HU202587B

HU202587B - Process for producing recombinant dna expression vectors and for gene expression

Info

Publication number: HU202587B
Application number: HU85836A
Authority: HU
Inventors: Brigitte Elisabeth Schoner; Roland George Schoner
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1984-03-06
Filing date: 1985-03-05
Publication date: 1991-03-28
Also published as: AU589355B2; GR850571B; KR850006703A; EP0154539A3; DK99985A; ES540936A0; HUT40162A; JPS611387A; ES550012A0; SU1491346A3; PT80051B; PT80051A; DK99985D0; CN85101555A; EG17786A; NZ211313A; AU3950285A; ZA851626B; IL74507A0; DOP1985004337A

Description

A találmány új, szelektálható és autonóm replikálódó rekombináns dezoxi-ribonukleinsav kifejeződő vektorokra vonatkozik. A találmány szerinti vektorok tartalmaznak:

1. egy olyan transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciát, amely egy pepiidet vagy polipcptidet meghatározó nukleotid-szekvenciával leolvasási fázisban van;

2. egy transzlációs stop jelet;

3. egy funkcionális polipeptidet meghatározó nukleotid-szekvenciával leolvasási fázisban levő transzlációs start jelet; továbbá

4. egy további transzlációs stop jelet

A fenti nukleotid-szekvenciát transzkripció után transzlatálható policisztronos mRNS generálására készítettük. A találmány tárgya továbbá a fentiek felhasználása.

A rekombináns dezoxi-ribonukleinsav technológia fejlődését és kiterjedését nagymértékben limitálja erős génkifejeződést biztosító vektorok hiánya. Bár az alábbi promoter rendszereket már beépítették rekombináns dezoxi-ribonukleinsav vektorokba, ezeken kívül más kifejeződő rendszer lényegében nem áll rendelkezésünkre: lac [Roberts és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 76,5596 (1979); és Guarante cs munkatársai, Cell., 20, 543 (1980)], trp [Hallewell és Emtage, Gene, 9, 27 (1980)], a lambda bakteriofág P_L [Remaut és munkatársai, Gene, 75,81 (1981); Bemard és munkatársai, Gene,

5. 59 (1979) és Derom és munkatársai, 17, Gene, 45 (1982)] és Ipp [Ziebel és munkatársai, J. Bacteriol., 745, 654 (1981); Lee és munkatársai, J. Bacteriol., 746, 861 (1981) és Nakamura és Inouye, Cell, 75, 1109 (1979)].

Tény, hogy sok heterológ (idegen) gén nem fejeződik ki, vagy legjobb esetben a fenti ismert kifejeződő vektorokat használva a kifejeződés mértéke gyenge. A kifejeződés hiánya gyakran összefügg a mRNS transzkripciójával, mivel ez szuboptimális vagy nem képes kötődni a riboszómákhoz. Ennek oka lehet a nem megfelelő hurokszerkezet kialakulása, amely létrehozza a riboszóma kötőhelyet, oka lehet a mRNS általános instabilitása vagy olyan szekvenciák jelenléte, amelyek gátolják a riboszómához való kötődést vagy a transzlációs elindulást Egyik esetben sem mutatható ki a transzláció, és ennek következtében a szükséges polipcptid nem fejeződik ki vagy nem termelődik.

A találmány szerinti eljárással ezeket a nehézségeket megoldjuk anélkül, hogy egy gént szintetikusan kelljen módosítanunk. A gén szintetikus módosítása nemcsak időigényes munka és drága, de jelentősen növeli annak a veszélyét, hogy hibák kerülnek a dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciába. A találmány szerinti eljárással ezt a problémát megoldjuk úgy, hogy az mRNS transzkriptum 5’-végét megváltoztatjuk anélkül, hogy módosulna vagy megváltozna a számunkra érdekes gén szekvenciája.

A leírásban bizonyos kifejezéseket használunk, amelyek magyarázatát az alábbiakban adjuk meg: Rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektor:

olyan autonóm replikálódó molekula, például - de nem limitálóan - plazmid, amely dezoxi-ribonukleinsav molekulához egy vagy több további dezoxi-ribonukleinsav szegmens kapcsolható, vagy amelyhez ilyen szegmenst kapcsoltunk.

Rekombináns dezoxi-ribonukleinsav kifejeződő (expressziós) vektor:

olyan rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektor, amelybe egy vagy több transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciát építettünk be.

Transzkripciós aktivációs szekvencia:

olyan dezoxi-ribonukleinsav-szckvencia, amely szabályozza vagy lehetővé teszi a dezoxi-ribonukleinsav átírását hírvivő ribonukleinsav (mRNS) transzkriptummá.

Transzlációs aktivációs szekvencia:

olyan dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia, amely szabályozza vagy lehetővé teszi a hírvivő ribonukleinsav transzkriptum átírását egy peptiddé vagy polipcptiddé.

Transzlációs start jel:

olyan dezoxi-ribonukleinsav triplet, amely a transzlációs start kodont határozza meg.

Transzlációs stop jel:

olyan dezoxi-ribonukleinsav triplet, amely egy transzlációs stop kodont ír le.

Transzformáció:

dezoxi-ribonukleinsav bejuttatása rccipiens gazdasejtbe, amely ezáltal új genotípust képvisel.

Transzformáns:

transzformált recipiens gazdasejt.

Restrikciós fragmens:

egy vagy több restrikciós enzim hatása révén generált lineáris dczoxi-ribonuklcinsav-szekvencia.

Funkcionális polipeptid:

kinyerhető, biológiailag aktív heterológ (idegen) polipeptid vagy prekurzor, egy kinyerhető, bioaktív, heterológ polipeptidből és homológ polipeptid egy részéből vagy teljes egészéből álló polipcptid, vagy olyan kinyerhető, biológiailag inaktív fúziós polipeptid termék, amely egy heterológ polipeptidből és egy biológiai aktivitást megszüntető polipeptid részből áll, ez utóbbi specifikusan hasítható.

Fuzionált géntermék:

olyan kinyerhető, heterológ polipeptid, amely egy homológ polipeptid egy részét vagy teljes egészét tartalmazza.

Az alábbiakban megadjuk a találmányhoz mellékelt ábrák leírását:

1M. ábra: a pNM575 plazmid előállításának sematikus ábrázolása.

5-8. ábra: a pNM789B plazmid előállításának sematikus ábrázolása.

9. ábra: a pCZ114 és pCZ105.1 plazmidok restrikciós térképe.

10. ábra: a pCZ1140 plazmid restrikciós térképe.

11. ábra: a szintetikus timozin alfa 1 gén.

12. ábra: a TI5 nukleotid-fragmens szintézisének protokollja.

13. ábra: a pTHal plazmid előállítása.

14. ábra: a szintetikus proinzulin gén.

15. ábra: a pHI7 Δ4Δ1 plazmid előállítása.

16. ábra: a pHI104 plazmid előállítása.

A találmány tárgya eljárás rekombináns dezoxi-ribonukleinsav kifejeződő vektor előállítására. Úgy járunk el, hogy összekapcsolunk

a) egy transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciát,

b) egy riboszóma kötőhelyet és egy peptidet vagy polipeptidet kódoló nukleoüd-szekvenciát tartalmazó dezoxi-ribonukleinsav linkért, amely peptidet vagy polipcptidet kódoló szekvencia tartalmaz egy

HU 202 587 Β transzlációs stop jelet a peptid vagy polipeptid karboxil-terminális részét leíró nukleotid triplet szomszédságában és attól 3’-irányban, tartalmaz továbbá egy, a fenti stop jeltől 3’-irányban és közvetlenül szomszédosán egy transzlációs start szignált, továbbá

c) egy funkcionális polipeptidet meghatározó nukleotid-szekvenciát, amely funkcionális polipeptidet leíró szekvencia tartalmaz a funkcionális polipeptid karboxil-terminális nukleotid tripletjének szomszédságában és attól 3’-irányban egy transzlációs stop szignált, azzal a feltétellel, hogy a vektor szelektálható és autonóm replikálódik.

A találmány szerinti vektorok előállítására az alábbi

Xbal-HgiAI dezoxi-ribonukleinsav linker-szekvenciát beépítjük a pCZIOl plazmid 10,2 kb nagyságú BamHI-Xbal és 0,6 kb nagyságú BamHI-HGiAI fragmenseibe: 5’-CTAGAGGGTATTAATA ATG TTC CCA TTG

GAG GAT GAT TAA ATG TCCCATAATTAT TAC AAG GGT AAC CTC CTA CTA ATT TAC

TTC CCA GCC ATG TCC TTG TCC GGC CTG TTT GCC AAC GCT

AAG GGT CGG TAC AGG AAC AGG CCG

GAC AAA CGG TTG CGA

GTGCT-3’

C---5’, ahol

A dezoxi-adenil-csoport,

G dezoxi-guanil-csoport,

C dezoxi-citozil-csoport és

T timidilcsoport.

A kapott plazmidot pCZ114 jellel jelöljük, és tartalmaz

1. az E. coli lipoprotein génjének transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciáját [Nakamura és Inouye, 1979, lásd előbb] leolvasási fázisban egy olyan nukleotid-szekvenciával, amely leír mind egy riboszóma kötőhelyet, mind pedig egy alábbi aminosav sorrendű peptidet:

MET-PHE-PRO-LEU-GLU-ASP-ASP,

ahol
MET	metionin.
PHE	fenil-alanin,
PRO	prolin,
LEU	leucin,
GLU	glutaminsav és
ASP	aszparaginsav;

2. tartalmaz továbbá a fenti peptidet meghatározó szekvenciához képest megfelelően elhelyezett és leolvasási fázisban levő transzlációs stop jelet;

3. a fenti stop szignál szomszédságában fekvő 3’irányban egy transzlációs start jelet, és amely leolvasási fázisban helyezkedik el a metionil borjú növekedési hormont (met-bGH) leíró nukleotidszekvenciával; továbbá

4. a met-bGH-t kódoló szekvenciával leolvasási fázisban levő és megfelelően elhelyezett transzlációs stop jelet.

A kiindulási pCZIOl plazmid 10,8 kb nagyságú, előállítására a pNM789B plazmid 0,6 kb nagyságú Xbal-BamHI fragmensét ligáljuk a hasonló restrikciós végekkel rendelkező pIM-I’-A3 plazmiddal. Az utóbbi plazmid tartalmazza az E. coli lipoprotein gén transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciáját, tartalmaz egy termoindukálható úgynevezett runaway (elveszthető) replikonL A plazmid az E. coli K12 RV308/pIM-I’-A3 törzsből állítható elő. A törzset letétbe helyeztük a Northern Régiónál Research Laboratory, Peoria, Illinois, állandó törzsgyűjteményében, ahol az az NRRL B-15733 sorszámot kapta.

A pNM789B kiindulási plazmid a pKENI 11 plazmidból származik, ahogy az az 1-8. ábrákból és az alábbi 1. példából kiderül. A pKENI 11 dezoxi-ribonukleinsavat az E. coli K12 CC6720/pKENlll törzsből állítjuk elő, a törzset NRRL B-15011 sorszámon helyeztük letétbe a Northern Régiónál Research Laboratory, Peoria, Illinois állandó törzsgyűjteményében. A pNM789B dezoxi-ribonukleinsav szintén tartalmazza az E. coli lipoprotein gén transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciáját, és ezen kívül tartalmazza a megfelelően elhelyezett transzlációs stop jellel együtt azt a kódoló szekvenciát, amely leír egy fúziós proteint. Ez utóbbi fúziós protein a szarvasmarha növekedési hormon fehérjéből és ennek amino-terminális végén elhelyezkedő kilenc aminosavból álló polipeptidből áll. A fenti, az Xbal-BamHI fragmensen elhelyezkedő transzkripciós aktivációs és fúziós proteint leíró szekvencia Ugatásakor a megfelelően hasított ρΙΜ-Γ-Α3 dezoxi-ribonukleinsavhoz eredményezi a pCZIOl kiindulási plazmidot

A témában jártas szakember felismeri, hogy a fent leírt Xbal-HgiAI dezoxi-ribonukleinsav linker molekula fontos része a pCZl 14 szemléltető jelleggel bemutatott plazmidnak. A linker szekvencia kódolja

1. azt a transzlációs aktivációs szekvenciát amely egy peptidet és egy riboszóma kötőhelyet leíró nukleotid-szekvenciával leolvasási fázisban van,

2. megfelelően elhelyezett és az előző peptidet kódoló szekvenciával leolvasási fázisban levő transzlációs stop szignált és

3. egy olyan transzlációs start jelet amely a fentiekben ismertetett stop jel közvetlen közelében helyezkedik el 3’-irányban, és amely leolvasási fázisban van a met-bGH-t kódoló szekvencia egy részével.

A met-bGH-t kódoló szekvencia további része (ideértve a megfelelően elhelyezett transzlációs stop jelet) és egy transzkripciós aktivációs szekvencia könnyen kialakítható a pCZIOl plazmid megfelelő fragmensén ligálással. Ligálás után például a 10,8 kb nagyságú, szemléltető jelleggel bemutatott metionil-szarvasmarha növekedési hormont (met-bGH) kifejező pCZ114 plazmidhoz jutunk. A témában jártas szakember feUsmeri, hogy az első peptid és a met-bGH funkcionális polipeptid nem fuzionált géntermék, hanem inkább egyetlen policisztronos mRNS transzkriptumból leíiódó transzlatált és szeparált protein. A pCZl 14 dezoxi-ribonukleinsav restrikciós térképét a mellékelt 9. ábrán mutatjuk be.

A találmány szerinti eljárást bemutató több rokon bGH-t kifejező plazmidot állíthatunk elő. Bár egy adott dezoxi-ribonukleinsav linker-szekvencia meg kell hogy maradjon, legalább két szeparált polipeptid kifejezésére egyetlen mRNS molekuláról, a felhasználható linker dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciák száma gyakorlatilag végtelen. Ezeketa szekvenciákat ismert módon szintetizálhatjuk a módosított foszfo-triészter módszerrel, teljesen védett didezoxi-ribonukleotid építőköveket használva. A szintetikus módszerek jól ismertek az iro3

HU 202 587 Β dalomból, és például az alábbi közleményekben megadottak szerint vitelezhetők ki: Itakura és munkatársai, Science, 198,1056 (1977) és Crea és munkatársai, Proc.

Nat. Acad. Sci„ 75,5765 (1978), USA. Ilyen szekvencia például az alábbi, szemléltető és nem limitáló jelleggel bemutatott dezoxi-ribonukleotidok:

	1.	5’-CTAGAGGGTA TTAATA 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1	ATG 1 1 1 TAC	TTC 1 1 1 AAG	CCA 1 1 1 GGT	TTG 1 1 1 AAC	GAT 1 1 1 CTA	GAT 1 1 1 CTA	GAT 1 1 1 CTA	TAA 1 1 1 ATT
3’	1 1 i 1 1 1 1 1 1 1 1 1 TCCCA TAA ITAT
c	ATG 1 1 1	TTC 1 1 1	CCA GCC ATG TCC III III III III	TTG 1 1 1	TCC 1 1 1	GGC 1 1 1	CTG 1 1 1	TTT 1 1 1	GCC 1 1 1	AAC > 1 1	GCT 1 1 1
□	1 1 1 TAC	AAG GGT CGG TAC AGG	1 1 1 AAC	1 1 1 AGG	1 1 1 CCG	1 1 1 GAC	1 1 1 AAA	1 1 1 CGG	1 1 1 TTG	1 1 1 CGA
	GTGCT 1	3’
	1 c		5’
10
	2.	5’-CTAGAGGGTA T TAATA 1 1 I I 1 1 1 1 1 1 1 1	ATG 1 1 1	GAT 1 1 1	CAG i 1 1	GAG 1 1 1	GAT 1 1 1	TAA 1 1 1	ATG 1 1 1	TTT 1 1 1
		3’	1 i I 1 1 1 1 1 1 1 1 1 TCCCA TAA TTAT	1 1 1 TAC	1 1 1 CTA	1 1 1 GTC	1 1 1 CTC	l 1 1 CTA	1 1 1 ATT	1 1 1 TAC	1 1 1 AAA
15	CCT 1 1 1	GCT 1 1 1	ATG TCC TTG TCC III III III III	GGC 1 1 1	CTG 1 1 1	TTT 1 1 1	GCC 1 1 1	AAC 1 1 1	GCT 1 1 1	GTGCT 1
	1 1 1 GGA	1 1 1 CGA	III III III III TAC AGG AAC AGG	1 1 1 CCG	1 1 1 GAC	1 1 1 AAA	1 l 1 CGG	1 1 1 TTG	1 1 1 CGA	1 c
20	3.	5’ CTAGAGGGTA TTAA TA 1 t 1 1 1 1 1 1 1 1 1 <	ATG 1 i 1	GAT 1 1 1	CAG 1 1 1	TAA 1 1 1	ATG 1 1 1	TTT t 1 1	CCG 1 1 1	GCT 1 1 1
		3’	1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 I TCCCA TAA TTAT	1 I 1 TAC	1 1 1 CTA	1 I 1 GTC	1 1 1 ATT	1 1 1 TAC	I 1 1 AAA	1 1 I GGC	1 1 i CGA
	ATG 1 1 1	TCC 1 1 1	TTG TCC GGC CTG III Ili III III	TTT 1 1 1	GCC 1 1 1	AAC 1 1 1	GCT 1 1 1	GTGCT 1	3’
25	1 1 1 TAC	AGG AAC AGG CCG GAC	1 1 1 AAA	1 1 1 CGG	1 1 1 TTG	1 1 1 CGA	C		5’
	4.	5 ’ CTAG AGGG TAT TAA TA 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1	ATG 1 1 1	GAT 1 1 1	GAT 1 1 t	AAG 1 1 1	TAA 1 1 1	ATG 1 1 1	TTC 1 1 1	CCA 1 1 i
30		3’	1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 TCCCA TAA ITAT	1 1 f TAC	1 1 1 CTA	1 I 1 CTA	1 1 1 TTC	1 1 1 ATT	1 1 I TAC	1 i 1 AAG	1 1 I GGT
	GCC i ( 1	ATG 1 1 1	TCC TTG TCC GGC Ml Ml Ml III	CTG 1 1 l	TTT 1 I 1	GCC 1 1 1	AAC 1 1 1	GCT 1 1 1	GTGCT l	3’
	1 1 1 CGG	1 1 i TAC	Ml Ml Ml Μ 1 AGG AAC AGG CCG	1 1 1 GAC	1 1 1 AAA	I 1 1 CGG	1 1 1 TTG	l 1 1 CGA	1 C		5’
35	5.	5’ CTAGAGGGTAAA TTCT 1 1 1 1 I I 1 I 1 1 1 1	ATG 1 1 1	GAT 1 1 1	GAT 1 1 1	AAG 1 1 1	TAA 1 1 1	ATG 1 1 1	TTT 1 1 1	CCG 1 1 1
		3’	1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 TCCCA TTTAAGA	1 1 1 TAC	1 1 1 CTA	i 1 1 CTA	1 1 1 TTC	1 1 1 ATT	1 1 1 TAC	1 1 1 AAA	1 1 1 GGC
	GCT	ATG	TCC TTG TCC GGC	CTG	TTT	GCC	AAC	GCT	GTGCT	3’
40	1 1 1	1 1 1	III III III III	1 1 1	1 1 1	1 1 1	1 1 1	1 1 1	1
	CGA	TAC	AGG AAC AGG CCG	GAC	AAA	CGG	TTG	CGA	c		5’

A fenti nukleotid-szekvenciákat egymástól függetlenül hozzákapcsolhatjuk a pCZIOl plazmid dezoxi-ribonukleinsav 10,2 kb nagyságú BamHI-Xbal és a 0,6 kb nagyságú BamHI-HgiAI fr^gmenseihez, amikor sorrendben megkapjuk az alábbi jelű plazmidokat: pCZIOl.1, pCZIOOO, pCZIOOO.l, pCZ1060 és 55 pCZ1120. Ezek a plazmidok transzkripciót követően egyetlen policisztronos mRNS molekulát szinteüzálnak, ez leírja mind az előpeptidet, mind pedig a met-bGH-t.

A találmányt nem limitáljuk egy adott transzkripciós 60 aktivációs szekvencia használatára, mivel egy specifikus szekvencia kiválasztása nem kritikus a találmány szerinti eljárás felhasználhatósága szempontjából.

Az előzőekben példaként említett Iipoprotein aktivációs szekvencia helyett használhatunk például, nem limitáló 65 jelleggel, más, az alábbiakban felsorolt transzkripciós aktivációs szekvenciákat is: E. coli triptofán (trp), E. coli laktóz (lac), lambda bakteriofág P_lOl, lambda bakteriofág PrO_r, Bacillus subtilis vegetatív (vég) vagy Streptomyces azureus tiosztrepton rezisztencia (tsr) gén transzkripciós aktivációs szekvenciát Ezen kívül kettesével is felhasználhatunk egy vagy több transzkripciós aktivációs szekvenciát, például a trp és a lac transzkripciós aktivációs szekvenciákat A fenti szekvenciákat korábban jellemezték; szintetikusan előállíthatók vagy ismert plazmidokból izolálhatok.

