KR102636161B1 - 단일-가닥 결합 단백질 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 DNA 분자를 탈혼성화하거나 또는 상보성 ssDNA의 혼성화를 방지하기 위한, 500mM의 나트륨 이온의 존재 하에 최대 ssDNA 결합 능력의 적어도 50%를 나타내는 단일-가닥 DNA 결합 단백질(SSB)의 용도에 관한 것으로서, 상기 SSB는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 1과 적어도 75% 동일한 아미노산 서열, 또는 그의 기능적 단편을 포함하고, 상기 DNA 분자 또는 ssDNA는 (i) 적어도 350mM의 나트륨 이온; (ii) 적어도 50mM의 칼륨 이온; (iii) 적어도 150mM의 마그네슘 이온; 또는 (iv) 적어도 200mM의 칼슘 이온 중 하나 이상을 함유하는 용액 내에 존재하거나 또는 그에 노출된다.
Description
본 발명은 고염 농도에서 기능할 수 있는, 단일-가닥(단일-가닥화로도 알려짐) DNA-결합 단백질(SSB), 특히 SSB의 한 부류에 관한 것이다.
단일-가닥 DNA-결합 단백질(SSB)은 단일-가닥 DNA(ssDNA) 및 RNA에 결합하여, 핵단백질 복합체를 형성할 수 있지만, 이중-가닥 DNA에 대한 그의 친화도는 낮다. 이러한 복합체에 존재하는 핵산은 이어서 폴리머라제 또는 다른 DNA 또는 RNA 변형 효소에 대한 기질로서 역할을 할 수 있다. 이. 콜라이(E. coli)로부터, 동종사량체로서 ssDNA에 결합하는 178개 아미노산 단백질인 SSB가 가장 잘 특징화된다.
SSB는 생체내 DNA 복제 및 재조합에 수반되며, 풀어진 DNA 듀플렉스의 분리를 효과적으로 유지하고(재어닐링을 방지하고) 2개 가닥을 단일-가닥 형태로 유지한다. SSB는 DNA 또는 RNA가 단일-가닥 형태로 보존될 필요가 있는 모든 적용에서 사용될 수 있다. 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 기술은 변성된 DNA를 안정화시킬 수 있는 SSB를 부가하고, 듀플렉스 형성을 방지하고, ssDNA를 뉴클레아제에 의한 소화로부터 보호함으로써 최적화될 수 있다. SSB는 또한 핵산의 역전사 PCR 및 등온 증폭에서 사용된다. 다른 적용은 부위 지정 돌연변이유발에서 RecA와 조합하여 사용하는 것을 포함한다. SSB는 DNA 서열분석 반응에서 사용된 특이적 DNA 폴리머라제를 자극하고, 파이로시퀀싱 기술의 맥락에서 이는 신호 강도를 증가시키고, 비특이적 신호를 감소시키며, 중합 효능을 개선시킨다.
분자 생물학에서 SSB의 유용성은 분명하지만, SSB의 능숙함은 반응 혼합물에 존재하는 염의 유형 및 농도에 매우 의존한다(Nucleic Acid Research [2008] Vol. 36 No. 1 p294-9). 특히, 상승된 염 농도에서 안정한 핵단백질 복합체를 형성할 수 있는 상업적으로 입수가능한 SSB는 없다. 염-안정한 핵단백질 복합체는, 예를 들어 "차세대" DNA 서열분석, 예를 들어 일루미나 워크플로우 방법에서 매우 바람직한, 고염 완충제로의 세척을 견딜 수 있다. 광범위한 염 조건, 특히 상승된 염 농도에서 안정한 핵단백질 복합체를 형성할 수 있는 SSB, 및 고농도의 염의 존재 하에 수행될 수 있는 핵산 증폭 및 서열분석 방법에 대한 필요성은 확인된 바 있다.
본 발명자들은 적합하게 상용성인 SSB 분자를 이용하는 이러한 방법을 개발하였다.
제1 측면에서, 본 발명은 핵산 증폭 또는 서열분석 방법을 제공하며, 여기서 반응 혼합물 또는 샘플 용액은 500mM의 나트륨 이온의 존재 하에 최대 ssDNA 결합 능력의 적어도 50%를 나타내는 단일-가닥 DNA 결합 단백질(SSB)을 함유한다.
추가 측면에서, 본 발명은 부위 지정 돌연변이유발 방법을 제공하며, 여기서 반응 혼합물은 500mM의 나트륨 이온의 존재 하에 최대 ssDNA 결합 능력의 적어도 50%를 나타내는 단일-가닥 DNA 결합 단백질(SSB)을 함유한다.
추가 측면에서, 본 발명은 현미경을 사용하여 샘플에서 (예를 들어 세포내) 핵산 구조를 검사하는 방법을 제공하며, 여기서 핵산 샘플을 500mM의 나트륨 이온의 존재 하에 최대 ssDNA 결합 능력의 적어도 50%를 나타내는 단일-가닥 DNA 결합 단백질(SSB)과 접촉시킨다. 이러한 방법에서, SSB는 ssDNA의 영역을 안정화시키고/시키거나 표시한다.
이러한 방법에서, 예를 들어, 전자 현미경 또는 형광 현미경이 사용될 수 있다. 형광 현미경검사 방법에서 이용된 SSB는, 예를 들어 형광 표지를 포함하는 형광 유도체일 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 제한 효소 소화 방법을 제공하며, 여기서 반응 혼합물은 500mM의 나트륨 이온의 존재 하에 최대 ssDNA 결합 능력의 적어도 50%를 나타내는 단일-가닥 DNA 결합 단백질(SSB)을 함유한다.
추가 측면에서, 본 발명은 역전사 방법(예를 들어 RT-PCR 방법에서 제1 단계)을 제공하며, 여기서 반응 혼합물은 500mM의 나트륨 이온의 존재 하에 최대 ssDNA 결합 능력의 적어도 50%를 나타내는 단일-가닥 DNA 결합 단백질(SSB)을 함유한다.
추가 측면에서, 본 발명은 T4 폴리머라제의 활성을 증진시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 T4 폴리머라제를 500mM의 나트륨 이온의 존재 하에 최대 ssDNA 결합 능력의 적어도 50%를 나타내는 단일-가닥 DNA 결합 단백질(SSB)과 접촉시키는 단계를 포함한다. 대안적으로 보면, 본 발명은 T4 폴리머라제의 활성을 증진시키기 위한, 500mM의 나트륨 이온의 존재 하에 최대 ssDNA 결합 능력의 적어도 50%를 나타내는 단일-가닥 DNA 결합 단백질(SSB)의 용도를 제공한다.
상기 방법에서 SSB 결합에 대한 표적 핵산은 바람직하게는 ssDNA이지만 RNA일 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 ssDNA 또는 RNA를 뉴클레아제 소화로부터 보호하는 방법을 제공하며, 여기서 반응 혼합물 500mM의 나트륨 이온의 존재 하에 최대 ssDNA 결합 능력의 적어도 50%를 나타내는 단일-가닥 DNA 결합 단백질(SSB)을 함유한다. 이러한 보호는 샘플/생성물의 "클린-업(clean-up)" 또는 정제 방법에서 사용할 수 있다. 대안적으로 보면, 본 발명은 ssDNA를 뉴클레아제 소화로부터 보호하기 위한, 500mM의 나트륨 이온의 존재 하에 최대 ssDNA 결합 능력의 적어도 50%를 나타내는 단일-가닥 DNA 결합 단백질(SSB)의 용도를 제공한다. 대안적으로 보면, 본 발명은 ssDNA 또는 RNA를 뉴클레아제 소화로부터 보호하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 ssDNA 또는 RNA를 500mM의 나트륨 이온의 존재 하에 최대 ssDNA 결합 능력의 적어도 50%를 나타내는 단일-가닥 DNA 결합 단백질(SSB)과 접촉시키는 단계를 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 핵산 정제 방법, 즉 하나 이상의 핵산 분자를 샘플로부터 단리하는 방법을 제공하며, 여기서 샘플을 500mM의 나트륨 이온의 존재 하에 최대 ssDNA 결합 능력의 적어도 50%를 나타내는 단일-가닥 DNA 결합 단백질(SSB)과 접촉시킨다. 바람직하게는, 핵산 분자는 DNA 분자, 바람직하게는 ≥ 0.5 Mbp, 보다 바람직하게는 ≥ 1 Mbp 크기의 DNA 분자이다. 그의 크기로 인해, 이러한 큰 DNA 단편은 단리 동안 기계적 파손이 일어나기 쉽다. 그러나, 본 발명의 SSB의 사용은 무손상 분자의 단리를 허용하는 DNA 구조를 안정화시킨다.
각각의 경우에, 상기 기재된 방법 또는 용도는 500mM의 나트륨 이온의 존재 하에 최대 ssDNA 결합 능력의 적어도 50%를 나타내는 SSB를 이용하며; 이러한 특성은 SSB가 고염 농도를 견디고 고염 농도에서 활성이며, 즉 호염성으로 고려될 수 있다는 것을 의미한다.
상기 기재된 바와 같은 핵산 서열분석, 증폭, 돌연변이유발, 검사, 소화 및 역전사 방법은 관련 기술분야에 널리 알려져 있고, 표준 조건 및 시약이 이용될 수 있다.
상기 정의된 본 발명의 많은 방법은 DNA 폴리머라제를 사용하는 뉴클레오티드 중합을 수반한다. 전형적으로 상기 방법은 DNA 폴리머라제, 주형 핵산 분자, 500mM의 나트륨 이온의 존재 하에 최대 ssDNA 결합 능력의 적어도 50%를 나타내는 SSB, 주형 핵산 분자의 일부를 어닐링할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 뉴클레오티드(예를 들어 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트, dNTPS)의 하나 이상의 종을 포함하는 반응 혼합물을 제공하는 단계, 및 올리고뉴클레오티드가 프라이머 주형 핵산 분자를 어닐링하고, 상기 DNA 폴리머라제가 하나 이상의 뉴클레오티드를 중합함으로써 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머를 연장시키는 조건 하에 상기 반응 혼합물을 배양하는 단계를 포함한다. 적합한 조건은 관련 기술분야에 널리 알려져 있다. 임의로, 폴리뉴클레오티드 생성물의 생성이 검출된다(예를 들어 겔 전기영동을 통함).
500mM의 나트륨 이온의 존재 하에 최대 ssDNA 결합 능력의 적어도 50%를 나타내는 단일-가닥 DNA 결합 단백질(SSB)은 본 발명의 SSB로서 본원에 지칭될 수 있다. 이는 표준 상업적으로 입수가능한 SSB, 예를 들어 이. 콜라이 SSB가 사용될 수 있는 통상적인 방법에서 사용될 수 있지만, 유리하게는 고염 농도를 이용하는 방법에서 사용된다.
상기 방법 및 용도(예를 들어 증폭, 서열분석 및 부위 지정 돌연변이유발)은 전형적으로 하기 중 하나 이상을 함유하는 반응 혼합물, 샘플 용액 또는 세척 완충제를 이용할 것이다:
(i) 적어도 350mM의 나트륨 이온,
(ii) 적어도 50mM의 칼륨 이온,
(iii) 적어도 150mM의 마그네슘 이온, 또는
(iv) 적어도 200mM의 칼슘 이온.
추가 측면에서, 본 발명은 DNA 분자를 탈혼성화하기 위한, 500mM의 나트륨 이온의 존재 하에 최대 ssDNA 결합 능력의 적어도 50%를 나타내는 단일-가닥 DNA 결합 단백질(SSB)의 용도를 제공하며, 여기서 DNA 분자는 하기 중 하나 이상을 함유하는 용액 내에 존재하거나 또는 그에 노출된다:
(i) 적어도 350mM의 나트륨 이온,
(ii) 적어도 50mM의 칼륨 이온,
(iii) 적어도 150mM의 마그네슘 이온, 또는
(iv) 적어도 200mM의 칼슘 이온.
