CN100391974C

CN100391974C - 一种重组胶原蛋白及其合成和表达纯化方法

Info

Publication number: CN100391974C
Application number: CNB2006100489460A
Authority: CN
Inventors: 姚菊明
Original assignee: Zhejiang Sci Tech University ZSTU
Current assignee: Zhejiang Sci Tech University ZSTU
Priority date: 2006-01-09
Filing date: 2006-01-09
Publication date: 2008-06-04
Anticipated expiration: 2026-01-09
Also published as: CN1793177A

Abstract

本发明公开了一种重组胶原蛋白及其合成和表达纯化方法，该重组胶原蛋白氨基酸序列的主体为Gly-Xaa-Yaa的三联体，其中Xaa和Yaa中至少有一个带电氨基酸残基；其N末端或C末端包含半胱氨酸残基的序列；在整个氨基酸序列中包含有Arg-Gly-Asp残基组合。利用合成的低聚核苷酸经退火处理成为双螺旋的目的DNA单体；目的DNA单体通过在新质粒中的重复聚合连接而成为高分子DNA；将重组后的DNA转入到大肠杆菌，得到重组胶原蛋白。利用该方法得到的重组胶原蛋白具有和天然胶原蛋白相同的强而稳定的三重螺旋结构，因此具有良好的应用价值，可以广泛应用在生物医用材料、组织工程、化妆品和食品等领域。

Description

一种重组胶原蛋白及其合成和表达纯化方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种类似天然胶原蛋白的重组胶原蛋白及其合成方法。

背景技术

胶原蛋白在哺乳动物机体中含量丰富，通常以胶原纤维形式存在，对动物和人体皮肤、血管、筋腱和软骨的形成都十分重要，为这些结缔组织提供一定的结构和机械力学性质。由于胶原蛋白固有的生物相容性、生物降解性和吸收性以及促进细胞生长等诸多功能，使其在生物医用材料、组织工程、化妆品和食品等领域得到了广泛应用。在分子结构上，胶原蛋白是由平行线型链组成，每一线型链由三条扭曲左旋的聚肽链通过链间氢键紧密结合而形成一极强的右旋三重螺旋结构。而胶原肽链的一级结构多为Gly-Xaa-Yaa的三联体，它富含甘氨酸和脯氨酸残基；另外，还含有较多的不由DNA碱基密码子编码的羟脯氨酸，它是在蛋白质一级结构序列形成之后由特定的酶——脯氨酸-4-羟化酶作用于序列中的脯氨酸形成的，羟脯氨酸羟基通过分子间氢键对稳定胶原螺旋结构起着重要的作用。对于胶原蛋白而言，真正可发挥其生物功能的必须是由三条缠绕的直链组成，成为螺旋构造，若三条螺旋直链立体结构遭到加工或受高热而破坏，则成为一般俗称的明胶。

目前，胶原蛋白多半从牛筋和牛皮等动物组织中萃取，但随着疯牛病及其人类变种——“克雅氏症”的出现，人们开始担心牛胶原蛋白及其衍生物可能会受到污染，从而使其在医用领域的应用受到极大限制。随着重组DNA技术的发展，运用DNA重组技术所生产的重组人胶原蛋白，可提高纯度、降低动物体内萃取时受到病毒感染的风险，也可选择性地保留胶原蛋白的优点，并降低其抗原性。因此，国内外陆续有公司或研究单位开始开发重组胶原蛋白的生产技术。例如，美国FibroGen公司已成功表达包括I型胶原在内的9种不同类型的重组胶原蛋白Cohesion Technologies，Inc.也利用转基因的方法，培育出含类人胶原蛋白的小白鼠。但通过哺乳类或昆虫细胞株生产的成本极高、生产周期长，而且昆虫细胞和部分哺乳动物中没有足够水平的脯氨酸-4-羟化酶。研究人员也利用微生物(如大肠杆菌E.coli)来生产重组胶原蛋白，因为该方法的生产成本相对较低。但在大多数的大肠杆菌和酵母中其自身根本不能合成脯氨酸-4-羟化酶，因而不能形成羟脯氨酸残基。所以，用这些方法得到的重组胶原蛋白严格地说只是明胶，因为其内部并没有形成天然胶原所特有的三重螺旋结构，其理化性质和生物活性也因而受到很大的影响。

