゴヌクレオチドの中での正しくない配列による内在するミスマッチを取り除いた。
新規のミスマッチエンドヌクレアーゼをコードする幾つかの新規の遺伝子を特定し、単離した。これらの遺伝子のヌクレオチド配列は演繹されたアミノ酸配列と一緒に添付の配列表にて提供される。
本実施例は、Bac−to−Bac(登録商標)バキュロウイルス発現系(カリフォルニア州、カールスバッドのLife Technologies Inc.)を利用することによって昆虫細胞にてMimulus guttatus及びVitis viniferaから単離されたミスマッチエンドヌクレアーゼの異種発現を可能にする2つの組換え発現カセットの構築を記載する。
本実施例は、BAC−TO−BAC(登録商標)バキュロウイルス発現系(カリフォルニア州、カールスバッドのLife Technologies Inc.)を利用することによって昆虫細胞の培養にて組換えで発現させたMimmulus−C−His及びVitis−C−Hisエンドヌクレアーゼの産生の詳細を記載する。手短には、製造元の仕様に従ってP1ウイルスの生成及び組換え発現カセットの異種性作出を行った。組換えエンドヌクレアーゼの発現のためのP1ウイルスストック培養の細胞溶解物を以下に記載するような抗Hisタグ抗体を用いたウエスタンブロットアッセイによって解析した。
膜の調製:各昆虫細胞培養物の細胞ペレットをIMAC A緩衝液(20mMのトリス、500mMのNaCl、0.0125%のBrij−35、0.01%のTritonX−100、0.005%のTween−20、pH8.0)にて再浮遊させた。次いで、細胞浮遊液を超音波処理(3×30秒、脈動させる)し、卓上遠心機を用いて18,000rpmにて60分間遠心した。上清を捨て、ペレットを20mMトリス−HCl、150mMのNaCl、5%グリセロールに再懸濁させた。タンパク質濃度を定量し、次いで最終緩衝液(50mMのトリス−HCl、300mMのNaCl、10μMのZnCl2、20%グリセロール)にて10mg/mLに希釈した。タンパク質抽出物を1mL分画に等分し、液体窒素を用いて瞬間凍結し、−80℃で保存した。細胞溶解の効率をモニターするために、SDS−PAGEゲルアッセイ(CRITERION(商標)染色のないプレキャストPAGEシステム)(カリフォルニア州、ハーキュリーズのBioRad Laboratories Inc.)及びウエスタンブロット解析(抗HISエピトープ抗体)を通常、全細胞及び再懸濁したペレット試料にて実施した。
I.20mMのトリス−HCl、150mMのNaCl
II.20mMのトリス−HCl、150mMのNaCl、0.0125%のBrij−35、0.01%のTritonX−100、0.005%のTween−20
III.20mMのトリス−HCl、150mMのNaCl、8Mの尿素
IV.20mMのトリス−HCl、150mMのNaCl、0.0125%のBrij−35、0.01%のTritonX−100、0.005%のTween−20、8Mの尿素
実施例6に記載された発現カセットのそれぞれは、エンドヌクレアーゼの成熟コア領域をコードする核酸配列に操作可能に連結されたミツバチのメリチンの分泌シグナルをコードするヌクレオチド配列を含有した。この特徴は、それが昆虫細胞の細胞質でいったん産生されると組換えタンパク質が培養培地に分泌されるのを可能にする。
上記実施例7で記載されたように単離した精製した組換えMimulusC−Hisキメラエンドヌクレアーゼを実施例3に記載されたような種々の2工程エラー訂正アッセイに供した、すなわち、先ずエンドヌクレアーゼ酵素反応を行い、その後、エキソヌクレアーゼ酵素反応を行った。配列決定したクローンの数に合成したDNAの塩基対(bp)の数を乗じ、次いでこの数をエラーの総数で割ることによってエラーの総数で割ることによってエラー比率を決定した。
例となるエンドヌクレアーゼ−RES I
US7078211−SEQ ID NO:01−核酸配列
>RES I_US7078211_SEQIDNO_01
US7078211−SEQ ID NO:02−アミノ酸配列
>RES I_US7078211_SEQIDNO_02
例となるエンドヌクレアーゼ−CEL I
US6391557−SEQ ID NO:03−核酸配列
>CEL I_US6391557_SEQIDNO_03
US6391557−SEQ ID NO:04−アミノ酸配列
>CEL I_US6391557_SEQIDNO_04
例となるエンドヌクレアーゼ−CEL II
US7560261−SEQ ID NO:05−核酸配列
>CEL II_US7560261_SEQIDNO_05
US7560261−SEQ ID NO:06−アミノ酸配列
>CEL II_US7560261_SEQIDNO_06
US7560261−SEQ ID NO:07−核酸配列
>CEL II_US7560261_SEQIDNO_07
US7560261−SEQ ID NO:08−アミノ酸配列
>CEL II_US7560261_SEQIDNO_08
例となるエンドヌクレアーゼ−CEL I変異体−Mimulus guttatus
核酸配列 SEQ ID NO:09
アミノ酸配列 SEQ ID NO:10
昆虫細胞での発現用のアミノ酸配列 SEQ ID NO:11
下線−ミツバチのミリチンの分泌シグナル;
リンカーを伴ったポリヒスチジンタグ
例となるエンドヌクレアーゼ−CEL I変異体−Solanum tuberosum
核酸配列 SEQ ID NO:12
アミノ酸配列 SEQ ID NO:13
例となるエンドヌクレアーゼ−CEL I成熟コアの配列
アミノ酸配列 SEQ ID NO:14
例となるエンドヌクレアーゼ−CEL II変異体−Vitis vinifera
核酸配列 SEQ ID NO:15
アミノ酸配列 SEQ ID NO:16
昆虫細胞での発現用のアミノ酸配列 SEQ ID NO:17
下線−ミツバチのミリチンの分泌シグナル;
リンカーを伴ったポリヒスチジンタグ
例となるエンドヌクレアーゼ−CEL II変異体−Chocolate pots
核酸配列 SEQ ID NO:18
アミノ酸配列 SEQ ID NO:19
例となるエンドヌクレアーゼ−CEL II変異体−Obsidian pool
核酸配列 SEQ ID NO:20
アミノ酸配列 SEQ ID NO:21
例となるエンドヌクレアーゼ−CEL II 変異体−Vitis vinifera
核酸配列 SEQ ID NO:22
アミノ酸配列 SEQ ID NO:23
例となるエンドヌクレアーゼ−CEL II変異体−Solanum
核酸配列 SEQ ID NO:24
アミノ酸配列 SEQ ID NO:25
例となるエンドヌクレアーゼ−CEL II変異体−Medicago
核酸配列 SEQ ID NO:26
アミノ酸配列 SEQ ID NO:27
例となるエンドヌクレアーゼ−CEL II変異体成熟コア配列
アミノ酸配列 SEQ ID NO:28
例となるエンドヌクレアーゼ−CEL II変異体成熟コア配列
アミノ酸配列 SEQ ID NO:29
Mimulus guttatusのCEL Iのコドンが最適化された成熟コア領域
