CN117024569B - 生物合成人体结构性材料viii型胶原蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
提供了生物合成人体结构性材料VIII型胶原蛋白的方法。本公开提供了多肽，其包含一个或多个重复单元，所述重复单元直接或通过接头连接，所述重复单元包含选自下组的氨基酸序列或其变体：SEQ ID NO:1、4、7、10、13、16、19、22、25或28。该多肽可用于生物敷料、人体仿生材料或整形美容材料。本文的方法利用基因工程技术生产VIII型胶原蛋白，克服了现有技术的缺陷。
Description
技术领域
本发明涉及多肽领域，具体涉及人体结构性材料VIII型胶原蛋白以及其生物合成方法。
背景技术
胶原蛋白是动物体内含量最多、分布最广的蛋白质，是结缔组织的主要组成成分。VIII型胶原是一种短链非纤原性胶原，是视网膜膜的主要成分，是角膜内皮细胞下层膜(将角膜内皮细胞与角膜基质分开的基底膜)的主要成分。VIII型胶原由内皮细胞产生，形成独特的六边形晶格结构。它存在于心脏、大脑、肝脏、肺、肌肉和软骨中的软骨细胞周围。此外，在脑肿瘤的活跃增生血管周围和血管瘤的大纤维化血管中也发现了VIII型胶原。
VIII型胶原被称为短胶原或网状胶原，VIII型胶原蛋白中有两条相似的α链，α1(VIII)和α2(VIII)，两种同源三聚体亚型，[α1(VIII)]3和[α2(VIII)]3，被认为是主要的分子种类，但也可能存在异源三聚体。牛眼后弹力层呈六角形网状结构，具有薄的VIII型胶原原纤维，免疫组织化学分析和电子显微镜观察表明，VIII型胶原蛋白是该结构骨架的主要成分。此外，通过旋转阴影分析观察到，VIII型胶原蛋白可能形成四面体样超分子结构，其能够提供结构支撑，调节细胞行为。
两种VIII型胶原蛋白基因Col8a1，Col8a2的双敲除小鼠出现明显的眼前节发育不全表型，前房呈球形、角膜球状突起。角膜基质弥漫性变薄，类似于在人类角膜球中所见。后弹力层明显变薄并且没有前带状区域。角膜内皮细胞增大，数量减少。最后，突变的角膜内皮细胞在体外对不同生长因子的反应显示增殖能力下降，表明VIII型胶原蛋白可能作为生长因子诱导的细胞增殖的增强剂。
以前，VIII型胶原被描述为由两条α1链和一条α2链组成的异源三聚体，但体外研究表明，形成α1或α2的同源三聚体。这些同源三聚体具有胃蛋白酶抗性，免疫组织化学研究表明它们并不总是在角膜、视神经、主动脉和脐带中共定位。α1链全长744个氨基酸(aa)，n端前27个氨基酸为信号肽。
VIII型胶原的NC1结构域(aa572-744)是一种名为伐他汀的蛋白质，已被证明是一种有效的血管生成抑制剂，对主动脉内皮细胞具有诱导凋亡的活性。α2链长703aa，在α1-28的n端有一个信号肽。α1和α2前胶原蛋白基因各含有4个外显子。其特征之一是最大的外显子编码整个三螺旋结构域(COL1)和C端非三螺旋结构域(NC1)。VIII型胶原蛋白与X型胶原蛋白序列同源性高，内含子-外显子结构相似。这表明两种胶原源于相同的前体细胞基因，属于相同的胶原亚类。VIII型胶原能够像X型胶原一样形成六边形晶格结构。
VIII型胶原是一种对中性粒细胞弹性酶非常敏感的糖蛋白，与其他血管胶原如I、II、IV和V型胶原不同，它在4h内完全降解。VIII型胶原是由主动脉和角膜内皮细胞、肺动脉内皮细胞和微血管内皮细胞合成的。并不是所有的内皮细胞都表达VIII型胶原，因为大血管和小血管中都不存在这种胶原。此外，在体外和体内均发现单核细胞和巨噬细胞表达VIII型胶原。人类肥大细胞也被证明在正常和病理条件下产生VIII型胶原蛋白。它已被证明有助于血管生成、组织重塑、纤维化和癌症。表达VIII型胶原的肥大细胞见于血管周围间隙。VIII型胶原也在平滑肌细胞中表达，刺激细胞迁移。
角膜内皮分泌VIII型胶原，通过α1和α2多肽的相互作用，在内皮膜内组装成六角形晶格结构。COL8A2基因突变与早期Fuchs内皮性角膜营养不良有关，但与COL8A1无相关性。VIII型胶原被认为参与内皮细胞的分化和组织。在心脏发育过程中，VIII型胶原蛋白在血管形成中起着重要作用，它被免疫定位到毛细血管和小动脉的内皮下层。VIII型胶原蛋白在早期动脉粥样硬化中表达上调，并被认为与血栓形成和单核细胞浸润有关。它在动脉粥样硬化病变中积聚，其分布模式暗示其在斑块稳定中的作用。VIII型胶原存在于活跃增殖的脑肿瘤血管周围和血管瘤的大纤维化血管中。最后，VIII型胶原在人类糖尿病肾病中表达，但在其他肾脏疾病中不表达。
直至目前，各种研究使用的胶原蛋白绝大多数来自于动物组织、皮肤提取物。从动物体提取胶原蛋白水溶性差，可加工性很弱，直接限制了许多潜在用途的开发。而利用基因工程技术生产的胶原蛋白，可以有效克服上述缺点。
发明内容
本发明部分基于发明人的以下发现：本发明人对人Ⅷ型胶原蛋白进行大规模功能区筛选，得到不同的重组人源化Ⅷ型胶原蛋白的目的基因功能区，其中与阳性对照(人Ⅰ型胶原蛋白)相比具有更高的促进细胞粘附的活性。本发明还表明本发明的多肽适合于表达和纯化。此外，发明人还发现与其他多肽(C8b和C8d-j)相比，C8a和C8c的表达量和纯化效果较好，可用于产业生产。本发明的C8a和C8c还具有三螺旋结构。
在一方面，本发明提供了多肽，其包含一个或多个重复单元，所述重复单元直接或通过接头连接，所述重复单元包含选自下组的氨基酸序列或其变体：SEQ ID NO:1、4、7、10、13、16、19、22、25或28，所述变体是(1)所述氨基酸序列中突变一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列或者(2)与所述氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，多个重复单元为2-50个重复单元，例如2-45、2-40、2-35、2-30、2-25、2-20、2-15、2-10或2-8个重复单元。
在一个实施方案中，接头包含一个或多个氨基酸残基，例如1-10个、1-9个、1-8个、1-7个、1-6个、1-5个、1-4个、1-3个、或1-2个氨基酸残基。
在一个实施方案中，突变选自取代、添加、插入或缺失。
在一个实施方案中，取代是保守氨基酸取代。
在一个实施方案中，多肽是重组胶原蛋白。在一个实施方案中，多肽是重组VIII型胶原蛋白。在一个实施方案中，多肽是人重组VIII型胶原蛋白。
在一个实施方案中，多肽具有细胞粘附活性或者具有三螺旋结构。
在一个实施方案中，多肽包含选自下组的氨基酸序列或其变体：SEQ ID NO:2、5、8、11、14、17、20、23、26或29，所述变体是(1)所述氨基酸序列中突变一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列或者(2)与所述氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，突变选自取代、添加、插入或缺失。在一个实施方案中，取代是保守氨基酸取代。
在另一个方面，提供了核酸，其编码本文所述的多肽。在一个实施方案中，其中核酸包含经密码子优化的核苷酸序列。在一个实施方案中，针对大肠杆菌表达进行密码子优化的核苷酸序列。在一个实施方案中，核酸包含选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21、24、27或30。
在另一个方面，提供了载体，其包含本文所述的核酸。在一个实施方案中，载体包含与所述核酸可操作连接的表达控制元件、纯化标签的核苷酸和/或前导序列的核苷酸。在一个实施方案中，表达控制元件选自启动子、终止子或增强子。在一个实施方案中，纯化标签选自His标签、GST标签、MBP标签、SUMO标签或NusA标签。在一个实施方案中，载体是表达载体或克隆载体，优选为pET-28a(+)。pET-28a(+)可以包含N端的His、Thrombin和T7蛋白标签、和C端His标签。在本文中，多肽的N端可以包含酶切位点以便于纯化，例如TEV酶酶切位点。
在另一个方面，提供了宿主细胞，其包含本文所述的核酸或载体。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞或原核细胞。在一个实施方案中，真核细胞是酵母细胞、动物细胞和/或昆虫细胞，在一个实施方案中，原核细胞是大肠杆菌细胞，例如大肠杆菌BL21。
