CN103122027B - 一种重组人源胶原蛋白及其生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组人源胶原蛋白及其生产方法，属于基因工程技术领域。一种重组人源胶原蛋白，结构为单链结构，基本重复单元为gergapgfrgpagpngipgekgpagergap，为人胶原蛋白III型肽段，末端序列为GPPGPCCGGG，为人胶原蛋白II型肽段。生产步骤为：大肠杆菌基因工程菌的构建；大肠杆菌基因工程菌的发培养；重组人源胶原蛋白的诱导和表达；重组人源胶原蛋白的纯化。本发明采用大肠杆菌表达系统，适于大规模放大，生产成本低，产量高。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种重组人源胶原蛋白及其生产方法。
背景技术
胶原蛋白是广泛分布于人体结缔组织的一类蛋白质，也是人体中含量最多的蛋白质，可以占到蛋白质总量的25%~35%。它的主要功能体现在维护细胞外环境，维持组织器官的正常生理功能，修复肌体损伤等方面。胶原蛋白是天然的生物资源，具有其它高分子材料所望尘莫及的生物组织相容性，对细胞的支撑弹性和可降解性，因此，胶原蛋白可以广泛的应用在医药和化妆品等行业中。
然而，天然胶原蛋白无法溶于水，性质不均一，很难被人体利用，往往需要利用化学手段处理之后使用。而且，当前市场上销售的胶原蛋白产品都是取自猪、牛、鱼等动物组织中，很难避免病毒感染，同时无法与人体相容，会导致免疫排斥和过敏症状。如果从人胎盘原料中提取，不仅来源有限，更面临法律的严惩。所以，目前的胶原蛋白只能在化妆品和保健品中使用，根本无法发挥胶原蛋白的原本生物学功能。
从结构上来说，人体天然的胶原蛋白的结构非常的复杂，所以才导致人源胶原蛋白极难通过常规手段表达和大量制备。天然胶原分子形成了一种特殊的超螺旋结构，由三条无链内氢键形成而仅受链间氢键支撑的多肽链组成。这种螺旋性的结构是以3个氨基酸残基为基本重复体的左手螺旋，这3个氨基酸残基通常为Gly-X-Pro。Gly对胶原蛋白中氢键的形成是必须的，它本身没有侧链，可以使胶原蛋白紧密堆积。在更高级的结构层次上，胶原超螺旋会进一步缔合成为胶原原纤维。在生物体中，胶原蛋白的合成和修饰从原胶原开始，经历了羟基化、糖基化、相互交联等诸多化学变化，受到了多种生物酶的复杂调控。原胶原除了含有胶原链之外，还含有球状的头部和尾部。没有这些头部和尾部，胶原链就不会折叠成为正确的三螺旋，从而缺乏胶原蛋白的生物学活性。因此，按照原始基因序列制备的胶原蛋白不可能在体外自发的组织形成正确的空间结构。这样的困难严重阻碍了人胶原蛋白的研发和生产。
生产胶原蛋白的传统方法是利用酸、碱、酶解法处理动物来源的组织，提取胶原蛋白衍生物。这些方法提取的胶原蛋白本身已经丧失了原本的生物学活性，无法应用于生物医学领域发挥真正的功能。随着现代生物技术的发展，人们不断尝试利用转基因技术，在动物、植物和微生物表达体系中制备重组人胶原蛋白，解决了传统提取工艺的诸多缺点。国外研究机构通过培育含人胶原蛋白基因的小鼠，得到了含有人胶原蛋白的乳汁，但是这样生产的成本过高，生产周期过长，无法投入大规模生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组人源胶原蛋白及其生产方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种重组人源胶原蛋白，结构为单链结构，基本重复单元为gergapgfrgpagpngipgekgpagergap，为人胶原蛋白III型肽段，末端序列为GPPGPCCGGG，为人胶原蛋白II型肽段。
进一步地，上述的重组人源胶原蛋白为HC8，为单链结构，包括氨基酸257个，基本重复单元为gergapgfrgpagpngipgekgpagergap，为人胶原蛋白III型肽段，末端序列为GPPGPCCGGG，为人胶原蛋白II型肽段，序列如下：
gergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergaprsgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergaprspefgppgpccggg。
所述人源胶原蛋白HC8的DNA序列如下：
ggcgagcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatccggcgagcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatctccggaattcggcccgcctggtccttgttgtggcggcggc。
上述的人源胶原蛋白为HC16，为单链结构，包括氨基酸501个，基本重复单元为gergapgfrgpagpngipgekgpagergap，为人胶原蛋白III型肽段，其末端序列为GPPGPCCGGG，为人胶原蛋白II型肽段，序列如下：
gergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergaprsgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergaprsgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergaprsgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergaprspefgppgpccggg。
所述人源胶原蛋白HC16的DNA序列如下：
ggcgagcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatccggcgagcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatccggcgagcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatccggcgagcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatctccggaattcggcccgcctggtccttgttgtggcggcggc。
上述的重组人源胶原蛋白的生产方法，包括如下步骤：
（1）大肠杆菌基因工程菌的构建；
（2）大肠杆菌基因工程菌的发酵培养；
（3）重组人源胶原蛋白的诱导和表达；
（4）重组人源胶原蛋白的纯化。
其中，步骤（1）中所述大肠杆菌基因工程菌的构建，步骤如下：（1）优化选择人的II型和III型胶原蛋白基因螺旋区的DNA片段，利用PCR的方法将片段进行密码子优化和拼接重组，得到完整的重组基因；（2）将重组基因转入大肠杆菌表达菌株中，筛选得到大肠杆菌基因工程菌。
步骤（2）中所述大肠杆菌基因工程菌的发酵培养，步骤如下：（1）挑取优选后的大肠杆菌基因工程菌单菌落，至于5ml的LB培养基中37℃培养过夜；（2）将菌液按照1：100接种放大培养，37℃培养3小时，加入IPTG进行诱导，20℃继续培养16小时，离心收集菌体。
步骤（4）中所述重组人源胶原蛋白的纯化，步骤如下：（1）用Tris缓冲液重悬细菌，超声破碎，离心收集上清液；（2）利用镍离子亲和柱从上清液中纯化得到重组人源胶原蛋白。
与现有技术相比，本发明具有以下特点：
（1）本发明首次选择的III型胶原蛋白序列为长期筛选优化的序列；
（2）采用大肠杆菌表达系统，适于大规模放大， 20小时即可完成一轮发酵，生产成本非常低，而且基因中的序列针对大肠杆菌表达系统进行了密码子优化，进一步提高了产量；
（3）生产的重组人源胶原蛋白具有非常好的亲水性和稳定性，其氨基酸组成与天然胶原蛋白氨基酸序列相应部分100%相同，应用于人体不会产生免疫排斥和过敏反应，可以广泛应用于生物医药和化妆品行业；
（4）本发明产品经过活性检测，具有达到甚至超过人体天然蛋白的生物学活性，是目前报道过的最优化的胶原蛋白设计方案，可以在人体中行使天然蛋白的功能，达到真正的产品应用的目的。
附图说明
图1为本发明载体pET32a-HC8和pET32a-HC16构建的质粒图谱；
图2为本发明HC8和HC16蛋白纯化后的电泳图；
图3为本发明HC8和HC16蛋白与人胶原蛋白相对照的生物活性检测结果。以人胶原蛋白的细胞黏附活性为1，显示HC8和HC16样品的相对细胞黏附活性。
具体实施方式
实施例1：HC8基因表达载体的构建及表达
一、人源胶原蛋白HC8全长基因序列经过密码子优化后如下所示：
ggcgagcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatccggcgagcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatctccggaattcggcccgcctggtccttgttgtggcggcggc
HC8基因全长771bp，利用PCR的方法克隆扩增此DNA片段，琼脂糖凝胶电泳回收目的基因。利用引物上加入的Nco I和Xho I的酶切位点，加入相应的限制性内切酶将基因片段切成粘性末端，并与相应酶切处理过的pET32a的表达载体共孵育，加入T4 DNA连接酶，4℃连接12小时，转化大肠杆菌DH5α；用氨苄青霉素钠-LB平板筛选挑出白斑克隆，利用分子克隆的碱裂解法或者煮沸法提取质粒，再用酶切和PCR的方法鉴定阳性克隆正确，最后测序确定重组质粒含有正确的基因序列阅读框架，构建成功pET32a-HC8重组表达载体。
二、将正确的pET32a-HC8质粒转化大肠杆菌BL21，用氨苄青霉素钠-LB平板筛选出单斑克隆，在5mlLB培养基中培养过夜，按照1:100转接，在摇瓶中37℃培养至OD600为0.4-0.6，按照1:5000加入IPTG储液，20℃培养8-10小时（时间再延长会进一步提高产量），离心收集菌体，保存于-20℃或者立即进入下步纯化。
三、用PBS缓冲液洗涤混合后的菌体沉淀，用20-40ml体积重悬约500ml菌液沉淀，用溶菌酶配合Triton X-100帮助裂解细菌（可选），在冰水混合物环境下超声破菌（2s超声，5s间歇，全长45min，保护温度44℃），12000rpm/min离心20min，收集上清液。此时溶液中即含有大量的Trx-HC8重组蛋白。