Részletesebben szólva, a triptofán (trp) transzkripciós aktivációs szekvenciát megkapjuk, ha a ρΗΙ7Δ4Δ1 plazmidot EcoRI-Clal emésztésnek vetjük alá. A ρΗΙ7Δ4Δ1 plazmid az 5. példában megadottak szerint állítható elő. Mivel a ρΗΙ7Δ4Δ1 plazmidban több Taql

HU 202 587 Β restrikciós hely van, a kívánt EcoRI-Taql fragmenst legjobban úgy állíthatjuk elő és sokszorosíthatjuk, ha az előzőleg ligáit ρΗΙ7Δ4Δ1 EcoRI-Hpal és Hpaí-Taql fragmenseket a pBR322 plazmid EcoRI-Clal restrikciós helyébe klónozzuk. Az így kapott 4,6 kb nagyságú plaz- 5 midot pNM608 jellel jelöljük, ez tartalmazza a Irp transzkripciós aktivációs szekvenciát, és így felhasználható a találmány szerinti eljárás további kiviteli példáiban.

tartalmazó, szemléltető jelleggel megadott plazmidok előállítására például ligáljuk:

1) a 0,29 kb nagyságú EcoRI-Taql, a pNM608 plazmidból származó fragmenst;

2) a pCZIOl plazmid 10 kb nagyságú EcoRI-BamHI fragmensét;

3) a pCZIOl 0,6 kb nagyságú BamHI-HgiAI fragmensét, és

4) az alábbiakban megadott bármelyik dezoxi-ribo-

A fentiekben ismertetett trp aktivációs szekvenciát	10	nukleotid-szekvenciát:
	1.	5’ CGACA 1 1 1	ATG TTC CCA III III III	TTG 1 1 1	GAG 1 1 1	GAT 1 t 1	GAT 1 1 1	TAA 1 1 1	ATG t 1 1	TTC t 1 1	CCA 1 1 1
		1 1 1 3’ TGT	III III III TAC AAG GGT	I 1 1 AAC	i 1 1 CTC	1 1 1 CTA	1 1 1 CTA	1 1 1 ATT	1 1 1 TAC	1 i 1 AAG	1 1 1 GGT
	GCC	ATG TCC	TTG TCC GGC	CTC	TTT	GCC	AAC	GCT	GTGCT	3’
5	1 1 1	III III	III III III	1 1 1	1 1 1	1 1 1	1 1 1	1 1 1	1
	CGG	TAC AGG	AAC AGG CCG	GAG	AAA	CGG	TTG	CGA	c		5’
	2.	5’ CGACA	ATG TTC CCA	TTG	GAT	GAT	GAT	TTA	ATG	TTC	CCA
10		1 1 1	III III III	1 1 1	1 1 1	1 1 1	1 1 1	1 1 1	1 1 1	1 1 1	1 1 1
		3’ TGT	TAC AAG GGT	AAC	CTA	CTA	CTA	ATT	TAC	AAG	GGT
	GCC 1 1 1	ATG TTC III III	TTG TCC GGC Itt III III	CTC 1 1 1	TTT 1 1 t	GCC 1 1 1	AAC t 1 1	GCT	GTGCT 1	3’
	1 1 1 CGG	III III TAC AGG	III III III AAC AGG CCG	1 1 1 GAG	1 1 1 AAA	1 1 1 CGG	1 1 1 TTG	1 i 1 CGA	c		5’
15
	3.	5’ CGACC	ATG GAT CAG	GAG	TAA	ATG	TTC	CCG	GCT	ATG	TCC
		1 1 1	III III III	1 1 1	1 1 1	1 1 1	1 1 1	1 1 1	1 1 1	1 1 1	1 1 1
		3’ TGG	TAC CTA GTC	CTC	ATT	TAC	AAG	GGC	CGA	TAC	AGG
20	TTG	TCC GGC	CTC TTT GCC	AAC	GCT	GTGCT	3’
	1 1 1	III III	III III III	1 1 1	1 1 1	1
	AAC	AGG CCG GAG AAA CGG	TTG	CGA	c		5’
25	4.	5’ CGACC 1 1 1	ATG GAT GAT III III III	AAG 1 1 1	TAA 1 1 1	ATG 1 1 1	TTT 1 1 1	CCG 1 1 1	GCT 1 1 1	ATG 1 1 1	TCC 1 i 1
		1 1 1 3’ TGG	III III III TAC CTA CTA	1 1 1 TTC	1 1 1 ATT	1 1 t TAC	1 1 1 AAA	i 1 1 GGC	I 1 1 CGA	1 1 1 TAC	1 1 1 AGG
	TTG 1 1 1	TCC GGC III III	CTC TTT GCC III III III	AAC 1 1 1	GCT f 1 1	GTGCT 1	3’
	1 1 1 AAC	AGG CCG GAG AAA CGG	1 1 1 TTG	1 1 1 CGA	c		5’
30	•
	5.	5’ CGACC	ATG GAT GAT	AAG	GAG	TAA	ATG	TTT	CCG	GCT	ATC
		1 1 1	III III III	1 1 1	1 1 1	1 1 1	1 1 1	1 1 1	1 1 1	1 1 1	1 1 1
		3’ TGG	TAC CTA CTA	TTC	CTC	ATT	TAC	AAA	GGC	CGA	TAC
35	TCC	TTG TCC GGC CTC TTT	GCC	AAC	GCT	GTGCT	3’
	1 1 1	III III	III III III	1 1 1	1 1 1	1 1 1	1
	AGG	AAC AGG CCG GAG AAA	CGG	TTG	CGA	c		5’
40

A fentiek szerint végzett ligációk után sonendben az alábbi, 10,8 kb nagyságú plazmidokat kapjuk meg: pCZ105.1, pCZ105.2, pCZ106.1, pCZll2.1 és pCZ112.2. Ezek a plazmidok transzkripciót követően olyan egyszerű policisztronos hírvivő ribonukleinsavat határoznak meg, amelyek kódolják az előpeptidet és a metionin-szarvasmarha növekedési hormont, így tovább szemléltetik a találmány szerinti eljárást. A szemléltető jelleggel bemutatott pCZ105.1 plazmid restrikciós térképét a mellékelt 9. ábrán adjuk meg.

A találmány szerinti eljárás igen rugalmas, azaz gya55 korlatilag bármely funkcionális polipeptidet meghatározó nukleotid-szekvenciát behelyettesíthetünk a fentiekben példaként megadott metionin-szarvasmarha növekedési hormont kódoló szekvenciával. Uyen kódoló szekvenciák például - nem limitálóan - a humán növe60 kedési hormont, a humán pre-növekedési hormont, a sertés növekedési hormont, emlős növekedési hormont, madár növekedési hormont, növekedési hormont felszabadító faktort, humán inzulin A láncot, humán inzulin B láncot, humán proinzulint, humán pre-proinzulint, hu65 mán és nem-humán interferont, urokinázt, szöveti plaz5

HU 202 587 Β minogén aktivátort, interleukin Π-t, továbbá bármely polipeptid hormont, bármely polipeptid enzimet és bármely kutatási vagy gyakorlati értékű, biológiailag aktív polipeptidet meghatározó szekvenciát.

Részletesebben szólva, a humán növekedési hormont kifejező, szemléltető jelleggel ismertetett vektor előállítására a pCZIOl plazmid 10,2 kb nagyságú BamHI-Xbal fragmensét és a pNM575 jelű plazmid dezoxi-ribonukleinsav 0,5 kb nagyságú BamHI-FnuDII fragmensét ligáljuk az alábbi linker szekvenciához:

5’-CTAG AGGGTATTAATA ATG TTC CCA TTG GAG GAT GAT TAA ATG

3’-------TCCCATAATTAT TAC AAG GGT

AAC CTC CTA CT A ATT TAC

TTC CCA ACC ATT CCC TTA TCC AGG CTT

TTT GAC AAC GCT ATG

AAG GGT TGG TAA GGG AAT AGG TCC

GAA AAA CTG TTG CGA TAC

CTC CG-3’

GAG GC-5’, ahol

A dezoxi-adenil-csoport,

G dezoxi-guanil-csoport,

C dezoxi-citozil-csoport és

T timidilcsoport.

A kapott, pCZl 140 jelű plazmid szekvenciálisán tartalmazza az

1. E. coli lipoprotcin gén transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciáját, leolvasási fázisban egy olyan nukleotid-szekvenciával, amely leírja mind a riboszóma kötőhelyet, mind pedig az alábbi szekvenciájú proteint:

MET PHE PRO LEU GLU ASP ASP,

ahol
MET	metionin,
PHE	fenil-alanin,
PRO	prolin,
LEU	leucin,
GLU	glutaminsav és
ASP	aszparaginsav;

2. megfelelően elhelyezett és a fenti peptidet meghatározó szekvenciával leolvasási fázisban levő transzlációs stop jelet;

3. a fenti stop szignállal közvetlenül szomszédos és 3’-irányba eső transzlációs start jelet, amely leolvasási fázisban van a metionil-humán növekedési hormont leíró nukleotid szekvenciával; és

4. megfelelően elhelyezett és a metionil-humán növekedési hormont leíró szekvenciával leolvasási fázisban levő transzlációs stop jelet.

A fentiekben leírt linker-szckvenciát ismert módon szintetizáljuk, az előzőekben megadott irodalmi hivatkozások szerint [Itakura és munkatársai (1977); Crea és munkatársai (1978)].

A pNM575 kiindulási plazmidot az 1-4. ábrán és az

1. példában megadottak szerint állítjuk elő. A pCZl 140 szemléltető jelleggel bemutatott plazmid restrikciós térképét a mellékelt 10. ábrán adjuk meg.

A leírásban specifikus kiviteli változatként ismertetjük azt a plazmidot, amelynek replikációját egy hőindukálható, elveszthető (runaway) replikon határozza meg, ezt az 1 557 774 számú brit szabadalmi leírásban és az alábbi közleményből ismerhetjük meg: Uhlin cs munkatársai, Gene, 6, 91 (1979). 30 °C hőmérséklet alatt, elsősorban 25 ’C-on a replikon viszonylag alacsony példányszámot, sejtenként 10-15 példányt határoz meg. Ha a hőmérsékletet 37 ’C-ra növeljük, a példányszámot szabályozó rendszer elveszik, és a replikont tartalmazó plazmid dezoxi-ribonukleinsav száma sejtenként eléri az 1000-2000 darabot. Egy adott elveszthető replikont tartalmaz a leírásban ismertetett plM-I’-A3 dezoxi-ribonukleinsav.

Érthetően, a találmány nem limitálható egy adott elveszthető replikonra vagy példányszám mutánsra. Más, indukálható elveszthető replikonokat vagy magas példányszámot biztosító replikonokat kaphatunk megfelelő szelekcióval vagy állíthatunk elő az alábbi közleményben megadott módon: Nemzetközi W082/02901 számú szabadalmi leírás és Bittner és Vapnek, Gene, 75, 319 (1981). Használhatunk ezen kívül nem elveszthető replikonokat, mindaddig, míg ezek funkcionálnak E. coli, Bacillus, Streptomyces vagy más, megfelelő mikroorganizmus sejtben. Replikonkcnt például - nem limitáló jelleggel - használhatunk például bármely, alábbiakban felsorolt replikont: pMBl, ColEl, NR1, RK2, RK6, pSCIOl, RP1, RP4, F és másokat, közöttük olyan bakteriofágokat, amelyek E. coli sejtekben replikálódnak. Használhatunk pEL7, pEL103, SCP2, SCP2’ plazmidokból származó replikonokat, használhatunk Streptomyccs sejtekben rcplikálódó bakteriofágokat és pC194, pBSl, pE194, pUBllO, pT127 és más hasonló, köztük Bacillus sejtekben rcplikálódó bakteriofágokat is. A témában jártas szakember felismeri, hogy ezek és más elveszthető replikonok használhatók a találmány szerinti eljárásban felhasznált expressziós vektorok konstruálására.

A találmány szerinti dezoxi-ribonukleinsav szekvenciák és plazmidok számtalan más módosítása és variációja előállítható. így például a genetikai kód degeneráltsága miatt bármely aminosavat meghatározó nukleotid helyettesíthető, de helyettesíthető például a TAG vagy TGA transzlációs stop jel a TAA »»» » J ? » J »

ATC ACT ATT transzlációs stop jellel. Ezenkívül a transzkripciós aktivációs szekvencia és a második transzlációs start kodon között a vektorban több nukleotid változtatható, mindaddig módosíthatunk, míg megfelelő transzlációs szignálok (riboszóma kötőhely és első transzlációs start jel) és stop szignálok maradnak jelen. További változtatások lehetségesek, például:

1. az első transzlációs stop jel leolvasási fázisának áthelyezését a második transzlációs start jelhez képest úgy, hogy egy vagy több nuklcotidot építünk be;

2. egy vagy több nukleotid triplctet helyezünk be úgy, hogy a leolvasási fázis megmarad az első transzlációs stop szignál és a második transzlációs start szignál között;

3. az első cisztron (a transzkripciós aktivációs szekvenciát is magába foglaló szakasz és az első transzlációs stop jel közötti régió) hosszát változtatjuk úgy, hogy nukleotid triplcteket helyezünk be az első transzlációs start- és stop szignálok közé. Bár a cisztron hossza nem kritikus, előnyös az, amely 220 aminosavat kódol.

Az első cisztront leíró nukleotid triplcteket megválaszthatjuk ismert elképzelések és megalapozott vélemények alapján [Zukcr és Sticglcr, Nucleic Acids Resc-611

HU 202 587 Β arch, 9,133 (1981)], annak érdekében, hogy elkerüljük komplementer bázisok keletkezését a hírvivő ribonukleinsavban. Az ilyen komplementer bárzisok között létrejövő hidrogénhíd-kötések miatt hurok konfigurációk jönnek létre, és az átfedések csökkentik a transzláció hatékonyságát Az első cisztront létrehozó nukleotid tripletek előnyösen létrehozzák a transzkripció során a riboszóma kötőhelyet, mégpedig megfelelően elhelyezve az 5’-vég felé a második transzlációs start kodonhoz képest. Ezt elérhetjük úgy, hogy olyan nukleotid tripleteket választunk ki, amelyek legalább két kodont reprezentálnak, amelyek nemcsak aminosavakat határoznak meg, hanem együtt létrehozzák a kívánt riboszóma kötőhelyet is.

A témában jártas szakember érti, hogy a fentiekben ismertetett összes módosítás és variáció könnyen szintetizálható az előzőekben megadott szintetikus módszereket használva. így a találmány szerinti eljárás nemcsak a példaként említett dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciákra és plazmidokra vonatkozik. A találmány tárgya továbbá új eljárás funkcionális polipeptidek előállítására.

A találmány értelmében úgy járunk el, hogy

1. egy kompetens sejtet szelektálható és autonóm replikálódó olyan rekombináns dezoxi-ribonukleinsav kifejeződő vektorral transzformálunk, amely áll:

a) egy pepiidet vagy polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciával leolvasási fázisban levő transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciából, ahol a pepiidet vagy polipeptidet kódoló szekvencia a pepiid vagy polipeptid karboxil-terminális végét leíró nukleotid triplet közvetlen szomszédságában és attól a 3’-vég felé egy transzlációs stop jelet tartalmaz,

b) a fenti stop szignál közvetlen szomszédságában és attól 3’-irányban elhelyezkedő transzlációs start jelből, amely a funkcionális polipeptidet leíró nukleotid-szekvenciával leolvasási fázisban van, és amely funkcionális polipeptidet meghatározó szekvencia egy transzlációs stop jelet tartalmaz a funkcionális polipeptid karboxil-terminális végét meghatározó nukleotid triplet közvetlen szomszédságában és attól 3’-irányban, és

2. a transzformált sejtet a gén kifejeződésére alkalmas körülmények között tenyésztjük.

* A fenti módszer megoldja azt a problémát, amikor gyenge vagy egyáltalán nem következik be a génkifejeződés, olyan esetekben, amikor a hírvivő ribonukleinsav instabil, nem megfelelő konfigurációjú, vagy nem rendelkezik a riboszómákhoz való hatékony kötődéshez szükséges megfelelő szekvenciával. A találmány szerinti eljárással megoldódik ez a probléma oly módon, hogy két cisztronból álló egyetlen hírvivő ribonukleinsav transzkriptum keletkezik A vektor első peptidjét vagy polipeptidjét meghatározó szekvencia transzkripciót követően tartalmazza az első cisztron üzenetét, ez megszünteti a hurkok képződését a hírvivő ribonukleinsav másodlagos szerkezetében. Ezek az előnytelen konfigurációk, amelyek valószínűleg gátolják a megfelelő kötődést a riboszómához és így a transzlációt és kifejeződést, nem jönnek létre, mert olyan nukleotidokat választunk ki, amelyek transzkripciókor nem generálnak komplementer bázisokat Mivel ezt elvégezhetjük mind a genetikai kód degeneráltságát felhasználva, mind pedig az előzőekben megadott irodalomban [Zuker és

Stiegler (1981)] megadott alapokon és módszereket használva, a találmány csak néhány, ha egyáltalán bármiféle limitációnak vethető alá. így a találmány szerinti módszert használva kifejezhetünk gyakorlatilag bármilyen kutatási vagy gyakorlati értékű polipeptidet leíró dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát A találmány szerinti eljárást felhasználhatjuk szekvenciák beépítésére, és ezzel az egyébként nem stabil ribonukleinsav stabilizálásra, vagy a riboszómához való kötődést és a húrvivő ribonukleinsav transzlációjának megkezdését befolyásoló szekvenciák eltávolítására vagy kicserélésére.

A találmány szerinti vektorokat és módszert több mikroorganizmussal használhatjuk, például gram-negatív festődésű prokarióta mikroorganizmusokkal, például Escherichia coli-val, például E. coli K12, E. coli K12 RV308, E. coli K12 HB101, E. coli K12, C600, E. coli K12 C600 R_k-M_k-, E. coli K12 RR1 és E. coli K12 MM294 mikroorganizmusokkal, Serratia, Pseudomonas és más mikroorganizmusokkal; gram-pozitív festődésű prokarióta mikroorganizmusokkal, például az alábbiakkal: Bacillus, például B. subtilis, B. thuringiensis vagy B. thuringiensis var. israelensis, továbbá Streptomyces, például S. fradiae, S. ambofaciens, S. lividans és S. griseofuscus.

Bár a találmány összes kiviteli módja használható, egyes vektorok és transzformánsok előnyösek. Előnyös vektorok a következők: pCZ114, pCZIOl.l, pCZ105.1, pCZ105.2, pCZ106.1, pCZ112.1, pCZ112.2 és pCZ1140, előnyös transzformánsok például a következők: E. coli K12 RV308/pCZ114, E. coli K12 RV308/pCZ101.1, E. coli K12 RV308/pCZ105.1, E. coli K12 RV308/pCZ106.1, E. coli K12

RV308/pCZ112.1 és E. coli K12 RV308/pCZ1140. Az előnyös csoporton belül a pCZ114 és pCZIOl.l plazmidok és az E. coli K12 RV308/pCZ114 és E. coli K12 RV308/pCZ 101.1 transzformánsok különösen előnyösek.

A témában jártasak felismerik, hogy a találmány szerinti vektorok és módszer használható megfelelő gazdasejtek transzformálására úgy, hogy standard fermentációs körülmények között kifejeződjön egy külső eredetű fehérjetermék. Az exogén protein termék ezután a kapott fermentléből ismert módszerekkel izolálható.

Az alábbi példákban tovább szemléltetjük a találmány szerinti eljárást

Mind az aktuális eljárást, mind annak magyarázatát megadjuk a megfelelő helyen.

A példákban a DNS centrifugálását 5 percen át, 5 ’C hőmérsékleten és 15 000/perc fordulaton végezzük. A teljes sejteket 15 percig, 5 ’C hőmérsékleten, 5000/pere fordulatszámmal centrifugáltuk.

1. példa

A pNM789B plazmid előállítása

A)A pKEN021 plazmidés ennekXbat-BamHlfragmensének előállítása

Kiindulási anyagként a pKEN021 (lásd a 3. ábrán: 106) 5,1 kb nagyságú Xbal-BamHI restrikciós fragmensét használjuk. A pKEN021 plazmid a pKENlll származéka [lásd az 1. ábrán; 101, továbbá Lee és munkatársai, J. BacL, 146, 861-866 (1981) és Zwiebel és munkatársai, J. BacL, 145, 654-656 (1981)], amely plazmid az E. coli CC620 törzsből izolálható (letéti szám: NRRL 15 011), és amely 2,8 kb nagyságú frag7

-713

HU 202 587 Β mensén hordozza az E. coli lipoprotein génjét. A fragmens leírását Nakamura és Inouye adja meg [Cell, 18, 1109-1117 (1979)]. A pKEN021 plazmidban az egyetlen EcoRI és Sáli restrikciós helyek közötti 650 bázispár nagyságú szekvenciát (pBR322 plazmid) olyan szekvenciával helyettesítették, amely az E. coli lipoprotein génjét hordozza. A lipoprotein gén szekvenciája [Nakamura és Inoye (1979), lásd előbb] 462 bázispárból álló Alul fragmenst tartalmaz, a lipoprotein gén első tripletjétől (metionin) az 5’-vég felé haladva, és ez tartalmazza apromotert, az 5’-nem transzlatált szakaszt és a riboszóma kötőhelyet. A transzlációs iniciációs metionin szignál előtt 16 bázispárral helyezkedik el a riboszóma kötőhelyen belül az egyetlen Xbal restrikciós hely. Egyetlen PvuII restrikciós helyet találtunk a struktúrgén transzlációs terminációs kodonjától 105 bázispárral balra, ezt BamHI restrikciós hellyé változtatjuk úgy, hogy egy alábbi nukleotid sorrendű, szintetikus dczoxi-ribonukleinsav linkért kapcsolunk hozzá;

5’-CCGGATCCGG-3’. (A linkért az alábbi helyről vásároltuk: Collaborative Research.) A BamHI helyet a lipoprotein utolsó 35 aminosavának kódoló szekvenciája, a transzlációs terminációs jel és a hírvivő ribonukleinsav 3’-nem transzlatált régiójának megfelelő szekvencia követi. A pKEN02l plazmid tartalmaz továbbá egy 850 bázispárból álló, a lipoprotein génnel nem összefüggő szekvenciát, ez az E. coli kromoszómában jobbra helyezkedik el. Ezek a szekvenciák azért vannak jelen, mivel a gén eredeti izolálásakor a módszerek és a rendelkezésre álló restrikciós helyek ilyen eredményt adtak.

Az első, második és harmadik ábrán megadott sémából kiderül, hogy a pKEN021 plazmid a pKENl 11 plazmidból származik. Az előállítást az alábbiak szerint végezzük:

gg pKENl 11 (lásd az 1. ábra: 101) dezoxi-ribonukleinsavat 25 egység Hpall restrikciós enzimmel kezelünk 300 μΐ alábbi összetételű pufferban:

mmól/1 trisz-hidro-klorid, pH = 7,4, mmól/1 magnézium-diklorid és mmól/1 -merkapto-etanol.

