CN110195045A

CN110195045A - 一种新型壳聚糖酶CsnF及其应用

Info

Publication number: CN110195045A
Application number: CN201910550026.6A
Authority: CN
Inventors: 杨文钰
Original assignee: Shandong Haoyue Pharmaceutical Technology Co Ltd
Current assignee: Ji'nan Appollo chitin Fertilizer Co.,Ltd.
Priority date: 2019-06-24
Filing date: 2019-06-24
Publication date: 2019-09-03
Anticipated expiration: 2039-06-24
Also published as: CN110195045B

Abstract

本发明涉及一种新型壳聚糖酶CsnF及其应用。所述壳聚糖酶CsnF氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供一种在毕赤酵母中重组表达壳聚糖酶CsnF的制备方法，以及重组菌的发酵工艺，发酵液酶活力高达376.6 U/mL，提供一种壳聚糖酶CsnF的纯化方法，纯度>95%，回收率高达92.2%。本发明所述壳聚糖酶CsnF稳定性良好，降解主产物为壳二糖和壳三糖，具有良好的工业化应用潜质。

Description

一种新型壳聚糖酶CsnF及其应用

技术领域

本发明涉及一种新型壳聚糖酶CsnF及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

壳寡糖具有广泛的抑菌、抗炎、抗肿瘤作用，被公认为有效的保健功能食品。壳寡糖由N-乙酰-D-氨基葡萄糖（GLcNAc）和D-氨基葡萄糖（GLcN）通过β-l,4-糖苷键连接而成，极易溶于水，在医药、保健品、功能食品等领域比大分子壳聚糖有更大的应用价值，被誉为“生命的第六元素”。

目前，壳寡糖的制备方法主要分为酸解法、物理降解法、生物酶法三种。其中物理降解法（微波法、超声破碎法）只能作为辅助降解；酸解法利用大量的浓酸和浓碱处理，对环境造成极大污染，而且反应过程剧烈，不宜控制产物分布。相比较于酸解法，利用壳聚糖酶生物酶法降解大分子壳聚糖具有反应条件温和、降解产物单一、反应过程容易控制、环境友好等优势，逐渐成为壳寡糖制备过程中的主流方法。但是，目前市场上销售的壳聚糖酶价格昂贵、活力较低，且稳定性较差，严重限制了壳聚糖酶的应用前景。因此，急需发现新的壳聚糖酶并开发其制备和纯化工艺，为壳寡糖的高值化应用奠定基础。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种新型壳聚糖酶CsnF及其制备方法。本发明所述壳聚糖酶CsnF产量高达367.6 U/mL，一步亲和纯化纯度>95%，回收率高达92.2%。最适反应温度为70 ℃，最适pH为6.0，性质稳定，降解主产物为壳二糖和壳三糖。本发明所述壳聚糖酶CsnF产量高、制备方法简单、纯度高、稳定性好，具有良好的工业化应用潜质。

一方面，本发明提供一种新型壳聚糖酶CsnF，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

SEQ ID NO.1：

FAEASINSSGNSYTEIRAQLNNRSGWPAKKTDQLSFRYYVDLTEAVEAGYSAEDIKVTAGYNEGASVSELKPHDASKHIYYTEVSFSGVLIYPGGQSAHKKEVQFRLSAPDGTSFWNPENDHSYQGLSHALLKTRYIPVYDDGRLVFGHEPGYEKETPEDERDVPDNIKAFKESIVKQGSCNDPLAKGFHSADGDDGSYVYCGDHVKDYNVIYLQGTEGKLVNMDIDCDGIQGSSADDGRCGSSGDTQSVTSFQDRLRTYSTKQKDLDANIHPYVVFGNLGTKKNWPTFDAQKHGIKPLSIIAVVCGGKMFYGIWGDENGDDGEESMVGEAAISLATACFGKSMNGNNGHDADDVLYIAFPGSDAVPGDDGADWNATNFKDFESSLSSVGDKLVARINDTSSGNGTDSGDDDSGATRVWSTWGMGFCVVSVMAAMMI

另一方面，本发明还提供一种壳聚糖酶CsnF对应的核酸序列，如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.2：