在另一个方面，提供了组合物，其包含本文所述的多肽、核酸、载体和宿主细胞中的一个或多个。在一个实施方案中，组合物是试剂盒。在一个实施方案中，组合物是生物敷料、人体仿生材料、整形美容材料、类器官培养材料、心血管支架材料、涂层材料、组织注射填充材料、眼科材料、妇产科生物材料、神经修复再生材料、肝脏组织材料及血管修复再生材料、3D打印人造器官生物材料、化妆品原料、药用辅料和食品添加剂中的一种或多种。在一个实施方案中，组合物为注射用组合物或口服用组合物。
在另一个方面，提供了本文的多肽、核酸、载体、宿主细胞和/或组合物在生物敷料、人体仿生材料、整形美容材料、类器官培养材料、心血管支架材料、涂层材料、组织注射填充材料、眼科材料、妇产科生物材料、神经修复再生材料、肝脏组织材料及血管修复再生材料、3D打印人造器官生物材料、化妆品原料、药用辅料和食品添加剂中的一种或多种中的用途。
在另一个方面，提供了促进细胞粘附的方法，其包括使本文的多肽、核酸、载体、宿主细胞和/或组合物与细胞接触的步骤。在一个实施方案中，细胞是动物细胞。动物细胞可以是哺乳动物细胞或人细胞。
在另一个方面，提供了对有需要的受试者进行整形美容、组织注射填充、眼科治疗、神经修复或血管修复的方法，其包括对受试者施用本文的多肽。在一个实施方案中，施用为口服施用或注射施用。在一个实施方案中，受试者具有Ⅷ型胶原蛋白缺陷相关的疾病或病症，例如眼前节发育不全。
在另一个方面，提供了生产本文所述的多肽，其包括：
(1)在合适的培养条件下培养本文所述的宿主细胞；
(2)收获包含多肽的宿主细胞和/或培养基；和
(3)纯化多肽。
在一个实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌细胞，优选为大肠杆菌BL21(DE3)细胞。
在一个实施方案中，步骤(1)包括将大肠杆菌细胞在LB培养基中培养并且通过IPTG诱导表达。
在一个实施方案中，步骤(2)包括收获大肠杆菌菌体，重悬于平衡工作液中，对大肠杆菌菌体进行均质化，优选高压均质化，分离上清液。在一个实施方案中，平衡工作液包含100-500mM氯化钠、10-50mM Tris、10-50mM咪唑，pH7-9。
在一个实施方案中，步骤(3)包括粗纯、酶切、精纯和/或反挂镍柱纯化。在一个实施方案中，步骤(3)包括粗纯，以及以下一个或多个：酶切、精纯和/或反挂镍柱纯化。
在一个实施方案中，粗纯包括对上清液进行Ni-琼脂糖凝胶柱纯化以得到含目标蛋白的洗脱液，其中洗脱液包含100-500mM氯化钠、10-50mM Tris和100-500mM咪唑，优选pH7-9。
在一个实施方案中，精纯包括用强阴离子交换层析柱对酶切后的产物进行梯度洗脱；优选地，梯度洗脱包括0-15％ B液1-5分钟然后保持3个柱体积、15-30％ B液1-5分钟然后保持3个柱体积、30-50％ B液1-5分钟然后保持3个柱体积、50-100％ B液1-5分钟然后保持3个柱体积；其中B液包含10-50mM Tris，0.5-5M氯化钠，pH7-9。
在一个实施方案中，反挂镍柱纯化包括对酶切后的产物对Ni-琼脂糖凝胶柱纯化；优选地，洗脱液包含10-50mM Tris，10-50mM氯化钠，0.5-5M咪唑，pH7-9。
在本文中，酶切可以是TEV酶进行的酶切。
本发明的优点包括：
1.本发明的多肽(例如C8a-C8j)源自Ⅷ型胶原蛋白，为重组Ⅷ型胶原蛋白；特别地，源自人Ⅷ型胶原蛋白，是人重组Ⅷ型胶原蛋白；
2.本发明的多肽(例如C8a-C8j)适合于大肠杆菌的制备，并且可以进行分离纯化；
3.本发明的多肽(例如C8a和C8c)具有较大的表达量且适合于后续纯化；和
4.本发明的多肽具有细胞粘附活性。本发明的多肽(例如C8a和C8c)与阳性对照相比更高的细胞粘附活性。本发明的多肽具有三螺旋结构。
附图说明
图1显示C8a纯化结果。C8a精纯后收率较高，目的蛋白纯度较好。
图2显示C8b纯化结果。C8b的粗纯目的蛋白有部分杂带，1M洗有部分目的蛋白，精纯后收率较低，目的蛋白纯度较好。
图3显示C8c纯化结果。C8c的目的蛋白纯度较好,20:1酶切少部分目的蛋白未被切开。
图4显示C8d纯化结果。C8d的收率较高，反挂镍后75kDa处杂带未被去除。
图5显示C8e纯化结果。C8e的粗纯目的蛋白有杂带，收率较低。
图6显示C8f纯化结果。C8f的粗纯目的蛋白杂带较多。
图7显示C8g纯化结果。C8g的粗纯收率较高,目的蛋白为两条带。
图8显示C8h纯化结果。C8h的粗纯收率较低。
图9显示C8i纯化结果。对于C8i，20：1酶切大部分蛋白未被切开；5:1酶切仍未被切开。
图10显示C8j纯化结果。C8j的粗纯收率较低。
图11显示C8a、C8c细胞粘附活性检测结果。
图12显示C8a圆二色谱扫描分析结果。
图13显示C8c圆二色谱扫描分析结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如本文中所用，“VIII型胶原”被称为短胶原或网状胶原，VIII型胶原蛋白中有两条相似的α链，α1(VIII)和α2(VIII)，两种同源三聚体亚型，[α1(VIII)]3和[α2(VIII)]3，被认为是主要的分子种类，但也可能存在异源三聚体。牛眼后弹力层呈六角形网状结构，具有薄的VIII型胶原原纤维，免疫组织化学分析和电子显微镜观察表明，VIII型胶原蛋白是该结构骨架的主要成分。此外，通过旋转阴影分析观察到，VIII型胶原蛋白可能形成四面体样超分子结构，其能够提供结构支撑，调节细胞行为。
如本文中所用，“多肽”是指通过肽键连接的多个氨基酸残基。在本文中，多肽包含一个或多个重复单元。该重复单元可以来源于人Ⅷ型胶原蛋白。因此，多肽可以为人重组Ⅷ型胶原蛋白。多个重复单元可以通过接头连接，该接头可以是重复单元在人Ⅷ型胶原蛋白上的天然氨基酸残基，例如1-50个氨基酸残基。重复单元可以为SEQ ID NO:1、4、7、10、13、16、19、22、25或28。多肽可以为SEQ ID NO:2、5、8、11、14、17、20、23、26或29。
如本文中所用，“人重组Ⅷ型胶原蛋白”指由或基本上由源自人Ⅷ型胶原蛋白的序列组成的重组蛋白。在本文中，人重组Ⅷ型胶原蛋白可以由或基本上由人Ⅷ型胶原蛋白衍生的片段或片段的多个重复组成。
如本文中所用，术语“变体”意指具有细胞粘附活性的、在一个或多个位置处包括改变(即，取代、添加、插入和/或缺失)的多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占据某一位置的氨基酸；缺失意指去除占据某一位置的氨基酸；而插入意指在邻接并且紧随占据某一位置的氨基酸之后添加氨基酸。添加指在氨基酸序列的C端和/或N端添加一个或多个氨基酸残基。取代可以是保守取代。重复单元的变体可以是SEQ ID NO:1、4、7、10、13、16、19、22、25或28中改变或突变(即，取代、添加、插入和/或缺失)一个或多个氨基酸残基后的序列。多肽的变体可以是SEQ ID NO:2、5、8、11、14、17、20、23、26或29中改变或突变(即，取代、添加、插入和/或缺失)一个或多个氨基酸残基后的序列。
在本发明的上下文中，保守取代可由在一个或多个下表中反映的氨基酸类别内的取代定义：
保守类别的氨基酸残基：
酸性残基 D和E
碱性残基 K、R,和H
亲水的不带电残基 S、T、N和Q
脂族不带电残基 G、A、V、L和I
非极性不带电残基 C、M和P
芳族残基 F、Y和W。
备选的氨基酸残基的物理和功能分类：
含醇基残基 S和T
脂族残基 I、L、V和M
环烯基相关残基 F、H、W和Y
疏水的残基 A、C、F、G、H、I、L、M、R、T、V、W和Y
带负电残基 D和E
极性残基 C、D、E、H、K、N、Q、R、S和T
带正电残基 H、K和R
小残基 A、C、D、G、N、P、S、T和V
极小残基 A、G和S
参与转角形成的残基A、C、D、E、G、H、K、N、Q、R、S、P和T
柔性残基 Q、T、K、S、G、P、D、E和R。
如本文中所用，“细胞粘附”指细胞与胶原蛋白之间的粘附。胶原蛋白(例如本文中所述的多肽)可以促进细胞与培养细胞的容器之间的粘附。
如本文中所用，术语“表达”包括涉及多肽生产的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
如本文中所用，术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
如本文中所用，术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不相同的任何亲本细胞子代。