A reakciót 2 órán át végezzük 37 ’C hőmérsékleten. Kétszer 300 μΐ alábbi összetételű eleggyel extrahálunk: fenol-kloroform 50 : 50. A vizes fázist elkülönítjük és

2,5 térfogat etanollal és 0,1 térfogat 3 mólos nátriumacetát-oldattal kicsapjuk. A kivált dezoxi-ribonukleinsavat 100 μΐ elektroforetikus pufferban oldjuk és 5% poliakril-amidot tartalmazó gélen frakcionáljuk (a gélen végzett munkák során az akril-amid és a bisz aránya: 29 : 1, kivéve, ha másként nem jelezzük). A gélt 0,5 Mg/ml etidium-bromiddal festjük, és a csíkokat hosszú hullámhosszú ultraibolya fényben vizsgáljuk. A gélről elektroelúcióval 950 bázispárból álló csíkot izolálunk dialitikus zsákba. A dezoxi-ribonukleinsavat fenol és kloroform elegyével extraháljuk, etanollal kicsapjuk, majd ezután 2,5 Mg-nyi terméket 25 μΐ alábbi összetételű TEN-oldatban oldjuk:

mmól/1 nátrium-klorid, mmól/1 trisz-hidro-klorid, pH = 7,4 és mmól/1 nátrium-etilén-dinitrilo-tetraecetsav (EDTA), pH = 8,0.

Mg mennyiségű, 950 bázispárból álló Hpall fragmenst Alul restrikciós enzimmel kezelünk 200 μΐ alábbi összetételű elegyben:

mmól/1 nátrium-klorid, mmól/1 trisz-hidro-klorid, pH = 7,6, mmól/1 magnézium-diklorid és 6 mmól/1 β-merkapto-etanol.

A reakciót 2 órán át 37 'C hőmérsékleten végezzük.

Ezután 6% poliakril-amidot tartalmazó gélen frakcionáljuk a dezoxi-ribonukleinsavat, és a keletkezett 462 bázispárból álló Alul fragmenst az előzőekben megadottak szerint különítjük el és tisztítjuk. 1 Mg 462 bázispárból álló Alul fragmenst 10 μΐ T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz pufferban oldunk, aminek összetétele a következő:

mmól/1 trisz-hidro-klorid, pH = 7,6, mmól/1 magnézium-diklorid, mmól/1 ditio-treitol,

0,4 mmól/1 adenozin-trifoszfát.

Az elegy 150 pmól foszforilezett EcoRI linkért is tartalmaz (5’-GGAATTCC-3’; Collaborative Research), továbbá 2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázt. 16 órán át 4 ’C-on inkubáljuk a reakcióelegyet, majd 65 ’C-on tartjuk 10 percen át, és ezután 100 Ml-re hígítjuk, az alábbi összetételű EcoRI pufferral:

100 mmól/1 trisz-hidro-klorid, pH = 7,2, mmól/1 nátrium-klorid, mmól/1 magnézium-diklorid, mmól/1 β-merkapto-etanol.

Az elegyhez 40 egység EcoRI enzimet adunk, majd 2 órán át 37 C hőmérsékleten inkubálunk. Fenol és kloroform elegyével extraháljuk a mintát, etanollal kicsapjuk. A kivált dezoxi-ribonukleinsavat 20 μΐ T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz pufferban oldjuk, a puffért 0,1 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázzal és 0,1 μΐ pBR322 (1. ábra: 102) dezoxi-ribonukleinsavval egészítjük ki. A ribonukleinsavat EcoRI enzimmel linearizáljuk, és ezután alkalikus foszfatázzal kezeljük. 4 ’C hőmérsékleten 16 órán át ligálunk, majd a kapott dezoxi-ribonukleinsavval ismert módon E. coli K12 HB101 törzset transzformálunk. A transzformánsokat 12 Mg/ml tetraciklint tartalmazó agar lemezeken szelektáljuk, és a plazmidokat a rezisztens telepekből a gyors alkalikus extrakcióval izoláljuk. [Bimbóim és Doly, Nucleic Acids. Research, 7, 1513-1523 (1979).] így 466 bázispárból álló Xbal-BamHI fragmenst tartalmazó plazmidot (1. ábra: 103) kapunk, a következő lépésben ezt használjuk kiindulási anyagként.

Mg plazmid dezoxi-ribonukleinsavat (2. ábra: 103) 2 egység HindlII enzimmel kezelünk 50 μΐ alábbi öszszetételű reakcióelegyben:

mmól/1 nátrium-klorid, mmól/1 trisz-hidro-klorid, pH = 7,4, mmól/1 magnézium-diklorid és 6 mmól/1 β-merkapto-etanol.

A reakciót 1 órán át 37 ’C hőmérsékleten végezzük. Fenol és kloroform elegyével extraháljuk az elegyet, majd a dezoxi-ribonukleinsavat etanollal kicsapjuk, a kicsapott terméket 200 pl alábbi összetételű pufferban oldjuk:

300 mmól/1 nátrium-klorid, mmól/1 nátrium-acetát, pH = 4,25, mmól/1 cink-diklorid és 200 egység SÍ nukleáz [Miles Laboratories].

órán át 15 ’C hőmérsékleten tártjuk a reakcióelegyet, majd a reakció leállítására fenol és kloroform elegyével extraháljuk, és etanollal kicsapjuk a terméket. A kapott dezoxi-ribonukleinsavat 10 μ! T4 dezoxi-ribo-815

HU 202 587 Β nukleinsav ligáz pufféiban oldjuk, a pufferhoz előzőleg 20 pmól foszforilezett BamHI linkért (5’- CCGGATCCGG-3’; Collaborative Research) és 2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázt adunk. 4 ’C hőmérsékleten 16 órán át inkubáljuk az elegyet, majd a ligáz inaktiválására 10 percen át 65 ’C hőmérsékleten tartjuk, ezt követően pedig az alábbi összetételű BamHI pufferral 100 gl-re egészítjük ki:

150 mmól/1 nátrium-klorid, mmól/1 trisz-hidro-klorid, pH = 8,0, mmól/1 magnézium-diklorid, és 6 mmól/1 β-merkapto-etanol.

Ez az elegy 20 egység BamHI enzimet is tartalmaz. 2 órán át 37 ’C hőmérsékleten tartjuk a reakcióelegyet, majd 1% agarózt tartalmazó gélen tisztítjuk A gélt festjük és a 4,5 kb nagyságú nagyobb fragmenst eluálással elkülönítjük, miután fagyasztottuk. Ezután fenol és kloroform elegyével extrahálva és etanollal kicsapva tisztítjuk a terméket A kohézív BamHI végekkel rendelkező tisztított fragmenst 20 μΐ T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz pufferban oldjuk, ez 0,1 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázt tartalmaz. 16 órán át 4 ’C hőmérsékleten ligálunk, majd a kapott dezoxi-ribonukleinsavval E. coli HB101 sejteket transzformálunk. A transzformánsokat ampicillin (ApQ rezisztencia alapján szelektáljuk, 100 gg/ml ampicillin jelenlétében. A telepeket 10 gg/ml tetraciklinnel szembeni érzékenységre vizsgáljuk (Te’). Több ApTc’ genotípusú és az előzőekben megadott Bimboim-módszerrel izolált plazmidot vizsgálunk a HindIU hely hiányára és az egyetlen BamHI hely jelenlétére. EcoRI és Sáli restrikciós endonukleázokkal egymást követő emésztés után 466 és 305 bázispárból álló fragmenseket kapunk Egy ilyen plazmidot (2. ábra: 104) szelektálunk, és ezután az lpp promotertől 5’-iiányban elhelyezkedő EcoRI helyet HindIU hellyé alakítjuk áL gg plazmid (2. ábra: 104) dczoxi-ribonuklcinsavat 100 μΐ EcoRI pufféiban 0,2 egység EcoRI restrikciós endonukleázzal kezelünk 10 percen át 37 ’C hőmérsékleten. A reakció leállítására 10 percen át 37 ’C hőmérsékleten. A reakció leállítására 10 percen át 65 ’C hőmérsékleten tartjuk az oldatot, majd ezután fenol és kloroform elegyével extrahálunk, és a dezoxi-ribonukleinsavat etanollal kicsapjuk. A terméket 200 μΐ Sí nukleáz pufferben oldjuk, a puffer 1000 egység/ml S1 nukleázt tartalmaz. A reakciót 1 órán át végezzük 12 ’C hőmérsékleten. A reakció leállítását fenol és kloroform elegyével kivitelezett extrakcióval végezzük, a terméket etanollal csapjuk ki. A kapott dezoxi-ribonukleinsavat 10 gl, 20 pmól foszforilezett HindIU linkért (5’-CCAAGCTTGG-3’; Collaborative Research) és 2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázt tartalmazó T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz pufféiban szuszpendáljuk. 16 órán át 4 ’C hőmérsékleten inkubáljuk az elegyet, majd 10 percen át 65 ’C hőmérsékleten tartjuk, és 150 gl, 10 egység Hindin enzimet tartalmazó Hindin pufferral hígítjuk 150 gl végtérfogatig. Az elegyet 2 órán át 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk, majd ezután 1 % agarózt tartalmazó gélen frakcionáljuk. A legnagyobb csíkot (az egyetlen vágást szenvedett plazmiddal azonos) ismert módon elkülönítjük és tisztítjuk, majd 20 gl, 0,2 egység T4 ligázt tartalmazó T4 ligáz pufferban oldjuk. A reakcióelegyet 4 ’C hőmérsékleten 16 órán át inkubáljuk, majd E. coli HB101 sejteket transzformálunk. A transzformánsokat ampicillin rezisztenciára szelektáljuk, és az ismert módon izolált plazmidokat restrikciós enzimes analízisnek vetjük alá. Szelektáljuk az EcoRI-Hindm fragmenst tartalmazó plazmidot (2. ábra: 105), és klónozó vektorként használjuk fel az lpp gén 3’-régiójának klónozására.

gg plazmid (3. ábra: 105) dezoxi-ribonukleinsavat 50 gl Sáli restrikciós pufféiban 2 egység Sáli enzimmel kezelünk. A puffer összetétele a következő:

150 mmól/1 nátrium-klorid, mmól/1 trisz-hidro-klorid, pH = 7,9, mmól/1 magnézium-diklorid, mmól/1 β-merkapto-etanol.

A reakciót 1 órán át 37 ’C hőmérsékleten végezzük, majd 2 egység BamHI enzimet tartalmazó BamHI pufferral 150 μΐ végtérfogatra hígítjuk. 1 órán át 37 ‘C hőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet, majd 2,5 egység alkalikus foszfatázt adagolunk, és 1 órán át 65 ’C hőmérsékleten folytatjuk az inkubálásL A terméket fenol és kloroform elegyével extraháljuk, etanollal kicsapjuk, TEN (lásd előbb) elegyben oldjuk, és felhasználjuk az lpp gén 3’-fragmensének klónozására.

Az lpp gén 3 ’-régióját tartalmazó fragmens előállítására 10 gg pKENl 11 (3. ábra: 101) dezoxi-ribonukleinsavat 200 gl, 10 egység Hpal enzimet tartalmazó alábbi összetételű Hpal pufferban oldunk:

mmól/1 kálium-klorid, mmól/1 trisz-hidro-klorid, pH = 7,4, mmól/1 magnézium-diklorid és mmól/1 β-merkapto-etanol.

A reakciót 2 órán át 37 ’C hőmérsékleten végezzük. A dezoxi-ribonukleinsavat fenol és kloroform elegyével extraháljuk és etanollal kicsapjuk, a kicsapott terméket 10 gl, 20 pmól foszforilezett Sáli linkért tartalmazó T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz pufféiban oldjuk, az oldathoz 2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázt adunk. A linker az alábbi nukleotid sorrendű: 5’-GGTCGACC-3’, beszerezhető: Collaborative Research. A reakciót 16 órán át végezzük 4 ’C hőmérsékleten. A ligáz inaktiválására 10 percen át 65 ’C hőmérsékleten tartjuk az elegyet.

A kapott elegyet 10 egység Sáli enzimet tartalmazó Sáli pufferral 100 μί-re hígítjuk és 1 órán át 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk. Ezután 300 gl térfogatúra hígítjuk 10 egység PvuII restrikciós enzimet tartalmazó, alábbi összetételű PvuII pufferral:

mmól/1 nátrium-klorid, mmól/1 trisz-hidro-klorid, pH - 7,5, mmól/1 magnézium-diklorid, mmól/1 β-merkapto-etanol.

órán át 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk az elegyet, majd a dezoxi-ribonukleinsavat 5% poli-akril-amidot tartalmazó gélen frakcionáljuk.

0,5 gg, 950 bázispárból álló fragmenst különítünk el, tisztítunk és oldunk TEN elegyben.

0,2 gg fragmenst 20 gl T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz pufferban oldunk, ez 20 pmól foszforilezett BamHI linkért (5’-CCGGATCCGG-3’; Collaborative Research), és 2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázt tartalmaz. Az elegyet 16 órán át 4 *C hőmérsékleten inkubáljuk. A kapott dezoxi-ribonukleinsavat 10 percen át 65 C hőmérsékleten tartjuk, és ezután 100 gl BamHI pufferral hígítjuk, a puffer 20 egység BamHI enzimet tartalmaz. 2 órán át 37 C hőmérsékleten inkubáljuk az elegyet, és ezután 5% poliakril-amidot tartalmazó gélen frakcionáljuk a fölös linker molekulák eltávolítására.

-917

HU 202 587 Β

A kapott 950 bázispárból álló fragmens BamHI és Sáli kohézív végeket hordoz, a fragmenst ismert módon tisztítjuk, 20 μΐ T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz puffcrban oldjuk, a pufferhoz előzőleg 0,2 gg klónozó vektor dezoxi-ribonukleinsavat (lásd előbb) és 0,2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz enzimet adunk. 16 órán át 4 ’C hőmérsékleten inkubáljuk az elegyet, majd a dezoxi-ribonukleinsawal E. coli K12 HB101 sejteket transzformálunk.

Az ampicillinre rezisztens transzformánsokból plazmidot izolálunk, és a Sall-BamHI fragmens jelenlétének vizsgálatára ismert módon analizáljuk.

Az előállítandó 5,2 kb nagyságú fragmenst pKEN021 jellel jelöljük (3. ábra: 106).

gg pKEN021 plazmidot 37 ’C hőmérsékleten 200 gl alábbi összetételű Xbal-BamHI pufferban emésztünk:

150 mmól/1 nátrium-klorid, mmól/1 trisz-hidro-klorid, pH = 8,0, mmól/1 magnézium-klorid, mmól/1 β-merkapto-etanol.

Az emésztést 10 egység BamHI enzimmel végezzük 1 órán át. Ezután 10 egység Xbal enzimmel folytatjuk az emésztést 37 ’C hőmérsékleten. A kapott Xbal-BamHI emésztett dezoxi-ribonukleinsavat 2,5 egység alkalikus foszfatázzal kezeljük 1,5 órán át 65 °C hőmérsékleten, majd fenol és kloroform elegyével extraháljuk, etanollal kicsapva összegyűjtjük, és további felhasználáshoz 50 gl TEN-pufferban oldjuk (3. ábra: 107).

B) A pNM575 plazmid előállítása

A humán növekedési hormon génjének kódoló szekvencia részét tartalmazó dezoxi-ribonukleinsav fragmens forrásaként a ptrpED50chGH800 plazmidot használjuk [4. ábra: 108; Martial és munkatársai, Science, 205,602-601 (1979)]. Ezt a fragmenst szintetikusan is előállíthatjuk [Itakura és munkatársai (1977) és Crea és munkatársai (1978), lásd előbb], vagy ismert módon izolálhatjuk [Goodman és munkatársai, Methods in Enzymology, 68, 75-90 (81979)]. Ebben az esetben humán növekedési hormont meghatározó hírvivő ribonukleinsavat izolálunk (mRNS) humán agyalapi mirigyből. A humán növekedési hormon génjének egy részét hordozó ptrpED50chGH800 plazmid egyetlen Smal restrikciós helyet tartalmaz a gén transzlációs terminációs kodonjától jobbra 6 bázispárral. Ezt a helyet BamHI helyre változtatjuk az alábbiak szerint eljárva:

gg plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 6 egység Smal enzimmel emésztünk 200 gl alábbi összetételű Smal restrikciós pufferban:

mmól/1 trisz-hidro-klorid, pH = 8,0, mmól/1 magnézium-diklorid, mmól/1 kálium-klorid és 6 mmól/1 β-merkapto-etanol.

1,5 órán át 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet. Miután az emésztés teljes, fenol és kloroform elegyével extrahálunk, a dezoxi-ribonukleinsavat pedig etanolos kicsapással elkülönítjük. A csapadékot 24 gl TEN elegyben oldjuk. 40 pmól foszforilezett BamHI adapter fragmenst (Collaborative REsearch) adunk 0,5 gg (02 pmól végekre számítva) fenti módon emésztett plazmidhoz 16 gl, 2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázt tartalmazó ligáz pufferban. 2 órán át 22 *C hőmérsékleten, 16 órán át 4 ’C hőmérsékleten, végül 10 percen át 65 ’C hőmérsékleten inkubáljuk a reakcióele10 gyet. BamHI restrikciós enzimmel ismert módon kohéziv végeket állítunk elő. Az enzim hasítja a linker szekvenciát és a klónozott humán növekedési hoirnon cDNS szekvencia kezdeténél lévő BamHI helyet így BamHI végekkel rendelkező, 691 bázispárból álló fragmenshez jutunk, ezt 6% poliakril-amidot tartalmazó gélen ismert módon szeparáljuk és elkülönítjük. Az elkülönített dezoxi-ribonukleinsav fragmenst ligáljuk 0,2 gg BamHI restrikciós endonukleázzal emésztett és alkalikus foszfatázzal kezelt pBR322 dezoxi-ribonukleinsavval (4. ábra: 102), a ligálást 20 gl, előzőekben megadott összetételű 0,2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázt tartalmazó pufferban végezzük.

órán át 4 ’C hőmérsékleten inkubáljuk az elegyet, majd ezután Wensink és munkatársai [Cell.,3,315-325 (1974)] szerint eljárva E. coli JA221 (NRRL B-15014) sejteket transzformálunk.

A transzformánsokat 100 gg/ml ampicillint tartalmazó agar lemezeken szelektáljuk, és a bennük lévő plazmidot ismert módon izoláljuk, ezután pedig restrikciós enzimes és gcl-elektroforetikus analízissel azonosítjuk. Az előállított pNM575 jelű plazmid (4. ábra: 109) körülbelül 700 bázispárból álló BamHI fragmenst tartalmaz. Ezt ismert módon sokszorosítjuk további felhasználásra.

C) A pNM702 plazmid előállítása

Az érett humán növekedési hormon dezoxi-ribonukleinsav szekvenciájában egy FnuDII hely található, ez az első nukleotidtól 47 bázispámyi távolságban helyezkedik el.

gg pNM575 dezoxi-ribonukleinsavat 25 egység BamHI enzimmel emésztünk 250 gl BamHI pufferban 1 órán át 37 ’C hőmérsékleten. A BamHI kohéziv végekkel rendelkező, 691 bázispárból álló fragmenst 6% poliakril-amidot tartalmazó gélről izoláljuk és tisztítjuk ismert módon. A fragmens tisztítása után a termék 1/3-át (8 gg plazmid dezoxi-ribonukleinsavval, ekvivalens)

2,5 egység FnuDII enzimmel emésztjük, 100 gl alábbi összetételű FnuDII pufferban:

mmól/1 nátrium-klorid, mmól/1 trisz-hidro-klorid, pH = 7,4, mmól/1 magnézium-diklorid, és mmól/1 β-merkapto-etanol.

Az emésztést 37 ’C hőmérsékleten végezzük 1,5 órán át. Az 538 bázispárból álló dezoxi-ribonukleinsav fragmenst 6% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézist végezve ismert módon izoláljuk. A fragmens tartalmazza az utolsó, 175 aminosavat meghatározó kódoló szekvenciát, cs ezután pedig egy transzlációs stop jelet.

A foszfo-triészter módszert használva kétszálú dezoxi-ribonukleinsav fragmenst (5. ábra: 110) szintetizálunk az lpp promoter kapcsolásához a humán növekedési hormont leíró kódoló régióval. A kétszálú dezoxi-ribonukleinsav fragmenst (5. ábra: 110) az alábbi szekvenciájának találtuk:

Xbal ’-CTAG AGGGTATTAATAATGTTCCC ATTGGATGATGATGATAAGTTCCCAA3 ’-----TCCC ATAATTATTAC AAGGGTAACCTACTACTACTATTCAAGGGTTCCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATGCTCCG-3’ FnuDII

GGTAAGGGAATAGGTCCGAAAAACTGTTGCGATACGAGGC-5’.

-1019

HU 202 587 Β

A fragmenst az ismert foszfo-triészter módszert használva állítjuk elő, a fragmenst a következő szegmensekből állítjuk össze:

1. CTAGAGGGTAT

2. TAATAATGTTCC

3. CATTGGATGAT

4. GATGATAAGTTCC

5. CAACCATTCCC

6. TTATCCAGGC

7. TTTTTGACAACG

8. CTATGCTCCG

9. CATTATTAATACCCT

10. ATGGGAA

11. CTTATCATCATCCA

12. GGTTGGGAA

13. GGATAAGGGAAT

14. GTCAAAAAGCCT

15. CGGAGCATAGCGTT.

A fentiek szerint előállított szegmenseket T4 ligázzai katalizált reakció segítségével egyenként kapcsoljuk egymáshoz, az alábbiak szerint eljárva:

a) az 5’-nem foszforilezett 1. szegmenst 5’-foszforilezett 9. szegmens jelenlétében T4 ligázzai hozzákapcsoljuk az 5’-foszforilezett szegmenshez, amikor megkapjuk az 1 duplexet [Brown és munkatársai, 68, 109-151, Methods in Enzymology (1797)]. A duplexet preparatív gél-elektroforézissel izoláljuk 15% poliakril-amidot tartalmazó gélen.

b) Az 5’-foszforilezett 3 szegmenst hozzákapcsoljuk az 5’-foszforilezett 4 szegmenshez T4 ligáz segítségével 5’-foszforilezett 11 szegmens jelenlétében, amikor megkapjuk a 2 duplexet, amit 15% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézissel tisztítunk.

c) Az 5’-foszforilezett 5 szegmenst 5’-foszforilezett 12 és 13 szegmens jelenlétében T4 ligázzai hozzákapcsoljuk az 5’-foszforilezeu 6 szegmenshez, amikor megkapjuk a 3 dezoxi-ribonukleinsav duplexet. Ezt 15% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézissel tisztítjuk.

d) Az 5’-foszforilezett 7 szegmenst 5’-foszforilezett 14 és 5’-nem foszforilezett 15 szegmens jelenlétében T4 ligázzai hozzákapcsoljuk az 5’-foszforilezett 8 szegmenshez, amikor megkapjuk a 4 dezoxi-ribonukleinsav duplexet, amit 15% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézissel tisztítjuk.

e) A 2, 3 és 4 dezoxi-ribonukleinsav duplexeket T4 ligáz enzimmel összekapcsoljuk, és a kapott 5 dezoxi-ribonukleinsav duplexet 15% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézissel tisztítjuk.

f) Az 5’-foszforilezett 10 szegmenst és az 5 dezoxiribonukleinsav duplexet T4 ligázzai hozzákapcsoljuk az 1 dezoxi-ribonukleinsav duplexhez. A kapott dezoxi-ribonukleinsav duplexet (5. ábra: 110) 10% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézissel tisztítjuk. Ezt a dezoxi-ribonukleinsav duplexet ezután T4 polinukleotid-kináz enzimmel enzimatikusan foszforilezzük és a foszforilezést (gamma-P³²) ATP jelenlétében végezzük.

A pNM702 expressziós plazmidot úgy állítjuk elő, hogy a pKEN021 plazmid (5. ábra: 107) Xbal-BamHI fragmensét (0,1 pmól; 0,4 gg) enzimatikusan kapcsoljuk 0,05 pmól szintetikus dezoxi-ribonukleinsav fragmenshez (5. ábra: 110) és 0,3 pmól (0,08 gg) 538 bázispárból álló fragmensünkhöz (5. ábra: 109) 24 gl reakcióelegyben, 1,5 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz jelenlétében. 16 (kán át 4 ’C hőmérsékleten inkubáljuk az elegyet, majd az előzőekben megadottak szerint E. coli JA221 sejteket transzformálunk. A transzformánsokat 100 gg/ml ampicillint tartalmazó agar lemezeken szelektáljuk, majd az adott expressziós plazmid fonásaként tenyésztjük.

A humán növekedési hormon kifejeződését ismert radioimmun-méréssel határozzuk meg [Twomey és munkatársai, Clin. Chem., 20,389-391 (1974)]. A mérések szerint egy sejtben legalább 2 millió molekula szintetizálódik.

D) A pNM789plazmid előállítása

Kiindulási anyagként a pNM702 plazmidot használjuk (6. ábra: 111); ez a humán növekedési hormon expressziós plazmidja. Az előállított plazmid az alábbi aminosav szekvenciát fejezi ki:

Met-Phe-Pro-Leu-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-bGH.

A szarvasmarha növekedési hormon egy részét meghatározó kódoló szekvenciát hordozó két dezoxi-ribonukleinsav fragmenst a pBR348 plazmidból (6. ábra: 112), [Miller és munkatársai, J. Bioi. Chem., 255,75217524 (1980)] izoláljuk. A plazmid a pBR322 plazmid Pstl restrikciós helyére klónozva tartalmaz egy 831 bázispárból álló, szarvasmarha növekedési hormont meghatározó szekvenciák A Miller és munkatársai (1980) által megadott eljáráson kívül a szarvasmarha növekedési hormont leíró szekvenciát előállíthatjuk szintetikusan [Itakura és munkatársai, 1977, vagy Crea és munkatársai, 1978], vagy előállítható ismert módon Goodman és munkatársai (1979) a szarvasmarha agyalapi mirigyéből izolált hírvivő ribonukleinsavból kiindulva.

A humán és a szarvasmarha növekedési hormont meghatározó kódoló szekvencia igen hasonló, és több homológiát mutat A szarvasmarha növekedési hormont kifejező plazmid előállításakor különösen előnyösen használható a PvuII restrikciós enzimmel kapott fragmens elegy. A keletkező fragmensek 497 bázispár nagyságúak humán növekedési hormon és 494 bázispár hosszúak a szarvasmarha növekedési hormon esetén, a megfelelő restrikciós helyek hasonló leolvasási fázisban vannak mindkét szekvencia esetén.

(lg pNM702 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat (6. ábra: 111) egy egység PvuII restrikciós enzimmel részlegesen emésztünk 200 μΐ alábbi összetételű PvuII restrikciós pufferban:

mmól/1 nátrium-klorid, mmól/1 trisz-hidro-klorid, pH = 7,5, mmól/1 magnézium-diklorid, és mmól/1 β-merkapto-etanol.

A reakciót 37 ’C hőmérsékleten végezzük 10 percen át. A reakció leállítására 10 percen át 65 ’C hőmérsékleten tartjuk az elegyet, majd a dezoxi-ribonukleinsavat alkalikus foszfatázzal kezeljük és a fragmenseket 1% agarózt tartalmazó gélen különítjük el. A 497 bázispártról álló PvuII fragmensnek megfelelő lineáris dezoxi-ribonukleinsavat (6. ábra: 113) ismert módon izoláljuk, tisztítjuk és használjuk fel a köztes plazmid (6. ábra: 114) előállítására. A lineáris fragmens valamivel gyorsabban mozdul el a gélen, mint az egyetlen helyen hasított plazmid.

A pBR348 plazmid 494 bázispártról álló PvuII frag11

-1121

HU 202 587 Β mensének előállítására 10 pg plazmidot 10 egység PvuII enzimmel emésztünk 1 órán át 37 *C hőmérsékleten 200 pl PvuII pufferral készült elegyben. A fragmenseket 6% poliakril-amidot tartalmazó gélen különítjük el, és a 494 bázispárból álló fragmenst (6. ábra: 112) ismert módon azonosítjuk és tisztítjuk.

Köztes plazmidot állítunk elő (6. ábra: 114) úgy, hogy 0,2 pg pNM702 plazmidból származó PvuII fragmenst kapcsolunk 0,05 pg 494 bázispárból álló fragmensünkhöz 20 pl T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz pufféiban, 2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz jelenlétében. A reakciót 16 órán át végezzük 4 ’C hőmérsékleten. A transzformánsok előállítására transzformációt és ampicillin jelenlétében szelekciót végzünk, majd a transzformánsokból a plazmidot izoláljuk és analizáljuk a 494 bázispárból álló PvuII fragmens jelenlétére és megfelelő orientációjára. A további kísérletekhez kiválasztjuk a 494 bázispárt tartalmazó PvuII fragmenst és a 440 bázispárból álló Xbal-Smal fragmenst tartalmazó plazmidokat.

pg köztes plazmidot (7. ábra: 114) egy egység PvuII enzimmel emésztünk 200 pl PvuII puffénál készült reakcióelegyben 5 percen át 37 ’C hőmérsékleten, 10 percen át 65 ’C hőmérsékleten tartjuk az elegyet, majd 1% agaróz gélen elektroforézist végezve elkülönítjük és tisztítjuk az egyetlen PvuII helyet tartalmazó lineáris dezoxi-ribonukleinsavat. A kapott 3 pg-nyi terméket 5 egység Xbal enzimmel teljesen emésztjük, és alkalikus foszfatázzal kezeljük. A fragmenseket 1% agaróz gélen tisztítjuk és a legnagyobb fragmenst (az Xbal és az első PvuII hely között a humán és szarvasmarha növekedési hormonban lévő 109/bázispárt már nem tartalmaz) ismert módon izoláljuk (7. ábra: 115).

A szarvasmarha növekedési hormon első 23 aminosavát (69 bázispár) leíró dezoxi-ribonukleinsav szekvencia az első PvuII restrikciós helyig két Hpall restrikciós helyet tartalmaz, az első a kódoló szekvencia első nukleotidjától 23 bázispámyi távolságra helyezkedik. 63 bázispárból álló fragmenst (7. ábra: 116) szintetizálunk foszfo-triészter módszerrel. Ez a szakasz a következő részeket tartalmazza: az lpp riboszóma kötőhelyen lévő Xbal helytől számítva 19 bázispámyi szekvencia, az ATG transzlációs start jel, majd 24 bázispámyi rész, amely az alábbi peptidet határozza meg: Phe-Pro-Leu-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys:, tartalmaz továbbá 20 nukleotidot, amely a szarvasmarha növekedési hormont kódoló szekvencia egy része (a Phe-től az első Hpall helyig). A fragmens az alábbi szekvenciájú:

Xbal

5’-CTAGAGGGTATTAATAATGTTCCCATTGGATGATGATGATAAG3 ’-----TCCCATAATTATTACA AGGGTAACCTACTACTACTATTCTTCCCAGCCATGTCCTTGTC-----3’ Hpall

AAGGGTCGGTACAGGAACAGGC---5’

A 60 bázispárból álló fragmens előállítására a következő szegmenseket izoláljuk:

1. CTAGAGGGTAT

2. TAATAATGTTCC

3. CATTGGATGAT

4. GATGATAAGTTCC

5. CAGCCATGTCCTTGTC

6. ATGGGAACATTATTAATACCCT

7. TTATC ATC ATC ATCC A

8. ATGGCTGGGAAC

9. CGGACAAGGAC.

A fenti szegmenseket és T4 ligáz enzimet használva lépésenként állítjuk elő a 66 bázispárból álló fragmenst, az alábbiak szerint:

a) az 5’-nem foszforilezett 1 szegmenst hozzákapcsoljuk az 5’-foszforilezett 2 szegmenshez 5’-foszforilezett 6 szegmens jelenlétében T4 ligáz enzimmel, amikor megkapjuk az 1 duplexet Ezt 15% poliakrilamidot tartalmazó gélen elektroforézissel tisztítjuk.

b) Az 5%-foszforilezett 3, 4 és 5 szegmenseket 5’-foszforilczctt 7, 8 és 5’-nem foszforilezett 9 szegmens jelenlétében T4 ligázzal kapcsoljuk, amikor megkapjuk a 2 dezoxi-ribonukleinsav duplexet. Ezt 15% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézissel tisztítjuk.

c) Az 1 és 2 dezoxi-ribonukleinsav duplexeket ezután T4 ligázzal összekapcsoljuk, amikor megkapjuk a 7. ábrán 116 számmal jelzett dezoxi-ribonukleinsav duplexet, amit 15% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézissel tisztítunk. Ezt a dezoxi-ribonukleinsav duplexet ezután ismert módon enzimatikusan foszforilezzük T4 polinukleotid kináz enzimmel (gamma-P³²)-ATP jelenlétében.

A 46 bázispárból álló dezoxi-ribonukleinsav fragmenst, amely reprezentálja a fentiek során leírt Hpall hely és a PvuII hely közötti szakaszt, előállíthatjuk szintetikusan, de izolálhatjuk az eredeti pBR348 plazmidból is. így, 100 pg pBR348 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 50 egység PvuII enzimmel emésztünk 400 pl PvuII pufferban, 2 órán át 37 ‘C hőmérsékleten. Fenolos extrakció és etanolos kicsapást követően a kapott dezoxi-ribonukleinsavat 400 pl alábbi összetételű PstI pufferban oldjuk:

mmól nátrium-klorid, mmól trisz-hidro-klorid, pH = 7,4, mmól magnézium-diklorid, és mmól β-merkapto-etanol.

Az elegyhez 50 egység PstI enzimet adunk, és 2 órán át 37 ’C hőmérsékleten inkubálunk. A dezoxi-ribonukleinsav fragmenseket 6% poliakril-amidot tartalmazó gélen futtatjuk, és a 46 bázispárból álló szekvenciát tartalmazó 135 bázispárból álló fragmenst ismert módon elkülönítjük és tisztítjuk.

Az elkülönített dezoxi-ribonukleinsav 1/3 részét (megfelel 33 pg-nak) egy egység Hpall restrikciós enzimmel részlegesen emésztjük 100 pl alábbi összetételű Hpall pufferban:

mmól/1 trisz-hidro-klorid, pH = 7,4, mmól/1 magnézium-diklorid, és 6 mmól/1 β-merkapto-etanol.

A reakciót 40 percen át 37 ’C hőmérsékleten végezzük. 10 percen át 65 ‘C hőmérsékleten tartjuk az elegyet, majd a dezoxi-ribonukleinsav fragmenseket 5% akril-amidot tartalmazó gélen futtatjuk (akril-amid: bisz aránya = 19:1), a futtatáskor megfelelő marker fragmenseket is használunk. A 135 bázispárból álló fragmens Hpall részleges emésztésével kapott 46 bázispárból álló fragmenst (7. ábra: 112) ismert módon tisztítjuk.

0,2 pg plazmid vektor (7. ábra: 115) Xbal-PvuII fragmenst, 3,2 pmól szintetikusan előállított, 63 bázispárból álló fragmenst (7. ábra: 116) és 04 pmól 46 bázispárból álló fragmenst (7. ábra: 112) inkubálunk 10 pl ligációs pufferban 2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz jelenétében 16 órán át 4 ’C hőmérsékleten.

-1223

HU 202 587 Β

Az eleggyel E. coli JA221 sejteket transzformálunk, és a kapott, a pNM789 plazmidot tartalmazó transzformánsokat ampicilin rezisztencia alapján szelektáljuk. A pNM789 plazmid (7. ábra: 117) azonosítását a 494 bázispárból álló PvuII és a 109 bázispárból álló Xbal-PvuII fragmensek jelenlétének bizonyításával végezzük.

E) A pNM789B plazmid végső előállítása A 8. ábra 117 számmal jelzett pNM789 plazmidja egyetlen aminosavat meghatározó kodonnal különbözik a teljes szarvasmarha növekedési hormon kodonjától. A cserét úgy végezzük, hogy a pNM789 plazmid 28 bázispárból álló PvuII-BamHI fragmensét eltávolítjuk, és helyettesítjük az alábbi szekvenciájú szintetikus, kétszálú ffagmenssel (8. ábra: 118):

5’-CTGTGCCTTCTAG-3’

3’-GACACGGAAGATCCTAG-5’ pG pNM789 plazmidot egy egység PvuII enzimmel kezelünk 200 pl PvuII pufferban 5 percen át 37 ’C hőmérsékleten. 10 percen át 65 ’C-on tartjuk az elegyet, majd 300 pl végtérfogatra hígítjuk BamHI puffer adagolásával. A fragmenseket 10 egység BamHI enzimmel teljesen emésztjük 1 órán át 37 ’C hőmérsékleten, majd 5 egység alkalikus foszfatázzal lehasítjuk a foszfátcsoportokat 1 órán át 65 ’C-on végzett reakcióval. A kapott dezoxi-ribonukleinsav fragmenseket 1% agarózt tartalmazó gélen különítjük el, és ismert módon tisztítunk egy olyan dezoxi-ribonukleinsav fragmenst amely megfelel a pNM789 plazmid egyetlen helyen hasított lineáris alakjának (8. ábra: 119). 0,2 pg így izolált fragmenst 5 pmól szintetikus fragmenssel ligálunk 2 egység T4 ligázzal katalizált reakcióban 20 pl ligáz puffénál készült reakcióelegyben. A ligálást 4 ’C hőmérsékleten végezzük egy éjszakán át Transzformációt követően több plazmidot izolálunk és vizsgálunk a 494 bázispárból álló PvuII és a 628 bázispárból álló Xbal-BamHI fragmens jelenlétére. A fenti fragmenseket tartalmazó plazmidok megfelelnek a pNM789B plazmidnak (8. ábra: 120).

2. példa

A pCZIOl plazmid és az E. coli K12 RV308/pCZ101 törzs előállítása

A) A ρΙΜ-Γ -A3 plazmid izolálása Az E. coli K12/pIM-I’-A3 (NRRL B-15733) baktériumot TY táptalajban tenyésztjük. A táptalaj összetétele a következő:

1% tripton,

0,5% élesztőkivonal 0,5% nátrium-klorid, pH = 7,4.

A táptalaj 50 pg/ml kanamicint is tartalmaz. A tenyésztést ismert módon végezzük, 25 ’C hőmérsékleten. 1:10 arányban friss táptalajjal hígítjuk a tenyészetet, és 3 (kán át 37 ’C hőmérsékleten inkubálunk, majd 0,5 ml tenyészetet 1,5 ml térfogatú Eppendorf csőbe adagolunk. 15 másodpercen át centrifugálunk. Ha másként nem adjuk meg, az összes lépést szobahőmérsékleten végezzük. A kapott felülúszót óvatosan eltávolítjuk egy pipettával, és a sejtüledéket 100 pl alábbi összetételű, frissen előállított lizozimos oldatban szuszpendáljuk:

mg/ml lizozim, mmól/1 glükóz, mmól/1 diamino-tetraecetsav és 25 mmól/1 trisz-hidro-klorid, pH = 8,0.

Az elegyhez 200 pl alkalikus nátrium-lauril-szulfátoldatot adunk (0,2 n nátrium-hidroxid, 1% nátrium-lauril-szulfát), majd enyhén rázzuk az elegyet, és lízisig 0 ’C hőmérsékleten tartjuk (körülbelül 5 perc). Ezután 150 pl 3 mólos nátrium-acetát-oldatot adagolunk, és néhány másodpercen át forgatva a csövet óvatosan keverjük annak tartalmát Legalább 60 percen át 0 ’C hőmérsékleten tartjuk az elegyet és ezután 15 percen át centrifugáljuk, amikor majdnem teljesen tiszta felülúszót kapunk. A felülúszót egy másik centrifugacsőbe öntjük, majd 3 térfogatnyi hideg, abszolút etanolt adunk hozzá. 5 percen át szárazjég és etanol keverékében tartjuk a centrifugacsövet, majd a kivált csapadékot 5 percen át centrifugálva elkülönítjük, és a felülúszót óvatosan leszívjuk. Az összegyűjtött csapadékot 100 pl alábbi összetételű TE elegyben oldjuk. Ennek összetétele a következő:

mmól/1 trisz-hidro-klorid, pH = 8,0, mmól/1 etilén-diamin-tetraecetsav.

Az elegy tartalmazza a pIM-I’-A3 jelű plazmid dezoxi-ribonukleinsavat

B) A pNM789B plazmid emésztése Xbal-BamHI enzimekkel, és a 0,6 kb nagyságú Xbal-BamHI fragmens előállítása pg pNM789B dezoxi-ribonukleinsavat oldunk 50 pl alábbi összetételű Hi-só pufferban. Ennek összetétele a következő:

100 mmól/1 nátrium-klorid, mmól/1 trisz-hidro-klorid, pH = 8,0, mmól/1 magnézium-diklorid és 5 mmól/1 β-merkapto-etanol.

Az oldathoz 10-10egység BamHI és Xbal restrikciós enzimet adunk, és 1 órán át 37 ’C hőmérsékleten inkubálunk. 5 pl, 7,0 pH-jú, 3 mólos nátrium-acetát-oldattal leállítjuk a reakciót, majd 2 térfogatnyi abszolút etanollal kicsapjuk a dezoxi-ribonukleinsavat. Az emésztett terméket 100 pl TE pufferban oldjuk, és felhasználásig 0 ’C hőmérséldeten tároljuk.

C) A ρΙΜ-Γ-Α3 plazmid Xbal-BamHI emésztése

Az emésztést a 2. példa B) pontja szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pNM789B plazmid helyett a pIM-I’-A3 plazmidot használjuk. Az előállított dezoxi-ribonukleinsavat 100 pl TE pufferban oldjuk, és felhasználásig 0 ’C hőmérsékleten tároljuk.

D) Ligálás és transzformálás pg pIM-I’-A3 emésztett plazmidot 1 pg pNM789B plazmid Xbal-BamHI fragmenst 40 pl vizet és 5 pl, 5 mmólos adenozin-trifoszfát-oldatot, továbbá 5 pl alábbi összetételű ligációs elegyet állítunk elő, és 5 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázzal egészítjük ki. A ligációs elegy összetétele a következő:

500 mmól/1 trisz-hidro-klorid, pH = 7,8,

200 mmól/1 ditio-treitol,

100 mmól/1 magnézium-diklorid.

A reakciót 2 (kán át 20 ’C hőmérsékleten végezzük. 2 percen át 65 ’C hőmérsékleten tartjuk az elegyet, jégfürdőben lehűtjük és Wensink módszere szerint [Cell., 3, 315 (1974)] transzformáljuk az E. coli K12 RV308 sejteket A baktériumokat TY lemezen növesztjük, ennek a táptalajnak az összetétele a következő:

tripton 1%, élesztőkivonat 0,5%,

-1325

HU 202 587 Β nátrium-klorid 0,5%, agar 1,5%, pH = 7,4.

A táptalaj ml-enként 50 pg kanamicint tartalmaz.

Az E. coli K12 RV308 törzset az alábbi állandó törzsgyűjteménybe helyeztük letétbe NRRL B-15624 sorszámon: Northern Régiónál Research Laboratory, Peoria, Illinois.

Akapott transzformánsok közül néhány, ahogy azt az ismert módon kivitelezett agaróz gél-elektroforetikus analízis [Maniatis és munkatársai (1982), lásd előbb] jelzi, csak a 10,8 kb nagyságú plazmidot tartalmazza. Egy ilyen transzformánst szelektáltunk, E. coli K12 RV308/pCZ101 jellel jelöltünk, ampicillint tartalmazó TY agaron szélesztettük, majd ismert bikorbiológiai technikákat használva tenyésztettük. A kapott sejteket hazsnáljuk fel az L példa A) pontja szerint eljárva a pCZIOl plazmid izolálására.

3. példa

A pCZ114 plazmid és az E. coli K12 RV308!pC7„l 14 törzs előállítása

A) A pCZIOl plazmid 10,2 kb nagyságú Bamlll-Xbal fragmensének előállítása

A fragmenst a 2. példa B) pontja szerint eljárva állítjuk elő, azzal a különbséggel, hogy a pNM789 plazmid helyett a pCZIOl plazmidot használjuk. Az előállítandó 10,2 kb nagyságú BamHI-Xbal restrikciós fragmenseket agaróz gél-elektroforézissel ismert módon izoláljuk [Maniatis és munkatársai (1982), lásd előbb], és ezután 100 pl TE-pufferban oldjuk, és felhasználásig 0 °C hőmérsékleten tároljuk.

B) A pCZIOl plazmid 0,6 kb nagyságú BamM-llg'iAl fragmensének előállítása

A fragmenst a 2. példa B) pontja szerint eljárva állítjuk elő, azzal a különbséggel, hogy a pNM789B plazmid és az Xbal restrikciós enzim helyett a pCZIOl plazmidot és a HgiAI restrikciós endonukleázt használjuk. A0,6 kb nagyságú BamHI-HgiAI restrikciós fragmensekct ismert módon agaróz-gél-elektroforézissel izáljuk [Maniatis és munkatársai (1982), lásd előbb] és ezután 100 μΐ TE-pufferban oldjuk, és felhasználásig 0 ’C hőmérsékleten tároljuk.