TTCGCTGAAGCTTCTATCAACTCTTCTGGTAACTCTTACACTGAAATCAGAGCTCAATTGAACAACAGATCTGGTTGGCCAGCTAAGAAGACTGACCAATTGTCTTTCAGATACTACGTTGACTTGACTGAAGCTGTTGAAGCTGGTTACTCTGCTGAAGACATCAAGGTTACTGCTGGTTACAACGAAGGTGCTTCTGTTTCTGAATTGAAGCCACACGACGCTTCTAAGCACATCTACTACACTGAAGTTTCTTTCTCTGGTGTTTTGATCTACCCAGGTGGTCAATCTGCTCACAAGAAGGAAGTTCAATTCAGATTGTCTGCTCCAGACGGTACTTCTTTCTGGAACCCAGAAAACGACCACTCTTACCAAGGTTTGTCTCACGCTTTGTTGAAGACTAGATACATCCCAGTTTACGACGACGGTAGATTGGTTTTCGGTCACGAACCAGGTTACGAAAAGGAAACTCCAGAAGACGAAAGAGACGTTCCAGACAACATCAAGGCTTTCAAGGAATCTATCGTTAAGCAAGGTTCTTGTAACGACCCATTGGCTAAGGGTTTCCACTCTGCTGACGGTGACGACGGTTCTTACGTTTACTGTGGTGACCACGTTAAGGACTACAACGTTATCTACTTGCAAGGTACTGAAGGTAAGTTGGTTAACATGGACATCGACTGTGACGGTATCCAAGGTTCTTCTGCTGACGACGGTAGATGTGGTTCTTCTGGTGACACTCAATCTGTTACTTCTTTCCAAGACAGATTGAGAACTTACTCTACTAAGCAAAAGGACTTGGACGCTAACATCCACCCATACGTTGTTTTCGGTAACTTGGGTACTAAGAAGAACTGGCCAACTTTCGACGCTCAAAAGCACGGTATCAAGCCATTGTCTATCATCGCTGTTGTTTGTGGTGGTAAGATGTTCTACGGTATCTGGGGTGACGAAAACGGTGACGACGGTGAAGAATCTATGGTTGGTGAAGCTGCTATCTCTTTGGCTACTGCTTGTTTCGGTAAGTCTATGAACGGTAACAACGGTCACGACGCTGACGACGTTTTGTACATCGCTTTCCCAGGTTCTGACGCTGTTCCAGGTGACGACGGTGCTGACTGGAACGCTACTAACTTCAAGGACTTCGAATCTTCTTTGTCTTCTGTTGGTGACAAGTTGGTTGCTAGAATCAACGACACTTCTTCTGGTAACGGTACTGACTCTGGTGACGACGACTCTGGTGCTACTAGAGTTTGGTCTACTTGGGGTATGGGTTTCTGTGTTGTTTCTGTTATGGCTGCTATGATGATC

另一方面，本发明还提供一种壳聚糖酶CsnF的制备与纯化方法。

另一方面，本发明还提供了所述壳聚糖酶CsnF在降解壳聚糖中的应用。

另一方面，一种降解壳聚糖的方法，所选用的壳聚糖酶为CsnF。

优选：所述降解条件中反应温度为20~90℃。最适反应温度为70℃。

有益效果：

1.本发明的壳聚糖酶CsnF为人工设计的壳聚糖酶，全长含有437个氨基酸，N端（Phe¹-Gly¹⁵²）为第三家族碳水化合物结合域（CBM3），C端（Arg¹⁶²-Ile⁴³⁷）为真菌来源多糖水解酶（GH75）家族壳聚糖酶保守区，中间含有一段Linker结构（Thr¹⁵³-Glu¹⁶¹），为两段结构域提供空间位阻。

2.本发明提供了一种制备壳聚糖酶CsnF的方法，即利用基因工程的技术方法，将壳聚糖酶CsnF的基因序列异源重组表达到毕赤酵母中，经发酵后，发酵液酶活力高达367.6U/mL，具有工业化生产的潜质。该酶纯化方法简单，利用镍柱对其进行一步亲和纯化，回收率高达92.2%，蛋白质纯度>95%。

3.本发明的壳聚糖酶CsnF具有优良的理化性质，最适pH为6.0，在pH4.0-6.0范围内保持稳定，50 ℃孵育1 h仍然保持72.6%的活性，60 ℃孵育1 h仍然保持47.3%的活性，70℃孵育1 h仍然保持38.6%的活性。降解方式为内切，降解主产物壳二糖和壳三糖。