본 발명의 SSB는 부분적으로 혼성화된 ssDNA 분자를 탈혼성화할 수 있으며, 예를 들어 상기 SSB의 부재 하에 ssDNA 분자는 적어도 2, 4 또는 6개 쌍형성된 뉴클레오티드(즉 1, 2 또는 3개 또는 그 초과의 수소 결합된 쌍)의 하나 이상의 듀플렉스 영역을 가질 수 있다. 본 발명의 SSB의 존재 하에, DNA 분자는 듀플렉스 영역(들)이 없을 수 있으며, 즉 본질적으로 2차 구조가 없다.
"부분적으로 혼성화된" ssDNA 분자는 적어도 5%, 10%, 20%, 30% 또는 40% 혼성화될 수 있으며, 즉 적어도 5%, 10%, 20% 등의 그의 뉴클레오티드는 듀플렉스의 부분이다. 전형적으로, 60% 이하, 예를 들어 50% 이하 또는 40%의 뉴클레오티드가 듀플렉스의 부분이다. 이 맥락에서, "듀플렉스" 및 "혼성화"는 수소 결합을 통해 듀플렉스 영역을 형성하는 단일 가닥 내의 내부 영역을 지칭한다.
표적 ssDNA 분자는 전형적으로 20 내지 5000개 뉴클레오티드 길이, 전형적으로 20 내지 3000개, 예를 들어 30 내지 1500개 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
다른 실시양태에서, 탈혼성화될 DNA는 dsDNA 분자이다. 이러한 실시양태에서, 일부 또는 대안적으로 모든 DNA 듀플렉스는 탈혼성화될 수 있다. 예를 들어 PCR에서, SSB는 새롭게 분리된 가닥에 결합하고 새로운 상보성 뉴클레오티드의 포함을 가능하게 하는 듀플렉스의 상당히 작은 부분의 탈혼성화에 수반된다.
서열분석 방법, 예를 들어 나노포어 서열분석에서, dsDNA 표적 분자는, 예를 들어 최대 200 킬로베이스(kb), 또는 심지어 300kb로 매우 클 수 있다. 전형적으로 최대 50kb 또는 100kb, 예를 들어 50 베이스 내지 300kb, 보다 통상적으로 100 베이스 내지 200kb. (예를 들어 나노포어) 서열분석을 위한 기질은 RNA/cDNA 하이브리드일 수 있다.
상이한 염 농도에서 ssDNA에 결합하는 능력을 분석하는 적합한 방법은 본원의 실시예 및 도면에 제시된다. 이러한 방법은 주어진 SSB 분자가 500mM의 나트륨 이온의 존재 하에 최대 ssDNA 결합 능력의 적어도 50%를 나타내는지 여부를 달성하는데 사용될 수 있다. 적합한 방법은 형광 염료 및 켄처(quencher) 모이어티를 갖는 ssDNA로 만들어진 분자 비콘(분자 비콘)을 이용하며; 형광은 SSB 결합 정도 및 이것이 분자 비콘의 영역 내에서 혼성화에 대해 미치는 영향에 의존하고, 따라서 염료 및 켄처의 서로에 대한 근접성에 영향을 미친다.
대안적으로, 또는 게다가, 본 발명 (및 본 발명의 방법 및 용도에 이용된) SSB는 250mM의 칼륨 이온의 존재 하에, 및/또는 150mM의 마그네슘 이온의 존재 하에, 및/또는 200 mM의 칼슘 이온의 존재 하에 최대 ssDNA 결합 능력의 적어도 40%, 바람직하게는 적어도 50% 또는 60%를 나타낸다.
바람직하게는 본 발명의 SSB는 500mM의 나트륨 이온의 존재 하에 최대 ssDNA 결합 능력의 적어도 60%, 보다 바람직하게는 적어도 70%를 나타낸다.
추가 측면에서, 본 발명은 상보성 ssDNA의 혼성화를 방지하기 위한, 500mM의 나트륨 이온의 존재 하에 최대 ssDNA 결합 능력의 적어도 50%를 나타내는 단일-가닥 DNA 결합 단백질(SSB)의 용도를 제공하며, 여기서 ssDNA는 하기 중 하나 이상을 함유하는 용액 내에 존재하거나 또는 그에 노출된다:
(i) 적어도 350mM의 나트륨 이온,
(ii) 적어도 50mM의 칼륨 이온,
(iii) 적어도 150mM의 마그네슘 이온, 또는
(iv) 적어도 200mM의 칼슘 이온.
추가 측면에서, 본 발명은 하기 중 하나 이상을 함유하는 용액 내에 존재하거나 또는 그에 노출된 DNA 분자를, 500mM의 나트륨 이온의 존재 하에 최대 ssDNA 결합 능력의 적어도 50%를 나타내는 단일-가닥 DNA 결합 단백질(SSB)과 접촉시키는 단계를 포함하는, DNA 분자를 탈혼성화하는 방법을 제공하며:
(i) 적어도 350mM의 나트륨 이온,
(ii) 적어도 50mM의 칼륨 이온,
(iii) 적어도 150mM의 마그네슘 이온, 또는
(iv) 적어도 200mM의 칼슘 이온,
여기서 SSB는 서열번호(SEQ ID NO:) 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 1과 적어도 75% 동일한 아미노산 서열, 또는 그의 기능적 단편을 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 하기 중 하나 이상을 함유하는 용액 내에 존재하거나 또는 그에 노출된 ssDNA를, 500mM의 나트륨 이온의 존재 하에 최대 ssDNA 결합 능력의 적어도 50%를 나타내는 단일-가닥 DNA 결합 단백질(SSB)과 접촉시키는 단계를 포함하는, 상보성 ssDNA의 혼성화를 방지하는 방법을 제공하며:
(i) 적어도 350mM의 나트륨 이온,
(ii) 적어도 50mM의 칼륨 이온,
(iii) 적어도 150mM의 마그네슘 이온, 또는
(iv) 적어도 200mM의 칼슘 이온,
여기서 SSB는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 1과 적어도 75% 동일한 아미노산 서열, 또는 그의 기능적 단편을 포함한다.
"상보성 ssDNA"는 ssDNA의 단일 가닥 내의 상보성의 내부 영역, 뿐만 아니라 상보성의 영역 또는 영역들을 갖는 2개의 개별 ssDNA 분자를 포함한다. 상보성의 영역 또는 영역들은 2개의 ssDNA 분자가 표준 dsDNA 듀플렉스를 자연적으로 형성할 수 있도록 분자의 전체 또는 실질적으로 모든 길이를 따라 연장시킬 수 있다. 혼성화의 방지는 부분적이거나 또는 완전할 수 있으며, 부분적 혼성화는 예를 들어 증폭 반응에서 발생하며, 원래 듀플렉스의 풀어짐 및 새로운 상보성 가닥의 생성이 진행되므로 단지 혼성화로부터 방지될 듀플렉스의 작은 영역에 대한 필요가 있다.
일부 실시양태에서, 상기 정의된 방법 및 용도에 이용된 반응 혼합물, 용액 또는 세척 완충제는 적어도 500mM, 적어도 750mM 또는 적어도 1000mM의 나트륨 이온을 함유할 것이다.
일부 실시양태에서, 상기 정의된 방법 및 용도에 이용된 반응 혼합물, 용액 또는 세척 완충제는 적어도 100mM, 적어도 300mM, 적어도 600mM 또는 적어도 1000mM의 칼륨 이온을 함유할 것이다.
일부 실시양태에서, 상기 정의된 방법 및 용도에 이용된 반응 혼합물, 용액 또는 세척 완충제는 적어도 200mM 또는 적어도 250mM의 마그네슘 이온을 함유할 것이다.
일부 실시양태에서, 상기 정의된 방법 및 용도에 이용된 반응 혼합물, 용액 또는 세척 완충제는 적어도 150mM, 200mM 또는 300mM의 칼슘 이온을 함유할 것이다.
상기 농도는 모두 본원의 맥락에서 고염 농도로 간주된다.
일부 실시양태에서, 상기 정의된 방법 및 용도에 이용된 반응 혼합물, 용액 또는 세척 완충제는 유기 염, 예를 들어 아세테이트 또는 글루타메이트 뿐만 아니라 하나 이상의 무기 염을 함유할 것이다. 일부 실시양태에서, 상기 정의된 방법 및 용도에 이용된 반응 혼합물, 용액 또는 세척 완충제는 상기 논의된 수준에서 나트륨 및 칼륨 이온을, 바람직하게는 또한 상기 논의된 수준에서 마그네슘 또는 칼슘 이온을 함께 함유할 것이다. 세척 완충제는 유리하게는 예를 들어 단백질 정제 프로토콜에서 단백질 복합체를 파괴하거나, 또는 DNA-결합 단백질을 DNA 샘플로부터 제거하기 위한 고농도의 하나 초과의 염을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 정의된 방법 및 용도에 이용된 반응 혼합물, 용액 또는 세척 완충제는 카오트로픽 염을 함유한다.
본 발명자들은 SSB를 박테리아 살리니박터 루베르(Salinibacter ruber)로부터 확인하고 특징화하였으며(International Journal of Systemic and Evolutionary Microbiology [2002] 52, 485-491), 이러한 단백질 및 그의 유도체, 단편, 변이체 및 상동체는 본 발명에 따라 특히 바람직하다.
야생형 에스. 루베르 SSB 서열은 하기와 같다:
따라서, 본 발명에 따른 바람직한 SSB 분자(즉 500mM의 나트륨 이온의 존재 하에 최대 ssDNA 결합 능력의 적어도 50%를 나타냄)는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 1과 적어도 75% 동일한 아미노산 서열, 또는 그의 기능적 단편을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 SSB는 서열번호 1, 또는 그의 단편과 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95%, 예를 들어 적어도 98% 또는 99% 또는 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
일부 실시양태에서, SSB는 서열번호 1과 비교하여 단일 또는 다중 아미노산 변경(부가, 치환, 삽입 또는 결실)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 서열은 바람직하게는 최대 20개, 예를 들어 최대 10 또는 5개, 바람직하게는 1, 2 또는 3개, 보다 바람직하게는 1 또는 2개 변경된 아미노산을 함유할 수 있다. 치환은 보존적 또는 비-보존적 아미노산을 가질 수 있다. 바람직하게는 상기 변경은 보존적 아미노산 치환이다.
바람직하게는, SSB는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 그의 기능적 단편을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, SSB는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 그의 기능적 단편으로 이루어진다. 가장 바람직한 실시양태에서, SSB는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진다.
SSB의 기능적 단편은 "단일-가닥 DNA 결합 단백질" 및 "SSB" 및 "본 발명의 SSB"라는 용어에 의해 제공되고 포괄된다. 기능적 단편은 본원에 정의된 상승된 염 농도에서 ssDNA에 결합할 수 있는 단편이다. 따라서 이들은 500mM의 나트륨 이온의 존재 하에 최대 ssDNA 결합 능력의 적어도 50%를 나타낸다. 활성 단편은 전형적으로 팔량체 형성의 원인이 되는 75개 아미노산 C-말단 영역의 (예를 들어 모든 또는 실질적으로 모든) 기능적 부분을 함유할 것이며, 보다 바람직하게는 활성 단편은 100개 아미노산 C-말단 영역, 보다 바람직하게는 111개 아미노산 C-말단 영역의 기능적 부분 (예를 들어 모든 또는 실질적으로 모든)을 함유한다. 본원의 어디에서든 사용된 바와 같이, 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 영역과 관련하여 "실질적으로"라는 용어는 고려된 영역의 길이의 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 99%를 의미한다. "실질적으로 없는"이란 용어는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 99%가 없다는 것을 의미한다.