C) A dezoxi-ribonukleinsav linker szekvencia előállítása

Az alábbi nukleotid-sorrendű linker szekvenciát állítjuk elő:

5’-CTAGAGGGTATTAATA ATG TTG GAG GAT GAT TAA ATG TTC CCA GCC

3'-----TCCCATAATTAT TAC AAC CTC CTA

CTA ATT TAC AAG GGT CGG

ATG TCC TTG TCC GGC CTG TTT GCC AAC GCT

GTGCT-3’

TAC AGG AAC AGG CCC GAC AAA CGG TTG CGAC-----5’.

Az adott linker szekvenciát módosított foszfo-triészter módszenei állítjuk elő, lényegében az alábbi közlésekben leírtak szerint eljárva: Itakura és munkatársai, 1977, Crea és munkatársai, 1978; lásd előbb.

A szintézis módszerét az 1. példában is részletesen szemléltetjük.

D) Ligálás és transzformálás

A 3. példa C) pontja szerint előállított dezoxi-ribonukleinsav linker 20 pmólnyi mennyiségét, 1 pg, a pCZIOl plazmidból származó 10,2 kb nagyságú BamHI-XbaI fragmenst és 0,5 pg, a pCZIOl plazmidból kapott 0,6 kb nagyságú BamHI-HgiAI fragmenst keverjük és ligálunk. A kapott plazmiddal E. coli K12 RV308 sejteket transzformálunk a 2. példa D) pontja szerint eljárva.

A kapott transzformánsok közül néhány az ismert módon végzett agaróz gél-elektroforetikus analízis [Maniatis és munkatársai (1982)] és más vizsgálatok szerint csak az adott 10,8 kb nagyságú plazmidot tartalmazzák. Ezeket a transzformánsokat E. coli K12 RV308/pCZl 14 jellel jelöljük, szelektáljuk őket, ampicillint tartalmazó ΤΎ-agaron szélesztjük, és ismert mikrobiológiai technikákat használva tenyésztjük. A kapott sejtek a nátrium-lauril-szulfát gél-elektroforézis, RIA és más vizsgálatok szerint kifejezik a met-bGH-t, mégpedig nagy mennyiségben. Mivel a pCZ114 dezoxi-ribonukleinsav tcrmindukálható, ún. runaway (elveszthető) replikont tartalmaz, az adott met-bGH kifejeződése maximálisan bekövetkezik 37 °C hőmérsékleten.

4. példa

A pCZIOl.1 plazmidésazE. coli K12RV308IpCZIOl.1 törzs előállítása

A kísérleteket a 3. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a 3. példa C) pontjában megadott linker szekvencia helyett az alábbi nukleotid-szckvenciájú fragmenst használjuk: 5’-CTAGAGGGTATTAATA ATG TTC CCA TTG GAT GAT GAT TAA ATG TTC

3’-----TCCCATAATTAT TAC AAG GGT AAC

CTA CTA CTA ATT TAC AAG

CCA GCC ATG TCC TTG TCC GGC CTG TTT

GCC AAC GCT GTGCT-3’

GGT CGG TAC AGG AAC AGG CCG GAC AAA CGG TTG CGA C-----5’.

A fenti linker szekvenciát Itakura és munkatársai (1977) és Crea és munkatársai (1978) módszere szerint állítjuk elő. A szintézis módját az 1. példában részletesen szemléltetjük.

Az E. coli K12 RV308/pCZ101.1 jellel jelzett transzformánsokalanepicillint tartalmazó TY agaron szélesztjük, és ezután felhasználjuk a pCZIO 1.1 plazmid termelésére és izolálására, ismert módon kivitelezett tenyésztést követően.

A nátrium-lauril-szulfálos gél-elektroforézis, RIA és más vizsgálatok szerint a transzformánsok nagy mennyiségben kifejezik a metionin-szarvasmarha növekedési hormont. Mivel a pCZ 101.1 plazmid hőindukálható, ún. runaway replikont tartalmaz, a met-bGH maximális kifejeződése következik be 37 ’C hőmérsékleten.

5. példa a pII17A4Al plazmid előállítása

A mellékelt 15. ábrán adjuk meg a ρΗ17Δ4Δ1 plazmid előállításának vázlatát

A) A pBRIltrp plazmid előállítása

A pGMl plazmid hordozza az E. coli triptofán operonját egy ALE1413 jelű delécióval [Miozzari és munkatársai, J. Bacteriology, 1457-1466 (1978)], és ezért olyan fúziós proteint fejez ki, amely a trp vezető proteinjének első 6 aminosavát és a trpE polipeptid (a továbbiakban LE’ jellel jelöljük) utolsó harmadát, to-1427

HU 202 587 Β vábbá a teljes trp D polipeptidet tartalmazza, az összes, a trp promoter-operátor rendszer szabályozása alatt áll.

AzE.coliK12W3110tna2trp-Á102/pGMl törzset az alábbi törzsgyűjteményben helyeztük letétbe: ATCC 31622 sorszámon, American Type Culture Collection. A sejtekből a pGMl ismert módon izolálható.

pg plazmidot PvuII restrikciós enzimmel emésztünk, az enzim a plazmidot öt ponton hasítja. A génfragmenseket ezután EcoRI linkerekkel kombináljuk (ez komplementer oligonukleotidokból áll, szekvenciája a következő: pCATGAATTCATG), ami által EcoRI helyet tartalmazó plazmidba való, klónozásra használható EcoRI restrikciós enzim által felismerhető helyet juttatunk a fragmensbe.

A pGMl plazmidból kapott 20 pg-nyi mennyiségű dezoxi-ribonukleinsav fragmenseket 10 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázzal kezeljük 20 pmól 5’-foszforilezett, alábbi szekvenciájú szintetikus oligonukleotid jelenlétében: pCATGAATTCATG. A reakciót 20 pl alábbi összetételű T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz pufferban végezzük 4 *C hőmérsékleten, egy éjszakán át:

mmól/1 trisz, pH = 7,6,

0,5 mmól/1 adenozin-trifoszfát, mmól/I magnézium-diklorid és mmól/1 ditio-treitol.

Az oldatot 10 percen át 70 ’C hőmérsékleten tartjuk a ligálási reakció leállítására. A linkereket EcoRI enzimmel hasítjuk és az EcoRI végekkel rendelkező fragmenseket 5% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézissel különítjük el. A három legnagyobb fragmenst izoláljuk a gélről úgy, hogy először etidium-bromiddal festjük, majd ultraibolya fényben lokalizáljuk a fragmenseket, végül kivágjuk a gélről a számunkra érdekes részeket.

300 pl 0,1 x TBE-oldatban szuszpendáljuk a gélfragmenseket, és dialízis zsákban elektroforézist végzünk 1 órán át 0,1 x TBE-pufferban, 100 V feszültségkUlönbség mellett A TBE-puffer összetétele a következő:

10,8 g trisz-bázis, g bórsav,

0,09 g dinátrium-etilén-diamino-tetraecetsav, *11 vízben.

Adialíziszsákból összegyűjtjük a vizes oldatot, fenollal, majd kloroformmal extraháljuk, és az oldat nátrium-klorid koncentrációját 0(2 mólra állítjuk be. Ezután etanolos kicsapással kinyerjük a dezoxi-ribonukleinsavat.

Az EcoRI ragadós végekkel rendelkező trp promoter/operátor rendszert tartalmazó fragmenseket úgy azonosítjuk, hogy beépítjük egy tetraciklin-érzékeny plazmidba, amely a promoter/operátor rendszer beépülése következtében tetraciklin rezisztenssé válik. Az összes dezoxi-ribonukleinsav fragmenst a továbbiakban poliakril-amid gél-elektroforézissel és elektroelucióval izoláljuk

B) A trp promoter/operátor rendszer által szabályozott, tetraciklin rezisztenciát kifejező pBRH trp plazmid kialakítása és az A) pontban izolált, trp promoter! operátor rendszert tartalmazó dezoxi-ribonukleinsav fragmens azonosítása és sokszorosítása

A pBRHl plazmid [Rodriguez és munkatársai, Nucleic Acids Research, 6,3267-3287 (1979); ATCC 37070 jelű törzs] ampicillin antibiotikummal szembeni rezisztenciát fejez ki, és tartalmazza a tetraciklin rezisztenciát meghatározó gént, de nem áll promoter szabályozása alatt, így nem határozza meg ténylegesen a reisztenciát. A plazmidot hordozó sejtek azért tetraciklinre érzékenyek. Az EcoRI helyre promoter/operátor rendszert juttatva, a plazmid tetraciklin-rezisztenciát fog meghatározni.

A pBRHl plazmidot EcoRI enzimmel emésztjük. Az enzimet fenolos extrakcióval távolítjuk el, majd kloroformmal extrahálunk és a dezoxi-ribonukleinsavat etanolos kicsapást követően vízben oldjuk. A kapott dezoxi-ribonukleinsavat egy másik reakcióelegyben, az 5. példa A) pontja szerint előálhtott három dezoxi-ribonukleinsav fragmenssel kombináljuk, és az előzőekben megadottak szerint eljárva, T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázzal ligáljuk mindhármat. A reakcióelegyben lévő dezoxi-ribonukleinsavval E. coli K12 294 (NRRL B-15625) sejteket transzformálunk, ismert módon [Hcrshfield és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 71,3455-3459 (1974)] és a baktériumokat LB táptalajra [Maniatis és munkatársai (1982), lásd előbb] szélesztjük, a táptalajhoz pedig előzőleg 20 pg/ml ampicillint és 5 pg/ml tetraciklint adtunk. Több tetraciklinre rezisztens telepet szelektálunk, és izoláljuk belőle a plazmid dezoxi-ribonukleinsavat, amit pBRH trp jellel jelölünk.

Több tetraciklinre rezisztens telepet szelektálunk, és a plazmid dezoxi-ribonukleinsavat izoláljuk belőlük, majd pBRHtrp jellel jelöljük. A kívánt fragmens jelenlétét restrikciós enzimes analízissel bizonyítjuk. A pBRHtrp plazmid β-laktamáz enzimet fejez ki, ez felelős az ampicillin-rezisztenciáért A plazmid tartalmazza a trp promoter/operátor rendszert hordozó dezoxi-ribonukleinsav fragmenst A dezoxi-ribonukleinsav fragmens kódolja továbbá az előproteint (LE’), meghatározza a trp vezető protein első 6 aminosavából és a trpE polipeptid utolsó harmadából álló fúziós fehérjét, meghatároz továbbá egy második proteint (D’ jellel jelöljük), amely megfelel a trp D polipeptid első felének. A plazmid által meghatározott harmadik protein a tetraciklin rezisztenciát kódoló gén által leírt fehérje.

C) A pSOM7&2 plazmid előállítása

A pBRHtrp plazmidot EcoRI restrikciós endonukleázzal emésztjük, és a kapott fragmenst poliakril-amid gél-elektroforézissel és azt követő elektroelucióval izoláljuk. Az izolált fragmenst a pSOMl 1 plazmid [Itakura és munkatársai, Sci., 198,1056 (1977); 4 366 246 számú amerikai és 2 007 676A nagy-britanniai szabadalmi leírások] EcoRI emésztést követően kapott lineáris fragmensével keverjük. A keveréket T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázzal ligáljuk, és a kapott dezoxi-ribonukleinsavval E. coli K12 294 sejteket transzformálunk, az előzőekben megadottak szerint eljárva. A transzformáns baktériumokat ampicillint tartalmazó lemezeken szelektáljuk, és a kapott ampicillinre rezisztens telepeket telephibridizációval vizsgáljuk [Gruenstein és munkatársai, Proc. Nat Acad. Sci., USA 72,3951-39655 (1975)].

A pBRHtrp plazmidból izolált trp promoter/operátor rendszert tartalamzó fragmenst P³² izotóppal radioaktívan jelezzük, és a fenti hibridizációkor próbaként használjuk. Több telep pozitív a telep-hibridizációs kísérletekben, és ezért szelektáljuk azokat Izoláljuk a sejtekből a plazmid dezoxi-ribonukleinsavat és a beépült fragmensek orientációját BglII és BamHI restrikciós enzimekkel végzett kettős emésztést követően analizáljuk. A trp promoter/operátor rendszert hordozó fragmenst

-1529

HU 202 587 Β megfelelő orientációban tartalmazó plazmidokat hordozó telepeket 10 gg/ml ampicillint tartalmazó LB jelű táptalajban tenyésztjük. A plazmidot pSOM7A2 jellel jelöljük, és felhasználjuk a további kísérletekben.

D) A pTrp24 plazmid előállítása

1. Sorrendben a kódoló szál 5'- és 3’-végein BglII és EcoRI restrikciós helyeket hordozó, az LE’ polipeptid távolabbi régióit leíró génfragmens izolálása

ApSOM7Á2 plazmidot HindlII restrikciós endonukleázzal emésztjük, majd az emésztést lambda exonuklcázzal (5’-3’ exonukleáz) megismételjük, olyan körülmények között, hogy az LE’ szakaszt meghatározó szekvencián belül a BglII restrikciós hely mellett következzen be az emésztés. 20 gg HindlII enzimmel emésztett pSOM7A2 dezoxi-ribonukleinsavat az alábbi összetételű pufferben oldunk:

mmól/1 glicin-puffer, pH = 9,6, mmól/1 magnézium-diklorid, mmól/1 β-merkapto-etanol.

A kapott elegyet 5 egység lambda exonukleázzal kezeljük 60 percen át, szobahőmérsékleten. A reakcióelegyet fenollal extraháljuk, majd az extrakciót megismételjük kloroformmal, és a terméket etanollal kicsapjuk.

Az LE’ génfragmens távolabbi végén ExoRI restrikciós endonukleáz által felismert hely kialakítására a továbbfejlesztett foszfo-triészter-módszerrel [Crea és munkatársai (1978), lásd előbb] az alábbi prímért szintetizáljuk: P³²CCTGTGCATGAT. Ezt hibridizáljuk az LE’ génfragmens egyszálú végéhez, ez utóbbit lambda exonukleázos emésztéssel alakítjuk ki.

A hibridizációt úgy végezzük, hogy 20 gg lambda exonukleázzal és HindlII enzimmel emésztett pSOM7A2 plazmidot 20 gl vízben oldunk és az oldathoz 50 pmól 5’ -foszforilezett, a fentiekben ismertetett oligonukleotidot adunk. A szintetikus fragmens az LE’ szekvenciát meghatározó 3’-véghez hibridizálódik, az LE’ fragmens visszamaradó egyszálú részét Klenow polimeráz I enzimmel töltjük fel dATP, dTTP, dGTP és dCTP jelenlétében. A Klenow polimeráz I enzimfragmenst úgy állítjuk elő, hogy a dezoxi-ribonukleinsav polimeráz I enzimet proteolitikusan hasítjuk. A fragmens 5’-3’ irányú polimerizáló, 3’-5’ exonukleotikus aktivitással rendelkezik, de nem bír a szülőenzim 5’-3’ irányú exonukleolitikus aktivitásával [Komberg, Freeman és Co., SFO,98 (1974)].

A reakcióelegyet 50 ’C hőmérsékletre melegítjük, és lassan 10 ’C-ra hűtjük, miután 4 gl Klenow enzimet adagolunk. 15 percen át szobahőmérsékleten inkubáljuk areakcióelegyet, majd 37 ’C-on folytatjuk az inkubálást 30 pácén át. A reakció leállítására 5 gl 0,25 mólos etilén-diamino-ecetsavat adagolunk. Ezután fenollal, majd kloroformmal extraháljuk a reakcióelegyet, és a terméket etanollal kicsapjuk. A dezoxi-ribonukleinsavat BglII enzimmel hasítjuk, és a fragmenseket poliakril-amid gél-elektroforézissel különítjük el. A gélről készített autoradiogram szerint 470 bázispár nagyságú P³²jelzett fragmens látszik a várt helyen, ezt elektroelucióval elkülönítjük.

Ahogy azt kifejtettük, ez az LE’ (d) fragmens BglII véggel és a príménél kezdődő helyen pedig tompa véggel rendelkezik.

2. A pTHa.1 plazmid előállítása

ApTHal plazmid előállítására a timozin α 1 szinte- ¹⁶ tizált gént bejuttatjuk a pBR322 plazmidba. A timozin α 1 gén szintézisét meghatározó dezoxi-ribonukleinsav előállítására 16 nukleotidból álló oligonukleotidot (T,. -T₁₆) állítunk elő és ligálunk, ezt a mellékelt 11. ábrán a kettős vonallal jelzett nyilak mutatják.

Az 5’-végekhez és az N-terminális véghez egy met ATG nukleotidot építünk be (egyszálú kohézív végek) azért, hogy az EcoRI és BamHI enzimekkel hasított plazmidhoz kapcsolni tudjuk. Belátható, hogy a gén közepén lévő BglII hely segítségével analizálhatjuk a rekombináns plazmidokat.

AT_rT₁₆ oligo-dezoxi-ribonukleinsavakat módosított foszfo-triészter-módszerrel állítjuk elő [Ilakúra és munkatársai (1977) és Crea és munkatársai (1978)]. A különböző oligo-dezoxi-ribonukleotidokat az I. táblázatban ismertetjük.

I. táblázat

A timozinal gén szintetikus oligonukleotidjai

HPLC

Ve- gyü- let	Szekvencia	Hosz- analízis, szú- retenciós
ság	idő* (perc)*
Ti	A-A-T-T-C-A-T-G-T-C	10	17,4
T₂	T-G-A-T-G-C-T-G-C-T-G-T-T-G-A	15	24,3
T₃	T-A-C-T-T-C-T-T-C-T-G-A	12	20,3
T₄	G-A-T-T-A-C-T-A-C-T-A-A-A	13	22,0
T₅	G-C-A-G-C-A-T-C-A-G-A-C-A-T-G	15	24,8
T₆	G-A-A-G-T-A-T-C-A-A-C-A	12	20,1
T₇	A-G-T-A-A-T-C-T-C-A-G-A-A	13	22,6
Ts	A-A-G-A-T-C-T-T-T-A-G-T	12	20,2
T₉	G-A-T-C-T-T-A-A-G-G-A-G	12	20,4
Tio	A-A-G-A-A-G-G-A-A-G-T-T	12	21,1
Tn	G-T-C-G-A-A-G-A-G-G-C-T	12	20,5
Tl2	G-A-G-A-A-C-T-A-A-T-A-G	12	20,4
Tn	C-T-T-C-T-T-C-T-C-C-T-T	12	19,9
Tl4	T-T-C-G-A-C-A-A-C-T-T-C	12	20,5
Tl5	G-T-T-C-T-C-A-G-C-C-T-C	12	20,2
Tl6	G-A-T-C-C-T-A-T-T-A	10	17,2
* =	szobahőmérsékleten

A mellékeit 12. ábrán foglaljuk össze a T_1S fragmens szintézise kapcsán a szintézis módját Az ábrán számozzuk a T₁₅ fragmens szintézisekor használt különböző nuklcotidokat. Az ábrán az alábbi rövidítéseket használjuk:

TPSTe: 2,4,6-triizopropil-benzol-szulfonil-tetrazol;

BSA: benzol-szulfonsav;

TLC: vékonyréteg-kromatográfía·,

HPLC: nagyfelbontású folyadék-kromatográfia;

DMT: 4,4’-dimetoxi-tritil-csoport

CE: 2-ciano-etil-csoport;

R: p-klór-fenil-csoport;

Bz: benzoilcsoport;

An: anizoilcsopoit;

iBu: izobutirilcsoport;

Py: piridín;

AcOH: ecetsav;

Et3N: trietil-amin.

mg (0,05 mmól) teljesen védett 4 tridezoxi-ribonukleotidot és 108 mg (0,1 mmól) 2 vegyületet az 5’-hi-1631

HU 202 587 Β roxil-csoporton kezelünk, a védőcsoport lehasítására. A reakciót úgy végezzük, hogy 2% benzol-szulfonsavval reagáltatjuk a vegyületeket, kloroform és metanol 7 : 3 arányú elegyében (10 és 20 ml, sorrendben). A reakciót 10 percen át 0 ’C hőmérsékleten végezzük. A reakció leállítására telített, vizes ammónium-bikarbonátoldatot adunk (2 ml) 25 ml kloroformmal extraháljuk, végül kétszer 10 ml vízzel mossuk az oldatot A szerves oldószeres fázist magnézium-szulfáttal vízmentesítjük, 5 ml térfogatúra töményítjük és petroléterrel (35-60 ’Cos frakció) kicsapjuk. A színtelen csapadékot centrifugálással összegyűjtjük és csökkentett nyomású térben szárítjuk, amiután megkapjuk a ó és 8 számú vegyületet. A termék a szilikagél vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálat [Merck 60 F254, kloroform és metanol 9 : 1 arányú elegye] homogén.

Az 7 és 5 jelű trimerek 270 mg-nyi (0,15 mmól), illetve 145 mg-nyi (0,075 mmól) mennyiségeit az 5 és 7 számú foszfo-diészter-származékaikká alakítjuk át úgy, hogy 25 percen át szobahőmérsékleten trietil-amin, piridin és víz 1: 3 :1 arányú elegyének 10 ml-ében reagáltatjuk. A reagensek eltávolítására rotavaporban desztillálunk, és a desztillációs maradékot háromszor 10 ml vízmentes piridinnel desztillálva szárítjuk. A 8 (0,05 mmól) és 7 trimert 50 mg (0,15 mmól) 2,4,6-triizopropil-benzol-szulfonil-tetrazollal vegyítjük 3 ml vízmentes piridinnel készült reakcióelegyben, majd az elegyet 2 órán át szobahőmérsékleten hagyjuk állni csökkentett nyomású térben. A vékonyréteg-kromatográfiás analízis szerint a 8 trimer 95%-a hexamerré alakul (úgy állapítjuk meg, hogy a 4,4’-dimetoxi-tritiI-csoportot 10%-os, vizes kénsavval permetezzük, és 60 ’C-on hevítve láthatóvá tesszük). 1 ml vizet adunk a reakcióelegyhez, és az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk. A piridint toluolos kiegészítés után desztillációval űzzük el, majd a 8 ml 2%-os benzol-szulfonsavval lehasítjuk az 5’-védócsoportot, ahogy azt a 4 és 2 trimerek előállítása kapcsán megadtuk.