综上所述，本发明所述壳聚糖酶CsnF序列新颖、产量高、稳定性好，具有良好的工业化应用潜质。

附图说明

图1为本发明壳聚糖酶CsnF的蛋白质分离纯化图（M，蛋白质标准品；1，纯化前发酵液上清，2，纯化所得壳聚糖酶CsnF）

图2为本发明壳聚糖酶CsnF的最适反应温度分析

图3为本发明壳聚糖酶CsnF的温度稳定性分析

图4为薄层层析（TLC）法检测本发明壳聚糖酶CsnF的降解方式和酶解产物（M，DP1-3，壳寡糖1-3糖标准品）。

具体实施方式

实施例1 壳聚糖酶CsnF的序列分析

本发明所述壳聚糖酶CsnF的产酶基因csnF为人工合成序列。本发明所述壳聚糖酶CsnF全长含有437个氨基酸，N端（Phe¹-Gly¹⁵²）为第三家族碳水化合物结合域（CBM3），C端（Arg¹⁶²-Ile⁴³⁷）为真菌来源多糖水解酶（GH75）家族壳聚糖酶保守区，中间含有一段Linker结构（Thr¹⁵³-Glu¹⁶¹），为两段结构域提供空间位阻。在氨基酸序列不变的情况下，我们将该基因序列根据宿主（毕赤酵母）的密码子偏好性，进行了碱基序列优化，利于其在毕赤酵母中进行高效表达。

将壳聚糖酶CsnF的碱基序列以限制性内切酶EcoR I和Not I为酶切位点，设计重组引物如下（下划线为限制性内切酶位点，斜体为限制性内切酶保护碱基）：

正向引物：PcsnF-EF：

5’- CCGGAATTCTTCGCTGAAGCTTCTATCAAC-3’ (EcoR I)

反向引物：PcsnF-ER：

5’- ATAGTTTAGCGGCCGCGATCATCATAGCAGCCATAA-3’ (Not I)

PCR扩增条件为：94℃预变性3 min；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1 min，共30个循环；72℃延伸2 min；4℃稳定15 min。PCR反应所用DNA聚合酶为Primerstar HS购自大连宝生物公司。

PCR产物用限制性内切酶EcoR I和Not I进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的PCR产物。Ppic9k质粒DNA（美国Invitrogen公司），同样用限制性内切酶EcoR I和NotI进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳并回收酶切后的产物片段。酶切所用酶和底物反应体系（温度、时间、DNA用量等）均参照大连宝生物提供的产品说明操作。

双酶切处理的PCR产物和Ppic9k质粒载体参照DNA连接酶（大连宝生物公司）说明书进行连接反应；连接产物转化至大肠杆菌DH5α菌株（美国Invitrogen公司），涂布在Luria-Bertani (LB)培养基固体平板上（含有50 μg/mL氨苄青霉素的），37℃温箱中培养12-16小时后，挑取单克隆；将单克隆转接至LB液体培养基中（含有50 μg/mL氨苄青霉素），转速为180 rpm的37℃摇床中培养过夜。将单克隆进行序列测定，选择阳性克隆，并将其命名为Ppic9k-csnF。质粒保存在-20℃备用。

挑取在最高遗传霉素浓度的YPD平板上生长良好的高抗性转化子，接种到YPG液体培养基中过夜培养。无菌条件下取1mL菌液，12000pm，离心2min，收集沉淀用500μL PBS（pH7.4）重悬；再次重复以上操作；12000rpm，离心2min，收集沉淀用100μL ddH20重悬；沸水浴10min，在液氮中冷冻10min，再沸水浴10min；12000rpm，离心2min，取上清液作为模板，以设计的正向引物和3’AOXl反向引物为引物，用PCR法鉴定阳性重组酵母转化子。

实施例2 壳聚糖酶CsnF的制备及纯化方法

选择PCR鉴定为阳性的重组转化子接种到BMGY液体培养基中，29-30℃，220-250rpm，培养至稀释50倍后OD600=0.6-0.7。6000rpm，离心10min，收集菌体，弃去BMGY液体培养。加入BMMY液体培养基（诱导培养基），按1.0%浓度加入甲醇，29-30℃，220-250 rpm条件下开始甲醇诱导培养。每隔24h补加一次甲醇，使得培养基中甲醇终浓度始终维持在1.0%，每隔24h定时取样。发酵结束后，12000 rpm，离心10min，分离菌体和发酵液上清。壳聚糖酶CsnF活性的标准测定方法为：100 μL酶液加入900 μL 0.3%壳聚糖底物（20 mM 醋酸-醋酸钠，pH=6.0），在70℃下反应10 min，加入750 μL的DNS试剂，沸水中反应10 min进行显色，在OD520下检测其吸光度。酶活力定义为1 U为每min产生1 μM还原糖所需要的酶量。经检测，发酵液中壳聚糖酶活力可达367.6 U/mL。