如本文中所用，术语“核酸”意指单链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以原本不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或者是合成的，该核酸分子可以包含一个或多个控制序列。核酸可以为SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21、24、27或30。核酸可以是经密码子优化的核酸，例如针对大肠杆菌细胞表达进行密码子优化的核酸。
术语“可操作地连接”意指如下构型，在该构型中，控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，使得该控制序列指导该编码序列的表达。
两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。出于本发明的目的，使用如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人，2000,Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序所实施的尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch，1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的尼德尔的输出(使用非简化选项获得)用作同一性百分比并且计算如下：
(相同的残基×100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人,2000,同上)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔程序所实施的尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,同上)来确定两个脱氧核苷酸序列之间的序列同一性。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的尼德尔的输出(使用非简化选项获得)用作同一性百分比并且计算如下：
(相同的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
多肽
本发明提供了多肽，其包含一个或多个重复单元，所述重复单元直接或通过接头连接，所述重复单元包含选自下组的氨基酸序列或其变体：SEQ ID NO:1、4、7、10、13、16、19、22、25或28。变体可以是(1)SEQ ID NO:1、4、7、10、13、16、19、22、25或28的氨基酸序列中突变一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列或者(2)与SEQ ID NO:1、4、7、10、13、16、19、22、25或28的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。就本文所述的多肽而言，突变可以选自取代、添加、插入或缺失。优选地，取代是保守氨基酸取代。
本文所述的多肽可以包含多个重复单元，例如2-50个重复单元，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个重复单元。
本文所述的多肽中的接头可以包含一个或多个氨基酸残基，例如1-10个、1-9个、1-8个、1-7个、1-6个、1-5个、1-4个、1-3个、或1-2个氨基酸残基。
本文所述的多肽是重组胶原蛋白，特别是重组VIII型胶原蛋白，优选具有细胞粘附活性。本文所述的多肽可以是源自人的，因此是人重组VIII型胶原蛋白。
本文所述的多肽也可以包含选自下组的氨基酸序列或其变体：SEQ ID NO:2、5、8、11、14、17、20、23、26或29，所述变体是(1)所述氨基酸序列中突变一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列或者(2)与所述氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
核酸构建体
本发明还涉及核酸构建体，其包含可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的核酸，在与控制序列相容的条件下，该一个或多个控制序列指导编码序列在合适的宿主细胞中的表达。载体可以包含核酸构建体。
可用多种方式操纵核酸以提供多肽的表达。取决于表达载体，在核酸插入载体之前对其进行操纵可能是理想的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰核酸的技术是本领域熟知的。
控制序列可为启动子，即，被宿主细胞识别用于表达编码本发明的多肽的多核苷酸。启动子包含介导多肽的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何核酸，包括变体、截短型及杂合型启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
用于指导本发明的载体或核酸构建体在细菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是获得自以下的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子。
在酵母宿主中，有用的启动子从以下的基因中获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。
控制序列也可为由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。终止子可操作地连接至编码多肽的多核苷酸的3'末端。在宿主细胞中有功能的任何终止子可用于本发明中。
细菌宿主细胞的优选终止子从以下的基因中获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。
酵母宿主细胞的优选终止子从以下的基因中获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。酵母宿主细胞的其他有用的终止子由Romanos等人(1992,同上)描述。
控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区，其提高该基因的表达。
合适的mRNA稳定子区的实例从以下基因中获得：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等人,1995,Journal of Bacteriology[细菌学杂志]177:3465-3471)。
控制序列也可以是前导序列，即对宿主细胞翻译很重要的mRNA的非翻译区域。前导序列可操作地连接至编码多肽的多核苷酸的5'末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。
酵母宿主细胞的合适的前导序列从以下的基因中获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
控制序列还可以是多腺苷酸化序列，一种可操作地连接至该多核苷酸的3’末端并且当转录时由宿主细胞识别为将多腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用在宿主细胞中有功能的任何多腺苷酸化序列。
酵母宿主细胞的有用的多腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.CellularBiol.[分子细胞生物学]15:5983-5990描述。
控制序列还可以是编码与多肽的N-末端连接的信号肽并指导多肽进入细胞的分泌途径的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5'-端本身可以含有在翻译阅读框中天然与编码多肽的编码序列区段相连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5'-端可以含有对编码序列而言是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地含有信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以单纯地替代天然信号肽编码序列以便增强多肽的分泌。然而，可以使用指导已表达多肽进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。