核酸配列 SEQ ID NO:30
Mimulus guttatusのCEL Iの昆虫細胞での発現のためにコドンが最適化された発現カセット
核酸配列 SEQ ID NO:31
Vitis viniferaのCEL IIのコドンが最適化された成熟コア領域
核酸配列 SEQ ID NO:32
Mimulus guttatusのCEL Iの昆虫細胞での発現のためにコドンが最適化された発現カセット
核酸配列 SEQ ID NO:33
Claims (33)
- (a)少なくとも1つのヌクレオチドミスマッチを含む第1の複数の二本鎖核酸分子を得る工程と、
(b)ミスマッチを有する核酸分子を一方向性のミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有する少なくとも1つの分子と反応させることによって、ミスマッチを有する前記複数の二本鎖核酸分子を断片化する工程と、
(c)(b)のミスマッチを有する断片化二本鎖核酸分子と、(b)の一方向性ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性と同じ方向性の一方向性エキソヌクレアーゼ活性を有する少なくとも1つの分子とを反応させることによって、前記ヌクレオチドミスマッチを取り除いて、断片化したエラーがない二本鎖核酸分子を提供する工程と、
(d)(c)の断片化したエラーがない二本鎖核酸分子を含む第2の複数の二本鎖核酸分子を構築する工程であって、第2の複数の二本鎖核酸分子は第1の複数の二本鎖核酸分子に比べてヌクレオチドミスマッチの頻度が低い、工程と
を含む、核酸分子のエラー訂正の方法。 - 第1の複数の核酸分子が1つまたは複数の合成ヌクレオチド配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 第1の複数の核酸分子が、1つまたは複数の天然に存在する遺伝子配列と1つまたは複数の合成のヌクレオチド配列との混合物を含む、請求項1に記載の方法。
- 第1の複数の核酸分子を得る工程が核酸分子を合成することを含む、請求項1に記載の方法。
- 第1の複数の核酸分子を得る工程が、サブセット及び/又はオリゴヌクレオチドから核酸分子を構築することを含む、請求項1に記載の方法。
- 工程(b)と工程(c)が別々の反応として実施される、請求項1に記載の方法。
- 工程(b)と工程(c)が1工程の同時反応として実施される、請求項1に記載の方法。
- 一方向性のミスマッチエンドヌクレアーゼ活性がミスマッチに対して5'を切断し、一方向性のエキソヌクレアーゼ活性が前記断片化された核酸分子の5'末端から前記ヌクレオチドミスマッチを取り除く、請求項1に記載の方法。
- 一方向性のミスマッチエンドヌクレアーゼ活性が前記ミスマッチに対して3'を切断し、一方向性のエキソヌクレアーゼ活性が前記断片化された核酸分子の3'末端から前記ヌクレオチドミスマッチを取り除く、請求項1に記載の方法。
- 一方向性のミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有する前記少なくとも1つの分子が、RES I、CEL I、CEL II、SPエンドヌクレアーゼ、SP I、T7エンドヌクレアーゼ、T4エンドヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼV、Mutタンパク質、それらのいずれかの変異体、及び上記の2以上の組み合わせから成る群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 一方向性のミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有する前記少なくとも1つの分子が、CEL I、CEL II、それらのいずれかの変異体、及び上記の2以上の組み合わせから成る群から選択される、請求項10に記載の方法。
- 一方向性のミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有する前記少なくとも1つの分子が、
(a)SEQ ID NO:01、SEQ ID NO:03、SEQ ID NO:05、SEQ ID NO:07、SEQ ID NO:09、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、いずれかの相補体、及びいずれかの断片から成る群から選択される核酸配列と、低、中、又は高ストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸配列;
(b)SEQ ID NO:01、SEQ ID NO:03、SEQ ID NO:05、SEQ ID NO:07、SEQ ID NO:09、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、いずれかの相補体、及びいずれかの断片から成る群から選択される核酸配列に対して70%以上の同一性を示す核酸配列;並びに
(c)SEQ ID NO:02、SEQ ID NO:04、SEQ ID NO:06、SEQ ID NO:08、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、及びSEQ ID NO:29から成る群から選択されるアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を示すポリペプチドをコードする核酸配列
から成る群から選択される核酸配列によってコードされる、請求項1に記載の方法。 - 一方向性のエキソヌクレアーゼ活性を有する前記少なくとも1つの分子が、エキソヌクレアーゼIII、DNAポリメラーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、T7エキソヌクレアーゼ、T5エキソヌクレアーゼ、及びそのいずれかの変異体から成る群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 一方向性のエキソヌクレアーゼ活性を有する前記少なくとも1つの分子が、校正活性を持つポリメラーゼである、請求項1に記載の方法。
- 校正活性を持つポリメラーゼが、T4ポリメラーゼ、T7ポリメラーゼ、及びphi29ポリメラーゼから成る群から選択される、請求項14に記載の方法。
- 一方向性のミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有する前記少なくとも1つの分子が、CEL I、CEL II、そのいずれかの変異体、及び上記の2以上の組み合わせから成る群から選択され、
一方向性のエキソヌクレアーゼ活性を有する前記少なくとも1つの分子が、エキソヌクレアーゼIII及びその変異体から成る群から選択される、
請求項1に記載の方法。 - (a)SEQ ID NO:09、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、その相補体、若しくはいずれかの断片から成る群から選択される核酸配列と、低、中、又は高ストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸配列;又は