发酵停止后，12000 rpm离心10 min，弃菌体，收集上清液；发酵上清液上样于10mL镍离子亲和层析柱，上样流速为5 mL/min，利用10 mM咪唑洗脱，去除杂蛋白，再利用150mM的咪唑洗脱，收集洗脱组分。将活性成分透析去除咪唑，分装储存在-20℃备用。通过镍离子一步亲和纯化，蛋白回收率达到92.2%。纯化所得壳聚糖酶CsnF进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），如图1所示，壳聚糖酶CsnF的分子量为50 kDa左右，与序列分析中预测的蛋白大小一致。通过凝胶分析发现，纯化所得壳聚糖酶CsnF的蛋白纯度达到95%以上。

实施例3 温度对壳聚糖酶CsnF的影响

将实施例2中纯化所得壳聚糖酶CsnF在不同条件下进行酶活力测定，检测不同温度对酶活力的影响。在不同温度（20-90℃）下反应10 min，检测不同反应温度对酶活力的影响，以最高酶活力为100%，计算不同温度下壳聚糖酶CsnF的相对酶活力。如图2所示，壳聚糖酶CsnF的最适反应温度为70℃。

将实施例2中纯化所得壳聚糖酶CsnF在不同温度（0-80 ℃）下孵育1 h，取出后，在其最适反应温度（70℃）下检测其酶活力，以孵育前的活力作为100%，如图3所示，壳聚糖酶CsnF温度稳定性较好，在40 ℃下孵育1 h，酶活性可达到孵育前的81.3%，在50 ℃下孵育1h，酶活性可达到孵育前的72.6%，在60 ℃下孵育1 h，酶活性可达到孵育前的47.3%，在70℃下孵育1 h，酶活性可达到孵育前的38.6%。说明该酶具有良好的温度稳定性，利于其后续应用。

实施例4 壳聚糖酶CsnF酶解产物薄层层析分析

将实施例2中纯化所得壳聚糖酶CsnF与0.3%壳聚糖在70℃下分别孵育1 h，然后在高效薄层层析板（HPTLC）检测。具体为：将HPTLC层析板裁剪成7 cm宽合适大小的样本，将孵育前后样品点样在原点处，置于有展开剂（正丁醇:冰醋酸:水=2:2:1）的展缸中30 min，吹干层析板，浸入显色剂（0.5%茚三酮乙醇溶液）中2s，取出吹干，80℃烘烤，至样品出现。如图4所示，与标准品迁徙率比较发现，壳聚糖酶CsnF酶解主产物为壳二糖（DP2）和壳三糖（DP3）。

序列表

<110> 山东昊岳医药科技有限公司

<120> 一种新型壳聚糖酶CsnF及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 437

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Phe Ala Glu Ala Ser Ile Asn Ser Ser Gly Asn Ser Tyr Thr Glu Ile