细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下的基因中获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews[微生物评论]57:109-137描述。
酵母宿主细胞的有用的信号肽从以下的基因中获得：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。其他的有用的信号肽编码序列由Romanos等人(1992，同上)描述。
表达载体
本发明还涉及包含本发明的核酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。核酸和控制序列可连接在一起以生产重组表达载体，该重组表达载体可包括一个或多个便利的限制位点以使编码该多肽的多核苷酸在此类位点处的插入或取代。可替代地，可以通过将核酸或包含该核酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达该多核苷酸。在产生表达载体时，编码序列如此位于载体中，使得编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是可以方便地经受重组DNA程序并且可以引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是直链或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何手段。可替代地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。而且，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的总DNA，或可以使用转座子。
载体优选地含有允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。
细菌选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因、或赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素、或四环素抗性)的标记。酵母宿主细胞的合适的标记包括但不限于：ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。
选择性标记可以是如WO 2010/039889中描述的双选择性标记系统。在一个方面，双选择性标记是hph-tk双选择性标记系统。
载体可以含有允许载体整合至宿主细胞基因组中或载体在细胞中独立于基因组而自主复制的元件。
对于整合到宿主细胞基因组中，载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，载体可以含有用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组中的染色体中的精确位置处的另外的多核苷酸。为了提高在精确位置处整合的可能性，整合元件应当含有足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、和800至10,000个碱基对，这些核酸与相对应的靶序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。而且，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。
为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，该复制起点使得载体在讨论中的宿主细胞中自主复制成为可能。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、和pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、和pAMβ1的复制起点。
用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合以及ARS4与CEN6的组合。
可将本发明多核苷酸的多于一个拷贝插入宿主细胞以提高多肽的生产。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数量，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝以及由此该多核苷酸的另外的拷贝的细胞。
用于连接上述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见例如，Sambrook等人,1989)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包含可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的多肽的生产。将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体维持，如较早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不相同的任何亲本细胞子代。宿主细胞的选择将在很大程度上取决于编码多肽的基因及其来源。
宿主细胞可以是在本发明的多肽的重组生产中有用的任何细胞，例如，原核生物或真核生物。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属以及脲原体属。
宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
宿主细胞可以是真菌细胞，如担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)等。真菌宿主细胞可以为酵母细胞，包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌纲(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。酵母宿主细胞可以是假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)细胞，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomycesnorbensis)、卵形酵母(Saccharomyces oviformis)或解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)细胞。
生产方法
本发明还涉及生产本文所述的多肽，其包括：
(1)在合适的培养条件下培养本文所述的宿主细胞；
(2)收获包含多肽的宿主细胞和/或培养基；和
(3)纯化多肽。
宿主细胞是在合适的使用本领域已知的方法生产多肽的营养培养基中培养的。例如，可通过摇瓶培养、或在实验室或工业发酵器中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)培养细胞，该培养在合适的介质中并且在使多肽表达和/或分离的条件下进行。使用本领域中已知的程序，培养发生在包含碳和氮来源及无机盐的合适的营养培养基中。合适的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽被分泌到该营养培养基中，那么可以直接从该培养基中回收该多肽。如果多肽不进行分泌，那么其可以从细胞裂解液中进行回收。
可以使用本领域已知的对于多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法包括但不限于：特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定多肽的活性。
可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，可通过常规程序，包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀，从营养培养基回收多肽。在一个方面，回收包含多肽的发酵液。
可以通过本领域已知的多种程序纯化多肽，包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水色谱法、聚焦色谱法、和尺寸排阻色谱法)、电泳程序(例如，制备型等电聚焦电泳)、差异性溶解(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或提取，以便获得基本上纯的多肽。
步骤(1)可以包括以下一个或多个步骤：构建表达质粒，例如将编码核苷酸序列插入pET-28a-Trx-His表达载体中得到重组表达质粒。可以将构建成功的表达质粒转化大肠杆菌细胞中(例如大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3))。具体过程可以为：(1)取待转化的质粒加入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中；(2)将混合物置于冰上冰浴(例如10-60min，例如30min)，然后水浴热激(例如于40-50℃，例如42℃，45-90s)，取出后置于冰上冰浴(例如1-5min，例如2min)；(3)加入液体LB培养基，然后培养(例如于35-40℃，例如37℃、150-300rpm，例如220rpm条件下培养40-80min，例如60min)；(4)涂布菌液并且挑选单菌落。例如取菌液均匀涂布在含有氨苄西林钠LB平板上，将平板在37℃的培养箱中培养15-17h，待其长出大小均匀的菌落。
步骤(2)可以包括将单菌落于含有抗生素储液的LB培养基中培养(例如在150-300rpm，例如220rpm，35-40℃，例如37℃恒温摇床中5-10h，例如7h)。再将培养后的摇瓶降温至10-20℃，例如16℃，添加IPTG诱导表达一段时间后收集菌体(例如通过离心收集)。
步骤(3)可以包括将菌体用平衡工作液重悬，将菌液降温至≤15℃，进行均质(例如高压均质，例如1-5次，例如2次)，均质后的菌液分离得到上清液。平衡工作液可以包含100-500mM氯化钠、10-50mM Tris和10-50mM咪唑，pH7-9。例如，氯化钠的浓度可以为110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480或490nM。Tris的浓度可以为10、15、20、25、30、35、40、45或50nM。咪唑的浓度可以为10、15、20、25、30、35、40、45或50nM。pH可以为7、7.5、8、8.5或9。
步骤(3)可以包括对多肽进行纯化和酶切。纯化可以是粗纯，包括对上清液进行Ni-琼脂糖凝胶柱纯化以得到含目标蛋白的洗脱液。粗纯可以包括水洗柱材，例如2-10个柱体积(CV)，例如5个CV。可以对柱材用平衡液(200mM氯化钠、25mM Tris、20mM咪唑，pH8.0)平衡，例如2-10个CV，例如5个CV。平衡液可以包含100-500mM氯化钠、10-50mM Tris和10-50mM咪唑，pH7-9。例如，氯化钠的浓度可以为110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480或490nM。Tris的浓度可以为10、15、20、25、30、35、40、45或50nM。咪唑的浓度可以为10、15、20、25、30、35、40、45或50nM。pH可以为7、7.5、8、8.5或9。
步骤(3)可以包括将上清液加入柱材中，用洗杂液清洗杂蛋白。洗杂液可以包含100-500mM氯化钠、10-50mM Tris和10-50mM咪唑，pH7-9。例如，氯化钠的浓度可以为110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480或490nM。Tris的浓度可以为10、15、20、25、30、35、40、45或50nM。咪唑的浓度可以为10、15、20、25、30、35、40、45或50nM。pH可以为7、7.5、8、8.5或9。然后，可以添加洗脱液并且收集流穿液。洗脱液可以包含100-500mM氯化钠、10-50mM Tris、100-500mM咪唑，pH8.0。例如，氯化钠的浓度可以为110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480或490nM。Tris的浓度可以为10、15、20、25、30、35、40、45或50nM。咪唑的浓度可以为110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480或490nM。pH可以为7、7.5、8、8.5或9。
酶切可以包括添加TEV酶酶切(按蛋白总量与TEV酶总量比为10-100:1，例如50:1，10-20℃，例如16℃酶切2-8h，例如4h)。将酶切后的蛋白液透析，例如放入透析袋，于1-6℃，例如4℃透析1-8h，例如2h，再转移至新的透析液中1-6℃，例如4℃过夜透析。
纯化可以包括精纯(例如蛋白等电点＞8.0)。优选地，精纯包括用强阴离子交换层析柱(例如pH可以为7、7.5、8、8.5或9。)对含目标蛋白的洗脱液或酶切后的产物(例如酶切且透析后的产物)进行梯度洗脱。梯度洗脱包括0-15％ B液1-5分钟然后保持1-5个，例如3个柱体积、15-30％ B液1-5分钟然后保持1-5个，例如3个柱体积、30-50％ B液1-5分钟然后保持1-5个，例如3个柱体积、50-100％ B液1-5分钟然后保持1-5个，例如3个柱体积。B液可以包含10-50mM Tris，0.5-5M氯化钠，pH7-9。例如，Tris的浓度为15、20、25、30、35、40或45mM。氯化钠的浓度为1、2、3或4M。pH可以为7、7.5、8、8.5或9。精纯可以包括使用A液平衡柱材并且上样，然后梯度洗脱。A液可以包含10-50mM Tris，10-50mM氯化钠，pH7-9。例如，Tris的浓度为15、20、25、30、35、40或45mM。氯化钠的浓度为15、20、25、30、35、40或45mM。pH可以为7、7.5、8、8.5或9。
纯化可以包括反挂镍柱纯化(例如蛋白等电点<8.0)。反挂镍柱纯化可以包括对酶切后的产物(例如透析后的产物)对Ni-琼脂糖凝胶柱纯化。洗脱液可以包含10-50mM(例如15、20、25、30、35、40或45mM)Tris，10-50mM(例如15、20、25、30、35、40或45mM)氯化钠，0.5-5M(例如1、2、3或4M)咪唑，pH7-9(例如7、7.5、8、8.5或9)。
进一步提供以下实施例以阐明本发明。
实施例
本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。
实施例1：Ⅷ型胶原蛋白片段的构建、表达和筛选
1、进行大规模功能区筛选，得到以下不同的重组人源化Ⅷ型胶原蛋白的目的基因功能区。
1)C8a氨基酸序列：
gKpgmpgmpgKpgamgmpgaKgEigqKgEigpmgipgpqgppgphglp(SEQ ID NO:1)
gKpgmpgmpgKpgamgmpgaKgEigqKgEigpmgipgpqgppgphglp
gKpgmpgmpgKpgamgmpgaKgEigqKgEigpmgipgpqgppgphglp
gKpgmpgmpgKpgamgmpgaKgEigqKgEigpmgipgpqgppgphglpgKpgmpgmpgKpgamgmpgaKgEigqKgEigpmgipgpqgppgphglpgKpgmpgmpgKpgamgmpgaKgEigqKgEigpmgipgpqgppgphglp
(其中C8a的重复单元的氨基酸序列以SEQ ID NO:1所示，重复数目为6；C8a的氨基酸序列以SEQ ID NO:2所示)
碱基序列：
2)C8b氨基酸序列：
gKpggpglpgqpgpKgDRgpKglpgpqglRgpKgDK(SEQ ID NO:7)
gKpggpglpgqpgpKgDRgpKglpgpqglRgpKgDK
gKpggpglpgqpgpKgDRgpKglpgpqglRgpKgDK
gKpggpglpgqpgpKgDRgpKglpgpqglRgpKgDK
gKpggpglpgqpgpKgDRgpKglpgpqglRgpKgDK
gKpggpglpgqpgpKgDRgpKglpgpqglRgpKgDK
(其中C8b的重复单元的氨基酸序列以SEQ ID NO:7所示，重复数目为6；C8b的氨基酸序列以SEQ ID NO:8所示)
