CN110272888A

CN110272888A - 一种新型硫酸软骨素酶CslF及其应用

Info

Publication number: CN110272888A
Application number: CN201910627377.2A
Authority: CN
Inventors: 杨文钰
Original assignee: Shandong Haoyue Pharmaceutical Technology Co Ltd
Current assignee: QINGDAO WANTUMING BIOLOGICAL PRODUCTS Co.,Ltd.
Priority date: 2019-07-12
Filing date: 2019-07-12
Publication date: 2019-09-24
Anticipated expiration: 2039-07-12
Also published as: CN110272888B

Abstract

本发明涉及一种深海微生物来源硫酸软骨素酶CslF及其应用。所述硫酸软骨素酶CslF氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供一种硫酸软骨素酶CslF的重组表达及纯化制备方法，发酵液酶活力可达39.4 U/mL，一步纯化纯度>95%，回收率为84.6%。本发明所述硫酸软骨素酶CslF具有嗜冷特性，最适反应温度为30℃，在0℃,10℃,20℃下检测活性可达到最适反应温度下的51.9%，74.3%和86.1%。所述硫酸软骨素酶CslF降解主产物为二糖和四糖，具有良好的应用潜质。

Description

一种新型硫酸软骨素酶CslF及其应用

技术领域

本发明涉及一种深海微生物来源硫酸软骨素酶CslF及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

硫酸软骨素（Chondroitin sulfate），主要为动物（猪、牛、马、羊、鸡、鲨鱼等）的软骨为原料的一种高分子酸性粘多糖，其分子结构为β-D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基半乳糖通过β1→3糖苷键形成的重复二糖单位所组成的多糖链。它是一种白色或微黄色粉末，吸水性强，大量研究表明，硫酸软骨素具有降血脂、抗动脉粥样硬化和抗病毒性肝炎等活性，临床中已用于防治关节炎、肾炎、神经痛、偏头痛等。相比大分子硫酸软骨素，硫酸软骨素寡糖分子具有易于吸收，穿透性强，分布广等优势，在临床上效果更佳。

相比传统的酸解法，利用硫酸软骨素酶生物酶法降解大分子硫酸软骨素具有反应条件温和、降解产物单一、反应过程容易控制、环境友好等优势，成为硫酸软骨素寡糖制备过程中的重要方法。但是，目前市场上销售的硫酸软骨素酶价格昂贵、活力较低，品种单一，无法满足特定条件下的应用，因此急需开发新的硫酸软骨素酶。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种深海微生物来源硫酸软骨素酶CslF及其制备方法。本发明所述硫酸软骨素酶CslF产量高达39.4 U/mL，一步纯化纯度>95%，回收率为84.6%。本发明所述硫酸软骨素酶CslF具有嗜冷特性，最适反应温度为30 ℃，在0 ℃，10℃，20 ℃下检测活性可达到最适反应温度下的51.9%，74.3%和86.1%。所述硫酸软骨素酶CslF降解主产物为硫酸软骨素二糖和四糖，具有良好的应用潜质。

一方面，本发明提供一种新型硫酸软骨素酶CslF，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

SEQ ID NO.1：

VPGKEILVTTQTELYYGHKVKPGDVIVMKDGVWTDVVINGNVIAVVTEVITLRAQIPGKVVLNGGVKLIGVKPNLVVQGLLGKKGVITKKDAVVIVGEVENCRLTNVGIIDYNPADGNTEYYWVLFNGVHNRVDHCYFTGKVNKQPVMQNGEENARYNKVDRCYIKDIPYVAKANGREILRIFGYGHADQPGDDGAYFTVEYNLFDHAHGEGTEIVVLKVNHNIVRYNTVIAVRGGLVGRRGKFNTFEGNFVFGKGEGYTVGIRVAGPFHRVINNYVADVTEDGLRLIAGEYYEKVLTGNFAAKKKNLPKYLQVQDCYIAQNTFVNCGENGINIGFNYKNQWPVLQMVLFPENNKFVNNLVYNCKGNAINIEVLDTTTPLDVFHFKPNFFEVNLVFGVKICNVVLPVGIIKVDPKLKLGVDGLYRLVVKVPAINNGADVDAKDDFEGVLRDAKR