而半胱氨酸(Cys)的巯基是所有的氨基酸侧链中最活跃的反应基团，相邻分子链间的半胱氨酸残基可通过巯基形成二硫键，从而起到稳定蛋白质分子结构的作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种在羟脯氨酸缺失的情况下，利用基因重组技术，在重组胶原蛋白中导入具有半胱氨酸残基的氨基酸序列，然后利用大肠杆菌生产重组胶原蛋白的方法，从而提高重组胶原蛋白中三重螺旋结构的形成和稳定的一种方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明的一种重组胶原蛋白，其氨基酸序列的主体为Gly-Xaa-Yaa的三联体，其中Xaa和Yaa中至少有一个带电荷侧基的氨基酸残基；其N末端或C末端包含半胱氨酸残基的序列；在整个氨基酸序列中包含有Arg-Gly-Asp残基组合。

该重组胶原蛋白的氨基酸序列的主体为Gly-Glu-Arg，Gly-Asp-Leu，Gly-Lys-Asp，Gly-Arg-Asp，Gly-Arg-Leu，Gly-Glu-Asp，Gly-Asp-Leu三联体。

所述带电氨基酸残基为谷氨酸，天门冬氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，赖氨酸或精氨酸。

该重组胶原蛋白由如下所示的氨基酸序列组成：[Gly-Glu-Arg-Gly-Asp-Leu-Gly-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-Arg-Gly-Val-Val-Gly-Glu-Arg-Gly-Glu-Arg-Gly-Glu-Arg-Gly-Ala-Ser]_n-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Cys-Cys-Gly-Gly-Gly。

一种合成重组胶原蛋白的方法，包括以下步骤：

(1)利用化学合成的低聚核苷酸经退火处理成为双螺旋的目的DNA单体；

(2)目的DNA单体通过在新质粒中的Spe I和Nhe I限制性内切酶位点的重复聚合连接而成为高分子DNA；

(3)将高分子DNA连接入表达用质粒，并转入到表达用大肠杆菌宿主细胞，通过诱导剂诱导蛋白质表达；

(4)利用金属螯合层析对表达所得蛋白进行纯化，得到重组胶原蛋白。

所述的化学合成的低聚核苷酸的长度为200个碱基对或以下。

步骤(1)所述的低聚核苷酸为

Coll-1：

5’CTAGTGGCGAACGTGGTGATCTGGGCCCGCAGGGTATCGCGGGCCAGCGTGGTGTGGTTGGCGAGCGTGGTGAACGCGGCGAGCGTGGTG 3’

Coll-2：

5’CTAGCACCACGCTCGCCGCGTTCACCACGCTCCCGAACCACACCACGCTGGCCCGCGATACCCTGCGGGCCCAGATCACCACGTTCGCCA 3’

Fusion-1：

5’CTAGTGGCCCGCCAGGTCCGTGCTGTGGCGGTGGCG 3’

Fusion-2：

5’CTAGCGCCACCGCCACAGCACGGACCTGGCGGGCCA 3’

Adapter-1：

5’CTAGAATGACTAGTGGGCCCGCTAGCATGT 3’

Adapter-2：

5’CTAGACATGCTAGCGGGCCCACTAGTCATT 3’。

一种重组胶原蛋白的表达方法，包括以下步骤：

(1)将重组pET30a(+)-Coll(n)-Fusion质粒转化感受态细胞BL21(DE3)pLysS细菌，挑取单菌落接种于LB液体培养基，37℃振荡培养过夜，然后以1∶100接种于含10～50μg/ml卡纳霉素和25～170μg/ml氯霉素的TB液体培养基，当OD₆₀₀达到0.5～1.0左右时，加入浓度为0.1～2mM诱导剂IPTG诱导蛋白质的表达；

(2)继续培养2～5小时后经5000×g、4℃离心10分钟后收集菌体。

一种重组胶原蛋白的纯化方法，包括以下步骤：

(1)用3～7倍于细胞湿重的冰冷的细胞裂解缓冲液将菌体重悬，冰浴，超声波破碎细胞，使重组蛋白释放；

(2)20000×g，4℃离心30分钟，上清为澄清的细胞粗提物；该粗提物经金属螯合层析、蒸馏水中透析，再经冷冻干燥收集目的蛋白。

细胞破碎后液体粘度升高，若混合液的粘度达到较难进行层析操作，可适当稀释细胞裂解液，或加入含有终浓度为5mM的MgCl₂的10μg/ml无蛋白酶污染的DNA酶，以降低粘稠度。

本发明的有益之处在于：

(1)该胶原蛋白中虽不包含羟脯氨酸残基，但能形成类似天然胶原蛋白的稳定的三螺旋结构，从而解决了国际上重组胶原蛋白很难形成稳定三螺旋结构因而缺乏天然胶原活性的困境，属国内外首创。

(2)该胶原蛋白C末端的Cys能够与相邻蛋白分子上的Cys之间形成二硫键，从而起到形成和稳定胶原蛋白分子三螺旋结构的作用。

(3)该技术生产的重组胶原蛋白完全既具有天然胶原所固有的生物相容性以及热可逆成胶特性，又具有低免疫排异反应等安全性。它可以广泛应用在生物医用材料、组织工程、化妆品和食品等领域。

附图说明

图1为小鼠成纤维细胞BALB/3T3在本发明的实施例的重组胶原蛋白上经2小时培养后的细胞接着数量；

图中以天然胶原蛋白及纤维粘连蛋白的评价作对照。2小时培养反映的是细胞在载体上的粘附性能。

图2为小鼠成纤维细胞BALB/3T3在本发明的实施例的重组胶原蛋白上经24小时培养后的细胞接着数量；

图中以天然胶原蛋白及纤维粘连蛋白的评价作对照。24小时培养反映的是细胞在载体上的生长性能。

具体实施方式

下面以一个例子来说明本发明的技术方案：

本发明中所使用的三联体氨基酸序列都来源于天然胶原蛋白，如，Gly-Glu-Arg，Gly-Asp-Leu，Gly-Lys-Asp，Gly-Arg-Asp，Gly-Arg-Leu，Gly-Glu-Asp，Gly-Asp-Leu等，并且，这些氨基酸序列在天然胶原蛋白中的含量较多。

其特殊之处在于：它们都是以三联体Gly-Xaa-Yaa为基本的组成单元，Gly为甘氨酸；该类三联体中至少有一个带电荷侧基的氨基酸残基，例如Glu(谷氨酸)，Asp(天门冬氨酸)，Gln(谷氨酰胺)，Asn(天冬酰胺)，Lys(赖氨酸)和Arg(精氨酸)等。

另外，本发明中采用了另外一个氨基酸序列，如Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Cys-Cys-Gly-Gly-Gly。

其特殊之处在于：序列中包含了两个半胱氨酸(Cys)残基。

实施例1、重组胶原蛋白的构建：

一种设计的重组胶原蛋白的氨基酸序列如下：

[Gly-Glu-Arg-Gly-Asp-Leu-Gly-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-Arg-Gly-Val-Val-Gly-Glu-Arg-Gly-Glu-Arg-Gly-Glu-Arg-Gly-Ala-Ser]₈-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Cys-Cys-Gly-Gly-Gly

(1)设计和合成了四个低聚核苷酸：Coll-1，Coll-2，Fusion-1和Fusion-2，然后运用退火的方法分别得到两段双螺旋DNA，其核苷酸序列分别为：

Coll-1：

Coll-2：

Fusion-1：

5’CTAGTGGCCCGCCAGGTCCGTGCTGTGGCGGTGGCG 3’

Fusion-2：

5’CTAGCGCCACCGCCACAGCACGGACCTGGCGGGCCA 3’

Coll-1和Coll-2经退火处理所得双螺旋DNA对应于氨基酸序列Gly-Glu-Arg-Gly-Asp-Leu-Gly-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-Arg-Gly-Val-Val-Gly-Glu-Arg-Gly-Glu-Arg-Gly-Glu-Arg-Gly-Ala-Ser。

Fusion-1和Fusion-2经退火处理所得双螺旋DNA对应于氨基酸序列Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Cys-Cys-Gly-Gly-Gly

在两段DNA片断的两端，分别设计了Spe I和Nhe I限制性内切酶位点。

(2)设计两个低聚核苷酸(Adapter-1和Adapter-2)，然后运用退火的方法得到一段双螺旋DNA，序列为：

Adapter-1：

5’CTAGAATGACTAGTGGGCCCGCTAGCATGT 3’

Adapter-2：

5’CTAGACATGCTAGCGGGCCCACTAGTCATT 3’

把设计有Spe I和Nhe I限制性内切酶位点的Adapter DNA连接到质粒pUC118(购自Takara)的Xba I位点中，制作成一个新的质粒pUC118-linker。

其特殊之处在于：在原先没有限制性内切酶位点Spe I和Nhe I的pUC118中，通过重组技术导入了该位点而创建了一个新的质粒。

(3)用限制性内切酶Spe I和Nhe I对pUC118-linker进行切割，ClAP处理后，用1.2％琼脂糖凝胶电泳分离，切取目的片段，利用DNA凝胶回收试剂盒(Gel Extraction Kit)(购自碧云天公司)纯化后与胶原蛋白基因Coll连接，得到重组质粒，命名为pUC118-linker-Coll(1)，后转入大肠杆菌DH5α(购自Novagen)中，用氨苄青霉素进行克隆选择。将克隆株在1.5ml LB培养基中重新培养。以碱裂解法提取质粒，以Spe I-Nhe I双酶切法筛选接入正确外源基因的转化子。以Rapid Plasmid DNA Daily Mini-prep Kit小量制备质粒，并经DNA测序确认其序列，得质粒pUC118-linker-Coll(1)。

用Spe I和Nhe I对pUC118-linker-Coll(1)进行切割，用1.2％琼脂糖凝胶电泳分离，切取目的片段，利用DNA凝胶回收试剂盒(Gel Extraction Kit)纯化后得到单体Coll(1)；另一方面，用Spe I或Nhe I对pUC118-linker-Coll(1)进行切割，CIAP处理后，用1.2％琼脂糖凝胶电泳分离，切取目的片段，利用DNA凝胶回收试剂盒(Gel Extraction Kit)纯化后得到线性的pUC118-linker-Coll(1)。将单体Coll(1)与线性pUC118-linker-Coll(1)连接，得到重组质粒，命名为pUC118-linker-Coll(2)，后转入大肠杆菌DH5α中，用氨苄青霉素进行克隆选择。将克隆株在1.5ml LB培养基中重新培养，用碱裂解法提取与纯化带有两个重复(两倍体)目的DNA的质粒pUC118-linker-Coll(2)。

重复该步骤，就可以得到四倍体，八倍体和十六倍体等具有不同重复数量目的DNA的质粒。

(3)将以上多倍体，如八倍体pUC118-linker-Coll(8)用Spe I或Nhc I进行切割，CIAP处理后，用1.2％琼脂糖凝胶电泳分离，切取目的片段，利用DNA凝胶回收试剂盒(Gel Extraction Kit)纯化后得到线性的pUC118-linker-Coll(8)，将单体Fusion DNA与线性pUC118-linker-Coll(8)连接得到pUC118-linker-Coll(8)-Fusion，后转入大肠杆菌DH5α中，用氨苄青霉素进行克隆选择。将克隆株在1.5ml LB培养基中重新培养，用碱裂解法提取与纯化目的DNA的质粒pUC118-linker-Coll(8)-Fusion。

(4)用BamHI和HindIII对质粒pUC118-linker-Coll(8)-Fusion和pET30a(+)(购自Novagen)进行切割，用1.2％琼脂糖凝胶电泳分离，切取目的片段，利用DNA凝胶回收试剂盒(Gel Extraction Kit)纯化后得到Coll(8)-Fusion和线性pET30a(+)DNA；线性pET30a(+)DNA经CIAP处理后与Coll(8)-Fusion连接，并转入大肠杆菌DH5α中，用卡纳霉素进行克隆选择。将克隆株在1.5ml LB培养基中重新培养，带有目的DNA的表达质粒pET30a(+)-Coll(8)-Fusion用碱裂解法提取与纯化。

实施例2、重组胶原蛋白质的表达：

(1)将测序验证的pET30a(+)-Coll(8)-Fusion质粒转化感受态细胞BL21(DE3)pLysS(购自Novagen)细菌，挑取单菌落接种于LB液体培养基，37℃振荡培养过夜，然后以1∶100接种于含10-50μg/ml卡纳霉素和25-170μg/ml氯霉素的TB液体培养基，当OD₆₀₀达到0.5-1.0左右时，加入诱导剂IPTG诱导蛋白质的表达，IPTG的浓度为0.1-2mM。继续培养2-5小时后经离心收集菌体(5000×g，4℃离心10分钟)。

本发明的特殊之处在于：诱导表达的时间和温度可根据实际情况，如目的蛋白的可溶性，稳定性和表达量进行调整，可调整为采用30℃诱导4小时以上，或者20-25℃或12-15℃诱导过夜。

实施例3、重组胶原蛋白质的纯化：

用3-7倍于细胞湿重的冰冷的细胞裂解缓冲液(Cell Lysis Buffer)将上述收集的菌体重悬，冰浴，超声波破碎细胞，使蛋白Coll(8)-Fusion释放。细胞破碎后液体粘度升高，若混合液的粘度过高，可适当稀释细胞裂解液，或加入含有终浓度为5mM的MgCl₂的10μg/ml无蛋白酶污染的DNA酶，以降低粘稠度。20,000×g，4℃离心30分钟，上清即为澄清的细胞粗提物。该粗提物经金属螯合层析、蒸馏水中透析，再经冷冻干燥收集蛋白。蛋白质的表达和纯化结果通过SDS-PAGE凝胶电泳和免疫印迹实验进行确认。

实施例4、细胞粘附生长性能评价：

(1)将重组胶原蛋白溶解于PBS(磷酸缓冲盐溶液，pH 7.4)中，浓度为0.5％。以同样的方法溶解天然胶原蛋白及纤维粘连蛋白于PBS中。

(2)蛋白涂层：将上述三种0.5％蛋白溶液分别注入三个48口孔细胞培养板(Microplate)中，每个口孔注入蛋白溶液500μl于底部，经过30分钟后使其成层。

(3)细胞接种与培养：将小鼠成纤维细胞BALB/3T3(购自中国科学院上海生科院细胞资源中心)混悬于新鲜的液体培养基Eagle’s MEM(FBS)中，以每孔1×10⁵细胞的密度接种于上述培养板中，于37℃、5％CO₂、95％空气高湿度的培养箱中培养2小时和24小时。

(4)细胞接着数的评价：细胞培养结束后，使培养基从培养板上脱离，用500μl PBS冲洗三次并去除PBS，每孔注入200μl 0.5％Triton-X100/PBS保存一个晚上，使细胞悬浮。在细胞悬浮液中，加入LDH(乳酸脱氢酶)液，并直接在plate reader分析仪上测定340nm处的吸光度。

上述三种蛋白质材料经2小时(图1)和24小时(图2)培养后的细胞接着数量。2小时培养反映的是细胞在载体上的粘附性能，而24小时培养反映的是细胞在载体上的生长性能。两图均以天然胶原蛋白的细胞接着性为基准，即100来比较的。实验结果显示：无论是细胞在重组胶原蛋白上的粘附性能还是生长性能都超过了天然胶原的一倍以上，与纤维连接蛋白相近。因此，该重组胶原蛋白经适当加工后，具有很好的应用前景，尤其适用于生物医用材料、组织工程等领域的应用。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.一种重组胶原蛋白，其特征在于：该重组胶原蛋白由如下所示的氨基酸序列组成：[Gly-Glu-Arg-Gly-Asp-Leu-Gly-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-Arg-Gly-Val-Val-Gly-Glu-Arg-Gly-Glu-Arg-Gly-Glu-Arg-Gly-Ala-Ser]₈-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Cys-Cys-Gly-Gly-Gly。

2.一种合成如权利要求1所述的重组胶原蛋白的方法，其特征在于依次包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的重组胶原蛋白的合成方法，其特征在于：所述的化学合成的低聚核苷酸的长度为200个碱基对或以下。

4.根据权利要求2所述的重组胶原蛋白的合成方法，其特征在于：步骤(1)所述的低聚核苷酸为

Coll-1：

5’CTAGTGGCGAACGTGGTGATCTGGGCCCGCAGGGTATCGCGGGCCAGCGTGGTGTGGTT

GGCGAGCGTGGTGAACGCGGCGAGCGTGGTG 3’

Coll-2：

5’CTAGCACCACGCTCGCCGCGTTCACCACGCTCCCGAACCACACCACGCTGGCCCGCGAT

ACCCTGCGGGCCCAGATCACCACGTTCGCCA 3’

Fusion-1：

5’CTAGTGGCCCGCCAGGTCCGTGCTGTGGCGGTGGCG 3’

Fusion-2：

5’CTAGCGCCACCGCCACAGCACGGACCTGGCGGGCCA 3’

Adapter-1：

5’CTAGAATGACTAGTGGGCCCGCTAGCATGT 3’

Adapter-2：

5’CTAGACATGCTAGCGGGCCCACTAGTCATT 3’。

5.一种如权利要求1所述的重组胶原蛋白的表达方法，其特征在于依次包括以下步骤：

(1)将重组pET30a(+)-Coll(8)-Fusion质粒转化感受态细胞BL21(DE3)pLysS细菌，挑取单菌落接种于LB液体培养基，37℃振荡培养过夜，然后以1∶100接种于含10～50μg/ml卡纳霉素和25～170μg/ml氯霉素的TB液体培养基，当OD₆₀₀达到0.5～1.0左右时，加入浓度为0.1～2Mm诱导剂IPTG诱导蛋白质的表达；

(2)继续培养2～5小时后经5000×g、4℃离心10分钟后收集菌体。

6.一种如权利要求1所述的重组胶原蛋白的纯化方法，其特征在于依次包括以下步骤：

(1)用3～7倍于细胞湿重的冰冷的细胞裂解缓冲液将权利要求5中所述的菌体重悬，冰浴，超声波破碎细胞，使重组蛋白释放；

7.根据权利要求6所述的重组胶原蛋白的纯化方法，其特征在于：细胞破碎后液体粘度升高，若混合液的粘度达到较难进行层析操作，可适当稀释细胞裂解液，或加入含有终浓度为5mM的MgCl₂的10μg/ml无蛋白酶污染的DNA酶，以降低粘稠度。