碱基序列：
3)C8c氨基酸序列：
gKpgvtgfpgpqgplgKpgapgEpgpqgpigvpgvqgppgip(SEQ ID NO:4)
gKpgvtgfpgpqgplgKpgapgEpgpqgpigvpgvqgppgip
gKpgvtgfpgpqgplgKpgapgEpgpqgpigvpgvqgppgip
gKpgvtgfpgpqgplgKpgapgEpgpqgpigvpgvqgppgip
gKpgvtgfpgpqgplgKpgapgEpgpqgpigvpgvqgppgip
gKpgvtgfpgpqgplgKpgapgEpgpqgpigvpgvqgppgip
(其中C8c的重复单元的氨基酸序列以SEQ ID NO:4所示，重复数目为6；C8c的氨基酸序列以SEQ ID NO:5所示)
碱基序列：
4)C8d氨基酸序列：
gKpgqDgipgqpgfpggKgEqglpglpgppglp(SEQ ID NO:10)
gKpgqDgipgqpgfpggKgEqglpglpgppglp
gKpgqDgipgqpgfpggKgEqglpglpgppglp
gKpgqDgipgqpgfpggKgEqglpglpgppglp
gKpgqDgipgqpgfpggKgEqglpglpgppglp
gKpgqDgipgqpgfpggKgEqglpglpgppglp
(其中C8d的重复单元的氨基酸序列以SEQ ID NO:10所示，重复数目为6；C8d的氨基酸序列以SEQ ID NO:11所示)
碱基序列：
5)C8e氨基酸序列：
gKpgfpgpKgDRgmggvpgalgpRgEKgpigapgiggppgEpglpgipgpmgppgaigfpgpKgEggivgpqgppgpKgEpglqgfpgKpgflgEvgppgmRglpgpigpKgEagqKgvpglpgvpgllgpKgEpgipgDqglqgppgipgiggpsgpigppgipgpKgEpglpgppgfp(SEQ ID NO:13)
gKpgfpgpKgDRgmggvpgalgpRgEKgpigapgiggppgEpglpgipgpmgppgaigfpgpKgEggivgpqgppgpKgEpglqgfpgKpgflgEvgppgmRglpgpigpKgEagqKgvpglpgvpgllgpKgEpgipgDqglqgppgipgiggpsgpigppgipgpKgEpglpgppgfp
(其中C8e的重复单元的氨基酸序列以SEQ ID NO:13所示，重复数目为2；C8e的氨基酸序列以SEQ ID NO:14所示)
碱基序列：
6)C8f氨基酸序列：
gKpgfpgpKgDRgmggvpgalgpRgEKgpigapgiggppgEpglpgipgpmgppgaigfpgpKgEggivgpqgppgpKgEpglqgfpgKpgflgEvgppgmRglpgpigpKgEagqKgvpglpgvpgllgpKgEpgipgDq(SEQID NO:16)
gKpgfpgpKgDRgmggvpgalgpRgEKgpigapgiggppgEpglpgipgpmgppgaigfpgpKgEggivgpqgppgpKgEpglqgfpgKpgflgEvgppgmRglpgpigpKgEagqKgvpglpgvpgllgpKgEpgipgDq(其中C8f的重复单元的氨基酸序列以SEQ ID NO:16所示，重复数目为2；C8f的氨基酸序列以SEQ ID NO:17所示)
碱基序列：
7)C8g氨基酸序列：
gKpgfpgpKgDRgmggvpgalgpRgEKgpigapgiggppgEp(SEQ ID NO:19)
gKpgfpgpKgDRgmggvpgalgpRgEKgpigapgiggppgEp
gKpgfpgpKgDRgmggvpgalgpRgEKgpigapgiggppgEp
gKpgfpgpKgDRgmggvpgalgpRgEKgpigapgiggppgEp
gKpgfpgpKgDRgmggvpgalgpRgEKgpigapgiggppgEp
gKpgfpgpKgDRgmggvpgalgpRgEKgpigapgiggppgEp(其中C8g的重复单元的氨基酸序列以SEQ ID NO:19所示，重复数目为6；C8g的氨基酸序列以SEQ ID NO:20所示)
碱基序列：
/>
8)C8h氨基酸序列：
gpKgEggivgpqgppgpKgEpglqgfpgKpgflgEvgppgmR(SEQ ID NO:22)
gpKgEggivgpqgppgpKgEpglqgfpgKpgflgEvgppgmR
gpKgEggivgpqgppgpKgEpglqgfpgKpgflgEvgppgmR
gpKgEggivgpqgppgpKgEpglqgfpgKpgflgEvgppgmR
gpKgEggivgpqgppgpKgEpglqgfpgKpgflgEvgppgmR
gpKgEggivgpqgppgpKgEpglqgfpgKpgflgEvgppgmR(其中C8h的重复单元的氨基酸序列以SEQ ID NO:22所示，重复数目为6；C8h的氨基酸序列以SEQ ID NO:23所示)
碱基序列：
9)C8i氨基酸序列：
gpKgEagqKgvpglpgvpgllgpKgEpgipgDq(SEQ ID NO:25)
gpKgEagqKgvpglpgvpgllgpKgEpgipgDq
gpKgEagqKgvpglpgvpgllgpKgEpgipgDq
gpKgEagqKgvpglpgvpgllgpKgEpgipgDq
gpKgEagqKgvpglpgvpgllgpKgEpgipgDq
gpKgEagqKgvpglpgvpgllgpKgEpgipgDq(其中C8i的重复单元的氨基酸序列以SEQID NO:25所示，重复数目为6；C8i的氨基酸序列以SEQ ID NO:26所示)
碱基序列：
10)C8j氨基酸序列：
gKpgvaglhgppgKpgalgpqgqpglpgppgppgppgpp(SEQ ID NO:28)
gKpgvaglhgppgKpgalgpqgqpglpgppgppgppgpp
gKpgvaglhgppgKpgalgpqgqpglpgppgppgppgpp
gKpgvaglhgppgKpgalgpqgqpglpgppgppgppgpp
gKpgvaglhgppgKpgalgpqgqpglpgppgppgppgpp
gKpgvaglhgppgKpgalgpqgqpglpgppgppgppgpp(其中C8j的重复单元的氨基酸序列以SEQ ID NO:28所示，重复数目为6；C8j的氨基酸序列以SEQ ID NO:29所示)
碱基序列：
上述每种编码核苷酸序列为商业合成。将上述每种编码核苷酸序列(在5’端添加了胶原工具酶酶切位点，胶原工具酶酶切位点的氨基酸序列为ENLYFQ，核苷酸序列为GAAAACCTGTATTTCCAG)。插入pET-28a-Trx-His表达载体的KpnI和XhoI酶切位点之间，得到重组表达质粒。
3、将构建成功的表达质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)。具体过程为：(1)在超低温冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)置于冰上，待半融时取2μl待转化的质粒加入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，稍微混匀2-3次。(2)将混合物置于冰上冰浴30min，然后于42℃水浴热激45-90s，取出后置于冰上冰浴2min。(3)转移至生物安全柜中，并加入700μl液体LB培养基，然后于37℃、220rpm条件下培养60min。(4)取200μl的菌液均匀涂布在含有氨苄西林钠的LB平板上。(5)将平板在37℃的培养箱中培养15-17h，待其长出大小均匀的菌落。
4、从转化好的LB平板中挑取5-6个单菌落于含有抗生素储液的LB培养基的摇瓶中，在220rpm，37℃恒温摇床中7h。再将培养后的摇瓶降温至16℃，添加IPTG诱导表达一段时间后，将菌液分装于离心瓶中，于8000rpm、4℃离心10min，收集菌体，并记录菌体重量，取样(标注：菌液)进行电泳检测。
5、将收集的菌体用平衡工作液(200mM氯化钠、25mM Tris、20mM咪唑，pH8.0)重悬，将菌液降温至≤15℃，进行均质，高压均质两次(分别取两次均质后的样品标注：均一、均二)，完成后收集菌液。将均质后的菌液分装至离心瓶中，于17000rpm、4℃离心30min，收集上清液，取上清液(标注为上清)和沉淀(标注为沉淀)进行电泳检测。