另一方面，本发明还提供一种硫酸软骨素酶CslF对应的核酸序列，如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.2：

GTTCCGGGTAAAGAAATCCTGGTTACCACCCAGACCGAACTGTACTACGGTCACAAAGTTAAACCGGGTGACGTTATCGTTATGAAAGACGGTGTTTGGACCGACGTTGTTATCAACGGTAACGTTATCGCTGTTGTTACCGAAGTTATCACCCTGCGTGCTCAGATCCCGGGTAAAGTTGTTCTGAACGGTGGTGTTAAACTGATCGGTGTTAAACCGAACCTGGTTGTTCAGGGTCTGCTGGGTAAAAAAGGTGTTATCACCAAAAAAGACGCTGTTGTTATCGTTGGTGAAGTTGAAAACTGCCGTCTGACCAACGTTGGTATCATCGACTACAACCCGGCTGACGGTAACACCGAATACTACTGGGTTCTGTTCAACGGTGTTCACAACCGTGTTGACCACTGCTACTTCACCGGTAAAGTTAACAAACAGCCGGTTATGCAGAACGGTGAAGAAAACGCTCGTTACAACAAAGTTGACCGTTGCTACATCAAAGACATCCCGTACGTTGCTAAAGCTAACGGTCGTGAAATCCTGCGTATCTTCGGTTACGGTCACGCTGACCAGCCGGGTGACGACGGTGCTTACTTCACCGTTGAATACAACCTGTTCGACCACGCTCACGGTGAAGGTACCGAAATCGTTGTTCTGAAAGTTAACCACAACATCGTTCGTTACAACACCGTTATCGCTGTTCGTGGTGGTCTGGTTGGTCGTCGTGGTAAATTCAACACCTTCGAAGGTAACTTCGTTTTCGGTAAAGGTGAAGGTTACACCGTTGGTATCCGTGTTGCTGGTCCGTTCCACCGTGTTATCAACAACTACGTTGCTGACGTTACCGAAGACGGTCTGCGTCTGATCGCTGGTGAATACTACGAAAAAGTTCTGACCGGTAACTTCGCTGCTAAAAAAAAAAACCTGCCGAAATACCTGCAGGTTCAGGACTGCTACATCGCTCAGAACACCTTCGTTAACTGCGGTGAAAACGGTATCAACATCGGTTTCAACTACAAAAACCAGTGGCCGGTTCTGCAGATGGTTCTGTTCCCGGAAAACAACAAATTCGTTAACAACCTGGTTTACAACTGCAAAGGTAACGCTATCAACATCGAAGTTCTGGACACCACCACCCCGCTGGACGTTTTCCACTTCAAACCGAACTTCTTCGAAGTTAACCTGGTTTTCGGTGTTAAAATCTGCAACGTTGTTCTGCCGGTTGGTATCATCAAAGTTGACCCGAAACTGAAACTGGGTGTTGACGGTCTGTACCGTCTGGTTGTTAAAGTTCCGGCTATCAACAACGGTGCTGACGTTGACGCTAAAGACGACTTCGAAGGTGTTCTGCGTGACGCTAAACGT

另一方面，本发明还提供一种硫酸软骨素酶CslF的制备与纯化方法。

另一方面，本发明还提供了所述硫酸软骨素酶CslF在降解硫酸软骨素中的应用。

另一方面，一种降解硫酸软骨素的方法，所选用的硫酸软骨素酶为CslF。

优选：所述降解条件中反应温度为0~60℃。最适反应温度为30℃。

有益效果：

1.本发明的硫酸软骨素酶CslF为新颖的硫酸软骨素酶，在《Genbank》数据库中与本发明所述硫酸软骨素酶CslF最高氨基酸序列相似度仅为90.97%，说明本发明的硫酸软骨素酶CslF为序列和结构新颖的硫酸软骨素酶。