(b)SEQ ID NO:09、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、その相補体、若しくはいずれかの断片から成る群から選択される核酸配列に対して70%以上の同一性を示す核酸配列;又は
(d)SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、及びSEQ ID NO:29から成る群から選択されるアミノ酸配列に対して50%以上の同一性を示すポリペプチドをコードする核酸配列
を含む、単離された核酸分子。 - 前記核酸配列が、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有する分子をコードする、請求項17に記載の核酸分子。
- 異種核酸に操作可能に連結された請求項17に記載の核酸分子を含む組換え核酸構築物。
- 異種核酸が異種転写制御要素である、請求項19に記載の組換え核酸構築物。
- 異種核酸が、ポリペプチド配列をコードする核酸配列を含む、請求項19に記載の組換え核酸構築物。
- 前記ポリペプチド配列が分泌シグナル又はエピトープタグを含む、請求項21に記載の組換え核酸構築物。
- 請求項19に記載の核酸構築物を含む組換え宿主細胞。
- 昆虫細胞、哺乳類細胞、微生物細胞、又は植物細胞である、請求項23に記載の組換え宿主細胞。
- 宿主細胞に導入された請求項17に記載の核酸配列を含む核酸分子によって発現される、単離されたポリペプチド。
- SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:11のアミノ酸残基1〜297、SEQ ID NO:11のアミノ酸残基22〜308、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:17のアミノ酸残基1〜320、及びSEQ ID NO:17のアミノ酸残基22〜331から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項25に記載の単離されたポリペプチド。
- (i)一方向性のミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有する分子と、(ii)(i)の一方向性のミスマッチエンドヌクレアーゼ活性と同じ方向性の一方向性のエキソヌクレアーゼ活性を有する分子とを含む、組成物。
- (i)の分子が、RES I、CEL I、CEL II、T7エンドヌクレアーゼ、T4エンドヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼV、Mutタンパク質、そのいずれかの変異体、及び上記の2以上の組み合わせから成る群から選択され;(ii)の分子が、エキソヌクレアーゼIII、DNAポリメラーゼ、そのいずれかの変異体、及び上記の2以上の組み合わせから成る群から選択される、請求項27に記載の組成物。
- (i)の分子が、CEL I、CEL II、そのいずれかの変異体、及び上記の2以上の組み合わせから成る群から選択され;(ii)の分子が、エキソヌクレアーゼIII及びその変異体から成る群から選択される、請求項27に記載の組成物。
- (i)の分子が、RES I、CEL I、CEL II、T7エンドヌクレアーゼ、T4エンドヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼV、Mutタンパク質、そのいずれかの変異体、及び上記の2以上の組み合わせから成る群から選択され;(ii)の分子が、エキソヌクレアーゼIII又はその変異体である、請求項27に記載の組成物。
- 請求項27に記載の組成物を含むキット。
- 一方向性のミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有する分子が、RES I、CEL I、CEL II、T7エンドヌクレアーゼ、T4エンドヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼV、Mutタンパク質、そのいずれかの変異体、及び上記の2以上の組み合わせから成る群から選択され;一方向性のミスマッチエンドヌクレアーゼと同じ方向性の一方向性のエキソヌクレアーゼ活性を有する分子が、エキソヌクレアーゼIII、DNAポリメラーゼ、そのいずれかの変異体、及び上記の2以上の組み合わせから成る群から選択される、請求項31に記載のキット。
- 一方向性のミスマッチエンドヌクレアーゼ活性と同じ方向性の一方向性のエキソヌクレアーゼ活性を有する分子が、RES I、CEL I、CEL II、T7エンドヌクレアーゼ、T4エンドヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼV、Mutタンパク質、そのいずれかの変異体、及び上記の2以上の組み合わせから成る群から選択され;一方向性のミスマッチエンドヌクレアーゼと同じ方向性の一方向性のエキソヌクレアーゼ活性を有する分子が、エキソヌクレアーゼIII又はその変異体から成る群から選択される、請求項32に記載のキット。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201261593813P | 2012-02-01 | 2012-02-01 | |
US61/593,813 | 2012-02-01 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017245919A Division JP6663904B2 (ja) | 2012-02-01 | 2017-12-22 | エラーを最少限に抑える核酸分子の合成のための材料及び方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2020078330A true JP2020078330A (ja) | 2020-05-28 |
JP7175290B2 JP7175290B2 (ja) | 2022-11-18 |
Family
ID=48905917
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014555797A Pending JP2015509005A (ja) | 2012-02-01 | 2013-02-01 | エラーを最少限に抑える核酸分子の合成のための材料及び方法 |
JP2017245919A Active JP6663904B2 (ja) | 2012-02-01 | 2017-12-22 | エラーを最少限に抑える核酸分子の合成のための材料及び方法 |
JP2020023979A Active JP7175290B2 (ja) | 2012-02-01 | 2020-02-17 | エラーを最少限に抑える核酸分子の合成のための材料及び方法 |
