CN107326034A - 一种壳聚糖酶及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种壳聚糖酶及其基因和应用，壳聚糖酶基因的苷酸序列如SEQ ID NO:1；所述核苷酸序列编码的壳聚糖酶Csn‑PD，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2。所述壳聚糖酶Csn‑PD能够专一性降解壳聚糖产生唯一产物——壳二糖，因此可以用于高纯度壳二糖的制备，且反应条件温和，能源消耗少，无污染物产生，在酶法制备壳二糖中具有很好的工业应用前景，具有重要的经济价值。

Description

一种壳聚糖酶及其基因和应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种新型的壳聚糖酶及其基因和应用。具体地说，涉及从Paenibacillus dendritiformis分离出新型的壳聚糖酶及其基因以及其用途等。本发明的壳聚糖酶可以用于催化壳聚糖制备壳二糖。

背景技术

壳聚糖(Chitosan)是由自然界中广泛存在的甲壳素经过脱乙酰作用得到的，大量的研究表明壳聚糖在食品、化工、医药及农业等领域都有广泛的应用前景。但由于壳聚糖的溶解性问题，严重阻碍了其资源的有效利用。因此，将壳聚糖降解为寡糖后再对其加以利用是目前该领域研究的热点之一，更被列为各国的糖工程重点研究项目。壳寡糖(Chitooligosaccharide)是一类聚合度(Degree of Polymerization，DP)一般为2-20、可溶于水的氨基糖类化合物，也是目前发现的自然界中唯一带正电荷的碱性寡糖，具有优越的生物活性，被誉为第六生命要素，极具开发价值。已有研究证明壳寡糖具有独特生理活性和功能性，非常容易被人体吸收，具有杀菌、抗肿瘤、调节人体免疫功能等功效，是优良的功能性保健食品；另外在糖尿病的防治、降血糖血脂、改善骨质疏松症以及神经保护作用等方面的功效也已有相关的文献报道；另外在化妆品方面，由于壳寡糖具有保湿吸湿，且纯天然、无毒性的特点，如今已被越来越多地应用于高档化妆品中。

根据文献报道，壳寡糖的功能与其聚合度有密切关系，如聚合度为2-3的壳寡糖具有爽口甜味和良好保湿性与耐热性，又由于其降血糖的生理功能，安全性能高，且在人体内很少被消化道吸收，是糖尿病人和肥胖病人理想的功能性甜味剂；聚合度4-7的壳寡糖具有抑制癌细胞生长和转移的效果，作为肿瘤放疗的辅助性药物，能有效提高人体抗肿瘤免疫功能，对细胞分裂具有调节作用，在日本已被用作抗肿瘤功能性保健食品。聚合度为3-6的壳寡糖具有抗感染作用，而且随聚合度的增大活性增强，是颇具开发前景的药物来源。聚合度为3-7的壳寡糖能减少粪便钙排泄，与壳聚糖会减少钙的吸收作用不同，壳寡糖会增加钙和其它矿物质的吸收，效果比乳糖、Vc更好。

目前，特定聚合度壳寡糖的制备仍然是一个难题，主要制备方法包括化学法和酶解法。化学法虽然能够降解壳聚糖生成壳寡糖，但无法或很难获得分散度低的、分子质量可控的壳寡糖，而且存在环境污染、过程繁琐、重复性差、产物不均一且难以纯化等弊端。酶法制备具有反应条件温和、催化效率高、过程易于控制等优点。壳聚糖酶(Chitosanase,EC3.2.1.132)是专一性水解壳聚糖的酶，可以催化水解壳聚糖的β-1,4-糖苷键得到壳寡糖，广泛分布于细菌、真菌、病毒以及植物等生物群中，在降解壳聚糖多聚物、制备壳寡糖中发挥着重要作用。然而，目前的壳聚糖酶大多存在专一性差的问题，导致产物聚合度范围不可控。因此，获得能够专一性降解壳聚糖生成特定聚合度壳寡糖的壳聚糖酶，具有重要的理论意义和广阔的应用前景。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种壳聚糖酶及其基因和应用，即一种能够降解壳聚糖产生壳二糖的壳聚糖酶，从而弥补现有技术的不足。

本发明提供一种壳聚糖酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供所述核苷酸序列编码的壳聚糖酶Csn-PD，其氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。

本发明还提供一种转化有上述壳聚糖酶基因的基因工程菌株，工程菌为大肠杆菌；具体地，通过将所述壳聚糖酶基因构建重组表达质粒，然后转化大肠杆菌而获得。

本发明还提供所述壳聚糖酶Csn-PD或转化有上述壳聚糖酶基因的基因工程菌株在催化壳聚糖上的应用。

本发明提供的所述壳聚糖酶Csn-PD或转化有上述壳聚糖酶基因的基因工程菌株可用于催化壳聚糖生产壳二糖。

本发明与现有技术相比的有益效果：

本发明的壳聚糖酶Csn-PD能够专一性降解壳聚糖产生唯一产物——壳二糖，因此可以用于高纯度壳二糖的制备，且反应条件温和，能源消耗少，无污染物产生，在酶法制备壳二糖中具有很好的工业应用前景，具有重要的经济价值。

附图说明

图1：本发明的壳聚糖酶Csn-PD经Ni-IDA亲和层析纯化的纯酶SDS-PAGE电泳图，M为Marker。

图2：温度变化对本发明壳聚糖酶Csn-PD酶活力的影响。

图3：pH变化对本发明壳聚糖酶Csn-PD酶活力的影响。

图4：本发明的壳聚糖酶Csn-PD对壳聚糖的水解特性。

具体实施方式

下面通过实施例结合附图对本发明的方法做进一步说明。但实施例中所用到的实验条件可以根据已有技术进行选择。对于实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。

本发明人通过基因组数据库挖掘的方法分析了一些基因组序列，候选了一批在一些生物信息学上被预测为壳聚糖酶或假定壳聚糖酶基因序列。所述的挖掘方法具体为，以来自Bacillus circurans MH-K1的壳聚糖酶MH-K1的氨基酸序列为模板探针，在NCBI数据库中进行pBLAST搜索，筛选出与壳聚糖酶MH-K1同源性在30～80％的壳聚糖酶或假定壳聚糖酶序列。

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

实施例1、壳聚糖酶基因的克隆

依据上述方法从数据库中筛选出一个来自Paenibacillus dendritiformis的候选基因，根据Genbank数据库中已提交的该菌的序列信息，以其中编码壳聚糖酶(chitosanase；Genbank ID:WP_006679998.1)的目的基因序列为模板序列，经密码子优化后，进行全基因合成。

设计上游引物PDF(5'CGCGGATCCATGACCAACGCTAAAC 3'，下划线部分为BamHI酶切位点)和下游引物PDR(5'GTCGACGGAGCTCTTATTCATTTTCC 3'，下划线部分为SacI酶切位点)，以合成的目的基因为模板，进行PCR扩增。

PCR条件为94℃预变性2min；98℃变性10s；68℃延伸30s，30个循环。

PCR产物纯化后，用BamHI和SacI进行双酶切，酶切产物经纯化后与经相同双酶切过的原核表达载体pET-28a(+)连接，得到重组质粒Csn-PD/pET-28a，然后将其转入大肠杆菌DH5α中，挑取转化子进行测序验证。

测序结果显示重组质粒为在载体pET-28a(+)的BamHI和SacI位点间插入的片段序列与SEQ ID NO:1所述核酸序列完全一致。

实施例2、重组壳聚糖酶Csn-PD的表达及纯化

按常规方法将实施例1中的重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，获得生产壳聚糖酶Csn-PD的基因工程菌BL21/Csn-PD。

将上述重组菌接种至LB培养基，于37℃培养至对数生长期后，加入IPTG至终浓度0.1mmol/L，37℃继续培养20小时。离心收集菌体，并用生理盐水洗涤两次，加入一定量的NPI-0缓冲液(50mM Na₂HPO₄，0.3M NaCl，pH8.0)悬浮，配成0.1g/10mL的壳聚糖酶湿菌体悬浮液。然后在冰水浴中进行超声破菌(功率200～400W，工作3s，间隙5s，超声15min)，离心收集上清，此即为壳聚糖酶的粗酶液。粗酶液中含有重组蛋白Csn-PD，即重组壳聚糖酶Csn-PD。

基于pET-28a(+)质粒中有编码His-tag标签蛋白的序列，使用琼脂糖Ni-IDA亲和柱纯化重组蛋白Csn-PD，具体纯化步骤如下：将粗酶液上样于已经用NPI-0缓冲液(50mMNa₂HPO₄，0.3M NaCl，pH8.0)平衡好的Ni-IDA柱，先用10mL NPI-20缓冲液(50mM Na₂HPO₄，0.3M NaCl，20mM Imidazole，pH8.0)清洗柱子，然后用10mL NPI-200缓冲液(50mM Na₂HPO₄，0.3M NaCl，200mM Imidazole，pH8.0)进行洗脱，并将洗脱液收集，得到纯化的重组壳聚糖酶Csn-PD溶液。经SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度，结果如图1所示，根据图1结果，重组蛋白Csn-PD表达量较高，在约31kDa处看到清晰条带，与预期的壳聚糖酶大小吻合，命名壳聚糖酶Csn-PD。

实施例3、重组壳聚糖酶Csn-PD的酶学性质检测

将实施例2中制备得到的纯化的重组壳聚糖酶Csn-PD溶液在50mM，pH7.0的磷酸缓冲液中稀释，然后分别在20-60℃下进行反应，反应条件为：取10μL纯酶加入至990μL 50mM，pH7.0的磷酸缓冲液中，在不同的温度下温浴10min后，分别加入100μL 1％壳聚糖反应10min，随后采用DNS法测定反应液中的还原糖含量。以酶活力的最高值作为100％，结果如图2所示。结果显示重组壳聚糖酶Csn-PD的最适温度为45℃，在20-50℃均具有较高活性。

将实施例2中制备得到的纯化的重组壳聚糖酶Csn-PD溶液分别用pH4.0-8.0(柠檬酸盐缓冲液pH 4.0-6.0；磷酸盐缓冲液pH 6.0-8.0)的缓冲液稀释，然后在30℃进行反应，反应条件为：取10μL纯壳聚糖酶Csn-PD加入至990μL pH4.0-8.0不同缓冲液中孵育10min后，分别加入100μL 1％壳聚糖反应10min，随后采用DNS法测定反应液中的还原糖含量。以酶活力的最高值作为100％，结果如图3所示。结果显示重组壳聚糖酶Csn-PD的最适pH为7.0，在弱酸性环境下酶活较高，弱碱性环境则会引起酶活的显著降低。

实施例4重组壳聚糖酶Csn-PD在酶法制备壳二糖中的应用

利用实施例2制备的重组壳聚糖酶Csn-PD制备壳二糖，将壳聚糖溶于pH5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液(0.2M)，配置成1％的壳聚糖溶液。按重量比0.1-1:100加入重组壳聚糖酶Csn-PD溶液。混合均匀后在37℃反应1h，收集反应液浓缩至小于10mL，然后加入3倍体积无水乙醇，除去未分解的壳聚糖，再将溶液冻干，即得壳二糖粗品。利用薄层层析检测产物成分，结果如图4所示。

本发明的壳聚糖酶Csn-PD具有良好的生物催化活性，相对其它已报道的大部分壳聚糖酶，本发明壳聚糖酶Csn-PD在反应过程中产物组分相对单一，只有壳二糖和壳三糖产生，随着反应进行，壳三糖也逐渐降解为壳二糖，这使得其产物中掺杂其它聚合度的壳寡糖的量非常少，显示了该壳聚糖酶Csn-PD在酶法制备壳二糖方面的应用潜力。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，并不能以此限制本发明的保护范围。本领域人员可以根据本发明做各种改动或修饰，这些等效形式同样涵盖在本申请所附权利要求书所限定的范围之内。

序列表

<110> 中国水产科学研究院黄海水产研究所

<120> 一种壳聚糖酶及其基因和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 5

<211> 899

<212> DNA

<213> 壳聚糖酶(Chitosanase)