2.本发明提供了一种制备硫酸软骨素酶CslF的方法，即利用基因工程的技术方法，将硫酸软骨素酶CslF的基因序列异源重组表达到大肠杆菌，经发酵后，发酵液酶活力达到39.4 U/mL。该酶纯化方法简单，利用镍柱对其进行一步亲和纯化，回收率高达84.6%，蛋白质纯度>95%。

3.本发明所述硫酸软骨素酶CslF具有嗜冷特性，最适反应温度为30 ℃，在0 ℃，10 ℃，20 ℃下检测活性可达到最适反应温度下的51.9%，74.3%和86.1%，可满足在低温下应用的社会需求。

综上所述，本发明所述硫酸软骨素酶CslF序列新颖、产量高、制备简单、性质特殊，具有良好的工业化应用潜质。

附图说明

图1为本发明硫酸软骨素酶CslF的蛋白质分离纯化图（M，蛋白质标准品；1，纯化所得硫酸软骨素酶CslF）；

图2为本发明硫酸软骨素酶CslF的最适反应温度分析

图3为本发明硫酸软骨素酶CslF的温度稳定性分析

图4为薄层层析（TLC）法检测本发明硫酸软骨素酶CslF的降解方式和酶解产物（M，DP2，4，硫酸软骨素寡糖2，4糖标准品；0-3分别为降解0, 15, 30, 60 min样品）；

具体实施方式

实施例1 硫酸软骨素酶CslF的序列分析

本发明所述硫酸软骨素酶CslF的产酶基因CslF为人工合成序列。前期研究中，我们发现深海细菌Flavobacterium sp. F103具有较高的硫酸软骨素酶活性，对其进行全基因测序时，发现其含有一个预测的硫酸软骨素酶序列，将其命名为cslF。在氨基酸序列不变的情况下，我们将该基因序列根据宿主（大肠杆菌的）的密码子偏好性，进行了碱基序列优化，利于其在大肠杆菌中进行高效表达。本发明所述硫酸软骨素酶CslF包含有1362个碱基序列，编码454个氨基酸序列。利用NCBI中的保守结构域Conserved domain (CDD)分析，发现该序列包含有一个多糖裂解酶第6家族（PL-6）的保守区。多重序列比对Basic Local AlignmentSearch Tool (Blast)发现，在《Genbank》数据库中，与本发明所述的硫酸软骨素酶CslF氨基酸序列相似度最高的为Flavobacterium sp. GS13菌株中的硫酸软骨素酶（WP_133274971.1）。经过Clustal W软件分析发现，两者之间的序列相似度为90.97%。我们深入分析发现《Genbank》中硫酸软骨素酶（WP_133274971.1）为预测蛋白，并未有文献报道其生物学功能。该序列含有519个氨基酸序列，与本发明所述硫酸软骨素酶CslF具有较大差异。

将硫酸软骨素酶CslF的碱基序列以限制性内切酶Nco I和Xho I为酶切位点，设计重组引物如下（下划线为限制性内切酶位点，斜体为限制性内切酶保护碱基）：

正向引物：PCslF-F：

5’- CATGCCATGGGTTCCGGGTAAAGAAATCCTG-3’ (Nco I)

反向引物：PCslF-R：

5’- CCGCTCGAGACGTTTAGCGTCACGCAGAACAC-3’ (Xho I)

PCR扩增条件为：94℃预变性3 min；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1 min，共30个循环；72℃延伸2 min；4℃稳定15 min。PCR反应所用DNA聚合酶为Primerstar HS购自大连宝生物公司。

PCR产物用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的PCR产物。pET22b (+)质粒DNA（美国Invitrogen公司），同样用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳并回收酶切后的产物片段。酶切所用酶和底物反应体系（温度、时间、DNA用量等）均参照大连宝生物提供的产品说明操作。

双酶切处理的PCR产物和pET-22b(+)质粒载体参照DNA连接酶（大连宝生物公司）说明书进行连接反应；连接产物转化至大肠杆菌DH5α菌株（美国Invitrogen公司），涂布在Luria-Bertani (LB)培养基固体平板上（含有50 μg/mL氨苄青霉素的），37℃温箱中培养12-16小时后，挑取单克隆；将单克隆转接至LB液体培养基中（含有50 μg/mL氨苄青霉素），转速为180 rpm的37℃摇床中培养过夜。将单克隆进行序列测定，选择阳性克隆，并将其命名为pET22b-CslF。重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)（购自大连宝生物公司），将重组大肠菌株命名为BL21(DE3)/pET22b-CslF，保存在-80℃备用。

实施例2 硫酸软骨素酶CslF的制备及纯化方法

将重组菌株BL21(DE3)/pET22b-CslF在100 mL的LB液体培养基中（50 μg/mL氨苄青霉素），在37℃摇床中180 rpm震荡培养至OD₆₀₀=0.6，加入终浓度为0.1 mM的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），在20℃诱导20 h。硫酸软骨素酶CslF活性的标准测定方法为：100μL酶液加入900 μL 0.3%硫酸软骨素底物（20 mM 醋酸-醋酸钠，pH=6.0），在30℃下反应10min，加入750 μL的DNS试剂，沸水中反应10 min进行显色，在OD520下检测其吸光度。酶活力定义为1 U为每min产生1 μM还原糖所需要的酶量。经检测，发酵液中硫酸软骨素酶活力可达39.4 U/mL。

发酵停止后，12000 rpm离心10 min，弃菌体，收集上清液；发酵上清液上样于10mL镍离子亲和层析柱，上样流速为5 mL/min，利用10 mM咪唑洗脱，去除杂蛋白，再利用150mM的咪唑洗脱，收集洗脱组分。将活性成分透析去除咪唑，分装储存在-20℃备用。通过镍离子一步亲和纯化，蛋白回收率达到84.6%。纯化所得硫酸软骨素酶CslF进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），如图1所示，硫酸软骨素酶CslF的分子量为50 kDa左右，与序列分析中预测的蛋白大小一致（50.4 kDa）。通过凝胶分析发现，纯化所得硫酸软骨素酶CslF的蛋白纯度达到95%以上。

实施例3 温度对硫酸软骨素酶CslF的影响

将实施例2中纯化所得硫酸软骨素酶CslF在不同条件下进行酶活力测定，检测不同温度和pH对酶活力的影响。在不同温度（0-60℃）下反应10 min，检测不同反应温度对酶活力的影响，以最高酶活力为100%，计算不同温度下硫酸软骨素酶CslF的相对酶活力。如图2所示，硫酸软骨素酶CslF的最适反应温度为30℃。本发明所述硫酸软骨素酶CslF具有嗜冷特性，在0 ℃，10 ℃，20 ℃下检测活性可达到最适反应温度下的51.9%，74.3%和86.1%，可满足在低温下应用的社会需求。

将实施例2中纯化所得硫酸软骨素酶CslF在不同温度（0-60 ℃）下孵育1 h，取出后，在其最适反应温度（30℃）下检测其酶活力，以孵育前的活力作为100%，如图3所示，硫酸软骨素酶CslF在0-30 ℃下保持稳定，酶活力可保留80%以上，利于其后续应用。

实施例4 硫酸软骨素酶CslF酶解产物薄层层析分析

将实施例2中纯化所得硫酸软骨素酶CslF与0.3%硫酸软骨素在50℃下分别孵育0，15，30，60 min，然后在高效薄层层析板（HPTLC）检测。具体为：将HPTLC层析板裁剪成7 cm宽合适大小的样本，将孵育前后样品点样在原点处，置于有展开剂（正丁醇:冰醋酸:水=2:2:1）的展缸中30 min，吹干层析板，浸入显色剂（0.5%茚三酮乙醇溶液）中2s，取出吹干，80℃烘烤，至样品出现。如图4所示，与标准品迁徙率比较发现，硫酸软骨素酶CslF酶解主产物为二糖（DP2）和四糖（DP4）。

序列表

<110> 山东昊岳医药科技有限公司

<120> 一种新型硫酸软骨素酶CslF及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 454

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Val Pro Gly Lys Glu Ile Leu Val Thr Thr Gln Thr Glu Leu Tyr Tyr

1 5 10 15

Gly His Lys Val Lys Pro Gly Asp Val Ile Val Met Lys Asp Gly Val

20 25 30

Trp Thr Asp Val Val Ile Asn Gly Asn Val Ile Ala Val Val Thr Glu

35 40 45

Val Ile Thr Leu Arg Ala Gln Ile Pro Gly Lys Val Val Leu Asn Gly

50 55 60

Gly Val Lys Leu Ile Gly Val Lys Pro Asn Leu Val Val Gln Gly Leu

65 70 75 80

Leu Gly Lys Lys Gly Val Ile Thr Lys Lys Asp Ala Val Val Ile Val

85 90 95

Gly Glu Val Glu Asn Cys Arg Leu Thr Asn Val Gly Ile Ile Asp Tyr

100 105 110

Asn Pro Ala Asp Gly Asn Thr Glu Tyr Tyr Trp Val Leu Phe Asn Gly

115 120 125

Val His Asn Arg Val Asp His Cys Tyr Phe Thr Gly Lys Val Asn Lys

130 135 140

Gln Pro Val Met Gln Asn Gly Glu Glu Asn Ala Arg Tyr Asn Lys Val

145 150 155 160

Asp Arg Cys Tyr Ile Lys Asp Ile Pro Tyr Val Ala Lys Ala Asn Gly

165 170 175

Arg Glu Ile Leu Arg Ile Phe Gly Tyr Gly His Ala Asp Gln Pro Gly

180 185 190

Asp Asp Gly Ala Tyr Phe Thr Val Glu Tyr Asn Leu Phe Asp His Ala

195 200 205

His Gly Glu Gly Thr Glu Ile Val Val Leu Lys Val Asn His Asn Ile

210 215 220

Val Arg Tyr Asn Thr Val Ile Ala Val Arg Gly Gly Leu Val Gly Arg

225 230 235 240

Arg Gly Lys Phe Asn Thr Phe Glu Gly Asn Phe Val Phe Gly Lys Gly

245 250 255

Glu Gly Tyr Thr Val Gly Ile Arg Val Ala Gly Pro Phe His Arg Val

260 265 270

Ile Asn Asn Tyr Val Ala Asp Val Thr Glu Asp Gly Leu Arg Leu Ile

275 280 285

Ala Gly Glu Tyr Tyr Glu Lys Val Leu Thr Gly Asn Phe Ala Ala Lys

290 295 300

Lys Lys Asn Leu Pro Lys Tyr Leu Gln Val Gln Asp Cys Tyr Ile Ala

305 310 315 320

Gln Asn Thr Phe Val Asn Cys Gly Glu Asn Gly Ile Asn Ile Gly Phe

325 330 335

Asn Tyr Lys Asn Gln Trp Pro Val Leu Gln Met Val Leu Phe Pro Glu

340 345 350

Asn Asn Lys Phe Val Asn Asn Leu Val Tyr Asn Cys Lys Gly Asn Ala

355 360 365

Ile Asn Ile Glu Val Leu Asp Thr Thr Thr Pro Leu Asp Val Phe His

370 375 380

Phe Lys Pro Asn Phe Phe Glu Val Asn Leu Val Phe Gly Val Lys Ile

385 390 395 400

Cys Asn Val Val Leu Pro Val Gly Ile Ile Lys Val Asp Pro Lys Leu

405 410 415

Lys Leu Gly Val Asp Gly Leu Tyr Arg Leu Val Val Lys Val Pro Ala

420 425 430

Ile Asn Asn Gly Ala Asp Val Asp Ala Lys Asp Asp Phe Glu Gly Val

435 440 445

Leu Arg Asp Ala Lys Arg

450

<210> 2

<211> 1362

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gttccgggta aagaaatcct ggttaccacc cagaccgaac tgtactacgg tcacaaagtt 60

aaaccgggtg acgttatcgt tatgaaagac ggtgtttgga ccgacgttgt tatcaacggt 120

aacgttatcg ctgttgttac cgaagttatc accctgcgtg ctcagatccc gggtaaagtt 180

gttctgaacg gtggtgttaa actgatcggt gttaaaccga acctggttgt tcagggtctg 240

ctgggtaaaa aaggtgttat caccaaaaaa gacgctgttg ttatcgttgg tgaagttgaa 300

aactgccgtc tgaccaacgt tggtatcatc gactacaacc cggctgacgg taacaccgaa 360

tactactggg ttctgttcaa cggtgttcac aaccgtgttg accactgcta cttcaccggt 420

aaagttaaca aacagccggt tatgcagaac ggtgaagaaa acgctcgtta caacaaagtt 480

gaccgttgct acatcaaaga catcccgtac gttgctaaag ctaacggtcg tgaaatcctg 540

cgtatcttcg gttacggtca cgctgaccag ccgggtgacg acggtgctta cttcaccgtt 600

gaatacaacc tgttcgacca cgctcacggt gaaggtaccg aaatcgttgt tctgaaagtt 660

aaccacaaca tcgttcgtta caacaccgtt atcgctgttc gtggtggtct ggttggtcgt 720

cgtggtaaat tcaacacctt cgaaggtaac ttcgttttcg gtaaaggtga aggttacacc 780

gttggtatcc gtgttgctgg tccgttccac cgtgttatca acaactacgt tgctgacgtt 840

accgaagacg gtctgcgtct gatcgctggt gaatactacg aaaaagttct gaccggtaac 900

ttcgctgcta aaaaaaaaaa cctgccgaaa tacctgcagg ttcaggactg ctacatcgct 960

cagaacacct tcgttaactg cggtgaaaac ggtatcaaca tcggtttcaa ctacaaaaac 1020

cagtggccgg ttctgcagat ggttctgttc ccggaaaaca acaaattcgt taacaacctg 1080

gtttacaact gcaaaggtaa cgctatcaac atcgaagttc tggacaccac caccccgctg 1140

gacgttttcc acttcaaacc gaacttcttc gaagttaacc tggttttcgg tgttaaaatc 1200

tgcaacgttg ttctgccggt tggtatcatc aaagttgacc cgaaactgaa actgggtgtt 1260

gacggtctgt accgtctggt tgttaaagtt ccggctatca acaacggtgc tgacgttgac 1320

gctaaagacg acttcgaagg tgttctgcgt gacgctaaac gt 1362

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

catgccatgg gttccgggta aagaaatcct g 31

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccgctcgaga cgtttagcgt cacgcagaac ac 32

Claims

1.一种新型硫酸软骨素酶CslF，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的硫酸软骨素酶CslF所对应的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

3.如权利要求1所述的硫酸软骨素酶CslF的制备与纯化方法。

4.如权利要求1所述的硫酸软骨素酶CslF在降解硫酸软骨素中的应用。

5.一种降解硫酸软骨素的方法，其特征是，所选用的硫酸软骨素酶为权利要求1所述的硫酸软骨素酶CslF。

6.如权利要求5所述的方法，其特征是，降解条件中反应温度为0~60℃，最适反应温度为30℃。