CN110195047A

CN110195047A - 一种新型壳聚糖酶CsnT及其应用

Info

Publication number: CN110195047A
Application number: CN201910529359.0A
Authority: CN
Inventors: 杨文钰
Original assignee: Shandong Haoyue Pharmaceutical Technology Co Ltd
Current assignee: Zaozhuang Quanding Biotechnology Co., Ltd
Priority date: 2019-06-19
Filing date: 2019-06-19
Publication date: 2019-09-03
Anticipated expiration: 2039-06-19
Also published as: CN110195047B

Abstract

本发明涉及一种新型壳聚糖酶CsnT及其应用。所述内切壳聚糖酶CsnT氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供一种壳聚糖酶CsnT的发酵和纯化方法，发酵液酶活力高达796.3 U/mL，一步纯化纯度>95%，回收率为88.9%。本发明所述壳聚糖酶CsnT性质稳定，在50℃孵育1h可保持52.4%的酶活力，降解主产物壳二糖和壳三糖，具有良好的工业化应用潜质。

Description

一种新型壳聚糖酶CsnT及其应用

技术领域

本发明涉及一种新型壳聚糖酶CsnT及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

壳寡糖被誉为“生命的第六元素”，具有广泛的抑菌、抗炎、抗肿瘤作用，被公认为有效的保健功能食品。壳寡糖由N-乙酰-D-氨基葡萄糖（GLcNAc）和D-氨基葡萄糖（GLcN）通过β-l,4-糖苷键连接而成，极易溶于水，在医药、保健品、功能食品等领域比大分子壳聚糖有更大的应用价值。

利用壳聚糖酶生物酶法降解大分子壳聚糖具有反应条件温和、降解产物单一、反应过程容易控制、环境友好等优势，逐渐成为壳寡糖制备过程中的主流方法。但是，目前市场上销售的壳聚糖酶价格昂贵、活力较低，且稳定性较差，严重限制了壳聚糖酶的应用前景。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种新型壳聚糖酶CsnT及其制备方法。本发明所述壳聚糖酶CsnT产量高达796.3 U/mL, 最适反应温度为50 ℃，在40 ℃孵育1 h可保持65.5%的酶活力，在50 ℃孵育1 h可保持52.4%的酶活力。降解主产物为壳二糖和壳三糖。本发明所述壳聚糖酶CsnT产量高、制备方法简单、纯度高、稳定性好，具有良好的工业化应用潜质。

一方面，本发明提供一种新型壳聚糖酶CsnT，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

SEQ ID NO.1：

SKLVSZGAPVPNLRTRTVAVAVGGVHKLIASGAIAGTAAQANAVSSLAPAITAVSAASTGDLSAPAKKEIAMQLVCSAENSSLDWKAQYGSGTGDMLELVQNYANTKPDYIEDIDEDRGYTGGIIGFTNNVLKPFLPVLRKVNGTKSHEGLGQKYVDAWHQAAKDSVFLKEQDKVRDSMYFNPRKVSQGKSDGLSNLGQFMYYDAIFMHGPGDSSDSFGGIRKSAMKNAKTPAQGGDEKTYLQAFATARKKIMKQENAHSDTSRVRTVDAQLKFLNEGNYDLHTPLKWKVYGDPYEIK

另一方面，本发明还提供一种壳聚糖酶CsnT对应的核酸序列，如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.2：

AGTAAATTAGTTAGTGGTGCTCCTGTTCCTAATTTAAGAACTAGAACTGTTGCTGTTGCTGTTGGTGGTGTTCATAAATTAATTGCTAGTGGTGCTATTGCTGGTACTGCTGCTCAAGCTAATGCTGTTAGTAGTTTAGCTCCTGCTATTACTGCTGTTAGTGCTGCTAGTACTGGTGATTTAAGTGCTCCTGCTAAAAAAGAAATTGCTATGCAATTAGTTTGTAGTGCTGAAAATAGTAGTTTAGATTGGAAAGCTCAATATGGTAGTGGTACTGGTGATATGTTAGAATTAGTTCAAAATTATGCTAATACTAAACCTGATTATATTGAAGATATTGATGAAGATAGAGGTTATACTGGTGGTATTATTGGTTTTACTAATAATGTTTTAAAACCTTTTTTACCTGTTTTAAGAAAAGTTAATGGTACTAAAAGTCATGAAGGTTTAGGTCAAAAATATGTTGATGCTTGGCATCAAGCTGCTAAAGATAGTGTTTTTTTAAAAGAACAAGATAAAGTTAGAGATAGTATGTATTTTAATCCTAGAAAAGTTAGTCAAGGTAAAAGTGATGGTTTAAGTAATTTAGGTCAATTTATGTATTATGATGCTATTTTTATGCATGGTCCTGGTGATAGTAGTGATAGTTTTGGTGGTATTAGAAAAAGTGCTATGAAAAATGCTAAAACTCCTGCTCAAGGTGGTGATGAAAAAACTTATTTACAAGCTTTTGCTACTGCTAGAAAAAAAATTATGAAACAAGAAAATGCTCATAGTGATACTAGTAGAGTTAGAACTGTTGATGCTCAATTAAAATTTTTAAATGAAGGTAATTATGATTTACATACTCCTTTAAAATGGAAAGTTTATGGTGATCCTTATGAAATTAAA

另一方面，本发明还提供一种壳聚糖酶CsnT的制备与纯化方法。

另一方面，本发明还提供了所述壳聚糖酶CsnT在降解壳聚糖中的应用。

另一方面，一种降解壳聚糖的方法，所选用的壳聚糖酶为CsnT。

优选：所述降解条件中反应温度为0~70℃。最适反应温度为50℃。

有益效果：

1.本发明的壳聚糖酶CsnT为新颖的壳聚糖酶，在《Genbank》数据库中与本发明所述壳聚糖酶CsnT最高氨基酸序列相似度仅为83.81%，说明本发明的壳聚糖酶CsnT为序列和结构新颖的壳聚糖酶。

2.本发明提供了一种制备壳聚糖酶CsnT的方法，即利用基因工程的技术方法，将壳聚糖酶CsnT的基因序列异源重组表达到大肠杆菌，经发酵后，发酵液酶活力高达796.3U/mL，具有工业化生产的潜质。该酶纯化方法简单，利用镍柱对其进行一步亲和纯化，回收率高达88.9%，蛋白质纯度>95%。

3.本发明的壳聚糖酶CsnT具有优良的理化性质，最适pH为6.0，在pH 4.0-6.0范围内保持稳定，40 ℃孵育1 h仍然保持70.6%的活性。降解方式为内切，降解主产物壳二糖和壳三糖。

综上所述，本发明所述壳聚糖酶CsnT序列新颖、产量高、稳定性好，具有良好的工业化应用潜质。

附图说明

图1为本发明壳聚糖酶CsnT的蛋白质分离纯化图（M，蛋白质标准品；1，纯化前样品，2，纯化所得壳聚糖酶CsnT）；

图2为本发明壳聚糖酶CsnT的最适反应温度分析

图3为本发明壳聚糖酶CsnT的温度稳定性分析

图4为薄层层析（TLC）法检测本发明壳聚糖酶CsnT的降解方式和酶解产物（M，DP1-3，壳寡糖1-3糖标准品）。

具体实施方式

实施例1 壳聚糖酶CsnT的序列分析

本发明所述壳聚糖酶CsnT的产酶基因csnT为人工合成序列。前期研究中，我们发现海洋细菌Renibacterium sp. T109具有较高的壳聚糖酶活性，对其进行全基因测序时，发现其含有一个预测的壳聚糖酶序列。在氨基酸序列不变的情况下，我们将该基因序列根据宿主（大肠杆菌的）的密码子偏好性，进行了碱基序列优化，利于其在大肠杆菌中进行高效表达。本发明所述壳聚糖酶CsnT包含有891个碱基序列，编码298个氨基酸序列。利用NCBI中的保守结构域Conserved domain (CDD)分析，发现该序列包含有一个多糖水解酶第46家族（GH-46）的保守区。多重序列比对Basic Local Alignment Search Tool (Blast)发现，在《Genbank》数据库中，与本发明所述的壳聚糖酶CsnT氨基酸序列相似度最高的为Renibacterium salmoninarum菌株中的壳聚糖酶（WP_012246499.1）。经过Clustal W软件分析发现，两者之间的序列相似度仅为83.81%，具有较大的差异性。我们深入分析发现壳聚糖酶（WP_012246499.1）为预测蛋白，并未有文献报道其生物学功能。该序列含有314个氨基酸序列，其中99-302个氨基酸预测为第46家族的壳聚糖酶。

将壳聚糖酶CsnT的碱基序列以限制性内切酶Nco I和Xho I为酶切位点，设计重组引物如下（下划线为限制性内切酶位点，斜体为限制性内切酶保护碱基）：

正向引物：PcsnT-F：

5’- CATGCCATGG AGTAAATTAGTTAGTGGTGCTCC-3’ (Nco I)

反向引物：PcsnT-R：

5’- CCGCTCGAGTTTAATTTCATAAGGATCAC-3’ (Xho I)

PCR扩增条件为：94℃预变性3 min；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1 min，共30个循环；72℃延伸5 min；4℃稳定15 min。PCR反应所用DNA聚合酶为Primerstar HS购自大连宝生物公司。

PCR产物用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的PCR产物。pET22b (+)质粒DNA（美国Invitrogen公司），同样用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳并回收酶切后的产物片段。酶切所用酶和底物反应体系（温度、时间、DNA用量等）均参照大连宝生物提供的产品说明操作。

双酶切处理的PCR产物和pET-22b(+)质粒载体参照DNA连接酶（大连宝生物公司）说明书进行连接反应；连接产物转化至大肠杆菌DH5α菌株（美国Invitrogen公司），涂布在Luria-Bertani (LB)培养基固体平板上（含有50 μg/mL氨苄青霉素的），37℃温箱中培养12-16小时后，挑取单克隆；将单克隆转接至LB液体培养基中（含有50 μg/mL氨苄青霉素），转速为180 rpm的37℃摇床中培养过夜。将单克隆进行序列测定，选择阳性克隆，并将其命名为pET22b-csnT。重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)（购自大连宝生物公司），将重组大肠菌株命名为BL21(DE3)/pET22b-csnT，保存在-80℃备用。

实施例2 壳聚糖酶CsnT的制备及纯化方法

将重组菌株BL21(DE3)/pET22b-csnT在100 mL的LB液体培养基中（50 μg/mL氨苄青霉素），在37℃摇床中180 rpm震荡培养至OD₆₀₀=0.6，加入终浓度为0.1 mM的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），在20℃诱导20 h。壳聚糖酶CsnT活性的标准测定方法为：100 μL酶液加入900 μL 0.3%壳聚糖底物（20 mM 醋酸-醋酸钠，pH=6.0），在50℃下反应10 min，加入750 μL的DNS试剂，沸水中反应10 min进行显色，在OD520下检测其吸光度。酶活力定义为1U为每min产生1 μM还原糖所需要的酶量。经检测，发酵液中壳聚糖酶活力可达796.3 U/mL。

发酵停止后，12000 rpm离心10 min，弃菌体，收集上清液；发酵上清液上样于10mL镍离子亲和层析柱，上样流速为5 mL/min，利用10 mM咪唑洗脱，去除杂蛋白，再利用150mM的咪唑洗脱，收集洗脱组分。将活性成分透析去除咪唑，分装储存在-20℃备用。通过镍离子一步亲和纯化，蛋白回收率达到88.9%。纯化所得壳聚糖酶CsnT进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），如图1所示，壳聚糖酶CsnT的分子量为33 kDa左右，与序列分析中预测的蛋白大小一致。通过凝胶分析发现，纯化所得壳聚糖酶CsnT的蛋白纯度达到95%以上。

实施例3 温度对壳聚糖酶CsnT的影响

将实施例2中纯化所得壳聚糖酶CsnT在不同条件下进行酶活力测定，检测不同温度和pH对酶活力的影响。在不同温度（0-70℃）下反应10 min，检测不同反应温度对酶活力的影响，以最高酶活力为100%，计算不同温度下壳聚糖酶CsnT的相对酶活力。如图2所示，壳聚糖酶CsnT的最适反应温度为50℃。

将实施例2中纯化所得壳聚糖酶CsnT在不同温度（0-70 ℃）下孵育1 h，取出后，在其最适反应温度（50℃）下检测其酶活力，以孵育前的活力作为100%，如图3所示，壳聚糖酶CsnT温度稳定性较好，在40 ℃下孵育1 h，酶活性可达到孵育前的65.5%，在50 ℃下孵育1h，酶活性可达到孵育前的52.4%。说明该酶具有良好的温度稳定性，利于其后续应用。

实施例4 壳聚糖酶CsnT酶解产物薄层层析分析

将实施例2中纯化所得壳聚糖酶CsnT与0.3%壳聚糖在50℃下分别孵育1 h，然后在高效薄层层析板（HPTLC）检测。具体为：将HPTLC层析板裁剪成7 cm宽合适大小的样本，将孵育前后样品点样在原点处，置于有展开剂（正丁醇:冰醋酸:水=2:2:1）的展缸中30 min，吹干层析板，浸入显色剂（0.5%茚三酮乙醇溶液）中2s，取出吹干，80℃烘烤，至样品出现。如图4所示，与标准品迁徙率比较发现，壳聚糖酶CsnT酶解主产物为壳二糖（DP2）和壳三糖（DP3）。

序列表

<110> 山东昊岳医药科技有限公司

<120> 一种新型壳聚糖酶CsnT及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 298

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ser Lys Leu Val Ser Glx Gly Ala Pro Val Pro Asn Leu Arg Thr Arg