<400> 5

atgaccaacg ctaaaccggc taaaaaaatg accaaaatcc tggttgttct gctgtctttc 60

tctttcctgg tttctttctt cggtatcaac gctctgctgc cgaccaaagc ttacgctgct 120

aactctcacg acgaaaactt ctctccggaa accctgaaat tcctgcgtac caacaccggt 180

ctggacggtg aacagtggga caacatcatg aaactgatca acaaaccgga acaggactct 240

ctggactgga ccaaatacta cggttactgc gaagacatcg gtgacgaccg tggttacacc 300

atcggtatct tcggtgctac caccggtggt tctaacgaca aacacccgga cggtccgacc 360

ctgttcaaag aattcgacgc tgcttctggt gctgctaacc cgtctgttga aggtggtctg 420

gctcgtatcg gtgttaacgg ttctatgaaa ggttctatcc tgaaaatcaa agactctgaa 480

aaagttttct gcggtaaaat caaaaaactg cagaacaacg acacctggcg tgaagctatc 540

tggcagacct tctacaaagt ttacatcaaa tactctgttc agcaggctcg tcagcgtggt 600

ttcaactctg ctctgaccat cggttctttc gttgacaccg ctctgaacca gggtgctacc 660

ggtgactctg gtaccctgca gggtatcctg tctcgttctg gtaaatctac cgacgaaaaa 720

accttcatga aaaaattcta cgctgaacgt accctggttg ttgacaccaa cgactacaac 780

cagccgccga acggtaaaaa ccgtgttaaa cagtggtctc agctgtggga catgggtaaa 840

gctgacctga aaaacgctga cgacgctatc gttaaagtta cctcttggaa aatgaaata 899

<210> 3

<211> 299

<212> PRT

<213> 壳聚糖酶(Chitosanase)

<400> 3

Met Thr Asn Ala Lys Pro Ala Lys Lys Met Thr Lys Ile Leu Val Val

1 5 10 15

Leu Leu Ser Phe Ser Phe Leu Val Ser Phe Phe Gly Ile Asn Ala Leu

20 25 30

Leu Pro Thr Lys Ala Tyr Ala Ala Asn Ser His Asp Glu Asn Phe Ser

35 40 45

Pro Glu Thr Leu Lys Phe Leu Arg Thr Asn Thr Gly Leu Asp Gly Glu

50 55 60

Gln Trp Asp Asn Ile Met Lys Leu Ile Asn Lys Pro Glu Gln Asp Ser

65 70 75 80

Leu Asp Trp Thr Lys Tyr Tyr Gly Tyr Cys Glu Asp Ile Gly Asp Asp

85 90 95

Arg Gly Tyr Thr Ile Gly Ile Phe Gly Ala Thr Thr Gly Gly Ser Asn

100 105 110

Asp Lys His Pro Asp Gly Pro Thr Leu Phe Lys Glu Phe Asp Ala Ala

115 120 125

Ser Gly Ala Ala Asn Pro Ser Val Glu Gly Gly Leu Ala Arg Ile Gly

130 135 140

Val Asn Gly Ser Met Lys Gly Ser Ile Leu Lys Ile Lys Asp Ser Glu

145 150 155 160

Lys Val Phe Cys Gly Lys Ile Lys Lys Leu Gln Asn Asn Asp Thr Trp

165 170 175

Arg Glu Ala Ile Trp Gln Thr Phe Tyr Lys Val Tyr Ile Lys Tyr Ser

180 185 190

Val Gln Gln Ala Arg Gln Arg Gly Phe Asn Ser Ala Leu Thr Ile Gly

195 200 205

Ser Phe Val Asp Thr Ala Leu Asn Gln Gly Ala Thr Gly Asp Ser Gly

210 215 220

Thr Leu Gln Gly Ile Leu Ser Arg Ser Gly Lys Ser Thr Asp Glu Lys

225 230 235 240

Thr Phe Met Lys Lys Phe Tyr Ala Glu Arg Thr Leu Val Val Asp Thr

245 250 255

Asn Asp Tyr Asn Gln Pro Pro Asn Gly Lys Asn Arg Val Lys Gln Trp

260 265 270

Ser Gln Leu Trp Asp Met Gly Lys Ala Asp Leu Lys Asn Ala Asp Asp

275 280 285

Ala Ile Val Lys Val Thr Ser Trp Lys Met Lys

290 295

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgcggatcca tgaccaacgc taaa 24

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtcgacggag ctcttattca ttttcc 26

Claims (4)

1.一种壳聚糖酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1。

2.权利要求1所述核苷酸序列编码的壳聚糖酶Csn-PD，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2。

3.一种转化有权利要求1所述壳聚糖酶基因的基因工程菌株，工程菌为大肠杆菌；具体地，通过将所述壳聚糖酶基因构建重组表达质粒，然后转化大肠杆菌而获得。

4.权利要求2所述壳聚糖酶Csn-PD或转化有权利要求1所述壳聚糖酶基因的基因工程菌株在催化壳聚糖上的应用。