기능적 단편은 적어도 140개 아미노산 길이일 수 있다. 바람직한 단편은 적어도 150개, 적어도 160개, 적어도 170개 또는 적어도 175개 아미노산 길이이다. 단편은 서열번호 1의 상응하는 부분과 적어도 75 또는 80%, 바람직하게는 적어도 85% 또는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%(예를 들어 적어도 98% 또는 99% 또는 99.5%), 또는 100% 동일하다.
따라서 본 발명에 따른 기능적 단편은 500mM의 나트륨 이온의 존재 하에 최대 ssDNA 결합 능력의 적어도 50%를 나타낸다.
본 발명에 따른 모든 SSB(기능적 단편 포함)는 ssDNA에 대해 고친화도를 가지며, 특히, 이들은 10mM의 NaCl을 함유하는 완충제에서 150개 뉴클레오티드 ssDNA 분자에 대한 결합의 몰 농도(M)로서 측정된, 10x10-8 M 이하, 바람직하게는 5x10-8M 이하, 및 일부 매우 바람직한 실시양태에서 3x10-8M 미만의 해리 상수(KD)를 가질 수 있다. 실시예는 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 KD를 결정하는 적합한 방법을 기재한다. 이들 값은, 본원의 어디에서든 논의된 바와 같은, 저염 농도에서 성능을 나타내며, 본 발명의 SSB의 고유한 이점은 고염 농도에서 인식된다.
본 발명자들은 중간 내지 높은 농도를 포함한 광범위한 염 농도에서, 에스. 루베르로부터의 SSB가 ssDNA(이는 이중 가닥 영역 또는 영역들을 갖는 분자의 부분일 수 있거나 아닐 수 있음)에 결합하는 그의 능력을 유지한다는 것을 밝혀냈다. 결과적으로 고염 농도에서 ssDNA의 혼성화를 방지하고 DNA(이는 완전히 또는 부분적으로 혼성화될 수 있고 2차 구조의 영역을 갖는 ssDNA 분자일 수 있거나 또는 dsDNA 분자 예를 들어 자연 발생 듀플렉스일 수 있음)를 탈혼성화하는 그의 능력을 유지한다. (예를 들어 표준 dsDNA 복제 동안 발생하는 바와 같은) 안정한 이중 헬릭스를 형성하는 2개의 상보성 가닥의 분리는 탈혼성화를 달성하기 위해 헬리카제 뿐만 아니라 SSB를 필요로 한다. 다른 한편으로, SSB 단독은 2차 구조가 없는 일부 듀플렉스 영역을 갖는 ssDNA 분자를 제공할 수 있다.
서열번호 1의 SSB에 대한 대안으로서, 살리노박터 이라니쿠스(Salinobacter iranicus) 또는 에스. 루투에우스(S. lutueus)로부터의 SSB(International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology [2012] 62, 1521-1527) 또는 그의 유도체, 단편 또는 변이체가 이용될 수 있다. 이들 분자의 유도체 및 변이체는 에스. 루베르에 관해 본원에 논의된 바와 동일한 야생형 서열과 서열 동일성 관계(% 동일성)를 갖는 것들을 포함한다.
용액에서 단일-가닥 DNA 2차 구조 형성은 주로 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기 쌍형성 및 염기 스태킹(stacking)에 기인한다. 이러한 구조의 안정성 및 ssDNA의 전반적인 강성은 고염 농도 용액에서 크게 증가한다. 염 이온은 포스페이트 백본에 결합하여, 정전기력에 의해 주로 구동된 ssDNA-리간드 상호작용을 방해한다. 따라서, 고염 환경에서, ssDNA의 생물물리학적 특성의 변화는 세포 유지 시스템의 오작동을 야기할 수 있다. 이. 콜라이 SSB의 경우에, 고염 농도는 SSB 기능을 방지하거나, 또는 ssDNA-SSB 핵단백질 복합체가 이미 형성된 경우에, ssDNA 단백질 복합체의 과응축을 야기한다. NaCl의 20 mM 이하의 염 농도에서, 이. 콜라이 SSB는 높은-협동성 모드로 ssDNA에 결합하여, 신장된 필라멘트형 핵단백질 복합체를 형성하고, NaCl의 20 내지 200 mM의 염 농도에서, 이. 콜라이 SSB 사량체는 사량체가 제한된 협동성으로 결합하는 "스트링 상의 비드(beads-on-string)" 구조를 생성하며, 따라서 심지어 이들 염 농도에서 및 ssDNA의 존재 하에. 올리고머성/중합체성 4차 구조가 이. 콜라이 SSB와 함께 관찰되지 않는 것으로 알려져 있다.
실시예에 제시된 바와 같이, 본 발명의 SSB는 ssDNA의 부재 하에 고염 조건 하에 팔량체성 4차 구조를 형성하고(도 3), ssDNA에 결합될 때 고염 조건 하에 중합체성 4차 구조를 형성한다(도 2a, 도 4).
본원에 기재된 염 조건 하에, 본 발명의 SSB는 바람직하게는 ssDNA의 부재 하에 우세하게는 적어도 팔량체성 4차 구조를 갖는다. 바람직하게는, 본 발명의 SSB는 최대 2M의 NaCl 농도에서 ssDNA의 부재 하에 우세하게는 팔량체성 4차 구조를 갖는다. 본원에 기재된 염 조건 하에, 본 발명의 SSB는 바람직하게는 ssDNA의 존재 하에 우세하게는 중합체성 4차 구조를 갖는다. 본원에 사용된 바와 같은, "우세하게는"은 샘플 내 SSB 단백질의 50% 초과가 나타낸 올리고머성/중합체성 상태를 갖는다는 것을 의미한다.
단량체로서 발현된 단백질이 동일한 단백질의 다중 카피와 회합하여 중합체를 형성하는 것을 나타내는데 사용된, "중합체성 4차 구조"는 관련 기술분야에 널리 알려진 용어이다.
단백질의 4차 구조, 즉 올리고머성 상태를 결정하는 방법은 관련 기술분야에 널리 알려져 있고, 임의의 이러한 방법을 사용하여 SSB의 4차 구조, 즉 올리고머성 상태를 결정할 수 있다. 예를 들어, 실시예에 입증된 바와 같이, 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 단백질의 평군 올리고머 질량을 결정할 수 있으며, 그에 의해 해당 단백질의 4차 구조를 나타낸다. 알려진 분자량을 갖는 표준 단백질 예를 들어 페리틴(440 kDa), 알돌라제(158 kDa), 콘칼부민(75 kDa) 및 오브알부민(43 kDa)을 사용하는 보정은 관련 기술분야에 널리 알려져 있다.
SSB 단량체 크기의 10배 초과의 평균 올리고머 질량은 우세하게는 중합체성 4차 구조를 나타낸다. SSB 단량체 크기의 6배 초과의 평균 올리고머 질량은 우세하게는 팔량체성 4차 구조를 나타낸다.
바람직하게는, 본 발명의 SSB는, 표준 단백질 페리틴(440 kDa), 알돌라제(158 kDa), 콘칼부민(75 kDa) 및 오브알부민(43 kDa)을 참조하여, 25 mM Tris, pH 7.5 및 언급된 NaCl 농도를 함유하는 완충제에서 Superdex 200 칼럼 상에서 수행된 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 결정 시, 0.15 M NaCl에서 SSB 단량체 크기의 적어도 10배, 및/또는 SSB 단량체 크기의 적어도 6배, 보다 바람직하게는 2 M NaCl에서 SSB 단량체 크기의 적어도 7배의 평균 올리고머 질량을 나타낸다.
본 발명자들은 놀랍게도 야생형 에스. 루베르 SSB의 돌연변이가 단일 가닥 핵산에 대한 그의 결합 친화도를 유의하게 증가시킨다는 것을 밝혀냈다. 따라서 본 발명에 따른 바람직한 SSB 분자는 위치 17 또는 71에서, 또는 가장 바람직하게는 둘 다에서 치환을 포함한다. 위치 71에서 치환이 특히 바람직하다.
추가 측면에서, 본 발명은 500mM의 나트륨 이온의 존재 하에 최대 ssDNA 결합 능력의 적어도 50%를 나타내고, 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 1과 적어도 75% 동일한 아미노산 서열, 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 단일-가닥 DNA 결합 단백질(SSB)을 제공하며, 여기서 위치 17 또는 71에서 아미노산은 치환되어 있다.
야생형 에스. 루베르 SSB에서, 위치 17 및 71은 아스파르트산이 차지한다. 대체 아미노산은 바람직하게는 음전하가 결여되어 있고, 바람직하게는 pH 7.0에서 (그의 측쇄 상에) 양전하를 전달한다. 적합한 대체 아미노산은 리신, 히스티딘, 아르기닌, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함하고, 리신 및 아르기닌이 바람직하고, 리신이 특히 바람직하다.
위치 17 및 71이 서열번호 1의 전장 야생형 서열을 참조하여 정의된 것으로 이해될 것이다. 본 발명의 일부 SSB 분자에서, 상이한 출발 서열의 아미노산 부가 또는 결실 또는 선택을 통해, "위치 17 및 71"은 표준 서열 정렬이 수행될 때 동등한 위치로서 이해될 것이며, 즉 치환된 잔기는 해당 분자에서 17번째 또는 71번째 잔기가 아닐 수 있다.
이들 SSB(위치 17 및/또는 71에서 치환 또는 그의 등가물을 가짐)는 돌연변이된 SSB로서 본원에서 지칭되고, 상기 정의된 본 발명의 방법 및 용도에서 사용하기에 바람직한 SSB이다. 상기 기재된 본 발명의 SSB의 바람직한 특징은 또한 이들 돌연변이된 SSB에 의해 나타낸다. 예를 들어, 돌연변이된 SSB는 바람직하게는 250mM의 칼륨 이온, 및/또는 150mM의 마그네슘 이온의 존재 하에 최대 ssDNA 결합 능력의 적어도 40%를 나타낸다. 바람직하게는, 돌연변이된 SSB는 500mM의 나트륨 이온의 존재 하에 최대 ssDNA 결합 능력의 적어도 60% 또는 보다 바람직하게는 적어도 70%를 나타낸다. 바람직하게는, 돌연변이된 SSB는 카오트로픽 염, 특히 본원에 정의된 바와 같은, 고농도에서 양이온을 포함하는 카오트로픽 염의 존재 하에 최대 ssDNA 결합 능력의 적어도 60% 또는 보다 바람직하게는 적어도 70%를 나타낸다.
바람직한 실시양태에서, 돌연변이된 SSB는 서열번호 1과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95%, 예를 들어 적어도 98% 또는 99% 동일하지만, 위치 17 및/또는 71에서 치환을 갖는 아미노산 서열, 또는 상기 치환(들)을 포함하는 그의 기능적 단편을 포함한다.
일부 실시양태, 뿐만 아니라 위치 17 또는 71에서 돌연변이에서, 돌연변이된 SSB는 서열번호 1과 비교하여 단일 또는 다중 아미노산 변경(부가, 치환, 삽입 또는 결실)을 갖는다. 이러한 서열은 바람직하게는 최대 20개, 예를 들어 최대 10 또는 5개, 바람직하게는 1, 2 또는 3개, 보다 바람직하게는 1 또는 2개의 변경된 아미노산을 함유할 수 있다. 치환은 보존적 또는 비-보존적 아미노산을 가질 수 있다. 바람직하게는 상기 변경은 보존적 아미노산 치환이다.
바람직하게는 위치 17 및 71에서 아미노산은 서열번호 1과 비교하여 치환된다.