6、将重组人源化Ⅷ型胶原蛋白的进行纯化和酶切，具体过程是：(1)粗纯：a.水洗柱材(Ni6FF，Cytiva)，5个CV。b.平衡液(200mM氯化钠、25mM Tris、20mM咪唑，pH8.0)平衡柱材，5个CV。c.上样：将离心后的上清液加入柱材中，直至液体流完后，取流穿进行电泳检验(标注为流穿)。d.清洗杂蛋白：添加洗杂液25mL(200mM氯化钠，25mM Tris，20mM咪唑)至液体流完，并取洗杂流穿进行电泳检验(标注为洗杂)。e.收集目的蛋白：添加20mL洗脱液(200mM氯化钠、25mM Tris、250mM咪唑，pH8.0)，并收集流穿液(标注：洗脱)，检测蛋白浓度计算蛋白量，并进行电泳检测。f.用1M咪唑工作液清洗柱材(标注为1M洗)。g.纯化水清洗柱材。(2)酶切：按蛋白总量与TEV酶总量比为50：1(若未切开，考虑增加酶浓度，例如总量比为20:1或5:1)，添加TEV酶，16℃酶切4h，取样(标注为切后)进行电泳检测。将酶切后的蛋白液放入透析袋，于4℃透析2h，再转移至新的透析液中4℃过夜透析(标注为换液)。
(3)精纯(蛋白等电点＞8.0)：a.平衡柱材(Capto Q，Cytiva)：使用A液(20mMTris，20mM氯化钠，pH8.0)将柱材平衡，流速为10ml/min。b.上样：流速为5ml/min，上样并收集流穿(标注为QFL)，并进行电泳检测。c.梯度洗脱：分别设置0-15％ B液(20mM Tris，1M氯化钠，pH8.0)2min(标注为0-15％ B洗)然后保持3个CV、15-30％ B液2min然后保持3个CV、30-50％ B液2min然后保持3个CV、50-100％ B液2min然后保持3个CV，出峰收集并进行电泳检测。d.清洗柱材。将蛋白储存在4℃环境中。
(4)反挂镍(Ni6FF，Cytiva)(蛋白等电点＜8.0)：a.平衡柱材：使用A液(20mMTris，20mM氯化钠，20mM咪唑，pH8.0)将柱材平衡，5个CV。b.上样：将酶切换液后的蛋白加入柱材中，直至液体流完后，取流穿进行电泳检测(标注为反挂镍)。c.用1M咪唑工作液(20mMTris，20mM氯化钠，1M咪唑，pH8.0)清洗柱材(标注为1M洗)。d.纯化水清洗柱材。将蛋白储存在4℃环境中。
7、浓度检测
精确量取适量样品，用洗脱液稀释10-50倍，用玻璃棒充分搅拌均匀。使用紫外可见分光光度计在280nm处测定吸光度，根据公式C(mg/ml)＝A280×吸光系数×稀释倍数，计算蛋白浓度(注：吸光系数可根据氨基酸序列得出，吸光度值需在0.1-1)。
浓度检测结果如下：
蛋白表达量C8a>C8i>C8b>C8g>C8d>C8c>C8f>C8e>C8j>C8h。
8、电泳检测
具体过程为：取样品蛋白液40μl，加入10μl 5×的蛋白上样缓冲液(250mM的Tris-HCl(pH6.8)，10％SDS,0.5％溴酚蓝，50％甘油，5％β-巯基乙醇)，置于100℃沸水中煮10min，然后每孔10μl加入SDS-PAGE蛋白胶中，电压80V跑2h后，用考马斯亮蓝染色液(0.1％考马斯亮蓝R-250，25％异丙醇，10％冰醋酸)进行蛋白染色20min，再利用蛋白脱色液(10％醋酸，5％乙醇)进行脱色。
电泳检测结果显示：
图1显示C8a纯化结果。C8a精纯后收率较高，目的蛋白纯度较好。图2显示C8b纯化结果。C8b的粗纯目的蛋白有部分杂带，1M洗有部分目的蛋白，精纯后收率较低，目的蛋白纯度较好。图3显示C8c纯化结果。C8c的目的蛋白纯度较好，20:1酶切少部分目的蛋白未被切开。图4显示C8d纯化结果。C8d的收率较高，反挂镍后75kDa处杂带未被去除。图5显示C8e纯化结果。C8e的粗纯目的蛋白有杂带，收率较低。图6显示C8f纯化结果。C8f的粗纯目的蛋白杂带较多。图7显示C8g纯化结果。C8g的粗纯收率较高,目的蛋白为两条带。图8显示C8h纯化结果。C8h的粗纯收率较低。图9显示C8i纯化结果。对于C8i，20：1酶切大部分蛋白未被切开；5:1酶切仍未被切开。图10显示C8j纯化结果。C8j的粗纯收率较低。
电泳检测结果表明：1、C8e、C8h、C8j粗纯收率较低，目的蛋白条带较细；2、C8i粗纯目的蛋白35kDa处有一条明显杂带，基本不能被酶切；3、C8b、C8f目的蛋白杂带较多，精纯后收率较低；4、C8g收率较高，目的蛋白为两条带，纯度较低；5、C8d收率较高，反挂Ni柱后杂带较多，纯度较低；5、C8a、C8c收率较高，目的蛋白纯度较好。选择C8a、C8c进行后续检测。
实施例2：重组Ⅷ型人源化胶原蛋白的质谱检测
实验方法
蛋白样品经DTT还原和碘代乙酰胺烷基化处理后，加入胰蛋白酶酶解过夜。酶解后得到的肽段再经C18ZipTip脱盐后，与基质α-cyano-4-hydroxycinnamic acid(CHCA)混合点板。最后用基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪MALDI-TOF/TOF UlraflextremeTM，Brucker，Germany进行分析(肽指纹图谱的技术可以参考Protein J.2016；35:212-7)。
数据检索是通过从本地masco网站上MS/MS Ion Search页面处理的。蛋白质鉴定结果是根据酶解后所产生的肽段的一级质谱得到的。检测参数：Trypsin酶解，设两个漏切位点。设定半胱氨酸的烷基化为固定修饰。甲硫氨酸的氧化为可变修饰。鉴定所用的数据库为NCBprot。
表1：重组Ⅷ型人源化胶原蛋白C8a质谱检出分子量及对应多肽
检出多肽片段与理论序列相比，覆盖率为100％，检测结果非常可信。
实施例3：重组Ⅷ型人源化胶原蛋白的生物活性检测
胶原蛋白的活性检测方法可以参考文献Juming Yao,Satoshi Yanagisawa,Tetsuo Asakura,Design,Expression and Characterization of Collagen-LikeProteins Based on the Cell Adhesive and Crosslinking Sequences Derived fromNative Collagens,J Biochem.136,643-649(2004)。具体实施方法如下：
(1)利用紫外吸收法检测待测蛋白样品的浓度，包括牛Ⅰ型胶原蛋白(中国食品药品检定研究院，编号：380002)、本发明提供的重组蛋白C8a、C8c。
具体为分别测定样品在215nm和225nm下的紫外光吸收，利用经验公式C(μg/mL)＝144×(A215-A225)计算蛋白质浓度，注意需在A215<1.5的情况下检测。该方法的原理是：测定肽键在远紫外光下的特征吸收，不受生色团含量的影响，干扰物质少，操作简便，适合检测考马斯亮蓝不显色的人胶原蛋白及其类似物。(参考文献为Walker JM.The ProteinProtocols Handbook,second edition.HumanaPress.43-45.)。检测完蛋白浓度后，用PBS将所有待测蛋白浓度调整到0.5mg/mL。
(2)样本准备：使用样品原液直接进行实验；使用D-PBS将阳性对照人Ⅰ型胶原蛋白(PC)稀释至1mg/ml备用；阴性对照为D-PBS缓冲液(NC)。
(3)包被：在酶标板中分别加入不同浓度的胶原蛋白及阳性对照和阴性对照，每孔100μL,每组设置5个复孔，4℃孵育过夜。
(4)封闭：弃去上清，加入100μL 1％BSA(56℃热灭活30min)，37℃孵育60min。弃去上清，用D-PBS溶液清洗3次。
(5)细胞接种：每孔中加入105个D-PBS重悬的培养状态良好3T3/NIH细胞，37℃孵育120min。每孔用D-PBS溶液清洗3次。
(6)检测：用CCK8检测试剂盒(厂商碧云天，产品目录编号C0038)检测OD450nm的吸光度。根据如下公式，计算细胞的贴壁程度。细胞的贴壁率即可以反应胶原蛋白的细胞粘附能力。细胞粘附能力越高，越能在短时间给细胞提供优质的外环境，帮助细胞贴壁。
式中：
P：相对细胞粘附性比值；
OD1：测试胶原蛋白样品各复孔在450nm处的紫外吸光度平均值；
OD2：对照胶原蛋白样品各复孔在450nm处的紫外吸光度平均值；
OD0：空白对照组各复孔在450nm处的紫外吸光度平均值。
(7)统计分析：使用双尾t-test统计分析目标重组人源化胶原蛋白与阴性对照的统计学差异，其中*，P＜0.05；**，P＜0.01；***，P＜0.001。
结果如图11所示，与D-PBS组相比，阳性对照有明显促细胞粘附作用，重组人源化胶原蛋白C8a、C8c亦对细胞粘附有促进作用。
实施例4：重组Ⅷ型人源化胶原蛋白圆二色谱紫外扫描分析
实验方法
(1)仪器参数设定
带宽(Band width): 1.0nm
步(Step) 1.0nm
测量范围:190-260nm(远-UV区扫描)/250-340nm(近-UV区扫描)
每个点的时间(Time-per-point) 0.5s
重复(Repeats) 3次
池长度(Cell Length) 10mm|0.5mm
温度 室温
(2)标准品远近紫外扫描
设定扫描波长180-340nm进行背景测试、空白缓冲液测试，然后采集1mg/mL CSA标准品溶液在180-340nm范围的圆二色远近紫外吸收。
样品处理
取精纯后的C8a、C8c蛋白样品，用10KD的超滤浓缩管(密理博)将蛋白分别浓缩至蛋白浓度为1mg/ml。
(4)样品远紫外扫描
将比色皿用2M HNO3浸泡过夜，去离子水冲洗干净后晾干，先采集背景，再采集空白缓冲液，然后在比色皿中加适量供试品按照上述参数进行190-260nm的远紫外扫描并采集数据。
(5)样品近紫外扫描
将比色皿用2M HNO3浸泡过夜，去离子水冲洗干净后晾干，先采集背景，再采集空白缓冲液，然后在比色皿中加入适量供试品按照上述参数进行250-340nm的近紫外扫描并采集数据。
(6)扫描图谱处理
对扫描后的所有图谱用软件Pro-Data Viewer进行subtract baseline、smoothing处理。
实验结果和分析
结果显示：C8a、C8c在221nm处均有正峰，表明该蛋白均具有三螺旋结构(即具有活性胶原蛋白普遍的结构特征)，结果见图12、图13。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (45)
1.重组胶原蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO: 2。
2.根据权利要求1所述的重组胶原蛋白，其具有三螺旋结构。
3.核酸，其编码根据权利要求1或2所述的重组胶原蛋白。
4.根据权利要求3所述的核酸，其包含经密码子优化的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的核酸，其包含针对大肠杆菌表达进行密码子优化的核苷酸序列。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的核酸，其包含SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列。
7.载体，其包含根据权利要求3-6中任一项所述的核酸。
8.根据权利要求7所述的载体，其包含与所述核酸可操作连接的表达控制元件、纯化标签的核苷酸和/或前导序列的核苷酸。
9.根据权利要求8所述的载体，其中表达控制元件选自启动子、终止子或增强子。
10.根据权利要求8所述的载体，其中纯化标签选自His标签、GST标签、MBP标签、SUMO标签或NusA标签。
11.根据权利要求7-10中任一项所述的载体，其是表达载体或克隆载体。
12.根据权利要求11所述的载体，其为pET-28a(+)。
13.宿主细胞，其包含根据权利要求3-6中任一项所述的核酸或根据权利要求7-12中任一项所述的载体；其中宿主细胞是真核细胞或原核细胞；其中真核细胞是酵母细胞、动物细胞和/或昆虫细胞。
14.根据权利要求13所述的宿主细胞，其中原核细胞是大肠杆菌细胞。
15.根据权利要求14所述的宿主细胞，其中大肠杆菌细胞为大肠杆菌BL21。
16.组合物，其包含根据权利要求1或2所述的重组胶原蛋白、根据权利要求3-6中任一项所述的核酸、根据权利要求7-12中任一项所述的载体和根据权利要求13-15中任一项所述的宿主细胞中的一个或多个。
17.根据权利要求16所述的组合物，其是试剂盒。
18.根据权利要求16所述的组合物，其是生物敷料、人体仿生材料、整形美容材料、类器官培养材料、心血管支架材料、涂层材料、组织注射填充材料、眼科材料、妇产科生物材料、神经修复再生材料、肝脏组织材料及血管修复再生材料、3D打印人造器官生物材料、化妆品原料、药用辅料和食品添加剂中的一种或多种。
19.根据权利要求18所述的组合物，其为注射用组合物或口服用组合物。
20.根据权利要求1或2所述的重组胶原蛋白、根据权利要求3-6中任一项所述的核酸、根据权利要求7-12中任一项所述的载体和/或根据权利要求13-15中任一项所述的宿主细胞在生物敷料、人体仿生材料、整形美容材料、类器官培养材料、心血管支架材料、涂层材料、组织注射填充材料、眼科材料、妇产科生物材料、神经修复再生材料、肝脏组织材料及血管修复再生材料、3D打印人造器官生物材料、化妆品原料、药用辅料和食品添加剂中的一种或多种中的用途。
21.在体外促进细胞粘附的方法，其包括使根据权利要求1或2所述的重组胶原蛋白、根据权利要求3-6中任一项所述的核酸、根据权利要求7-12中任一项所述的载体和/或根据权利要求13-15中任一项所述的宿主细胞与细胞在体外接触的步骤。
22.根据权利要求21所述的方法，其中细胞是动物细胞。
23.根据权利要求22所述的方法，其中动物细胞为哺乳动物细胞。
24.根据权利要求23所述的方法，其中哺乳动物细胞为人细胞。
25.生产根据权利要求1或2所述的重组胶原蛋白的方法，其包括：
(1) 在合适的培养条件下培养根据权利要求13-15中任一项所述的宿主细胞；
(2) 收获包含重组胶原蛋白的宿主细胞和/或培养基；和
(3) 纯化重组胶原蛋白。
26.根据权利要求25所述的方法，其中宿主细胞是大肠杆菌细胞。
27.根据权利要求26所述的方法，其中大肠杆菌细胞为大肠杆菌BL21(DE3)细胞。
28.根据权利要求26或27所述的方法，其中步骤(1)包括将大肠杆菌细胞在LB培养基中培养并且通过IPTG诱导表达。
29.根据权利要求26或27所述的方法，其中步骤(2)包括收获大肠杆菌菌体，重悬于平衡工作液中，对大肠杆菌菌体进行均质化，分离上清液。
30.根据权利要求29所述的方法，其中均质化为高压均质化。
31.根据权利要求29所述的方法，其中平衡工作液包含100-500 mM氯化钠、10-50 mMTris、10-50 mM咪唑，pH7-9。
32.根据权利要求25-27中任一项所述的方法，步骤(3)包括粗纯和以下一个或多个：酶切、精纯和反挂镍柱纯化。
33.根据权利要求32所述的方法，其中粗纯包括对上清液进行Ni-琼脂糖凝胶柱纯化以得到含目标蛋白的洗脱液，其中洗脱液包含100-500mM氯化钠、10-50mM Tris和100-500mM咪唑。
34.根据权利要求32所述的方法，其中洗脱液的pH为7-9。
35.根据权利要求32所述的方法，其中酶切包括用TEV酶酶切。
36.根据权利要求35所述的方法，其中以蛋白总量与TEV酶总量比为10-100:1酶切2-8h。
37.根据权利要求32所述的方法，其中精纯包括用强阴离子交换层析柱对酶切后的产物进行梯度洗脱。
38.根据权利要求37所述的方法，其中梯度洗脱包括0-15% B液1-5分钟然后保持3个柱体积、15-30% B液1-5分钟然后保持3个柱体积、30-50% B液1-5分钟然后保持3个柱体积、50-100% B液1-5分钟然后保持3个柱体积；其中B液包含10-50 mM Tris，0.5-5M氯化钠，pH7-9。
39.根据权利要求32所述的方法，其中反挂镍柱纯化包括对酶切后的产物对Ni-琼脂糖凝胶柱纯化。
40.根据权利要求39所述的方法，其中洗脱液包含10-50 mM Tris，10-50 mM氯化钠，0.5-5M咪唑，pH7-9。
41.权利要求1或2的重组胶原蛋白在制备用于对有需要的受试者进行整形美容、组织注射填充、眼科治疗、神经修复或血管修复的试剂盒或药物中的用途。
42.根据权利要求41所述的用途，其中药物为口服施用或注射施用药物。
43.根据权利要求41所述的用途，其中受试者具有Ⅷ型胶原蛋白缺陷相关的疾病或病症。
44.根据权利要求43所述的用途，其中Ⅷ型胶原蛋白缺陷相关的疾病或病症为眼前节发育不全。
45.根据权利要求41所述的用途，其中受试者是人。
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| GR01 | Patent grant | ||
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