1 5 10 15

Arg Ala Gln Leu Asn Asn Arg Ser Gly Trp Pro Ala Lys Lys Thr Asp

20 25 30

Gln Leu Ser Phe Arg Tyr Tyr Val Asp Leu Thr Glu Ala Val Glu Ala

35 40 45

Gly Tyr Ser Ala Glu Asp Ile Lys Val Thr Ala Gly Tyr Asn Glu Gly

50 55 60

Ala Ser Val Ser Glu Leu Lys Pro His Asp Ala Ser Lys His Ile Tyr

65 70 75 80

Tyr Thr Glu Val Ser Phe Ser Gly Val Leu Ile Tyr Pro Gly Gly Gln

85 90 95

Ser Ala His Lys Lys Glu Val Gln Phe Arg Leu Ser Ala Pro Asp Gly

100 105 110

Thr Ser Phe Trp Asn Pro Glu Asn Asp His Ser Tyr Gln Gly Leu Ser

115 120 125

His Ala Leu Leu Lys Thr Arg Tyr Ile Pro Val Tyr Asp Asp Gly Arg

130 135 140

Leu Val Phe Gly His Glu Pro Gly Tyr Glu Lys Glu Thr Pro Glu Asp

145 150 155 160

Glu Arg Asp Val Pro Asp Asn Ile Lys Ala Phe Lys Glu Ser Ile Val

165 170 175

Lys Gln Gly Ser Cys Asn Asp Pro Leu Ala Lys Gly Phe His Ser Ala

180 185 190

Asp Gly Asp Asp Gly Ser Tyr Val Tyr Cys Gly Asp His Val Lys Asp

195 200 205

Tyr Asn Val Ile Tyr Leu Gln Gly Thr Glu Gly Lys Leu Val Asn Met

210 215 220

Asp Ile Asp Cys Asp Gly Ile Gln Gly Ser Ser Ala Asp Asp Gly Arg

225 230 235 240

Cys Gly Ser Ser Gly Asp Thr Gln Ser Val Thr Ser Phe Gln Asp Arg

245 250 255

Leu Arg Thr Tyr Ser Thr Lys Gln Lys Asp Leu Asp Ala Asn Ile His

260 265 270

Pro Tyr Val Val Phe Gly Asn Leu Gly Thr Lys Lys Asn Trp Pro Thr

275 280 285

Phe Asp Ala Gln Lys His Gly Ile Lys Pro Leu Ser Ile Ile Ala Val

290 295 300

Val Cys Gly Gly Lys Met Phe Tyr Gly Ile Trp Gly Asp Glu Asn Gly

305 310 315 320

Asp Asp Gly Glu Glu Ser Met Val Gly Glu Ala Ala Ile Ser Leu Ala

325 330 335

Thr Ala Cys Phe Gly Lys Ser Met Asn Gly Asn Asn Gly His Asp Ala

340 345 350

Asp Asp Val Leu Tyr Ile Ala Phe Pro Gly Ser Asp Ala Val Pro Gly

355 360 365

Asp Asp Gly Ala Asp Trp Asn Ala Thr Asn Phe Lys Asp Phe Glu Ser

370 375 380

Ser Leu Ser Ser Val Gly Asp Lys Leu Val Ala Arg Ile Asn Asp Thr

385 390 395 400

Ser Ser Gly Asn Gly Thr Asp Ser Gly Asp Asp Asp Ser Gly Ala Thr

405 410 415

Arg Val Trp Ser Thr Trp Gly Met Gly Phe Cys Val Val Ser Val Met

420 425 430

Ala Ala Met Met Ile

435

<210> 2

<211> 1311

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttcgctgaag cttctatcaa ctcttctggt aactcttaca ctgaaatcag agctcaattg 60

aacaacagat ctggttggcc agctaagaag actgaccaat tgtctttcag atactacgtt 120

gacttgactg aagctgttga agctggttac tctgctgaag acatcaaggt tactgctggt 180

tacaacgaag gtgcttctgt ttctgaattg aagccacacg acgcttctaa gcacatctac 240

tacactgaag tttctttctc tggtgttttg atctacccag gtggtcaatc tgctcacaag 300

aaggaagttc aattcagatt gtctgctcca gacggtactt ctttctggaa cccagaaaac 360

gaccactctt accaaggttt gtctcacgct ttgttgaaga ctagatacat cccagtttac 420

gacgacggta gattggtttt cggtcacgaa ccaggttacg aaaaggaaac tccagaagac 480

gaaagagacg ttccagacaa catcaaggct ttcaaggaat ctatcgttaa gcaaggttct 540

tgtaacgacc cattggctaa gggtttccac tctgctgacg gtgacgacgg ttcttacgtt 600

tactgtggtg accacgttaa ggactacaac gttatctact tgcaaggtac tgaaggtaag 660

ttggttaaca tggacatcga ctgtgacggt atccaaggtt cttctgctga cgacggtaga 720

tgtggttctt ctggtgacac tcaatctgtt acttctttcc aagacagatt gagaacttac 780

tctactaagc aaaaggactt ggacgctaac atccacccat acgttgtttt cggtaacttg 840

ggtactaaga agaactggcc aactttcgac gctcaaaagc acggtatcaa gccattgtct 900

atcatcgctg ttgtttgtgg tggtaagatg ttctacggta tctggggtga cgaaaacggt 960

gacgacggtg aagaatctat ggttggtgaa gctgctatct ctttggctac tgcttgtttc 1020

ggtaagtcta tgaacggtaa caacggtcac gacgctgacg acgttttgta catcgctttc 1080

ccaggttctg acgctgttcc aggtgacgac ggtgctgact ggaacgctac taacttcaag 1140

gacttcgaat cttctttgtc ttctgttggt gacaagttgg ttgctagaat caacgacact 1200

tcttctggta acggtactga ctctggtgac gacgactctg gtgctactag agtttggtct 1260

acttggggta tgggtttctg tgttgtttct gttatggctg ctatgatgat c 1311

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccggaattct tcgctgaagc ttctatcaac 30

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atagtttagc ggccgcgatc atcatagcag ccataa 36

Claims

1.一种新型壳聚糖酶CsnF，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的壳聚糖酶CsnF所对应的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

3.如权利要求1所述的壳聚糖酶CsnF的制备与纯化方法。

4.如权利要求1所述的壳聚糖酶CsnF在降解壳聚糖中的应用。

5.一种降解壳聚糖的方法，其特征是，所选用的壳聚糖酶为权利要求1所述的壳聚糖酶CsnF。

6.如权利要求5所述的方法，其特征是，降解条件中最适反应温度为70℃，最适pH为6.0。