CN85101555A - 重组脱氧核糖核酸(dna)表达载体和基因表达方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是有关为牛生长激素衍生物编码的新的选择性的自主复制重组DNA的表达载体。本发明还包括上述载体的新的转化株，制备蛋白质的颗粒的方法及其应用的方法。
Description
本发明是有关一种可选择的、自主复制重组脱氧核糖核酸（DNA）表达载体的发明。它包括以下顺序排列：（1）一种转录的和翻译的活化顺序，它置于为肽和多肽编码的核苷酸顺序的译读码上;（2）翻译的终止信号;（3）翻译的起始信号，它置于为功能多肽编码的核苷酸顺序的译读码上;（4）添加的翻译终止信号。上述的柑苷酸顺序能通过转录，用于生成可翻译的多顺反子信使核糖核酸。本发明也涉及到其使用方法。
重组脱氧核糖核酸技术的开发和发展一直由于缺乏能提供高水平的基因表达的载体而大大受到了限制。虽然类似乳糖（lac）（罗伯茨（Roberts）等人，1979年，美国全国科学协会记录汇编（Proc Nat Acad Sci USA）76/5596和格阿兰特（Guarante等人，1980年，细胞学（Cell）20/543），色氨酸（trp）（哈勒威尔（Hallewell）和埃默达柯（Emtage），1980年，基因（Gene）9/27），噬菌体λPL（雷莫德（Remaut）等人，1981年，基因（Gene）15（1）/81，伯纳德（Bernard）等人，1979年，基因（Gene）5/59和特罗姆（Derom）等人，1982年，基因（Gene）和（lPP）（齐培尔（Ziebel）等人，1981年，丁细菌学（J.Bacteriol）145/654，李（Lee）等人，1981年，丁细菌学（J.Bacteriol）146/861和中村（Nakamura）和依诺耶（Inouye），1979年，细胞学（Cell）18/1109）等的启动子体系已经和各种的重组脱氧核糖酸载体有所结合，但除此之外，没有更多的其他可采用的表达体系。实际上，很多异种基因不能被表达，或者充其量也只能通过使用这些已知的表达载体拙劣地表达了。这种表达的贫乏现象经常是与信使核糖核酸的转录有联系的，它是不适合于或不能结合到核蛋白体中去。以上现象可能是由于不适当的干
和环结构而形成的，这些结构隔绝了用于结合到核蛋白体的位点，或是由于信使核糖核酸转录的不稳定性而形成的，或是由于抑制核蛋白体的结合作用或抑制翻译起始的顺序的出现而形成的。在任何情况下，只要缺乏翻译，就不会有所需的多肽的表达或生产。
本发明是解决有关表达的各种问题，其中不需要对基因的人工合成的修饰。因为这种人工合成的修饰不仅仅耗费时间和资金，而且实际上是增加了这样的风险，即会给脱氧核糖核酸顺序带来偶然的误差。这个问题能够通过本发明加以解决：即不需对所处理的具体基因顺序进行改变或修饰，而通过改动信使脱氧核糖核酸转录的5′端的方法加以解决。
为了明确本文中公开的和提出权力要求的本项发明，以下列出有关的专业术语。
重组脱氧核糖核酸无性繁殖载体-任何一个包括但不仅限于质粒的自主复制剂，它含有一个脱氧核糖核酸分子，而一个或更多的附加脱氧核糖核酸片段能够或已经被添加到这个分子上。
重组脱氧核糖核酸表达载体-任何与一个或更多的转录和翻译激活因子顺序相结合的重组脱氧核糖核酸无性繁殖载体。
转录活化顺序-任何一个能指导或使脱氧核糖核酸转录成为信使核糖核酸转录的脱氧核糖核酸顺序。
翻译活化顺序-任何一个能指导或使信使核糖核酸转录的翻译成为肽或多肽的脱氧核糖酸顺序。
翻译起始信号-任何一个为翻译起始密码子编码的脱氧核糖核酸的三联体。
翻译终止信号-任何一个为翻译终止密码子编码的脱氧核糖核酸的三联体。
转化作用-把脱氧核糖核酸引入到作为接受者的宿主细胞中去的作用，由此而改变了其基因型。
转化株-一个经受了转化作用的作为接受者的宿主细胞。
限制片段-任何一个由于一个或更多的限制酶的作用而生成的线性脱氧核糖核酸顺序。
功能性多肽-可恢复的生物活性的异种多肽或前体;含有异种多肽和部份或全部同种多肽的可恢复的生物活性的多肽;或是含有异种多肽和能够被具体切断的生物非活性多肽的可恢复生物非活性的融合多肽。
融合基因产物-含有一部份或全部同种多肽的可恢复的异种多肽。
图示的说明
图1-4：是质粒PNM575的构建草图的图示。
图5-8：是质粒PNM898的构建草图的图示。
图9：是质粒PCZ114和PCZ105.1的限制部位图。
图10：是质粒PCZ1140的限制部位图。
图11：是胸腺素α-1合成基团。
图12：是核苷酸片断T15的合成草图。
图13：是质粒PThα1的构建草图。
图14 是胰岛素原合成基因。
图15：是质粒PH17△4△1的构建草图。
图16：是质粒PH1104的构建草图。
本发明提供了制备重组脱氧核糖核酸表达载体的方法，它包括连接：
a）转录的和翻译的活化顺序。
b）脱氧核糖核酸联结子，该联结子含有为核蛋白体结合部位以及肽或多肽编码的核苷酸顺序。该肽或多肽的编码顺序含有翻译终止信号，该信号是紧密相邻地置于为该肽或多肽的羧基末端编码的核苷酸三联体的下面位置，同时含有紧密相邻地置于该终止信号下面位置的翻译起始信号。
c）为功能性多肽编码的核苷酸顺序，而该功能性多肽编码顺序含有翻译终止信号，该信号紧密相邻地置于为该功能性多肽的羧基末端编码的核苷酸三联体的下面位置。这要以该载体是可以选择和自主复制为限制条件。
这些载体可以通过把XbaaI-HgiAI脱氧核糖核酸联结子顺序
其中：
A是脱氧腺嘌呤
G是脱氧乌嘌呤
C是脱氧胞嘧啶
T是胸腺
啶
连接到质粒PCZ101的片段～10.2仟碱基BamHI-XbaI和～0.6仟碱基BamHi-HgiAI的方法加以构建。该质粒被称为质粒PCZ114，按前后秩序它包含了（1）大肠杆菌脂蛋白基因转录和翻译活化顺序（Nakamura和Inouye，1979年），它是置于为核糖体结合部位和顺序MET PHE PRO LEU GLU ASP ASP的肽编码的核苷酸的顺序的译读码上。其中：
MET 是蛋氨酸
PHE 是苯丙氨酸
LEU 是亮氨酸
GLU 是谷氨酸
ASP 是天冬氨酸。
（2）位置适中的置于前述的肽编码顺序的译读码上的翻译终止信号。（3）紧密相邻地置于前述的终止信号下面位置的，同时也置于为甲硫氨酰-牛的生长激素（met-bGH）编码的核苷酸顺序的译读码上的翻译起始信号。（4）位置适中的置于甲硫氨酰-牛的生长激素（met-bGH）密码顺序的译读码上的翻译终止信号。
质粒PCZ101起始物质是～10.8仟碱基，是通过把质粒PNM789B的片段～0.6仟碱基XbaI-BamHI连接到类似的水解质粒PIM-I′-A3上而构建的。这后一个质粒含有大肠杆菌脂蛋白基因的转录和翻译活化顺序和热诱导失控复制子，它可以从大肠杆菌K12RV308/PIM-I′-A3中制取。该菌株是作为长期保存的培养基寄存在，美国伊利诺斯州Northern Regio-nal Research Laboratory，Peoria Illinois。这个其登记号码是NRRLB-15733的菌株是质粒的较为优先的来源和贮存储主。质粒PNM789B起始物质是根据图1-8所示和下述例1的步骤由质粒PKEN111衍生而得。这种质粒PKENlll能从大肠杆菌K12CC620/PKENlll中制取。而该菌株是作为长期保存的培养基寄存在，美国伊利诺斯州Northern Re-gional Research Laboratory Peoria Illinois。这个其登记号码是NRRLB-15011的菌株是质粒的较为优先的来源和贮存储主。质粒PNM789B也含有大肠杆菌脂蛋白基因的转录和翻译活化顺序。另外也含有包括位置适中的翻译终止信号在内的含有牛生长激素（bGH）和一个连在bGH-N末端上的9元多肽的融合蛋白的编码顺序。把上述包含在Xbal-BamHI片段的转录活化的和融合的蛋白密码顺序连接到被适当切断的质粒PIM-I′-A3上，就变成了上述的质粒PCZ101起始物质。
本领域的普通技术人员将认识到上面已经说明过的Xbal-HgiAI脱氧核糖核酸联结子是本文所例证的质粒PCZ114的重要组成。这个联结子（1）为翻译活化顺序编码。而这个顺序是置于为肽和核糖体结合位点编码的核苷酸顺序的译读码上。（2）为翻译终止信号编码。这个信号是位置适中地置于前述的肽编码顺序的译读码上。（3）为翻译起始信号编码。这个信号是紧密相邻地置于前述的终止信号的下面位置，同时也置于甲硫氨酰-牛的生长激素（Wet bGH）中部分密码顺序的译读码上。剩余的甲硫氨酰-牛的生长激素（met-bGH）编码顺序（包括位置适中的翻译终止信号）和转录活化顺序，能够通过质粒PCZ101的合适片段的连接而容易地形成了。这样的连接导致了本文所例证的～10.8仟碱基甲硫氨酰-牛的生长激素（met-bGH）表达质粒PCZ114的形成。普通的技术人员将认识到第一肽和甲硫氨酰-牛的生长激素（met-bGH）功能性多肽不包括融合基因产物，而更确切地说只是由单独的多顺反子信使核糖核酸转录本翻译得来的分离蛋白质。在附图的图9中显示了本文所例证的质粒PCZ114的限制位点图。
同样地人们能够构建许多可用于进一步阐明本发明的有关bGH表达质粒。例如，虽然每个特定的核糖核酸联结子顺序必须允许使至少两个分离多肽从单个信使核糖核酸转录本中表达，而实际上能够被用于实施上述构建的联结子脱氧核糖核酸顺序的数量却是无限的。这些顺序能按常规的改良磷酸三酯方法，通过使用完全封闭的二-脱氧核糖核苷酸结构单元去加以合成。这种合成方法是人所周知的，实际上人们能依据Itakura等人1977年Science 198∶1056和Crea等人，1978年，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 75∶5765所提供的程序实施该方法。本文所例证的顺序包括了，但不局限于脱氧核糖核苷酸，如下列所示：
上述所排列的顺序能够独立地连接到质粒PCZ101的～10.2仟碱基BamHI-XbaI片段和～0.6仟碱基BamHI-HgiAI片段上，分别构建了作为本文所例证的质粒PCZ101.1，PCZ1000，PCZ1000.1，PCZ1060和PCZ1120。这些质粒经过转录，提供了一个单独的多顺反子信使核糖核酸，它是为第一肽也为甲硫氨酰-牛的生长激素编码。
本发明并非只局限于特定转录活化顺序的用途。因为选择一个特定的顺序对实施本发明是无关紧要的。我们能够用转录活化顺序代替前面谈及过的所例证的脂蛋白活化顺序，而前者包括了，但不局限于大肠杆菌色氨酸（trp），大肠杆菌乳糖（lac），噬菌体PLOL噬菌体PROR，植物枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）（Veg）的和金色链霉素（Streptomycesazureus）硫链丝菌素（thiostrepton）抗性（tSr）基因转录活化顺序。另外，一个或更多的转录活化顺序能串，在一起使用。例如（trp）和（lac）转录活化顺序系列。所有上述的顺序已经如前所述，就其特征作了必要之说明，而且人们既能用人工合成方法又能从已知质粒中制备它们。
更有甚者，人们能用质粒PH17△4△1的Eco RI-CIaI的水解制取色氨酸转录活化顺序。根据本文后面所叙述的例5的方法人们能构建质粒PH17△4△1。由于质粒PH17△4△1的Tag 1限制位点有多重性，人们能够通过把前述的连接过的PH17△4△1 EcoR-Hpal和HpaI片段无性繁殖到EcoRI-CIaI水解的途径，使所要求的EcoRI-TagI片段得到最佳的生长和增强。这个称为质粒PNM608的～4.6仟碱基质粒，含有色氨酸转录活化顺序，它对组成本发明的附加实施例是极为有用的。
本文所例证的含有前面谈及过的色氨酸活化顺序的质粒能够通过连接：（1）质粒PNM608的～0.29仟碱基EcoRI-TagI片段。（2）质粒PCZ101的～10仟碱基EcoRI-BamHI片段。（3）质粒PCZ101的～0.6仟碱基BamHI-HgIA片段。（4）任何一个下列的脱氧核糖核苷酸顺序的途径去构建。
上文所叙述的连接分别导致了本文所例证的～10.8仟碱基质粒PCZ105.1，PCZ105.2，PCZ106.1，PCZ112.1和PCZ112.2的构建。这些质粒通过转录提供了为第一肽也为甲硫氨酰-牛生长激素编码的单个的多顺反子信使核糖核酸。从而进一步阐明了本发明。附图中的图9中显示了所例证的质粒PCZ105.1的限制位点图。
本发明的意义是多方面的，以致于人们实际上能用为功能性多肽编码的任何一个核苷酸顺序代替在上文中已例证过的甲硫氨酰-牛生长激素（met-bGH）编码顺序。这样的编码顺序包括了但不局限于具有研究和商业价值的：人生长激素（hGH），前-人生长激素（Pre-hGH），猪的生长激素（PGH），哺乳类动物的生长激素，鸟的生长激素，生长激素释放因子，人体胰岛素A链，人体胰岛素B链，人体胰岛素原，人体前胰岛素原，人类和非人类干扰素，尿激酶;组织血纤维蛋白溶酶原激活剂，内白细胞（杀菌）素（interleukin）Ⅱ，任何一种多肽激素，任何一种多肽酶和任何一种生物活化的多肽。
更有甚者，人们能够通过把质粒PCZ101的～10.2仟碱基BamHI-XbaI片段和质粒PNM575的～0.5仟碱基BamHI-FnuDII片段连接到联结子顺序
其中：A是脱氧腺嘌呤
G是脱氧乌嘌呤
C是脱氧胞嘧啶
T是胸腺嘧啶
的途径去构建本文所例证的说明人体生长激素表达的载体。
被称为质粒PCZ1140的作为产物的质粒，按前后秩序包含了：（1）大肠杆菌脂蛋白质基因转录和翻译活化顺序。它是置于为核糖体结合位点和顺序MET PHE PRO LEU ASP ASP的肽编码的核苷酸的顺序的译读码上。