四、用PBS缓冲液清洗镍离子亲和柱（Ni-NTA His-Bind Resin）柱材，然后将柱材和Trx-HC8的溶液混合共育，室温或冰上轻摇30min，然后上柱，用含有15mM 咪唑的PBS溶液洗涤杂蛋白，柱上就剩下了纯的Trx-HC8，在柱上加入适量具有His标签的Prescission Protease（简称PPase）蛋白酶，于室温或冰上轻摇2小时，即可将HC8蛋白从柱上释放出来，用PBS溶液洗脱HC8蛋白，所得产物透析过夜，冻干为干粉待用。
五、所得HC8蛋白利用SDS-PAGE检测纯度，并与人天然胶原蛋白相对照测量蛋白活性。
实施例2 HC16基因表达载体的构建及表达
一、人源胶原蛋白HC16全长基因序列经过密码子优化后如下所示：
ggcgagcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatccggcgagcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatccggcgagcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatccggcgagcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatctccggaattcggcccgcctggtccttgttgtggcggcggc
HC16基因全长1503bp，利用PCR的方法克隆扩增此DNA片段，琼脂糖凝胶电泳回收目的基因。利用引物上加入的Nco I和Xho I的酶切位点，加入相应的限制性内切酶将基因片段切成粘性末端，并与相应酶切处理过的pET32a的表达载体共孵育，加入T4 DNA连接酶，4℃连接12小时，转化大肠杆菌DH5α；用氨苄青霉素钠-LB平板筛选挑出白斑克隆，利用分子克隆的碱裂解法或者煮沸法提取质粒，再用酶切和PCR的方法鉴定阳性克隆正确，最后测序确定重组质粒含有正确的基因序列阅读框架，构建成功pET32a-HC16重组表达载体。
二、将正确的pET32a-HC16质粒转化大肠杆菌BL21，用氨苄青霉素钠-LB平板筛选出单斑克隆，在5mlLB培养基中培养过夜，按照1:100转接，在摇瓶中37℃培养至OD600为0.4-0.6，按照1:5000加入IPTG储液，20℃培养8-10小时（时间再延长会进一步提高产量），离心收集菌体，保存于-20℃或者立即进入下步纯化。
三、用PBS缓冲液洗涤混合后的菌体沉淀，用20-40ml体积重悬约500ml菌液沉淀，用溶菌酶配合Triton X-100帮助裂解细菌（可选），在冰水混合物环境下超声破菌（2s超声，5s间歇，全长45min，保护温度44℃），12000rpm/min离心20min，收集上清液，此时溶液中即含有大量的Trx-HC16重组蛋白。
四、用PBS缓冲液清洗镍离子亲和柱（Ni-NTA His-Bind Resin）柱材，然后将柱材和Trx-HC16的溶液混合共育，室温或冰上轻摇30min，然后上柱；用含有15mM 咪唑的PBS溶液洗涤杂蛋白，柱上就剩下了纯的Trx-HC16；在柱上加入适量含有His标签的Prescission Protease（简称PPase）蛋白酶，于室温或冰上轻摇2小时，即可将HC16蛋白从柱上释放出来；用PBS溶液洗脱HC16蛋白；所得产物透析过夜，冻干为干粉待用。
五、所得HC16蛋白利用SDS-PAGE检测纯度，并与人天然胶原蛋白相对照测量蛋白活性。
图1为pET-32a的质粒图谱说明，以及多克隆位点的展开示意图，显示插入的HC8或HC16的基因片段和人工构建的Prescission Protease蛋白酶切位点。图2 为纯化后的HC8和HC16的SDS-PAGE电泳结果，显示正确的蛋白大小和较高的蛋白纯度。图3 为HC8和HC16的蛋白活性检测结果，人胶原为商品化的人胶原蛋白，为阳性对照，PBS是空白缓冲液，由此可见，HC8和HC16的蛋白对于细胞有很强的黏附性，可以短时间内帮助细胞营造微环境，辅助细胞与基质相互结合，具有超过天然蛋白的高生物活性。
实施例3 HC8和HC16蛋白检测活性
胶原蛋白的活性检测方法可以参考文献Juming Yao, Satoshi Yanagisawa, Tetsuo Asakura, Design, Expression and Characterization of Collagen-Like Proteins Based on the Cell Adhesive and Crosslinking Sequences Derived from Native Collagens, J Biochem. 136, 643-649 (2004)。具体实施方法如下：
1，利用紫外吸收法检测待测蛋白样品的浓度，包括对照人胶原蛋白（Sigma, C7774），HC8和HC16样品。具体为分别测定样品在215nm和225nm下的紫外光吸收，利用经验公式C(μg/mL)=144X(A215-A225) 计算蛋白质浓度，注意需在A215<1.5的情况下检测。该方法的原理是测定肽键在远紫外光下的特征吸收，不受生色团含量的影响，干扰物质少，操作简便，适合检测考马斯亮蓝不显色的人胶原蛋白及其类似物。（参考文献为Walker JM. The Protein Protocols Handbook, second edition. Humana Press. 43-45.）。检测完蛋白浓度后，用PBS将所有待测蛋白浓度调整到0.5mg/ml。
2，向96孔板中加入100μl各种蛋白溶液和空白PBS溶液对照，室温静置60min。
3，每孔中加入105个培养状态良好的3T3细胞，37度孵育60min。
4，每孔用PBS清洗4次。
5，用LDH检测试剂盒（Roche,04744926001）检测OD492nm的吸光度。根据空白对照的数值，可以计算出细胞的贴壁程度。细胞的贴壁率即可以反应胶原蛋白的活性。蛋白的活性越高，越能在短时间给细胞提供优质的外环境，帮助细胞贴壁。以人胶原蛋白的贴壁率为1，可以测算出HC8和HC16样品的相对细胞黏附活性。
Claims (4)
1.一种重组人源胶原蛋白，其特征在于，该人源胶原蛋白为HC8，为单链结构，由257个氨基酸组成，基本重复单元为gergapgfrgpagpngipgekgpagergap，为人胶原蛋白III型肽段，末端氨基酸序列为GPPGPCCGGG，为人胶原蛋白II型肽段，序列如下：
gergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergaprsgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergaprspefgppgpccggg；
或者，该人源胶原蛋白为HC16，为单链结构，由501个氨基酸组成，基本重复单元为gergapgfrgpagpngipgekgpagergap，为人胶原蛋白III型肽段，其末端氨基酸序列为GPPGPCCGGG，为人胶原蛋白II型肽段，序列如下：
gergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergaprsgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergaprsgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergaprsgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergaprspefgppgpccggg。
2.根据权利要求1所述的一种重组人源胶原蛋白，其特征在于，所述人源胶原蛋白HC8的DNA序列如下：
ggcgagcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatccggcgagcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatctccggaattcggcccgcctggtccttgttgtggcggcggc。
3.根据权利要求1所述的一种重组人源胶原蛋白，其特征在于，所述人源胶原蛋白HC16的DNA序列如下：
ggcgagcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatccggcgagcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatccggcgagcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatccggcgagcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatctccggaattcggcccgcctggtccttgttgtggcggcggc。
4.权利要求1所述的重组人源胶原蛋白的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）大肠杆菌基因工程菌的构建：步骤如下：（ 
）优化选择人的II型和III型胶原蛋白基因螺旋区的DNA片段，利用PCR的方法将片段进行密码子优化和拼接重组，得到完整的重组基因；（）将重组基因转入大肠杆菌表达菌株中，筛选得到大肠杆菌基因工程菌；
（2）大肠杆菌基因工程菌的发酵培养：步骤如下：（
）挑取优选后的大肠杆菌基因工程菌单菌落，置于5ml的LB培养基中37℃培养过夜；（）将菌液按照1：100接种放大培养，37℃培养3小时，加入IPTG进行诱导，20℃继续培养16小时，离心收集菌体；
（3）重组人源胶原蛋白的诱导和表达；
（4）重组人源胶原蛋白的纯化：步骤如下：（）用Tris缓冲液重悬细菌，超声破碎，离心收集上清液；（
）利用镍离子亲和柱从上清液中纯化得到重组人源胶原蛋白。
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