Family Applications Before (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014555797A Pending JP2015509005A (ja) | 2012-02-01 | 2013-02-01 | エラーを最少限に抑える核酸分子の合成のための材料及び方法 |
JP2017245919A Active JP6663904B2 (ja) | 2012-02-01 | 2017-12-22 | エラーを最少限に抑える核酸分子の合成のための材料及び方法 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US9771576B2 (ja) |
EP (2) | EP2809795B1 (ja) |
JP (3) | JP2015509005A (ja) |
CN (1) | CN104220602B (ja) |
AU (2) | AU2013214771B2 (ja) |
CA (2) | CA2862149C (ja) |
DK (1) | DK2809795T3 (ja) |
IL (1) | IL233687B (ja) |
SG (2) | SG10201606285YA (ja) |
WO (1) | WO2013116771A1 (ja) |
Families Citing this family (33)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP6009649B2 (ja) | 2013-03-14 | 2016-10-19 | タカラバイオ株式会社 | 耐熱性のミスマッチエンドヌクレアーゼの利用方法 |
KR102423377B1 (ko) | 2013-08-05 | 2022-07-25 | 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 | 드 노보 합성된 유전자 라이브러리 |
CN107002067A (zh) | 2014-09-11 | 2017-08-01 | 宝生物工程株式会社 | 利用热稳定性错配内切核酸酶的方法 |
AU2015362618B2 (en) * | 2014-12-16 | 2022-01-27 | C3J Therapeutics, Inc. | Compositions of and methods for in vitro viral genome engineering |
EP3037530B1 (en) * | 2014-12-22 | 2017-02-01 | Sandoz Ag | Sequence variants |
CA2975852A1 (en) | 2015-02-04 | 2016-08-11 | Twist Bioscience Corporation | Methods and devices for de novo oligonucleic acid assembly |
WO2016172377A1 (en) | 2015-04-21 | 2016-10-27 | Twist Bioscience Corporation | Devices and methods for oligonucleic acid library synthesis |
CN108368482A (zh) | 2015-09-18 | 2018-08-03 | 特韦斯特生物科学公司 | 寡核酸变体文库及其合成 |
KR20180058772A (ko) | 2015-09-22 | 2018-06-01 | 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 | 핵산 합성을 위한 가요성 기판 |
CN108473984A (zh) * | 2015-11-04 | 2018-08-31 | 阿特雷卡公司 | 用于分析与单个细胞相关联的核酸的核酸条形码的组合组 |
CN108603307A (zh) | 2015-12-01 | 2018-09-28 | 特韦斯特生物科学公司 | 功能化表面及其制备 |
US10793888B2 (en) * | 2015-12-22 | 2020-10-06 | Jiangnan University | In vitro method for fast scarless DNA assembly using thermostable exonucleases and ligase |
JP6854340B2 (ja) | 2016-08-22 | 2021-04-07 | ツイスト バイオサイエンス コーポレーション | デノボ合成された核酸ライブラリ |
KR102217487B1 (ko) | 2016-09-21 | 2021-02-23 | 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 | 핵산 기반 데이터 저장 |
EA201991262A1 (ru) | 2016-12-16 | 2020-04-07 | Твист Байосайенс Корпорейшн | Библиотеки вариантов иммунологического синапса и их синтез |
EP3586255A4 (en) | 2017-02-22 | 2021-03-31 | Twist Bioscience Corporation | NUCLEIC ACID-BASED DATA STORAGE |
WO2018170169A1 (en) | 2017-03-15 | 2018-09-20 | Twist Bioscience Corporation | Variant libraries of the immunological synapse and synthesis thereof |
US10883092B2 (en) * | 2017-04-18 | 2021-01-05 | Mgi Tech Co., Ltd. | Phi29 DNA polymerase and encoding gene and application thereof |
WO2018231864A1 (en) | 2017-06-12 | 2018-12-20 | Twist Bioscience Corporation | Methods for seamless nucleic acid assembly |
CA3066744A1 (en) | 2017-06-12 | 2018-12-20 | Twist Bioscience Corporation | Methods for seamless nucleic acid assembly |
CA3075505A1 (en) | 2017-09-11 | 2019-03-14 | Twist Bioscience Corporation | Gpcr binding proteins and synthesis thereof |
GB2583590A (en) | 2017-10-20 | 2020-11-04 | Twist Bioscience Corp | Heated nanowells for polynucleotide synthesis |
JP7191448B2 (ja) | 2018-01-04 | 2022-12-19 | ツイスト バイオサイエンス コーポレーション | Dnaベースのデジタル情報ストレージ |
GB201814590D0 (en) * | 2018-09-07 | 2018-10-24 | Oxford Biomedica Ltd | Viral vector production system |
JP7032976B2 (ja) * | 2018-03-30 | 2022-03-09 | 日揮触媒化成株式会社 | 金属粒子分散液及びその製造方法 |
AU2019270243A1 (en) | 2018-05-18 | 2021-01-07 | Twist Bioscience Corporation | Polynucleotides, reagents, and methods for nucleic acid hybridization |
CN111349673A (zh) * | 2018-12-20 | 2020-06-30 | 江苏金斯瑞生物科技有限公司 | 一种单链dna的合成及错误纠正方法 |
SG11202109283UA (en) | 2019-02-26 | 2021-09-29 | Twist Bioscience Corp | Variant nucleic acid libraries for antibody optimization |
WO2020176678A1 (en) | 2019-02-26 | 2020-09-03 | Twist Bioscience Corporation | Variant nucleic acid libraries for glp1 receptor |
CN114729342A (zh) | 2019-06-21 | 2022-07-08 | 特韦斯特生物科学公司 | 基于条形码的核酸序列装配 |
US10894812B1 (en) | 2020-09-30 | 2021-01-19 | Alpine Roads, Inc. | Recombinant milk proteins |
AU2021353004A1 (en) | 2020-09-30 | 2023-04-13 | Nobell Foods, Inc. | Recombinant milk proteins and food compositions comprising the same |
US10947552B1 (en) | 2020-09-30 | 2021-03-16 | Alpine Roads, Inc. | Recombinant fusion proteins for producing milk proteins in plants |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030157495A1 (en) * | 2002-02-01 | 2003-08-21 | Padgett Hal S. | Nucleic acid molecules encoding CEL I endonuclease and methods of use thereof |
US20030157682A1 (en) * | 2002-02-01 | 2003-08-21 | Padgett Hal S. | Mismatch endonucleases and methods of use |
WO2008112683A2 (en) * | 2007-03-13 | 2008-09-18 | President And Fellows Of Harvard College | Gene synthesis by circular assembly amplification |
Family Cites Families (40)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IE54046B1 (en) | 1981-08-25 | 1989-05-24 | Celltech Ltd | Expression vectors |
US4579821A (en) | 1981-11-23 | 1986-04-01 | University Patents, Inc. | Control of DNA sequence transcription |
US4656134A (en) | 1982-01-11 | 1987-04-07 | Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University | Gene amplification in eukaryotic cells |
US4486533A (en) | 1982-09-02 | 1984-12-04 | St. Louis University | Filamentous fungi functional replicating extrachromosomal element |
US4599311A (en) | 1982-08-13 | 1986-07-08 | Kawasaki Glenn H | Glycolytic promotersfor regulated protein expression: protease inhibitor |
US4977092A (en) | 1985-06-26 | 1990-12-11 | Amgen | Expression of exogenous polypeptides and polypeptide products including hepatitis B surface antigen in yeast cells |
US4601978A (en) | 1982-11-24 | 1986-07-22 | The Regents Of The University Of California | Mammalian metallothionein promoter system |
US4713339A (en) | 1983-01-19 | 1987-12-15 | Genentech, Inc. | Polycistronic expression vector construction |
US4661454A (en) | 1983-02-28 | 1987-04-28 | Collaborative Research, Inc. | GAL1 yeast promoter linked to non galactokinase gene |
US5139936A (en) | 1983-02-28 | 1992-08-18 | Collaborative Research, Inc. | Use of the GAL1 yeast promoter |
US4870008A (en) | 1983-08-12 | 1989-09-26 | Chiron Corporation | Secretory expression in eukaryotes |
US4931373A (en) | 1984-05-25 | 1990-06-05 | Zymogenetics, Inc. | Stable DNA constructs for expression of α-1 antitrypsin |
US4766073A (en) | 1985-02-25 | 1988-08-23 | Zymogenetics Inc. | Expression of biologically active PDGF analogs in eucaryotic cells |
DE3578435D1 (de) | 1984-12-06 | 1990-08-02 | Labofina Sa | Promotoren fuer die expression von fremden genen in hefe, plasmide, die diese promotoren enthalten, sowie deren verwendung zur herstellung von polypeptiden. |
GR860984B (en) | 1985-04-17 | 1986-08-18 | Zymogenetics Inc | Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells |
US4882279A (en) | 1985-10-25 | 1989-11-21 | Phillips Petroleum Company | Site selective genomic modification of yeast of the genus pichia |
US4935349A (en) | 1986-01-17 | 1990-06-19 | Zymogenetics, Inc. | Expression of higher eucaryotic genes in aspergillus |
GB8611832D0 (en) | 1986-05-15 | 1986-06-25 | Holland I B | Polypeptide |
US5063154A (en) | 1987-06-24 | 1991-11-05 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Pheromone - inducible yeast promoter |
US4956288A (en) | 1988-04-22 | 1990-09-11 | Biogen, Inc. | Method for producing cells containing stably integrated foreign DNA at a high copy number, the cells produced by this method, and the use of these cells to produce the polypeptides coded for by the foreign DNA |
US5037743A (en) | 1988-08-05 | 1991-08-06 | Zymogenetics, Inc. | BAR1 secretion signal |
US5162228A (en) | 1988-12-28 | 1992-11-10 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Gylceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene and promoter |
US5162222A (en) | 1989-07-07 | 1992-11-10 | Guarino Linda A | Use of baculovirus early promoters for expression of foreign genes in stably transformed insect cells or recombinant baculoviruses |
JPH08502646A (ja) | 1992-09-14 | 1996-03-26 | ファイザー・インコーポレイテッド | 不死化細胞およびその使用 |
EP0889966A1 (en) | 1995-11-09 | 1999-01-13 | ZymoGenetics, Inc. | Compositions and methods for producing heterologous polypeptides in pichia methanolica |
WO1997046701A1 (en) | 1996-06-05 | 1997-12-11 | Fox Chase Cancer Center | Mismatch endonucleases and uses thereof in identifying mutations in targeted polynucleotide strands |
US5869245A (en) | 1996-06-05 | 1999-02-09 | Fox Chase Cancer Center | Mismatch endonuclease and its use in identifying mutations in targeted polynucleotide strands |
CN1238806A (zh) | 1996-07-17 | 1999-12-15 | 津莫吉尼蒂克斯公司 | 甲醇毕赤酵母营养突变体的制备 |
CA2261151C (en) | 1996-07-17 | 2003-09-16 | Zymogenetics, Inc. | Transformation of pichia methanolica |
US6391557B1 (en) | 2000-02-22 | 2002-05-21 | Fox Chase Cancer Center | Nucleic acid molecule encoding a mismatch endonuclease and methods of use thereof |
US6699980B1 (en) | 2000-02-28 | 2004-03-02 | Fox Chase Cancer Center | Nucleic acid molecule encoding a mismatch endonuclease and methods of use thereof |
US7838219B2 (en) | 2001-02-02 | 2010-11-23 | Novici Biotech Llc | Method of increasing complementarity in a heteroduplex |
JP4689940B2 (ja) * | 2001-02-02 | 2011-06-01 | ノビシ バイオテック,リミティド ライアビリティ カンパニー | ヘテロ二本鎖の相補性を増大させる方法 |
DE10248258A1 (de) * | 2002-10-16 | 2004-05-06 | Biopsytec Analytik Gmbh | Mutierte Nukleinsäure einer Cel I-Endonuklease und Verfahren zur Herstellung des rekombinanten vollständigen Cel I-Proteins |
US7129075B2 (en) | 2002-10-18 | 2006-10-31 | Transgenomic, Inc. | Isolated CEL II endonuclease |
US7560261B2 (en) | 2004-06-17 | 2009-07-14 | Transgenomic, Inc. | Nucleic acid sequences encoding CEL II endonuclease |
US20070269870A1 (en) | 2004-10-18 | 2007-11-22 | George Church | Methods for assembly of high fidelity synthetic polynucleotides |
DK3064599T3 (en) | 2008-02-15 | 2019-04-08 | Synthetic Genomics Inc | METHODS IN VITRO FOR COMBINING AND COMBINATORY CONSTRUCTION OF NUCLEIC ACID MOLECULES |
WO2011102802A1 (en) * | 2010-02-18 | 2011-08-25 | Agency For Science, Technology And Research | Method for reducing mismatches in double-stranded dna molecules |
LT2768607T (lt) * | 2011-09-26 | 2021-12-27 | Thermo Fisher Scientific Geneart Gmbh | Daugiašulininė plokštelė didelio efektyvumo, mažo tūrio nukleorūgščių sintezei atlikti |
-
2013
- 2013-02-01 AU AU2013214771A patent/AU2013214771B2/en active Active
- 2013-02-01 CA CA2862149A patent/CA2862149C/en active Active
- 2013-02-01 CA CA3156904A patent/CA3156904A1/en active Pending
- 2013-02-01 EP EP13743710.9A patent/EP2809795B1/en active Active
- 2013-02-01 WO PCT/US2013/024496 patent/WO2013116771A1/en active Application Filing
- 2013-02-01 US US13/757,633 patent/US9771576B2/en active Active
- 2013-02-01 EP EP19193201.1A patent/EP3597764A3/en active Pending
- 2013-02-01 SG SG10201606285YA patent/SG10201606285YA/en unknown
- 2013-02-01 DK DK13743710.9T patent/DK2809795T3/da active
- 2013-02-01 SG SG11201404332RA patent/SG11201404332RA/en unknown
- 2013-02-01 JP JP2014555797A patent/JP2015509005A/ja active Pending
- 2013-02-01 CN CN201380009031.7A patent/CN104220602B/zh active Active
-
2014
- 2014-07-17 IL IL233687A patent/IL233687B/en active IP Right Grant
-
2017
- 2017-08-02 US US15/667,515 patent/US10704041B2/en active Active
- 2017-12-06 AU AU2017272206A patent/AU2017272206B2/en active Active
- 2017-12-22 JP JP2017245919A patent/JP6663904B2/ja active Active
-
2020
- 2020-02-17 JP JP2020023979A patent/JP7175290B2/ja active Active
- 2020-07-02 US US16/920,204 patent/US11884916B2/en active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030157495A1 (en) * | 2002-02-01 | 2003-08-21 | Padgett Hal S. | Nucleic acid molecules encoding CEL I endonuclease and methods of use thereof |
US20030157682A1 (en) * | 2002-02-01 | 2003-08-21 | Padgett Hal S. | Mismatch endonucleases and methods of use |
JP2005529586A (ja) * | 2002-02-01 | 2005-10-06 | ラージ スケール バイオロジー コーポレイション | ミスマッチエンドヌクレアーゼ及び使用方法 |
WO2008112683A2 (en) * | 2007-03-13 | 2008-09-18 | President And Fellows Of Harvard College | Gene synthesis by circular assembly amplification |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
" CCIC7557.B1 CCIC MIMULUS GUTTATUS IM62 ROOTS (H) ERYTHRANTHE GUTTATA CDNA CLONECCIC7557 5', MRNA S, JPN6021012062, ISSN: 0004642323 * |
." CBPG5929.B1 CBPG MIMULUS GUTTATUS IM62 ROOTS, SEEDLINGS, FRUITS, CALLUS (L) ERYTHRANTHE GUTTATA, JPN6021012061, ISSN: 0004642322 * |
JOURNAL OF PLANT PHYSIOLOGY, 2005, VOL.162, PP.1263-1269, JPN6021012066, ISSN: 0004642321 * |
NUCLEIC ACIDS RESEARCH, 2012, 40(3), E23, EPUB 2011 NOV 29, JPN6016043424, ISSN: 0004642320 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2809795A4 (en) | 2016-03-16 |
CN104220602B (zh) | 2018-10-30 |
AU2013214771A1 (en) | 2014-08-14 |
EP2809795B1 (en) | 2019-09-18 |
EP3597764A2 (en) | 2020-01-22 |
JP2015509005A (ja) | 2015-03-26 |
US9771576B2 (en) | 2017-09-26 |
US20180051280A1 (en) | 2018-02-22 |
DK2809795T3 (da) | 2019-12-16 |
IL233687A0 (en) | 2014-09-30 |
JP6663904B2 (ja) | 2020-03-13 |
SG10201606285YA (en) | 2016-09-29 |
EP3597764A3 (en) | 2020-05-06 |
US20200332286A1 (en) | 2020-10-22 |
JP2018068311A (ja) | 2018-05-10 |
US11884916B2 (en) | 2024-01-30 |
WO2013116771A1 (en) | 2013-08-08 |
CN104220602A (zh) | 2014-12-17 |
EP2809795A1 (en) | 2014-12-10 |
CA3156904A1 (en) | 2013-08-08 |
US20130225451A1 (en) | 2013-08-29 |
JP7175290B2 (ja) | 2022-11-18 |
CA2862149A1 (en) | 2013-08-08 |
CA2862149C (en) | 2022-07-26 |
SG11201404332RA (en) | 2014-08-28 |
AU2013214771B2 (en) | 2017-09-07 |
AU2017272206B2 (en) | 2020-01-16 |
US10704041B2 (en) | 2020-07-07 |
IL233687B (en) | 2021-05-31 |
AU2017272206A1 (en) | 2018-01-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7175290B2 (ja) | エラーを最少限に抑える核酸分子の合成のための材料及び方法 | |
CN102796728B (zh) | 用于通过转座酶的dna片段化和标记的方法和组合物 | |
US20230193222A1 (en) | Variants of Family a Dna Polymerase and Uses Thereof | |
WO2023039378A1 (en) | Class ii, type v crispr systems | |
KR20240053585A (ko) | 카고 뉴클레오티드 서열을 전이시키기 위한 시스템 및 방법 | |
EP2718430B1 (en) | Sequence-specific engineered ribonuclease h and the method for determining the sequence preference of dna-rna hybrid binding proteins | |
JPWO2006095769A1 (ja) | 低温性微生物由来エンドヌクレアーゼ | |
Xiong et al. | High efficiency and throughput system in directed evolution in vitro of reporter gene | |
KR102636161B1 (ko) | 단일-가닥 결합 단백질 | |
US7902335B1 (en) | Heat-stable recA mutant protein and a nucleic acid amplification method using the heat-stable recA mutant protein | |
WO2004020621A1 (ja) | 耐熱性リボヌクレアーゼh | |
WO2023039377A1 (en) | Class ii, type v crispr systems | |
JP2007275010A (ja) | アクチンの製造方法、それに用いるベクターおよび原核宿主細胞 | |
JP2007530046A (ja) | 新規モジュラーII型制限エンドヌクレアーゼCspCI、および新規特異性を有するエンドヌクレアーゼを製造するためのモジュラーエンドヌクレアーゼの用途 | |
JPH11151087A (ja) | Dnaポリメラーゼ遺伝子 | |
US20070016970A1 (en) | Guinea pig-chymase | |
JP2003274962A (ja) | 新規な耐熱性dnaポリメラーゼ及び該dnaポリメラーゼの生産方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200311 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20200311 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210405 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210701 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20210728 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20211118 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220215 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220516 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220804 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20221031 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20221108 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7175290 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |