CN109609536A

CN109609536A - 一种全细胞一步合成l-肌肽的方法

Info

Publication number: CN109609536A
Application number: CN201910040717.1A
Authority: CN
Inventors: 朱益波; 王志杰; 孙启武; 赖淑涵; 彭鑫成; 楚银凤
Original assignee: Changshu Institute of Technology
Current assignee: Suzhou Bainuo Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2019-01-16
Filing date: 2019-01-16
Publication date: 2019-04-12
Anticipated expiration: 2039-01-16
Also published as: CN109609536B

Abstract

本发明公开了一种全细胞一步合成L‑肌肽的方法，包括以下步骤：1)构建重组载体，所述重组载体含有核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸脂酰基转移酶基因，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；2)将核苷酸序列SEQ ID NO.1所示的基因转入大肠杆菌获得重组大肠杆菌；3)将底物β‑丙氨酸甲酯以及L‑组氨酸溶于缓冲溶液，pH值为7.5‑9.5；4)将重组大肠杆菌加入缓冲溶液中进行反应，反应温度25‑42℃；本发明利用该基因的重组质粒和重组工程菌在催化体系中直接催化合成L‑肌肽，提高了L‑肌肽的转化率，同时解决了氨肽酶法催化过程繁复的酶分离纯化和高成本的难题。

Description

一种全细胞一步合成L-肌肽的方法

技术领域

本发明涉及一种肌肽的合成方法，具体是一种直接采用重组大肠杆菌作为全细胞催化剂高效率合成L-肌肽的方法，属于生物生产技术领域。

背景技术

L-肌肽(β-丙氨酰-L-组氨酸)及其类似物(如高肌肽和鹅肌肽)，是广泛存在于哺乳动物的大脑、肌肉和其他重要组织中的天然活性二肽。自该活性肽发现的一百多年来，已有大量的研究发现或者证明L-肌肽具有显著的抗氧化、消除胞内自由基、抗衰老等活性，并且在临床上用于高血压、心脏病、老年性白内障、溃疡、抗肿瘤、促进伤口愈合等方面的辅助治疗。由于其抗氧化的活性强，毒副作用低并具有多种生理活性，该活性肽及其衍生物在医药、保健、卫生、化妆品等领域已有广泛的应用，市场空间广阔。

目前L-肌肽的生产主要采用化学合成法。已有的化学合成方法比较多，主要可以分为两大类：(1)利用β-丙氨酸参与合成。其主要路线是β-丙氨酸经氨基保护、羧基活化后与保护的L-组氨酸缩合，然后脱掉保护基团得到L-肌肽。该路线由于各个保护基团的差异导致合成路线较多。其中常用的方法是利用邻苯二甲酸酐与β-丙氨酸生成邻苯二甲酰-β-丙氨酸保护氨基，羧基与氯化亚砜反应生成邻苯二甲酰-β-丙氨酰氯，再与保护的L-组氨酸形成肽键后脱保护基团得到产品。该路线比较复杂，收率低，肽键形成过程中易消旋，影响产品纯度，并且溶剂消耗大，易造成环境污染；(2)无β-丙氨酸参与的反应：主要原理为L-组氨酸先与不同的β-丙氨酸前体生成肽键，再进一步转换为肌肽。常用的路线是在醇钠作用下，L-组氨酸和氰乙酸乙酯发生酰化反应，得到氰基乙酰-L-组氨酸，经催化氢化还原得L-肌肽。该路线相对简单，省去对不同基团的保护和脱保护的过程，避免消旋反应的发生，但是采用了易水解的醇纳，需要无水操作，要求严格，并未工业化应用。同时，氰乙酸乙酯为环境毒害物质，易引起水体污染和毒性反应。