1 5 10 15

Thr Val Ala Val Ala Val Gly Gly Val His Lys Leu Ile Ala Ser Gly

20 25 30

Ala Ile Ala Gly Thr Ala Ala Gln Ala Asn Ala Val Ser Ser Leu Ala

35 40 45

Pro Ala Ile Thr Ala Val Ser Ala Ala Ser Thr Gly Asp Leu Ser Ala

50 55 60

Pro Ala Lys Lys Glu Ile Ala Met Gln Leu Val Cys Ser Ala Glu Asn

65 70 75 80

Ser Ser Leu Asp Trp Lys Ala Gln Tyr Gly Ser Gly Thr Gly Asp Met

85 90 95

Leu Glu Leu Val Gln Asn Tyr Ala Asn Thr Lys Pro Asp Tyr Ile Glu

100 105 110

Asp Ile Asp Glu Asp Arg Gly Tyr Thr Gly Gly Ile Ile Gly Phe Thr

115 120 125

Asn Asn Val Leu Lys Pro Phe Leu Pro Val Leu Arg Lys Val Asn Gly

130 135 140

Thr Lys Ser His Glu Gly Leu Gly Gln Lys Tyr Val Asp Ala Trp His

145 150 155 160

Gln Ala Ala Lys Asp Ser Val Phe Leu Lys Glu Gln Asp Lys Val Arg

165 170 175

Asp Ser Met Tyr Phe Asn Pro Arg Lys Val Ser Gln Gly Lys Ser Asp

180 185 190

Gly Leu Ser Asn Leu Gly Gln Phe Met Tyr Tyr Asp Ala Ile Phe Met

195 200 205

His Gly Pro Gly Asp Ser Ser Asp Ser Phe Gly Gly Ile Arg Lys Ser

210 215 220

Ala Met Lys Asn Ala Lys Thr Pro Ala Gln Gly Gly Asp Glu Lys Thr

225 230 235 240

Tyr Leu Gln Ala Phe Ala Thr Ala Arg Lys Lys Ile Met Lys Gln Glu

245 250 255

Asn Ala His Ser Asp Thr Ser Arg Val Arg Thr Val Asp Ala Gln Leu

260 265 270

Lys Phe Leu Asn Glu Gly Asn Tyr Asp Leu His Thr Pro Leu Lys Trp

275 280 285

Lys Val Tyr Gly Asp Pro Tyr Glu Ile Lys

290 295

<210> 2

<211> 891

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agtaaattag ttagtggtgc tcctgttcct aatttaagaa ctagaactgt tgctgttgct 60

gttggtggtg ttcataaatt aattgctagt ggtgctattg ctggtactgc tgctcaagct 120

aatgctgtta gtagtttagc tcctgctatt actgctgtta gtgctgctag tactggtgat 180

ttaagtgctc ctgctaaaaa agaaattgct atgcaattag tttgtagtgc tgaaaatagt 240

agtttagatt ggaaagctca atatggtagt ggtactggtg atatgttaga attagttcaa 300

aattatgcta atactaaacc tgattatatt gaagatattg atgaagatag aggttatact 360

ggtggtatta ttggttttac taataatgtt ttaaaacctt ttttacctgt tttaagaaaa 420

gttaatggta ctaaaagtca tgaaggttta ggtcaaaaat atgttgatgc ttggcatcaa 480

gctgctaaag atagtgtttt tttaaaagaa caagataaag ttagagatag tatgtatttt 540

aatcctagaa aagttagtca aggtaaaagt gatggtttaa gtaatttagg tcaatttatg 600

tattatgatg ctatttttat gcatggtcct ggtgatagta gtgatagttt tggtggtatt 660

agaaaaagtg ctatgaaaaa tgctaaaact cctgctcaag gtggtgatga aaaaacttat 720

ttacaagctt ttgctactgc tagaaaaaaa attatgaaac aagaaaatgc tcatagtgat 780

actagtagag ttagaactgt tgatgctcaa ttaaaatttt taaatgaagg taattatgat 840

ttacatactc ctttaaaatg gaaagtttat ggtgatcctt atgaaattaa a 891

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

catgccatgg agtaaattag ttagtggtgc tcc 33

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccgctcgagt ttaatttcat aaggatcac 29

Claims

1.一种新型壳聚糖酶CsnT，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的壳聚糖酶CsnT所对应的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

3.如权利要求1所述的壳聚糖酶CsnT的制备与纯化方法。

4.如权利要求1所述的壳聚糖酶CsnT在降解壳聚糖中的应用。

5.一种降解壳聚糖的方法，其特征是，所选用的壳聚糖酶为权利要求1所述的壳聚糖酶CsnT。

6.如权利要求5所述的方法，其特征是，降解条件中反应温度为0~70℃，最适反应温度为50℃。