A 70 terméket szilikagél oszlopon (Merck 60 H, 3,5 x 5 cm) tisztítjuk, kloroform és metanol 98; 2-95: 5 térfogatú elegyével végzett gradiens elucióval. A 70 te/méket tartalmazó frakciókat szárazra desztilláljuk.

Hasonlóképpen eljárva, az 5 trimert a 6 jelű vegyülethez kapcsoljuk, és a teljesen védett terméket szilikagélen közvetlenül tisztítjuk. Az utóbbi vegyületet a 3’végen védőcsoport hasítására a fentiek szerint eljárva trietil-amin, piridin és víz elegyében reagáltatjuk, amiután megkapjuk a 9 jelű fragmenst

Végül a 9 és 10 hexamereket 2 ml vízmentes piridinben 75 mg (0,225 mól) 2,4,6-triizopropil-benzol-szulfonil-tetrazol kondenzálószer jelenlétében összekapcsoljuk. A reakció 4 óra alatt zajlik le szobahőmérsékleten, ezután az elegyet rotavaporban desztilláljuk, és a desztillációs maradékot szüikagélen kromatografáljuk. A 160 mg súlyú 77 terméket petroléterrel csapjuk ki. A termék a vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálat szerint homogén. 20 mg 77 számú vegyületet 0,5 ml piridinben oldunk, és 7 ml tömény ammónium-hidroxiddal kezelünk, a védőcsoportok hasítására. A reakciót 60 ’C hőmérsékleten végezzük 8 órán áL Ezután 15 percen át szobahőmérsékleten 80%-os ecetsav-oldatban kezelünk. Az ecetsavat desztillációval eltávolítjuk, és a szilárd halmazállapotú desztillációs maradékot 4 ml 4%-os vizes ammónium-hidroxid-oldatban oldjuk, és az oldatot háromszor 2 ml etil-éterrel extraháljuk. A vizes fázist

1-2 ml térfogatúra töményítjük, és egy részét a 72 vegyület tisztítására nagynyomású folyadék-kromatográfiának vetjük alá. A legnagyobb csúcsnak megfelelő frakciókat összegyűjtjük (körülbelül 2 A^ egység), és 5 ml térfogatúra töményítjük. A végső 72 terméket Bio-gélen (P-2,1,5 x 100 cm méretű oszlop) kisózzuk. Az eluálást 20%-os, vizes etanollal végezzük. Az oldatot szárazra desztilláljuk, és 20 μΐ vízben szuszpendáljuk a desztülációsmaradékoLamikorddatotkapunk(A_2S<:10). A 72 vegyület szekvenciáját kétdimenziós szekvenciaanalízissel bizonyítjuk.

Ateljes timozinal gént 16 szintetikus oligonukleotidból állítjuk elő, a szomatosztatin előállítása kapcsán megadottak szerint eljárva [Itakura és munkatársai (1977)], eljárhatunk az inzulin [Goeddel és munkatársai (1979)] vagy a növekedési hormon [Goeddel és munkatársai (1979)], Natúré, 281,544, kapcsán leírtak szerint is.

10-10 pg mennyiségű T₂-T₁₅ oligonukleotidot (gamma-P³²)-adenozin-trifoszfáttal [New England Nuclear] kvantitativen foszforilezünk T4 polinukleotid-kináz enzimmel [Goeddel és munkatársai (1979)]. A kapott specifikus akti vitás 1 Ci/mmól. A radioaktivan jelzett fragmenseket 20% poliakril-amid/7 mól karbamid gélen elektrofoiézissel tisztítjuk, és az eluált fragmensek szekvenciáját kétdimenziós elektroforetikus homokromatográfiával bizonyítjuk [Jay és munkatársai, Nucleic Acids Rés., 7,331 (1974)]. Az analitikai méréseket kígyóméreggel részlegesen emésztett termékkel végezzük. A Tj és T₁₆ fragmenseket nem-foszforüezett alakban használjuk a nem kívánatos polimerizáció csökkentésére, ami a következő ligációs reakció során következhet be.

2-2 pg oligonukleotidot 4 fragmenst tartalmazó négy csoportban kapcsolunk össze (lásd a mellékelt 13. ábrát), a kapcsolást ismert módon T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázzal végezzül [Goeddel és munkatársai (1979), lásd előbb].

A reakcióterméket 15% poliakril-amidot tartalmazó gélen 7 mól karbamid jelenlétében elektroforézissel tisztítjuk [Maxam és Gilbert, PNAS, USA 77, 3455 (1977)]. A négy izolált terméket ligáljuk, és a reakcióelegyet 10% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézissel választjuk szét. A timozinal gén nagyságának megfelelő helyen lévő dezoxi-ribonukleinsavat (90-105 bázispár) elektroelucióval izoláljuk.

0,5 pg pBR322 plazmidot BamHI és EcoRI restrikciós endonukleázzal kezelünk, és a fragmenseket poliakril-amid gcl-elektroforézissel szeparáljuk. A nagy fragmenst elektroelucióval izoláljuk a gélről, és ezután a szintetizált dezoxi-ribonukleinsavhoz ligáljuk [Goeddel és munkatársai, Natúré, 281,544 (1979)].

A kapott eleggyel E. coli K12 294 sejteket transzformálunk. A transzformációs elegy 5%-át 20 pg/ml ampicillint tartalmazó LB lemezeken szélesztjük. A kapott négy ampicillinre rezisztens telep tetraciklinre érzékeny; ez azt jelenti, hogy a tetraciklin rezisztenciát meghatározó génbe épült be az adott dezoxi-ribonukleinsav szekvencia. A négy telepből izolált plazmid analízise szerint a pThal jellel jelzett tennék az alábbiakkal jellemezhető:

a) tartalmaz egy, a pBR322 plazmidban jelen nem lévő BglII helyet, ami a 11. ábrán bemutatottak szerint a timozinal gén jelentésére utal; továbbá:

b) tartalmaz a BamHI-EcoRI hasításakor keletkező, körülbelül 105 bázispárból álló fragmenst.

-1733

HU 202 587 Β

ApThal plazmid előállításának sematikus, nem méretarányos ábrázolását látjuk a mellékelt 13. ábrán, ahol a vastagon kihúzott vonal az 5’-foszfát-csoportokat jelzi.

3. A kezelt pThal és az LE' (d) fragmens reakciója A pThal plazmid ampicillin rezisztenciát meghatározó gént és egy olyan struktúrgént hordoz, amely az 5’-kódoló szál végén az EcoRI helyen és a 3’-vég BamHl helyén a timozinal génnel azonos. A timozin gén BglII helyet is tartalmaz. Az LE’ (d) fragmenst befogadni képes plazmid előállítására a pThal plazmidot EcoRI enzimmel emésztjük, majd dTTP és dATP jelenlétében Klenow polimeráz I enzimmel az EcoRI végeken tompa végeket alakítunk ki. A kapott terméket BglII enzimmel emésztve olyan lineáris dezoxi-ribonukleinsav fragmenshez jutunk, amely tartalmazza az ampicillin rezisztenciát meghatározó gént és ellenkező végein egy ragadós BglII szakaszt és egy tompa véget A termék recirkularizálható egy BglII ragadós véget és egy tompa véget tartalmazó LE’ (d) fragmenssel T4 ligáz jelenlétében. így kapjuk meg a pTrp24 jelű plazmidot

Ennek érdekében a tompa végligáció helyén EcoRI helyet állítunk elő.

C) A pSOM7A2A4 plazmid előállítása

ApTrp24 dezoxi-ribonukleinsavat BglII, majd EcoRI enzimmel hasítjuk, poliakril-amid gél-elektroforézist és elektroeluciót végzünk, amikor olyan fragmenst kapunk, amely LE’ (d) polipeptidet leíró kodonokkal, BglII ragadós véggel és a 3’-kódoló végének szomszédságában egy EcoRI ragadós véggel rendelkezik. Az LE’ (d) fragmenst a pSOM7A2 plazmid BglII helyére klónozhatjuk, amikor a triptofán promoter/operátor rendszer szabályozása alatt álló, kifejeződő polipeptid-szomatosztatin fúziós proteint meghatározó dczoxi-ribonukleinsavhoz jutunk.

Úgy járunk el, hogy

1. a pSOM7A2 plazmidot a triptofán promotcr/operátor renszerhez képest távolabb eső EcoRI hely hasítására részlegesen emésztjük EcoRI enzimmel, majd

2. megfelelően megválasztjuk a primer szekvenciát a kodon megfelelő leolvasási fázisban tartására, és egy EcoRI enzim által felismerhető hely újraalakítására.

pg pSOM7Á2 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat

200 μΐ alábbi összetételű pufferban oldunk:

mmól/1 trisz, pH = 7,5, mmól/1 magnézium-diklorid,

0,02% NP40 detergens és

100 mmól/1 nátrium-klorid.

A dezoxi-ribonukleinsavat 0,5 egység EcoRI enzimmel kezeljük. A reakcióelegyet 37 ’C hőmérsékleten tartjuk 15 percen át, majd fenollal, ezután kloroformmal extraháljuk, a terméket etanollal kicsapjuk és ezuátn BglII enzimmel emésztjük. A kapott nagyobb fragmenst poliakril-amid gél-elektroforézissel és elektroelucióval izoláljuk. Ez a fragmens tartalmazza az „LE’ (p)” kodonokat, mégpedig az LE’ polipeptid proximális végének megfelelő szakaszt. Ez a BglII helytől 5’-iranyban helyezkedik el. Ezt a fragmenst a fentiekben ismertetett LE’ (d) fragmcnshcz ligáljuk T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázzal, amikor a ρδΟΜ7Δ2Δ4 jelű plazmidot kapjuk meg. EztE. coli K12 294 sejtekbe transzformálva olyan fúziós proteint termelő törzshöz jutunk, amely termeli a teljes LE polipeptidet és a szomatosztatint; mégpedig a triptofán promoter/operátor rendszer szabályozása alatt.

F) Tetraciklin rezisztenciát meghatározó gén szomszédságában a 3'-végnél PstI szekvenciát és az 5'-végnél BglII szekvenciát hordozó lineáris dezoxi-ribonukleinsav előállítása

A pBR322 plazmidot Hindin enzimmel emésztünk, és a ragadós Hindin végeket SÍ nukleázzal hasítjuk. Az SÍ nukleázos kezelést úgy végezzük, hogy 10 pg Hindin enzimmel hasított pBR322 dezoxi-ribonukleinsavat az alábbi összetételű SÍ jelű puffer 30 pl-ében oldunk:

0,3 mól/1 nátrium-klorid,

1,0 mmól/1 cink-diklorid,

25,0 mmól/1 nátrium-acetát, pH = 4,5.

A reakcióelegyhez 300 egység S1 nukleázt adunk, és a reakciót 30 percen át végezzük 15 ’C hőmérsékleten. A reakció leállítására 1 pl alábbi összetételű, 30X S1 nukleázt leállító oldatot adunk:

0,8 mól trisz-bázis és

50,0 mmól etilén-diamino-tetraecetsav.

Fenollal, majd kloroformmal extraháljuk az elegyet, a termeket etanollal kicsapjuk és ezután az előzőekben megadottak szerint EcoRI enzimmel emésztjük. Poliakril-amid gél-elektroforézissel és az azt követő elektroelucióval izoláljuk a fragmenst, az EcoRI ragadós véggel és egy olyan tompa véggel rendelkezik, amelynek kódoló szálja timidin nukleotiddal kezdődik. Az S1 nukleázzal emésztett HindlII szekvencia timidinnel kezdődik, ez egy Klenow polimeráz I enzimmel kezelt BglII véghez kapcsolható úgy, hogy ligáció után a BglII enzim által felismerhető szekvencia újra létrejön.

Úgy járunk el, hogy az 5. példa C) pontja szerint előállított pSOM7A2 plazmidot BglII enzimmel emésztjük, és a kapott BglII ragadós végeket Klenow polimeráz I enzimmel feltöltjük a 4 dezoxi-nukleotid-trifoszfát jelenlétében. A kapott termékei EcoRI enzimmel hasítva, majd a kis fragmenst poliakril-amid gél-elektroforézissel és elektroelucióval tisztítva olyan lineáris dezoxiribonukleinsav fragmenshez jutunk, amely tartalmazza atriptofán promoter/operátor rendszert és a BglII helytől balra eső LE’ proximál is (közelebbi) kodonjait [LE ’ (p)].

A termék EcoRI felismerőhellyel és a BglII hely feltöltése miatt egy tompa véggel rendelkezik. Bár a BglII hely bázis-szekvenciája visszaáll az SÍ enzimmel emésztett Hindin tompa végligációja következtében. A két fragmenst T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz jelenlétében összekapcsoljuk, amikor pHKYlO jelű plazmidot kapunk, amit E. coli K12 294 sejtekbe transzformálva szaporítunk. A tetraciklinre rezisztens sejtek hordozzák a pHKY 10 plazmidot, ezeket szelektáljuk, és a plazmid dezoxi-ribonukleinsavat extraháljuk. A terméket BglII és PstI enzimmel emésztjük, poliakril-amid gél-elektroforézissel és elektroelúcióval izoláljuk a nagyobb fragmenst, amiután PstI és BglII ragadós végeket tartalmazó lineáris dezoxi-ribonukleinsavat kapunk. A pHKYlO plazmidból származó dezoxi-ribonukleinsav fragmens tartalmazza a replikációs origót, és így felhasználható annak a ρΗΙ7Δ4Δ1 plazmidnak az előállítására, amelyben jelen van a trp LE’ fúziós proteint meghatározó génszekvencia, és a trp promoter/operátor rendszer szabályozása alatt álló tetraciklin rezisztencia gén is.

-1835

HU 202 587 Β

G) A trppromoterloperaátor rendszert hordozó lineáris dezoxi-ribonukleinsav előállítása

Az 5. példa E) pontja szerint előállított pSOM7A2A4 plazmidot EcoRI enzimmel részlegesen, és Psű enzimmel teljesen emésztjük. A kapott fragmens tartalmazza a trp promoter/operátor rendszert, poliakril-amid gél-elektroforézist követő elektroelúcióval izoláljuk. EcoRI enzimmel részlegesen emésztünk, mivel így kapjuk meg azt a fragmenst amely a szomatosztatin proteint meghatározó gén 5’-végének közelében van hasítva, de nem hasadt az ampicillin rezisztencia gén és a trp promoter/operátor rendszer között levő EcoRI enzim által felismert szakasz mentén. Az ampicillin rezisztenciát meghatározó gén elveszett az ampicillin rezisztencia génen belül eső PstI felismerő hely vágása következtében, azonban az 5. példa F) pontja szerint előállított lineáris pHKYlO dezoxi-ribonukleinsav-származék ligálásakor ez a szekvencia helyreáll.

H) A proinzulin 32 N-terminális aminosavát kódoló szintetikus gén előállítása oligonukleotidot állítunk elő (lásd a II. táblázatot), a proinzulin első 32 aminosavját meghatározó gén előállításának első lépéseként. A 14. ábrán mutatjuk be a teljes előállított gén nukleotid-szekvenciáját //. táblázat

A humán proinzulin szintetikus oligonukleotidjai

Vegyület	Szekvencia
Hl	AATTCATGTT
H2	CGTCAATCAGCA
H3	CCTTTGTGGTTC
H4	TCACCTCGTTGA
H5	TTGACGAACATG
H6	CAAAGGTGCTGA
H7	AGGTGAGAACCA
H8	AGCTTCAACG
Bl	AGCTTTGTAC
B2	CTTGTTTGCGGT
B3	GAACGTGGTTTC
B4	TTCTACACTCCT
B5’	AAGACTCGCC
B6	AACAAGGTACAA
B7	ACGTTCACCGCA
B8	GTAGAAGAAACC
B9	AGTCTTAGGAGT
B10’	GATCCGGCG.

A 14. ábrán zárójelek között aláhúzva ábrázoljuk a szintetikus nuklaotidokaL Ezeket ismert módon állítjuk elő [Crea és munkatársai, J. Bioi. Chem., 250, 4592 (1978) és Itakura és munkatársai, J. Bioi. Chem., 97, 7327 (1975)]. Egyes oligonukleotidokat felhasználtak az előzőleg leírt humán inzulin B-láncát meghatározó gén előállítására [Crea és munkatársai, 1978 és Goeddel és munkatársai (1979)]. A B5’ és B10’ oligonukleotidok Hpall és terminális BamHI és EcoRI restrikciós helyeket tartalmaznak. A terminális felismerhető helyek klónozás céljára különösen alkalmasak.

A H1-H8 jelű, nyolc oligonukleotidot előzőleg a humán inzulin B-láncát meghatározó gén előállítására használták [Goeddel és munkatársai (1979)], ez tartalmazza a B-lánc génjének azt a részét, amely az 1-13. aminosavat határozza meg, tartalmazza továbbá az Nterminális metionin kodonját. A B-lánc génjének jobb felét a Bl, B2, B3, B4, B5\ B6, B7, B8, B9 és BIO’ sorszámú oligonukleotidokból állítjuk elő T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázzal végzett ligálással Goeddel és munkatársai szerint (1979) eljárva. A kapott fragmens kódolja a humán inzulin B-láncának 14-30. aminosavát, és az összekötő lánc első argininjét A génszekvenciában hasonló leolvasási fázisban egy Hpall restrikciós hely van beépítve, ugyanúgy helyezkedik el, mint a humán inzulin génben levő Hpall hely. A ligáit génfragmens poliakril-amidos gélelektroforézises tisztítása után elektroelúciót végzünk, és az izolált legnagyobb fragmenst pBR322 plazmidba építjük be Hindffl-BamHI hasítást követően. A kapott pBR3 jelű plazmidot E. coli K12 294 sejtekbe transzformáljuk. A plazmid ampicillin és tetraciklin antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát határoz meg, és tartalmazza a kívánt nukleotid szekvenciát

Ezután két fragmenst ligálunk, a pBR3 plazmid 58 bázispárból álló HindlII-BamHI fragmensét és a pBHl plazmid 46 bázispárból álló EcoRI-HindlQ fragmensét [lásd: Goeddel és munkatársai (1979)]. így olyan fragmenst kapunk, amely EcoRI és BamHI végekkel rendelkezik. Ezt a fragmenst EcoRI és BamHI enzimekkel hasított pBR322 plazmidba építjük be ismert módon, és a kapott pIB3 jelű plazmidot E. coli K12 294 sejtekbe transzformáljuk. Sokszorosítás és izolálást követően a pIB3 plazmidot EcoRI és Hpall restrikciós endonukleázokkal kezeljük egy olyan szintetikus génfragmens előállítására (lásd a 15. ábra, 1 fragmensét), amely meghatározza a proinzulin N-terminális aminosavait és a metionint. A szintetikus gént poliakril-amidon kivitelezett gél-elektroforézissel ismert módon izoláljuk.

I) A humán proinzulin 50 karboxil-termnális aminosavait meghatározó cDNS izolálása

A mellékelt 16. ábrán adjuk meg a cDNS előállásának sémáját. Az alábbi dezoxi-ribonukleinsav szekvenciát állítjuk elő: pCCGGATCCGGTTTuT. Ez a szekvencia tartalmaz egy BamHI enzim által felismert helyet, és egy körülbelül 20 tagból álló 3’-politimidilsavrészL A szekvenciát felhasználjuk a reverz transzkriptáz által vezérelt cDNS szintézishez. A prímért terminális dezoxi-nukleotidil-transzferázzal állítjuk elő [Enzo Biochem, 200 egység] 0,6 ml reakcióelegyben 1 gmól BamHldekanukleotid jelenlétében, 1,5 x 10* gmól TTP-vei. A reakciót 1 órán át 37 ’C hőmérsékleten végezzük Chang és munkatársai által leírt pufferban [Natúré, 275, 617 (1978)].

A humán inzulinóma szövetet az alábbi helyen szereztük bé: Institute für Diabetcsforschung, München, Nyugat-Ncmetország. A témában jártas szakemberek tudják, hogy a humán inzulinóma szövet hozzáférhető és több más forrásból beszerezhető. A humán inzulinóma szövetből a poli A hírvivő ribonukleinsav (2,5 gg) izolálható Ullrich és munkatársai szerint [Science, 196, 1313 (1977)]. Ez kétszálú cDNS molekulává alakítható át Wickens és munkatársai szerint [J. Bioi. Chem., 253, 2483 (1978)].

Úgy járunk el, hogy az alábbi összetételű, 80 μΐ tréfogatú reakcióelegyet 0 ’C hőmérsékleten előinkubálunk:

-1937

HU 202 587 Β mmól/1 trisz-hidro-klorid (pH = 8,3,42 C hőmérsékleten), mmól/1 kálium-klorid, mmól/1 magnézium-diklorid, mmól/1 β-merkapto-etanol, mmól/1 d-CCGGATCCGGTT_lgT primer és 1 mmól/1 dNTP.

Ezután reverz transzkriptázt adagolunk, és az. elegyet 15 percen át 42 *C hőmérsékleten inkubáljuk. A kapott ribonukleinsav-dezoxi-ribonukleinsav hibridet ismert módon denaturáljuk.

A komplementer cDNS szálat 150 μΐ alábbi összetételű reakcióelegyben szintetizáljuk:

mmól/1 trisz-hidro-klorid, pH = 8,3, mmól/1 kálium-klorid, mmól/1 magnézium-diklorid, mmól/1 β-merkapto-etanol, mmól/1 dNTP és egység Klenow polimeráz I.

Az elegyet 90 percen át 15 ’C hőmérsékleten inkubáljuk, majd az inkubálást 4 ’C hőmérsékleten 15 órán át folytatjuk. Ezután 2 órán át 1000 egység Sl nukleáz jelenlétében [Miles Laboratories, Elkhart, Indiana] 37 ’C hőmérsékleten emésztünk Wickens és munkatársai szerint (1978) eljárva.

A kapott 0,37 pg mennyiségű kétszálú cDNS terméket 8% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroférzissel tisztítjuk, és az 500 bázispárnál nagyobb fragmenseket eluáljuk. A fragmens 3’-végeihez terminális dezoxi-nukleotidil transzfcrázzal oligo-dezoxi-citidilsav végeket kapcsolunk Maizei szerint eljárva [Meth. Virol, 5, 180 (1971)]. A dC végű cDNS fragmenseket ezután pBR322 plazmidba építjük be, amit előzőleg PstI restrikciós enzimmel kezeltünk, és azután terminális dezoxi-nukleotidil transzferázzal dezoxi-guanidilsav véggel láttunk el. A kapott plazmidokkal E. coli K12 294 sejteket transzformálunk, és a kapott izolátumokat LB és TÉT táptalajon szélesztjük. A tetraciklinre rezisztens, de ampicillin antibiotikumra érzékeny telepeket izoláljuk, és bizonyítjuk a három PstI restrikciós hellyel rendelkező plazmidok jelenlétét Ez a restrikciós kép jelzi a proinzulin gén jelenlétét [Sures és munkatársai, Science, 208, 57 (1980)]. Egy plazmidot pHI104 jellel jelöltünk, ez egy 600 bázispárból álló beépített szakaszt tartalmaz, és adja a várt PstI restrikciós képet. Tartalmazza továbbá a cDNS preparálása során bevezetett 3 ’-poliA és poliGC szakasz között a BamHI helyet. A14. ábrán mutatjuk be a beépített szakasz bizonyos nukleotid szekvenciáját.

J) A humán proinzulint kódoló gén összeállítása

A humán proinzulint kódoló gén összeállításának sémáját a mellékelt 15. ábrán mutatjuk be. A 15. ábrán 1 számmal jelzett fragmens egy szintetikus génszegmens, amely a proinzulin első 31 aminosavját kódolja. Ezt 50 pg pIB3 plazmidból állítjuk elő, a fentiek szerint EcoRI és Hpall restrikciós endonukleázokkal hasítva. Ez a fragmenst tartalmaz továbbá egy mctionint kódoló ATG kodont a prepro inzulin preszekvenciája helyett.

A 32-86. aminosavakat és az mRNS molekula 3’-nem transzlatált régióját, illetve a transzlációs stopjelet tartalmazó cDNS gén szegmenst 40 pg pHI 104 plazmidból állítjuk elő BamHI és azt követő Hpall restrikciós enzimmel való hasítással. A két fragmenst poliakril-amid gél-elektroforézissel és az azt követő elektroelúcióval izoláljuk. A két génfragmenst ezután T4 dezoxi20 ribonukleinsav ligázzal 20 pl ligáz pufferban összekapcsoljuk. A reakciót 4 C hőmérsékleten végezzük 24 órán át. 50 pl vízzel hígítjuk az elegyet, és fenollal, majd kloroformmal ismert módon extraháljuk, és azután etanollal kicsapjuk a terméket.

A kapott dezoxi-ribonukleinsavat BamHI és EcoRI restrikciós enzimmel kezeljük, ezen felismerő helyek regenerálására és a génpolimerek eltávolítására. Az összeállt proinzulin gént poliakril-amid gélen kivitelezett elektroforézissel tisztítjuk, és pBR322 plazmidba építjük EcoRI és BamHI emésztést és T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázzal kivitelezett ligálással. A kapott dezoxi-ribonukleinsavat E. coli K12 294 sejtekbe transzformáljuk, és a kapott telepeket tetraciklin érzékenységre és ampicillin rezisztenciára vizsgáljuk.

Az egyik telepből izolált pHI3 plazmid tartalmazza a kívánt proinzulin gént, amit nukleotid szekvencia analízissel jellemzőnk.

K) A humán proinzulint tartalmazó kimer protein kifejezésére alkalmas plazmid előállítása

A teljes humán proinzulin gént, amely tartalmazza a metionint kódoló N-terminális kodont is, a pHI3 plazmidból izoláljuk EcoRI és BamHI restrikciós enzimes kezeléssel. A fragmenst gél-elektroforézissel tisztítjuk, és ezután T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázzal ligáljuk az

5. pléda G) pontja szerint előállított pSOM7A2A4 plazmidból származó Pstl-EcoRI részleges emésztéssel kapott fragmenshez, és az 5. példa F) pontja szerint kapott pHKYlO plazmid nagyobb Pstl-BglII fragmenséhez.

pg EcoRI és BamHI végekkel rendelkező komplet humán proinzulin gént, 4 pg pSOM7A2A4 Pstl-EcoRI (részleges) fragmenst és 1 pl pHKYlO Pstl-BglII fragmenst ligálunk T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázzal ligáláshoz használt pufferben, 4 ’C hőmérsékleten, 24 órán át. A ligáit dezoxi-ribonukleinsav eleggyel E. coli K12 294 sejteket transzformálunk. Ampicillin és tetraciklin antibiotikumok jelenlétében növekvő telepeket szelektálunk, és ezekben megtaláljuk a ρΗΙ7Δ4Δ1 plazmidot, amely olyan proteint fejez ki, amelynek molekulasúlya azonos a várt trp LE’-propinzulin fúziós peptid várt molekulasúlyának. A fenti proteint kifejező ρΗΙ7Δ4Δ1 plazmidot teljes mértékben jellemzünk mind a dezoxi-ribonukleinsav szekvencia megállapításával, mind pedig a beépült gén és a vektor dezoxi-ribonukleinsav restrikciós helyeinek vizsgálatával.

ΑρΗΙ7Δ4Δ1 plazmidot a mellékelt 15. ábrán mutatjuk be. A plazmid könnyen szelektálható, mivel az ampicillin és tetraciklin antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát meghatározó gén a klónozás során helyreállt.

6. példa

A pNM608 plazmid és az E. coli K12 RV308/pNM608 törzs előállítása

A) A ρΗΙ7Δ4Δ1 plazmid 253 bázispárból álló EcoRlHpalfragmensének előállítása pg ρΗΙ7Δ4Δ1 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat, 10 pl (10X) alábbi összetételű reakciópuffert, 80 pl vizet és 5 pl (5 egység) Hpal restrikciós enzimet keverünk:

100 mmól/1 trisz-hidro-klorid, pH = 7,

100 mmól/1 magnézium-diklorid, mmól/1 β-meikapto-etanol és

200 mmól/1 kálium-klorid.

A reakciót 1 órán át 37 ’C hőmérsékleten végezzük.

-2039

HU 202 587 Β

A reakció leállítására 5 percen át 70 *C hőmérsékleten inkubálunk. Ezután jégfiirdőben lehűtjük az elegyet, 12 μΐ 1 mólos trisz-hidro-klorid-oldatot, pH = 7,2, 7 μΐ vizet és 1 μΐ (10 egység) EcoRl restrikciós enzimet adunk hozzá. A kapott elegyet először 1 órán át 37 ‘C hőmérsékleten, majd ezután 5 percen át 70 *C-on inkubáljuk. Jégfürdőben lehűtjük az elegyet, és a kapott dezoxi-ribonukleinsavat fenollal és kloroform, izoamilalkohol 24 : 1 arányú elegyével extraháljuk, majd etanollal kicsapjuk.

Az előállítandó 253 bázispárból álló EcoRI-Hpal restrikciós fragmenst poliakril-amid gél-elektroforézissel és elektroelúcióval különítjük el, etanollal kicsapjuk, és a kicsapódott terméket 10 pl TE pufferban oldjuk, az oldatot pedig felhasználásig 0 ’C hőmérsékleten tároljuk.

B) A ρΗΓ7ΔΑΔ1 plazmid 34 bázispárból álló Hpal-Taql fragmensének előállítása pl (5X) alábbi összetételű EcoRl pufferban 20 pg ρΗΓ7Δ4Δ1 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat, 124 μΐ vizet és 4 pl (20 egység) EcoRl restrikciós enzimet inkubálunk 37 *C hőmérsékleten, 1 órán át:

250 mmól/I nátrium-klorid,

500 mmól/1 trisz-hidro-klorid, pH = 7,2, mmól/1 magnézium-diklorid, mmól/1 β-merkapto-etanol.

A reakció leállítására 5 percen át 70 ’C hőmérsékleten inkubáljuk az elegyet. A kapott 862 bázispárból álló EcoRl fragmenst 6% poliakril-amidot tartalmazó gélen végzett elektroforézissel és az azt követő elektroelúcióval izoláljuk. A terméket etanollal csapjuk ki. A fragmenst ezután 100 pl, 16 egység Hpal restrikciós enzimet tartalmazó Hpal pufferban oldjuk. 37 ’C hőmérsékleten inkubálunk 1,5 órán át, majd 7,5 egység Taql restrikciós enzimet adagolunk. Az inkubációt további 1,5 órán át folytatjuk, majd a fragmenseket ismert módon különítjük el 7,5% poliakril-amidot tartalmazó gélen. Az előállítani kívánt 34 bázispárból álló Hpal-Taql fragmenst elektroelúcióval és etanolos kicsapással különítjük el, majd 5 pl TE pufferban oldjuk.

C}ApBR322 plazmid emésztése EcoRl-Clal enzimekkel ’C hőmérsékleten 1 órán át inkubáljuk az alábbi összetételű reakcióelegyet pg pBR322 dezoxi-ribonukleinsav, pl Clal reakcióelegy, 100 mmól/1 trisz-hidro-klorid, pH = 7,4,

100 mmól/1 magnézium-diklorid, mmól/1 β-merkapto-elanol,

77,5 pl víz és 7,5 pl (15 egység) Clal restrikciós enzim.

Areakció leállítására 5 percen át 70 ’C hőmérsékleten tartjuk az elegyet Jégfürdőben lehűtjük, majd 12,5 pl 1 mólos trisz-hidro-klorid-oldatot, pH = 7,2, 6,25 pl 1 mólos nátrium-klorid-oldatot, 2,5 pl 0,1 mólos magnézium-diklorid-oldatotés 1 pl (10 egység) EcoRl restrikciós enzimet adagolunk hozzá. 1 órán át 37 ’C hőmérsékleten, majd 5 percen át 70 ’C-on inkubáljuk a reakcióelegyet. Jégfürdőbe lehűtjük, majd a kapott dezoxiribonukleinsavat 1% agarózt tartalmazó gélen elektroforézissel szétválasztjuk. A nagyobb fragmenst elúcióval izoláljuk, etanollal kicsapjuk és 20 pl TE pufferban oldjuk, majd felhasználhatóságig 0 ’C hőmérsékleten tároljuk.

D) Ligálás és transzformálás

A6. példa A) pontja szerint előállított 253 bázispárból álló EcoRI-Hpal fragmens 0,2 pg-ját, 0,5 pg, a 6. példa B) pontja szerint előállított Hpal-Taql fragmenst és a 6. példa C) pontja szerint előállított 0,1 pg EcoRI-Clal dezoxi-ribonukleinsavat ligálunk, és ezután E. coli K12 RV308 sejtekbe transzformálunk, a 2. plda D) pontja szerint eljárva.

A transzformánsok közül néhány, ahogy azt az agaróz gélen végzett elektroforézis [Maniatis és munkatársai (1982)] és más vizsgálatok mutatják, csak a 4,6 kb nagyságú plazmidot hordozzák. Az egyik ilyen transzformánst E. coli K12 RV308/pNM608 jellel jelölünk, szelektáljuk, ampicillint tartalmazó TY agáron szélesztjük, és ismert mikrobiológiai technikákat használva tenyésztjük. A pNM609 plazmid izolálás után forrása a ρΗΙ7Δ4Δ1 plazmid 287 bázispárból álló EcoRI-Clal (Taql) fragmensének.

7. példa

A pCZIOS.l plazmid és az E. coli K12 RV308lpCZ105.1 törzs előállítása

A) A pNM608 plazmid emésztése EcoRI-Clal enzimekkel, és a 0288 kb nagyságú EcoRI-Taql fragmens előállítása (ez azonos a ρΗ17Δ4Δ1 plazmid0,288 kb nagyságú EcoRI-Taqlfragmensével) pg pNM608 dezoxi-ribonukleinsavat inkubálunk 10 egység EcoRl és 10 egység Clal restrikciós enzimmel, 37 'C hőmérsékleten, 1 órán át, 50 pl alábbi öszszetételű só-pufferban:

mmól/1 nátrium-klorid,

100 mmól/1 trisz-hidro-klorid, pH = 7,5, mmól/1 magnézium-diklorid, mmól/1 β-merkapto-etanol.

pl 3 mólos nátrium-acetát-oldatot (pH = 7,0) adunk az elegyhez, majd a dezoxi-ribonukleinsavat 3 térfogat 100%-os etanollal kicsapjuk. A dezoxi-ribonukleinsav terméket 100 pl TE pufferban oldjuk, és felhasználásig 0 ’C hőmérsékleten tároljuk.

B) A dezoxi-ribonukleinsav linker szekvencia előállítása

Az alábbi linker szekvenciát állítjuk elő:

5’-CGACA ATG TTC CCA TTG GAG GAT GAT TAA ATG TTC CCA GCC ATG

3’---TGT TAC AAG GGT AAC CTC CTA

CTA ATT TAC AAG GGT CGG TAC

TCC TTG TCC GGC CTG TTT GCC AAC GCT GTGCT-3’

AGG AAC AGG CCG GAC AAA CGG TTG CGA C-----5’.

A szintézist Itakura és munkatársai (1977) és Crea és munkatársai (1978) módosított foszfo-triészter módszerével végezzük. A szintézis módszerét az 1. példában részleteztük.

C) Ligálás és transzformálás

A 7. példa B) pontjában megadott dezoxi-ribonukleinsav linker 20 pmólnyi mennyiségét, 1 pg pNM608 plazmid, 7. példa A) pontja szerint előállított fragmensét, és 0,5 pg pCZIOl plazmidból származó 10,2 kb nagyságú bamHI-EcoRI fragmenst, továbbá 1 pg, a 3.

-2141

HU 202 587 Β példa B) pontja szerint előállított, pCZIOl plazmidból származó 0,6 kb nagyságú BamHI-HgiAI fragmenst ligálunk. A 10,2 kb nagyságú BamHI-EcoRI fragmenst a 2. példa B) pontja szerint állítjuk elő, azzal a különbséggel, hogy az Xbal restrikciós enzim és a hozzátartozó puffer helyett EcoRI restrikciós enzimet és a megfelelő puffért használjuk.

A ligálást követően kapott plazmiddal E. coli K12 RV308 sejteket transzformálunk, a 2. példa D) pontja szerint eljárva.

A kapott transzformánsok közül néhány az agaróz gélen végzett elektroforézis [Maniatis és munkatársai (1982)] és más vizsgálatok szerint csak az adott 10,8 kb nagyságú plazmidot tartalmazzák. Egy ilyen transzformánst E. coli K12 RV308/pCZ 105.1 jellel szelektáltunk, ΊΎ agaron ampicillin jelenlétében szélesztettünk, és ismert mikrobiológiai technikákat használva tenyésztettünk. A kapott sejtek az SDS gél-elektroforézis, RIa és más vizsgálatok szerint kifejezik a metionin-szarvasmarha növekedési hormont, maximális szinten. Mivel a pCZ105.1 plazmid egy tcrmoindukálható, ún. runaway replikont tartalmaz, a metionin-szarvasmarha növekedési hormon maximális kifejeződése 37 ’C hőmérsékleten következik be.

8. példa

A pCZ105.2 plazmid és az E. coli K12 RV308/pCZ105.2 törzs előállítása

A 7. példa szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy az alábbi dezoxi-ribonukleinsav linker szekvenciát állítjuk elő a 7. példában megadott helyett:

5’-CGACA ATG TTC CCA TTG GAT GAT GAT TAA ATG TTC CCA GCC ATG

3’---TGT TAC AAG GGT AAC CTA CTA

CTA ATT TAC AAG GGT CGG TAC

TCC TTG TCC GGC CTG TTT GCC AAC GCT GTGCT-3’

AGG AAC AGG CCG GAC AAA GGG TTG CGA C-----5’.

A fenti linker szekvenciát Itakura és munkatársai (1977) és Crea és munkatársai (1978) szerint állítjuk elő. A szintézis módszerét részletesen szemléltettük az 1. példában.

A kapott, itt E. coli K12 RV308/pCZ105.2 jellel jelzett transzformánsokat ampicillint tartalmazó TY agaron szélesztjük, és ezután a pCZ105.2 plazmid termelésére és izolálására ismert módon tenyésztjük. A transzformánsok az SDS gél-elektroforézises, RIA és más vizsgálatok szerint nagy mennyiségben fejezi ki a metionin-szarvasmarha növekedési hormont. Mivel a pCZ105.2 plazmid tartalmazza a hőindukálható „elveszthető” (runaway) replikont, a metionin-szarvasmarha növekedési hormon kifejeződése maximális mértékben 37 *C hőmérsékleten következik be.

9. példa

A pCZIOó.l plazmid és az E. coli K12 RV308/pCZ106.1 törzs előállítása

A 7. példában megadottakat ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy az ott használt linker szekvencia helyett az alábbi dezoxi-ribonukleinsav szekvenciát használjuk:

5’-CGACC ATG GAT CAG GAG TAA ATG

TTC CCG GCT ATG TCC TTG

3’---TGG TAC CTA GTC CTC ATT TAC

AAG GGC CGA TAC AGG AAC

TCC GCC CTC TTT GCC AAC GCT GTGCT-3’ AGG CGG GAG AAA CGG TTG CGA C----5’.

A fentiekben megadott linker szekvenciát Itakura és munkatársai (1977) és Crea és munkatársai (1978) módszere szerint állítjuk elő. A fenti szintézis módszerét az

I. példában is szemléltettük.

Az itt E. coli K12 RV308/pCZ106.1 jellel jelzett transzformánsokat TY agaron szélesztjük, az agarba előzőleg ampicillint kevertünk. Ezután a pCZIOó.l plazmid termelésére és izolálására ismert módon tenyésztjük a törzset. A transzformánsok az SDS gélelektroforézises, RIA és más vizsgálatok szerint nagymértékben kifejezik a metionin-szarvasmarha növekedési hormont. Mivel a pCZ 106.1 plazmid egy hőindukálható ún. runaway replikont tartalmaz, a metioninszarvasmarha növekedési hormon kifejeződése 37 ’C hőmérsékleten maximális.

10. példa

ApCZ112.1 plazmidésazE. coliK12RV308!pCZ112.1 törzs előállítása

Az előállítást a 7. példa szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy az ott megadott linker szekvencia helyett az alábbi dezoxi-ribonukleinsav szekvenciát használjuk:

5’-CGACC ATG GAT GAT AAG TAA ATG TTT CCG GCT ATG TCC TTG

3’---TGG TAC CTA CTA TTC ATT TAC

AAA GGC CGA TAC AGG AAC

TCC GGC CTC TTT GCC AAC GCT GTGCT-3’ AGG CCG GAG AAA CGG TTG CGA C----5’.

Az itt megadott linker szekvenciát Itakura és munkatársai (1977) és Crea és munkatársai (1978) szerint állítjuk elő. A szintézis módszerét az 1. példában részletesen szemléltettük.

Az itt E. coli K12 RV308/pCZ112,l jellel jelzett transzformánsokat ampicillint tartalmazó TY agaron szélesztjük, és ezután a pCZ 112.1 plazmid termelésére és izolálására ismert módon tenyésztjük. A transzformánsok az SDS gél-elektroforézises, RIA és más vizsgálatok szerint nagy mennyiségben fejezik ki a metionin-szarvasmarha növekedési hormont. Mivel a pCZ112.1 plazmid hőindukálható ún. runaway véggel replikont tartalmaz, a metionin-szarvasmarha növekedési hormon kifejeződése 37 ’C hőmérsékleten maximális.

II. példa

A pCZl 12.2 plazmid és az E. coli K12 RV308ípCZ112.2 törzs előállítása

Az előállítást a 7. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy az ott megadott linker szekvencia helyett az alábbi dezoxi-ribonukleinsavszekvenciát használjuk:

5’-CGACC ATG GAT GAT AAG GAG TAA ATG TTT CCG GCT ATG TCC

3’---TGG TAC CTA CTA TTC CTC ACC

TAC AAA GGC CGA TAC AGG

-2243

HU 202587 Β

TTG TCC GGC CTC TTT GCC AAC GCT GTGCT-3’

AAC AGG CCG GAG AAA CGG TTG CGA C-----5’.

A fenti linker szekvenciát Itakura és munkatársai (1977) és Crea és munkatársai (1978) módszerével állítjuk elő. A fenti szintézis módszert az 1. példában részletesen szemléltettük.

Az E. coli K12 RV308/pCZ112.2 jellel jelzett transzformánsokat ampicillint tartalmazó TY agaron szélesztjük, és ezután a pCZl 12.2 plazmid termelésére és izolálására ismert módon tenyésztjük. A transzformánsok az SDS gél-elektroforézises, RIA és más vizsgálatok szerint nagymértékben kifejezik a metionin-szarvasmarha növekedési hormont. Mivel a pCZ112.2 plazmid egy hőindukálható ún. runaway replikont tartalmaz, a metionin-szarvasmarha növekedési hormon maximális kifejeződése következik be 37 ’C hőmérsékleten.

12. példa

A pCZIOOO plazmid és az E. coli K12 RV308U000 törzs előállítása

A 3. példában megadottakat ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a 3. példa C) pontjában megadott linker szekvencia helyett az alábbi dezoxi-ribonukleinsav linker-szekvenciát használjuk:

5’-CTAGAGGGTATTAATA ATG GAT CAG GAG GAT TAA ATG TTT CCT GCT

3’-----TCCCATAATTAT TAC CTA GTC

CTC CTA ATT TAC AAA GGA CGA

ATG TCC TTG TCC CGC CTG TTT GCC AAC GCT GTGCT-3’

TAC AGG AAC AGG CCG GAC AAA CGG TTG CGA C-----5’.

A fenti linker-szekvenciát Itakura és munkatársai (1977) és Crea és munkatársai (1978) módszere szerint állítjuk elő. A szintézis módszerét az 1. példában részletesen szemléltettük.

Az E. coli K12 RV308/pCZ1000 jellel jelzett transzformánsokat ampicillint tartalmazó TY agaron szélesztjük, és ezután a pCZIOOO plazmid termelésére és izolálására ismert módon tenyésztjük. A transzformánsok az SDS gél-elektroforézises, RIA és más vizsgálatok szerint nagymértékben kifejezik a metionin-szarvasmarha növekedési hormont.

Mivel a pCZIOOO hőindukálható runaway replikont tartalmaz, a metionin-szarvasmarha növekedési hormon kifejeződése maximálisan 37 ‘C hőmérsékleten következik be.