특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 돌연변이된 SSB는 서열번호 1의 아미노산을 포함하거나 또는 그로 이루어지지만, 위치 17 또는 71, 바람직하게는 둘 다에서 아미노산은 하기 제시된 바와 같은 리신이다:
본 발명의 돌연변이된 SSB(그의 단편 포함)를 코딩하는 핵산 분자, 또는 그와 실질적으로 상동인 핵산 분자는, 본 발명의 추가 측면을 형성한다. 바람직한 핵산 분자는 서열번호 1의 SSB를 코딩하는 핵산이지만, 위치 17 또는 71에서 아미노산은 리신, 아르기닌, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민으로부터 선택된 아미노산으로 대체된 바 있다. 특히 바람직한 핵산은 서열번호 2의 SSB를 코딩하는 것, 예를 들어 서열번호 5에 서술된 핵산 분자이다. 서열번호 5의 퇴화 버전은 서열번호 2를 코딩할 것이다.
본 발명의 핵산 분자 및 단백질은 바람직하게는 "단리되거나" 또는 "정제된다".
서열 동일성은 임의의 편리한 방법에 의해 평가될 수 있다. 그러나, 서열 사이의 상동 동일성 정도를 결정하기 위해, 서열의 다중 정렬을 만드는 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 Clustal W(Thompson, Higgins, Gibson, Nucleic Acids Res., 22:4673-4680, 1994)가 유용하다. 바람직한 경우에, Clustal W 알고리즘은 BLOSUM 62 점수 행렬(Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915-10919, 1992) 및 갭 개방 페널티 10 및 갭 연장 페널티 0.1과 함께 사용될 수 있으며, 최대 순서 일치가 2개 서열 사이에 수득되도록 하며, 여기서 서열들 중 1개의 총 길이의 적어도 50%는 정렬에 수반된다. 서열을 정렬하는데 사용될 수 있는 다른 방법은 Smith 및 Waterman(Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482, 1981)에 의해 개정된 Needleman 및 Wunsch(Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443, 1970)의 정렬 방법이며, 최대 순서 일치가 2개 서열 사이에 수득되고 동일한 아미노산의 수가 2개 서열 사이에 결정되도록 한다. 2개 아미노산 서열 사이의 백분율 동일성을 계산하는 다른 방법은 일반적으로 관련 기술분야에서 인식되고, 예를 들어, 문헌(Carillo and Lipton, SIAM J. Applied Math., 48:1073, 1988)에 의해 기재된 것들 및 문헌(Computational Molecular Biology, Lesk, e.d. Oxford University Press, New York, 1988, Biocomputing: Informatics and Genomics Projects)에 기재된 것들을 포함한다.
일반적으로, 컴퓨터 프로그램은 이러한 계산을 위해 이용될 것이다. 서열의 쌍을 비교하고 정렬하는 프로그램, 예컨대 ALIGN(Myers and Miller, CABIOS, 4:11-17, 1988), FASTA(Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444-2448, 1988; Pearson, Methods in Enzymology, 183:63-98, 1990) 및 갭형 BLAST(Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997), BLASTP, BLASTN, 또는 GCG(Devereux, Haeberli, Smithies, Nucleic Acids Res., 12:387, 1984)가 또한 이 목적에 유용하다. 더욱이, 유럽 생물정보학 협회의 달리 서버(Dali server)는 단백질 서열의 구조-기반 정렬을 제공한다(Holm, Trends in Biochemical Sciences, 20:478-480, 1995; Holm, J. Mol. Biol., 233:123-38, 1993; Holm, Nucleic Acid Res., 26:316-9, 1998).
참조점을 제공함으로써, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 본 발명에 따른 서열은 디폴트 파라미터를 갖는 ALIGN 프로그램(예를 들어 프랑스 몽펠리에 소재의 IGH의 GENESTREAM 네트워크 서버에서 인터넷 상에서 이용가능함)을 사용하여 결정될 수 있다.
본원에 사용된 "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄 예를 들어 양으로 하전된, 소수성 등을 갖는 또 다른 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 관련 기술분야에 정의된 바 있다.
본 발명의 SSB는 유전적으로 코딩된 아미노산을 포함하지만, 또한 하나 이상의 비-유전적으로 코딩된 아미노산, 또는 변형된 아미노산, 또는 N 또는 C 말단 변형을 함유할 수 있다.
핵산 분자 또는 서열 및 단백질 또는 폴리펩티드,예를 들어, SSB와 관련하여 본원에 사용된 "단리된" 또는 "정제된"이란 용어는 자연 환경으로부터 단리되거나, 그로부터 정제되거나, 또는 그가 실질적으로 없는 경우에, 예를 들어, 생성을 위해 사용된 유기체(실제로 이들이 자연적으로 발생한 경우에) 또는 숙주 세포로부터 단리된 또는 그로부터 정제된 이러한 분자를 지칭하거나, 또는 기계적 프로세스에 의해 생성되는 경우에 이러한 분자를 지칭하며, 즉 재조합 및 합성적으로 생성된 분자를 포함한다.
따라서, SSB와 같은 단백질 또는 폴리펩티드 분자와 함께 사용되는 경우에, "단리된" 또는 "정제된"이란 용어는 공급원으로부터 유래되는 세포 물질 또는 다른 단백질이 실질적으로 없는 단백질을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이러한 단리된 또는 정제된 단백질은 재조합 기술에 의해 생성되는 경우에 세포 배지가 실질적으로 없거나, 또는 화학적으로 합성되는 경우에 화학 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없다.
추가 측면에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 분자 및 본 발명의 핵산 분자에 의해 코딩된 단백질 서열의 전사 및 번역을 위한 필수 조절 서열을 함유하는 발현 벡터(바람직하게는 재조합 발현 벡터)를 제공한다.
가능한 발현 벡터는 벡터가 사용된 숙주 세포와 상용성인 한, 코스미드 또는 플라스미드를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 발현 벡터는 숙주 세포의 형질전환에 적합하며, 이는 발현 벡터가 본 발명의 핵산 분자 및 상기 핵산 분자에 작동적으로 연결된, 발현을 위해 사용될 숙주 세포에 기초하여 선택된 조절 서열을 함유한다는 것을 의미한다. 작동적으로 연결된은 핵산이 핵산의 발현을 허용하는 방식으로 조절 서열에 연결된다는 것을 의미하는 것으로 의도된다.
적합한 조절 서열은 박테리아, 진균, 바이러스, 포유동물, 또는 곤충 유전자를 포함한 다양한 공급원으로부터 유래될 수 있고, 관련 기술분야에 널리 알려져 있다. 적절한 조절 서열의 선택은 하기 논의된 바와 같은 선택된 숙주 세포에 대해 의존하고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 수반될 수 있다. 이러한 조절 서열의 예는, 전사 프로모터 및 인헨서 또는 RNA 폴리머라제 결합 서열, 전사 개시 신호를 포함한 리보솜 결합 서열을 포함한다. 추가적으로, 선택된 숙주 세포 및 이용된 벡터에 따라, 다른 서열, 예컨대 복제의 기원, 추가의 DNA 제한 부위, 인헨서, 및 전사의 유도성을 부여하는 서열이 발현 벡터 내에 포함될 수 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 또한 본 발명의 재조합 분자로 형질전환된 또는 형질감염된 숙주 세포의 선택을 용이하게 하는 선택가능한 마커 유전자를 함유할 수 있다.
재조합 발현 벡터는 또한 재조합 단백질의 증가된 발현; 재조합 단백질의 증가된 용해도를 제공하는 융합 모이어티를 코딩하고; 친화도 정제에서 리간드로서 작용함으로써 표적 재조합 단백질의 정제를 보조하는 유전자를 함유할 수 있다(예를 들어 정제 및/또는 확인을 가능하게 하는 적절한 "태그", 예를 들어, His 태그 또는 myc 태그가 존재할 수 있음).
재조합 발현 벡터는 숙주 세포 내로 도입되어 형질전환된 숙주 세포를 생성할 수 있다. "로 형질전환된", "로 형질감염된", "형질전환" 및 "형질감염"이란 용어는 관련 기술분야에 알려진 가능한 많은 기술 중 하나에 의해 세포 내로 핵산(예를 들어, 벡터)의 도입을 포함하는 것으로 의도된다. 숙주 세포를 형질전환하고 형질감염시키는 적합한 방법은 문헌(Sambrook et al., 1989(Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)) 및 다른 실험실 교재에서 찾을 수 있다.
적합한 숙주 세포는 매우 다양한 원핵 숙주 세포 및 진핵 세포를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 단백질은 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)와 같은 박테리아 숙주 세포에서 발현될 수 있다.
단백질 또는 펩티드와 같은 다른 분자에 접합된 본 발명의 SSB를 포함하는 N-말단 또는 C-말단 융합 단백질(예를 들어 에피토프 태그 또는 정제 태그)은 재조합 기술을 통해 융합함으로써 제조될 수 있다.
본 발명의 SSB는 또한 다른 모이어티, 예를 들어 형광 모이어티를 포함하는 것들과 같은 리포터 모이어티에 접합될 수 있다. 융합 단백질은 핵산 폴리머라제에 융합된 본 발명의 SSB를 포함할 수 있으며, 상기 폴리머라제는 내열성 및/또는 내염성일 수 있다.
추가 측면은 본 발명의 하나 이상의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포 또는 바이러스를 제공한다. 또한 본 발명의 핵산 분자 중 하나 이상을 포함하는 숙주 세포 또는 바이러스가 제공된다. 본 발명의 SSB를 발현할 수 있는 숙주 세포 또는 바이러스가 추가 측면을 형성한다.
적절한 경우에, 본 발명의 SSB는 천연 공급원으로부터 단리될 수 있으며, 예를 들어 살리노박터(Salinobacter)의 추출물로부터 단리되거나, 또는 숙주 세포에서 재조합적으로 생성되고 그로부터 단리되고 정제될 수 있다. 특정 실시양태에서, SSB는 SSB가 자연적으로 발견된 것과 동일한 유기체가 아니거나, 또는 그로부터 유래되지 않은 숙주 세포, 즉 이종 숙주 세포에서 재조합 기술에 의해 생성된다.
본 발명자들은 야생형 에스. 루베르 SSB 유전자의 코돈 최적화된 버전을 제조하였고, 본원에서 서열번호 4로 지정된다. 서열번호 4의 핵산 서열 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 핵산 분자는 본 발명의 추가 측면을 구성한다. 기능적 단편은 상기 정의된 바와 같은 SSB의 기능적 단편을 코딩하는 것들이다. 서열번호 5의 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자는 코돈 최적화되고, 위치 17 및 71에서 리신에 대한 코돈을 포함하며, 본 발명의 바람직한 실시양태이다.
본 발명의 SSB는 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 대안적으로, 무세포 발현 시스템은 SSB의 생성을 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 SSB는 단계별 신장에 의해 화학적 합성을 사용하여 한번에 1개 아미노산을 생성할 수 있다. 이러한 화학적 합성 기술(예를 들어 고체 상 합성)은 단백질 화학에서 널리 알려져 있다.
본 발명의 추가 측면은 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 본 발명의 SSB(돌연변이된 SSB 포함)를 생성하는 방법을 제공한다. 바람직한 방법은 (i) 본 발명의 재조합 발현 벡터 중 하나 이상 또는 핵산 분자 중 하나 이상을 포함하는 숙주 세포를, 코딩된 SSB의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 단계; 및 임의로 (ii) 상기 SSB를 숙주 세포로부터 또는 성장 배지/상청액으로부터 단리 또는 수득하는 단계를 포함한다. 이러한 생성 방법은 또한 SSB의 정제 단계 및/또는 SSB를 적절한 완충제 또는 담체와 같은 적어도 하나의 추가의 구성성분을 포함하는 조성물 또는 생성물로 제제화하는 단계를 포함할 수 있다.
SSB는 관련 기술분야에 알려지고 문헌에 광범위하게 기재된 단백질에 대한 임의의 정제 기술 또는 그의 임의의 조합을 사용하여 숙주 세포/배양 배지 또는 천연 공급원으로부터 분리되거나, 또는 단리될 수 있다. 이러한 기술은, 예를 들어, 침전, 한외여과, 투석, 다양한 크로마토그래피 기술, 예를 들어 겔 여과, 이온-교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 전기영동, 원심분리 등을 포함할 수 있다. 상기 논의된 바와 같은, 본 발명의 SSB는 단리, 가용화 및/또는 정제 또는 확인 시 도움이 되는 아미노산 모티프, 또는 다른 단백질 또는 비-단백질 태그, 예를 들어 폴리히스티딘 태그를 전달하도록 변형될 수 있다.
상기 논의된 바와 같은, 본 발명의 일 측면은 핵산 서열분석 방법이다. 바람직한 실시양태에서, 이들 방법은 차세대 서열분석 방법이다. 소위 "차세대", 또는 "2세대" 또는 "3세대" 서열분석 접근법("1세대" 접근법으로서 생어 디데옥시뉴클레오티드 방법과 관련하여)은 널리 보급되었다. 이들 새로운 기술은, 예를 들어 병렬의 사용, 예를 들어 대량 병렬 서열분석 반응의 결과로서, 또는 덜 시간-소모적인 단계를 통한 고처리량을 특징으로 한다. 다양한 고처리량 서열분석 방법은 단일 분자 서열분석을 제공하고, 파이로시퀀싱, 가역성 종결인자 서열분석, 라이게이션에 의한 절단성 프로브 서열분석, 라이게이션에 의한 비-절단성 프로브 서열분석, DNA 나노볼, 단일 분자, 실시간 서열분석(SMRT) 및 나노포어 서열분석과 같은 기술을 이용한다.
본 발명의 방법 및 용도에 따라 생성될 수 있는 바와 같은, 염-안정한 핵단백질 복합체는 고염 완충제로의 세척을 견딜 수 있다. 이는 하기 프로세스에 기재된 바와 같은 차세대 서열분석에서 매우 유용하다. 표면-결합된 DNA 올리고뉴클레오티드의 클러스터를 생성하는 고체 상 DNA 증폭 동안, 다수의 세척물이 사용된다. 세척 단계의 목적은 미결합된 주형을 제거하고 표면-부착된 올리고에 대한 비-상보성 주형의 어닐링을 제한하는 것이다. 이러한 세척 용액 대부분은 고농도의 염을 함유한다. 염을 도입하여 SSB 단백질을 활성화시킴으로써, DNA는 세척 사이클 전체에 걸쳐 단일 가닥으로 유지되고, 따라서 많은 DNA-프로세싱 효소의 활성을 감소시키는 2차 구조를 형성할 수 없다. 이는 SSB 단백질의 부가가 DNA 폴리머라제의 충실도 및 진행도를 증가시키는 것으로 제시된 바 있다 (Nucleic Acids Res [2003] 31(22): 6473-6480). 이들 파라미터는 클러스터 생성 프로세스 동안 매우 중요하며, 하기 서열분석 단계가 가능한 한 효율적으로 수행되도록 보장한다.
고염 세척물은 또한 고처리량 서열분석의 2세대 코어 프로세스인 합성에-의한-서열분석(Sequencing-by-Synthesis)에 포함된다. 하기 사이클의 파괴를 방지하기 위해, 과량의 뉴클레오티드 및 다른 구성성분, 예컨대 절단 제거된 합성 억제제, 절단 효소 등이 세척 단계에서 제거된다. 다시, 세척 과정 전반에 걸쳐 단일 가닥 형태의 DNA를 유지할 수 있는 SSB 단백질은 서열분석의 품질을 매우 개선시킬 것이다.
따라서 본 발명의 바람직한 서열분석 방법은 고체 상 DNA 증폭 단계 및/또는 합성에-의한-서열분석 단계를 포함한다.
나노포어 서열분석은 "3세대" 서열분석 방법으로서 알려져 있고, 본 발명의 특히 바람직한 서열분석 방법이다. 나노포어 서열분석은 뉴클레오티드 A, T, C 및 G 각각이 포어를 통과할 때 관찰된 포어를 가로지르는 전류에 대한 상이한 효과를 활용한다(Wang et al.(2015) Frontiers in Genetics, Vol 5, Article 449). 나노포어는 약 1 나노미터 이하(예를 들어 ≤ 2nm)의 내부 직경을 갖는 홀이며, 포어는 유기 또는 무기 물질, 예컨대 투과막 단백질, 실리콘 또는 그라핀으로 형성된다. 전형적으로, dsDNA 분자는 포어를 통해 그의 가닥 중 하나를 통과함으로써 서열화되며, 각각의 뉴클레오티드는 포어를 가로지르는 전류의 판독가능한 변화를 야기한다. SSB는 포어의 상류에 있고 (아직) 서열화되지 않은 가닥 및/또는 포어를 통과하는 가닥에 결합될 때 도움이 될 수 있다.
따라서, 본 발명의 바람직한 실시양태는 나노포어 서열분석의 방법이며, 여기서 샘플 용액은 500mM의 나트륨 이온의 존재 하에 최대 ssDNA 결합 능력의 적어도 50%를 나타내는 단일-가닥 DNA 결합 단백질(SSB)을 함유하며; 바람직하게는 SSB는 에스. 루베르 SSB 또는 그의 유도체, 단편, 변이체 또는 상동체이다. 따라서 SSB는 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 1과 적어도 75% 동일한 아미노산 서열을 갖거나, 또는 상기 정의된 바와 같은 그의 기능적 단편이다.
본 발명의 특히 바람직한 "2세대" 서열분석 방법은, SSB가 신호 강도를 증가시키고/시키거나, 비특이적 신호를 감소시키고/시키거나, 중합 효율을 개선시키고/시키거나, 비-정량적 신호를 줄이고/줄이거나, 효소 아피라제 및 폴리머라제의 억제를 줄일 수 있는 파이로시퀀싱이다. 파이로시퀀싱은 뉴클레오티드 포함 시 방출되는 피로포스페이트의 검출에 기초한 합성에-의한-서열분석 방법의 예이다.
상기 논의된 바와 같이, 본 발명의 측면은 핵산 증폭 방법이다. 전형적으로, 상기 방법은 DNA 폴리머라제, 상기 정의된 바와 같은 본 발명의 SSB, 주형 핵산 분자, 주형 핵산 분자의 일부를 어닐링할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머(들)(예를 들어 2개 이상의 프라이머, 예컨대 2, 3, 4, 5 또는 6개 프라이머), 및 뉴클레오티드(예를 들어 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트, dNTPS)를 포함하는 반응 혼합물을 제공하는 단계, 및 상기 반응 혼합물을 올리고뉴클레오티드 프라이머(들)가 주형 핵산 분자를 어닐링하고 상기 DNA 폴리머라제가 하나 이상의 뉴클레오티드를 중합함으로써 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머(들)를 연장시켜 폴리뉴클레오티드를 생성하는 조건 하에 배양하는 단계를 포함한다. 적합한 조건은 관련 긴술분야에 널리 알려져 있다. 본 발명의 증폭 방법은 PCR (및 RT-PCR)을 포함하지만, 핵산 증폭의 바람직한 방법은 등온 증폭 방법이다. 본 발명의 등온 증폭 방법은 일정한 온도에서 수행되고, 바람직한 온도는 본원의 다른 곳에서 설정된다. 임의로, 폴리뉴클레오티드 생성물의 생성이 검출된다(예를 들어 겔 전기영동을 통함).
예시적인 등온 증폭 방법은 루프 매개 등온 증폭(LAMP), 롤링 서클 증폭(RCA), 가닥 치환 증폭(SDA), 헬리카제 의존성 증폭(HDA), 다중 치환 증폭(MDA) 및 교차 프라이밍 증폭(CPA)을 포함한다.
상기 논의된 바와 같이, 본 발명의 측면은 부위-지정-돌연변이유발 방법이다. 이러한 방법은 달리 돌연변이 부위 주변의 주형 DNA에 상보성인 원하는 돌연변이(들)를 포함하는 DNA 프라이머를 이용할 수 있다. 프라이머가 본원에 정의된 바와 같은 SSB를 추가로 포함하는 반응 혼합물에서 주형에 어닐링되는 경우에, DNA 폴리머라제는 프라이머를 연장시키는데 사용된다. 반응 혼합물은 전형적으로 또한 단백질 Rec A를 포함한다. 주형 서열의 카피는 원하는 돌연번이를 포함하고, 이는 벡터 내로 삽입되고 숙수 세포 내로 도입되고 클로닝될 수 있다.
본 발명의 용도 및 방법은 전형적으로 시험관내에서 수행된다.
본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같은 본 발명의 SSB를 포함하는 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 바람직하게는 완충제 및 안정화제 예컨대 글리세롤 또는 수크로스를 포함하고, 또한 DNA 폴리머라제를 포함할 수 있다. 조성물은 수성이고 표준 완충제 예컨대 Tris, HEPES 등으로 완충될 수 있다. 일부 실시양태에서, SSB를 함유하는 완충제는 고염 농도, 예를 들어 적어도 350mM의 나트륨 이온, 적어도 50mM의 칼륨 이온, 적어도 150mM의 마그네슘 이온 및/또는 적어도 200mM의 칼슘 이온을 함유할 수 있다. 따라서, 본 발명의 SSB는 유리하게는 이러한 고염 세척 완충제에 포함될 수 있다. 상기 정의된 바와 같은 본 발명의 SSB에 대해 적합한 제제는 pH 8.0에서 25mM Tris-Cl, 200mM NaCl 및 10% 글리세롤을 포함한다.
본 발명은 상기 정의된 바와 같은 본 발명의 하나 이상의 SSB, 또는 본 발명의 하나 이상의 조성물, 또는 본 발명의 하나 이상의 핵산 분자, 또는 본 발명의 하나 이상의 발현 벡터, 또는 본 발명의 하나 이상의 숙주 세포 또는 바이러스를 포함하는 키트를 추가로 포함한다. 바람직하게는 상기 키트는 본원에 기재된 방법 및 용도, 예를 들어 핵산 증폭 또는 서열분석 방법, 예컨대 나노포어 서열분석 방법에서 사용하기 위한 것이다. 바람직하게는 상기 키트는 키트 구성성분의 사용을 위한 , 예를 들어 핵산 증폭 또는 서열분석을 위한 지침서를 포함한다. 따라서 키트는 폴리머라제, 세척 또는 다른 완충제(이는 본원에 추가로 논의된 바와 같은 고염 농도를 함유할 수 있음), 뉴클레오티드, 핵산 프라이머, 리가제, 토포이소머라제 또는 기라제(또는 나노포어 서열분석을 돕기 위한 다른 분자 운동 단백질) 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 서열분석 장치, 예를 들어 MinION 또는 GridION(Oxford Nanopore Technologies)에서 사용하기에 적합한 카트리지 내에 함유된, 상기 정의된 바와 같은 본 발명의 SSB, 또는 본 발명의 조성물을 제공한다.
본 발명은 하기 비제한적 실시예 및 도면을 참조하여 추가로 기재된다.
도 1 a), b), c) 및 d)는 1가 및 2가 염의 존재 하에 DNA에 대한 에스. 루베르 SSB(야생형 및 돌연변이체 형태) 및 이. 콜라이 SSB의 결합을 제시한다.