其中：MET 是蛋氨酸
PHE 是苯丙氨酸
PRO 是脯氨酸
LEU 是亮氨酸
GLU 是谷氨酸
ASP 是天冬氨酸
（2）位置适中的和置于前面谈及的肽编码顺序的译读码上的翻译终止信号;（3）翻译起始信号，它是紧密相邻地置于前面谈及的终止信号的下面位置。同时置于为甲硫氨酰-人体生长激素（met-hGH）编码的核苷酸顺序的译读码上;（4）位置适中地置于甲硫氨酰-牛的生长激素顺序译读码上的翻译终止信号。上述的联结子顺序能依据前面引用过的Itakura等人，1977年和Crea等人，1978年的方法，通过常规的合成方法制得。而质粒PNM575起始物质能够依据图1-4和下述例1所示的步骤被构建。附图中的图10显示了所例证的质粒PCZ1140的限制位点图。
由本文所示的具体实施例中可知，质粒的复制是取决于热诱导失控复制子，这复制子已在西德专利1，557，774和Uhlin等人，1979年，在Gene6/91刊物上所公开了。在低于30度（℃）的温度条下，特别是在25度（℃）时，这复制了只维持了较低的复制数量，大约每个细胞有10～15个复制数。当温度升到37度（℃）时，复制就失去了控制，含有复制子的质粒脱氧核糖核酸能增到使每个细胞有1000～2000个复制数。这里所例证的特定的失控复制子是包含在前面谈及的质粒PIM-I′-A3起始物质中。
本发明不是只局限于任何特定失控复制子和复制数突变种的用途上。人们能够通过适当的选择或者能够依据在International Publication Number Wo 82/02901和Bittner和Vap-nek在1978年Gene刊物上公开的方法去构建其他的可诱导失控的或具有高复制数的复制子。另外，非失控复制子只要它们在大肠杆菌，链霉菌或其他合适的微生物宿主细胞中有功能作用，就能被加以利用。所例证的复制子包括了但不局限于从PMBI、COIEI、NRI、RK2、RK6、PSC101、RPI、RP4、F及其同类得来的，包括噬菌体在内的能在大肠杆菌中复制的复制子;从PEL7、PEL103、SCP2、SCP2＊及其同类得来的，包括噬菌体在内的能在链霉菌复制的复制子和从PC194、PBSI、PE194、PUB110、PT127及其同类得来的，包括噬菌体在内的能在杆菌中复制的复制子。普通技术人员将认识到，这些复制子和各种失控复制子能被取而代用去构成属于本发明范围内的表达载体。
对现有的所例证的脱氧核糖核酸顺序进行更多的其他修饰和变异是可行的。例如，基因密码的退化使人们能够用在在任何氨基酸编码区域中存在的核苷酸和
翻译终止信号去代替已经专门例证过的
翻译终止信号。另外，只要提供合适的翻译信号（核糖体结合位点和第一翻译始发及终止信号），核苷酸的数目以及对它的在转录活化顺序和载体的第二翻译起始密码子之间的选择就可以发生变化。现有范围内的其他变异包括了：（1）通过添加一个或更多的核苷酸使与第二翻译起始信号有关的第一翻译终止信号的译读码发生移码，（2）在第一翻译终止信号和第二翻译起始信号之间安置一个或更多的核苷酸三联体，从而维持了译读码，（3）通过在第一翻译起始信号和终止信号之间添加核苷酸三联体，改变第一顺反子的长度（在转录活化顺序和第一翻译终止信号之间，并包括两者在内的区域）。虽然顺反子的长度是无关紧要的，但采用为2-20氨基酸编码的较短的第一顺反子是更为优越。为防止在信使核糖核酸中产生互补碱基，根据1981年Nucleic Acids Research 9（1）：133的ZHKur和Stieg-ler的有原理和推断应该选择采用含有第一顺反子的核苷酸三联体。互补碱基产物之间的氢的结合（配对）导致了据信号是降低了翻译效率的干茎构型和环构型及其交迭的形成。含有第一顺反子的核苷酸三联体经过转录，最好也应提供一个位置适当地置于第二翻译起始密码子上面位置的核糖体结合位点。人们能够通过选择核苷酸三联体做到以上要求。这些三联体能产生至少两个的密码子，这不只是指氨基酸，也包括所需要的核糖体结合位点。
普通技术人员将认识到：上述的所有修饰和变异能够根据前面引用过的合成方法去实施。因此，本发明决不是只局限于本文专门例证过的脱氧核糖核酸顺序和质粒。
本发明还提供了一个生产功能性多肽的新方法，它包括了：
（1）用可选择的和自主复制子重组脱氧核糖核酸表达载体去转化有适应力的细胞。它包括了a）转录和翻译活化顺序，它是置于为肽和多肽编码的核苷酸顺序的译读码上。该肽或多肽编码顺序含有翻译终止信号，而该信号是紧密相邻地置于为该肽或多肽的羧基末端编码的核苷酸三联体的下面位置。b）翻译起始信号，它紧密相邻地置于该终止信号的下面位置，而且是置于为功能性多肽编码的核苷酸顺序的译读码上，该功能性多肽密码顺序包括了翻译终止信号，该信号是紧密相邻地置于为该功能性多肽的羧基末端编码的核苷酸三联体的下面位置。
（2）在适合于基因表达的生长条件下培养转化细胞。
上面谈及的方法解决了在许多情况下存在的低水平的或无基因的表达的问题，该情况下的信使核糖核酸是不稳定的，缺乏合适的构型或缺乏用于核糖体的高效连接的合适的顺序。本发明通过为含有两个顺反子的单个信使核糖核酸转录进行转化的途径解决了这个问题。为防止在信使核糖核酸中形成干茎和环第二结构的转化，人们设计出载体的第一肽或多肽密码顺序，它经过转录含有信息的第一顺反子。这种构型，据信是促使了适合的核糖体的连接，通过选择使用一种不会由于转录而生成互补碱基的核苷酸去防止翻译和表达。人们根据基因密码的退化和前面引用过的原理和方法（Zuker和Stiegler，1981年）就能做到这一点。因此本发明几乎不会受到任何限制的。本发明方法对表达为任何一种多肽编码的脱氧核糖核酸是极为有用的，而且具有可观的研究和商业上的价值。据本发明还可添加有用的顺序，从而使其他原来不稳定的核糖核酸趋于稳定;或者去掉或者置换那些干扰核糖体结合的干扰信使核糖核酸翻译起始的那些顺序。
本文所述的表达载体和本发明的方法可以广泛地用于宿主有机体。例如，革兰氏阴性原核生物有机体（gram-negative Prokary-otic Organisms）诸如下列的大肠杆菌类（Escherichia Coli）。如大肠杆菌K12，大肠杆菌K12RV308，大肠杆菌K12RRI和大肠杆菌K12MM294，还有粘质沙雷氏杆菌类（Serratia），绿脓杆菌类（Pseudomonas）及其同类;革兰氏阳性原核生物有机体（grampositive Prokaryotic Organ-isms例如，枯草杆菌类（Bacillus）。诸如，植物枯草芽孢杆菌（Bsubtilis），苏云金芽孢杆菌（B.thoringiensis）和苏云金芽孢菌israelensis变种（B.thuringiensis Var israelensis），还有链霉菌类（Streptomyces），诸如，新霉素链霉菌（S.tradiae），产二素链霉菌（S.ambotaciens），变铅青链霉素（S.lividans）和灰岩澡链霉素（S.griseotuccus）虽然本发明的所有实施例是有用的，但是只有某些载体和转化是最佳的。最佳的载体包括PCZ114、PCZ101.1、PCZ105.1、PCZ105.2、PCZ106.1、PCZ112.1、PCZ112.2和PCZ1140，而最佳的转化是包括了大肠杆菌K12RV 308/PCZ114，大肠杆菌K12RV 308/PCZ106.1，大肠杆菌K12RV 308/PCZ112.1，大肠杆菌K12RV 308/PCZ1140。在上述的载体和转化中，质粒PCZ114和PCZ101.1，以及转化中的大肠杆菌K12RV308/PCZ114和大肠杆菌K12RV308/PCZ101.1尤其更为突出。
普通技术人员将认识到：假如要用表达载体和本发明的方法去转化合适的宿主有机体，就需要用标准的发酵条件去表达外源蛋白质产物。而外源蛋白质产物是从发酵肉汁中用常规的方法分离出来的。下面要写到的一些实例将进一步阐述本文中的发明内容。在实例中主要是叙述本发明的具体方法和步骤，以及一些必要的解释。
实施例1
质粒PNM789的构建
A、质粒PKEN021的构建和它的XbaI-BamHI片段
质粒PKEN021的XbaI-BamHI分裂（如图6中106）产生的～5.1仟碱基片段作为起始物。质粒PKEN021是PKEN111的一种衍生物（如图1中101，Lee等人1981年在J：Bact 146：861-866和Zwiebel等人1981年在J：Bact 145∶654-656中作了进一步描述），后者以大肠杆菌CC 620寄存（NRRL寄存只15011）且具有～2.8仟碱基片段，它包含大肠杆菌的脂蛋白基因。NaKamura和Inouye 1979年在《细胞》（Cell）18∶1109-1117中对这种片段作了描述。在质粒PKEN021中，从大肠杆菌的脂蛋白基因取下的顺序取代了在PBR322的仅有的EcoRI和SalI两个限制位点之间的650个碱基对顺序。这种脂蛋白基因顺序（NaKamura和Inouye 1979年）包含位于脂蛋白基因的第一个三联体（蛋氨酸）上面位置的462个碱基对AluI片段，脂蛋白基因包含启动子，5′-未翻译区和核蛋白体结合部位。唯一的XbaI限制位点置于翻译起始蛋氨酸信号之前的核蛋色结合体部位16个碱基对之内。位于结构基因的翻译末端密码子上面位置的105碱基对处的PvuII限制位点，在加入合成DNA联结子（5′CC GG AT CC GG3′由协作研究得到）后改变为BamHI限制位点。脂蛋白的最后35个氨基酸的密码顺序、翻译末端信号和对应信使RNA的3′-未翻译区的顺序跟从着BamHI位点。质粒PKEN021还包含与脂蛋白基因无关的并且位于大肠杆菌染色体中脂蛋白基因下面位置的大约850个外部顺序碱基对，这些顺序是作用于基因最初分离的限制酶位点及其方法的结果。
参照图1、2和3，质粒PKEN021来源于PKEN111，方法如下：在300微升缓冲液中，25单位的HpaII限制酶催化水解约50微克的PKEN111，水解温度37℃，反应2小时，缓冲液含有20毫摩尔浓度三羟甲基氨基甲烷缓冲剂·盐酸PH7.4，10毫摩尔浓度MgCl2和6毫摩尔浓度β-巯基乙醇，用300微升酚与氯仿之混合物（50∶50）将上述混合液进行两次提取，然后把溶液态回收物用2.5体积的乙醇和0.1体积3摩尔浓度乙酸钠沉淀。把DNA片段溶解于100微升的电泳缓冲液中，并在5%的聚丙烯酰胺凝胶分成几个部分（除注明外，丙烯酰胺与二丙烯酰胺之比为29∶1），将凝胶在含有0.5微克/毫升的溴化3.8-二氨基-5-乙基-6-苯菲啶鎓的溶液中着色，于长波段紫外光下显现带，分离出950个碱基对带，且用电洗提将其从凝胶中回收并置于透析袋内。经酚/氯仿提取，乙醇沉淀后，将回收的DNA（大约25微克）溶解于25微升的TEN中（10毫摩尔浓度Nacl、10毫摩尔浓度三羟甲基氨基甲烷缓冲剂·盐酸PH7.4和1毫摩尔浓度乙二胺四乙酸钠（EDTA）PH8.0）。
在200微升的缓冲液中，用AluI限制酶催化水解大约2微克的950个碱基对HpaII片段，温度为37℃，反应2小时，缓冲液中含有50毫摩尔浓度Nael、6毫摩尔浓度三羟甲基氨基甲烷缓冲剂·盐酸PH7.6，6毫摩尔浓度MgCl2和6毫摩尔浓度β-巯基乙醇。将DNA分布于6%的聚丙烯酰胺凝胶上，按照前面所述方法回收和提纯所产生的462个碱基对AluI片段，并将其（约1微克）溶解于10微升74DNA连接酶缓冲液中（66毫摩尔浓度三羟甲基氨基甲烷缓冲剂·盐酸PH7.6，10毫摩尔浓度Mgcl2，10毫摩尔浓度二硫苏糖醇，0.4毫摩尔浓度ATP），其中缓冲液内含有150皮摩尔磷酸化联结子（5′GG AA TT CC 3′来自协作研究）和2单位74DNA连接酶。将上述混合液置于4℃下培养16小时后，再于65℃下加热10分钟，随后向该混合液内加入EcoRI缓冲液（100毫摩尔浓度三羟甲基氨基甲烷缓冲液·盐酸PH7.2，50毫摩尔浓度Nacl，10毫摩尔浓度MgCl2，6毫摩尔浓度β-巯基乙醇）和40单位EcoRI酶稀释至10微升，在37℃下培养2小时后，用酚/氯仿对样品进行提取，再用乙醇沉淀，然后将DNA溶解于10微升的T4 DNA连接酶缓冲液中，该缓冲液含有0.1单位的T4 DNA连接酶和0.1微克的PBR 322（如图1中的102），其中PBR322是经EcoRI线性化后又经碱性磷酸酶处理过的。在4℃下经16小时连接反应后，产物DNA用来转化大肠杆菌K12HB101，在含有12微克/毫升四环素的琼脂平板上选择转化株，按照Birnboim和Doly 1979年在《核酸研究》（Nucleic Acids research）7∶1513-1523中描述的快速碱性提纯法，从抗性菌落中分离质粒。选择出包含466个碱基对XbaI-BamHI片段的质粒（如图1中103），作为下个步骤的起始物。
