CN1073980A

CN1073980A - 胶原样多肽

Info

Publication number: CN1073980A
Application number: CN 92112775
Authority: CN
Inventors: K·H·加德纳; R·L·洛克; J·P·奥布赖恩; F·R·沙伦米
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 1991-11-12
Filing date: 1992-11-12
Publication date: 1993-07-07
Also published as: JPH07501445A; EP0613496B1; EP0613496A1; JP3345816B2; DE69228254D1; DE69228254T2; WO1993010231A1; AU3130793A

Abstract

本发明涉及胶原样多肽。本发明的多肽具有提供某种化学和生物学活性的功能性片段。这些多肽也包括用于增强将该多肽加工成纤维或其它成型制品时的加工性能的结构特性。

Description

本发明涉及新的胶原样多肽。更具体地说，本发明涉及掺入了体现化学或生物学活性的功能片段和用以增强加工性能的结构成分的胶原样聚合物。

胶原是高等动物体内最重要的结构蛋白，在大多数脊椎动物中占蛋白质总量的约三分之一。胶原在人体中的普遍存在使得人们有兴趣将胶原样构建体在生物医学领域中加以广泛应用，特别是作为植入物替代或补充受损或患病的结构组织。

胶原可以从脊椎动物的皮肤、腱和骨胳中分离，也存在于无脊椎动物的全身。天然衍生的胶原物质依其来源而有多种多样的化学结构。这些物质可以在进行改变后得到新的物质，如皮革和明胶。

胶原具有多个水平上的结构等级。单个肽链的长度为1000-1100个氨基酸，并有由重复的三肽Gly-X-Y组成的氨基酸顺序，其中的X和Y可以是任何氨基酸，但最可能的是脯氨酸或羟脯氨酸。20个基本氨基酸和羟脯氨酸及其对应的单字母和三字母代码列于表12中。脯氨酸是在蛋白质合成过程中掺入到肽链中的，羟脯氨酸不是在蛋白质合成过程中掺入的，而是由合成后修饰作用由脯氨酸衍生而来。天然胶原或作为本发明主题的任何胶原样聚合物中的任何脯氨酸残基，原则上都可以经适当的化学或酶处理而转变成羟脯氨酸。因此，在聚合物结构或任何终产物的物质组合物中提到的脯氨酸，都应引伸地理解为是指脯氨酸或羟脯氨酸。但是，因为羟脯氨酸不能在蛋白质合成过程中掺入，并且也不存在编码羟脯氨酸的DNA顺序，所以，如果在任何结构中提到最初在体内合成的脯氨酸或编码脯氨酸的DNA顺序，都应理解为仅指脯氨酸。

经常出现的脯氨酸（和羟脯氨酸）残基，指导肽链形成每个三肽一圈的（左手）螺旋构象。每隔两个位置出现的甘氨酸（没有大侧链），使三条螺旋链裹在一起形成一个超螺旋的右手三股螺旋，正是这个每圈有30-40个残基的三股螺旋被认为是胶原的特征，限定了胶原的结构特点。三条肽链间形成的化学交联稳定了螺旋结构。

杆状三股螺旋结构称为原胶原分子。原胶原分子头尾相连以平行束排列成行形成胶原细纤维。原胶原分子间的头尾间隙沿每一细纤维长度方向有规律地交错开，产生特征性条纹图型。胶原细纤维可以组成交联的平行束而形成纤维，如腱中的纤维;也可以以随机交织的交联网络形式存在，如皮肤中的胶原。

在细菌中克隆特异DNA顺序的可能性已挖掘出了通过细菌生产新蛋白质的潜力。这些技术使科学家能设计出比天然来源蛋白质具有更广泛特性的构建体。

Ferrari等人在已公布的PCT申请（WO 88/03533）中公开了生产含有重复顺序的高分子量肽的方法。用合成的能够表达许多单个重复肽单位的核酸寡聚物组建核酸顺序，并将寡聚物连接成所需长度的多核苷酸。编码寡聚肽顺序的单个单位利用了氨基酸密码子的冗余性以避免以前由含有多重复单位的基因带来的问题。单个肽单位具有4-30个氨基酸，通常在同一个单位中相同的氨基酸至少出现两次，并通常被至少一个氨基酸分隔开。

Cappello和Ferrari在已公布的PCT申请（WO 90/05177）中公开了用重组技术制备的多肽聚合物。这些聚合物以天然存在的蛋白质（例如丝和胶原）为基础，并由于引入了一个插入的氨基酸顺序而被修饰。插入的氨基酸顺序能够与周围分子相互作用，但通常不参与聚合物的排列成分。插入顺序可以是一段天然存在的顺序，也可以是一段被修饰过的天然存在顺序，它可以提供进行交联或结合抗体或其它分子的化学活性位点。该专利申请还讨论了能在高温下经受热可逆性凝胶化作用的胶原样聚合物（CLP）。CLP聚合物主要由重复三肽顺序GPP组成，还包括其它三肽以减少总的基因重复性。还讨论了作为软涂料使用的CLP聚合物，该聚合物由于导入了Gly-Leu-Pro-Gly-Pro-Lys-Gly-Asp-Arg-Gly-Asp-Ala-Gly-Pro-Lys-Gly-Ala-Asp-Gly-Ser-Pro顺序而具有细胞附着官能团。

Williams等人的已公布的PCT申请（WO 88/05082）公开了包括胶原类似物在内的肽寡聚物的微生物生产方法。

因为天然胶原具有交联结构，如不经过化学或酶学消化作用继而丧失分子量，就不能重新溶解而用于纺丝、成型等方面。消化作用还使之不可能恢复在天然胶原中存在的全等级结构，因为在消化作用中被破坏的肽片段中有一些是指导高级结构的形成所需的。最后，天然胶原不容易被修饰而引入特定的化学或生物学官能团。

尽管在上文引用的资料中描述了各种用生物工程方法生产的胶原样聚合物，但这些聚合物的结构中还未掺入专门用于增强加工性能的任何特性。具体地说，还没有试图引入能对聚合物的溶解性提供pH依赖性控制的结构，以有利于纤维的纺丝或其它成型制品的制作。虽然交联的存在是天然胶原的特征，而且交联可能是固定（稳定）纤维和其它成型制品中胶原类似物的二级结构和三级结构所必需的，但也还没有人试图引入用以提供一些规则间隔的位点以供聚合物链进行受控化学交联的结构。

为便于纤维的纺丝而设计的结构所提供的聚合物溶解性的pH依赖性控制，也便于聚合物的化学或酶学衍生作用，特别是脯氨酸向羟脯氨酸的化学或酶学转变。已经熟知，胶原样聚合物发生热变性（加热使特征性三股螺旋解体）的温度是聚合物结构中羟脯氨酸与脯氨酸比值的函数。某些脯氨酸向羟脯氨酸的转变可能是生成在生理温度下不经交联就具有构象稳定性的物质所需要的。对聚合物溶解性的pH依赖性控制将有利于这一转变。

本发明提供了用生物工程技术生产的胶原样多肽，它具有为增强加工性能而设计的结构。这些多肽包括下式的嵌段共聚物：

其中，

A为具有通式[Gly-x-y]_3-30的氨基酸顺序的嵌段肽单位，其中，约50～75%的氨基酸x和y各自独立地选自脯氨酸和羟脯氨酸，每一个[Gly-x-y]氨基酸顺序可以相同或不同;

B为具有通式[Gly-x-y]_3-30的氨基酸顺序的嵌段肽单位，其中，约25-60%的氨基酸x和y各自独立地选自脯氨酸和羟脯氨酸，每一个[Gly-x-y]氨基酸顺序可以相同或不同：

C为具有通式[Gly-x-y]_3-30的氨基酸顺序的嵌段肽单位，其中，约25-60%的氨基酸x和y各自独立地选自脯氨酸和羟脯氨酸，其余的氨基酸x和y中至少有一个独立地选自赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬氨酸和谷氨酸，每一个[Gly-x-y]氨基酸顺序可以相同或不同;

f1、k、f2和m各自等于或大于1;

j1和j2之和等于或大于1。

含有上述A和B嵌段肽单位的胶原样多肽和含有上述C嵌段肽单位的胶原样多肽也包括在本发明中。

嵌段单位A的特定构建体所具有的顺序中，所有的不是脯氨酸和羟脯氨酸的氨基酸x和y选自甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸，例如，嵌段单位A可以由下列氨基酸顺序组成：

Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro.

嵌段单位B顺序的特定构建体所包括的一些顺序中，至少约66%的氨基酸x和y各自独立地选自脯氨酸、羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸。

例如，所说顺序包括：

Gly-Ser-Arg-Gly-Asp-Pro-Gly-Pro-Pro

Gly-Ala-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Gly

Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro

Gly-Pro-Pro-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser.

B嵌段单位的其它例子包括：

Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Gly-Pro-Pro

Gly-Pro-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg.

C型嵌段所包括的一些顺序中，至少约50%的氨基酸x和y各自独立地选自脯氨酸、羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸。

其余的氨基酸x和y中至少有一个独立地选自天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、酪氨酸和半胱氨酸，以提供控制溶解性的pH依赖性离子电荷;并且/或者选自赖氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬氨酸和谷氨酸，以提供衍生作用或交联的反应位点。

C嵌段单位氨基酸顺序的例子包括：

Gly-Ala-His-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Lys.

Gly-Pro-Lys-Gly-Lys-Ala-Gly-Pro-Lys

Gly-Pro-His-Gly-Lys-Ala-Gly-Pro-Lys

Gly-Pro-His-Gly-Lys-Ala-Gly-Pro-His

Gly-Pro-His-Gly-His-Ala-Gly-Pro-His

Gly-Pro-Glu-Gly-His-Ala-Gly-Pro-Lys

Gly-Pro-Glu-Gly-His-Ala-Gly-Pro-His

Gly-Pro-Glu-Gly-His-Ala-Gly-Pro-Glu

Gly-Pro-Glu-Gly-Glu-Ala-Gly-Pro-Glu

本发明包括选自下列通式的胶原样嵌段共聚物：

[C₂A₂₄C₂]_n

[C₂A₁₂C₂]_n

[C₂（AB）₁₂C₂]_n

[C₂B₁₂C₂]_n

[C₂B₆C₂]_n

[C₂B₂₄C₂]_n.

本发明的另一个方面是由上述嵌段共聚物（包括加入了天然胶原的聚合物混合物）组成的胶原样材料。这类材料包括纤维、薄膜、涂料以及医用植入物。

图1说明质粒载体pPT 0140的构建。pPT 0140含有二个为形成模型蛋白质DCP-1至DCP-6的单体单位的末端而设计的“c₂”单位。pPT 0140中的二个c₂单位被独特的BanI限制性内切酶位点分开，以后在该位点内插入另外的嵌合单位。

图2说明通过将多体化的a₂单位（DCP-1和DCP-2）或（ab）₂单位（DCP-3）插入到pPT 0140载体中构建DCP-1、DCP-2和DCP-3单体单位。

图3说明质粒pPT 0224的构建，其中的（db）₃单位是在掺入到DCP-4和DCP-5基因中之前组装的。

图4说明随后将掺入到DCP-6单位单位中的d₄亚单位的构建。

图5说明通过将多体化的（db）₃单位（DCP-4和DCP-5）或d₄单位（DCP-6）插入到pPT 0140载体中构建DCP-4、DCP-5和DCP-6单体单位。

图6说明用于在大肠杆菌中表达DCP-1、DCP-2、DCP-3、DCP-4、DCP-5和DCP-6基因的质粒载体的构建。为此，使各个克隆的单体单位自我连接形成多体，然后将多体插入到表达载体pSY 1262中。

本发明的胶原样聚合物适于与其本身或与其它能形成三股螺旋的聚合物自我组装成三股螺旋结构。例如，天然胶原可以在混有本发明胶原样聚合物的混合物中用作“补充剂”。本发明的组合物专门设计成可以加工成成型制品，如纤维，并能克服上面讨论过的天然胶原加工中的问题。本发明的胶原样聚合物也可用作涂料组合物。

具体地说，本发明的聚合物是嵌段共聚物，其中，嵌段或者是具有很强三股螺旋形成能力的嵌段，或者是一般的三股螺旋相容性嵌段，或者是二者的混合物，这些嵌段中有规律地散布着引入了用以增强加工性能的结构特性的三股螺旋相容性嵌段。

本发明胶原样聚合物中的所有嵌段的氨基酸顺序，都包含[Gly-x-y]三肽的多重重复，其中x代表单个氨基酸，y也代表单个氨基酸。

在具有很强三股螺旋形成能力的嵌段中，具有很高百分率（超过50%）的氨基酸x和y是脯氨酸（或羟脯氨酸），不是脯氨酸（或羟脯氨酸）的x和y是象甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸这样一些氨基酸，它们的侧链小，对三股螺旋的形成不造成空间位阻。高浓度的脯氨酸（或羟脯氨酸）和大侧链的缺乏，使得三股螺旋的几何形状在热力学上非常有利于具有很强三股螺旋形成能力的嵌段，即使是短片段也将在溶液中自发地形成特征性的三股螺旋。

在三股螺旋相容性嵌段中，氨基酸x和y仍然可能是脯氨酸、羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸。这就使三股螺旋的几何形状在热力学上有利于三股螺旋相容性嵌段，在邻近的嵌段具有很强三股螺旋形成能力时尤其如此。但是，三股螺旋相容性嵌段也可包括除了脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸以外的有限数目的氨基酸x和y，以使含有这些嵌段的聚合物具有有用的化学、物理或生物特性，或者使产生的氨基酸顺序的相应DNA顺序不过多重复。

在引入了用以增强加工性能的结构特性的三股螺旋相容性嵌段中，氨基酸组成与上述普通三股螺旋相容性嵌段相似，但对不是脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸的氨基酸x和y进行了选择，以通过可电离基团的存在提供溶解性的pH依赖性控制，或提供为控制溶解性而进行衍生作用的反应位点。还可以选择氨基酸，以提供共价或离子化学交联的反应位点，以控制溶解性并控制和稳定链的构象与聚集。

更具体地说，本发明的胶原样聚合物是嵌段共聚物，它们由按下列通式排列的三类嵌段A、B和C组成：

其中f1、k、f2和m各自等于或大于1;j1和j2之和等于或大于1。f1、k、f2、m、j1和j2应理解为代表整数。

胶原样聚合物的总长至少为250个氨基酸，最好象天然胶原一样总长为约1000-1100个氨基酸。最好也对j1、j2和k进行选择，使得存在于C型嵌段之间的A或B型嵌段中含有200-250个氨基酸。这就提供了似乎存在于天然胶原中的那种长程顺序或周期性，正如天然胶原细纤维中原胶原分子的交错排列所证实的。

上述通式中的所有A型嵌段（即当j1＞1时）可以是相同的，但如果它们都是A型的话，也可彼此不同。与此类似，B型和C型嵌段在同类区段中可以是相同的，也可以彼此不同。本发明的构建体由于避免了各个肽顺序的单调重复而有利于基因的稳定性和蛋白质的表达。

所有三类嵌段A、B和C都具有通式[Gly-x-y]_3-30。

鉴于已知的由长距离单调重复的小嵌段单位造成的基因稳定性问题，本发明的胶原样聚合物是用足够大的单位构建的，这些单位大得足以提供结构变化并使用于实现交联、生物活性和高级结构控制的基团能“天然”掺入。尽管可以构建长的合成DNA寡聚物，但利用已知的方法容易构建相当于3-100或更少氨基酸的长度。大于约12个氨基酸的嵌段单位会使相应DNA寡聚物的构建变得复杂。优选的是9-30个氨基酸的嵌段多肽单位。

A型嵌段具有很强的三股螺旋形成能力。氨基酸x和y中约50-75%独立地选自脯氨酸和羟脯氨酸。不是脯氨酸和羟脯氨酸的所有氨基酸x和y最好独立地选自甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸。

在下文的实施例中进一步描述的九肽A型嵌段的例子是

a＝Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro.

B型嵌段是三股螺旋相容性的。至少约25-60%的x和y是脯氨酸或羟脯氨酸，并且最好至少约66%的x和y是甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸或羟脯氨酸。其余的x和y可以是任何氨基酸。将在下文的实施例中进一步描述的九肽B型嵌段的例子是

b＝Gly-Ser-Arg-Gly-Asp-Pro-Gly-Pro-Pro

d＝Gly-Ala-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Gly.

所设计的九肽b包括具有生物活性的细胞结合顺序Arg-Gly-Asp，但仍采取了三股螺旋相容性嵌段的排列方式。所设计的九肽d是三股螺旋相容性的，它替代具有很强三股螺旋形成能力的九肽a，其脯氨酸含量较低，相应DNA中的变异也较多（用一个“其它的”氨基酸Gln置换其中一个脯氨酸而实现）。

含有类似粘连蛋白（Arg-Gly-Asp，Arg-Gly-Asp-Ser，Gly-Arg-Gly-Asp，或Gly-Arg-Gly-Asp-Ser）或Laminin（Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg）中的生物活性的细胞结合顺序的B型九肽和十二肽的其它例子还有：

Gly-Ser-Arg-Gly-Asp-Pro-Gly-Pro-Ala

Gly-Ser-Arg-Gly-Asp-Pro-Gly-Ala-Pro

Gly-Ser-Arg-Gly-Asp-Ala-Gly-Pro-Pro

Gly-Ser-Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Pro-Pro

Gly-Pro-Pro-Gly-Ser-Arg-Gly-Asp-Pro

Gly-Pro-Pro-Gly-Ser-Arg-Gly-Asp-Ala

Gly-Pro-Pro-Gly-Ser-Arg-Gly-Asp-Gly

Gly-Ala-Pro-Gly-Ser-Arg-Gly-Asp-Pro

Gly-Pro-Ala-Gly-Ser-Arg-Gly-Asp-Pro

Gly-Pro-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro

Gly-Pro-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Ala-Pro

Gly-Pro-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Ala

Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Arg-Gly-Asp-Ser

Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Arg-Gly-Asp-Ser

Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-Arg-Gly-Asp-Ser

Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Pro-Gly-Pro-Pro

Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Pro-Gly-Ala-Pro

Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Pro-Gly-Pro-Ala

Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Pro-Pro

Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Ala-Gly-Pro-Pro

Gly-Pro-Pro-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Pro

Gly-Ala-Pro-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Pro

Gly-Pro-Ala-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Pro

Gly-Pro-Pro-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Gly

Gly-Pro-Pro-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Ala

Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro

Gly-Pro-Pro-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser

Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Gly-Pro-Pro

Gly-Pro-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg

Gly-Pro-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Gly-Pro-Pro

Gly-Pro-Ala-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Gly-Pro-Pro

Gly-Ala-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Gly-Pro-Pro

Gly-Pro-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Gly-Ala-Pro

Gly-Pro-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Gly-Pro-Ala

Gly-Ala-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Gly-Ala-Pro

Gly-Ala-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Gly-Pro-Ala

Gly-Pro-Ala-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Gly-Ala-Pro

Gly-Pro-Ala-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Gly-Pro-Ala

Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg

Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg

Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg

Gly-Pro-Pro-Gly-Ala-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg

Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Ala-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg

Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ala-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg

Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-Ala-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg

Gly-Pro-Ala-Gly-Ala-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg

Gly-Ala-Pro-Gly-Ala-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg

Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Pro

Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-Pro

Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro

Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Gly-Pro-Pro-Gly-Ala-Pro

Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Ala

Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ala

Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-Ala

Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Gly-Pro-Ala-Gly-Ala-Pro

Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Gly-Ala-Pro-Gly-Ala-Pro

C型嵌段是三股螺旋相容性的，具有可供改善加工性能的官能团。约25-60%的氨基酸x和y独立地选自脯氨酸和羟脯氨酸。其余的氨基酸x和y中至少有一个独立地选自天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、酪氨酸和半胱氨酸，以提供用于控制溶解性的pH依赖性离子电荷;或者选自赖氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬氨酸和谷氨酸，以提供进行衍生作用或交联的反应位点。将在下文实施例中进一步描述的九肽C型嵌段的例子是

C＝Gly-Ala-His-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Lys.

九肽c是三股螺旋相容性的，并包括两个分别带有一个侧链的氨基酸，其中一个氨基酸的侧链当pH降至中性以下时发生电离（组氨酸，pKa＝6.0）供溶解性的pH依赖性控制，另一个氨基酸的侧链上具有可进行交联的官能团（赖氨酸）。

C型九肽嵌段的其它例子示于以下系列：

Gly-Pro-Lys-Gly-Lys-Ala-Gly-Pro-Lys

Gly-Pro-His-Gly-Lys-Ala-Gly-Pro-Lys

Gly-Pro-His-Gly-Lys-Ala-Gly-Pro-His

Gly-Pro-His-Gly-His-Ala-Gly-Pro-His

Gly-Pro-Glu-Gly-His-Ala-Gly-Pro-Lys

Gly-Pro-Glu-Gly-His-Ala-Gly-Pro-His

Gly-Pro-Glu-Gly-His-Ala-Gly-Pro-Glu

Gly-Pro-Glu-Gly-Glu-Ala-Gly-Pro-Glu

这一系列的肽形成了从一个除了在非常碱性（高pH）的介质中外具有高密度阳离子电荷的嵌段，向一个除了在相当酸性（低pH）的介质中外具有高密度阴离子电荷的嵌段的递进系列。该系列说明如何选择C型嵌段中的氨基酸才能提供特定pH范围内的特定离子电荷分布以控制聚合物的溶解性。

从这些九肽嵌段单位中设计出六个胶原样聚合物，每个含有约1000个氨基酸，其结构如下：

DCP-1＝[c₂a₂₄c₂]₄

DCP-2＝[c₂a₁₂c₂]₈

DCP-3＝[c₂（ab）₁₂c₂]₄

DCP-4＝[c₂（db）₁₂c₂]₄

DCP-5＝[c₂（db）₆c₂]₈

DCP-6＝[c₂d₂₄c₂]₄

所设计的DCP-1是一个一般的胶原类似物，带有很少为交联和溶解性控制位点所打断的长程三股螺旋。

所设计的第二个构建体DCP-2是DCP-1的变异，带有较短程（1/2长度）的三股螺旋和二倍于DCP-1的交联/溶解性控制位点。

所设计的第三个构建体DCP-3包括来自亚单位b的生物活性细胞结合位点Arg-Gly-Asp。

所设计的第四个构建体DCP-4也包括来自亚单位b的生物活性细胞结合位点Arg-Gly-Asp。但与DCP-3相比，DCP-4由于包含亚单位d（一种B型嵌段）而不是亚单位a（一种A型嵌段）而具有较低的脯氨酸含量，相应的DNA顺序中有更大的多样性。

所设计的第五个构建体DCP-5是DCP-4的变异，具有较短（1/2长度）程的三股螺旋相容性嵌段和二倍于DCP-4的交联/溶解性控制位点。DCP-5之于DCP-4如同DCP-2之于DCP-1。

所设计的第六个构建体DCP-6是DCP-1的变异，它用三股螺旋相容性亚单位d代替具有很强三股螺旋形成能力的亚单位a。

应该认识到，上述构建体是优选的，每一种含有约1000个氨基酸，但根据构建体所需的分子量，氨基酸的总数可更多或更少。例如，其它构建体包括：

DCP-1＝[c₂a₂₄c₂]_1-8

DCP-2＝[c₂a₁₂c₂]_2-16

DCP-3＝[c₂（ab）₁₂c₂]_1-8

DCP-4＝[c₂（db）₁₂c₂]_1-8

DCP-5＝[c₂（db）₆c₂]_2-16

DCP-6＝[c₂d₂₄c₂]_1-8

在某些情况下不可能仅用一个克隆方案制备一个系列中的所有成员。例如，DCP-1的DNA模板在克隆过程中是不稳定的，因而可能仅分离出[C₂a₂₄C₂]_n（n＝1.0-1.5）。在构建DCP-2基因时发现，直至n＝7，[C₂a₁₂C₂]_n在克隆和表达过程中都是稳定的，但[C₂a₁₂C₂]₈明显不稳定而不能分离出来。与此相似，仅在一个表达系统中进行全长表达是不可能的。例如，用实施例2中的克隆方案不可能获得n＝5以上的DCP-2。DCP-3的基因很容易构建，尽管其表达水平很低（1-2%），但在表达中是稳定的，而且其产物包括较低分子量的聚合物片段。同样，也易于构建DCP-4、DCP-5和DCP-6的基因。它们在克隆和表达过程中也是稳定的，其表达水平将在实施例3中讨论。

应该认识到，可以用A、B和C型嵌段设计出其它胶原样聚合物的构建体。例如，可以制备以通式[A_j1B_j2]_k（k≥1，j1+j2≥1）为特征的胶原样多肽。也可以制备只含有C型嵌段的胶原样多肽。通式[C_f1（A_j1B_j2）_kC_f2]_m（f1+f2≥1;j1+j2≥1;k≥1，m≥1）代表了胶原样嵌段共聚物的另一种设计。

生产高分子量胶原样蛋白质聚合物的方法

实施例1

DNA制备方法

1、大肠杆菌质粒DNA的制备

A、小规模制备。用煮沸法或碱裂解法（Maniatis等《分子克隆：操作指南》，冷泉港实验室，1982）从1.5ml培养物中制备质粒DNA。

B、大规模制备。将一个携带质粒的菌株于1升含有合适抗生素的LB培养基中培养过夜，通过于10，000×g离心5分钟收集细胞，并重新悬浮于10ml冰冷的TE（10 mM Tris-HCl pH 8.1 mM EDTA）中，再次离心收集细胞，重新悬浮于4ml TES（TE和25%（w/v）蔗糖）中，通过涡旋搅拌而匀浆。样品保持于冰上进行下述步骤。向细胞悬浮液中加入1ml溶菌酶（10mg/ml），保温5分钟，再加入2ml 0.5M EDTA（pH 8），保温10分钟后加入50ml蛋白酶K（40mg/ml），10分钟后再加入15ml裂解缓冲液（0.1% Triton X-100、1mM EDTA、50 mM Tris-HCl pH 8）。裂解15-20分钟后，将细菌裂解产物于35，000×g离心90-120分钟。将上清液（19.8ml）移至装有20mg CsCl和400μl溴化乙锭（10mg/ml）的塑料管中。溶解后，将混合物分置于两个晶形塑料超离心管中，热密封，用Beckman Ti 65转

用一小环大肠杆菌细胞接种200ml无菌LB培养基中的培养物，在37℃振荡培养，直到OD₆₀₀达到约0.5。将培养物置冰上10分钟，再以6，000×g离心10分钟。将细胞沉淀物重新悬浮于100ml冰冷的0.1M MgCl₂中，置冰上保持30-40分钟，再次离心。沉淀物重新悬浮于2ml冰冷的0.1MCaCl₂中，移至无菌试管内在冰上保温24小时。然后将感受态细胞分成等份，贮存于-70℃。

2、大肠杆菌的转化

取一份冷冻感受态细胞，置冰上解冻。将0.1-1μg DNA加至50μl细胞中，将混合物在冰上保温30分钟。将试管从冰上移至42℃水浴中保温2分钟。加入1ml LB培养基，将转化混合物在所需的温度（通常是30℃或37℃）振荡培养2小时。然后将十分之一的转化混合物铺在含有适宜抗生素的LB平板上，必要时加入XGAL和IPTG。

抗体的产生：蛋白质化学及蛋白质的电泳

1、针对人工合成肽的抗体的制备

使顺序为Gly-Ala-His-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Lys-Gly-Ala-His-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Lys-Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro（DCP-c₂a₂）的合成肽与钥孔

血蓝蛋白偶联用作免疫原。将上述材料送至Antibodies公司在家兔体内制备抗体。在实验当天，用在完全弗氏佐剂中浓度为1mg/ml的肽结合物免疫家兔。在第30天用不完全弗氏佐剂中的抗原再次注射动物，并于第60天进行滴定。用微量滴定RIA法，以合成肽作抗原检测阳性血清（Kagen和Glick，1979，《放射免疫测定方法》，Jaffe和Berman编，Academic Press第328页）。获得与具有DCP-1和DCP-2顺序的合成肽反应的抗血清。子于60，000rpm离心24小时。用皮下注射针头从离心管中移出下部质粒DNA带。用等体积NaCl饱和的异丙醇抽提溴化乙锭三次。加2体积水至DNA溶液中。然后用乙醇沉淀DNA。

2、脱蛋白

用苯酚抽提方便体积的DNA样品，一般体积为100μl-10ml。用0.01M Tris-HCl pH 7.5、1 mM EDTA稀释DNA样品，并加入等体积的水饱和苯酚，短暂涡旋样品后置冰上3分钟，在一小型离心机中离心3分钟后，将水层移至另一管中，用等体积的氯仿：异戊醇（24∶1）提取一次。

3、乙醇沉淀

用乙醇沉淀法浓缩水缓冲液中的DNA。向DNA样品中加入1/10体积的3M乙酸钠pH 7.5和2-3体积的冷乙醇，DNA在-70℃沉淀30分钟，或于-20℃沉淀过夜，然后在小型离心机中于4℃离心沉降15分钟。用200μl 80%冷乙醇洗涤沉淀一次，再于4℃沉淀10分钟。空气干燥或冻干后，将沉淀重新悬浮于适宜的缓冲液中。

4、DNA的磷酸酶处理

通过向限制性酶消化反应物中直接加入1μl（25单位）小牛小肠磷酸酶（Boehringer Mannheim）进行DNA的磷酸酶处理，于37℃连续保温30分钟。在用苯酚抽提法脱蛋白之前，使磷酸酶于65℃灭活60分钟。

5、用DNA聚合酶I进行填充反应

将DNA重新悬浮于含有50 mM Tris-HCl pH 7.4、50 mM KCl、5mM MgCl₂和4种三磷酸脱氧核苷酸各400mM的缓冲液中。加入10单位Klenow DNA多聚酶（BRL），使反应在室温下进行15分钟。然后

在70℃熔化含有DNA的凝胶段5分钟，然后用TE1（10 mM Tris-HCl pH 7.5、0.2M NaCl）稀释约5倍。将凝胶溶液加到NACS柱（BRL）上。用5ml相同的缓冲液洗柱。用300μl TE2（10mM Tris-HCl pH 7.5、1.0M NaCl）洗脱小于1000bp的结合DNA片段，用300μl TE3（10 mM Tris-HCl pH 7.5、2M NaCl）洗脱较大的结合DNA片段。用乙醇沉淀法浓缩洗脱出的DNA。

10、DNA连接

连接粘性末端的反应液含有1μl DNA、1×AA缓冲液（见上述步骤6）、1 mM ATP和20单位T4 DNA连接酶（BRL），最终反应体积为20μl。使连接反应在15℃进行16-18小时，或在室温下进行1-2小时，对于钝末端连接，反应液含有1μg DNA、25mM Tris-HCl pH 7.5、5 mM MgCl₂、5 mM DTT、0.25mM亚精胺、200ng BSA、1 mM六胺氯化钴（HCC）、0.5 mM ATP和400单位T4 DNA连接酶（NEB），反应体积为20μl。使连接反应在室温进行30分钟至1小时。

11、琼脂糖DNA连接

使琼脂糖在65℃熔化，然后将温度降至37℃，并加入连接缓冲液（5×＝100 mM Tris-HCl，pH 7.5、50 mM MgCl₂、500 mM DTT、1mM ATP）。然后将反应管置于室温下，加入连接酶（1000单位T4 DNA连接酶（NEB）），反应体积一般为50μl。反应液在15℃保温16-18小时。

mRNA方法

1、mRNA的制备

用Summers，W.C.所述的改良方法（Anal.Biochem.33∶459-463.1970）制备mRNA。细胞在补充了卡那霉素（50μg/ml）的LB培养基中于用苯酚抽提DNA，并用乙醇沉淀。

6、用限制性核酸内切酶消化

在1×“AA”缓冲液[10×AA缓冲液为∶330 mM Tris-乙酸pH 7.9、660 mM乙酸钾、100 mM乙酸镁、50 mM二硫苏糖醇（DTT）T和1mg/ml牛血清白蛋白（不含核酸酶）]中用限制性核酸内切酶消化DNA。随时使DNA浓度保持在1μl/25μl以下。大多数限制性核酸内切酶的消化反应于37℃保温1-4小时，但BalI、BanI和NaeI的消化反应要保温过液。

7、DNA的分析性琼脂糖凝胶电泳

向准备进行凝胶分析的DNA样品中加入0.2体积的加样缓冲液（5×电泳缓冲液、0.01%溴酚蓝染料、50 mM EDTA和50%甘油）。然后上样至含有1.0%（w/v）琼脂糖凝胶的水平浸没式电泳仪的水平泳道中。电泳缓冲液可以是1×TAC，也可以是1/2×TBE。1×TAC是40 mM Tris-碱、10 mM EDTA，用乙酸调pH至7.8。1/2×TBE是0.045 M Tris-碱、0.045 M硼酸、1 mM EDTA，pH 8。凝胶电泳在40-50V进行18小时，然后取出凝胶，用0.5μg/ml溴化乙锭染色30分钟。用长波紫外透照灯观察DNA条带。

8、制备性琼脂糖凝胶电泳

方法和材料同分析性琼脂糖凝胶电泳。唯一的区别在于采用低熔点（LMP）琼脂糖，根据要纯化的DNA片段的大小，琼脂糖的浓度范围为0.5-2.5%（w/v）。在用溴化乙锭显色后，从LMP琼脂糖凝胶上切下DNA限制性片段。为了琼脂糖连接，缓冲液用1×TAE（50mM Tris-乙酸）。

9、NACS纯化

30℃或42℃下培养。离心10ml长至OD₆₀₀＝1.0的细胞，将所得的细胞沉淀物重新悬浮于10ml原生质体化缓冲液（15mM Tris-HCl pH 8.0、0.45M蔗糖、8mM EDTA）中，加入80μl溶菌酶（50mg/ml），然后将混合物置冰上保温15分钟。将细胞悬浮液用RC-5B离心机在SS-34转子中于7000rpm离心5分钟。将沉淀重新悬浮于0.5ml裂解缓冲液（10 mM Tris-HCl pH8.0、10mM NaCl、1 mM柠檬酸钠、1.5%SDS（w/v））和15μl焦碳酸二乙酯（DEPC）中。轻轻混合悬浮液，然后移至1.5ml Eppendorf管中，于37℃保温5分钟，然后置冰上冷却。加入250μl饱和NaCl（40%w/v），轻轻混合，置冰上再保温10分钟。将该浆液在4℃离心15分钟。将上清液分置于两个1.5ml管中，每管加入1ml 100%乙醇。使RNA在低温沉淀，然后于4℃离心20分钟。沉淀物用70%乙醇冲洗，干燥。然后将RNA重新悬浮于0.1ml H₂O中，测定OD₂₆₀和OD₂₈₀以确定RNA回收量及纯度。10ml生长细胞中的总RNA（5%mRNA、95% tRNA+rRNA）的平均回收量为0.5-1.0mg。

2、Northern印迹分析

将上述纯化的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，接着以10×SSC作转移缓冲液按Maniatis等所述方法将RNA转移到硝酸纤维素膜上（Maniatis等《分子克隆：操作指南》，冷泉港实验室1982年出版，第202-203页）。用ECL基因检测系统试剂盒（Amersham）进行探针标记、杂交过程和检测。所用的方法记载于Amersham国际公司的ECL基因检测系统RPN 2101第二号版本。

细菌转化方法

1、转化感受态大肠杆菌细胞的制备

按照上述步骤，合成具有下式的另外一个肽：（Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Ser-Arg-Gly-Asp-Pro-Gly-Pro-Pro）₂（DCP-（ab）₂），使该肽也与钥孔血蓝蛋白偶联用作免疫原。然后按上述方法制备与具有DCP-3顺序的合成肽结合的多克隆抗血清。

2、蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳

从生长中的培养物中取约10⁹个大肠杆菌细胞，于10，000xg离心沉降5分钟。将细胞沉淀物重新悬浮于100-500μl 2X样品缓冲液（100ml Tris-HCl pH6.8、4% SDS、10%β-巯基乙醇、60%甘油或蔗糖）中，用Tekmar超声破碎器超声处理30秒。将样品煮沸约5分钟，将20-100μl细胞裂解物上样到SDS-聚丙烯酰胺凝胶（7.5-16%W/V）上。按Laemmli（Nature，27∶80-685，1970）方法制备凝胶。用溶解在10%甲醇、7.5%乙酸中的2%考马斯亮蓝对凝胶中的蛋白质染色1小时，用10%甲醇、7.5%乙酸脱色过夜。

3.蛋白质表达分析

用培养在30℃的过夜培养物接种装在250ml烧瓶中的50ml培养基。加入卡那霉素使其终浓度为50μg/ml，培养物于30℃和搅拌（200rpm）下培养。当培养物OD₆₀₀达到0.8时，取40ml培养物移至经42℃预热的新烧瓶中，在同样温度下培养约2小时。将培养物（30℃和42℃）置冰上冷却，并测定OD₆₀₀。离心收集细胞，并分成OD₆₀₀为1.0的等份，用于利用合适的抗体进行Western分析。

4.凝胶中蛋白质的免疫印迹分析

蛋白质电泳后，从聚丙烯酰胺凝胶上移去一块侧面玻璃板。用转移缓冲液（25mM Tris-HCl、192mM甘氨酸、20%甲醇）湿润凝胶表面。用转移缓冲液饱和一块硝酸纤维滤膜（Sartorius，SM11307），然后置于凝胶上。逐出滤膜和凝胶之间的气泡。按制造商（Bio-Rad）的说明将凝胶和硝酸纤维素滤膜置于转移装置中。使转移以200mA进行3-4小时。然后取下硝酸纤维素滤膜，用AmidoSchwartz（0.05%酰胺黑、45%去离子水、45%甲醇、10%乙酸）染色3分钟，再用水进行脱色。滤膜上“BLOTTO”（5%W/V脱脂奶粉、50mM Tris-HCl pH7.4、0.9%W/V NaCl、0.2%W/V叠氮钠）中于室温下保温至少10分钟，将滤膜置于用0.5X Blotto（2.5%脱脂奶粉、50mM Tris-HCl pH7.4、0.9%NaCl、0.2%叠氮钠）适当稀释（1∶50-1∶500）的血清中，于室温下轻轻搅拌约16小时。滤膜用TSA（50mM Tris-HCl pH7.4、0.9%NaCl、0.2%叠氮钠）洗1小时，其中TSA换液5次。将该印迹置于含1×10⁷cpm¹²⁵I蛋白A的15ml 0.5X BLOTTO溶液中，室温下轻轻搅拌2小时。滤膜用TSA漂洗2小时，其中TSA最少换液7次，再用去离子水冲洗1次，然后空气干燥，用莎纶包装纸盖住印迹进行放射自显影。

5.氨基酸分析

用Henrickson和Meredith（1984）的PTC衍生法测定氨基酸组成，蛋白样品用5.7N持续沸腾的盐酸于108℃真空水解24小时。与PITC反应后，用HPLC反相色谱法，用Waters 100E系统和Supelco C18柱（4.6mm×25cm）在254nm处检测氨基酸衍生物，以0-50%乙腈在0.1M NH₄OAc pH6.78中的线性梯度作流动相（Henrickson，R.L.和Meredith，S.C.“用反相高效液相色谱法进行氨基酸分析”，Anal.Biochem.137∶65-74，1984）。

6.肽的合成

利用制造商提供的标准对称酐化学法，在Applied Biosystems430A型肽合成仪上用固相合成法制备合成肽。用Sarin等人（1981）的定量茚三酮法测定每一步骤的偶联产率。从固相载体上切下合成肽，用无水HF脱除氨基酸保护基（Stewart和Young，1984）。用色谱法在Sephadex G-50上使粗制肽脱盐（Sarin，V.K.，Kent S.B.H.，Tam，J.P.和Merrifield，R.B.，Anal.Biochem.237：927-936，1981;Stewart，J.M.和Young，J.D.，1984，《肽的固相合成》，Pierce化学公司，Rockford，IL.，85-89页）。

合成DNA的方法

1.DNA的体外合成

N，N-二异丙基磷酰胺（phosphoramidites）、可控多孔玻璃柱以及所有合成试剂都购自Applied Biosystems（Foster City，California）。在Applied Biosystems 381A型DNA合成仪上，用10倍过量的受护磷酰胺和1微摩尔结合在合成载体柱上的核苷酸，通过亚磷酸三酯法制备合成的寡核苷酸。用于合成的化学过程是推荐用于该合成仪的标准程序，并已被描述过（Matteucci等，J.Amer.Chem.Soc.，103：3185-3319，1981）。根据McBride等人（Tetrahedron Letters，24：245-248，1983）描述的标准方法，使寡聚体去保护并从固相载体上切下。按照Applied Biosystems（1984）所推荐的用保护基被脱除后的光密度来量度的重复合成产率大于97.5%。根据Applied Biosystems 1984年11月9日出版的手册（User Bulletin No.13）所述的制备性凝胶电泳法，纯化粗制的寡核苷酸混合物。依据寡聚体长度的不同，丙烯酰胺凝胶浓度在10-20%范围内变化。通过紫外光投影鉴定出纯化的寡聚体，从凝胶上切下寡聚体，并用挤压及浸泡法提取（Smith，Methods in Enzymology，65：371-379，1980）。

2.DNA测序

用下列方法测定DNA顺序。将含有感兴趣区域的片段克隆到M13mp18或M13mp19的多克隆位点（Maniatis等，1982;Norrander等，1983）。制备单链DNA，并用引物延伸法测序（Sanger等，1977;Biggin等，1983），测序时使用³⁵S-脱氧腺苷5′-（α-硫）-三磷酸（New England Nuclear）作为标记。在一些情况下，利用反转录酶（Molecular Genetics）用Zagursky等人（Gene Anal.Tech.1985，2：89-94）所采用的双脱氧：脱氧核苷三磷酸比例来延伸引物。这些反应中使用³²P或³⁵S标记的脱氧腺苷三磷酸。通过从G反应中去除脱氧鸟苷三磷酸而代之以终浓度为37.5μM的脱氧肌苷三磷酸（P-L Biochemicals），克服了出现于某些富含G-C顺序中的压缩假象。在另一些混合物中，G反应中的双脱氧GTP浓度为0.5mM。所有的顺序都在含有8M尿素的6%或8%聚丙烯酰胺凝胶上电泳（Sanger等，1978）。用于测序的引物购自P-L Biochemicals。用以贮存和分析数据的软件来自DNA Strider、DNA Inspector IIe或DNAid，用Apple Macintosh个人电脑进行处理。

双链质粒DNA的双脱氧DNA测序

如前人所述制备质粒DNA（“从大肠杆菌中小规模制备质粒DNA”，Maniatis等）。如前所述用DNA合成仪合成引物，并按照上述用于M13测序的方法使引物与质粒DNA退火。用Sequenase（UnitedStates Biochemicals）进行测序反应，所用条件为供货商推荐的条件。如上所述，所有顺序都进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。

实施例2

表1

DCP-1、DCP-2和DCP-3的结构

DCP-1 (c₂a₂₄c₂)₄

DCP-2 (c₂a₁₂c₂)₈

DCP-3 (c₂(ab)₁₂c₂)₄

其中：

a=Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro

b=Gly-Ser-Arg-Gly-Asp-Pro-Gly-Pro-Pro

c=Gly-Ala-His-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Lys

DNA设计

鉴于DCP聚合物结构的复杂性，其基因单体的设计如下：

1.2个c₂单位的设计和合成（5′和3′）

2.2个a单位的设计和合成

3.2个ab单位的设计和合成

质粒pPT 0134的构建

参照图1，专门设计和构建了能满足DCP聚合物基因构建要求的受体载体pPT 0134。该载体在其MCS（多克隆位点）上含有两个FokI限制性核酸内切酶识别位点。如实施例1所述，合成并纯化含有上述位点的二条寡核苷酸链。

FokI FokI ScaI

0.A) 5' - GTGCTGCGGATGCTCGAGATGGTGCATGCATGTACATCCGAGTACTTCGAT

0.B) 3' - ACGCCTACGAGCTCTACCACGTACGTACATGTAGGCTCATGAAGCTA

退火之后，用已用BanI和EcoRV限制性核酸内切酶消化过的pSY937（参见专利申请PCT/US87/02822）与这二条寡核苷酸链连接。用连接混合物的产物转化大肠杆菌，并在含有抗生素氯霉素的细菌平板上进行选择。单个菌落的质粒DNA经ScaI和StuI限制性核酸内切酶消化后用琼脂糖凝胶电泳进行分析。有一个质粒pPT 0124含有预期的DNA片段。然后将新MCS移至质粒pSY 1367。该质粒是pSY1299（参见专利申请PCT/US87/02822）的一个衍生物。用NciI消化质粒pSY1299，通过琼脂糖凝胶电泳和NACS纯化方法来纯化大DNA片段。在对大肠杆菌HB101菌株进行转化之前，先用DNA多聚酶（参见实施例1）处理纯化的DNA片段，然后进行连接以及用FokI进行消化。纯化出单个菌落的质粒DNA，并分析其限制性消化产物。发现有一个质粒pSY1366是正确的，并缺乏存在于pSY1299中的唯一FokI位点。

如实施例1所述，合成和纯化如下的二条寡核苷酸链：

(BanII) FokI

1.A) 5' - CTACATGTGTTACACATCCCGTGC

1.B) 3' - CCGAGATGTACACAATGTGTAGGGCACG

寡核苷酸链1.A和1.B进行退火后与用BanⅡ和FspⅠ限制性核酸内切酶消化过的质粒pSY1366 DNA连接。用该连接反应的产物转化大肠杆菌HB101菌株。纯化转化菌落中的质粒DNA，并用FokI消化。测定用FokI进行线性化的克隆的顺序，质粒pSY 1367含有所希望的MCS顺序，被选来用于后续的构建。用NruI和NcoI消化质粒pPT0124和pSY1367，通过琼脂糖凝胶电泳和NACS纯化方法纯化DNA片段，使pPT0124的小片段（约500bp）与pSY1367的大片段连接。用连接混合物的产物转化大肠杆菌。纯化单个菌落的质粒DNA，并通过限制性消化产物和DNA测序进行分析。有一个质粒pPT 0134含有所希望的顺序，用作进行DCP构建的受体载体。

c单位的合成和组装

如实施例1所述合成和纯化四条寡核苷酸链。每对寡核苷酸链编码一个c₂单位。

寡核苷酸链2.A和2.B进行退火后与用FokI限制性核酸内切酶消化过的质粒pSY 0134 DNA连接。用该连接反应的产物转化大肠杆菌HB101菌株。纯化转化菌落的质粒DNA，并用SfiI消化。测定用SfiI线性化的克隆的顺序。质粒pPT0135含有所希望的c₂顺序，选来用于后续的构建。如同链2.A和2.B一样，链2.C和2.D进行退火、连接和转化。从转化菌落中纯化质粒DNA，并用BanⅡ限制性核酸内切酶消化。测定用BanⅡ线性化的克隆的顺序。含有正确c₂DNA顺序的质粒pPT0137用于c₂-c₂中间质粒构建的组装。

质粒pPT 0135和pPT 0137用BanI和StuI限制性核酸内切酶消化。使pPT 0135的含有c₂（A链+B链）的大片段与pPT 0137的含有c₂片段（C链+D链）的小片段连接。用连接产物转化大肠杆菌HB101菌株。从转化体中纯化出质粒DNA，并分别用SfiI-StuI和BanⅡ-StuI限制性核酸内切酶进行两个消化反应。对在两个消化反应中均释放出一个约800bp DNA片段的克隆测序。如表2所示，质粒pPT 0140含有正确的c₂-c₂顺序，并用于DCP基因单体的构建。pPT 0140的构建在图1中说明。

表2

DCP-1和DCP-2基因单体的构建

如实施例1所述合成和纯化二条寡核苷酸链：

将编码a₂（3A和3B）的二条寡核苷酸链退火，并与预先用FokI限制性核酸内切酶消化过的质粒pPT 0134 DNA连接。用连接混合物的产物转化大肠杆菌HB 101菌株。用PstI限制性核酸内切酶消化转化体的质粒DNA，并对线性化的克隆测序，发现质粒pPT 0142是正确的，将其用于a₂单位的多体化。

用FokI限制性核酸内切酶消化质粒DNA pPT 0142，通过琼脂糖凝胶电泳分离含有a₂单位的片段，并如前所述（参见实施例1）用NACS柱进行纯化。使DNA片段自我连接，连接产物与预先用FokI限制性核酸内切酶消化的pPT 0134连接。用连接混合物的产物转化大肠杆菌HB101菌株。从转化体中纯化质粒DNA，并用FokI进行消化。选择含有相应于a₆的162bp DNA插入片段的克隆进行顺序分析。质粒pPT 0144具有预期的DNA顺序，被选来用于后续的构建。用FokI消化质粒pPT 0144的DNA，并利用琼脂糖凝胶电泳分离由消化反应产生的两个DNA片段。用NACS柱（参见实施例1）进一步纯化较小的DNA片段。如图2所示，使携带a₆编码顺序的DNA片段与预先用FokI消化过的质粒DNA pPT0140连接。用连接产物转化大肠杆菌HB101菌株。通过用FokI消化单个菌落的质粒DNA分析其中含有多个a₆DNA片段的插入片段。发现有a₆-a₂₄数种大小的插入片段。鉴定出有一个克隆即pPT 0147（示于表3）含有所希望的DCP-2基因单体顺序c₂a₁₂c₂，将该克隆用于进一步的构建。

含有a₂₄基因单体的克隆（如表4所示）是构建DCP-1聚合物基因所必需的，发现它在后续的传代过程中很不稳定。这种不稳定性被归因于受体质粒的高拷贝数。有鉴于此，将该质粒的基因单体再克隆到pBR322中（F.Boliver等，1977，Gene，2∶95-113）。通过用NruI和EcoRV限制性核酸内切酶消化和琼脂糖凝胶电泳，从质粒中分离出含有c a c基因片段的质粒DNA，并用NACS柱纯化。使该DNA片段与用EcoRV和NruI消化过的质粒pBR322 DNA连接（参见实施例1的琼脂糖连接）。用该连接反应的产物转化大肠杆菌HB101菌株，并在含有抗生素氨苄青霉素（100μg/ml）的细菌平板上进行选择。通过用BglⅡ消化来分析单个菌落的质粒DNA。进一步分析含有插入片段的克隆，选出一个克隆即pPT0153用于DCP-1聚合物基因的构建。该质粒是稳定的。

DCP-1聚合物基因的构建

先用AcyI限制性核酸内切酶消化质粒DNA pPT 0153，继而用FokI限制性核酸内切酶消化。通过琼脂糖凝胶电泳分离含有DCP-1基因单体的783bp DNA片段，并用NACS柱进行纯化（参见实施例1）。将单体基因片段与用BanI限制性核酸内切酶消化过的pSY 1262（参见专利申请PCT/US87/02822）连接。用连接产物转化大肠杆菌HB101菌株，并选择在含有抗生素卡那霉素的细菌平板上生长的转化体。通过用BamHI和PvuⅡ限制性核酸内切酶消化和琼脂糖凝胶电泳来分析单个菌落质粒DNA中含有多个DCP-1单体片段的插入片段。有一个克隆即pPT 0164含有783bp的基因单体;另外一个克隆即pPT 0165含有一个略大一些的片段（约1200bp）;第三个克隆即pPT 0166含有一个基因二聚体（1566bp）（参见图6）。

DCP-1蛋白质表达分析

将含有质粒pPT 0164或pPT 0165或pPT 0166的大肠杆菌HB101菌株在30℃下培养至OD₆₀₀为0.7，然后换到42℃培养2.0小时。用Western印迹分析法分析这些细胞所产生的蛋白质中能与DCP肽特异性抗血清反应的新蛋白质条带。在含有质粒pPT 0164的培养物中观察到一个表观分子量约45KD的条带。在含pPT 0165的培养物中观察到了一个68KD的条带，而在含pPT 0166的培养物中观察到了一个淡的模糊条带。因为在含有pPT0166的菌株中可检测的表达水平低，所以分析了由DCP-1克隆产生的mRNA。如实施例1所述制备mRNA。Northern印迹分析（参见实施例1）表明，所有克隆的DCP特异性mRNA都是全长的，而且不论DCP基因多大都是以大致相同的水平合成出来的。该项分析所用的探针是DCP-2单体DNA片段。

DCP-1 pPT0166 561个氨基酸分子量:46,409道尔顿

Met-Asp-Pro-Val-Val-Leu-Gln-Arg-Arg-Asp-Trp-Glu-Asn-Pro-Gly-

Val-Thr-Gln-Leu-Asn-Arg-Leu-Ala-Ala-His-Pro-Pro-Phe-Ala-Ser-

Asp-Pro-Met

[(Gly-Ala-His-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Lys)₂

(Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro)₂₄

(Gly-Ala-His-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Lys)₂]₂

Gly-Ala-Met-Asp-Pro-Gly-Arg-Tyr-Gln-Leu-Ser-Ala-Gly-Arg-Tyr-

His-Tyr-Gln-Leu-Val-Trp-Cys-Gln-Lys

DCP-2聚合物基因的构建

用FokI限制性核酸内切酶消化pPT0147的质粒DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳分离消化片段。切下483bp的DCP-1基因片段，用NACS柱（参见实施例1）进行纯化。如图6所示，使纯化的片段与用BanI限制性核酸内切酶消化过的pSY 1262连接。用该连接反应的产物转化大肠杆菌HB101菌株，并选择出能在含有抗生素卡那霉素的细菌平板上生长的转化体。从单个菌落中纯化质粒DNA，并分析DCP-2基因单体片段的多重插入。获得的数个克隆的大小为500-3，000bp。参见表5所示结果。

DCP-2蛋白质表达分析

将含有质粒pPT 0155至pPT 0163的大肠杆菌HB101菌株在30℃下培养至OD₆₀₀为0.7，然后换到42℃培养2.0小时。用Western印迹分析法分析由这些细胞产生的蛋白质中能与DCP-c₂a₂肽特异性抗血清反应的蛋白条带。参见表5所示结果。

表5

DCP-2 重复片段基因大小氨基酸数观察到的蛋白

表达克隆个数 (bp) 质条带(KD)

pPT 0155 1 603 201 检测不出

pPT 0156 2 1035 345 40

pPT 0157 3 1467 489 60

pPT 0158 4 1899 633 80

pPT 0159 5 2331 777 100

pPT 0160 6 2763 921 模糊

pPT 0161 7 3195 1065 检测不出

pPT 0162 7+ 3240 1080 检测不出

pPT 0163 7+ 3420 1140 检测不出

DCP-3单体的构建

如上所述（参见实施例1）合成和纯化四条编码（ab）₂的寡核苷酸链。

4.A) 5'-GTGCTCCGGGACCTGCAGAATATTATTCTAGAGGTGACCCAGGACCGCCTC -3′

4.B)3′- AGGCCCTGGACGTCTTATAATAAGATCTCCACTGGGTCCTGGCGGACCACG -5′

4.C) 5'- GGCCCACCGGGTAGCCGTGGCGATCCGGGACCACCGG-

4.D) 3'- ACGTCCGGGTGGCCCATCGGCACCGCTAGGCCCTGGTGGCC-

GTGCACCTGGCCCAGCGGGTCCGCCTGGAT -3'

CACGTGGACCGGGTCGCCCAGGCGGACCTAGATC -5'

对寡核苷酸链4.A和4.B进行退火，并与已用FokI限制性核酸内切酶消化过的DNA质粒pPT 0134连接（参见实施例1），用该连接反应的产物转化大肠杆菌HB101菌株。从转化菌落中纯化质粒DNA，并用PstI和SutI进行消化。对含约800bp片段的克隆测序。选择含有所希望的4.A链和4.B链顺序的质粒pPT 0139用于后续的构建。

对4.C链和4.D链进行退火，并与预先用XbaI和PstI限制性核酸内切酶消化过的DNA质粒pPT 0139连接。用该连接反应的产物转化大肠杆菌HB101菌株。从转化菌落中纯化质粒DNA，并用NcoRI和DraⅢ限制性核酸内切酶进行消化。对含有相当于4.A和B以及4.C和D链联合插入的DNA片段的克隆测序。如图6所示，选择含有正确（ab）₂DNA顺序的质粒pPT0143用于进一步的构建。

表6

用FokI限制性核酸内切酶消化pPT 0143的质粒DNA，通过琼脂糖凝胶电泳分离含有（ab）₂基因片段的片段，并用NACS柱纯化。然后将该DNA片段与已用FokI限制性核酸内切酶消化过的pPT 0134连接。用连接反应产物转化大肠杆菌HB101菌株，并选择能在含有抗生素氯霉素的细菌平板上生长的转化体。通过用FoKI限制性核酸内切酶消化单个菌落的质粒DNA，分析其中含有多重（ab）₂DNA片段的插入片段。获得了数个含有1至数个（ab）₂拷贝的克隆。用一个含有（ab）₆的克隆即pPT 0169作构建DCP-3基因单体的中间体。

通过用FokI限制性核酸内切酶消化、琼脂糖凝胶电泳及NACS纯化从pPT 0169中纯化（ab）₆基因片段。然后，将该DNA片段与预先用BanI限制性核酸内切酶消化过的DNA质粒pPT 0140连接（如图2所示）。用连接产物转化大肠杆菌HB101菌株，并在含有抗生素氯霉素的细菌平板上选择转化体。通过用FokI限制性核酸内切酶消化单个菌落的质粒DNA，分析其中含有多拷贝（ab）₆基因片段的插入片段。选择一个含有c₂（ab）₁₂c₂的克隆pPT 0171（如表7所示）作为进行后续构建的DCP-3基因单体。

表7

DCP-3聚合物基因的构建

用FokI限制性核酸内切酶消化pPT 0171的质粒DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳和NACS纯化纯化出含有DCP-3基因单体的片段。然后使DCP-3单体自我连接，再与用BanI限制性核酸内切酶消化过的DNA质粒pSY 1262连接（如图6所示）。用连接产物转化大肠杆菌HB101菌株，并选择能在含有抗生素卡那霉素的细菌平板上生长的转化体。从单个菌落中纯化质粒DNA，并在用XcmI和PvuⅡ限制性核酸内切酶消化后分析其中含有多拷贝DCP-3基因单体片段的插入片段。选择分别含有单体、二聚体、三聚体和四聚体形式DCP-3的克隆pPT 0173、pPT 0174、pPT 0175和pPT 0176进行表达分析。

DCP-3蛋白质表达分析

将含有DCP-3质粒pPT 0173、pPT 0174、pPT 0175或pPT 0176的大肠杆菌HB101菌株于30℃下培养至OD₆₀₀为0.7，然后换到42℃培养2.0小时。用Western印迹分析法分析这些细胞所产生的蛋白质中能与DCP肽特异性抗血清反应的新蛋白条带。观察每一个克隆的反应性条带（见表8所示结果）。但是，随着基因长度的增大，全长聚合物的表达降低。Northern分析表明，这些克隆中全长mRNA的合成处于相同的水平，这一Northern分析所用的探针是DCP-3单体片段。

表8

DCP-3 重复片段基因大小氨基酸数观察到的蛋白

表达克隆个数 (bp) 质条带(KD)

pPT 0173 1 927 309 28

pPT 0174 2 1683 561 64

pPT 0175 3 2439 813 98

pPT 0176 4 3195 1065 135

实施例3

表9DCP-4、DCP-5和DCP6的结构

DCP-4 [c₂(db)₁₂c₂]₄

DCP-5 [c₂(db)₆c₂]₈

DCP-6 [c₂d₂₄c₂]₄

其中:

b=Gly-Ser-Arg-Gly-Asp-Pro-Gly-Pro-Pro

c=Gly-Ala-His-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Lys

d=Gly-Ala-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Gly

DCP-4和DCP-5单体的构建

如实施例1所述，合成和纯化三条编码（db）₃的双链DNA片段，并进行退火处理。

分别克隆这三个DNA片段。使第一个双链片段（5.A和5.B）连接到预先用BanI限制性核酸内切酶消化过的pPT 0138上。用连接产物转化大肠杆菌HB101菌株，并选择能在含有抗生素氯霉素的细菌平板上生长的转化体。用EcoO1091和StuI限制性核酸内切酶消化单个菌落的质粒DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。对含有一个适当大小DNA片段的质粒DNA测序，将一个克隆即pPT0221用于后续的构建。

使第二对寡核苷酸链（5.C和5.D）与已用FokI限制性核酸内切酶消化过的pPT 0134连接。在转化大肠杆菌之后，通过用BanⅡ和StuI限制性核酸内切酶消化来分析单个菌落的质粒DNA。对用两种酶消化过的DNA测序。有一个克隆即pPT 0222含有预期的顺序，被用于后续的构建。

用FokI限制性核酸内切酶消化pPT0222的质粒DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳和随后的NACS纯化分离含有第二对寡核苷酸链（5.C和5.D）的片段（54bp）。使该DNA片段与预先用BanI限制性核酸内切酶消化过的pPT0221连接。用连接产物转化大肠杆菌。在用DraⅢ和StuI限制性核酸内切酶消化单个菌落的质粒DNA后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。DNA测序后，选择一个克隆即pPT0223作为第3个合成DCP基因片段的受体载体。

用BanI限制性核酸内切酶消化质粒pPT0223，然后与第三对寡核苷酸链（5.E和5.F）连接。用连接反应产物转化大肠杆菌HB101菌株，并选择能在含有抗生素氯霉素的细菌平板上生长的转化体。从单个转化体中纯化质粒DNA，并用FokI和BanI限制性核酸内切酶进行消化。对含有正确大小片段的克隆测序。将一个含有所希望顺序的克隆pPT 0224（如表10所示）用于DCP-4和DCP-5单体的后续构建。图3说明了pPT 0224的构建。

表10

用FokI和BanI限制性核酸内切酶消化pPT 0224的质粒DNA，通过琼脂糖凝胶电泳分离携带（db）₃的消化片段，并用NACS柱纯化。使纯化的片段自我连接，然后克隆到已用BanI限制性核酸内切酶消化过的pPT0140中（如图5所示）。用连接产物转化大肠杆菌HB101菌株。用FokI消化单个菌落的质粒DNA，借此分析其中含有多个（db）DNA片段的插入片段，发现了从（db）₃至（db）₁₂几个不同大小的插入片段。鉴定出有一个克隆即pPT 0229含有所希望的DCP-5单体顺序c₂（db）₆c₂，将其用于后续的构建。正如在DCP-1构建过程中所观察到的，发现含有DCP-4基因单体顺序c₂（db）₁₂c₂的克隆在后续的传代过程中高度不稳定。随后，将DCP-4基因单体克隆入pBR322。

通过用NruI和EcoRV限制性核酸内切酶消化和琼脂糖凝胶电泳，从质粒中分离含有DCP-4基因单体片段的质粒DNA，并用NACS柱纯化。使该DNA片段与预先用EcoRV和NruI限制性核酸内切酶消化过的质粒pBR322连接（参见实施例1的琼脂糖连接）。用连接产物转化大肠杆菌HB101菌株，并在含有氨苄青霉素（100μg/ml）的细菌平板上进行选择。通过用ScaI限制性核酸内切酶消化，分析单个菌落的质粒DNA。进一步分析含有插入片段的克隆，选出一个克隆即pPT0251用于DCP-4聚合物基因的构建。该质粒是稳定的。

DCP-4聚合物基因的构建

先用AcyI限制性核酸内切酶消化pPT0251的质粒DNA，再用FokI限制性核酸内切酶消化。通过琼脂糖凝胶电泳分离含有DCP-4基因单体的DNA片段，并用NACS柱纯化（参见实施例1）。如图6所示，将单体基因片段与预先用BanI限制性核酸内切酶消化过的pSY1262连接，用磷酸酶处理，用琼脂糖凝胶电泳和NACS柱纯化。用连接产物转化大肠杆菌HB101菌株，并选择能在含有抗生素卡那霉素（50μg/ml）的细菌平板上生长的转化体。从单个菌落中纯化质粒DNA，并分析其中DCP-4基因单体片段的多重插入。获得含有1、2或4拷贝DCP-4基因单体的几个克隆。质粒pPT0247、pPT0248和pPT0249分别含有1、2、4拷贝基因单体，被选来用于蛋白质表达分析。

DCP-4蛋白质表达分析

将含有质粒pPT0247、pPT0248和pPT0249的大肠杆菌HB101菌株于30℃下培养至OD₆₀₀为0.7，然后换到42℃培养2.0小时。用Western印迹分析法分析由这些细胞产生的蛋白质中能与DCP-c₂a₂肽特异性抗血清反应的新蛋白条带。对每个克隆都观察到一个相应于全长产物的反应性条带。

DCP-5聚合物基因的构建

在用FokI限制性核酸内切酶消化pPT0229的质粒DNA后，通过琼脂糖凝胶电泳和随后的NACS纯化，分离含有DCP-5基因单体的片段。如图6所示，将该基因片段与已用BanI限制性核酸内切酶消化过的pSY1262连接。用连接产物转化大肠杆菌HB101菌株，并选择能在含有抗生素卡那霉素（50μg/ml）的细菌平板上生长的转化体。从单个菌落中纯化质粒DNA，并分析其中含有多拷贝DCP-5基因单体顺序c₂（db）₆c₂的插入片段。质粒pPT0231和pPT0232分别含有3个和4个拷贝的DCP-5基因单体，被用于表达分析。

DCP-5蛋白质表达分析

将含有质粒pPT0231和pPT0232的大肠杆菌HB101菌株于30℃下培养至OD₆₀₀为0.7，然后换到42℃培养2.0小时。用Western印迹分析法分析由这些细胞产生的蛋白质中能与DCP-c₂a₂肽特异性抗血清反应的新蛋白质条带。对每个克隆都观察到一个相应于全长产物的反应性条带。

DCP-6基因单体的构建

如实施例1所述，合成和纯化四条编码d₄的寡核苷酸链，并进行退火处理。

使第一对由6A和6B链组成的寡核苷酸片段连接到预先用BanI限制性核酸内切酶消化过的pPT0138上。用连接产物转化大肠杆菌HB101菌株，并选择能在含有抗生素氯霉素的细菌平板上生长的转化体。用Eco01091和XmnI限制性核酸内切酶消化单个菌落的质粒DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。对含有正确大小片段的质粒DNA测序，有一个克隆即pPT0219含有正确的顺序，被用于后续的构建。

用BanI限制性核酸内切酶消化质粒pPT0219，并与第二对寡核苷酸链（6C和6D）连接。用连接产物转化大肠杆菌HB101菌株，并选择能在含有抗生素氯霉素的细菌平板上生长的转化体。从转化体中纯化质粒DNA，并用FokI和BanI限制性核酸内切酶消化。对含有正确大小片段的克隆测序。一个含有表11所示顺序的克隆pPT0220被用于DCP-6基因单体的后续构建。图4说明了pPT0220的构建。

表11

用FokI和BanI限制性核酸内切酶消化含有d₄顺序的质粒DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳及随后的NACS纯化分离含有d₄的消化片段。如图5所示，使纯化的片段自我连接，然后再与已用BanI限制性核酸内切酶消化过的DNA质粒pPT0140连接。用连接产物转化大肠杆菌HB101菌株，并选择能在含有抗生素氯霉素的细菌平板上生长的转化体。含有DCP-6基因单体（（d₄）₆，侧翼为c₂-c₂）的转化体pPT 0242被用于后续的构建。

DCP-6聚合物基因的构建

用FokI限制性核酸内切酶消化pPT0242的质粒DNA。通过琼脂糖凝胶电泳分离含有DCP-6基因单体的DNA片段，并用NACS柱纯化。如图6所示，将单体基因片段与已用BanI限制性核酸内切酶消化的pSY1262连接，用磷酸酶处理，用凝胶电泳和NACS柱纯化。用连接产物转化大肠杆菌HB101菌株，并选择能在含有抗生素卡那霉素（60μg/ml）的细菌平板上生长的转化体。从单个菌落中纯化质粒DNA，并分析其中DCP-6基因单体顺序c₂d₂₄c₂的多重插入。获得含有1-4拷贝DCP-6基因单体的几个克隆。质粒pPT0243、pPT0244、pPT0245和pPT0246分别含有1、2、3和4拷贝基因单体，被选来进行蛋白质表达分析。

DCP-6蛋白质表达分析

将含有质粒pPT0243至pPT0246的大肠杆菌HB101菌株于30℃下培养至OD₆₀₀为0.7，然后换到42℃培养2.0小时。用Western印迹分析法分析由这些细胞产生的蛋白质中能与DCP-c₂a₂肽特异性抗血清反应的新蛋白条带。结果见表11（a）。

DCP-6 重复片基因大小氨基酸观察到的蛋白质

表达克隆段个数 (bp) 个数条带(KD)

pPT0243 1 927 309 检测不出

pPT0244 2 1683 561 72

pPT0245 3 2439 813 110

pPT0246 4 3195 1065 140

表12

氨基酸单字母代码三字母代码

丙氨酸 A Ala

精氨酸 R Arg

天冬酰胺 N Asn

天冬氨酸 D Asp

天冬酰胺和/或天冬氨酸 B Asx

半胱氨酸 C Cys

谷氨酰胺 Q Gln

谷氨酸 E Glu

谷氨酰胺和/或谷氨酸 Z Glx

甘氨酸 G Gly

组氨酸 H His

异亮氨酸 I Ile

亮氨酸 L Leu

赖氨酸 K Lys

蛋氨酸 M Met

苯丙氨酸 F Phe

脯氨酸 P Pro

丝氨酸 S Ser

苏氨酸 T Thr

色氨酸 W Trp

酪氨酸 Y Tyr

缬氨酸 V Val

羟脯氨酸 Hyp

Claims

1、一种含有至少250个氨基酸的胶原样嵌段共聚物，其特征在于其通式为

其中：

A是具有通式为[Gl_y-x-y]_3-30的氨基酸顺序的嵌段肽单位，其中约50-75%的氨基酸x和y各自独自地选自脯氨酸和羟脯氨酸，每一个[Gl_y-x-y]氨基酸顺序可以相同或不同；

B是具有通式为[Gly-x-y]_3-30的氨基酸顺序的嵌段肽单位，其中约25-60%的氨基酸x和y各自独自地选自脯氨酸和羟脯氨酸，每一个[Gl_y-x-y]氨基酸顺序可以相同或不同；

C是具有通式为[Gl_y-x-y]_3-30的氨基酸顺序的嵌段肽单位，其中约25-60%的氨基酸x和y各自独自地选自脯氨酸和羟脯氨酸，其余的氨基酸x和y中至少有一个独立地选自赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬氨酸和谷氨酸，每一个[Gl_y-x-y]氨基酸顺序可以相同或不同；

f1、k、f2和m各自等于或大于1；

j1和j2之和等于或大于1。

2、一种含有至少250个氨基酸的胶原样多肽，其特征在于其通式为

其中：

A是具有通式为[Gly^-x^-y]_3-30的氨基酸顺序的肽单位，其中约50-75%的氨基酸x和y各自独自地选自脯氨酸和羟脯氨酸，每一个[Gly^-x^-y]氨基酸顺序可以相同或不同;

B是具有通式为[Gly^-x^-y]_3-30的氨基酸顺序的肽单位，其中约25-60%的氨基酸x和y各自独自地选自脯氨酸和羟脯氨酸，每一个[Gly^-x^-y]氨基酸顺序可以相同或不同;

k等于或大于1;

j1和j2之和等于或大于1。

3、一种含有至少250个氨基酸的胶原样多肽，其特征在于它具有通式为[Gly^-x^-y]_3-30的氨基酸顺序，其中约25-60%的氨基酸x和y各自独立地选自脯氨酸和羟脯氨酸，其余的氨基酸x和y中至少有一个独立地选自赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬氨酸和谷氨酸，每一个[Gly^-x^-y]氨基酸顺序可以相同或不同。

4、一种含有至少250个氨基酸的胶原样嵌段共聚物，其特征在于其通式为

其中：

A是具有通式为[Gly^-x^-y]_3-30的氨基酸顺序的嵌段肽单位，其中约50-75%的氨基酸x和y各自独自地选自脯氨酸和羟脯氨酸，每一个[Gly^-x^-y]氨基酸顺序可以相同或不同;

B是具有通式为[Gly^-x^-y]_3-30的氨基酸顺序的嵌段肽单位，其中约25-60%的氨基酸x和y各自独自地选自脯氨酸和羟脯氨酸，每一个[Gly^-x^-y]氨基酸顺序可以相同或不同;

C是具有通式为[Gly^-x^-y]_3-30的氨基酸顺序的嵌段肽单位，其中约25-60%的氨基酸x和y各自独自地选自脯氨酸和羟脯氨酸，其余的氨基酸x和y中至少有一个独立地选自赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬氨酸和谷氨酸，每一个[Gly^-x^-y]氨基酸顺序可以相同或不同;

k和m各自等于或大于1;

f1与f2之和等于或大于1;

j1与j2之和等于或大于1。

5、权利要求1的胶原样嵌段共聚物，其中所有在嵌段单位A中不是脯氨酸或羟脯氨酸的氨酸酸x和y都各自独立地选自甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸。

6、权利要求5的胶原样嵌段共聚物，其中嵌段单位A包含氨基酸顺序

Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro.

7、权利要求1的胶原样嵌段共聚物，其中在嵌段单位B中至少约66%的氨基酸x和y各自独立地选自脯氨酸、羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸。

8、权利要求7的胶原样嵌段共聚物，其中嵌段单位B包含氨基酸顺序

Gly-Ser-Arg-Gly-Asp-Pro-Gly-Pro-Pro.

9、权利要求7的胶原样嵌段共聚物，其中嵌段单位B包含氨基酸顺序

Gly-Ala-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Gly.

10、权利要求1的胶原样嵌段共聚物，其中嵌段单位B包含一个选自下列顺序的氨基酸顺序：

Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro

Gly-Pro-Pro-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser

Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Gly-Pro-Pro

Gly-Pro-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg.

11、权利要求1的胶原样嵌段共聚物，其中在嵌段单位C中至少约50%的氨基酸x和y各自独立地选自脯氨酸、羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸。

12、权利要求11的胶原样嵌段共聚物，其中其余的氨基酸x和y中至少有一个独立地选自天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、酪氨酸和半胱氨酸。

13、权利要求11的胶原样嵌段共聚物，其中其余的氨基酸x和y中至少有一个独立地选自赖氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。

14、权利要求11的胶原样嵌段共聚物，其中其余的氨基酸x和y中至少有一个独立地选自天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、酪氨酸和半胱氨酸，并且其余的氨基酸x和y中至少有一个独立地选自赖氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。

15、权利要求1的胶原样嵌段共聚物，其中嵌段单位C包含氨基酸顺序

Gly-Ala-His-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Lys.

16、权利要求1的胶原样嵌段共聚物，其中嵌段单位C包含一个选自下列顺序的氨基酸顺序：

Gly-Pro-Lys-Gly-Lys-Ala-Gly-Pro-Lys

Gly-Pro-His-Gly-Lys-Ala-Gly-Pro-Lys

Gly-Pro-His-Gly-Lys-Ala-Gly-Pro-His

Gly-Pro-His-Gly-His-Ala-Gly-Pro-His

Gly-Pro-Glu-Gly-His-Ala-Gly-Pro-Lys

Gly-Pro-Glu-Gly-His-Ala-Gly-Pro-His

Gly-Pro-Glu-Gly-His-Ala-Gly-Pro-Glu

Gly-Pro-Glu-Gly-Glu-Ala-Gly-Pro-Glu。

17、权利要求1的胶原样嵌段共聚物，该共聚物具有通式[C₂A₂₄C₂]_1-8，其中：

嵌段单位A包含氨基酸顺序

Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro

嵌段单位C包含氨基酸顺序

Gly-Ala-His-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Lys.

18、权利要求17中的胶原样嵌段共聚物，该共聚物具有通式[C₂A₂₄C₂]₄。

19、权利要求1的胶原样嵌段共聚物，该共聚物具有通式[C₂A₁₂C₂]_2-16，其中：

嵌段单位A包含氨基酸顺序

Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro

嵌段单位C包含氨基酸顺序

Gly-Ala-His-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Lys.

20、权利要求19的胶原样嵌段共聚物，该共聚物具有通式[C₂A₁₂C₂]₈。

21、权利要求1的胶原样嵌段共聚物，该共聚物具有通式[C₂（AB）₁₂C₂]_1-8，其中：

嵌段单位A包含氨基酸顺序

Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro,

嵌段单位B包含氨基酸顺序

Gly-Ser-Arg-Gly-Asp-Pro-Gly-Pro-Pro.

嵌段单位C包含氨基酸顺序

Gly-Ala-His-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Lys.

22、权利要求21的胶原样嵌段共聚物，该共聚物具有通式[C₂（AB）₁₂C₂]₄。

23、权利要求1的胶原样嵌段共聚物，该共聚物具有通式[C₂B₁₂C₂]_1-8，其中：

嵌段单位B包含氨基酸顺序

Gly-Ala-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Gly-

Gly-Ser-Arg-Gly-Asp-Pro-Gly-Pro-Pro

嵌段单位C包含氨基酸顺序

Gly-Ala-His-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Lys.

24、权利要求23的胶原样嵌段共聚物，该共聚物具有通式[C₂B₁₂C₂]₄。

25、权利要求1的胶原样嵌段共聚物，该共聚物具有通式[C₂B₆C₂]_2-16，其中：

嵌段单位B包含氨基酸顺序

Gly-Ala-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Gly-

Gly-Ser-Arg-Gly-Asp-Pro-Gly-Pro-Pro

嵌段单位C包含氨基酸顺序

Gly-Ala-His-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Lys.

26、权利要求25的胶原样嵌段共聚物，该共聚物具有通式[C₂B₆C₂]₈。

27、权利要求1的胶原样嵌段共聚物，该共聚物具有通式[C₂B₂₄C₂]_1-8，其中：

嵌段单位B包含氨基酸顺序

Gly-Ala-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Gly

嵌段单位C包含氨基酸顺序

Gly-Ala-His-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Lys.

28、权利要求27的胶原样嵌段共聚物，该共聚物具有通式[C₂B₂₄C₂]₄。

29、一种聚合混合物，该混合物包含权利要求1、2、3或4的胶原样嵌段共聚物和天然胶原。

30、一种纤维，该纤维包含权利要求1、2、3或4的胶原样嵌段共聚物。

31、一种薄膜，该薄膜包含权利要求1、2、3或4的胶原样嵌段共聚物。

32、一种涂料，该涂料包含权利要求1、2、3或4的胶原样嵌段共聚物。

33、一种医用植入物，该植入物包含权利要求1、2、3或4的胶原样嵌段共聚物。