目前，已有采用温和环保的酶催化合成方法，以取代传统化学合成工艺的报道。如采用氨肽酶催化β-丙氨酸甲酯与L-组氨酸一步合成L-肌肽(申请公布号为CN107217048A的专利文献)。采用重组氨肽酶全细胞合成L-肌肽等方法的报道(Heyland J,N Antweiler,JLutz,et al.Simple enzymatic procedure for L-carnosine synthesis:whole-cellbiocatalysis and efficient biocatalyst recycling[J].Microbial Biotechnology,2010,3(1):74-83.)。然而，由于氨肽酶具有很高的外切酶活力，导致在反应体系中无法积累高浓度的L-肌肽。并且，利用氨肽酶合成L-肌肽对反应体系要求较高，往往需要水相和有机相体系，以减少产物的水解作用。但是有机相对酶的活力存在一定程度抑制，氨基酸底物在有机相中溶解度也较低，种种原因都导致基于氨肽酶合成L-肌肽的产量很低(最优结果是3.7g/L，Microbial Biotechnology,2010,3(1):74-83.)。除此之外，氨肽酶会形成三肽，导致反应产物复杂、提取纯化困难、L-肌肽得率较低(Heck T,V S Makam,J Lutz,etal.Kinetic Analysis of L-Carnosine Formation byβ-Aminopeptidases.AdvancedSynthesis&Catalysis,2010,352(2-3):407-415.)。并且，采用生物酶法制备、分离成本高昂，难以回收再利用，不利于大规模运用。

发明内容

本发明的目的是提供一种全细胞一步合成L-肌肽的方法，该方法通过氨基酸脂酰基转移酶作用将β-丙氨酸甲酯转酰基于L-组氨酸，形成L-肌肽，并通过基因工程的方法构建重组工程菌，实现全细胞催化和重复利用，以实现L-肌肽绿色、高效、低成本合成。

为了达到上述技术目的，本发明的技术方案是：

一种全细胞一步合成L-肌肽的方法，包括以下步骤：

(1)构建重组载体，所述重组载体含有核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示(详见序列表)的氨基酸脂酰基转移酶基因，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示(详见序列表)。

(2)将核苷酸序列SEQ ID NO.1所示的基因转入大肠杆菌获得重组大肠杆菌。

本发明通过信号肽预测分析，发现该氨基酸脂酰基转移酶带有信号肽。进一步由蛋白质亚细胞定位预测分析软件分析发现该蛋白是胞外分泌蛋白。为避免蛋白表达后分泌到胞外，导致细胞催化活力下降。

具体地，将已知的氨基酸脂酰基核苷酸序列(GenBank:AB610978.1)经Jcat密码子优化后通过基因合成获得编码21-619位氨基酸的基因片段SEQ ID NO.1，该片段5’、3’两端分别添加MscI和XhoI酶切位点；将合成基因片段和表达载体分别经MscI和XhoI酶切后，胶回收目的片段，目的片段经连接，连接产物转化大肠杆菌,在含100μg/ml的LB培养基上过夜培养，挑取单菌落培养后，小量提取质粒酶切验证，获得重组大肠杆菌。

合成基因与表达载体经过酶切后，构建重组载体，优选的载体是pET22b。利用该载体携带的周质空间分泌信号肽序列，将重组蛋白表达后分泌到重组细胞的周质空间，以减少底物跨膜阻力，增加脂酰基转移酶与底物的结合机会，提高催化效率，同时有利于产物释放到细胞外，减少被胞内肽酶的降解几率。最终能显著提高L-肌肽的合成效率。

所述大肠杆菌包括所有根据现有技术可以作为宿主的大肠杆菌，优选但并不限于E.coli BL21(DE3)。

重组大肠杆菌发酵培养与基因诱导表达：所述重组大肠杆菌接种至含100μg/ml的LB培养基中，于37℃，220rpm过夜活化培养；将活化菌液接种至2.5L体积百分比为2％的LB培养基中，于37℃，300rpm，1.5vvm通气量，培养至OD₆₀₀＝0.6-0.8，加入终浓度为0.4mMIPTG，培养温度降为25℃继续培养10h，4℃离心发酵液收集菌体。

所述LB培养基包括酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L,pH值为7.2。

(3)将底物β-丙氨酸甲酯(β-Ala-OMe)以及L-组氨酸(L-His)溶于缓冲溶液，pH值为7.5-9.5。

β丙氨酸廉价易得，可以采用成熟工艺制备生产β-丙氨酸甲酯用作底物。L-组氨酸无需进行氨基保护，可以直接作为该方法的重组细胞底物。

(4)将重组大肠杆菌加入缓冲溶液中进行反应，反应温度25-42℃。反应适当时间，收集反应液离心分离菌体终止反应。

上述的合成方法，反应进行到适当程度时可以通过物理分离全细胞终止反应。分离获得的全细胞可以继续催化实现循环利用。

本发明利用来源于鞘氨醇杆菌属的氨基酸脂酰基转移酶具有远优于氨肽酶合成L-肌肽的能力,并且无需提取纯化重组蛋白，反应体系简单，不需要使用有机溶剂。本发明利用该基因的重组质粒和重组工程菌在催化体系中直接催化合成L-肌肽，提高了L-肌肽的转化率，同时解决了氨肽酶法催化过程繁复的酶分离纯化和高成本的难题。

本发明的方法与现有的技术相比具有如下技术效果：

1)合成原料β-丙氨酸只需要通过简单的步骤合成β-丙氨酸甲酯，原料简单易得，成本较低；

2)全细胞催化合成路径简单环保，省去了复杂的酶分离纯化的步骤，不需要补充辅助因子，成本低廉，降低了成本；

3)反应速率快，不催化产物L-肌肽的水解反应，摩尔转化率高，全细胞可固定化后重复利用(菌体回收后，可以多次应用于全细胞合成L-肌肽，催化活力稳定)，提高了生产效率，能显著降低生产成本，具有很高的应用潜力。

附图说明

图1为氨基酸脂酰基转移酶合成L-肌肽的反应示意图。

图2为全细胞循环利用的相对细胞活力示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

本发明的L-肌肽生物合成路径简要描述为如图1所示，具体包括以下步骤：

一、氨基酸脂酰基转移酶表达载体及大肠杆菌的构建

根据已知的氨基酸脂酰基核苷酸序列(GenBank:AB610978.1)经Jcat密码子优化后通过基因合成获得编码21-619位氨基酸的基因片段(SEQ ID NO.1)。该片段5’、3’两端分别添加MscI和XhoI酶切位点。

将合成基因片段和pET22b载体分别经MscI和XhoI酶切后，胶回收目的片段，目的片段经连接，连接产物转化E.coli BL21(DE3),在含100μg/ml的LB培养基上过夜培养，挑取单菌落培养后，小量提取质粒酶切验证，获得重组大肠杆菌。

二、重组大肠杆菌发酵培养与基因诱导表达

将步骤一获得的重组大肠杆菌接种至含100μg/ml的LB培养基(酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L,pH＝7.2)中，于37℃，220rpm过夜活化培养。将活化菌液接种至2.5L LB培养基中(2％，V/V)，于37℃，300rpm，1.5vvm通气量，培养至OD₆₀₀＝0.6-0.8，加入终浓度为0.4mM IPTG，培养温度降为25℃继续培养10h，4℃离心发酵液收集菌体，作为本发明实施例中所用全细胞催化剂。

三、全细胞催化合成L-肌肽

称取0.698g酯盐酸盐(50mMβ-Ala-OMe)和1.55g L-组氨酸(100mM L-His)，溶解于100mL，100mM，pH＝8.5含10mM EDTA的硼酸盐缓冲溶液中。加入重组大肠杆菌细胞5g，于25℃混匀，振荡反应2h，离心终止反应，取样进行L-肌肽定量测定，测得L-肌肽浓度为36.1mM，摩尔转化率为72.2％。

测定方法为：取适量体积反应液于15000g离心10min后，取上清液经适当稀释后，取30μl样品混于270μl 0.2M硼酸缓冲液(pH＝9.0)，加入300μl 1.5mg/ml FMOC-Cl乙腈溶液，室温放置10分钟，再加入300μl 4mg/ml盐酸金刚烷胺的乙腈：水(1:1)溶液，混匀，0.22μm滤膜过滤，上HPLC进行测定。

色谱分析条件：Zorbax ODS C18柱，上样量20μl；流动相组成：A：乙腈；B:50mM醋酸钠缓冲液pH4.2；检测波长263nm；流动相总流量1ml/min；柱温30℃；梯度洗脱程序：0-3min，34％A，66％B；3-10min，45％A，55％B；10-20min，60％A，40％B；20-30min，100％A；30-40min，100％A。

菌体重复利用合成L-肌肽

重组大肠杆菌按照步骤三反应结束后，离心收集菌体，重复该反应流程，通过测定各轮次L-肌肽的浓度计算相对活力，如图2所示。第一次循环利用的相对细胞活力为98.4％，第二次循环利用的相对细胞活力为96.3％，第三次和第四次循环利用的相对细胞活力分别为92.1％和89.5％。

上述实施例不以任何方式限制本发明，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 常熟理工学院

<120> 一种全细胞一步合成L-肌肽的方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1812

<212> DNA

<213> 鞘氨醇杆菌(Sphingbacterium siyangensis)

<400> 1

atggccatgc agaccgctgc tgactctgct tacgttcgtg accactacga aaaaaccgaa 60

gttgctatcc cgatgcgtga cggtaaaaaa ctgttcaccg ctatctactc tccgaaagac 120

aaatctaaaa aatacccggt tctgctgaac cgtaccccgt acaccgtttc tccgtacggt 180

cagaacgaat acaaaaaatc tctgggtaac ttcccgcaga tgatgcgtga aggttacatc 240

ttcgtttacc aggacgttcg tggtaaatgg atgtctgaag gtgacttcga agacatccgt 300

ccgaccacct actctaaaga caaaaaagct atcgacgaat ctaccgacac ctacgacgct 360

ctggaatggc tgcagaaaaa cctgaaaaac tacaacggta aagctggtct gtacggtatc 420

tcttacccgg gtttctactc taccgttggt ctggttaaaa cccacccgtc tctgaaagct 480

gtttctccgc aggctccggt taccgactgg tacatcggtg acgacttcca ccacaacggt 540

gttctgttcc tgcaggacgc tttcaccttc atgtctacct tcggtgttcc gcgtccgaaa 600

ccgatcaccc cggaccagtt caaaggtaaa atccagatca aagaagctga caaatacaac 660

ttcttcgctg aagctggtac cgctcgtgaa ctgaaagaaa aatacttcgg tgactctgtt 720

cagttctgga acgacctgtt caaacacccg gactacgacg acttctggaa atctcgtgtt 780

atcaccaact ctctgcagga agttaaaccg gctgttatgg ttgttggtgg tttcttcgac 840

gctgaagacg cttacggtac cttcaaaacc taccagtcta tcgaagacaa atctaaaaaa 900

aacaactcta tcctggttgc tggtccgtgg taccacggtg gttgggttcg tgctgaaggt 960

aactacctgg gtgacatcca gttcgaaaaa aaaacctcta tcacctacca ggaacagttc 1020

gaacagccgt tcttcaaata ctacctgaaa gacgaaggta acttcgctcc gtctgaagct 1080

aacatcttcg tttctggttc taacgaatgg aaacacttcg aacagtggcc gccgaaaaac 1140

gttgaaacca aaaaactgta cttccagccg cagggtaaac tgggtttcga caaagttcag 1200

cgtaccgact cttgggacga atacgttacc gacccgaaca aaccggttcc gcaccagggt 1260

ggtctgatcc agaaccgtac ccgtgaatac atggttgacg accagcgttt cgctgcttct 1320

cgtccggacg ttatggttta ccagaccgaa ccgctgaccg aagacctgac catcgttggt 1380

ccgatcaaaa acttcctgaa agtttcttct accggtaccg acgctgacta cgttgttaaa 1440

ctgatcgacg tttacccgaa cgacgctgct tcttaccagg gtaaaaccat ggctggttac 1500

cagatgatgg ttcgtggtga aatcatggct ggtaaatacc gtaacggttt cgacaaagct 1560

caggctctga ccccgggtat ggttgaaaaa gttaacttcg aaatgccgga cgttgctcac 1620

accttcaaaa aaggtcaccg tatcatggtt caggttcaga actcttggtt cccgctggct 1680

gaacgtaacc cgcaggtttt cctggctccg tacaccgcta ccaaagctga cttccgtaaa 1740

gctacccagc gtatcttcca cgacgttaac aacgctacct acatcgaatt ctctgttctg 1800

aaagacctcg ag 1812

<210> 2

<211> 600

<212> PRT

<213> 鞘氨醇杆菌(Sphingbacterium siyangensis)

<400> 2

Met Gly Thr Ala Ala Ala Ser Ala Thr Val Ala Ala His Thr Gly Leu

1 5 10 15

Thr Gly Val Ala Ile Pro Met Ala Ala Gly Leu Leu Leu Pro Thr Ala

20 25 30

Ile Thr Ser Pro Leu Ala Leu Ser Leu Leu Thr Pro Val Leu Leu Ala

35 40 45

Ala Thr Pro Thr Thr Val Ser Pro Thr Gly Gly Ala Gly Thr Leu Leu

50 55 60

Ser Leu Gly Ala Pro Pro Gly Met Met Ala Gly Gly Thr Ile Pro Val

65 70 75 80

Thr Gly Ala Val Ala Gly Leu Thr Met Ser Gly Gly Ala Pro Gly Ala

85 90 95

Ile Ala Pro Thr Thr Thr Ser Leu Ala Leu Leu Ala Ile Ala Gly Ser

100 105 110

Thr Ala Thr Thr Ala Ala Leu Gly Thr Leu Gly Leu Ala Leu Leu Ala

115 120 125

Thr Ala Gly Leu Ala Gly Leu Thr Gly Ile Ser Thr Pro Gly Pro Thr

130 135 140

Ser Thr Val Gly Leu Val Leu Thr His Pro Ser Leu Leu Ala Val Ser

145 150 155 160

Pro Gly Ala Pro Val Thr Ala Thr Thr Ile Gly Ala Ala Pro His His

165 170 175

Ala Gly Val Leu Pro Leu Gly Ala Ala Pro Thr Pro Met Ser Thr Pro

180 185 190

Gly Val Pro Ala Pro Leu Pro Ile Thr Pro Ala Gly Pro Leu Gly Leu

195 200 205

Ile Gly Ile Leu Gly Ala Ala Leu Thr Ala Pro Pro Ala Gly Ala Gly

210 215 220

Thr Ala Ala Gly Leu Leu Gly Leu Thr Pro Gly Ala Ser Val Gly Pro

225 230 235 240

Thr Ala Ala Leu Pro Leu His Pro Ala Thr Ala Ala Pro Thr Leu Ser

245 250 255

Ala Val Ile Thr Ala Ser Leu Gly Gly Val Leu Pro Ala Val Met Val

260 265 270

Val Gly Gly Pro Pro Ala Ala Gly Ala Ala Thr Gly Thr Pro Leu Thr

275 280 285

Thr Gly Ser Ile Gly Ala Leu Ser Leu Leu Ala Ala Ser Ile Leu Val

290 295 300

Ala Gly Pro Thr Thr His Gly Gly Thr Val Ala Ala Gly Gly Ala Thr

305 310 315 320

Leu Gly Ala Ile Gly Pro Gly Leu Leu Thr Ser Ile Thr Thr Gly Gly

325 330 335

Gly Pro Gly Gly Pro Pro Pro Leu Thr Thr Leu Leu Ala Gly Gly Ala

340 345 350

Pro Ala Pro Ser Gly Ala Ala Ile Pro Val Ser Gly Ser Ala Gly Thr

355 360 365

Leu His Pro Gly Gly Thr Pro Pro Leu Ala Val Gly Thr Leu Leu Leu

370 375 380

Thr Pro Gly Pro Gly Gly Leu Leu Gly Pro Ala Leu Val Gly Ala Thr

385 390 395 400

Ala Ser Thr Ala Gly Thr Val Thr Ala Pro Ala Leu Pro Val Pro His

405 410 415

Gly Gly Gly Leu Ile Gly Ala Ala Thr Ala Gly Thr Met Val Ala Ala

420 425 430

Gly Ala Pro Ala Ala Ser Ala Pro Ala Val Met Val Thr Gly Thr Gly

435 440 445

Pro Leu Thr Gly Ala Leu Thr Ile Val Gly Pro Ile Leu Ala Pro Leu

450 455 460

Leu Val Ser Ser Thr Gly Thr Ala Ala Ala Thr Val Val Leu Leu Ile

465 470 475 480

Ala Val Thr Pro Ala Ala Ala Ala Ser Thr Gly Gly Leu Thr Met Ala

485 490 495

Gly Thr Gly Met Met Val Ala Gly Gly Ile Met Ala Gly Leu Thr Ala

500 505 510

Ala Gly Pro Ala Leu Ala Gly Ala Leu Thr Pro Gly Met Val Gly Leu

515 520 525

Val Ala Pro Gly Met Pro Ala Val Ala His Thr Pro Leu Leu Gly His

530 535 540

Ala Ile Met Val Gly Val Gly Ala Ser Thr Pro Pro Leu Ala Gly Ala

545 550 555 560

Ala Pro Gly Val Pro Leu Ala Pro Thr Thr Ala Thr Leu Ala Ala Pro

565 570 575

Ala Leu Ala Thr Gly Ala Ile Pro His Ala Val Ala Ala Ala Thr Thr

580 585 590

Ile Gly Pro Ser Val Leu Leu Ala

595 600

Claims

1.一种全细胞一步合成L-肌肽的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)构建重组载体，所述重组载体含有核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸脂酰基转移酶基因，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(2)将核苷酸序列SEQ ID NO.1所示的基因转入大肠杆菌获得重组大肠杆菌；

(3)将底物β-丙氨酸甲酯以及L-组氨酸溶于缓冲溶液，pH值为7.5-9.5；

(4)将重组大肠杆菌加入缓冲溶液中进行反应，反应温度25-42℃。

2.根据权利要求1所述的一种全细胞一步合成L-肌肽的方法，其特征在于：在所述步骤(1)、(2)中，将已知的氨基酸脂酰基核苷酸序列经密码子优化后通过基因合成获得编码21-619位氨基酸的基因片段SEQ ID NO.1，该片段5’、3’两端分别添加MscI和XhoI酶切位点；将合成基因片段和表达载体分别经MscI和XhoI酶切后，胶回收目的片段，目的片段经连接，连接产物转化大肠杆菌,在LB培养基上过夜培养，挑取单菌落培养后，获得重组大肠杆菌。

3.根据权利要求2所述的一种全细胞一步合成L-肌肽的方法，其特征在于：所述表达载体为pET22b载体。

4.根据权利要求2所述的一种全细胞一步合成L-肌肽的方法，其特征在于：所述大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)。

5.根据权利要求2所述的一种全细胞一步合成L-肌肽的方法，其特征在于：所述重组大肠杆菌接种至含100μg/ml的LB培养基中，于37℃，220rpm过夜活化培养；将活化菌液接种至2.5L体积百分比为2％的LB培养基中，于37℃，300rpm，1.5vvm通气量，培养至OD₆₀₀＝0.6-0.8，加入终浓度为0.4mM IPTG，培养温度降为25℃继续培养10h，4℃离心发酵液收集菌体。

6.根据权利要求5所述的一种全细胞一步合成L-肌肽的方法，其特征在于：所述LB培养基包括酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L,pH值为7.2。

7.根据权利要求1所述的一种全细胞一步合成L-肌肽的方法，其特征在于：所述氨基酸脂酰基转移酶来源于鞘氨醇杆菌属。