大约2微克的这种质粒（如图2中103）被50微升HindIII缓冲液（60毫摩尔浓度Nacl，10毫摩尔浓度三羟甲基氨基甲烷缓冲剂·盐酸PH7.4，10毫摩尔浓度MgCl2和6毫摩尔浓度β-巯基乙醇）中的2单位HindIII酶催化水解，37℃下水解1小时后，用酚/氯仿进行提纯，乙醇沉淀，将DNA溶解于200微升缓冲液中，该缓冲液含有300毫摩尔浓度Nacl，30毫摩尔浓度乙酸钠PH4.25，1毫摩尔浓度Zncl2和200单位SI核酸酶（Miles实验室）。把上述混合液置于15℃下，反应1小时后，用酚/氯仿提取和乙醇沉淀以终止反应。把产物DNA溶解于10微升的T4DNA连接酶缓冲液中，该缓冲液中含有20皮摩尔磷酸化BamHI联结子（5′CC GG AT CC GG 3′来自协作研究）和2单位的T4 DNA连接酶。上述混合液在4℃下反应16小时后，再于65℃加热10分钟，使连接酶失活，然后在37℃下用含20单位BamHI酶的BamHI缓冲液（150毫摩尔浓度Nacl，20毫摩尔浓度三羟甲基氨基甲烷缓冲液·盐酸PH8.0，1毫摩尔浓度Mgcl2和6毫摩尔浓度β-巯基乙醇）稀释至10微升，2小时后，在1%琼脂凝胶上提纯混合物，并把凝胶着色，冷冻，用酚/氯仿提纯，通过洗脱回收较大的片段（～4.5仟碱基）。在4℃下，把回收的具有粘性末端的片段溶解在20微升的含有0.1单位的T4DNA连接酶的T4 DNA连接酶缓冲液中，16小时后，DNA用于转化大肠杆菌HB 101，选择对100微克/毫升的α-氨基苄青霉素（Ar p）有抗性的，并且筛选对100微克/毫升四环素（Ts c）敏感的转化株。按前面已描述的Birnboin步骤，用Ar pTs c菌落制备几种质粒，并且检验HindIII位点缺失和单-BamHI位点存在。用EcoRI、SalI继续催化水解产生了466碱基对片段和305碱基对片段，选择具有这种特性的质粒（如图2中104），然后将位于Ipp启动子上面位置的EcoRI位点改变到HindIII限制位点。
在37℃下，100微升EcoRI缓冲液中的2微克质粒（如图2中的104），用0.2单位的EcoRI催化水解，10分钟后，再于65℃加热10分钟终止其反应，然后用酚/氯仿提纯和乙醇沉淀DNA，再将其溶解在200微升的含有1000单位/毫升SI核酸酶缓冲液中，20℃下反应1小时后，用酚/氯仿提取和乙醇沉淀终止其反应。将产物DNA再悬浮于10微升的T4 DNA连接酶缓冲液中，该缓冲液含有20皮摩尔的磷酸化HindIII联结子（5′CC AA GC TT GG 3′来自协作研究）和2单位的T4DNA连接酶，上述混合物4℃下经16小时反应后，再于65℃下加热10分钟，然后用含10单位HindIII酶的HindIII缓冲液稀释至150微升，于37℃下培养2小时后，将其在1%琼脂糖凝胶上分成几个部分，回收并提纯最大的带（相当于单独切下质粒），再将其溶于20微升的含有0.2单位T4连接酶的T4连接酶缓冲液中，在4℃下培养16小时，尔后用来转化大肠杆菌HB 101。选择抗α-氨基苄青霉素的转化株，并用限制酶分析法离析质粒，再选择出具有500个碱基对EcoRI-HindIII片段的质粒（如图2中105），作为添加lpp基因的3′区的无性繁殖载体。
在37℃下，50微升SalI限制酶缓冲液（150毫摩尔浓度Nacl，6毫摩尔浓度三羟甲基氨基甲烷缓冲液。盐酸PH7.9，6毫摩尔浓度Mgcl2，6毫摩尔浓度β-巯基乙醇7中的大约2微克的质粒（如图3中105），被2单位的SalI催化水解，反应1小时后，用含有2单位BamHI的BamHI缓冲液稀释至150微升，37℃下，培养1小时后，加入2.5单位的碱性磷酸酶，然后于65℃下继续培养1小时，尔后用酚/氯仿提取该混合物，用乙醇沉淀，再溶解于TEN中，作为lpp3′片段的无性载体。
为了获得包含lpp3′区的片段，在37℃下，200微升HpaI缓冲液（20毫摩尔浓度Kcl，10毫摩尔浓度三羟甲基氨基甲烷缓冲剂·盐酸PH7.4，10毫摩尔浓度Mgcl2和6毫摩尔浓度β-巯基乙醇）中的10微克的PKEN111（如图3中101），用10单位HpaI催化水解2小时，其后用酚/氯仿提取和乙醇沉淀，再将DNA溶解于10微升的T4 DNA连接酶缓冲液中，该缓冲液含有20皮摩尔磷酸化SalI联结子（5′GG TC GA CC 3′来自协作研究）和2单位的T4 DNA连接酶，于4℃下培养16小时后，再于65℃下加热10分钟，使连接酶失活。37℃下，所得到的混合液用含有10单位SalI缓冲液稀释至100微升，培养1小时后，再用含有10单位PvuII限制酶的PvuII缓冲液（60毫摩尔浓度Nacl，6毫摩尔浓度三羟甲基氨基甲烷缓冲剂·盐酸PH7.5，6毫摩尔浓度MgCl2，6毫摩尔浓度β-巯基乙醇）稀释到300微升，继续培养1小时，尔后，将DNA在5%聚丙烯酰胺凝胶上分成几个部分，回收，提纯大约0.5微克的950个碱基对片段，并将其溶解于TEN中。在4℃下，用20微升的T4 DNA连接酶缓冲液稀释上述片段之2/10微克，培养16小时，该缓冲液含有20皮摩尔磷酸化BamHI联结子（5′CC GG AT CC GG 3′，来自协作研究）和2单位T4 DNA连接酶。于65℃下将产物DNA加热10分钟之后，再用含有20单位BamHI的BamHI缓冲液稀释至100微升，将其置于37℃下培养2小时，然后把它分布在5%的聚丙烯酰胺凝胶上，以去除多余的联结子分子，提纯得到的具有BamHI和SalI粘性末端的950个碱基对片段，并将其溶解在20微升的T4 DNA连接酶缓冲液中，该缓冲液含有0.2微克的前面描述过的无性载体和0.2单位T4 DNA连接酶两种物质。于4℃下经16个小时培养后，DNA用来转化大肠杆菌K12HB101，用抗α-氨基苄青霉素转化株制备质粒，并对其中的SalI-BamHI片段进行常规分析，将这种要求的质粒（～5.2仟碱基）命名为PKEN 021（如图3中106）。
于37℃下，200微升XbaI/BamHI缓冲液（150毫摩尔浓度NAcl，10毫摩尔浓度三羟甲基氨基甲烷缓冲剂·盐酸PH8，10毫摩尔浓度MgCl2，6毫摩尔浓度β-巯基乙醇）中的2微克PKEN021用10单位BamHI催化剂水解1小时后，再用10单位XbaI继续催化水解1小时，然后于65℃下，用2.5单位的碱性磷酸酶处理要求的XbaI-BamHI水解的DNA，用酚/氯仿提取，收集乙醇沉淀物，且将其溶解在50微升的TEN中，备用。（如图3中107）
B、质粒PNM575的构建
Matial等人1979年，在《科学》（Science）205∶602-607中所描述的质粒PtrpED50chGH800（如图4中108）作为含有人生长激素基因的部分密码顺序的DNA片段的来源。这种片段可合成得到（ItaKura等人1977年和Crea等人1978年），也可用Goodman等人1979年在《Methods in Enzymology》68∶75-90中描述的识别方法论获得，即从人脑下腺分离人生长激素mRNA密码，质粒ptrpED50chGH800的人生长激素基因部分包含位于基因的翻译终止密码子下面位置的唯一的SmaI限制位点6碱基对。用下面的步骤可将这个位点变化到BamHI位点。在37℃下，200微升SmaI限制缓冲液（15毫摩尔浓度三羟甲基氨基甲烷缓冲液·盐酸PH8.0，6毫摩尔浓度MgCl2，15毫摩尔浓度Kcl和6毫摩尔浓度β-巯基乙醇）中的6微克质粒被6单位的SmaI催化水解，反应1.5小时，水解完成后，用酚/氯仿提纯，乙醇沉淀，回收DNA，然后将其溶于24微升的TEN中。在16微升的含有2单位T4 DNA连接酶的T4 DNA缓冲液中，加入了0.5微克（0.2皮摩尔末端）上述水解后的质粒，再向其中加入40皮摩尔的磷酸化BamHI接合体片段（协作研究），该混合物先在22℃下培养2小时，后于4℃下培养16小时，再于65℃下培养10分钟。通常利用BamHI限制酶进行催化水解产生了BamHI粘性末端。酶分裂联结子顺序及位于无性人生长激素CDNA序列的起始端BamHI位点。这样产生的具有粘性BamHI末端的691个碱基对片段在6%的聚丙烯酰胺凝胶上分离，用常规方法进行回收，将回收的DNA片段与0.2微克的经BamHI催化水解的和碱性磷酸酶处理过的PBR322（如图4中102）连接起来（在前面描述的条件下，利用20微升缓冲液中的0.2单位的T4 DNA连接酶）。上述连接反应在4℃下进行16小时后，基本上按照WensinK等人1974年在《细胞》（cell）3∶315-325中的转化步骤，用上面得到的产物来转化大肠杆菌JA221（NRRL号：B-15014）。在含有100微克/毫升α-氨基苄青霉素琼脂平板上选择转化株，然后按常规方法分离出质粒，并用限制酶和凝胶电泳分析鉴定。这种要求的质粒被命名为PNM575（如图4中109），其含有大约700个碱基对的BamHI片段，通常将其放大备用。
C、质粒PNM702的构建
成人生长激素的DNA顺序包含一个FnuDII位点，该位点是第一个核苷酸的47个碱基对。在37℃下，250微升BamHI缓冲液中的25微克PNM575被25单位BamHI催化水解，1小时后，从6%聚丙烯酰胺凝胶上分离出具有BamHI粘性末端的691个碱基对片段，并进行提纯，提纯后的片段1/3（相当于8微克质粒），在100微升的FnuDII缓冲液（6毫摩尔浓度Nacl，6毫摩尔浓度三羟甲基氨基甲烷缓冲剂。盐酸PH7.4，6毫摩尔浓度MgCl2，6毫摩尔浓度β-巯基乙醇）中，被2.5单位的FnuDII催化水解，温度37℃下进行1.5小时，在6%聚丙烯酰胺凝胶上作电泳，并用标准的回收步骤分离538碱基对片段，该片段包含翻译终止信号之前的基因的最后175个氨基酸的密码顺序。用磷酸三酯方法合成双链DNA片段（如图5中110）以连接到带有人生长激素密码区的lpp启动子区上。双链DNA片段（如图5中110）具有如下顺序：
用识别磷酸三酯方法，制备片段，先制备如下短片段：
1）CTAGAGGGTAT
2）TAATAATGTTCC
3）CATTGGATGAT
4）GATGATAAGTTCC
5）CAACCATTCCC
6）TTATCCAGGC
7）TTTTTGACAACG
8）CTATGCTCCG
9）CATTATTAATACCCT
10）ATGGGAA
11）CTTATCATCATCCA
12）GGTTGGGAA
13）GGATAAGGGAAT
14）GTCAAAAAGCCT
15）CGGAGCATAGCGTT
利用上述制备的短片段，连接酶进行催化连接反应，分步描述如下：
a）在5′-磷酸化片段9参与，T4接连酶作用下，5′-未磷酸化片段1连接到5′-磷酸化片段2上，形成DNA双螺旋1（布朗（Brown）等人1979年《酶学法》（Methodsin Enzymology）68∶109-151），用15%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离该双螺旋。
b）在5′-磷酸化片段11参与，T4连接酶作用下，5′-磷酸化片段3连接到5′-磷酸化片段4上，形成DNA双螺旋2，用15%聚丙烯酰胺凝胶电泳提纯。
c）在5′-磷酸化片段12和13参与，T4连接酶作用下，5′-磷酸化片段5连接到5′-磷酸肥片段6上，形成DNA双螺旋3，用15%聚丙烯酰胺凝胶提纯。
d）在5′-磷酸化片段14和5′-未磷酸化片段15参与，T4连接酶作用下，5′-磷酸化片段7连接到5′-磷酸化片段8上，形成DNA双螺旋4，用15%聚丙烯酰胺凝胶电泳提纯。
e）在T4连接酶作用下，DNA双螺旋2、3和4连接在一起形成DNA双螺旋5，用15%聚丙烯酰胺凝胶电泳提纯。
f）在T4连接酶作用下，将5′-磷酸化片段10和DNA双螺旋5加到DNA双螺旋1上，得到的DNA双螺旋（如图5中110）用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳提纯。在T4聚核苷酸激酶和〔γ-P32〕ATP作用下，将这种DNA双螺旋磷酸化，步骤如下所述。
在24微升连接酶缓冲液中，1.5单位T4 DNA连接酶催化作用下，将0.1皮摩尔（0.4微克）的质粒PKEN021 XbaI-BamHI片段（如图5中107）、0.025皮摩尔合成的DNA片段（如图5中110）和0.3皮摩尔（0.08微克）538碱基对片段（如图5中109）连接起来，构成表达质粒PNM702，4℃下，培养16小时后，混合物用来转化前面所述的大肠杆菌JA221。在含100微克/毫升α-氨基苄青霉素的琼脂平板上选择转化株，并按照常规培养，以做为要求的表达质粒的最好来源。
用标准放射免疫测定法检测人生长激素（Twomey等人1974年Clin Chem 20∶389-391），并测出每个细胞含有至少2百万个分子。
D、质粒PNM789的构建
人生长激素的表达质粒-质粒PNM789（如图6中111）作为表达Met-Phe-Pro-Leu-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-bGH质粒结构的起始物。
Miller等人1980年，在J.Biol Chem 255∶7521-7524中描述的质粒PBP348（如图6中111）作为两个DNA片段的来源，这两个片段包含牛生长激素的一部分密码顺序。质粒包含在PBR 322的PstI限制部位中的无性繁殖的831碱基对牛生长激素密码顺序。Miller等人1980年描述的方法做为一种代表，可以用合成方法构成牛生长激素的顺序（ItaKura等人1977年和Grea等人1978年），或者用Goodman等人1979年描述的新的常规方法，从牛脑下腺中分离出的信使RNA中获得。
人生长激素与牛生长激素的密码顺序十分相似且显示出许多同一性，对牛生长激素来说，表达质粒的结构中特别有用的是由限制酶PvuII催化水解而产生的片段。人生长激素中产生的片段是497个碱基对，牛生长激素中产生的片段是496个碱基对，在两个顺序中，相应的限制位点出现在同样的译读密码上。
37℃下，200微升PvuII限制缓冲液（60毫摩尔浓度Nacl，6毫摩尔浓度三羟甲基氨基甲烷缓冲剂·盐酸PH7.5，6毫摩尔浓度MgCl2，6毫摩尔浓度β-巯基乙醇）中的10微克PNM702（如图6中111）被1单位的PvuII部分水解，水解10分钟，再于65℃下加热10分钟以终止反应，然后用碱性磷酸酶处理DNA，且在1%的琼脂糖凝胶上分离片段，通常，按照带有497个碱基对PvuII片段缺失（比单独切下质粒稍快些）的DNA尺寸大小切割下一段线性DNA片段，并将它提纯，用于中间质粒的结构中。