13. példa

A pCZIOOO.l plazmid ésazE. coli K12RV308lpCZ1000.1 törzs előállítása

Az előállítást a 3. példában megadottakat megismételve végezzük, azzal a különbséggel, hogy a 3. példa C) pontjában megadott linker-frekvencia helyett az alábbi dezoxi-ribonukleinsav linker-szekvenciát használjuk: 5’-CTAGAGGGTATTAATA ATG GAT CAG TAA ATG TTT CCG GCT ATG TCC

3’-----TCCCATAATTAT TAC CTA GTC

ATT TAC AAA GGC CGA TAC AGG

TTG TCC GGC CTG TTT GCC AAC GCT GTGCT-3’

AAC AGG CCG GAC AAA CGG TTG CGA C-----5’.

A megadott linker-szekvenciát Itakura és munkatársai (1977) és Crea és munkatársai (1978) módszere szerint álhtjuk elő. A szintézis módszerét az 1. példában részletesen szemléltettük.

Az E. coli K12 RV308/pCZ1000.1 jellel jelzett transzformánsokat TY agaron szélesztjük, amely táptalajba előzőleg ampicillint adtunk. Ezután a pCZIOOO. 1 plazmid termelésére és izolálására ismert módon tenyésztjük a sejteket. A transzformánsok az SDS gélelektroforézises, RIA és más vizsgálatok szerint nagymértékben fejezik ki a metionin-szarvasmarha növekedési hormont Mivel a pCZIOOO. 1 plazmid egy hőindukálható ún. runaway replikont tartalmaz, a metioninszarvasmarha növekedési hormon kifejeződése maximálisan 37 ’C tenyésztési hőmérséklet mellett következik be.

14. példa

A pCZl 060 plazmid és az E. coli K12 RV308lpCZ1060 törzs előállítása

A 3. példában megadottakat ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a 3. példa C) pontjában megadott linker-szekvencia helyett az alábbi dezoxi-ribonukleinsav linker-szekvenciát használjuk:

5’-CTAGAGGGTATTAATA ATG GAT GAT AAG TAA ATG TTC CCA GCC ATG

3’-----TCCCATAATTAT TAC CTA CTA

TTC ATT TAC AAG GGT CGG TAC

TCC TTG TCC GGC CTG TTT GCC AAC GCT GTGCT-3’

AGG AAC AGG CCG GAC AAA CGG TTG CGA C-----5’.

A fenti linker-szekvenciát Itakura és munkatársai (1977) és Crea és munkatársai (1978) ismert módszere szerint állítjuk elő. A szintézis módszerét az 1. példában részletesen szemléltettük.

Az E. coli K12 RV308/pCZ1060jellel jelzett transzformánsokat ampieillint tartalmazó TY agaron szélesztjük, és ezután a pCZl060 plazmid termelésére és izolálására ismert módon tenyésztjük a törzset. A transzformánsok az SDS gél-elektroforézises, RIA és más vizsgálatok szerint nagy mennyiségben fejezi ki a metioninszarvasmarha növekedési hormont. Mivel a pCZ1060 plazmid termoindukálható, ún. runaway replikont tartalmaz, a metionin-szarvasmarha növekedési hormon maximális kifejeződése 37 ’C tenyésztési hőmérsékleten következik be.

75. példa

A pCZl 120 plazmid és az E. coli KI2 RV308/pCZ1120 törzs előállítása

A 3. példában megadottakat ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a 3. példa C) pontjában ismertetett linker-szekvencia helyett az alábbi dezoxi-ribonukleinsav linker-szekvenciát használjuk:

5’-CTAGAGGGTATTAATA ATG GAT GAT AAG TAA ATG TIT CCG GCT ATG

3’----TCCCATAATTAT TAC CTA CTA TTC

ATT TAC AAA GGC CGA TAC

TCC TTG TCC GGC CTG TTT GCC AAC GCT GTGCT-3’

-2345

HU 202 587 Β

AGG AAC AGG CCG GAC AAA CGG TTG CGA C-----5’.

A fenti linker-szekvenciát Itakura és munkatársai (1977) és Crea és munkatársai (1978) szerint állítjuk elő. A szintézis módszerét az 1. példában részletesen ismertettük.

Az E. coli K12 RV308/pCZ1120 jellel jelzett transzformánsokat ampicillint tartalmazó TY agáron szélesztjük, és ezután a pCZl 120 plazmid előállítására és izolálására ismert módon tenyésztjük. A transzformánsok az SDS gél-elektroforézises, RIA és más vizsgálatok szerint nagy mennyiségben fejelik ki a metionin-szarvasmarha növekedési hormont Mivel a pCZ1120 plazmid hőindukálható, ún. runaway replikont tartalmaz, a metionin-szarvasmarha növekedési hormon termelése 37 ’C hőmérsékleten maximális.

16. példa

A pCZ1140 plazmid és az E. coli K12 RV308lpCZ1140 törzs előállítása

A) A pNM575 plazmid emésztése BamlII-FnuDIl enzimekkel, és a OÁ kb nagyságú BamHI-FnuDII fragmens létrehozása

Az 1. példa B) pontja szerint előállított pNM575 plazmid dezoxi-ribonukleinsav 5 gg-nyi mennyiségét 50 gl alábbi összetételű só-pufferban inkubáljuk 10 egység BamHI és 10 egység FnuDII restrikciós endonukleáz jelenlétében, 1 órán át, 37 ’C hőmérsékleten:

mmól/1 nátrium-klorid, mmól/1 trisz-hidro-klorid, pH = 8, mmól/1 magnézium-diklorid, mmól/1 β-merkapto-etanol.

gl 7,0pH-jú 3 mólos nátrium-acetát-oldatot adagolunk, majd a dezoxi-ribonukleinsavat 2 térfogat 100%os etanollal kicsapjuk és elkülönítjük. Az előállított dezoxi-ribonukleinsavat 100 gl TE pufferban oldjuk, és felhasználásig 0 ’C hőmérsékleten tároljuk.

B) A dezoxi-ribonukleinsav linker-szekvencia előállítása

Az alábbi szekvenciát állítjuk elő Itakura és munkatársai (1977) és Crea és munkatársai (1978) szerint eljárva. A szintézis módszerét az 1. példában részletesen szemléltettük.

5’-CTAGAGGGTATTAATA ATG TTC CCA TTG GAG GAT GAT TAA ATG TTC

3»-----TCCCATAATTAT TAC AAT GGT

AAC CTC CTA CTA ATT TAC AAG

CCA ACC ATT CCC ΊΤΑ TCC AGG CTT TTT GAC AAC GCT ATG CTC CG-3’

GGT TGG TAA GGG AAT AGG TCC GAA AAA CTG TTG CGA TAC GAG GC-5’.

C) Ligálás és transzformálás

Az alábbi dezoxi-ribonukleinsavakat ligáljuk: 20 pmól, a 16. példa B) pontja szerint előállított dezoxi-ribonukleinsav linkért, 1 gg, a 16 példa A) pontja szerint előállított BamHI-FnuDII fragmens-keveréket, és 0,5 gg, a 3. példa A) pontja szerint előállított 10,2 kb nagyságú BamHI-Xbal fragmenst A kapott plazmiddal a 2. példa D) pontja szerint eljárva E. coli K12 RV308 sejteket transzformálunk.

A transzformánsok egy része az agaróz gél-elektroforézises vizsgálat [Maniatis és munkatársai (1982), lásd előbb] csak a kívánt 10,8 kb nagyságú plazmidot tartalmazzák. Egy ilyen transzformánst E. coli K12 RV308/pCZl 140 jellel jelöltünk, szelektáltunk, ampicillint tartalmazó TY agaron szélesztünk, és ezután ismert mikrobiológiai technikákat használva tenyésztünk. A kapott sejtek az SDS gél-elektroforézises, RIA és más vizsgálatok szerint nagymértékben kifejezik a metioninhumán növekedési hormont. Mivel a pCZ1140 plazmid egy hőindukálható, ún. runaway replikont tartalmaz, a metionin-humán növekedési hormon maximális kifejeződése következik be 37 ’C tenyésztési hőmérsékleten.

Claims

1. Eljárás egy szelektálható és autonóm replikálódó rekombináns dezoxi-ribonukleinsav expressziós vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy ligálunk

1. egy transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciát,

2. egy riboszóma kötőhelyet és egy peptidet vagy polipeptidet kódoló nukleotid-szekvenciát tartalmazó dezoxi-ribonukleinsav linkért, ahol a peptidet vagy polipeptidet kódoló szekvencia egy transzlációs stop jelet tartalmaz az adott peptid vagy polipeptid karboxil-terminális végét leíró nukleotid-triplet szomszédságában és leolvasási irányban, és ettől a stop jeltől leolvasási irányban és közvetlen szomszédságban egy transzlációs start jelet és

3. egy funkcionális polipeptidet kódoló nukleotid-szekvenciát, ahol a funkcionális polipeptidet leíró szekvencia a karboxil-tenminális véget leíró nukleotid-triplet közvetlen szomszédságában és leolvasási irányban egy transzlációs stop jelet tartalmaz.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő alkotórészeket ligáljuk.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 2-20 aminosavból álló peptidet vagy polipeptidet kódoló nukleotid-szekvenciát tartalmazó DNS linkért ligálunk.

4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy alábbi aminosav sorrendű peptidet:

MET-PHE-PRO-LEU-GLU-ASP-ASP,

MET-GLU-ASP-ASP, MET-GLU-ASP-ASP-LYS, MET-ASP-ASP-LYS,

ΜΕΤ-GLU-ASP-GLN vagy MET-ASP-GLN, ahol

MET metionin,

PHE fenil-alanin,

PRO prolin,

LEU leucin,

GLU glutaminsav,

ASP aszparaginsav és

GLN glutamin, kódoló nukleotid-szekvenciát tartalmazó DNS linkért ligálunk.

5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a transzkripciós aktivációs szekvenciaként az E. coli triptofán vagy E. coli lipoprotein génjének transzkripciós aktivációs szekvenciáját ligálunk.

6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a transzkripciós aktivációs szekvenciaként egy

-2447

HU 202 587 Β vagy tandem elhelyezkedésű, több E. coli transzkripciós aktivációs szekvenciát ligálunk.

7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy transzkripciós aktivációs szekvenciaként az E. coli triptofán transzkripciós aktivációs szekvenciát ligálunk.

8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy funkcionális transzlációs aktivációs szekvenciát tartalmazó peptidet vagy polipeptidet tartalmazó DNS linkért ligálunk.

9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan linkért ligálunk, ahol a funkcionális polipeptidet kódoló szekvencia szarvasmarha növekedési hormont, humán növekedési hormont, humán pioinzulint kódoló szekvencia.

10. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás a pCZ114 plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy a pCZIOl plazmid 10(2 kb nagyságú BamHI-Xbal fragmensét egy alábbi nukleotid-szekvenciájú dezoxi-ribonukleinsav linkért:

5’-CTAGAGGGTATTAATA ATG TTG GAG GAT GAT AAA ATG TTC CCA

3’-----TCCCATAATTAT TAC AAC CTC

CTA CT A ATT TAC AAG GGT

GCC ATG TCC TTG TCC GGC CTG TTT GCC AAC GCT GTGCT-3’

CGG TAC AGG AAC AGG CCC GAC AAA

CGG TTG CGA C-----5’, és a pCZIOl plazmid 0,6 kb nagyságú BamHI-HgiAI fragmensét ligáljuk.

11. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás a pCZIOl.l plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy a pCZIOl plazmid 10,2 kb nagyságú BamHI-Xbal fragmensét, az alábbi nukleotid szekvenciájú dezoxi-ribonukleinsav linkért*

5’-CTAGAGGGTATTAATA ATG TTC CCA TTG GAT GAT GAT TAA ATG TTC

3’-----TCCCATAATTAT TAC AAG GGT

AAC CTA CTA CTA ATT TAC AAG

CCA GCC ATG TCC TTG TCC GGC CTG TTT GCC AAC GCT GTGCT-3’

GGT CGG TAC AGG AAC AGG CCG GAC

AAA CGG TTG CGA C-----5’ és a pCZIOl plazmid 0,6 kb nagyságú BamHI-HgiAI fragmensét ligáljuk.

12. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás a pCZIOOO plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy a pCZIOl plazmid 10(2 kb nagyságú BamHI-Xbal fragmensét az alábbi nukleotid szekvenciájú dezoxi-ribonukleinsav linkért:

5’-CTAGAGGGTATTAATA ATG GAT CAG GAG GAT TAA ATG TTT CCT

3’-----TCCCATAATTAT TAC CTA GTC

CTC CTA ATT TAC AAA GGA

GCT ATG TCC TTG TCC GGC CTG TTT GCC AAC GCT GTGCT-3’

CGA TAC AGG AAC AGG CCG GAC AAA

CGG TTG CGA C-----5’ és a pCZIOl plazmid 0,6 kb nagyságú BamHI-HgiAI fragmensét ligáljuk.

13. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás a pCZIOOO. 1 plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy a pCZIOl plazmid 10,2 kb nagyságú BamHI-Xbal' fragmensét az alábbi nukleotid szekvenciájú dezoxi-ribonukleinsav linkért:

5’-CTAGAGGGTATTAATA ATG GAT CAG TAA ATG TTT CCG GCT ATG

3’-----TCCCATAATTAT TAC CTA GTC

ATT TAC AAA GGC CGA TAC

TCC TTG TCC GGC CTG TIT GCC AAC GCT GTGCT-3’

AGG AAC AGG CCG GAC AAA CGG TTG CGA C-----5’, és a pCZIOl plazmid 0,6 kb nagyságú BamHI-HgiAI fragmensét ligáljuk.

14. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás a pCZ1060plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy a pCZIOl plazmid 10,2 kb nagyságú BamHI-Xbal fragmensét az alábbi összetételű nukleotid szekvenciájú dezoxi-ribonukleinsav linkért

5’-CTAGAGGGTATTAATA ATG GAT GAT AAG TAA ATG TTC CCA GCC

3’-----TCCCATAATTAT TAC CTA CTA

TTC ATT TAC AAG GGT CGG

ATG TCC TTG TCC GGC CTG TIT GCC AAC GCT GTGCT-3’

TAC AGG AAC AGG CCG GAC AAA CGG TTG CGA C----5’, és a pCZIOl plazmid 0,6 kb nagyságú BamHI-HgiAI fragmensét ligáljuk.

15. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás a pCZ1120 plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy a pCZIOl plazmid 10(2 kb nagyságú BamHI-Xbal fragmensét az alábbi nukleotid szekvenciájú dezoxi-ribonukleinsav linkért

5’-CTAGAGGGTATTAATA ATG GAT GAT AAG TAA ATG TTT CCG GCT

3·-----TCCCATAATTAT TAC CTA CTA

TTC ATT TAC AAA GGC CGA

ATG TCC TTG TCC GGC CTG TIT GCC AAC GCT GTGCT-3’

TAC AGG AAC AGG CCG GAC AAA CGG TTG CGA C-----5’, és a pCZIOl plazmid 0,6 kb nagyságú BamHI-HgiAI fragmensét ligáljuk.

16. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás a pCZ105.1 plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy a pNM608 plazmid EcoRI-Clal fragmensét a pCZIOl plazmid 10,2 kb nagyságú BamHI-Xbal fragmensét egy alábbi nukleotid szekvenciájú dezoxi-ribonukleinsav linker molekulát

5’-CGACA ATG TTC CCA TTG GAG GAT GAT TAA ATG TTC CCA GCC

3>---TGT TAC AAG GGT AAC CTC CTA

CTA ATT TAC AAG GGT CGG

ATG TCC TTG TCC GGC CTG TTT GCC AAC GCT GTGCT-3’

17. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás a pCZ105.2 plazmid előállítására, azzal jellemezve,

-2549

HU 202 587 Β hogy a pNM608 plazmid EcoRI-Clal emésztés után kapott fragmensét, a pCZ 101 plazmid 10,2 kb nagyságú BamHI-Xbal fragmensét, az alábbi nukleotid szekvenciájú dezoxi-ribonukleinsav linkért:

5’-CGACA ATG TTC CCA TTG GAT GAT GAT TAA ATG TTC CCA GCC

3’---TGT TAC AAG GGT AAC CTA CTA

CTA ATT TAC AAA GGT CGG

ATG TCC TTG TCC GGC CTG TTT GCC AAC GCT GTGCT-3’

18. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, a pCZIOő.l plazmid EcoRI-Clal emésztéssel kapott fragmensét, a pCZIOl plazmid 10,2 kb nagyságú BamHI-EcoRI fragmensét, az alábbi nukleotid szekvenciájú dezoxi-ribonukleinsav linker molekulát:

5’-CGACC ATG GAT CAG GAG TAA ATG TTC CCG GCT ATG TCC

3’---TGG TAC CTA GTC CTC ATT TAC

AAG GGC CGA TAC AGG

TTG TCC GCC CTC TTT GCC AAC GCT GTGCT-3’

AAC AGG CGG GAG AAA CGG TTG CGA C-----5’, és a pCZIOl plazmid 0,6 kb nagyságú BamHI-HgiAI fragmensét ligáljuk.

19. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás a pCZ112.1 plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy a pNM608 plazmid EcoRI-Clal emésztéssel kapott fragmensét, a pCZ 101 plazmid 10,2 kb nagyságú BamHI-EcoRI fragmensét, az alábbi nukleotid szekvenciájú dezoxi-ribonukleinsav linkért:

5’-CGACC ATG GAT GAT AAG TAA ATG TTT CCG GCT ATG TCC

3’---TGG TAC CTA CTA TTC ATT TAC

AAA GGC CGA TAC AGG

TTG TCC GGC CTC TTT GCC AAC GCT GTGCT-3’

AAC AGG CCG GAG AAA CGG TTG CGA C-----5’, és a pCZIOl plazmid 0,6 kb nagyságú BamHI-HgiAI fragmensét ligáljuk.

20. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás a pCZ112.2 plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy apNM608 plazmid EcoRI-Clal emésztéssel kapott fragmensét, a pCZIOl plazmid 10,2 kb nagyságú BamHI-EcoRI fragmensét, az alábbi nukleotid szekvenciájú dezoxi-ribonukleinsav linker molekulát:

5’-CGACC ATG GAT GAT AAG GAG TAA ATG TTT CCG GCT ATG

3’---TGG TAC CTA CTA TTC CTC ACC

TAC AAA GGC CGA TAC

TCC TTG TCC GGC CTC ITT GCC AAC GCT GTGCT-3’

AGG AAC AGG CCG GAG AAA CGG TTG CGA C-----5’, és a pCZIOl plazmid 0,6 kb nagyságú BamHI-HgiAI fragmensét ligáljuk.

21. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás a pCZ 1140 plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy a pCZIOl plazmid 10,2 kb nagyságú BamHI-Xbal fragmensét, az alábbi nukleotid szekvenciájú dezoxi-ribonukleinsav linker molekulát:

5’-CTAGAGGGTATTAATA ATG TTC CCA TTG GAG GAT GAT TAA ATG

3’-----TCCCATAATTAT TAC AAG GGT

AAC CTC CTA CTA ATT TAC

TTC CCA ACC ATT CCC TTA TCC AGG CTT TTT GAC AAC GCT ATG AAG GGT TGG TAA GGG AAT AGG TCC GAA AAA CTG TTG CGA TAC

CTC CG-3’

GAC GC-5’, és a pNM575 plazmid BamHI-FnuDIl emésztéssel kapott fragmensét ligáljuk.

22. Eljárás a pCZIOl plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy a pIM-I’-A3 plazmid Xbal-BamHI fragmensét és a pNM789B plazmid Xbal-BamHI fragmensét ligáljuk.

23. Eljárás szelektálható és autonóm replikálódó rekombináns dezoxi-ribonukleinsav expressziós vektornál transzformált prokariota gazdasejt előállítására, azzal jellemezve, hogy egy prokariota gazdasejtet valamely 1. igénypont szerint előállított vektorral transzformálunk.

24. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vektorként egy plazmiddal transzformálunk.

25. A 23. vagy 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan vektorral transzformálunk, melynek peptidet vagy polipeptidet kódoló szekvenciája az alábbi peptideket határozza meg:

MET-PHE-PRO-LEU-GLU-ASP-ASP, MET-GLU- ASP-ASP-LYS

MET-ASP-ASP-LYS, MET-GLU-ASP-GLN vagy

MET-ASP-GLN, ahol

MET metionin,

PHE fenil-alanin,

PRO prolin,

LEU leucin,

GLU glutaminsav,

ASP aszparaginsav,

GLN glutamin.

26. A 23-25. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan vektorral transzformálunk, melynek funkcionális polipeptidet kódoló szekvenciája szarvasmarha növekedési hormont, humán növekedési hormont vagy humán proinzulint határoz meg.

27. A 23-26. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan vektorral transzformálunk, melynek funkcionális polipeptidet kódoló szekvenciája egy biológiailag aktív polipeptidet határoz meg.

28. A 23-27. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vektorként pCZ114, pCZIOl.1, pCZIOOO, pCZIOOO.l, pCZIOÓO, pCZ1120, pCZ105.1, pCZ105.2, pCZIOő.l, pCZ112.1, pCZ112.2 vagy pCZl 140 plazmidot transzformálunk.

29. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként E. coli-t transzformálunk.

30. A 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy E. coli K12 RV308 törzset transzformálunk.

-2651

HU 202 587 Β

31. Eljárás funkcionális polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) egy prokarióta gazdasejtet az 1-21. igénypontok báráielyike szerinti rekombináns dezoxi-ribonukleinsav expressziós vektorral transzformálunk, és

b) a transzformált sejtet a génkifejeződéshez szükséges körülmények között tenyésztjük.

32. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként E. coli-t transzformálunk.

33. A 32. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, 10 hogy transzformált sejtként E. coli K12 RV308/pCZl 14, E. coli K12 RV308/pCZ10l.l, E. coli K12 RV308/pCZ1000, E. coli K12 RV308/pCZ1000.1, E. coli K12 RV3O8/PCZ1O6O, E. coli K12 5 RV308/pCZl 120, E. coli K12 RV3O8/pCZ 105.1, E. coli K12 RV3O8/pCZ 105.2, E. coli K12 RV308/pCZ106.1, E. coli K12 RV308/pCZ112.1, E. coli K12 RV308/pCZ112.2 vagy E. coli K12 RV308/pCZ1140 törzseket tenyésztünk.