도 2 a)는 전자 현미경으로 시각화된, ssDNA가 없거나 또는 M13 파지 ssDNA와 함께 5 또는 120초 동안 배양된 염의 혼합물(350mM NaCl, 600mM KCl 및 150 mM Mg(OAc)2)의 존재 하에 SrSSB D17KD71K 돌연변이체를 제시하며; b)는 염의 혼합물(350nM NaCl, 600nM KCl 및 150 mM Mg(OAc)2)의 존재 하에 DNA에 대한 에스. 루베르 SSB(야생형 및 돌연변이체 형태) 및 이. 콜라이 SSB의 결합을 제시한다.
도 3은 0.15M, 2 M 및 4 M NaCl에서 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 결정된 에스. 루베르 야생형 SSB, 및 0.15M NaCl에서 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 결정된 에스. 루베르 SSB cdel 111 말단 결실 돌연변이체의 겉보기 올리고머 질량을 제시한다.
도 4는 고염 조건에서 에스. 루베르 SSB의 결정 구조를 제시한다. 상기 구조는 중합된 사량체로 이루어진 필라멘트형 아키텍처를 도시한다. (a) 중합 계면은 별개의 사량체에 속하는 2개의 인접한 이량체에 의해 형성되고 필라멘트를 따라 반복된다. (b) 필라멘트에서 사량체의 결정 패킹. 결합된 DNA의 짧은 DNA 단편은 (dT)8 올리고뉴클레오티드에 침지된다.
도 1 a), b), c) 및 d)는 1가 및 2가 염의 존재 하에 DNA에 대한 에스. 루베르 SSB(야생형 및 돌연변이체 형태) 및 이. 콜라이 SSB의 결합을 제시한다.
도 2 a)는 전자 현미경으로 시각화된, ssDNA가 없거나 또는 M13 파지 ssDNA와 함께 5 또는 120초 동안 배양된 염의 혼합물(350mM NaCl, 600mM KCl 및 150 mM Mg(OAc)2)의 존재 하에 SrSSB D17KD71K 돌연변이체를 제시하며; b)는 염의 혼합물(350nM NaCl, 600nM KCl 및 150 mM Mg(OAc)2)의 존재 하에 DNA에 대한 에스. 루베르 SSB(야생형 및 돌연변이체 형태) 및 이. 콜라이 SSB의 결합을 제시한다.
도 3은 0.15M, 2 M 및 4 M NaCl에서 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 결정된 에스. 루베르 야생형 SSB, 및 0.15M NaCl에서 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 결정된 에스. 루베르 SSB cdel 111 말단 결실 돌연변이체의 겉보기 올리고머 질량을 제시한다.
도 4는 고염 조건에서 에스. 루베르 SSB의 결정 구조를 제시한다. 상기 구조는 중합된 사량체로 이루어진 필라멘트형 아키텍처를 도시한다. (a) 중합 계면은 별개의 사량체에 속하는 2개의 인접한 이량체에 의해 형성되고 필라멘트를 따라 반복된다. (b) 필라멘트에서 사량체의 결정 패킹. 결합된 DNA의 짧은 DNA 단편은 (dT)8 올리고뉴클레오티드에 침지된다.
실시예
wt 에스. 루베르 SSB 및 D17K D71K 돌연변이체의 확인 및 클로닝
단일 SSB 오픈 리딩 프레임을 이. 콜라이 SSB 서열 질의(NCBI: WP_042201710.1)를 갖는 blastp 알고리즘을 사용함으로써(J. Mol. Biol [1990] 215, 403-410) 에스. 루베르 균주 DSM 13855 게놈(GenBank: CP000160.1)에서 확인하였다. 위치 17 및 71에서 아스파르트산을 리신으로 대체하는 2점 돌연변이를 도입하여, D17K D71K 돌연변이체를 산출하였다.
야생형 SSB 및 D17K D71K 돌연변이체를 코딩하는 유전자를 이. 콜라이에서 발현에 대한 코돈 최적화로 합성하였다(DNA 2.0 사용). 코돈-최적화된 유전자에서, 원래 뉴클레오티드의 26%가 대체되었고, GC-함량은 원래 63%에서 47%로 변하였으며, 생성된 유전자를 이. 콜라이에서의 발현에 더 적합하게 만들었다.
표 1: 유전자 서열
이. 콜라이에서 SrSSB 단백질 변이체의 발현을 위한 구조체를 패스트 클로닝 방법(BMC Biotechnol [2011] 11, p 92)으로 클로닝하였다. SrSSB i FW(정방향) 및 SrSSB i RW(역방향) 올리고뉴클레오티드와 주형으로서 wt SrSSB 또는 SrSSB D17K D71K 합성 유전자를 사용한 PCR 반응에 의해 삽입 단편을 생성하였다. SrSSB v RW 및 SrSSB v FW 올리고뉴클레오티드와 주형으로서 pCOLD II 발현 벡터(Takara)를 사용한 PCR 반응에 의해 벡터 단편을 생성하였다. 주형 DNA를 제거하기 위해, DpnI 제한 효소를 첨가하였고, 단편을 혼합하고 3시간 동안 37℃에서 배양하였다. 이어서 혼합물을 NovaBlue 적격 세포(Novagene)로 형질전환시켜, 이. 콜라이 세포에서 유전자 둘 다의 발현에 대한 구조체를 산출하였다.
2종의 삽입물 및 벡터 단편의 생성을 위해, 퓨전 하이-피델리티 DNA 폴리머라제(Thermo)를 사용하였다. 유전자 클로닝에 사용된 올리고뉴클레오티드를 통합된 DNA 기술에 의해 합성하였다. 클로닝된 구조체를 DNA 서열분석에 의해 검증하였다.
표 2: 올리고뉴클레오티드
단백질 발현 및 정제
wt SrSSB 발현 플라스미드로 형질전환된 이. 콜라이 세포 균주 Bl21을 밤새 성장시킨 후, 암피실린(100mg/ml)으로 보충된 신선한 테리픽 브로쓰(Terrific Broth) 배지로 1:50으로 희석하였다. OD600이 0.5에 도달할 때까지 세포를 배양한 후 배양물을 18℃로 냉각시켰다. 0.5 mM IPTG를 첨가하여 재조합 단백질 발현을 유도하고, 밤새 18℃에서 계속 배양하였다. 이어서 원심분리(8000Хg, 4℃, 10 분)에 의해 세포를 수확하고, 완충제 A(Tris-HCl 25mM pH 7.4, NaCl 0.5 M, 이미다졸 10mM, β-메르캅토에탄올 5mM, Tween 20 0.05%, 글리세롤 10%)에 재현탁하였다. 프렌치 프레스에서 세포를 파괴한 후(27kpsi 적용됨), 조 추출물을 원심분리(65,000Хg, 4℃, 30 분)에 의해 정화하고, 상청액을 1 mL HisTrap HP 칼럼(GE Healthcare)을 사용한 고정화된 금속 친화도 크로마토그래피(IMAC)에 의한 단백질 정제에 사용하였다. 로딩하기 전에 칼럼을 5 칼럼 부피(CV)의 완충제 A로 평형시켰다. 정화된 용해물을 칼럼에 적용한 후에, 미결합된 물질을 완충제 A를 함유하는 5 CV 세척제로 제거하였다. 이어서 단백질을 10 CV 완충제 A에서 10mM 내지 500mM 이미다졸의 선형 구배로 용리시켰다. 이들을 조합하고 100kDa의 분자량 컷오프를 갖는 아미콘 울트라-15 필터 장치(Millipore, 미국)를 사용하여 농축한 후에, SSB를 함유하는 분획을 SDS-PAGE에 의해 검출하였다. 최종 투석을 완충제 B(Tris-HCl 25mM pH 7.4, NaCl 0.15 M, β-메르캅토에탄올 5mM, 글리세롤 10%)에 대해 수행하였다. D17K D71K 돌연변이체의 정제를 동일한 프로토콜에 따라 수행하였다. 정제된 SSB 단백질의 순도를 SDS-PAGE(95% 초과)를 사용하여 측정하였고, 농도를 형광측정법적으로 측정하였다.
단일-가닥 DNA 결합 활성 측정
형광 측정
야생형 에스. 루베르 SSB 및 D17K D71K 돌연변이체를 NaCl, KCl, MgCl2 및 CaCl2가 보충된 반응 완충제에서 ssDNA에 결합하는 그의 능력에 대해 시험하였다. 이. 콜라이 SSB를 웰 특징화된 참조 단백질로서 사용하였다.
검정에서 형광단-표지된 올리고뉴클레오티드(표 2, 서열번호 10)의 형광의 변화가 검출되고 있다. 올리고뉴클레오티드 MB를 짧은, 8개 염기 쌍(bp) 이중-가닥 스템 및 24개 염기 단일-가닥 루프를 갖는 부분적 헤어핀을 형성하도록 설계한다. 올리고를 형광 염료 - FAM(카복시플루오레세인) 및 FAM 형광을 켄칭하는 DABCYL(4-(4'-디메틸아미노페닐아조)벤조산)로 표지하였다. 올리고뉴클레오티드가 그의 천연 상태에 있을 경우에, 스템의 5' 및 3' 단부 둘 다의 헤어핀 상태는 근접하게 있고, FAM 형광은 DABCYL에 의해 켄칭된다. 24개 뉴클레오티드 루프에 대한 SSB 단백질의 결합은 이중-가닥 스템에서 수소 결합을 파괴하고 올리고뉴클레오티드의 탈혼성화를 강요한다. FAM 및 DABCYL의 공간 분리는 염료 형광의 측정을 허용한다(Tang et al. Chemical Communications [2011] 47(19), p5485-5487).
야생형 및 D17K D71K 돌연변이체 단백질 둘 다는 1가 및 2가 염 둘 다의 고염 농도에서 형광 프로브에 효율적으로 결합하고 탈혼성화할 수 있다. 각각 10mM 내지 1M, 0M 내지 1M 및 0M 내지 250mM 범위의 염화나트륨(NaCl), 염화칼륨(KCl) 및 염화마그네슘(MgCl2)의 존재 하에 ssDNA 프로브를 사용한 핵단백질 복합체 형성은 도 1a 내지 1c에서 제시된다.
반응물은 0.125 μM의 분자 비콘 및 0.25 μM의 이. 콜라이 SSB 사량체(단일 결합 단위), 4 μM의 wt SrSSB 및 2 μM의 D17K D71K를 함유하였다. 반응 혼합물을 형광 프로브를 함유하는 반응 완충제 MB(10mM Tris-HCl pH 7, 10mM NaCl) 50 μl에서 삼중으로 설정하고, 96-웰 플레이트(Corning)에서 나타낸 농도의 NaCl, KCl 또는 MgCl2로 보충하였다. 나타낸 SSB 단백질을 첨가하여 결합 반응을 개시한 후, 반응물을 25℃에서 15초 동안 배양하고, 형광을 Gemini 플레이트 판독기(Molecular Devices) 상에서 495nm에서의 여기 및 520nm에서의 방출로 측정하였다. 모든 그래프를 형광 단위로 측정된, 개시 반응의 100%로 정규화하였다.
염화나트륨, 염화칼륨 및 염화마그네슘의 농도를 증가시키면, SrSSB 변이체 둘 다는 ssDNA에 결합하고 탈혼성화하는 그의 능력을 유지한다. D17K D71K 돌연변이체는 wt 단백질과 매우 유사한 결합 수준을 제시하지만 농도의 절반에서만 ssDNA에 대한 증가된 친화도를 나타낸다.
염 농도를 200에서 400mM로 증가시키면(NaCl의 경우에), 이전에 기재된 이. 콜라이 SSB 단백질의 결합 친화도는 급격하게 하락한다(Biochemistry [1988] 27, 456-471). 이러한 하락은 단백질 및 핵산 사이의 정전기적 상호작용의 파괴 및 상보성 ssDNA에 의해 형성된 이중-가닥 DNA의 분절의 증가하는 안정성 둘 다에 기인한다. 이전 관찰과 일치하여, ssDNA에 대한 이. 콜라이로부터의 참조 SSB의 친화도는 모든 시험된 염의 농도가 증가하면 유의하게 감소하였다.
또한 증가된 농도의 CaCl2에 대한 이. 콜라이, 야생형 및 돌연변이체 에스. 루베르 SSB의 감수성을 시험하기 위한 실험을 수행하였다. 결과는 도 1d에 제시된다.
표면 플라즈몬 공명
또한 D17K D71K 돌연변이체의 더 높은 결합 친화도를 T200 기기(BIACORE) 상에서 표면 플라즈몬 공명의 사용으로 직접적으로 단백질-ssDNA 상호작용 강도를 조사함으로써 확인하였다. 이 바이오센서-기반 기술은 핵단백질 복합체를 포함한 상이한 복합체의 평형 해리 상수(KD)의 계산을 가능하게 하는 결합 파라미터의 실시간 측정을 가능하게 한다. 측정이 뉴클레오티드 서열에 의해 편향되지 않도록 하기 위해, 무작위로 생성된, 150개 뉴클레오티드, 5'-비오티닐화된 ssDNA 올리고뉴클레오티드를 사용하였다(표 2, 서열번호 11). 올리고뉴클레오티드를 비오틴-스트렙타비딘 상호작용을 통해 SA S-형 칩(BIACORE)의 표면에 부착하였다. 이어서, 2종의 단백질을 MB 완충제(10mM Tris-HCl pH 7, 10mM NaCl)에서 칩 표면 위에 10nM, 20nM, 40nM, 100nM, 150nM, 200nM, 300nM로 희석하여 전개하였다. 결합 이벤트를 칩 표면에 대한 질량 변화에 의해 검출하였으며, 이는 단백질-ssDNA 상호작용의 운동 파라미터의 실시간 측정을 가능하게 하였다. 운동 파라미터는 표 3의 표에 주어진다.
표 3
표 3은 150 nt 단일-가닥 DNA에 대한 결합의 해리 상수(KD) 및 야생형 단백질 및 D17D71K 에스. 루베르 SSB의 결합 모델에 대한 적합 품질을 제공한다. 1 미만의 Chi2 값은 KD 계산에 사용된 모델에 대한 실험적 데이터의 매우 우수한 적합도를 나타낸다. D17KD71K 돌연변이체의 KD는 1.8배 이상 더 낮았으며, 이는 돌연변이된 단백질의 증가된 결합 친화도를 나타낸다.
KD 값의 감소는 D17K D71K 돌연변이의 도입이 단일-가닥 DNA에 대한 야생형 SSB 단백질의 초기의 이미 높은 친화도를 유의하게 증가시킨다는 것을 검증한다.
이 실험은 반드시 저염 농도에서 수행되었지만 그럼에도 돌연변이체 단백질의 뛰어난 결합 친화도를 나타낸다.
염 혼합물에서의 결합 및 탈혼성화 형광 검정
야생형 에스. 루베르 SSB, D17K D71K 돌연변이체, 및 야생형 SSB의 C-말단 111 잔기가 결여된 에스. 루베르 SSB cdel111 C-말단 결실 돌연변이체를 NaCl, KCl 및 Mg(OAc)2의 혼합물을 함유하는 반응 완충제에서 ssDNA에 결합하는 그의 능력에 대해 각각 시험하였다. 이. 콜라이 SSB를 널리 특징화된 참조 단백질로서 사용하였다. 반응물은 0.125 μM의 분자 비콘, 0.25 μM의 이. 콜라이 SSB 사량체(단일 결합 단위), 4 μM의 wt SrSSB, D17KD71K 돌연변이체 팔량체 또는 cdel111 돌연변이체를 함유하였다. 반응물을 96-웰 플레이트(Corning)에서 350 mM NaCl, 600mM KCl 및 150 mM Mg(OAc)2를 함유하는 반응 완충제 MB(10mM Tris-HCl pH 7) 100 μl로 삼중으로 설정하고, 25℃에서 5시간 동안 배양하였다. 형광을 5분마다 495nm에서의 여기 및 520nm에서의 방출로 측정하였다. 분자 비콘을 함유하는 반응물의 기저 형광을 제하였다. 측정을 Gemini 마이크로 플레이트 판독기(Molecular Devices) 상에서 수행하였다.
실험 과정에서, 본 발명자들은 wt 및 돌연변이체 에스. 루베르 SSB 둘 다에 대한 형광의 증가를 관찰하였으며, 이는 DNA 프로브에 대한 단백질의 결합을 나타낸다. D17KD71K 돌연변이체는 고도로 농축된 염 혼합물에서 ssDNA에 대하여 유의하게 증가된 친화도를 가졌다. 이. 콜라이 SSB 및 cdel111은 실험 조건 하에 측정가능한 결합 활성을 갖지 않았다. 상기 결과는 도 2b에 제시된다.
사량체가 비교적 저농도의 2가 염, 예를 들어 염화마그네슘에서 안정성을 상실하는 이. 콜라이 SSB와는 달리, SrSSB는 고도로 농축된 1가 및 2가 염의 혼합물에서 그의 형태를 유지하고 ssNDA에 결합할 수 있다(도 2).
SrSSB-ssDNA 복합체의 전자 현미경검사
SrSSB D17KD71K 돌연변이체 단백질을 "염 혼합물에서 결합 및 탈혼성화 형광 검정" 하에 단독으로 또는 200배 초과의 ssDNA(M13mp18 단일-가닥 DNA, NEB)와 함께 동일한 반응 조건에서 배양하였다. 단백질 농도는 17μM(팔량체)이었고, 배양 시간은 5 내지 120분으로 다양하였다. 음성 염색 전자 현미경검사를 위한 샘플을 제조하기 위해, 분석물의 3 마이크로리터 드롭을 탄소 코팅된 그리드에 1분 동안 방치한 후 닦아냈다. 그리드를 Mili-Q 물로 5회 세척하고, 닦아내고 2% 우라닐 아세테이트로 1분 동안 염색하였다. 이어서 그리드를 닦고, 저선량 모드의 JEOL 1200 EXII에서 관찰을 위해 진공에서 건조시키고, 100 kV의 가속 전합에서 작동시켰다.
EM 시각화는 도 2a에 제시된다. 단백질을 단독으로 또는 M13 파지 ssDNA와의 반응 혼합물에서 5초 동안 배양한 경우에, 제한된 양의 고도로 정돈된 고리형 및 낫형 구조를 관찰할 수 있었다. 배양을 120초로 연장시킨 경우에, 다량의 큰, 정돈된 구조를 관찰할 수 있었다. 관찰된 광범위한 구조는 SrSSB-ssDNA의 핵단백질 복합체이며, 이는 단백질이 ssDNA와 함께 배양되는 경우에 광범위하게 형성된다. 따라서 단백질이 큰 정돈된 필라멘트형 핵단백질 복합체를 형성하고, 고도로 농축된 염 용액인 ssDNA에 결합하고 탈혼성화할 수 있다는 것을 확인하였다.
올리고머성 구조
다른 알려진 SSB에 대한 살리니박터 루베르(SrSSB)의 서열 정렬은 단백질이 대다수의 박테리아 SSB와 유사한 사량체를 형성한다고 제안했지만, SrSSB의 초기 특징화 동안, 단백질이 예상치 않은 더 높은 올리고머성 상태로 존재한다는 것을 발견하였다.
이. 콜라이 SSB의 경우에, 고염 농도가 SSB 기능을 방지하거나, 또는, ssDNA-SSB 핵단백질 복합체가 이미 형성된 경우에, ssDNA-단백질 복합체의 과응축을 야기하는 것으로 제시된 바 있다. NaCl의 20 mM 이하의 염 농도에서 이. 콜라이 SSB는 높은 협동성 모드로 ssDNA에 결합하여 신장된 필라멘트형 핵단백질 복합체를 형성하고, NaCl의 20 내지 200 mM의 염 농도에서 이. 콜라이 SSB 사량체는 사량체가 제한된 협동성으로 결합하는 "스트링 상의 비드" 구조를 생성하는 것으로 알려졌다.
고염 및 저염 조건 하에 살리니박터 루베르로부터 SSB의 어셈블리 상태를 결정하기 위해, 재조합적으로 생성된 SrSSB를 크기 배제 크로마토그래피 및 시차 주사 열량계에 의해 분석하였다. SSB 올리고머성 상태에서 염 농도의 영향을 조사하기 위해, SSB 올리고머 분자 질량을 Superdex 200 10/300 GL 칼럼(GE healthcare) 상에서 크기 배제 크로마토그래피를 통해 추정하였다. 상기 분석을 25mM Tris pH 7.5 및 0.15M(완충제 C1), 2M(완충제 C2), 4M(완충제 C3) NaCl을 함유하는 완충제 C에서 수행하였다. 이어서 야생형 에스. 루베르 SSB 단백질의 용리 패턴을 표준 단백질: 페리틴(440 kDa), 알돌라제(158 kDa), 콘칼부민(75 kDa), 오브알부민(43 kDa)의 용리 패턴과 비교하였다.
결과는 도 3에 제시된다. 크기 배제에 의한 정제된 SrSSB의 분석은 대략 225 kDa의 분자 질량에 상응하는 단일 피크로 입증되며, 이는 단량체의 분자 질량의 약 10.3배이다. 이 결과는 단백질이 이전에 기재된 SSB보다 더 큰 올리고머를 형성하고, SrSSB 사량체가 팔량체(사량체의 이량체), 십이량체(사량체의 삼량체) 및 4배 더 높은 올리고머성 상태를 어셈블리할 가능성이 가장 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 단량체의 10.3배의 관찰된 질량은 평형 상태에서 대략 42% 팔량체 및 58% 십이량체의 혼합물을 나타낸다. 염 농도가 증가하면, 관찰된 올리고머의 크기는 각각 2M 및 4M의 NaCl에서 단량체의 크기의 대략 7.6배(~90% 팔량체, 10% 사량체) 및 4.9배(~25% 팔량체, 75% 사량체)까지 감소된다. 올리고머성 상태의 분석을 또한 500 mM MgCl2의 존재 하에 수행하였으며, 이때 단백질 올리고머 크기는 단량체의 크기의 대략 8배였다(데이터는 제시되지 않음).
따라서, 에스. 루베르 SSB는 고염 조건의 존재 하에 심지어 ssDNA의 부재 하에서도 현저한 4차 구조 안정성을 나타낸다. 이러한 4차 구조는 ssDNA에 대한 결합에 필요하다. 에스. 루베르 SSB의 C-말단 결실 돌연변이체는 고도로 농축된 염의 혼합물에서 ssDNA에 결합하지 않는 것으로 제시되었고(도 2b), 150 mM NaCl에서 단량체(단지 사량체성 4차 구조를 나타냄)의 크기의 3.8배의 추정된 크기를 갖는 것으로 제시되었다(도 3).
놀랍게도, wt SSB와는 달리, C-말단 결실 돌연변이체 CΔ111은 팔량체를 형성할 수 없었으며, 대신에 사량체를 형성하였다(데이터는 제시되지 않음). 상기 논의된 바와 같이, CΔ111은 고염에서 ssDNA에 결합할 수 없었다. 따라서 SrSSB의 경우에, C-말단 도메인은 고염에서 필라멘트 형성 및 ssDNA 결합 활성 둘 다에 결정적이다.
결정화 및 구조 결정
야생형 에스. 루베르 SSB의 작은 프리즘-형상 결정을 20 μM의 d(T)75 올리고뉴클레오티드를 함유하는 단백질 용액(5 mg/ml) 1 μl 및 저장 용액(27% w/v PEG 3350, 100mM Tris-HCl pH 8.0, 0.25M MgCl2, 1 M 암모늄 술페이트) 1 μl로 이루어진 시팅 드롭으로 수득하였다. d(T)8 올리고뉴클레오티드를 형성된 결정을 함유하는 드롭에 0.25μM의 최종 농도로 첨가함으로써 침지 실험을 수행하였다.
도 4는 결정 구조 SrSSB(PDB ID 5ODN)가 사량체의 이량체로 구성된 비대칭 단위로서 팔량체를 갖는다는 것을 제시한다. 각각의 OB-폴드는 8개의 단백질 및 8개의 ssDNA 단편을 비대칭 단위로 초래하는 ssDNA의 하나의 짧은 단편에 결합된다. 팔량체화 계면은 도 4a에 제시된다. 도 4b는 SSB 단백질이, 심지어 사용된 고염 결정화 조건(0.25M MgCl2, 1 M 암모늄 술페이트) 하에서도, 빽빽하게 패킹된 사량체의 필라멘트를 형성한다는 것을 제시한다(도 3b).
<110> Universitetet i Tromso - Norges Arktiske Universitet
<120> Single-Strand Binding Protein
<130> MPI19-023
<150> GB 1703049.5
<151> 2017-02-24
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> PRT
<213> Salinibacter Ruber
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> D17KD71K SrSSB mutant
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<211> 507
<212> DNA
<213> Salinibacter ruber
<400> 3
atggcacgcg gagtcaacaa ggtcattctc atcggcaacc tcggcgacga tcccgaactg 60
cggtacaccg gcagcgggac ggctgtctgc aacatgtcgc tcgcgaccaa cgaaacctac 120
accgatagcg acggcaatga ggtgcaaaac accgagtggc acgacgtcgt ggcgtggggg 180
cggctcggag agatctgcaa cgagtacctt gacaagggct cccaggtcta cttcgagggc 240
aagctccaaa cccgctcttg ggaggaccgc gacaacaaca cgcgctactc gacggaggtg 300
aaggcccaag agatgatgtt cctcgacagc aatcgccagg gcggggcgga catggacggc 360
ttcgaccaga cccgtgggga cgaatccctg gaccaaaccc gccaggagca gcccgccggc 420
tcttccggtc cgcagcctgg gcagcaggcg tcctccgggg gcgaggacga ggacacattc 480
gagccggacg atgatcttcc gttctag 507
<210> 4
<211> 504
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> wt SrSSB codon optimized synthetic gene
<400> 4
atggcacgtg gtgtgaataa agtgattctg attggtaatc tgggtgatga tccggaactg 60
cgttataccg gtagcggcac cgcagtttgt aatatgagcc tggcaaccaa tgaaacctat 120
accgatagtg atggtaatga agtgcagaat accgaatggc atgatgttgt tgcatggggt 180
cgtctgggtg aaatttgtaa tgaatatctg gataaaggca gccaggtgta ttttgaaggt 240
aaactgcaga cccgtagctg ggaagatcgt gataataaca cccgttatag caccgaagtt 300
aaagcccaag aaatgatgtt tctggatagc aatcgtcagg gtggtgcaga tatggatggt 360
tttgatcaga cccgtggtga tgaaagcctg gatcagacac gtcaagaaca gcctgcaggt 420
agcagcggtc cgcagcctgg tcagcaggca agcagcggtg gtgaagatga agataccttt 480
gaaccggatg atgatctgcc gttt 504
<210> 5
<211> 504
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence encoding D17KD71K SrSSB mutant
<400> 5
atggcacgtg gtgtgaataa agtgattctg attggtaatc tgggtgataa accggaactg 60
cgttataccg gtagcggcac cgcagtttgt aatatgagcc tggcaaccaa tgaaacctat 120
accgatagtg atggtaatga agtgcagaat accgaatggc atgatgttgt tgcatggggt 180
cgtctgggtg aaatttgtaa tgagtacttg aaaaaaggca gccaggtgta ttttgaaggt 240
aaactgcaga cccgtagctg ggaagatcgt gataataaca cccgttatag caccgaagtt 300
aaagcccaag aaatgatgtt tctggatagc aatcgtcagg gtggtgcaga tatggatggt 360
tttgatcaga cccgtggtga tgaaagcctg gatcagacac gtcaagaaca gcctgcaggt 420
agcagcggtc cgcagcctgg tcagcaggca agcagcggtg gtgaagatga agataccttt 480
gaaccggatg atgatctgcc gttt 504
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Primer
<400> 6
ctttacttcc agggggccat ggcacgtggt gtgaat 36
<210> 7
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Primer
<400> 7
attcacacca cgtgccatgg ccccctggaa gtaaag 36
<210> 8
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Primer
<400> 8
gatgatctgc cgttttaatg aggatccgaa ttcaag 36
<210> 9
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Primer
<400> 9
cttgaattcg gatcctcatt aaaacggcag atcatc 36
<210> 10
<211> 82
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Molecular Beacon
<220>
<221> modified_base
<222> (7)
<223> dt-4-(4'-dimethylaminophenylazo) benzoic acid
<220>
<221> modified_base
<222> (32)
<223> dt-carboxyfluorescein
<400> 10
ggcccgtagg aggaaaggac atcttctagc atacgggccg tcaagttcat ggccagtcaa 60
gtcgtcagaa atttcgcacc ac 82
<210> 11
<211> 150
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Biotinylated ssDNA
<220>
<221> modified_base
<222> (1)
<223> biotinylated
<400> 11
aaagggtatt gacggaccag atgtagcgtg gcagaaaagg gtattgacgg accagatgta 60
gcgtggcaga gactgaaagg gtattgacgg accagatgta gcgtggcaga aaagggtatt 120
gacggaccag atgtagcgtg gcagagactg 150
Claims (46)
- 시험관 내에서 DNA 분자를 500mM의 나트륨 이온의 존재 하에 최대 ssDNA 결합 능력의 적어도 50%를 나타내는 단일-가닥 DNA 결합 단백질(SSB)과 접촉시키는 단계를 포함하는, DNA 분자를 탈혼성화하는 방법으로서, 상기 SSB는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 1과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하고,
상기 SSB는 서열번호 1의 위치 17 및 71에서 치환을 포함하고, 상기 위치 17 및 71에서 아미노산이 리신으로 치환되어 있으며,
상기 DNA 분자는 하기 중 하나 이상을 함유하는 용액 내에 존재하거나 또는 그에 노출되는, 방법:
(i) 적어도 350mM의 나트륨 이온,
(ii) 적어도 50mM의 칼륨 이온,
(iii) 적어도 150mM의 마그네슘 이온, 또는
(iv) 적어도 200mM의 칼슘 이온. - 제1항에 있어서, 상기 용액이 적어도 500mM의 나트륨 이온을 함유하는, 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 용액이 적어도 750mM의 나트륨 이온을 함유하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 용액이 적어도 100mM의 칼륨 이온을 함유하는, 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 용액이 적어도 300mM의 칼륨 이온을 함유하는, 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 용액이 적어도 600mM의 칼륨 이온을 함유하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 용액이 적어도 200mM의 마그네슘 이온을 함유하는, 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 용액이 적어도 250mM의 마그네슘 이온을 함유하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 용액이 적어도 250mM의 칼슘 이온을 함유하는, 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 용액이 적어도 300mM의 칼슘 이온을 함유하는, 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 하기 방법 동안 수행되는, 방법:
i) 핵산 증폭, 정제 또는 서열분석;
ii) 부위 지정 돌연변이유발;
iii) 현미경을 사용하여 샘플에서 핵산 구조 검사;
iv) 제한 효소 소화;
v) 역전사;
vi) T4 폴리머라제의 활성 증진; 또는
vii) ssDNA 또는 RNA를 뉴클레아제 소화로부터 보호. - 제11항에 있어서, 상기 서열분석이 나노포어 서열분석인, 방법.
- 시험관 내에서 ssDNA를 500mM의 나트륨 이온의 존재 하에 최대 ssDNA 결합 능력의 적어도 50%를 나타내는 단일-가닥 DNA 결합 단백질(SSB)과 접촉시키는 단계를 포함하는 상보성 ssDNA의 혼성화를 방지하는 방법으로서, 상기 SSB는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 1과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하고,
상기 SSB는 서열번호 1의 위치 17 및 71에서 치환을 포함하고, 상기 위치 17 및 71에서 아미노산이 리신으로 치환되어 있으며,
상기 ssDNA는 하기 중 하나 이상을 함유하는 용액 내에 존재하거나 또는 그에 노출되는, 방법:
(i) 적어도 350mM의 나트륨 이온,
(ii) 적어도 50mM의 칼륨 이온,
(iii) 적어도 150mM의 마그네슘 이온, 또는
(iv) 적어도 200mM의 칼슘 이온. - 제13항에 있어서, 상기 용액이 적어도 500mM의 나트륨 이온을 함유하는, 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 용액이 적어도 750mM의 나트륨 이온을 함유하는, 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 용액이 적어도 100mM의 칼륨 이온을 함유하는, 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 용액이 적어도 300mM의 칼륨 이온을 함유하는, 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 용액이 적어도 600mM의 칼륨 이온을 함유하는, 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 용액이 적어도 200mM의 마그네슘 이온을 함유하는, 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 용액이 적어도 250mM의 마그네슘 이온을 함유하는, 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 용액이 적어도 250mM의 칼슘 이온을 함유하는, 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 용액이 적어도 300mM의 칼슘 이온을 함유하는, 방법.
- 제13항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 하기 방법 동안 수행되는, 방법:
i) 핵산 증폭, 정제 또는 서열분석;
ii) 부위 지정 돌연변이유발;
iii) 현미경을 사용하여 샘플에서 핵산 구조 검사;
iv) 제한 효소 소화;
v) 역전사;
vi) T4 폴리머라제의 활성 증진; 또는
vii) ssDNA 또는 RNA를 뉴클레아제 소화로부터 보호. - 제23항에 있어서, 상기 서열분석이 나노포어 서열분석인, 방법.
- 단일-가닥 DNA 결합 단백질(SSB)로서, 500mM의 나트륨 이온의 존재 하에 최대 ssDNA 결합 능력의 적어도 50%를 나타내고 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 1과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 위치 17 및 71에서 아미노산이 리신으로 치환되어 있는, 단일-가닥 DNA 결합 단백질(SSB).
- 제25항에 있어서, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 SSB.
- 제25항 또는 제26항에 정의된 바와 같은 SSB를 코딩하는 핵산 분자.
- 제27항에 정의된 바와 같은 핵산 분자를 함유하는 발현 벡터.
- 제28항에 정의된 바와 같은 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 제28항에 정의된 바와 같은 발현 벡터를 포함하는 바이러스.
- 제25항 또는 제26항의 SSB, 및 완충제 또는 안정화제를 포함하는 조성물.
- 제25항 또는 제26항의 SSB; 또는 제25항 또는 제26항의 SSB, 및 완충제 또는 안정화제를 포함하는 조성물을, 폴리머라제, 세척 또는 다른 완충제, 뉴클레오티드, 핵산 프라이머, 리가제, 토포이소머라제 또는 기라제 중 하나 이상과 함께 포함하는, 키트.
- 제25항 또는 제26항에 있어서, 서열분석 장치에서 사용하기에 적합한 카트리지 내에 함유된, SSB.
- 서열분석 장치에서 사용하기에 적합한 카트리지 내에 함유된, 제31항에 청구된 바와 같은 조성물.
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