制备质粒PBP348的494个碱基对PvuII片段，即在200微升的含有10单位PvuII的PvuII缓冲液中水解10微克的质粒，37℃下水解1小时，尔后在6%聚丙烯酰胺凝胶上分离片段，通常显现出要求的494碱基对片段（如图6中112），将其提纯。
4℃下，在200微升含有2单位T4 DNA连接酶T4 DNA连接酶的缓冲液中，0.2微克的质粒PNM702与0.05微克的494个碱基对片段反应16小时，就可构成中间质粒（如图6中114）。在转化和选择抗α-氨基苄青霉素转化株后，对质粒中494碱基对PvuII片段的存在及相应方法做常规分析，选择带有494碱基对片段和440碱基对XbaI-SmaI片段的质粒，以用于后面的结构。
37℃下，200微升PvuII缓冲液中10微克中间质粒（如图7中114）被1单位PvuII水解，水解5分钟后，再于65℃下加热10分钟，混合物在1%琼脂糖凝胶上展开，将每个分子反切下的单独PvuII的这种线性DNA回收，提纯。回收物（大约微克）用5单位的XbaI完全水解，并用碱性磷酸酶处理，将这些片段在1%琼脂糖上展开，回收最大的片段（在人生长激素和牛生长激素中的XbaI和起始PvuII位点之间的缺失的109个碱基对片段）（如图7中115）。
牛生长激素的起始23个氨基酸（69个碱基对）至起始PvuII位点的DNA顺序包含两个HpaII限制位点，第一个位点是从第一个核苷酸密码顺序的23个碱基对，用磷酸三酯方法合成63个碱基对片段，这个片段对应19个碱基对顺序，即从lpp核蛋白体结合部位的KbaI位点经ATG翻译终止信号到Phe-Pro-Len-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys（24个碱基对）密码顺序和牛生长激素的20个核苷酸密码顺序（从Phe到起始HpaII位点），片段具有如下顺序：
在产生63碱基对片段时，需要制备下列九个短片段：
1）CTAGAGGGTAT
2）TAATAATGTTCC
3）CATTGGATGAT
4）GATGATAAGTTCC
5）CAGCCATGTCCTTGTC
6）ATGGGAACATTATTAATACCCT
7）TTATCATCATCATCCA
8）ATGGCTGGGAAC
9）CGGACAAGGAC
用上述制备的短片段，进行T4连接酶催化连接反应，分布描述如下：
a）在5′-磷酸化片段6参与，T4连接酶作用下，5′-未磷酸化片段1连接到5′-磷酸化片段2上，形成DNA双螺旋1，用15%聚丙烯酰胺凝胶电泳提纯。
b）在5′-磷酸化片段7、8和5′-未磷酸化片段9参与，T4连接酶作用下，5′-磷酸化片段3、4和5连接在一起，形成双螺旋2，用15%聚丙烯酰胺凝胶电泳提取。
c）在T4连接酶作用下，双螺旋1和2连接在一起，形成DNA双螺旋（如图7中116），用15%聚丙烯酰胺凝胶电泳提纯。该DNA双螺旋在T4聚核苷酸激酶和〔γ-P32〕ATP作用下磷酸化，步骤如下所述。
上述的HpaII位点至PvuII位点之间的46个碱基对DNA片段能够合成得到，或者从最初的PBP348质粒中获得。37℃下，400微升PvuII缓冲液中的100微克的质粒PBP348被50单位的PvuII催化水解，反应2小时后，进行酚提取和乙醇沉淀，并将其溶解于400微升会有50单位PstI的PstI缓冲液中（50毫摩尔浓度Nacl，6毫摩尔浓度三羟甲基氨基甲烷缓冲剂·盐酸PH7.4，6毫摩尔浓度MgCl2，6毫摩尔浓度β-巯基乙醇），2小时后，将DNA片段在6%聚丙烯酰胺凝胶上展开，用标准方法回收和提纯含要求的46个碱基对顺序的135个碱基对片段。将回收的DNA的1/3（相当于33微克）置于100微升的HPaII缓冲液中（20毫摩尔浓度三羟甲基氨基甲烷缓冲剂·盐酸PH7.4，7毫摩尔浓度MgCl2，6毫摩尔浓度β-巯基乙醇），用1单位的HPaII限制酶部分水解，温度37℃，反应40分钟，再于65℃下加热10分钟，将DNA片段在5%丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺∶二丙烯酰胺为79∶1）上沿适当尺寸标记展开。再用标准方法提纯由135个碱基对片段HpaII部分水解而产生的要求的46个碱基对片段。
4℃下，在2单位T4 DNA连接酶作用下，2/10微克的质粒载体的XbaI-PvuII片段（如图7中115），3.2皮摩尔合成的63碱基对片段（如图7中116）和0.5皮摩尔46个碱基对片段（如图7中112）在10微升连接缓冲液中培养16小时，连接物用于转化大肠杆菌JA221，得到的转化株正包含要求的质粒PNM789，并选择抗α-氨基苄青霉素的转化株，用常规方法筛选出494碱基对PvuII和109碱基对XbaI-PvuII两种片段都存在的质粒PNM789（如图7中117）。
E、质粒PNM789B的最终构成
为了完全转化牛生长激素，质粒PNM789（如图8中118）需要有一种氨基酸密码子变化。用合成的包含：
顺序的双螺旋片段代替质粒PNM789中去除的28碱基对PvuII至BamHI片段，来完成上述变化。
37℃下，200微升PvuII缓冲液中的10微克PNM789在1单位PvuII催化作用下，水解5分钟，然后再于65℃下加热10分钟，再加入BamHI缓冲液稀释至300微升，在10单位BamHI参与下完全水解，反应温度37℃，进行1小时，随后用5单位碱性磷酸酶处理，于65℃下培养1小时，在1%琼脂糖凝胶上分离DNA片段，用常规方法提纯单独切下的质粒PNM789的DNA片段（如图8中119）。20微升连接酶缓冲液中的上述片段的2/10微克与合成的片段5皮摩尔，在2单位T4连接酶催化下连接起来。于4℃下过夜，完成连接反应。随后进行转化反应，分离几种质粒，筛选出适当的PvuII（494碱基对）和XbaI-BamHI（628碱基对）片段，包含上述片段的质粒构成了要求的质粒PNM789（如图8中120）。
实施例2
质粒PCZ101和大肠杆菌K12 RV 308/-PCZ101的构建
A.质粒PIM-I′-A3的分离
用一般的微生物培养步骤，将大肠杆菌K12/PIM-I′-A3 NRRL B-15733（美国伊利诺斯农业研究培养物收集中心，寄存号B-15733）放在含卡那霉素50微克/毫升的TY肉汁（胰化胨肉汁1%、酵母浸出物0.5%、氯化钠0.5%、PH7.4）中培养，培养温度为25℃。把培养物按1∶10的比例稀释在新鲜的肉汁中，在37℃下保温3小时后，转移0.5毫升的培养物到1.5毫升的Epp-endrof试管内，离心分离约15分钟，除另有说明外，所有操作均在室温下进行。用一有细头的吸气器小心吸出上清液，使细胞小片重新悬浮于约100微升新配制的溶菌酶溶液（2微克/毫升）中，此溶菌酶溶液含溶菌酶2微克/毫升、葡萄糖50浓度毫摩尔、EDTA（乙二胺四乙酸盐）10毫摩尔浓度和Tris.HCl（三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液）25毫摩尔浓度，PH为8。约加200微升SDS（碱性十二烷基硫酸钠）溶液（NaOH 0.2当量、SDS 1%）后，缓慢将试管倒置在0℃下，直到溶菌作用完成（约5分钟），加入浓度为3克摩尔醋酸钠约150微升，倒置几秒钟使样品缓慢混合。
试管温度维持在0℃至少60分钟，再离心分离15分钟以得到几乎透明的上清液，把上清液转到盛有三倍体积、冷的100%乙醇的第二个离心试管内，将此试管放在干冰乙醇中5分钟，用离心（5分钟）法收集产生的沉淀，用吸气器去除上清液。把收集的细胞小片溶解在100微升TE（三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液浓度10摩尔、PH8.0、乙二胺四乙酸盐浓度1毫摩尔）中，这样便组成了欲要的质粒PIM-I′-A3 DNA。
B.质粒PNM 789 B的XbaI-BamHI的水解和XbaI-BamHI～0.6仟碱基片段的产生
在37℃下，用BamHI和XbaI限制酶各10个单位培养在50微升Hi缓冲溶液＊中的约5微克的质粒PNM 789B DNA，培养时间约为1小时。加入浓度为3摩尔、PH为7.0的醋酸钠5微升以后，其DNA用体积3倍的、100%的乙醇来沉淀。把欲要的DNA水解液溶解在100微升TE缓冲溶液中，在0℃下贮存、备用。
＊Hi盐酸缓冲液的配方是：
NaCl 100毫摩尔浓度
Tris.HCl 20毫摩尔浓度、PH8.0
MgCl210毫摩尔浓度
β-巯基乙醇 5毫摩尔浓度
C.质粒PIM-I′-A3的XbaI-BamHI水解
除了用质粒PNM 789B、不用质粒PIM-I′-A3外，这里欲要进行的水解与实施例2B相同。把欲要的DNA溶解在约100微升的缓冲溶液TE中，在0℃下贮存、备用。
D.连接和转化
把约1微克质粒PIM-I′-A3水解液、1微克质粒PNM 789B XbaI-BamHI水解液：40微升水、5微升（浓度5毫摩尔）ATP、5微升连接液＊和5个单位的T4 DNA连接酶混合、培养约2小时，其温度为20℃。在65℃下培养2分钟后再置于冰上冷却，得到的此连接混合物以作转化用，实际上这与Nensink，1974，Cell 3∶315采取的转化步骤相同，在TY培养基上（1%的胰化胨肉汁、0.5%的醇母浸出物、0.5%的氯化钠、1.5%的琼脂、PH7.4）培养的大肠杆菌含卡那霉素50微克/毫升。大肠杆菌K12 RV308已有寄存，NRRL B-15624，公众从此处可以得到这种大肠杆菌。
正如琼脂糖凝胶电泳（Maniatis et al.，1982）和其他试验所表明的那样，所得到的转化细胞只含欲要的质粒～10.8仟碱基，命名为K12 RV308/PCZ101，将其进行选择后，在含有适当抗菌素的TY培养基上培养，再用一般的微生物技术培养，采用与实施例1A中相同的步骤把所得的细胞用于分离质粒PCZ101用。
＊连接液的配方如下：
Tris.HCl 500毫摩尔浓度 PH7.8
二硫苏糖醇 200毫摩尔浓度
MgCl2100毫摩尔浓度
实施例3
质粒PCZ114和大肠杆菌K12 RV308/-PCZ114的构建
A.质粒PCZ101～10.2仟碱基BamHI-XbaI片段的构建
实际上，除了使用质粒PCZ101、不用PNM 789B外，遵从实施例2B的教导即可构成欲要的片段，欲要的～10.2仟碱基BamHI-XbaI限制酶一般用琼脂糖凝胶电泳（Maniatis et al.，1982）将其分离和离析，用约100微升TE缓冲液溶解，在零度下贮存、备用。
B.质粒PCZ101～0.6仟碱基BamHI-HgiAI片段的构建
实际上，在构成欲要的片段时，除了分别使用质粒PCZ101、限制酶HgiAI、不用质粒PNM 789B和限制酶XbaI外，只要遵从实施例2B的教导就行了。欲要的～0.6仟碱基BamHI-HgiAI限制片段一般用琼脂糖凝胶电泳（Maniatis et al.，1982）将其分离和离析，用约100微升TE缓冲液溶解，在0℃下贮存、备用。
C.DNA连接子顺序的构建
实际上，遵循Itakura et al.，1977，Crea et al.，1978等人的教导，采用改进的磷酸丙酯方法，一般便能合成出欲要的连接子的顺序，此合成方法在实施例1中也专门说明了。
D.连接和转化
将实施例3C中的DNA连接子浓度约20皮摩尔、质粒PCZ101～10.2仟碱基BamHI-XbaI片段1微克和质粒PCZ101～0.6仟碱基BamHI-HgiAI片段0.5微克混合、连接，把制得的此种质粒，用与实施例2D教导的相同的方法以转化大肠杆菌K12 RV308。
正如琼脂糖凝胶电泳（Maniatis et al.，1982）和其他试验一般表明的那样，所得到的这种转化细胞仅含欲要的～10.8仟碱基质粒，命名为K12 RV308/PCZ114，将其进行选择后，在含合适抗菌素的TY琼脂培养基上培养，然后再用一般微生物培养技术培养，SDS凝胶电泳、RIA和其他实验表明这种细胞高水平地表达Met-bGH，由于质粒PCZ114含有通过热诱导失控的复制子，所以Met-bGH的最大表达是在约37℃的培养温度时。
实施例4
质粒PCZ101.1和大肠杆菌K12 RV308/PCE101.1的构建
除用DNA连子顺序
来代替实施例3C中连接子的顺序外，遵从实施例3的教导便可得到欲要的结构，实际上用与Itakura et al.，1977和Crea et al.，1978等人相同的步骤便能构建上述连接子的顺序，上述合成方法在实施例1中也详述了。
把欲要的、命名为K12 RV308/PCZ101.1的大肠杆菌转化细胞在含有合适抗菌素的TY琼脂培养基上培养，作为下一步要用的产品，还应用一般方法进行培养，再分离出质粒PCZ101.1。SDS凝胶电泳、RIA和其他实验也表明转化细胞高水平地表达Met-bGH。由于质粒PCC101.1含有热诱导失控复制子，所以表达Met-bGH的最大温度是在培养温度大约37℃时。
实施例5
质粒PHI7△4△1的构建
有关质粒PHI7△4△1的部分结构示于附图15中。
A.质粒PBRHtrp的构建
质粒PGMI载有缺失△LE 1413的大肠杆菌色氨酸操纵子（Mi-ozzari，et al.，1978，J.Bacteriology，1457-1466），所以它表达融合蛋白，这种蛋白含：以trp为前导的头六个氨基酸、trpD多肽大约倒数第三个氨基酸（下文在连接处称之为LE′）和trpD多肽整个链，而所有这些都由启动子-操纵子系统控制的。大肠杆菌K12 W 3110 tna2 trp-△102/PGMI已寄存于美国标准微生物培养中心（ATCC No.31622），PGMI可用一般方法从菌珠上去除以在下述步骤中用。
用在五个位点分裂质粒的限制酶PVUII来水解约20微克的质粒。为给以后的无性繁殖成-含EcoRI点位的质粒提供-EcoRI分裂位点，把这种基因片段与EcoRI连接子（由顺序为PCATGAAT TC-ATG的自互补低核苷酸所组成）组合。在200皮摩尔的5′磷酸脂合成的低核苷酸PCATGAATTCATG存在下，在20微升T4 DNA连接酶缓冲溶液Tris.HCl 20毫摩尔浓度、PH7.6、ATP0.5毫摩尔浓度、MgCl210毫摩尔浓度、二硫苏糖醇5毫摩尔浓度）中，用10个单位的T4 DNA连接酶处理用PGMI得到的20微克DNA片段，处理时间一昼夜，温度4℃。将此溶液在70℃下加热10分钟以阻止连接。用Eco RI水解液和此片段来分裂连接子，这时的连接子就具有EcoRI终端，这种连接子再用5%的聚丙酰胺凝胶电泳（下文称“PAGE”）来分离。用溴乙烷首次染色法将三个最大的片段从凝胶中分离出来，再用紫外光定位和从凝胶上切下有用的部分，把有300微升0.1 XTBE的每一凝胶片段置于透析袋内，在100伏电压下，在0.1 XTBE缓冲溶液中（TBE缓冲液含：在一升水中有，Tris.base（三羟甲基氨基甲烷缓冲液）10.8克摩尔浓度、硼酸5.5克摩尔浓度、Na2EDTA 0.09克摩尔浓度），电泳1小时。收集透析袋的水液并用酚萃取、氯仿萃取，其中的氯化钠浓度是0.2克摩尔，乙醇沉淀后把DNA回收在水中。trp启动子/含带有EcoRI粘性末端片段的操纵子的鉴定是将其插进对四环素敏感的质粒中，由于启动子/操纵子的插入，对四环素敏感的质粒则成为抗四环素的了。在本实施例中叙述的所有DNA片段的分离都用PAGE法来进行，接着再用前面叙述的电洗提法处理。
B.在trp启动子/操纵子控制下的、表达抗四环素的质粒PBRH trp的构建，trp启动子/在上面“A”例中分离的含操纵子DNA片段的鉴定和放大
质粒PBRHI（Rodriguez，et al.，1979，Nucleic Acids Research 6，326-3287 and ATCC No.37070）表达抗氨苄青霉素，含抗四环素的基因，但是没配对启动子，所以不表达抗四环素，因此具有这种质粒的细胞对四环素是敏感的。在EcoRI位点引入一个启动子/操纵子系列，所以该质粒表达抗四环素。
质粒PBRHI用EcoRI水解，用酚萃取除去此酶后再用氯仿萃取，经乙醇沉淀后将此DNA悬浮于水中。在分离的反应混合物中，把此DNA与实施例5A中得到的三个DNA片段的每一个片段进行组合，再与前面叙述的T4 DNA连接酶连接。在反应混合物中存在的此DNA用作转化潜能大肠杆菌K12 294（NRRL B-15625），用现有技术进行此转化（Hershfield et al.，1974，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 71∶3455-3459），该细菌在含氨苄青霉素20微克/毫升、四环素5微克/毫升的培养基LB（Maniatis et al.，1982）上培养。
把几种抗四环素的菌落选出，分离出质粒DNA，命名为PBRHtrp。借助分析限制酶来确定欲要片段的存在。质粒pBRH trp表达β-内酰胺酶，授予其抗氨苄青霉素，它含有包括trp启动子/操纵子的DNA片段，该DNA片段也为第一蛋白编码，（命名为LE′），此蛋白含以trp为前导的头六个氨基酸的融合蛋白、trpE多肽大约倒数第三个氨基酸、一个第二蛋白（命名为D′）、大约相当于trpD多肽的头半段和一第三蛋白，第三蛋白用抗四环素基因来编码。
C.质粒PSOM 7△2的构建
用EcoRI限制酶水解质粒PBRH trp，把所得片段用PAGE法分离、电洗涤，再将其与EcoRI水解的质粒PSOMII（Itakura et al.，1977，Sci.198∶1056，US.Patent No.4，366，246，G.B.Patent Publication No.2007676A）组合，此混合物与T4 DNA连接酶连接，如以前叙述的那样把此DNA转化成K12 294大肠杆菌。选取的转化细胞在含氨苄青霉素的培养基上培养，用菌落杂交（Gruenstein et al.，1975，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 72∶3951-3965），对得到的抗氨苄青霉素进行筛选。把从PBRH离析出的用P32进行放射性标记trp启动子/含操纵子的片段在上述步骤中作探测用。菌落杂交表明几种菌落是阳性的，所以选取了这种菌落。把分离出来的质粒DNA用在双料水解液中的BgiLI和BamHI来进行限制分析以对插入的片段定位。含欲要的、带有位置适当的trp启动子/操纵子片段的质粒的菌落、在含氨苄青霉素浓度为10微克/毫升的LB介质中培养，这种欲要的质粒命名为PSOM7△2，它将用在下面要介绍的结构中。
D.质粒Ptrp 24的构建
1.为带有分别在编码链5′和3′末端的BglII和EcoR限制位点的LE′多肽末端区编码的基因片段的构建
质粒PSOM7△2经HindIII水解后，接着用入核酸外切酶（5′-3′核酸外切酶）水解，进行水解的条件应是，水解应在LE′编码区内的BgiII限制点以外进行。约20微克HindIII水解的PSOM7△2用缓冲液（甘氨酸缓冲液浓度20毫克分子，PH9.6，MgCl21毫摩尔，β颈基乙醇1毫摩尔浓度）溶解，把制得的混合物在室温下用5个单位的核酸外切酶处理60分钟，将反应混合物用酚萃取、氯仿萃取、乙醇沉淀。
在LE′基因片段的远端为产生EcoRI的残基，用改进的磷酸脂法（Crea et al.，1978）合成引物32PCCTGTGCATGAT，并将其杂交到由入核酸外切酶制得的LE′基因片段的单链末端，是按下述步骤来进行杂交的：把入核酸外切酶处理的质粒PSOM7△2HindIII水解液产物20微克溶解在20微升的水中，再与6微升含上面介绍的5′磷酸脂化的低核苷酸约80皮摩尔的溶液进行组合，把合成的此片段杂交到LE′编码顺序3′的末端，LE′片段仍为单链的部分通过Klenow聚合酶I填以dATP、dTTP、dGTP、dCTP。Klenow聚合酶I是一种由DNA聚合酶I的蛋白水解分解而得到的片段，它含5′→3′聚合性，3′→5′核苷酸外切活性，但不含亲代酶5′→3′核苷酸外切活性（kornberg，1974，N.H.Free-man and co.，SFO，98）。
把此反应混合物加热到50℃，再慢慢冷却到10℃后加4微升Klenow酶，在室温下培养15分钟，接着在37℃下保温30分钟，加入5微升浓度为0.25摩尔的EDTA以终止反应。该反应混合物用酚萃取，氯仿萃取、乙醇沉淀，用限制酶BgiII来分裂此DNA，用PAGE法分离。用此凝胶制得的放射性自显影照片表明P32标记片段的碱基对长度约为470，这个长度正是所要的，用电洗提后再回收。概括地说，片段LE′（d）有一BglII末端和一与引物始端相适应的平整末端。
2.质粒PThαI的构建
把合成的胸腺素α1的基因插进质粒PBR322便可构成质粒PThαI。胸腺素α1编码DNA的合成包括16低核苷酸（T1-T16）的合成和连接，此种核苷酸在附图11中用双箭头表示。在N末端插入一甲硫氨酸ATG，为了易化连接到裂化的带EcoRI和BamHI的质粒上，设计的5′末端为一具有粘性的单链末端。由于能易于鉴定，在基因中心的BglII位点有助于重组质粒的分析。
低脱氧核苷酸T1-T16是用Itakura et al.，1977和Crea et al.，1978等人改进的磷酸丙脂法来合成的，各种低脱氧核苷酸列在下面的表1中。
CPCH 856065
表1
胸腺素α1基因的合成低脱氧核苷酸
胸腺素α1基因的合成低脱氧核苷酸
HPLC分
析持留时间
化合物 顺序 长度 （分）＊
T1A-A-T-T-C-A-T-G-T-C 10 17.4
T2T-G-A-T-G-C-T-G-C-T-G-T-T-G-A 15 24.3
T3T-A-C-T-T-C-T-T-C-T-G-A 12 20.3
T4G-A-T-T-A-C-T-A-C-T-A-A-A 13 22.0
T5G-C-A-G-C-A-T-C-A-G-A-C-A-T-G 15 24.8
T6G-A-A-G-T-A-T-C-A-A-C-A 12 20.1
T7A-G-T-A-A-T-C-T-C-A-G-A-A 13 22.6
T8A-A-G-A-T-C-T-T-T-A-G-T 12 20.2
T9G-A-T-C-T-T-A-A-G-G-A-G 12 20.4
T10A-A-G-A-A-G-G-A-A-G-T-T 12 21.1
T11G-T-C-G-A-A-G-A-G-G-C-T 12 20.5
T12G-A-G-A-A-C-T-A-A-T-A-G 12 20.4
T13C-T-T-C-T-T-C-T-C-C-T-T 12 19.9
T14T-T-C-G-A-C-A-A-C-T-T-C 12 20.5
T15G-T-T-C-T-C-A-G-C-C-T-C 12 20.2
T16G-A-T-C-C-T-A-T-T-A 10 17.2
＊室温
正如附图12所总结的那样，下面合成片段T15的步骤代表了上述的合成。合成片段T15时用的核苷酸片段在图中是用数字来表示的，图中用的缩写如下：TPSTe 2，4，6-三异丙基苯硫酰四唑;BSA苯磺酸;TLC薄层层析;HPLC高性能液相层析;DMT 4，4′-二甲氧三苯;CE氰乙基;RP-氯苯基;BE苯甲酰基;An对甲氧苯酰;iBu异丁基;PY吡啶;ACOH醋酸;Et3N三乙基胺。
充分保护的三脱氧核苷酸4（8毫克，0.05毫克分子）和2（180毫克，0.1毫克分子），在0℃下，用2%BSA处理10分钟，这样将在羟基5′处断开，其中2%BSA为存在于氯仿/甲醇介质中，7∶3（体积/体积），（各为10和20毫升）。加入饱和的碳酸氢铵水溶液（2毫升）来抑制反应，用氯仿（25毫升）萃取、水（2×10毫升）洗涤，将有机层干燥（MgSO4）、浓缩为一小体积（约5毫升）、加入石油醚（35-65℃的馏分）进行沉淀，无色沉淀用离心法收集，在一干燥器中、在真空下干燥便能得到6和8，分别用薄层层析进行分析，分析结果表明6和8都是均一性的（Merck 60 F254，氯仿/乙醇，9∶1）。
在室温下，用三乙基胺/吡啶/水（1∶3∶1，体积/体积，10毫升）处理三联体1和3（270毫克、0.15毫摩尔浓度;145毫克，0.05毫摩尔浓度）25分钟，就可将其转换成它们的磷酸二脂（5和7，试剂用循环蒸发来去除，其残基用无水吡啶（3×10毫升）重复蒸发以干燥，在无水吡啶（3毫升）中把三联体8（0.05毫摩尔）和三联体7与TPSTe组合（50毫克，0.15毫摩尔浓度）在室温下，将反应混合物置于真空中2小时。TLC法分析表明，有95%的三联体8已转换成六联体产品（喷雾法、用10%的硫酸水液，在60℃下加热，测定DMT基，便可知道六联体产品）。加水（1毫升）以抑制反应，减压蒸发以除去吡啶。如上述的三联体4和2那样，该六联体用2%的BSA（8毫升）处理，则会在5′位置处断开。产品（10）在硅胶柱上纯化（Merch 60H 3.5×5厘米）、用氯仿/乙醇（98∶2-95∶5，体积/体积）分步洗脱以纯化，蒸发含产品10的馏分以干燥。同样的方法使产品三联体5与6配对，完全保护的产品直接用硅胶纯化，如上面叙述处理片段9那样，用三乙基胺/吡啶/水处理后面的这个化合物，它将在3′末端处断开。最后，将六联体9和10在无水吡啶中（2毫升）与作为缩合剂的TPSTe（75毫克，0.225毫克分子）配对。配对完成后（4小时，室温），循环蒸发该混合物，在硅胶上对残基进行色层分离。用石油醚进行沉淀，则可得到产品11（160毫克），薄层层析表明该产品是呈均一性的。在吡啶（0.5毫升）中的部分化合物（20毫克）用浓的氢氧化铵处理（7毫升，8小时，60℃）将完全断开，再用80%的醋酸处理（15分钟，室温）。在蒸去醋酸后，把其固体残基溶在4%的氢氧化铵（体积/体积，4毫升）中，用乙醚萃取（3×2毫升），把水相浓缩到1-2毫升，为纯化12要进行高性能液相层析，收集主峰时的部分（Ca.2 A254个单位），将其浓缩为大约5毫升。最终产品12用20%的乙醇、在硅胶过滤P-2（1.5×100厘米）上洗脱以脱盐，浓缩干燥，悬浮于水（200微升）中得到A254＝10的溶液，用两维顺序分析法确定12的顺序。
用合成的16低核苷酸、采用上面详述的、用于制备生长激素释放的抑制因子的方法（Itakura et al.，1977）、胰岛素的方法（Goeddel et al.，1979）和生长激素的方法（Goeddel et al.，1977，Nature 281∶544）来组合完善的胸腺素α1基因。在T4聚核苷酸激酶（Goeddel et al.，1979）下，用〔γ-P32〕-ATP（New England Nuclear）对10微克量的低核苷酸T2-T15定量进行磷酸脂化，最终比放大约为1居里/毫克分子。用20%的聚丙烯酰胺/7克分子脲凝胶电泳法纯化经放射性标记的片段，洗脱后片段的顺序用两维电泳/部分蛇毒水解均相色谱（Jay et al.，1974，Nucleic Acids Res.1∶331）进行鉴定。为了使不需要的共聚作用在顺序连接反应期间减到最低限度，应使片段T1和T16不磷酸脂化。利用已有技术（Goeddel et al.，1979）、通过T4 DNA连接酶把这些低核苷酸（每各2微克）组合在四个片段的四个组中（见附图13）。用凝胶电泳法，在含7摩尔脲的聚丙酰胺凝胶上纯化反应产物（Maxam and Gil-bert，1977，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 71∶3455）。把这四个产物连接在一起，反应混合物用10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行溶解，对范围大的胸腺素α1基因（90-105碱基对）进行电洗提。
质粒PBR322（0.5微克）用BamHI和EcoRI限制核苷酸内切酶进行处理，其片段用聚丙烯酰胺电泳进行分离，用电洗提法从凝胶上回收大的片段，再连接到组合而成的DNA上（Goeddel et al.，Nature 281∶154 1979）。用此混合物去转换大肠杆菌K12 294，5%的转化混合物在含有氨苄青霉素20微克/毫升的LB培养基上培养，得到的4个抗氨苄青霉素菌落对四环素敏感，这就表明已插在了抗四环素基因上。对这四个菌落的分析表明：在所有情况下，质粒-代号为ThaL含：（a）在PBR322自身中并未发现位点BglII，这就指出存在有如图11所胸腺素α1基因;（b）一个含由BamHI/EcoRI分裂产生的大约105碱基对的片段。质粒PTHdI（没按比例画）的链状结构示于附图13中，其中的黑点代表5′磷酸脂基团。
3.经处理的PTHaI和LE′（d）片段的反应
质粒PTHdI含有一特定的抗氨苄青霉素的基因和一特定的胸腺素α1结构基因，这种纯系的质粒是以EcoRI位点为结尾的5′编码链末端和以BamHI位点为结尾的3′末端，该胸腺素基因也含-BglII位点。为了制造出一个能接受上面制备的LE′（d）片段的质粒，PTHaI用EcoRI水解，接着将Klenow聚合酶1与dTTP和dATP反应生成一种平整的EcoRI残基。得到的BglII水解液产物产生一线性的、含有抗氧苄青霉素的基因的DNA片段，它的相反端则是一粘性的BglII粘性残基和一平整末端，得到的这个产物能再现，这是靠含-BglII粘性末端和一平整末端的LE′（d）片段在T4连接酶存在下反应形成的质粒Ptrp 24，此时在平整末端进行连接的位置再产生-EcoRI位点。
E.质粒PSOM 7△2△4的构建
带BglII和EcoRI的PTrp 24逐次水解液经PAGE、电洗提后产生一片段，该片段有带一以Bgl II为粘性末端和一与编码3′末端相邻的EcoRI为粘性末端的LE′（d）多肽的密码子。能无性繁殖LE′（d）片段到质粒PSOM 7△2的BglII位点上形成一LE′多肽/在色氨酸启动子/操纵子控制下表达的生长激素释放抑制融合蛋白。为达到此目的，则需要（1）为了分裂远的EcoRI位点到色氨酸启动子/操纵子的位置上，要有部分PSOM7△2的EcoRI水解液;（2）为适当维持密码子的解该密码和再产生一个EcoRI隔裂位点，要有选择恰当的引物的顺序。
这样，用200微升的缓冲液把16微克质粒PSOM702稀释，这种缓冲液含：三羟甲基氨基甲烷缓冲液20毫摩尔浓度、PH7.5，MgCl25毫摩尔浓度、NP 40洗涤剂0.02%，NaCl100毫摩尔浓度、稀释后的该质粒再用0.5单位的EcoRI处理。在37℃下保温15分钟后，反应混合物用酚萃取、氯仿萃取、乙醇沉淀、BglII水解。所得到的较大的片段用PAGE法离析，再进行电洗提，此片段含LE′多肽端的密码子“LE′（p）”，即密码子位于BglII位点的上面位置。在T4 DNA连接酶存在下，把此片段连接到上述的片段LE′（d）上，以形成质粒PSOM7△2△4，在完全转化为K12 294后，在色氨酸启动子/操纵子控制下，质粒PSOM7△2△4能有效产生一由完全重组的LE多肽和生长激素抑制因子组成的融合蛋白。
F.在3′末端有一PstI残基和在与特定抗四环素基因结合的5′末端有一BglII残基的线性DNA的构建
质粒PBR322被HindIII水解，突出的HindIII末端用Sl核酸酶水解，这包括：在15℃下，用30微升Sl缓冲液（NaCl浓度0.3克摩尔、ZnCl21毫摩尔浓度、醋酸钠25毫摩尔浓度、PH4.5）处理HindIII分裂的PBR322 30分钟，此缓冲液中有300单位的核酸酶。加入1微升3X Sl核酸酶抑制液（三羟甲基氨基甲烷碱性缓冲液0.8克摩尔浓度，EDTA 50毫升）以抑制此反应。该混合物经酚萃取、氯仿萃取、乙醇沉淀，再如前述的那样用EcoRI水解。把用PAGE法得到的此片段进行电洗提，此片段有一EcoRI粘性末端和一平整末端，该平整末端的编码链是以核苷酸胸苷为始端。以胸苷为始端的Sl水解的HindIII残基能连接到被处Klenow聚合酶处理的BglII残基上，这样便能根据其连接以重组BglII限制位点。
因此，在实施例5C中制备的质粒PSOM 7△2用BglII水解，得到的BglII粘性末端通过Klenow聚合酶1，用全部四个脱氧核苷酸脂处理，便能使之成为双链，所得的EcoRI卵裂经PAGE、电泳洗提小片段后产生一含色氨酸启动子/操纵子和在BglII位点（“LE′（p）”）上面位置的LE′的近端顺序密码子的DNA线性片段。该产品有一EcoRI端和一填充在BglII位点上而得到的平整末端，然而，重组的位点BglII是将平整端连接到上述Sl水解的HindIII片段的平整端上而得到的，这样，在T4 DNA连接酶存在下，使这两个片段连接以形成再现质粒PHKY10，此质粒是由通过转化而成为大肠杆菌的K12 294反应潜能细胞繁殖的。选择载有重组质粒PHKY10的抗四环素细胞、萃取质粒DNA，用BglII和PstI水解，PAGE法离析，电洗提大片段，便可得到欲要的有PstI和BglII粘性末端的线性片段。由PHKY10制备的此PNA片段含有复制起源，因此，它宜作构成质粒PHI7△4△1的成分，在此质粒中，既为多肽trp LE融合蛋白编码又给抗四环素的编码的基因都是由trp启动子/操纵子来控制的。
G.有Trp启动子/操纵子线性DNA的构建
把在实施例5E中制备的质粒PSOM7△2△4进行部分EcoRI水解，接PstI水解，制得的含有trp启动子/操纵子的片段经PAGE法处理，电洗提。为了获得一个被分裂的、和生长激素抑制因子5′末端相邻，但在抗氨苄青霉素基因和trp启动子/操纵子之间存在的EcoRI位点又不分裂的片段，部分EcoRI水解是必要的。抗氨苄青霉素基因是由于PstI切口而失去的抗氨苄青霉素的基因是能恢复的，其方法是把实例5F中制备的最终PHKY10线性DNA衍生物连接起来。
H.为胰岛素源32-N末端氨基酸编码的合成基因的制备
所制备的、列于表2的18个低核苷酸作为构成胰岛素源32个氨基酸基因编码的第一步，最后构成的整个核苷酸基因的顺序示于图14。
表2 人胰岛素源的合成低核苷酸
Compound 化合物 Sequence 顺序
H1 AATTCATGTT
H2 CGTCAATCAGCA
H3 CCTTTGTGGTTC
H4 TCACCTCGTTGA
H5 TTGACGAACATG
H6 CAAAGGTGCTGA
H7 AGGTGAGAACCA
H8 AGCTTCAACG
B1 AGCTTTGTAC
B2 CTTGTTTGCGGT
B3 GAACGTGGTTTC
B4 TTCTACACTCCT
B5′ AAGACTCGCC
B6 AACAAGGTACAA
B7 ACGTTCACCGCA
B8 GTAGAAGAAACC
B9 AGTCTTAGGAGT
B10′ GATCCGGCG
合成核苷酸示于图14的括号内、其下有横线，合成这些低核苷酸是采用Crea et al.，1978，Itakura et al.，1975，J.Biol.Chem.250∶4592和Itakura et al.，1975，J.Am.Chem.Soc.97∶7327等人介绍的方法，其中的几种低核苷酸用作构成Crea，et al.，1979，和Goeddel，et al.，1979他们以前介绍过的人胰岛素B链基因。两种低核苷酸（B5′和B10′）参入HpaII和末端BamHI及EcoRI限制位点，作无性繁殖时末端位点特别有用。
以前用于构成人胰岛素B链基因的左半段（Goeddel et al.，1979）的8个低核苷酸H1-H8含有为B链基因1-13氨基酸和另外的N末端甲硫丁氨酸的编号顺序。B链基因的右半段是由低核苷酸B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8、B9和B10、通过T4 DNA连接酶的连接而成的，这与Goeddel，et al.，1979，所教导的方法是一致的。所得到的这个基因片段为人胰岛素B链14-30氨基酸单位和以成键链开头的精氨酸编码。在同一码译读中，把一HpaII限制位点参入此基因顺序，而在人胰岛素基因中则参入到如HpaII位点的位置。用丙烯酰氨凝胶电泳纯化连接基因片段后，洗脱最大的DNA带，该片段插入HindIII-BamHI分裂的质粒PBR322中，得到的此质粒代号为PB3，通过转化将其插入大肠杆菌K12 294，此种质粒授与抵抗氨苄青霉素、抗四环素抗生长素的能力，业已发现此质粒含有欲要的核苷酸的顺序。
连接两个片段-PB3的58碱基对HindIII-BamHI片段和PBHI的46碱基对片段（Goeddel，et al.，1979）便能产生一个有EcoRI和BamHI末端的片段，再用一般方法连接此片段成一EcoRI和BamHI限制的质粒PBR322，得到的此质粒代号为PIB3，然后把它无性繁殖成大肠杆菌K12 294，经一般放大和离析后，用EcoRI和HpaII水解质粒PIB3便可制得一种合成基因片段（图15中的片段1），用它来给以前用蛋氨酸制备的N末端胰岛素编码。这种合成的基因一般用聚丙烯酰胺凝胶电泳离析。
I.50C-末端氨基酸为编码的人胰岛素原CDNA的分离
本方案用来获得所需要的CDNA，由附图中的图16所示。根据附图，将包含一个Bam HI认别顺序和一个近似于20残基的3′多胸〔腺嘧啶脱氧〕核苷酸的十核苷酸PCCGGATCCGGTTT18T，进行合成，并用来先导合成CDNA的AMV逆向转录酶。该先导物，用末端脱氧核苷酸转移酶（EnZO Biochem，200单位），在含有1.5×10-4微克分子TTP的反应溶液0.6毫升中，以1微克分子的Bam HI+核苷进行制备。该反应在37℃条件下，于Chang，等人，1978，Nature 275∶617中的缓冲系统中进行1小时。
人的胰岛瘤组织，由Institute fiir Diabetes-forsc-hung，Muenchen，West Germany，提供。本领域的普通技术人员都知道，人的胰岛瘤组织容易利用并可以从医疗群落中的许多其他来源得到。人的胰岛瘤组织的聚腺苷MRNA（2.5微克），基本上根据Ullrich，等人，1977，Science 196∶1313中提到的程序进行分离之后，大体上再根据Wickens，等人，1978，J.Biol，chem，253∶2483中的教导转换成双链CDNA。于是，将80微升体积的反应物，在0℃下予先保温，该体积的反应物含有15毫克分子三羟甲基氨基甲烷缓冲剂：盐酸（Tris Hcl）（在42℃时PH值为8.3），21毫克分子的Kcl，8毫克分子的Mgcl2，30毫克分子的β-巯基乙醇，2毫克分子的先导物dCCGGATCCGGTT18T，以及1毫克分子的dNPTS添加了AMV逆向转录酶之后，将该混合物在42℃下保温15分钟。该所得物RNA/DNA用常规的程序进行变性。
这个互补的CDNA链，在含有25毫克分子的三羟甲基氨基甲烷缓冲剂、盐酸，PH83，35毫克分子的Kcl，4毫克分子的Mgcl2，15毫克分子的β-巯基乙醇，1毫克分子的dNTPS和9个单位Klenow聚合酶I的反应物150微升中进行合成。该混合物在15℃下保温90分钟之后，继续在4℃下保温15小时。S1核苷酶水解液，是使用1000单位的S1核苷酶（Miles Labo-ratories，Elkkart，Indiana），大体上根据Wickens，等人，1978，的教导，在37℃下进行2小时实现的。双链CDNA（0.37微克），在8%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳移动，洗脱大于500碱基对的DNA片段。把低脱氧胞苷酸残基用末端脱氧核苷酸，大体上根据Maizel，1971，Meth，Virol，5∶18的程序添加到片段的3′末端上。然后把dC结尾的CDNA片段退火到PBR322，PBR322已经先用PstI限制酶水解后再用末端脱氧胞苷酸转移酶，结上脱氧核苷酸尾。所得到的质粒，用来转化大肠杆菌KI12Z294，并把产生的细胞移入平板的LB和TET基养基上培养。将抗四环素，而敏感氨苄青霉素的菌落进行分离，并筛选出有三个PStI限制位点的质粒。这样一个，正如Sure等人，1980，Science 208∶57的限制模式，表达了用作胰岛素的基因。一个代码为PHI104，包含了一个600碱基对插入物的质粒，给了预期的PStI限制模式。并含有一个在3′聚腺苷和在CDNA制备过程中引入的聚GC间的BamHI位点。在图14中给出了插入的某些核苷酸的顺序。
J.人的胰岛素原编码基因的集合
本方案用来集合人的胰岛素原的编码基因，是在附图中的图15中所示。
为胰岛素原开头31个氨基酸的合成基因片段，在图15中的片段1，使用上述的限制性内核酸酶Eco RI和HPaII，从50微克质粒PIB 3中回收。这些片段在胰岛素原前躯物的“前顺序”的位置中同样含有蛋氨酸的ATG顺序。
氨基酸32-86编码的CDNA基因片段，以及mRNA的翻译终止信号和3′没有翻译的区域，由40微克的PHI104质粒，先用BamHI限制酶处理，再用HPaII限制性酶处理的方法进行回收。这两个片段，是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳后再电洗脱的方法进行分离。基因片段，通过T4DNA连接酶，在20微升的连接酶缓冲液中，在4℃下处理24小时进行结合。该混合物，用50微升的H2O来进行稀释，通常用酚和氯份萃取后再用乙醇沉淀。
所得到的DNA，用BamHI和EcoRI转移酶处理，以再生这些部位并移动基因聚合体。将这个集合的胰岛素原基因，用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并连接（用T4DNA连接酶）到EcoRI和BamHI水解的质粒PBR322。所得到的该DNA，用来转换大肠杆菌K12294，之后所得的菌落，在四环素敏感性和氨苄青霉素抗性方面进行筛选。质粒PH13，是由含有所要求的胰岛素原基因的菌落进行分离，而该基因是继后通过核苷酸顺序分析加以鉴定。
K.表达含有人胰岛素原的嵌含蛋白质的质粒的构建
完全的人的胰岛素原基因，它包含有蛋氨酸编码的N-末端密码子，其基因由质粒PH13，用EcoRI和BamI转移酶处理法回收。所要求的片段，先用凝胶电泳纯化，之后连接于（用T4DNA连接酶）质粒PSOM7△2△4 PstI-EcoRI的部分水解物（在实施例5G中制备）和质粒PHkY 10（在实施例5F中所制备）的PstI-BglII片段的大部分水解物。于是，把约1微克完全的人的胰岛素原基因，其带有EcoRI和BamHI末端，4微克的PstI-EcoRI（部分）PSOM7△2△4片段和约1微克的PHKY10的PstI-BglII片段，用T4DNA连接酶，在连接缓冲液中，在4℃下，连接24小时。该连接的DNA混合物，被用来转化大肠杆菌K12294。从在氨苄青霉素和四环素上生长的菌落中挑选并找出含有所要求的质粒PHI7△4△1以及表达其分子量为色氨酰LE′-胰岛素原融合所要求之蛋白质的菌落。表达了前面提到的蛋白质的质粒PHI7△4△1，以DNA顺序和参入基因及载体的限制位点作为其全面的特征。质粒PHI7△4△1在附图中的图15中所描述，而且由于氨苄青霉素和四环素抗性的再生，就能够很容易被选择。
实施例6
质粒PNM 608和大肠杆菌K12RV308/PNM608的构建
A.质粒PHI7△4△1的～253碱基对EcoRI-HpaI片段的构建
将约5微克质粒PHI7△4△1DNA、10微升（10X）反应缓冲液＊、80微升水和5微升（5单位）HpaI限制酶在37℃下培养大约1小时后，再于70℃下培养5分钟终止其反应。混合物在冰上冷却后，加入1摩尔浓度三羟甲基氨基甲烷缓冲剂盐酸约12微升（PH7.2）、水7微升、EcoRI限制酶1微升（10单位），将得到的混合物先在37℃下培养1小时，再于70℃下培养5分钟，随后在冰上冷却。将产物DNA用酚提取，氯仿∶异戊醇（24∶1）之混合物提取，再用乙醇进行沉淀。通常用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离要求的～253个碱基对EcoRI-HpaI片段。用电洗提和ETOH沉淀将其回收，然后溶解于约10微升的TE缓冲液中，并保存在0℃下，备用。
＊HpaI限制酶反应缓冲液（10X）组成如下：
100毫摩尔浓度三羟甲基氨基甲烷缓冲剂·盐酸PH7
100毫摩尔浓度MgCl260毫摩尔浓度β-巯基乙醇
200毫摩尔浓度KCl
B.质粒PHI7△4△1的～34碱基对HpaI-JagI片段的构建
将约20微克的质粒PHI7△4△1 DNA在32微升（5X）EcoRI反应缓冲液＊、198微升水和4微升EcoRI限制酶（20单位）中培养大约1小时，温度为37℃。其后在70℃下培养5分钟以终止反应。用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳将得到的862碱基对片段分离，随后进行电洗提和乙醇沉淀，然后将该片段溶解于约100微升的含16单位HpaI限制酶缓冲液中，温度为37℃，1.5小时后，加入7.5单位的TagI限制酶，继续培养1.5小时，将得到的片段在7.5%的聚丙烯酰胺凝胶上进行分离，用电洗提和乙醇沉淀回收要求的～34碱基对HpI-TagI片段，并将其溶解于5微升的TE缓冲液中。
＊EcoRI限制酶反应缓冲液，组成如下：
250毫摩尔浓度Nacl，500毫摩尔浓度三羟甲基氨基甲烷缓冲剂·盐酸PH7.2，25毫摩尔浓度MgCl2，30毫摩尔浓度β-巯基乙醇。
C.质粒PBR322的EcoRI-CLaI水解
将约5微克的质粒PBR322 DNA，10微升CLaI反应混合液＊、77.5微升水和7.5微升CLaI限制酶（15单位）在37℃下培养大约1小时后，再于70℃下培养5分钟终止其反应。混合物在冰上冷却后，加入1摩尔浓度三羟甲基氨基甲烷缓冲剂·盐酸（PH7.2）约12.5微升，1摩尔浓度的NaCl 6.25微升，0.1摩尔浓度的Mgcl22.5微升和1微升EcoRI限制酶（10单位），将得到的混合物先在37℃下培养1小时，再于70℃下培养5分钟，随后在冰上冷却，用1%琼脂糖凝胶电泳分离产物DNA，通过洗提和乙醇沉淀，回收大的片段，并将其溶解于20微升的TE缓冲液中，保存在0℃下备用。
＊CLaI限制酶反应混合物（10X）组成如下：
100毫摩尔浓度三羟甲基氨基甲烷缓冲剂·盐酸PH7.4
100毫摩尔浓度Mgcl260毫摩尔浓度β-巯基乙醇
D.连接和转化
将实施例6A中的～253碱基对EcoRI-HpaI片段0.2微克，实施例6B中的HpaI-TagI片段0.5微克和实施例6C中的EcoRI-CLaI水解物0.1微克连接起来，用于转化大肠杆菌K12RV308。（基本上按照实施例2D的指导）
正如琼脂糖凝胶电泳和其它实验所证明，某些得到的转化株只含有要求的～4.6仟碱基质粒，这样的转化株被命名为大肠杆菌K12RV308/PNM608，且选择这种转化株接种在含有适当抗菌素的TY琼脂平板上，然后用常规微生物学技术进行培养。质粒PNM608包含并且是质粒PHI7△4△1的～287碱基对EcoRI-ClaI（TagI）片段的最好来源。
实施例7
质粒PCZ105.1和大肠杆菌K12 RV308/PCZ105.1的构建
A.质粒PNM608的EcoRI-ClaI水解和～0.288仟碱基EcoRI-TagI片段的产生（与质粒PHI7△4△1的～0.288仟碱基EcoRI-TagI片段相同）
将约5微克的质粒PNM608 DNA在50微升的盐缓冲液＊中培养大约1小时，温度为37℃，缓冲液中含EcoRI和CLaI限制
＊介质盐缓冲液组成如下：
50毫摩尔浓度Nacl 100毫摩尔浓度三羟甲基氨基甲烷缓冲剂·盐酸PH7.5 6毫摩尔浓度Mgcl22毫摩尔浓度β-巯基乙醇
酶各10单位。再加入5微升3摩尔浓度的乙酸钠，PH为7.0，用3体积100%的乙醇将DNA沉淀，把要求的DNA水解物溶于100微升的TE缓冲液中，保存在0℃下备用。
B.DNA联结子顺序的构建
通常用改进的磷酸三酯方法合成要求的联结子顺序，（基本上是按照Itakura等人1977年和Crea等人1978年的指导），合成方法在实施例1中已作专门说明。
C.连接和转化
将实施例7B中的DNA联结子约20皮摩尔，实施例7A中的PNM608水解物1微克，质粒PCZ101～10.2仟碱基BamHI-EcoRI片段0.5微克（根据实施例2B制备的，使用EcoRI限制酶和相应的缓冲液，不用X baI限制酶和缓冲液）和实施例3B中的质粒PCZ101～0.6仟碱基BamHI-HgiAI片段1微克连接起来，（基本上按照实施例2D的指导），用得到的质粒来转化大肠杆菌K12 RV308。
正如琼脂糖凝胶电泳和其它实验所证明，某些得到的转化株只含有要求的～10.8仟碱基质粒，这种转化株被命名为大肠杆菌K12RV308/PCZ105.1，并且选择这种转化株接种在含有适当抗菌素的TY琼脂平板上，然后按常规微生物学技术进行培养。经十二烷基磺酸钠凝胶电泳、放射免疫测定和其它实验证明得到的细胞高水平地表达了met-bGH，由于质粒PCZ105.1含有热诱导失控复制子，所以经37℃下培养后，最高水平地表达了met-bGH。
实施例8
质粒PCZ105.2和大肠杆菌K12RV308/PCZ105.2的构建
除了用下述的DNA联结子顺序代替实施例7中的联结子顺序外，大体上根据实施例7的指导，制得所要求的构成物。
上述特定的联结子顺序，可大体上根据1977年Itakura等人和1978年Crea等人所示的常规方法构建。上述的合成方法在实施例1中也已作了专门的说明。
为了以后质粒PCZ105.2的生产和分离，把所要求的转化株，在这里是被命名为大肠杆菌K12RV308/PCZ105.2的转化株，平舖在含有特定抗菌素的TY琼脂培养基上，然后按常规培养。通过十二烷基磺酸钠凝聚电泳、放射免疫测定及其他试验以证明转化株最高水平地表达了met-bGH。基于质粒PCZ105.2含有热诱导失控的复制子，约在37℃培养时可获得met-bGH最高水平的表达。
实施例9
质粒PCZ106.1和大肠杆菌K12RV308/PCZ106.1的构建
除了用下述的DNA顺序代替实施例7中的联结子顺序外，大体上根据实施例7的指导，制得所要求的构成物。
上述特定的联结子顺序，可大体上根据1977年Itakura等人和1978年Crea等人所示的常规方法构建。上述的合成方法在实施例1中也已作了专门的说明。
为了以后质粒PCZ106.1的生产和分离，把所要求的转化株，在这里是被命名为大肠杆菌K12RV308/PCZ106.1的转化株，平舖在含有特定抗菌素的TY琼脂培养基上，然后按常规培养。通过十二烷基磺酸钠凝聚电泳、放射免疫测定及其他试验以证明转化株最高水平地表达了met-bGH。基于质粒PCZ106.1含有热诱导失控的复制子，约在37℃培养时可获得met-bGH最高水平的表达。
实施例10
质粒PCZ112.1和大肠杆菌K12 RV308/PCZ112.1的构建
除了用下述的DNA顺序代替实施例7中的联结子顺序外，大体上根据实施例7的指导，制得所要求的构成物。
上述特定的联结子顺序，可大体上根据1977年Itakura等人和1978年Crea等人所示的常规方法构建。上述的合成方法在实施例1中也已作了专门的说明。
为了以后质粒PCZ112.2的生产和分离，把所要求的转化株，在这里是被命名为大肠杆菌K12 RV308/PCZ112.1的转化株，平舖在含有特定抗菌素的TY琼脂培养基上，然后按常规培养。通过十二烷基磺酸钠凝聚电泳、放射免疫测定及其他试验以证明转化株最高水平地表达了met-bGH。基于质粒PCZ112.1含有热诱导失控复制子，约在37℃培养时可获得met-bGH最高水平的表达。
实施例11
质粒PCZ112.2和大肠杆菌K12 RV308/PCZ112.2的构建
除了用下述的DNA顺序代替实施例7中的联结子顺序外，大体上根据实施例7的指导，制得所要求的构成物。
上述特定的联结子顺序，可大体上根据1977年Itakura等人和1978年Crea等人所示的常规方法构建。上述的合成方法在实施例1中也已作了专门的说明。
为了以后质粒PCZ112.2的生产和分离，把所要求的转化株，在这里是被命名为大肠杆菌K12 RV308/PCZ112.2的转化株，平舖在含有特定抗菌素的TY琼脂培养基上，然后按常规培养。通过十二烷基磺酸钠凝聚电泳、放射免疫测定及其他试验以证明转化株最高水平地表达了met-bGH。基于质粒PCZ112.2含有热诱导失控的复制子，约在37℃培养时可获得met-bGH最高水平的表达。
实施例12
质粒PCZ1000和大肠杆菌K12 RV308/PCZ1000的构建
除了用下述的DNA联结子顺序代替实施例3C中的联结子顺结子的顺序外，大体上根据实施例3的指导，制得所要求的构成物。
上述特定的联结子顺序，可大体上根据1977年Itakura等人和1978年Crea等人所示的常规方法构建。上述的合成方法在实施例1中也已作了专门的说明。
为了以后质粒PCZ1000的生产与分离，把所要求的转化株，在这里是被命名为大肠杆菌K12 RV 308/PCZ1000的转化株，平舖在含有特定抗菌素的TY琼脂培养基上，然后按常规培养。通过十二烷基磺酸钠凝聚电泳、放射免疫测定及其他试验以证明转化株最高水平地表达了met-bGH。基于质粒PCZ1000含有热诱导失控的复制子，约在37℃培养时可获得met-bGH最高水平的表达。
实施例13
质粒PCZ1000.1和大肠杆菌K12 RV308/PCZ1000.1的构建
除了用下述的DNA联结子顺序代替实施例3C中的联结子顺序外，大体上根据实施例3的指导，制得所要求的构成物。
上述特定的联结子顺序，可大体上根据1977年Itakura等人和1978年Crea等人所示的常规方法构建。上述的合成方法在实施例1中也已作了专门的说明。
为了以后质粒PCZ1000.1的生产和分离，把所要求的转化株，在这里是被命名为大肠杆菌K12 RV308/PCZ1000.1的转化株，平舖在含有特定抗菌素的TY琼脂培养基上，然后按常规培养，通过十二烷基磺酸钠凝聚电泳、放射免疫测定及其他试验以证明转化株最高水平地表达了met-bGH。基于质粒PCZ1000.1含有热诱导失控的复制子，约在37℃培养时可获得met-bGH最高水平的表达。
实施例14
质粒PCZ1060和大肠杆菌K12 RV308/PCZ1060的构建
除了用下述的DNA联结子顺序代替实施例3C中的联结子顺序外，大体上根据实施例3的指导，制得所要求的构成物。
上述特定的联结子顺序，可大体上根据1977年Itakura等人和1978年Crea等人所示的常规方法构建。上述的合成方法在实施例1中也已作了专门的说明。
为了以后质粒PCZ1060的生产和分离，把所要求的转化株，在这里是被命名为大肠杆菌K12RV308/PCZ1060的转化株，平舖在含有特定抗菌素的TY琼脂培养基上，然后按常规培养。通过十二烷基磺酸钠凝聚电泳、放射免疫测定及其他试验以证明转化株最高水平地表达了met-bGH。基于质粒PCZ1060含有热诱导失控的复制子，约在37℃培养时间可获得met-bGH最高水平的表达。
实施例15
质粒PCZ1120和大肠杆菌K12 RV308/PCZ1120的构建
除了用下述的DNA联结子顺序代替实施例3C中的联结子顺序外，大体上根据实施例3的指导，制得所要求的构成物。
上述特定的联结子顺序，可大体上根据1977年Itakura等人和1978年Crea等人所示的常规方法构建。上述的合成方法在实施例1中也已作了专门的说明。
为了以后质粒PCZ1120的生产和分离，把所要求的转化株，在这里是被命名为大肠杆菌K12RV308/PCZ1120的转化株，平舖在含有特定抗菌素的TY琼脂培养基上，然后按常规培养。通过十二烷基磺酸钠凝聚电泳、放射免疫测定及其他试验以证明转化株最高水平地表达了met-bGH。基于质粒PCZ1120含有热诱导失控的复制子，约在37℃培养时可获得met-bGH最高水平的表达。
实施例16
质粒PCZ1140和大肠杆菌K12 RV308/PCZ1140的构建
A.质粒PNM的BamHI-FnuDII水解和～0.5仟碱基
BamHI-FnuDII片段的产生
将约5微克的质粒PNM575（按实施例1B制备）加入到50微升的盐介质缓冲液＊中，与其量各为10个单位的BamHI和FnuDII限制酶一起，于37℃培养1小时。继加入3摩尔浓度的醋酸钠，PH达7.0后，DNA用二倍体积的100%的乙醇进行沉淀并回收。然后把此欲得到的DNA水解产物溶介在100微升的TE缓冲液中，0℃贮藏以备后用。
＊盐介质缓冲液按下述配方制备
50毫摩尔浓度 氯化钠
50毫摩尔浓度 三羟甲基氨基甲烷缓冲剂·盐酸，PH8
10毫摩尔浓度 氯化镁
6毫摩尔浓度 β-巯基乙醇
B.DNA联结子顺序的构建
上述特定的联结子顺序可以大体上根据1977年Itakura等人和1978年Crea等人所示的常规方法构建。上述的合成方法在实施例1中也已作了专门说明。
C.连接和转化
把实施例16B中的DNA联结子20皮摩尔，实施例16A中的BamHI-FnuDII水介液1微克和实施例3A中的～10.2仟碱基BamHI-XbaI片段0.5微克连接起来，用这所获得的质粒，大体上根据实施例2D的指导，来转化大肠杆菌K12 RV308。
将部分所获得的转化株，如常惯所示，通过琼脂糖凝聚电泳方法（Maniatis等人，1982）以证明其只含所要求的～10.8仟碱基质粒。选出一株这样的转化株，在这里是被命名为大肠杆菌K12 RV308/PCZ1140的转化株，平舖在含有特定抗菌素的TY琼脂培养基中，然后按常规微生物技术培养。通过十二烷基磺酸钠凝聚电泳、放射免疫测定及其他试验以证明所获得的细胞最高水平地表达了met-hGH。基于质粒PCZ1140含有热诱导失控的复制子，约在37℃培养时可获得met-hGH最高水平的表达。
85101555
勘误表
勘误表
勘误表
Claims (40)
1、一个制备重组DNA表达载体的方法，其包括连接：
a)一个转录和翻译的活化顺序；
b)一个包括为核糖体结合位点和肽或多肽编码的核苷酸顺序的联结子，上述的肽或多肽的编码顺序包含一个与为上述肽或多肽羧基末端编码的核苷酸三联体之下面位置直接相邻的翻译终止信号及一个与上述终止信号的下面位置直接相邻的翻译起始信号。
(c)一个为功能性多肽编码的核苷酸顺序，上述的功能性多肽编码顺序包含一个与上述的功能性多肽羧基末端编码的核苷酸三联体之下面位置直接相邻的翻译终止信号。
这要以载体是可选择和自主复制为限制条件。
2、如权利要求1的方法，其中的载体是质粒。
3、如权利要求1或2的方法，其中的肽或多肽的编码顺序为2-20个氨基酸编码。
4、如权利要求1、2或3，其中的肽或多肽的编码顺序是一个为MET-PHE-PRO-LEU-GLU-ASP-ASP，MET-GLU-ASP-ASP，MET-GLU-ASP-ASP-LYS，MET-ASP-ASP-LYS，MET-GLU-ASP-GLN或MET-ASP-GLN编码的顺序。
其中：
MET 是 蛋氨酸
PHE 是 苯基丙氨酸
PRO 是 脯氨酸
LEU 是 亮氨酸
GLU 是 谷氨酸
ASP 是 天冬氨酸
GLN 是 谷氨酰胺
5、如权利要求1-4中的任意一个方法，其中转录的活化顺序是大肠杆菌色氨酸，大肠杆菌指蛋白，大肠杆菌乳糖，噬菌体λPLPL噬菌体λPrOr，植物性枯草杆菌（Bacillus Subtillus Ve-getative）或金色链霉菌硫链丝菌素（Streptomyces azur-eus thiostrepton）抗性转录活化顺序。
6、如权利要求5的方法，其中转录的活化顺序包括一串或多串大肠杆菌转录活化顺序。
7、如权利要求1-6中的任意一个方法，其中转录的活化顺序是大肠杆菌色氨酸转录活化顺序或大肠杆菌脂蛋白转录活化顺序。
8、如权利要求1-7中的任意一个方法，其中一个或两个核苷酸对位于肽或多肽编码顺序的翻译终止信号与功能性多肽编码顺序的起始信号之间。
9、如权利要求1-7中的任意一个方法，至少有一个核苷酸三联体位于肽或多肽编码顺序的翻译终止信号与功能性多肽编码顺序的起始信号之间。
10、如权利要求1-9中的任意一个方法，其中的为肽或多肽编码的核苷酸顺序包含一个功能性翻译的活化顺序。
11、如权利要求1-10中的任意一个方法，其中的重组DNA表达载体包括一个通过转录产生含有功能性多肽和非融合附加肽或多肽密码子的可翻译的多顺反子mRNA的核苷酸顺序。
12、如权利要求1-11中的任意一个方法，其中的功能性多肽和非融合附加肽或多肽的密码子不在同一译读码中。
13、如权利要求1-12中的任意一个方法，其中的功能性多肽编码顺序是为下述物质编码的顺序：牛生长激素、人生长激素、人的前生长激素、猪生长激素、哺乳动物生长激素、鸟生长激素、人胰岛素A链、人胰岛素B链、人胰岛素原、人前胰岛素原、干扰素、尿激酶、人体组织的血纤维蛋白激活剂、生长激素释放因子或内白细胞素（int-erleukin Ⅱ）。
14、由权利要求1、2或3，去制备质粒PCZ114的方法，该质粒包括连接质粒PCZ101的～10.2仟碱基BamHI-XbaI片段，一个有下列核苷酸顺序的DNA联结子。
和质粒PCZ101的～0.6仟碱基BamHi-HgiAI片段。
15、由权利要求1、2或3去制备质粒PCZ101.1的方法，该质粒包括连接质粒PCZ101的～10.2仟碱基BamHI-XbaI片段，一个有下列核苷酸顺序的DNA联结子
16、由权利要求1、2或3去制备质粒PCZ1000的方法，该质粒包括连接质粒PCZ101的～10.2仟碱基BamHI-XbaI片段，一个有下列核苷酸顺序的DNA联结子
和质粒PCZ101的～0.6仟碱基BamHi-HgiAI片段。
17、由权利要求1、2或3去制备质粒PCZ1000.1的方法，该质粒包括连接质粒PCZ101的～10.2仟碱基BamHI-XbaI片段、一个有下列核苷酸顺序的DNA联结子
和质粒PCZ101的～0.6仟碱基BamHi-HgiAI片段。
18、由权利要求1、2或3去制备质粒PCz1060的方法，该质粒包括连接质粒PCZ101的～10.2仟碱基BamHI-XbaI片段、一个有下列核苷酸顺序的DNA联结子
和质粒PCZ101的～0.6仟碱基BamHI-HgiAI片段。
19、由权利要求1、2或3去制备质粒PCZ1120的方法，该质粒包括连接质粒PCZ101的～10.2仟碱基BamHI-XbaI片段、一个有下列核苷酸顺序的DNA联结子
和质粒PCZ101的～0.6仟碱基BamHI-HgiAI片段。
20、由权利要求1、2或3去制备质粒PCZ105.1的方法，该质粒包括连接质粒PNM608的EcoRI-ClaI水解液、质粒PCZ101的～10.2仟碱基BamHI-XbaI片段，一个有下列核苷酸顺序的DNA联结子
和质粒PCZ101的～0.6仟碱基BamHI-HgiAI片段。
21、由权利要求1、2或3去制备质粒PCZ105.2的方法，该质粒包括连接质粒PNM608的EcoRI-ClaI水解液、质粒PCZ101的～10.2仟碱基BamHI-XbaI片段、一个有下列核苷酸顺序的DNA联结子
和质粒PCZ101的～0.6仟碱基BamHI-HgiAI片段。
22、由权利要求1、2或3去制备质粒PCZ106.1的方法，该质粒包括连接质粒PNM608的EcoRI-ClaI水解液、质粒PCZ101的～102.2仟碱基BamHI-EcoRI片段，一个有下列核苷酸顺序的DNA联结子
和质粒PCZ101的～0.6仟碱基BamHI-HgiAI片段。
23、由权利要求1、2或3去制备质粒PCZ112.1的方法，该质粒包括连接质粒PNM608的ECO-RI-ClaI水解液、质粒PCZ101的～10.2仟碱基BamHI-EcoRI片段、一个有下列核苷酸顺序的DNA联结子
和质粒PCZ101的～0.6仟碱基BamHI-HgiAT片段。
24、由权利要求1、2或3去制备质粒PCZ112.2的方法，该质粒包括连接质粒PNM608的ECoRI-ClaI水解液，质粒PCZ101的～10.2仟碱基BamHI-EcoRI片段、一个有下列核苷酸顺序的DNA联结子
和质粒PCZ101的～0.6仟碱基EamHI-HgiAI片段。
25、由权利要求1、2或3去制备质粒PCZ1140的方法，该质粒包括连接质粒PCZ101的～10.2仟碱基BamHI-XbaI片段、一个有下列核苷酸顺序的DNA联结子
和质粒PNM的BamHI-FnuDII水解液。
26、一个制备质粒PCZ101的方法，其包括连接质粒PIM-I′-A3的XbaI-BamHI水解液和质粒PNM789B的XbaI-BamHI水解液。
27、一种用可选择和自主复制的重组DNA表达载体转化的宿主细胞，其包括：
a）一个在为肽或多肽编码的核苷酸顺序之译读码中的转录和翻译的活化顺序，上述的肽或多肽编码顺序包含一个与为上述的肽或多肽羧基末端编码的核苷酸三联体之下面位置直接相邻的翻译终止信号。
b）一个与上述的终止信号之下面位置直接相邻的翻译起始信号，它在为功能性多肽编码的核苷酸顺序的译读码中，上述的功能性多肽编码顺序包括一个与为上述的功能性多肽羧基末端编码的核苷酸三联体之下面位置直接相邻的翻译终止信号。
28、如权利要求27的细胞，其中的载体是质粒。
29、如权利要求27或28的细胞，其中载体的肽或多肽编码顺序为MET-PHE-PRO-LEU-GLU-ASP-ASP，MET-GLU-ASP-ASP-LYS，MET-ASP-ASP-LYS，MET-GLU-ASP-GLN或MET-ASP-GLN编码
其中：
AET 是 蛋氨酸
PHE 是 苯基丙氨酸
PRO 是 脯氨酸
LEU 是 亮氨酸
GLU 是 谷氨酸
ASP 是 天冬氨酸
GLN 是 谷氨酰胺
30、如权利要求27、28或29的细胞，其中载体的功能性多肽编码顺序为牛生长激素、人生长激素、人的前生长激素、猪生长激素、哺乳动物生长激素、鸟生长激素、人胰岛素A链、人胰岛素B链、人胰岛素原、人前胰岛素原、干扰素、尿激酶、人体组织的血纤维蛋白激活剂、生长激素释放因子或内白细胞素（interleukinⅡ）编码。
31、如权利要求27-30中的任意一个权利要求的细胞，其中载体的功能性多肽编码顺序为生物活性多肽编码。
32、如权利要求27-30中任一个权利要求的细胞，其中的载体是质粒PCZ114，PCZ101.1，PCZ1000，PCZ1000.1，PCZ1060，PCZ1120，PCZ105.1，PCZ105.2，PCZ106.1，PCZ112.1，PCZ112.2或PCZ1140
33、如权利要求27-30中任一个权利要求的细胞是原核生物细胞。
34、如权利要求33的细胞是大肠杆菌（E.Coli）、芽孢杆菌属（Bacillus）或链霉（菌）属（Streptomyces）。
35、如权利要求34的细胞是大肠杆菌K12RV308。
36、一个生产功能性多肽的方法，其包括：
（1）用权利要求1-25中任一权利要求的重组DNA表达载体转化细胞。
（2）在适合基因表达的条件下培养转化细胞。
37、如权利要求36的方法，其中转化的宿主细胞是原核生物细胞。
38、如权利要求37的方法，其中转化的原核生物细胞是大肠杆菌、芽孢杆菌属或链霉（菌）属。
39、如权利要求38的方法，其中转化的细胞是大肠杆菌。
40、如权利要求39的方法，其中转化的细胞是：
大肠杆菌 K12 RV308/PCZ114
大肠杆菌 K12 RV308/PCZ101.1
大肠杆菌 K12 RV208/PCZ1000
大肠杆菌 K12 RV308/PCZ1000.1
大肠杆菌 K12 RV308/PCZ1060
大肠杆菌 K12 RV308/PCZ1120
大肠杆菌 K12 RV308/PCZ105.1
大肠杆菌 K12 RV308/PCZ105.2
大肠杆菌 K12 RV308/PCZ106.1
大肠杆菌 K12 RV308/PCZ112.1
大肠杆菌 K12 RV308/PCZ112.2
大肠杆菌 K12 RV308/PCZ1140
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |