HU218269B - Új transzlációs aktiváló szekvencia - Google Patents

Új transzlációs aktiváló szekvencia Download PDF

Info

Publication number
HU218269B
HU218269B HU9203981A HU9203981A HU218269B HU 218269 B HU218269 B HU 218269B HU 9203981 A HU9203981 A HU 9203981A HU 9203981 A HU9203981 A HU 9203981A HU 218269 B HU218269 B HU 218269B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
plasmid
sequence
approximately
dna
phdm
Prior art date
Application number
HU9203981A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9203981D0 (en
HUT65816A (en
Inventor
Charles Lee Hershberger
Jane Larowe Sterner
Original Assignee
Eli Lilly And Co.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eli Lilly And Co. filed Critical Eli Lilly And Co.
Publication of HU9203981D0 publication Critical patent/HU9203981D0/hu
Publication of HUT65816A publication Critical patent/HUT65816A/hu
Publication of HU218269B publication Critical patent/HU218269B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C12N15/73—Expression systems using phage (lambda) regulatory sequences

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Programmable Controllers (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

A jelen találmány egy új transzlációs aktiválószekvenciát tartalmaz,mely a szóban forgó polipeptidtermékek magas szintű expressziójáraalkalmas. A transzlációs aktiválószekvenciát tartalmazó rekombinánsDNS-exp- ressziós vektorok elsősorban a humán proinzulin és a humánproinzulinanalógok humán inzulinprekurzor-mo- lekuláinakexpressziójára alkalmasak. ŕ

Description

A találmány egy új transzlációs aktiválószekvenciára vonatkozik.
Számos prokarióta és eukarióta gén nagy mennyiségben expresszálódik a prokariótákban, például az Escherichia coliban. Általában a klónozott gén transzkripciója és transzlációja hatásos riboszóma-kötőhelyeivel és erős promoterével rendelkező, sokkópiás vektorokat alkalmaznak [Masui, Y., Coleman, J., és Inouye, M. (1983) Experimental Manipulation of Gene Expression, ed. Inouye, M. (Academic, New York), pp. 15-32; Crowl, R., Seamans, C., Lomedico, P., és McAndrew, S. (1985) Gene 38:31-38]. Ugyanakkor ezekkel a vektorokkal a különböző eukarióta génekre nézve a génexpresszió erőteljesen változik. Kismértékű expressziót tulajdonítottak az E. coli proteázok fehérjedegradációjának [Emerick, A. W., Bertolani, B. L., Ben-Bassat, A., White, T. J., és Konrad, M. W. (1984) Bio/Technology 2:165-168] vagy a heterológ génszekvenciákat tartalmazó mRNS-ek hatástalan transzlációs iniciációjának [Ray, Ρ. N. és Pearson, M. L. (1974) J. Mól. Bioi. 85:163-175; Ray, Ρ. N. és Pearson, M. L. (1975) Natúré (London) 253, 647-650; Kelley, R. L., és Yanofsky, C. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:3120-3124; Nagai, K. és Thorgesen, H. C. (1984) Natúré (London) 309, 810-812; Varadarajan, R., Szabó, A. és Boxer, S. G. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5681-5684]. Számos tanulmány említette, hogy a transzláció iniciációjának hatásossága a Shine-Dalgamo (SD) szekvencia és a 16S rRNS közötti komplementaritás mértékétől, az SD-szekvencia és az iniciációs kodon távolságától, valamint ennek az „ablak”-régiónak a nukleinsavszekvenciájától függ [Shine, J. és Dalgamo, L. (1975) Natúré (London) 254, 34-38; Gold, L., Pribnow, D., Schneider, T., Shineding, S., Singer, B. S. és Stormo, G. D. (1981) Annu. Rév. Microbiol. 35:365-403; Stromo, G. D., Schneider, T. D. és Gold, L. M. (1982) Nucleic Acids Rés. 10:2971-2996; Kozák, M. (1983) Microbiol. Rév. 47:1-45; Hűi, A., Hayflick, J., Dinkelspiel, K. és deBoer, H. A. (1984) EMBO J. 3:623-629; Shepard, M. G., Yelverton, E. és Goeddel, D. V. (1982) DNA 1:125-131; deBoer, H. A. Hűi, A., Comstock, L. J., Wong, E. és Vasser, M. (1983) DNS 2:231-235; Whitehom, E. A., Livak, K. J. és Petteway, S. R., Jr. (1985) Gene 36:375-379], Egyértelmű, hogy a transzláció hatékonysága az mRNS 5’ le nem fordított területének külső SD-szekvenciájától és a fehérjekódoló terület 5’-végének szekvenciájától is függ [Stanssens, P., Remaut, E. és Fiers, W. (1985) Gene 36:211-223; Roberts, T. M., Kacich, R. és Ptashne, M. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:760-764; Gold, L., Stormo, G., és Saunders, R. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7061-7065], illetve az mRNS 3’ le nem fordított területétől.
Ezeknek a megfigyeléseknek az összehangolása céljából a transzláció gátlását javasolták a helyi másodlagos szerkezet SD-szekvenciát tartalmazó területeivel, és/vagy az AUG startkodonnal úgy, hogy a riboszómák ne tudják iniciálni a transzlációt [Gheysen, D., Iserentant, D. és Fiers, W. (1980) Gene 9:1-12; Schwartz, M., Roa, M. és Debarbouille, M. (1981)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2937-2941; Hall, M. N., Gabay, J., Debarbouille, M. és Schwartz, M. (1982) Natúré (London) 295, 616-618; Das, A., Urbanowsky, J., Weissbach, H., Nestor, J., és Yanofsky, C. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2879-2883; Berkhout, B. és van Duin, J. (1985) Nucleic Acids Rés. 13:6955-6967], Az ilyen másodlagos szerkezetek képződésével indokolhatjuk a metionil szarvasmarhanövekedésihormon (Met-bGH) expresszió gyengülését annak nagy mennyiségű natív kodonjával [George, H. J., L’Italien, J. J., Pilacinski, W. P., Glassman, D. L. és Kizyzek, R. A. (1985) DNS 4:273-281; Seeburg, P. H., Sias, S., Adelman, J., deBoer, H. A., Hayflick, J., Jhurani, P., Goeddel, D. V. és Heynecker, H. L. (1983) DNS 2:37-45]. Ennek az alapvető problémának a megoldására Seeburg és társai a szarvasmarha-növekedésihormon (bGH) gén 5’-végén néhány bázis kicserélésé: tervezték, így az expresszált humán növekedési hormon (hGH) gén 5 ’-végéhez hasonló szekvenciát hoztak léire. Hasonlóképpen George és társai a bGH génben 13 kodon kicserélése után nagymértékű expresszióról számoltak be (az összes sejtfehérje 15%-a). Ezeket a közelítéseket a fehérjék aminosavszekvenciája megvédésének igénye korlátozza. A policisztronikus expressziós rendszereket úgy hozták létre, hogy a fenti korlátok elkerülhetők legyenek.
Az egyszálú mRNS-fajtákból származó egynél több polipeptid expresszióját policisztronikus expressziónak nevezzük. Az ilyen policisztronikus rendszerek jól ismertek a vírusok és a baktériumok körében.
A policisztronikus expressziós rendszerek létrehozása a prokariótasejtek heterológ polipeptidtermékei expressziója céljából is alkalmas.
A policisztronikus expressziós rendszerek jellegzetessége egy első cisztron, melyet a nagy hatékonyságú transzlációs iniciációhoz választunk ki, és egy második cisztron, mely az első cisztronnal azonos irányban helyezkedik el, és a kívánt polipeptidterméket kódolja. Az első cisztron nagy transzlációs iniciációs hatékonysága a második cisztron expressziója során magasabb szintet eredményez, mint amit az első cisztron távolléte esetében érnénk el.
A policisztronikus expressziós rendszerek jellemzői az alábbiak: egy promoter, mely a policisztronikus mRNS expresszióját irányítja, egy vagy több riboszóma-kötőhely, az egyes cisztronok transzlációs iniciácios kodonjai és az egyes cisztronok transzlációs termináeiós kodonjai. A szóban forgó polipeptidtermékek expressziós szintje függ a promoter hosszától, a pollen ztronikus üzenet riboszóma-kötőhelyeinek hatékonyságától és a transzlációs iniciációs helyeknek a riboszóma-kötőhelyekhez viszonyított elhelyezkedésétől.
A jelen találmány egy új transzlációs aktiválószekvenciát tartalmaz, mely a szóban forgó polipeptidtermékek magas szintű expressziójára alkalmas. Az említett új transzlációs aktiválószekvencia szekvenciája (SEQ ID 1):
SEQ ID 1: ATCAGATCTATTAATAATG
A „transzlációs aktiválószekvencia” kifejezés a jelen találmányban egy DNS-szekvenciára vonatkozik,
HU 218 269 Β mely a messenger RNS-transzkripció során a prokariótasejt riboszómái által könnyíti meg a mRNS transzlációját.
A jelen találmány szerinti transzlációs aktiválószekvenciát tartalmazó rekombináns DNS-vektorokat létrehoztuk. A jelen találmány szerinti transzlációs aktiválószekvenciát tartalmazó rekombináns DNS-vektorok a szóban forgó polipeptidtermékek magas szintű expressziója céljára alkalmasak. A transzlációs aktiválószekvenciát tartalmazó rekombináns DNS-expressziós vektorok elsősorban a humán proinzulin és a humán proinzulinanalógok humán inzulinprekurzor-molekuláinak expressziójára alkalmasak. A jelen találmány szerinti transzlációs aktiválószekvencia alkalmassága a szóban forgó polipeptidtermékek, mint például a humán proinzulin, magas szintű expressziójára a molekuláris biológia jelentős előnye.
Az ábrák rövid ismertetése
Az 1. ábra a pCZR125 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét mutatja be.
A 2. ábra a pHPR91 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét mutatja be.
A 3. ábra a pHDM163 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét mutatja be.
A 4. ábra a pHDM 164 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét mutatja be.
Az 5. ábra a pHDM119 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét mutatja be.
A 6. ábra a pHDM121 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét mutatja be.
A 7. ábra a pHPR97 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét mutatja be.
A 8. ábra a pHPR104 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét mutatja be.
A 9. ábra a pHDM126 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét mutatja be.
A 10. ábra a pHDM133 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét mutatja be.
All. ábra a pHDM132 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét mutatja be.
A 12. ábra a pHDM 157 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét mutatja be.
A 13. ábra a pHDM136 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét mutatja be.
A 14. ábra a pHDM181 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét mutatja be.
A 15. ábra a pHDM128 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét mutatja be.
A 16. ábra a pHDM151 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét mutatja be.
A 17. ábra a pHDM152 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét mutatja be.
A 18. ábra a pHDM153 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét mutatja be.
A 19. ábra a pHPR106 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét mutatja be.
A 20. ábra a pHDM146 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét mutatja be.
A 21. ábra a pHDM 154 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét mutatja be.
A 22. ábra a pHDM147 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét mutatja be.
A 23. ábra a pHDM148 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét mutatja be.
A 24. ábra a pHDM 159 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét mutatja be.
A 25. ábra a pHDM 167 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét mutatja be.
A 26. ábra a pHDM 168 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét mutatja be.
A 27. ábra a pHDM 174 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét mutatja be.
A 28. ábra a pHDM 125 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét mutatja be.
A 29. ábra a pHDM144 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét mutatja be.
A 30. ábra a pH DM131 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét mutatja be.
A jelen találmány szerinti transzlációs aktiválószekvenciát egy hagyományos, két cisztronból álló expressziós rendszerben végbemenő 20 bázispár méretű szekvencia spontán deléciója során fedeztük fel. A 20 bázispár méretű szekvencia spontán deléciója egy rekombináns DNS-expressziós vektort eredményezett, mely feltűnően nagy mennyiségben termelt humán proinzulinanalógokat, és melyet a parenterális két cisztronból álló expressziós rendszerben a második cisztron kódol. A 20 bázispárból álló deléció (d20) DNS-szekveaciája az alábbi:
A fenti nukleotidszekvencia a Sequence ID 2, de a Sequence ID 2 a fenti szekvenciának csak az érzékeny szala (sense strand). A fenti szekvenciát a parenterális ké: cisztronból álló expressziós rendszer, és a 20 bp (d20) deléciója során keletkezett vektor DNS-szekvencit analízisével határoztuk meg.
A Sequence ID 2-nek megfelelő kétszálú DNS-szekvenciát a d20 deléciós terület és a számos restrikciós endonukleázhely szemléltetésére mutattuk be. A Sequence ID 2-nek megfelelő kétszálú DNS-szekvencia területe, melyet d20-ként jelöltünk, a parenterális két cisztronból álló expressziós vektorban levő 20 bp méretű deléció, mely a jelen találmány szerinti transzlációs ak’iválószekvenciát alkotja.
A Sequence ID 2-nek megfelelő kétszálú DNS-szekvencia 5’-területe (balra), amint fent említettük, megfelel a kmbda-104 promotemek, melyet az alábbi példákban is bemutatunk. A Sequence ID 2-re hivatkozva az eredeti, illetve a parenterális két cisztronból álló expressziós vektorról az alábbi információkat tudjuk. A parenterális, kél cisztronból álló expressziós vektor a fent ismertetett delta-20 régióban (d20) egy riboszóma-kötőhelyet alkalmaz. A parenterális plazmidban az első cisztron riboszóma-kötőhelye a TAGA-szekvencia, ami a d20 régió belsejében helyezkedik el. így a Sequence ID 2-hivatkozva látható, hogy a d20 régió deléciója során a létrejövő szekvencia az ATCAGATCTATTAATAATG szekvencia (Sequence ID 1), ami a jelen találmány szerinti transzlációs aktiválószekvenciának felel meg.
A Sequence ID 2 DNS-szekvenciája azt mutatja, ho+y számos olyan restrikciósendonukleáz-hasítási
HU 218 269 Β hely van, mely ezen a szekvencián helyezkedik el. A Sequence ID 2-n a fent ismertetett restrikciós endonukleáz-helyeket hivatkozás céljából soroltuk fel. A régión belül a restrikciósendonukleáz-hasítási helyek gyakorisága és változatossága a jelen találmány szerinti transzlációs aktiválószekvenciát tartalmazó, genetic engineering technikával előállított rekombináns DNS-expressziós vektorok széles körű megközelítését teszi lehetővé. A jelen találmány szerinti transzlációs aktiválószekvenciát tartalmazó rekombináns DNS-expressziós vektorokat az ATG alkalmazza a transzlációs aktiválószekvencia 3’-végén (jobb) mint a szóban forgó polipeptidtermékek expressziójának iniciációs kodonját. A jelen találmány szerinti rekombináns DNSexpressziós vektorok egy transzkripciós aktiválószekvenciát tartalmaznak, mely működőképesen kapcsolódik egy, a jelen találmány szerinti transzlációs aktiválószekvenciához, azzal a megkötéssel, hogy a transzlációs aktiválószekvencia működőképesen kapcsolódik egy, a szóban forgó polipeptidterméket kódoló DNS-szekvenciához. A szakmai gyakorlattal rendelkezők számára egyértelmű, hogy a jelen találmány szerinti transzlációs aktiválószekvenciák mind az egy, mind a két cisztronból álló expressziós rendszerekben alkalmazhatók. A Sequence ID 1 szekvenciáját mint a transzlációs aktiválószekvencia mRNS-szekvenciájával egyenértékű DNS-szálat expresszáljuk. A szakmai gyakorlattal rendelkezők számára egyértelmű, hogy DNS-szinten kétszálú DNS található, és a transzlációs aktiválószekvencia transzkripciója egy egyszálú mRNS-t eredményez, melyben a DNS-timidinjét uracillal helyettesítjük.
A transzlációs aktiválószekvenciák alkalmazása a szóban forgó polipeptidtermékek magas szintű expressziójának megkönnyítésére azt igényli, hogy a transzlációs aktiválószekvenciát a szóban forgó polipeptidterméket kódoló szekvenciával működőképesen kapcsoljuk. A szakmai gyakorlattal rendelkezők számára egyértelmű, hogy a transzlációs aktiválószekvenciák a messenger RNS-szekvenciája és a riboszómák közötti kapcsolat elősegítése útján működnek, és így lehetővé teszik a messenger RNS-t kódoló régiók fehérjévé történő transzlációját. így a szóban forgó polipeptidterméket kódoló szekvenciához működőképesen kapcsolt transzlációs aktiválószekvencia esetén a transzlációs aktiválószekvenciának a messenger RNS-szekvencia 5’-végén kell elhelyezkedni a szóban forgó polipeptidtermékek kódolásához.
Amennyiben a jelen találmány szerinti transzlációs aktiválószekvenciát kétcisztronos esetben alkalmazzuk, a transzlációs aktiválószekvencia 3’-végének (jobb) az ATG-je az első cisztron iniciációs kodonjaként funkcionál, míg a szóban forgó polipeptidterméket kódoló szekvenciák a második cisztron kódolórégióját foglalják el. A szakmai gyakorlattal rendelkezők számára egyértelmű, hogy amennyiben a jelen találmány szerinti transzlációs aktiválószekvenciát egycisztronos rendszerben alkalmazzuk a szóban forgó polipeptidtermékek - melyek az aminosavak aminoterminálisaként metionint tartalmaznak - termelésére, a szóban forgó polipeptidteimék kódolószekvenciáját genetic engineering eljárássá kell kezelni a metioningyökök N-terminális-redundanciájának csökkentése céljából. A transzkripciós aktiválószekvenciák változatossága a szóban forgó polipeptidterméket kódolószekvenciához működőképesen kapcsolódó, a jelen találmány szerinti transzlációs aktiválószekvenciát tartalmazó mRNS-ek transzkripciójának létrehozására alkalmas. A transzkripciós aktiválószekvenciákat a jelen találmány esetében mint az ilyen transzkripciós aktiválószekvenciák 3’-végén elhelyezkedő messenger RNS-szekvenciák transzkripcióját okozó DNS-szekvenciákat definiálhatjuk. A transzkripciós aktiválószekvenciák mind konstitutív, mind indukálható promotereket tartalmaznak. Az indukálható promoterek a definíció szerint az operonok, vagy a szabályozható transzkripciós aktiválószekvenciák alkotói. A szakmai gyakorlattal rendelkezők számára egyértelmű, hogy számos transzkripciós aktiválószekvencia lenne alkalmas a jelen találmány szerinti transzlációs aktiválószekvenciát tartalmazó messenger RNS-ek expresszálására. A regulátorkontroll alatt álló, vagy más szavakkal az indukálható transzkripciós aktiválószekvenciák előnyösek a jelen találmány céljaira. Ilyen, a jelen találmány céljaira alkalmas indukálható transzkripciós aktiválószekvenciák vagy promoterek a trp promoter, a tac promoter, és a lac promoter. Hawley, D. K. és McClure, W. R. [(1983) Nucleic Acids Research 11: 2237-2255], valamint Hawley, D. K. és Reynolds, R. P. [(1983) Nucleic Acids Research 15: 2343-2361] az E. coliban működő és a jeler találmány céljaira alkalmas promoterekről számoltál be.
Az alább bemutatásra kerülő 1. táblázat egy humán proinzulin- (HPI) analóg (MY-HPI) expresszióját irányító lambda-fág pL eredetű sorozatot alkalmazó rekoinbináns DNS-expressziós sorozat fermentációs hatásait mutatja be.
1. táblázat
A d20 hatása az MY-HPI-termelésre E. coli RV308-ban
Plazmid Tetraciklinrcziszten- cia-gcn Promoter d20 Száraz tömeg, g/1 Fajlagos aktivitás, %
pHDM126 parenterális pl04 van 13,1 10,9
pHDM133 parenterális pl04 nincs 23,1 3,2
pHDM147 dBam dBcl pl04 van 16,7 6,1
pHDM148 dBam dBcl pl 04 nincs 22,6 4,9
HU 218 269 Β
1. táblázat (folytatás)
Plazmid Tetracikiinrczisztcn- cia-gcn Promoter d20 Száraz tömeg, g/1 Fajlagos aktivitás, %
pHDM 153 dBam dB 1 p97 van 8,3 7,4
pHDM 144 dBam dBc 1 p97 nincs 8,9 8,3
pHDM 154 dBam dBc 1 pl06 van 16,7 5,3
pHDM 146 dBam dBc 1 pl06 nincs 13,3 6,1
pHDM167 dBam dBc 1 pl59 van 19,9 0,18
pHDM 168 dBam dBc 1 pl59 nincs 24,6 0,07
pHDM151 dBam dBcl p Syn 3 van 19,2 6,8
pHDM 152 dBam dBcl p Syn 3 nincs 26,7 1,5
Az 1. táblázat adatait úgy hoztuk létre, hogy a jelen találmány szerinti transzlációs aktiválószekvenciát alkalmazó expressziós vektorok összehasonlíthatók legyenek a minden egyéb szempontból azonos (kivéve abban, hogy a HPI-expresszió irányítására parenterális, két cisztronból álló expressziós rendszert alkalmaznak) plazmidokkal. Az 1. táblázat adatai száraz tömegre és fajlagos aktivitásra vonatkoznak. A száraz tömeg a fermentorban levő összes biomassza térfogategységre eső része a fermentáció végén. A fajlagos aktivitás az MY-HPI-ként visszanyert összes biomassza (száraz tömeg) %-ában kifejezett humán proinzulinaktivitás mutatója. Az 1. táblázat adatai szerint a módosított Pl04, Pl59 és P Syn 3 lambda-pL promoterek alkalmazása rendkívül magas szintű proinzulinanalóg-expressziót eredményez a Sequence ID 1 transzlációs aktiválószekvenciával a P97 és a Pl06 promoterekhez képest. Ennek megfelelően a Pl04, Pl59 és P Syn 3 promoterek előnyösek a jelen találmány szerinti transzlációs aktiválószekvenciát tartalmazó mRNS-ek transzkripciójára. A Pl04 promoter különösen előnyös a jelen találmány szerinti transzlációs aktiválószekvencia transzkripciójának irányítására. Az 1. táblázat adatai a jelen találmány szerinti transzlációs aktiválószekvencia alkalmazását mutatják be a Met-Tyr humán proinzulin termelésében.
A jelen találmány szerinti transzlációs aktiválószekvenciát tartalmazó expressziós vektorok sokaságát állítottuk elő más humán inzulinok expressziójához. A jelen találmány szerinti transzlációs aktiválószekvenciát tartalmazó expressziós vektorok létrehozását a továbbiakban részletesen ismertetjük.
A pHDM126 plazmid, mely a jelen találmány szerinti transzlációs aktiválószekvenciát tartalmazza, egy előnyös expressziós vektor a Met-Tyr humán proinzulin (Met-HPI) termelésében. A jelen találmány leírásában az aminosavakat a konvencionális hárombetűs jelekkel jelöltük vagy a szakmai gyakorlattal rendelkezők körében jól ismert egybetűs szimbólumokkal.
A 6. példa a pHDM 126 plazmid szerkezetét ismerteti. A pHDM126 plazmid a pHDM133 plazmidtól csak annyiban különbözik, hogy a pHDM126 plazmidból a d20 régió hiányzik, míg a pHDM 133 plazmidban jelen van. A húsz bp méretű deléció, melyet az Xbal-nek vélt rész Xbal hasításra való alkalmatlanságával detektáltunk, egyidejűleg nagyobb mennyiségű MY-HPItermelt.
A pHDM 181 plazmid a Met-Arg humán proinzulin előnyös expressziós vektora. A pHDM181 plazmid létrehozását a 9. példában ismertetjük. A pHDM181 plazmid a jelen találmány szerinti transzlációs aktiválószekvencia alkalmazásával magas szintű Met-Arg-HPI-expressziót eredményez. A pHDM 174 plazmid a MetPhe humán proinzulin előnyös expressziós vektora. A pHDM 174 plazmid létrehozását a 10. példában ismertetjük. A pHDM 126, a pHDM181 és a pHDM 174 plazmidok elsősorban az általuk kódolt humán proinzuiin N-terminális dipeptidextenziójában különböznek egymástól. A humán proinzulin és a humán proinzulin analógok N-terminális dipeptidextenziója lehetővé teszi a szóban forgó szemléltető polipeptidtermékek prokariótákban, például E. coliban történő expresszióját. Az N-terminális extenziók diamino-peptidáz I-gyel könynyen eltávolíthatók, így ezek humán proinzulinjait, illetve analógjait kapjuk. A pHDM 126, a pHDM181 és a pH DM 174 plazmidok abban hasonlítanak egymáshoz, hogy mindegyikük tartalmazza az alábbiakat: a jelen találmány szerinti transzlációs aktiválószekvenciát; egy lambda-pL eredetű transzkripcionális aktiválószekvenciát; egy, a cI857 hőérzékeny lambda-represszorfehérjét kódoló gént, mely a lambda-pL fág eredetű transzkripcionális aktiválószekvenciák által irányított gének expresszióját szabályozza; a ROP gént, mely a rekombináns DNS-expresszió során a replikációs origóból származó pBR322 plazmid alkalmazásával a plazmid kópiaszámát ellenőrzi; egy tetraciklinrezisztencia-gént, mely szelektálható markert biztosít; egy lambda-fág eredetű transzkripcionális aktiválószekvenciát; és egy a pBR322 plazmiJból származó replikációs origót.
Számos lambda-pL promotert (transzkripcionális aktiválószekvencia) állítottunk elő, melyeket az alábbi példákban ismertetünk. A lambda-pL 104 (Pl04) a jelen találmány szerinti humán inzulinprekurzor-expreszsziós vektorok előnyös transzkripcionális aktiválószekvenciája a vad típusú lambda-pL promoterhez képest, a Pl04 promotert alkalmazó expressziós vektorok fokozott stabilitása következtében. A szakmai gyakorlattal rendelkezők számára egyértelmű, hogy a jelen talál5
HU 218 269 Β mány céljaira számos más bakteriális promoter is alkalmazható lenne. A jelen találmány szerinti transzlációs aktiválószekvenciát tartalmazó mRNS-ek irányítására az indukálható promoterek előnyösek.
A lambda-cI857 represszort a 4.506,013 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás ismerteti, melyet 1985. március 19-én jegyeztek be. A lambdacI857 egy hőérzékeny represszor. A hő hatására indukálható vektorok, például a pHDM126, a pHDM181 és a pHDMl 74 a lambda-cI857 represszort a szóban forgó polipeptidtermékek expresszióját irányító Pl04 promoter szabályozására alkalmazzák.
A tetraciklinrezisztencia-gént a jelen találmány szerinti előnyben részesített vektorok szelektálható markereként alkalmazzák. A találmány szerinti vektorok létrehozása során alkalmazott tetraciklinrezisztenciagén eredeti forrása a pBR322 plazmid volt. A pBR322 plazmid a szakmában jól ismert. Lásd Bolivár és társai, (1977) Gene 2, 95-113. A pBR322 plazmid a New England Biolabs (Inc. 32 Tozer Rd., Beverly, MA 01915-5510) cégtől szerezhető be. A dBam dBcl-gyel jelölt tetraciklinrezisztencia-gén az 1. táblázatban egy olyan tetraciklinrezisztencia-gén, melyben a BamHI és a Belli restrikciós helyeket a tetraciklinrezisztencia-fehérje kódolt aminosavszekvenciájának megváltoztatása nélkül távolítottuk el.
A jelen találmány szerinti vektorok megszerkesztése során az E. coli replikációs origó (replicon; Őri) eredeti forrása a pBR322 plazmid volt. A pBR322 eredetű replikációs origó előnyös a jelen találmány szerinti replikációs origó céljára. A pBR322 plazmid eredetű replikációs origó a ROP génnel együtt megközelítőleg 10-30 plazmidmásolatot eredményez sejtenként.
Számos E. coli törzs alkalmas a jelen találmány szerinti vektorok gazdasejtjének. A kísérleti példák a jelen találmány szerinti vektorok létrehozása során alkalmazott törzseket mutatják be. A jelen találmány szerinti vektorok létrehozása során előnyös gazdasejt az E. coli DH5a (Bethesda Research Laboratories) és az E. coli MM294 (ATCC 31446). A szóban forgó polipeptidtermékek fermentációja során előnyös gazdasejt az E. coli RV308 (NRRL B-15624). A jelen találmány szerinti vektorok gazdasejtjének további E. coli törzseket is alkalmazhatunk, így például, korlátozások nélkül, az alábbiakat: E. coli C600RM, melyre általában mint C600-ra hivatkozunk (ATCC 33525), és E. coli JM109 (ATCC 53323).
A jelen találmány szerinti expressziós vektort tartalmazó E. coli RV308 transzformánsok tenyésztésére az „L-broth” tápközeg a leginkább előnyös.
A megfelelő szakmai gyakorlattal rendelkezők számára egyértelmű, hogy a jelen találmány számos szóban forgó polipeptidtermék expresszálására alkalmas. A pHDM126, a pHDM181 és a pHDM174 szemléltető expressziós vektorok a találmány szerinti transzlációs aktiválószekvenciát alkalmazzák a humán prolnzulinanalógok magas szintű expressziója eléréséhez. A Sequence ID 2 DNS számos restrikciósendonukleáz-helyet tartalmaz, melyek úgy helyezkednek el, hogy lehetővé váljon a plazmidok - így apHDM126, a pHDM181 és a pHDM174 - humán inzulinprekurzorait kódoló strukturális gének kicserélése a szóban forgó polipeptidtermékeket kódoló szekvenciával.
A nukleotidkémia és a molekuláris biológia a szintetikus gének, linkerek és regulátorszekvenciák létrehozásának teljes mértékben általános módját teszi lehetővé. Továbbá számos helyen rendelésre készítenek szintetikus DNS-termékeket. Amennyiben a megfelelő szakmai gyakorlattal rendelkező dolgozó maga kívánja a jelen találmány szerinti kódolószekvenciát megszintetizálni, a laboratóriumi eljárás az alábbi helyen található: Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publisher, 1988; a továbbiakban Current Protocols in Molecular Biology. A „Current Protocols in Molecular Biology”-ban a 2.11.1-2.11.15 fejezet az oligonukleotidszintézist ismerteti, a 2.12.1-2.12.4 fejezet az oligonudeotidtisztítást ismerteti, és a 8.0.3-8.4.6 fejezet a gének létrehozásának eljárását ismerteti. Az oligonuklectldszintézishez szükséges készülékek számos cégtől szerezhetők be.
A szóban forgó polipeptidtermékeket a jelen találmányban általános orvosi és állatgyógyászati alkalmazásra definiáltuk. így a szóban forgó polipeptidtermékek, melyek a jelen találmány céljaira megfelelnek, az alábbiak lehetnek: szarvasmarha-növekedési hormon, humán növekedési hormon, humán inzulin A lánc, humán inzulin B lánc, humán inzulinprekurzorok, beleértve az itt említett humán inzulinprekurzort, a humán preproinzulint éppúgy, mint más molekulákat, melyek eredendően, illetve enzimes vagy kémiai kezelés eredményeképpen inzulinszerű aktivitással rendelkeznek [lásd Brange, J. és társai, Diabetes Care (1990) Vol. 13, Ne. 9, 923-954; és 4.916.212 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás], τ-interferon, β-interferon, α-interferon, urokináz, humán szövet plazminogénaktivátor, humán interleukin 1 a, humán interleukin 1β humán interleukin 2, humán interleukin 3, humán interleukin 4, humán granulocita makrofágkolónia-stimi láló faktor, humán eritroprotein, humán C protein, humán inzulinszerű növekedési faktor I, humán inzulinszerű növekedési faktor II, szarvasmarhanövekedésihoimon-kibocsátó faktor, humán növekedésihormonkibocsátó faktor és hasonlók.
Az alábbiakban bemutatásra kerülő példák a jelen találmányt szemléltetik anélkül, hogy annak körét korlátoznák.
1. példa
A pHPR91 plazmid létrehozása
A. 4 pL 110 eredetű fragmentum létrehozása
A pCZR125 plazmidot, a szarvasmarha-növekedési hormonszerű polipeptid expressziós vektorát eredményező eljárást az alábbi A-D alfejezetekben ismertetjük. A pCZR125 plazmid a kívánt pHBR91 plazmid egyik közbenső terméke.
A pLUO plazmidot a 4.874.703 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás ismerteti, melyet 1989. október 17-én jegyeztek be. A 4.874.703 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást itt teljes egészében referenciaként említjük.
HU 218 269 Β μΐ pLllO plazmidot teljes mértékben feltártunk 15 μΐ (150 egység) Xbal-gyel (New England Biolabs, a továbbiakban NEB) 500 μΐ teljes reakció-térfogatban, mely 60 mM Trisz-HCl-t (pH 7,5) (a Trisz Trisz-[hidroxi-metilj-amino-metán), 10 mM MgCl2-t, 100 mM NaCl-t, és 6 mM β-merkapto-etanolt tartalmazott. Az elegyet 37 °C-on egy órát inkubáltuk. A feltárt DNS-t kétszer extraháltuk fenol-kloroform (50:50) eleggyel, majd a vizes fázist visszanyertük. A vizes fázisból a DNS-t 2,5 térfogatnyi abszolút etanol és 0,1 térfogatnyi 3,0 M nátriumacetát hozzáadásával nyertük vissza. A DNS-t centrifugálással összegyűjtöttük, és 50 μΐ vízben feloldottuk.
A fenti DNS-t BamHI alkalmazásával, az alábbi eljárás szerint, részlegesen feltártuk. 50 μΐ Xbal-gyel feltárt DNS-t elegyítettünk 0,2 μΐ (2 egység) BamHI 150 μΐ reakció-térfogatú elegyével, mely 10 mM Trisz-HCl-t (pH 7,8), 7 mM MgCl2-t, 150 mM NaCl-t és 6 mM βmerkapto-etanolt tartalmazott. Az elegyet 37 °C-on öt percig inkubáltuk. Az anyagot a fenti eljárás szerint megtisztítottuk, a mintát visszanyertük, és 150 μΐ TE-ben [10 mM Trisz-HCl (pH 7,4) és 1 mM etilén-diamintetraecetsav (EDTA)] felszuszpendáltuk. A mintához 5 μΐ füttatópuffert (25% v/v glicerol, 0,05% w/v brómfenol-kék, és 0,5% w/v xilén-cianol) adtunk, és a feltárt DNS-t 1%-os agarózgélen gélelektroforézissel ffakcionáltuk Maniatis és társai eljárása szerint (Maniatis és társai, 1982, Molecular Cloning; Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., p. 150-172). Az agarózgélt hígított etidium-bromiddal festettük meg, és a megközelítőleg 5,8 kb méretű Xbal-BamHI restrikciós fragmentumokat 300 nm-es UV fénnyel tettük láthatóvá. A gélnek a restrikciós fragmentumot tartalmazó részét megtartottuk. A DNS-t a gél darabokra vágásával, fenol-kloroform (50:50) eleggyel történő kétszeri extrahálásával és a DNS etanolos kicsapásával tisztítottuk, lásd fent.
B. Az Xbal-Ndel linker létrehozása
Az alábbi komplementer DNS-szegmenst automata DNS-szintetizátoron (Applied Biosystems 380B) szintetizáltuk meg, a β-ciano-etil-foszforamidit-kémia sze5 rirt:
SequenceID 3
CTAGAGGGTATTAATAATGTATATTGATTT
TAATAAGGAGGAATAATCA Sequence ID 4
TATGATTATTCCTCCTTATTAAAATCAATAT
ACATTATTAATACCCT
Ezeket az egyszálú DNS-szegmenseket (Sequence ID 3 és Sequence ID 4) általánosan ismert módon tisztítottuk meg, és vízben felszuszpendáltuk.
Az egyes egyszálú DNS-szegmensekből 5-5 μΐ-t elegyítettünk, és 70 °C-ra felmelegítettünk. Ezután az elegyet szoba-hőmérsékletűre hűtöttük, és 30 percig tempe álódni hagytuk a DNS-szegmenseket.
A temperálódott DNS-szegmenseket 1 μΐ (10 egy20 ség) T4 polinukleotid-kinázzal kezeltük, 70 mM Tr sz-HCl (pH 7,6), 0,1 M KC1, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, és 0,2 mM dezoxiadenin-5’-trifoszfát elegyében, 20 μΐ reakció-térfogatban. Az elegyet 37 °C-on 30 percig inkubáltuk. Ezután az elegyet 70 °C-on öt percig inkubáltuk, majd szobahőmérsékletre hűtöttük.
C. Szintetikus EK-BGH gén létrehozása
Az EK-BGH-t kódoló gént (Met-Phe-Pro-Leu(Asp)4Lys szarvasmarha-növekedési hormon) az egyszalú DNS 16 kémiailag szintetizált darabjából hoztuk létre, melyek hossza 71-83 nukleotid között volt, és amelyek a temperálódás után az EK-BGH gén összes komplementer szálát az Ndel-BamHI kohezív végekké együtt tartalmazták, A szintetikus EK-BGH gén kódolószekvenciáját mint Sequense ID 5-öt mutat35 juk be, és itt a hagyományos kétszálas formában mutatjuk be:
5’-TATGTTCCCATTGGATGATGATGATAAGTTCCCAGCCATGTCCTT I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I i I I I I I I I 1 I I I I I I I I I I I I
3'-ACAAGGGTAACCTACTACTACTATTCAAGGGTCGGTACAGGAA
GTCCGGCCTGTTTGCCAACGCTGTGCTCCGGGCTCAGCACCTGCATCAGCTGGCTGCTGA I I I I I I I I I I I I 1 I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 1 I I I I I I I I I I CAGGCCGGACAAACGGTTGCGACACGAGGCCCGAGTCGTGGACGTAGTCGACCGACGACT
CACCTTCAAAGAGTTTGAGCGCACCTACATCCCGGAGGGACAGAGATACTCCATCCAGAA I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 1 I I I I 1 I I I I I I I I I I I I I I I I I GTGGAAGTTTCTCAAACTCGCGTGGATGTAGGGCCTCCCTGTCTCTATGAGGTAGGTCTT
CACCCAGGTTGCCTTCTGCTTCTCTGAAACCATCCCGGCCCCCACGGGCAAGAATGAGGC I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I II I I I I I I I I I 1 I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I GTGGGTCCAACGGAAGACGAAGAGACTTTGGTAGGGCCGGGGGTGCCCGTTCTTACTCCG
CCAGCAGAAATCAGACTTGGAGCTGCTTCGCATCTCACTGCTCCTCATCCAGTCGTGGCT I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I i I I I I I I I I I 1 I I í 11 1111 11111 I GGTCGTCTTTAGTCTGAACCTCGACGAAGCGTAG/iGTGACGAGGAGTAGGTCAGCACCGA
TGGGCCCCTGCAGTTCCTCAGCAGAGTCTTCACCAACAGCTTGGTGTTTGGCACCTCGGA I I I ! I I I I I I I I I I I 1IIIiII I I I I I I I I 1 I I l I I I IIIIIIIII1I I 1 I I I I il I I I I ACCCGGGGACGTCAAGGAGTCGTCTCAGAAGTGGTTGTCGAACCACAAACCGTGGAGCCT
CCGTGTCTATGAGAAGCTGAAGGACCTGGAGGAAGGCATCCTGGCCCTGATGCGGGAGCT I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I : I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I GGCACAGATACTCTTCGACTTCCTGGACCTCCTTCCGTAGGACCGGGACTACGCCCTCGA
HU 218 269 Β
GGAAGATGGCACCCCCCGGGCTGGGCAGATCCTCAAGCAGACCTATGACAAATTTGACAC I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 1 I I I I I I I I I I CCTTCTACCGTGGGGGGCCCOACCCGTCTAGGAGTTCGTCTGGATACTGTTTAAACTGTG
AAACATGCGCAGTGACGACGCGCTGCTCAAGAACTACGGTCTGCTCTCCTGCTTCCGGAA I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I TTTGTACGCGTCACTGCTGCGCGACGAGTTCTTGATGCCAGACGAGAGGACGAAGGCCTT
GGACCTGCATAAGACGGAGACGTACCTGAGGGTCATGAAGTGCCGCCGCTTCGGGGAGGC I H I I I I I I I I I I I I I I I I II I I I t I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I i I I I I I I I I I I I I CCTGGACGTATTCTGCCTCTGCATGGACTCCCAGTACI'TCACGGCGGCGAAGCCCCTCCG
CAGCTGTGCCTTCTAG-3'
I I I I I I I I I I I I I I I I
GTCGACACGGAAGATCCTAG-5'.
D. DNS-ligálás
Az 1 A. példa eljárása szerint előállított pLl 10 restrikciós fragmentumból 2 μΐ-t (0,2 pg), az IB. példa eljárása szerint előállított DNS-fragmentumból 2 μΐ-t (8,75 Pmol), és az IC. példa eljárása szerint előállított DNS-fragmentumból (Sequence ID 5) 2 μΐ-t (0,1 pg) 1 μΐ (10 egység) T4 DNS ligázzal, 50 mM Trisz-HCllel (pH 7,6), 10 mM MgCl2-vel, 1 mM ditiotreitollal, 1 mM adenin-5’trifoszfáttal, és 5% (w/v) polietilénglikol-8000-rel, összesen 10 μΐ reakció-térfogatban ligáltunk a pCZR125 plazmid létrehozása céljából. A pCZR125 plazmidot az 1. ábrán mutatjuk be. Az elegyet 16 °C-on 16 órán keresztül inkubáltuk. Az így kapott elegy egy részét használtuk fel az Escherichia coli sejtek transzformálására, lásd lent.
E. A transzformálás eljárása
Az Escherichia coli K.12 RV3O8 sejteket NRRL B-15624 számon az alábbi helyről szereztük be: Northern Régiónál Research Laboratory, Peoria, Illinois. Az E. coli K.12 RV308 sejtek tenyészetéből 50 ml-t L-broth (10 g tripton, 10 g NaCl, és 5 g élesztőextraktum per liter víz) táptalajon O.D.590-en 0,5 abszorbanciaegység értékig tenyésztettük. A tenyészetet jégen 10 percig hűtöttük, majd a sejteket centrifugálással összegyűjtöttük. A sejtpelletet 25 ml hideg oldatban (50 ml CaCl2, 10 mM Trisz-HCl; pH 8,0) szuszpendáltuk, és 15 percig jégen inkubáltuk. A sejteket centrifugálással összegyűjtöttük, a sejtpelletet 2,5 ml hideg oldatban (50 ml CaCl2, 10 mM Trisz-HCl; pH 8,0) felszuszpendáltuk, és a mintát 4 °C-on 16 órán keresztül tartottuk.
Ebből a sejtszuszpenzióból 200 μΐ-t a fenti ligáit DNS-készítmény 50 μΐ-ével elegyítettünk, és jégen 60 percig inkubáltunk. Az elegyet 32 °C-on 45 percig inkubáltuk, majd 2 percre jégbe helyeztük. 5 ml TY tápközeget (1% tripton, 0,5% élesztőextraktum, és 1% nátrium-klorid, pH 7,4) adtunk az elegyhez, és 32 °Con további két órán keresztül inkubáltuk. Ennek a tenyészetnek 100 μΐ mennyiségét TY agarlemezekre (1% tripton, 0,5% élesztőextraktum, 1% nátrium-klorid és 1,5% agar, pH 7,4) oltottuk, melyek 5 pg/ml tetraciklint tartalmaztak. A lemezeket levegőztetés mellett 16 órán keresztül 32 °C-on inkubáltuk. A tetraciklinrezisztens tenyészeteket egyenként kiválasztottuk, és 2 ml TY tápközegre inokuláltuk. A tenyészeteket 37 °C-on 16 órán keresztül inkubáltuk, levegőztetés mellett.
F. Plazmid ,,Mini-Preb” DNS-izolálási eljárás
Az itt bemutatásra kerülő eljárás kis mennyiségű plazmid előállítására alkalmas. A plazmid „Mini-Prep” eljárás az 1. példában ismertetett eljárás változata, melyet a 4.874.703 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás ismertet, amit 1989. október 17-én jegyeztek be, és melyet itt teljes egészében referenciaként említünk. Amennyiben másképpen nem jeleztük, az alábbi eljárás minden lépését környezeti hőmérsékleten hajtottuk végre. Az egyes tenyészetekből 1,5 ml-t mikrocentrifugacsövekbe vittünk. A sejteket centrifugálással gyűjtöttük össze. A felülúszót fine-tip pipettával eltávolítottuk, és a sejtpelletet 100 pl térfogatú, 50 mM gli közt, 10 mM EDTA-t és 25 mM Trisz-HCl-t (pH 8,0) tartalmazó oldatban felszuszpendáltuk. Szobahőmérsékleten 5 percig inkubáltuk, majd 200 μΐ alkalikus nálrium-dodecil-szulfát- (SDS) oldatot (0,2 N NaOH, 1% SDS) adtunk hozzá. Az elegyet az elegyítés céljábó megfordítottuk, majd öt percig jégen tartottuk. Ezután 150 μΐ kálium-acetát-oldatot készítettünk (11,5 ml jégecetsav és 28,5 ml víz 60 ml 5 M kálium-acetáthoz). A keletkező oldatot (mely a káliumra nézve 3 M-os, és az acetátra nézve 5 M-os volt) enyhe rázás mellett a mintát tartalmazó csőhöz adtuk. A mintát 5 percig jégen tartottuk, majd 10 percig centrifugáltuk. A felülúszót egy másik centrifugacsőbe vittük át. Azonos térfogatú fenolt (0,1 M Trisszel telítve; pH 8,0) adtunk hozzá. A mintát elegyítettük, és 5 percig centrifugáltuk. A felülúszót összegyűjtöttük, és a fenolos extrakciót megismételtük. A felülúszóhoz 1 ml jéghideg abszolút etanolt adtunk. A mintát elegyítettük, és szárazjégen tartottuk, amíg erősen viszkózussá vált, de meg nem fagyott. A DNS-t ötperces centrifugálással gyűjtöttük össze. A felülúszót leszívással eltávolítottuk, és a DNSpellethez 500 μΐ 70%-os etanolt adtunk. A mintát a pelletek mosása céljából enyhén ráztuk, és két percig centrifugáltuk. A felülúszót eltávolítottuk, és a DNSpelletet vákuumban megszárítottuk. A DNS-t 50 μΐ TE (Ifi mM Trisz-HCl (pH 8,0) és 1 mM EDTA) oldatban feloldottuk, és 4 °C-on tároltuk.
G. Nagy mennyiségű DNS izolálása
A nagy mennyiségű pCZR125 plazmid-DNS izolálását az alábbiak szerint végeztük el. 1 liter mennyiségű, 5 pg/ml tetraciklint tartalmazó L-broth táptalajt inokulábunk az Escherichia coli RV308/pCZR125 tenyészettel. A tenyészet 32 °C-on 16 órán keresztül növekedett.
HU 218 269 8
A tenyészetet GSA rotorban (Sorvall) 6000 rpm mellett, 4 °C-on 5 percig centrifugáltuk. A keletkező felülúszót elöntöttük, és a sejtpelletet 40 ml TES pufferben (10 mM Trisz-HCl (pH 7,5), 10 mM HC1, és 1 mM EDTA) mostuk, majd centrifugálással összegyűjtöttük. A felülúszót elöntöttük, és a sejtpelletet szárazjég-etanol fürdőben megfagyasztottuk, majd felolvasztottuk. A felolvasztott sejtpelletet 10 ml mennyiségű, 25% szukrózt és 50 mM EDTA-t tartalmazó oldatban felszuszpendáltuk. Az oldathoz 1 ml 5 mg/ml lizozimoldatot, 3 ml 0,25 M EDTA-t (pH 8,0), és 100 pl 10 mg/ml forralt RNS-áz A-t (beszerezhető az alábbi helyről: Sigma Chemical Co., P. O. Box 14508, St. Louis, Mo.) adtunk, majd 15 percig jégen inkubáltuk. A lizozimmal kezelt sejtekhez 3 ml lizálóoldatot adtunk (3 ml 10%-os Triton X-100, 75 ml 0,25 M EDTA (pH 8,0), 15 ml Trisz-HCl (pH 8,0), és 7 ml H2O), az oldatot elegyítettük, és az így kapott elegyet további 15 percig jégen inkubáltuk. A lizált sejteket szárazjég-etanol fürdőben megfagyasztottuk, majd felolvasztottuk. A sejttörmeléket az elegyből 25 000 rpm melletti, 40 perces centrifugálással, SW28.1 rotor alkalmazásával (Beckman, Scientific Instrument Division, Campus Drive at Jamboree Blvd., Irvine, CA 92713), és puffereit fenolos extrakcióval eltávolítottuk. A sejtextraktumhoz körülbelül 30,44 g CsCl-t és megközelítőleg 1 ml 5 mg/ml etidiumbromidot adtunk, majd a térfogatot TES pufferrel (10 mM Trisz-HCl (pH 7,5), 10 mM HC1 és 1 mM EDTA) 40 ml-re egészítettük ki. Az elegyet VTÍ50 ultracentrifugacsőbe (Beckman) dekantáltuk, lezártuk azt, és VTÍ50 rotorban 42 000 rpm mellett 16 órát centrifugáltuk. Az így kapott, ultraviola fénnyel láthatóvá tett plazmidsávokat izoláltuk, és Ti75 csőben, és rotorban (Beckman) 50 000 rpm mellett 16 órát centrifugáltuk. A szükséges térfogat-beállítást 0,761 g/ml CsCl-t tartalmazó TES pufferrel végeztük el. A plazmidsávokat ismét izoláltuk, az etidium-bromid eltávolítása céljából sóval telített 2-propanollal extraháltuk, és TES pufferrel 1:3 arányban hígítottuk. Egy térfogatnyi nátriumacetátot és két térfogatnyi abszolút etanolt adtunk az oldathoz, majd -20 °C-on 16 órát inkubáltuk. A plazmid DNS-t 10 000 rpm melletti, 15 perces centrifugálással, SS34 rotor (Sorvall) alkalmazásával pelletizáltuk. Az így kapott plazmid DNS-t ΤΕ-pufferben szuszpendáltuk, és -20 °C-on tároltuk.
H. A pHPR91 létrehozása (1) A pCZR125 plazmidból 10 pg-ot megközelítőleg 30 egység EcoRI (New England Biolabs) 100 pl teljes reakció-térfogatú elegyével, mely 100 pg/ml BSA-t (szarvasmarhaszérum-albumin), 50 mM Trisz-HCl-t (pH 8,0), 10 mM MgCl2-t, és 100 mM NaCl-t tartalmazott, 37 °C-on egy óra alatt teljesen feltártunk. Ezután a mintát 70 °C-on 10 percig inkubáltuk az inaktív EcoRI eltávolítása céljából.
(2) Az EcoRI-gyel feltárt pCZR125 plazmidot DNS-polimeráz I alkalmazásával (Klenow-fragment) az alábbi eljárással kezeltük. A fenti reakcióelegy 25 pl-ét [Η (1) pont] 50 pl-re állítottuk be úgy, hogy az 250 pl dATP-t, 250 pl dCTP-t, 250 pl dGTP-t, 250 pl dTTP-t, 50 mM Trisz-HCl-t (pH 7,8), 10 mM MgCl2-t, mM β-merkapto-etanolt és 5 egység Klenow DNSpolimerázt tartalmazott. A mintát 37 °C-on 30 percig inkubáltuk. Ezután a reakcióelegyet 70 °C-on 15 percig inkubáltuk a Klenow-fragment inaktiválása céljából.
(3) Az EcoRI-gyel feltárt, Klenow-fragmenttel kezelt pCZR125 plazmid DNS-t ezután Seal (New England Biolabs) alkalmazásával, 37 °C-on történő egyórás inkubálással, 150 pl reakció-térfogatban, mely 50 mM Tr sz-HCl-t (pH 8,0), 10 mM MgCl2-t, 100 mM NaCl-t, 100 pg/ml BSA-t, és 18 egység Scal-t tartalmazott, teljesen feltártuk. A Scal-t ezután a minta 70 °C-on történő 15 perces inkubálásával inaktiváltuk.
(4) A pBR12 plazmidból 10 pg mennyiséget teljes mértékben feltártunk 30 egység Aval (New England Biolabs) 100 pl reakció-térfogatú elegyével, mely 100 pg/ml BSA-t, 50 mM Trisz-HCl-t (pH 8,0), 10 mM MgCl2-t, és 50 mM NaCl-t tartalmazott. Az elegyet 37 °C-on egy órát inkubáltuk. Az elegyet ezután 70 °Con 15 percig inkubáltuk az Aval inaktiválása céljából. A pBR12 plazmidot a 4.436.815 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertették, melyet 1984. március 13-án jegyeztek be, és melyet itt teljes egészében referenciaként említünk meg.
(5) Az Aval-gyel feltárt pBR12 plazmidmintát az alábbi eljárással kezeltük. A fenti reakcióelegy 25 pl-ét 50 pl-re állítottuk be úgy, hogy az 250 pl dATP-t, 250 pl dCTP-t, 250 pl dTTP-t, 50 mM Trisz-HCl-t (pH 7,8), 10 mM MgCl2-t, 10 mM β-merkapto-etanolt, és 5 e gység Klenow DN S-polimerázt tartalmazott. A mintát 37 °C-on 30 percig inkubáltuk. Ezután a reakcióelegyet 70 °C-on 15 percig inkubáltuk a Klenow-fragment inaktiválása céljából.
(6) A pCZR125 plazmid DNS-t és az Aval-gyel feltárt, Klenow-fragmenttel tompított EcoRI-gyel feltárt, Klenow-fragmenttel tompított (lásd a példa H (3) pontja) pHPR12 DNS-t (lásd a példa H (4) pontja) azonos térfogatú, fenollal telített pufferrel megtisztítottunk, majd azonos térfogatú éterrel extraháltunk. A DNS-t 1/10 térfogat 3 M nátrium-acetáttal és két térfogat etano lal visszanyertük. Az így kapott DNS-csapadékot összegyűjtöttük, és 40 pl reakció-térfogatban, mely 50 mM Trisz-HCl-t (pH 7,8), 10 mM MgCl2-t, 5 mM DTT-t (ditiotreitol), 5% glicerolt, és 40 egység DNSligázt tartalmazott, egy éjszaka alatt 40 °C-on ligáltuk.
(7) A H (6) lépés szerinti ligálóelegy egy részét alkalmaztuk az Escherichia coli KI2 MM294 sejteknek az IE. példa eljárása szerint történő transzformálására. Az E. coli K12 MM294 sejteket ATCC 31446 számon az alábbi helyről szereztük be: American Type Culture Collection, Rockville, Maryland 20852. A transzformáns sejteket 10 pg/ml tetraciklint tartalmazó L-agaron szelektáltuk. Az egyes tenyészeteket kiszúrtuk, és 10 pg/ml tetraciklint tartalmazó L-broth táptalajon tenyésztettük. A kívánt pHPR91 plazmidot tartalmazó tetraciklinrezisztens transzformánsokat restrikciós enzimes analízist alkalmazó plazmidtisztítási eljárás után azonosítottuk. A pHPR91 plazmid Pvul-gyel történő feLárása egy 1450 bázispárból álló fragmentet eredményezett. A pHPR91 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét a 2. ábrán mutatjuk be.
HU 218 269 Β
2. példa
A pHDM119 plazmid létrehozása
A. A pHDM163 közbenső plazmid létrehozása
Megközelítőleg 0,5 pgpHPR91 plazmidot (1. példa) tártunk fel BamHI alkalmazásával. Megközelítőleg 1 pg pHBR325 plazmidot (Bethesda Research Laboratories, P. O. Box 6009, Gaithersburg, MD20877) tártunk fel SauIIIA alkalmazásával. A pBR325 plazmid, a pBR322 plazmid származéka tartalmazza a Tn9-ről a klóramfenikol-rezisztencia (cat) gént. Lásd Balbas, P. és társai, (1986) Gene 50:3. A BamHI-gyel feltárt pHPR91 plazmidot és a SauIIIA-val feltárt pHBR325 plazmidot az ID. példa eljárása szerint ligáltuk.
A ligálóelegyet alkalmaztuk az Escherichia coli KI2 MM294 sejteknek az IE. példa eljárása szerint történő transzformálására. A transzformált sejteket 25 pg/ml klóramfenikolt tartalmazó L-agaron tenyésztettük. Az egyes tenyészetekből származó plazmidokat restrikcióshely-térképezéssel ellenőriztük, így azonosítottuk a pHPR91 plazmidból származó, megközelítőleg 4,8 kb méretű BamHI fragmentet tartalmazó rekombináns plazmidot, és a pBR325-ből származó, klóramfenikolacetil-transzferázt kódoló gént. A pHDM163 közbenső plazmid restrikciós helye és funkciós térképe a 3. ábrán látható.
B. A pHDM164 közbenső plazmid létrehozása
A pHDM164 plazmidot a pHDM163 plazmid Ndel helyének megszüntetésével hoztuk létre. A megszüntetett Ndel hely a replikációs (rep) origón és a rop gén között helyezkedik el a pHPR91 plazmidon, lásd 3. ábra. A pHDM163 plazmidon a fent említett Ndel helyek hozzájárultak a pHPR91 plazmid eredetű expressziós vektorok változatosságához (versatility).
A pHDM163 plazmidot az 1F. példa eljárása szerint az E. coli MM294/pHDM 163-ból izoláltuk. A pHDM163 plazmidot Ndel-gyel feltártuk. A feltárt anyagot Klenow-val kezeltük, és tompa végű ligálással recirkuláltattuk. A ligálóelegyet alkalmaztuk az E. coli MM294 transzformálására. A transzformált sejteket 25 pg/ml klóramfenikolt tartalmazó L-broth táptalajon tenyésztettük. Az egyes transzformánsokból származó plazmidokat összegyűjtöttük, és diagnosztikai restrikciósendonukleáz-térképezéssel erősítettük meg a pHDM164 plazmid azonosságát. A pHDM164 plazmid restrikciós helye és funkciós térképe a 4. ábrán látható.
C. A pHDMl 19 plazmid létrehozása
A pHDM164 plazmid megközelítőleg 3,1 kb méretű Nsil-Ncol fragmentumából körülbelül 0,2 pg-ot, és a pHPR91 plazmid megközelítőleg 3,3 kb méretű Nsil-Ncol fragmentumából körülbelül 0,06 pg-ot az
ID. példa eljárása szerint ligáltunk. Az Nsil és a Ncol restrikciós endonukleázokat a New England Biolabstól szereztük be. A pHDM164 plazmid megközelítőleg 3,1 kb méretű Nsil-Ncol fragmentuma az E. coli replikont és módosított Ndel helyét tartalmazza. A pHPR91 plazmid megközelítőleg 3,3 kb méretű Nsil-Ncol fragmentuma szarvasmarha-növekedési hormon gént tartalmaz.
A fenti ligálóelegyet alkalmaztuk az E. coli MM294 transzformálására. A transzformálást az IE. példa eljárása szerint hajtottuk végre. A transzformált sejteket 10 pg/ml tetraciklint tartalmazó L-agaron szelektáltuk. Az egyes transzformánsokból származó plazmidok restrikciósendonukleáz-térképezésével erősítettük meg a pHDM164 plazmid azonosságát. A plazmidizolálás eljárását az 1G. példában mutattuk be. A pHDM119 plazmid restrikciós helye és funkciós térkéjre a 5. ábrán látható.
3. példa
A pHDM121 plazmid létrehozása
A. Plazmidváz létrehozása
A pHDM121 plazmid a Met-Tyr-HPI expressziós vektora. A pHDM121 plazmidot a pHDM119 plazmidból a BST-t (szarvasmarha-növekedési hormon; bovine growth hormoné) kódoló szekvencia eltávolításával, és annak helyére Met-Tyr-HPI-t kódoló szintetikus DNS-szekvencia beillesztésével hoztuk létre. A rHDMl 19 plazmidot az 1G. példa eljárása szerint az E. coli MM294/pHDMl 19-ből izoláltuk.
A pHDM119 plazmidot Ndel-gyel feltártuk. A megközelítőleg 6,9 kb méretű DNS-fragmentumot izoláltuk, és BamHI-gyel feltártuk. A BamHI-gyel törtérő részleges feltárást 0,55 U BamHI/pl alkalmazásává, kétperces kezeléssel hajtottuk végre, majd a feltáró reakcióelegyet a BamHI inaktiválása céljából 10 percre 70 °C-ra melegítettük. Az Ndel-gyel, és a BamHI-gyel feltárt pHDM119 plazmidot 1%-os agarózgélen elektroforézissel izoláltuk. A pHDM plazmid BST kódolószekvenciájának megfelelő DNS-fragmenturnot a gélről mint megközelítőleg 6,331 kb méretű fragmentumot izoláltuk. A gélizolálás eljárása az
1. példában, valamint a 4.874.703 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban található, melyet itt referenciaként említünk meg.
B. 4 Met-Tyrproinzulint kódoló szekvencia létrehozása
Az Met-Tyr humán proinzulinszekvenciát tartalmazó kódolószál szekvenciáját mint Sequence ID 6-ot ismertetjük. Az említett régió hagyományos kétszálú DNS-szekvenciáját a fragmentum terminusa szemléltetése céljából az alábbiakban mutatjuk be:
TATGTATT I I I I I I ACATAA
TCTGTACCTG I I I I I I I I I I AGACATGGAC
GCCGTGAGGC I I I I I I I I I I CGGCACGCCG
TTGTTAACCA I I I I I 1 I I I I AACAATTGGT
GTGTGCGGTG I I I II I I I I I CACACGCCAC
AGAGGACCTG I I I I I I I I I I TCTCCTGGAC
ACACCTGTGC I I I I I I I I I I TGTGGACACG
AACGTGGCTT I I I I I I I I I I TTGCACCGAA
CAGGTGGGTC I I I I I I I I I I GTCCACCCAG
GGCTCCCACC I I t I I I I I I I CCGAGGGTGG
CTTCTACACC I I I I I I I I I I GAAGATGTGG
AGGTGGAGCT I I I I I I I I I I TCCACCTCGA
TGGTGGAAGC I I I I I I I I I I ACCACCTTCG
CCGAAGACCC I I I I I I I I I I GGCTTCTGGG
GGGCGGTGGC I I I I I I I I I I CCCGCCACCG
HU 218 269 Β
CCGGGTGCAG GCAGCCTGCA GCCGCTGGCC CTGGAGGGTT CCCTGCAGAA I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I i I I I I I I I GGCCCACGTC CGTCGGACGT CGGCGACCGG GACCTCCCAA GGGACGTCTT
GCGTGGCATT GTGGAACAAT GCTGTACCAG CATCTGCTCC CTGTACCAGC
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I LI I I I I I I I I I I
CGCACCGTAA CACCTTGTTA CGACATGGTC GTAGACGAGG GACATGGTCG
TGGAGAACTA CTGCAACTAG
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I l
ACCTCTTGAT GACGTTGATCCTAG
A fent bemutatott szekvenciát olyan oligonukleotid-szekvenciák szintetizálásával hoztuk létre, melyek a kódolószál átfedő régióinak (top; felül), és a nem érzékeny (nonsense) szálnak feleltek meg úgy, hogy az oligonukleotidszekvenciák elegyítésével az érzékeny, és a nem érzékeny szálak komplementer régiói közötti hibridizáció a Met-Tyr-HPI-t kódoló gén összeillesztését eredményezte. Az így kapott szekvencia egy 5’-NdeI tapadós véget, és egy 3’-BamHI tapadós véget tartalmazott, melyek megkönnyítették a Met-Tyr-HPI szekvencia beillesztését a fenti, az Ndel és a BamHI által feltárt pHDM119 plazmid DNS-be. A fenti MetTyr-HPI-t kódoló szekvenciát a British Biotechnology szabványos DNS-szintézisével hoztuk létre. Az oligonukleotidszintézist a jelen találmány 1. példájában ismertetjük, valamint a 4.874.403 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban, melynek alapján a megfelelő szakmai gyakorlattal rendelkezők a fenti Met-Tyr-HPI-t kódoló szekvenciát maguk is meg tudják szintetizálni.
C. A pHDM121 plazmid összeillesztése
A pHDM119 plazmidváz megközelítőleg 5,5 pg mennyiségét és a Met-Tyr-HPI-t kódoló szekvenciának megközelítőleg 0,5 pg mennyiségét ligáltuk az ID. példa eljárása szerint. A pHDM119 plazmid előállítása a pHDM 119 plazmid BamHI-gyel (New England Biolabs) való részleges feltárásával történt. A pHDM119 plazmid teljes hosszában lineáris DNS-ét agarózgélelektroforézissel izoláltuk, és Ndel-gyel (New England Biolabs) teljes mértékben feltártuk. A megközelítőleg 6,3 kb méretű Ndel-BamHI fragmentumot (a négy fragmentum közül a legnagyobb) ezután gélelektroforézissel izoláltuk. Az így kapott ligálóelegyet használtuk az E. coli 294 sejtek transzformálására. A pHDM121 restrikciós helye és funkciós térképe a 6. ábrán látható.
4. példa
A közbensőpHPR97plazmid létrehozása
A. Az EcoRI-BqlH-vel feltártpCZR125 létrehozása
A pCZR125 DNS 10 pg mennyiségét (1. példa) 5 pl (55 egység) EcoRI, és 5 pl (55 egység) BqlII alkalmazásával teljes mértékben feltártuk, 60 pl teljes reakció-térfogatban, mely 10 mM Trisz-HCl-t (pH 7,5), 10 mM MgCl2-t, 100 mM NaCl-t, és 10 mM β-merkapto-etanolt tartalmazott. Az elegyet 37 °C-on két órát inkubáltuk. A feltárt DNS-t megtisztítottuk, és a megközelítőleg 6,0 kb méretű fragmentumot preparatív agarózgél-elektroforézissel izoláltuk, a 3A. példa eljárása szerint.
B. A transzkripciós aktiválószekvencia-DNS létrehozása A transzkripciós aktiválószekvenciát az alábbi egyszálú DNS-szekvenciák szintetizálásával hoztuk létre:
SequenceID 7
5’-AATTCGATCTCTCACCTACCAAACAATGCCCCCCTGCAAAAAATAAATTCATATAAAAAACATACAGATAACCATCTGCGGTGAT20 AAATTATCTCTGGCGGTGTTGACATAAATACC ACTGGCGGTGAT ACTGAGCACATCA-3 ’ SequenceID 8
5’-GATCTGATGTGCTCAGTATCACCGCCAGTGGTATTTATGTCAACACCGCCAGAGATAT25 TTATCACCGCAGATGGTTATCTGTATGTTTTTTATATGAATTTATTTTTTGCAGGGGGGCATTGTTTGGTAGGTGAGAGATCG-3 ’
Az egyszálú DNS-szegmenseket (Sequence ID 3, és
Sequence ID 4) hagyományos úton tisztítottuk meg, majd vízben felszuszpendáltuk azokat.
Az egyszálú DNS-szegmensből 5 μΐ-t elegyítettünk, és 70 °C-ra felmelegítettünk. Ezután az elegyet szobahőmérsékletűre hűtöttük, és 30 percig temperálódni hagytuk a DNS-szegmenseket.
A temperálódott DNS-szegmenseket 1 pl (10 egység) T4 polinukleotid-kinázzal kezeltük, 70 mM Trsz-HCl (pH 7,6), 0,1 M KC1, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, és 0,2 mM dezoxiadenin-5’-trifoszfát elegyében, 20 pl reakció-térfogatban. Az elegyet 37 °C-on 30 per40 cig inkubáltuk. Ezután az elegyet 70 °C-on öt percig inKubáltuk, majd szobahőmérsékletre hűtöttük.
C. A pHPR97 végső összeillesztése
A 4A. példa eljárása szerint előállított restrikciós fragment 2 pg mennyiségét és a 4B. példa eljárása sze45 rint előállított, kinázzal kezelt DNS-ffagment 1 pg mennyiségét az ID. példa eljárása szerint ligáltuk, azzal az eltéréssel, hogy az elegyet szobahőmérsékleten 1 órát inkubáltuk, 5 percre 70 °C-ra melegítettük, majd szobahőmérsékletre hűtöttük. A ligáit DNS egy részét alkalmaztuk az Escherichia coli KI2 MM294 sejteknek az 1E. példa eljárása szerint történő transzformálására. Az E. coli K12 MM294 sejteket ATCC 31446 számén az alábbi helyről szereztük be: American Type Culture Collection, Rockville, Maryland 20852. A tet55 raciklinrezisztens transzformánsokat szelektáltuk, és plazmid-DNS-üket az 1. példa szerinti eljárással izoláltuK. Restrikciós analízist alkalmaztunk a pHPR97 plazmid szerkezetének igazolása céljából. A pHPR97 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét a 7. ábrán mi tatjuk be.
HU 218 269 Β
5. példa
A közbenső pHPR104 plazmid létrehozása
A pHPR104 plazmidot a 4. példa eljárása szerint hoztuk létre. A szintetikus transzkripciós aktiválószekvenciát az alábbi egyszálú DNS-szegmensek szintetizálásával hoztuk létre:
SequenceID 9 ’-AATTCATAC AG ATAACCATCTGCGGTGATAAATTATCTCTGGCGGTGTTGACATAAATACCACTGGCGGTGATACTGAGCACATCA-3’
SequenceID 10
5’-GATCTGATGTGCTCAGTATCACCGCCAGTGGTATTTATGTCAACACCGCCAGAGATAATTTATCACCGCAGATGGTTATCTGTATG-3’.
A pHPR104 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét a 8. ábrán mutatjuk be.
6. példa
A pHDM126 és a pHDMl 33 plazmid létrehozása
A. Áttekintés
A pHDM126 plazmid a pHDM121 plazmid származéka, mely egy, a plazmid stabilitását fokozó módosított lambda-pL promotert tartalmaz.
B. A pHDM121 plazmidból származó lambda-pL promoter alkalmazása
A pHDM121 plazmidból megközelítőleg 6,0 pg mennyiséget Nsil-gyel és BqlII-vel (mindkettő a Boehringer-Mannenheimtől) teljes mértékben feltártunk. A pHDM 121 plazmid megközelítőleg 6,0 pg mennyiségéből a kívánt körülbelül 4082 bp méretű fragmentum megközelítőleg 3,7 pg mennyiségben keletkezett.
C. A pHPR104 plazmidból származó módosított lambda-pL promoter izolálása
A pHPR104 plazmidból származó módosított lambda-pL promoter egy 2191 bp méretű fragmentumon helyezkedik el, melyet Nsil és BqlII restrikciós hely vesz körül. A pHPR104 plazmidot az Nsil-gyel és a BqlII-vel a B. pont szerint tártuk fel. A kívánt körülbelül 2191 bp méretű fragmentumnak megközelítőleg 3,7 pg mennyiségét nyertük vissza.
D. A pHDM126 és a pHDM133 plazmid létrehozása
A B. pont szerinti, az Nsil-gyel és a BqlII-vel feltárt pHDM121 plazmid megközelítőleg 0,3 pg mennyiségét a C. pont szerinti módosított lambda-pL promoter megközelítőleg 0,52 pg mennyiségével ligáltuk. A ligálóelegyet alkalmaztuk az Escherichia coli MM294 sejtek transzformálására. A transzformált sejteket 10 pg/ml tetraciklint tartalmazó L-agar-lemezeken szelektáltuk. A pHDM126 és a pHDM133 plazmidokat, amikor azt figyeltük meg, hogy az Xbal nem hasította el a pHDM126-ot, szeparált E. coli transzformánsokban azonosítottuk. A Met-Tyr-HPI-termelésben szintén különbséget észleltünk. A Met-Tyr-HPI-szint jelentős emelkedése a pHDM 104 és a pHDM 121 plazmid módosított lambda-pL promoterrégiója 20 bp méretű szekvenciájának spontán deléciójához kapcsolódott.
Amint fent említettük, a pHDM 126 és a pHDM 133 plazmidok a Met-Tyr-HPI magas szintű expresszióját irányító lambda-pL promoterben különböznek. A pHDM 126 plazmid restrikciós helye és funkciós térképe a 9. ábrán látható. A pHDM133 plazmid összehasonlítható térképét a 10. ábrán mutatjuk be. A delta szimbólummal jelölt d20 régió a módosított lambdapL promoter (melyet P104-gyel jelöltünk), és a MetTyr humán proinzulint kódoló szekvencia (melyet Met-HPI-ként jelöltünk) között helyezkedik el a 9. ábrán. A pHDM 133 plazmid (10. ábra) csak abban különbözik, hogy nem tartalmaz deléciót, és így egy további 20 bp méretű szekvenciát tartalmaz.
7. példa
A pHDM132 plazmid létrehozása
A. 4 pHDMl 19plazmidváz létrehozása
A pHDMl 19 plazmidot az 1. példa eljárása szerint izoláltuk. A pHDM 119 plazmid 5 pg mennyiségét Hpal alkalmazásával teljes mértékben feltártuk. A nyitott pHDM 119 plazmidot fenol/éter extrakcióval tisztítottuk meg.
B. 4 linker létrehozása
Egy Pvul restrikciós helyet tartalmazó, egyszálú, nem foszforilezett linkért szereztünk be a Boehringer-Mannenheimtől. A linker szekvenciája az alábbi: Sequence ID 11: 5’(GCGATCGC)3’.
A linkért vízben feloldottuk, és 0,1 pg/ml koncentrációra hígítottuk. A linker 20 pg mennyiségét tízperces 90 °C-ra történő melegítéssel temperáltuk, majd az oldal ot szobahőmérsékletre hűtöttük. A temperált linkerbő megközelítőleg 1 pg mennyiséget foszforileztünk 30 pl térfogatban, melyet a ligálópufferből készítettünk, ami 1,0 nM ATP-t és 10 U T4 polinukleotid-kinázt (New England Biolabs) tartalmazott. A foszforilezési reakció 37 °C-on 30 percig tartott. A foszforilezés után a T4 polinukleotid-kinázt az elegy tízperces 70 °C-ra történő melegítésével inaktiváltuk.
C. A pHDMl 19 és a linker összeillesztése a pHDM132 plazmid létrehozása céljából
A pHDM 132 plazmidot az A. pont szerinti 4 pl mennyiségű (megközelítőleg 0,1 pg) Hpal-gyel feltárt pHDMl 19 plazmid és B. pont szerinti 15 pl mennyiségű (megközelítőleg 0,5 pg) linker együttes kicsapásával illesztettük össze az alábbi eljárás szerint. A Hpalgyel feltárt, fenollal és éterrel extrahált pHDMl 19 plazmidot és a temperált/foszforilezett linkért ligálópufferrel 100 pl-re hígítottuk, majd 10 pl 3 M nátrium-acetátot és 220 pl hideg 100%-os etanolt adtunk hozzá. Az elegyet a csapadékképzés céljából egy éjszakán keresztül -20 °C-on inkubáltuk. Ezután 10 000 g mellett 15 percig centrifugáltuk. A felülúszót dekantáltuk, és a megmaradt folyadékot elpárologtattuk. A DNS-pelletet 35 pl vízben felszuszpendáltuk. 5 pl ligálópuffert, 5 pl 10 mM ATP-t, és 5 pl T4 polinukleotid-ligáz-oldatot (megközelítőleg 1 U, Nem England Biolabs) adtunk hozzá, így 50 pl térfogatú ligálóelegyet kaptunk. A ligálást egy éjszaka alatt hajtottuk végre, 15 °C-on. A ligálóelegyet ezután az E. coli 294 transzformálására használtuk fel. A transzformáns sejteket 10 pg/ml tetraciklint tartalmazó L-agaron szelektáltuk. Az egyes tenyészeteket kiszúrtuk, és 10 pg/ml tetraciklint tartal12
HU 218 269 Β mazó L-broth táptalajon tenyésztettük. így izoláltuk a pHDM132 plazmidot. A pHDM132 plazmid jelenlétét restrikciós feltárással bizonyítottuk, és nukleotidszekvenálással igazoltuk, hogy a példa B. pontja szerinti linker egy példányát kaptuk. A pHDM132 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét all. ábrán mutatjuk be.
8. példa
A pHDM157 létrehozása
A. A pHDMl 32 eredetű, megközelítőleg 0,487 bp méretű Sspií-Nsilfragmentum létrehozása
A pHDM132 plazmidot (7. példa) az 1. példa eljárása szerint izoláltuk. A pHDM 132 plazmidból megközelítőleg 4 pg mennyiséget Sspl és Nsil restrikciós enzimek alkalmazásával teljes mértékben feltártunk. A feltárt anyagot egyszer azonos térfogatú vízzel, majd kétszer azonos térfogatú éterrel extraháltuk a fehérjék eltávolítása céljából.
B. A pHDMl 26 eredetű, 5,773 kb méretű Sspil-Nsil fragmentum létrehozása
A pHDM126 plazmidot szintén Sspl és Nsil restrikciós enzimek alkalmazásával tártuk fel, majd fenollal és éterrel a pHDM132 plazmidhoz hasonló módon extraháltuk.
C. A pHDMl57plazmid összeillesztése
Az Sspl és Nsil restrikciós enzimek alkalmazásával feltárt pHDM132 plazmidot (lásd A. pont) és az Sspl és Nsil restrikciós enzimek alkalmazásával feltárt pHDM126 plazmidot (lásd B. pont) együttesen kicsaptuk, majd a 7C. példa eljárásához hasonló módon ligáltuk. A DHSa sejteket (Bethesda Research Laboratories) Wilson, T. A. és Gough, N. M. [(1988) Nuleic Acids Research, Vol. 16, No. 24:11820] eljárása szerint transzformáltuk. A transzformáláshoz egy Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, 1414 Harbour Way South, Richmond, CA 94804) Bacterial Electrotransformation és egy Pulse Controller készüléket alkalmaztunk az alábbi paraméterek beállításával: V=2,0 kV, R=200 Ω és C=25 pF (mikrofarad). A Bio-Rad Bacterial Electrotransformation és Pulse Controller (katalóguszám 165-2098) Version 2-89 útmutatója a transzformálási eljárást teljes mértékben ismerteti. A transzformáns sejteket 10 pg/ml tetraciklint tartalmazó L-agaron szelektáltuk. A pHDM157 plazmidot izoláltuk, és restrikciós endonukleázos térképezésnek vetettük alá. A pHDM157 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét a 12. ábrán mutatjuk be.
9. példa
A pHDM181 plazmid létrehozása
A. Áttekintés
A pHDM181 plazmid a Met-Arg-HPI-termelés előnyös expressziós vektora. A pHDM181 plazmid létrehozása számos, az alábbiakban bemutatásra kerülő közbenső plazmidon keresztül történt.
A pHDMl 36 plazmidot a pHDM133 plazmid Met-Tyr humán proinzulinja Met-Tyr részét kódoló DNS-szekvencia kivágásával (lásd 6. példa, 10. ábra), és annak helyére a Met-Arg-ot kódoló DNS-szekvencia beillesztésével állítottuk elő. A pHDM136 plazmid a pH DM181 plazmid létrehozásának egyik közbenső plazmidja. A pHDM136 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét a 13. ábrán mutatjuk be.
B. A pHDM133 plazmid eredetű fragmentumok létrehozása
A pHDM133 plazmidot az 1. példa eljárása szerint izoláltuk. A pHDM133 plazmid 5 pg mennyiségét Nsil és Ndel alkalmazásával teljes mértékben feltártuk.
A Nsil-t és a Ndel-t a New England Biolabstól szereztük be. A cI857 represszort kódoló szekvencia egy részét, a tetraciklinrezisztencia-markert, és a Pl04 promotert tartalmazó, megközelítőleg 2256 bp méretű fragmentumot gélen izoláltuk. A pHDM133 plazmid 5 pg mennyiségét Hpal és Nsil alkalmazásával, melyeket a New England Biolabstól szereztünk be, teljes mértékbe ι feltártuk. A humán proinzulint kódoló szekvencia nagyobb részét, valamint a terminátorszekvenciát, a rop gé ít, a replikációs origót és a cI857 karboxiterminális részét tartalmazó, megközelítőleg 4004 bp méretű fragmentumot gélen izoláltuk.
C. A Met-Arg linker szintézise
Az alábbi oligonukleotidokat szintetizáltuk: Sequence ID 12: 5’- TATGAGATTCGTT-3’
Sequence ID 13: 5’- AACGAATCTCA-3’.
Az oligonukleotidokat az 1. példa lejárása szerint temperáltuk, és kinázzal kezeltük. Az így kapott linker az alábbi volt:
TATGAGATTCGTT
I I I I I I I Η I I
ACTCTAAGCAA
A linker egy Ndel toldalékot tartalmazott (tapadós vég), és egy, a Hpal helynek megfelelő tompa véget.
D. A pHDM136 plazmid összeillesztése
A pHDM133 plazmid megközelítőleg 2256 bp méretű Nsil/Ndel fragmentumából körülbelül 0,5 pg mennyiséget, a pHDM133 plazmid megközelítőleg 4004 bp méretű Hpal/Nsil fragmentumából körülbelül 0,25 pg mennyiséget, és a példa C. pontja szerint előállított linkerből körülbelül 1 pg mennyiséget 50 pl ligálópufferrel, 1 mM ATP-vel, és 5 U T4 DNS-ligázza ligáltunk.
E. A pHDM136 plazmidtranszformáciö igazolása és a tenyészet hibridizációja
A példa D. pontja szerinti ligálóelegy 2 pl-ét 1:100 arányban felhígítottuk ΙχΤΕ-vel, és a hígított elegy 5 ml-ét használtuk fel az E. coli DH5a sejtek transzformálására. A transzformáláshoz a 8. példa szerinti elektroporációs eljárást alkalmaztuk. A transzform;íns sejteket 10 pg/ml tetraciklint tartalmazó L-agaron szelektáltuk. A tetraciklinrezisztens tenyészeteket tenyészethibridizációval ellenőriztük. A tenyészethibridizáeió céljából szondaként az alábbi oligonukleotidokat szintetizáltuk meg:
Sequence ID 14 (1. szonda) CAT ATG AGA TTC GTT AAC CA
Sequence ID 15 (2. szonda) CAT ATG TAT TTT GTT AAC ca
A tenyészethibridizáció a molekuláris biológia rutineljárása. A tenyészethibridizáció eljárását, valamint a
HU 218 269 Β kivitelezés lépéseit ismerteti a Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2d Edition Sambrook, Fritsch és Maniatis, Cold Spring Laboratory Press, 1989, 1.90-1.110. Az 1. szonda kapcsolódása (amit a szonda radioaktivitásával detektálunk) a transzformánsokat mutatja. A 2. szondát a Met-Tyr pro inzulint kódoló „vad típusú” szekvenciákhoz való kapcsolódás céljából terveztük. A 2. szondával hibridizálódott tenyészeteket eltávolítottuk. Az 1. szondával hibridizálódott, de a 2. szondával nem hibridizálódott tetraciklinrezisztens transzformánsokat 10 pg/ml tetraciklint tartalmazó L-broth táptalajon tenyésztettük. A plazmid DNS-t ezután az 1. példa eljárása szerint állítottuk elő. A pHDM136 plazmid azonosságának igazolása céljából a DNS-szekvenciát analizáltuk.
F. A pHDMl 81 plazmid létrehozása
A pHDM181 plazmidot a pHDM136 plazmid Ndel-Ncol fragmentumának a pHDM126 plazmid Ndel-Ncol fragmentumához ligálásával hoztuk létre. A pHDM126 és a pHDM136 plazmidok Ndel-gyel és Ncol-gyel történő feltárása eredményeképpen kapott restrikciós fragmentumokat agarózgél-elektroforézissel tisztítottuk meg. A pHDM136 plazmid Ndel-Ncol fragmentuma megközelítőleg 5,838 kb méretű fragmentumából körülbelül 2,0 pg mennyiséget, valamint a pHDM126 plazmid Ndel-Ncol fragmentuma megközelítőleg 415 bp méretű fragmentumából körülbelül 0,4 pg mennyiséget vízzel elegyítettünk, összesen 100 pl térfogatban. 10 pl 3 M nátrium-acetátot és 220 pl hideg etanolt adtunk hozzá. A DNS-t kicsaptuk, és a 7C. példa eljárása szerint ligáltuk. A ligálóelegyet ezután az E. coli MM294 transzformálására használtuk fel, lásd 8C. példa. A transzformáns sejteket 10 pg/ml tetraciklint tartalmazó L-agaron szelektáltuk. Ezután a plazmidokat izoláltuk a transzformánsokból, és restrikciós endonukleázos térképezésnek, valamint DNS-szekvenciaanalízlsnek vetettük alá a pHDM 181 plazmid azonosítása céljából. A pHDM181 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét a 14. ábrán mutatjuk be.
10. példa
A pHDMl 74 plazmid létrehozása
A. áttekintés
A pHDM174 plazmid a Met-Arg-HPI előnyös expressziós vektora. A pHDM174 plazmidot a pHDM plazmid Ndel-gyel és Hpal-gyel való feltárásával hoztuk létre, ezáltal eltávolítottuk a Met-Tyr-t kódoló szekvenciát, és helyére egy, a Met-Phe-t kódoló és az Ndel és a Hpal restrikciónak megfelelő terminussal rendelkező linkért illesztettünk.
B. A pHDM 157 eredetű fragmentum létrehozása
A pHDM 174 plazmidot (8. példa, 12. ábra) az 1. példa eljárása szerint hoztuk létre. A pHDM174 plazmidból 5 pg mennyiséget Ndel és Hpal restrikciós enzimek (mindegyik a NEB-től) alkalmazásával teljes mértékben feltártuk. A Met-Tyr szekvencia kivételével a teljes pHDM157 plazmidnak megfelelő nagy fragmentumot (megközelítőleg 6250 bp) gélen izoláltuk.
C. A Met-Tyr linker létrehozása
Az alábbi oligonukleotidokat szintetizáltuk meg:
Sequence ID 16: 5’ TATGTTTTTTGTT 3’
Sequence ID 17: 5’ AACAAAAAACA 3’
Az oligonukleotidokat az 1. példa eljárása szerint temperáltuk és kinázzal kezeltük. így az alábbi linkért kantuk:
5’ TATGTTTTTTGTT
I I I I I I I I I I I
ACAAAAAACAA 3’
A linker egy Ndel toldalékot (tapadós véget) és egy, a Hpal helynek megfelelő tompa véget tartalmazott.
D. A pHDMl 74 plazmid összeillesztése
A pHDM 157 plazmid Ndel-gyel és Hpal-gyel történő feltárása során kapott nagyobbik fragmentumból megközelítőleg 0,2 pg mennyiséget a példa C. pontjában kapott, megközelítőleg 1 pg Met-Phe linkerrel ligáltunk. A ligálási reakciót 50 pl teljes reakció-térfogatban hajtottuk végre.
E. A pHDMl 74 transzformáció és a tenyészethibridizálás igazolása
A D. pontban kapott ligálóelegyet E. coli DH5a sejtekbe elektrotranszformáltuk. Az elektroporációs eljárást (electroporation) a 8C. példában mutattuk be. A transzformánsokat a tetraciklinrezisztencia alapján szelektáltuk. A tetraciklinrezisztens tenyészeteket a 9E. példában ismertetett tenyészethibridizálásos eljárással analizáltuk. A tenyészethibridizálásos analízis során az alábbi szondákat alkalmaztuk:
Sequence ID 18 (1. szonda): CATATGTTTTTTGTTAACCA
Sequence ID 19 (2. szonda): CATATGTATTTTGTTAACCA
A tenyészeteknek az 1. szondával való hibridizálása a kívánt pHDM 174 plazmid jelenlétét mutatta. A 2. szonda a vad típusú vagy parenterális plazmid szekvenciájának felelt meg, mely a Met-Tyr humán proinzulint kódolta, és így a 2. szondával hibridizált tenyészeteket kidobtuk. Az 1. szondával hibridizált tenyészeteket pg/ml tetraciklint tartalmazó L-broth táptalajon tenyésztettük tovább. A plazmid DNS-t az 1. példa eljárása szerint izoláltuk, és a pHDM 174 plazmid jelenlétét DNS-szekvenálással igazoltuk. A pHDM 174 plazmido: az előnyben részesített E. coli R.V308 gazdába transzformáltuk a Met-Phe humán proinzulintermelése céljából. A pHDM 174 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét a 27. ábrán mutatjuk be.
példa
A pHDMl51 plazmid létrehozása
A. Áttekintés
A pHDM 151 a MY-HPI előnyös expressziós vektora. A pHDM151 plazmidban a MY-HPI expressziót egy módosított lambda-pL promoter irányítja. A módosított lambda-promoter, a P Syn 3 egy -10 konszenzus (consensus) szekvenciát és egy elmozdított (shifted) ÖLI régiót tartalmaz. A P Syn 3 promotert a P Syn 3 plazmidból állítottuk elő a példa B. pontjában ismertetett eljárás szerint. A közbenső pHDMl31 plazmid létrehozását a példa C. pontjában, míg a kívánt pH DM151 plazmid összeillesztését a példa D. pontjában ismertettük.
HU 218 269 Β
Β. A P Sin 3 plazmid létrehozása
1. Az EcoRI-Bqlll-vel feltárt pLlIO plazmid létrehozása
A pLUO plazmid megközelítőleg 6,0 kb méretű
EcoRI-BqlII restrikciós fragmentumát (lásd 1A. példa) az 1. példa eljárása szerint hoztuk létre.
2. A transzkripciós aktiválószekvencia létrehozása Az alábbi DNS-szegmensekből egy transzkripciós aktiválószekvenciát hoztunk létre:
Sequence ID 20 5 ’ - A ATTC AA A A A ΑΤΑ A ATTCCATATAAAAAACATACAGTTAACCATCTGCGGTGATAAATATTTATCTCTGGCGGTGTTGACATA-3’
Sequence ID 21 5’-TACCACTGGCGGTGATATAATG-3’
Sequence ID 22 5’-AGCACATCA-3’
Sequence ID 23 5’-ATTTATCACCGCAGATGGTTAACTGTATGTTTTTTATATGAATTT ATTTTTTG-3’
Sequence ID 24 5’-CAACACCGCCAGAGATAAAT-3
Sequence ID 25 5’-TCACCGCCAGTGGTATATGT-3’
Sequence ID 26 5’-GATCTGATGTGCTCATTATA-3’ Ezeket az oligonukleotidokat egy automata DNSszintetizátoron (Applied Biosystems, 850 Lincoln Center Dr. Foster City, CA 94404) szintetizáltuk meg az 1. példa eljárása szerint. A szintetikus DNS-szegmenseket TE-pufferben feloldottuk és 0 °C-on tároltuk.
A Sequence ID 21-Sequence ID 25 szintetikus oligonukleotidokból 1 nmol mennyiséget 1 μΐ (megközelítőleg 1 egység) T4 polinukleotid-kinázzal, 50 mM Trisz-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol (DTT), és 0,3 mM adenozin-5’-trifoszfát (ATP) jelenlétében 100 μΐ teljes reakció-térfogatban 30 perc alatt 37 °C-on foszforileztünk. Ezt az inkubálást tízperces újabb inkubálás követte 65 °C-on, majd a mintát lefagyasztottuk. Az egyes foszforilezett oligonukleotidokból 1 nmol mennyiséget 1,2 nmol nem foszforilezett oligonukleotiddal (Sequence ID 21 és Sequence ID 26) elegyítettünk 100 μΐ reakciópufferben, mely 50 mM Trisz-HCl-t (pH 7,6), 10 mM MgCl2-t, 10 mM ditiotreitolt (DTT), 0,5 mM ATP-t és 10 egység T4 polinukleotid-kinázt tartalmazott. A reakcióelegyet 40 °C-on egy éjszakán keresztül inkubáltuk. Az inkubálás után a ligáit 113 bázispárból álló kétszálú DNSfragmentumot gélelektroforézissel, 15%-os poliakrilamidgélen tisztítottuk meg. A DNS-fragmentumot a gélből eltávolítottuk, és 2 M trietil-ammónium-bikarbonátpufferes (pH 7,9) extrakcióval, majd DE-52 oszlopon történő kisózással (lásd Brown, E. és társai, Methods in Enzymology, 68:101) nyertük vissza. Az izolálás után a DNS-fragmentumot T4 polinukleotid-kinázzal foszforileztük a fent már ismertetett eljárás szerint. A kinázreakció után a DNS-t Sephadex G-50 oszlopra (Pharmacia, P-L Biochemicals, Inc. 800 Centennial Avenue, Piscataway, NJ 08854) vittük, majd izoláltuk, és 50 μΜ 10 mM Trisz-HCl-ben tároltuk (pH 8,0).
Ezt a DNS-fragmentumot az alábbi DNS-szegmensekből az 1. példa eljárása szerint is létrehozhatjuk: SequenceID 27 ’ - A ATTC A AA AAAT A A ATTC ATAT A A AA AACATACAGTTAACCATCTGCGGTGATAAATATTTATCTCTGGCGGTGTTGACATATACCACTGGCGGTGATATAATGAGCACATCA -3’ SequenceID 28
5’-GATCTGATGTGCTCATTATATCACCGCCAGTGGTATATGTCAACACCGCCAGAGATAAATATTTATCACCGCAGATGGTTAACTGT ATGTTTTTT ATATG AATTT ATTTTTTG-3 ’
3. A P Syn 3 plazmid létrehozása
A példa 1. lépésében kapott restrikciós fragmentum 2 pg-ját és a példa 2. lépésében kapott, kinázzal kezelt DNS-fragmentum 1 pg-ját ligáltuk az ID. példa eljárása szerint. A ligáit DNS egy részét alkalmaztuk az E. coli RK12 RV308 sejtek ligálására (lásd 8C. példa). A etraciklinrezisztens tenyészeteket az 1. példában ismertetett eljárással szelektáltuk. A P Syn 3 szerkezetét restrikciós enzimes analízissel igazoltuk.
C. A közbenső pHDM131 plazmid létrehozása
A pHDM 131 plazmidot a P syn 3 plazmid 0,9 kb méretű SalL/BqlII restrikciós fragmentumának (lásd a példa B. pontja), a pHDM 128 plazmid megközelítőleg 4,471 kb méretű SalL/BqlII restrikciós fragmentumával (mely B-18788 számon az alábbi helyről szerezhető be Northern Régiónál Research Laboratory [NRRL]) való ligálásával hoztuk létre. A pHDM 128 plazmidot az
1. példa eljárása szerint hoztuk létre. A pHDM 128 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét a 15. ábrán mi tatjuk be. A restrikciós endonukleázokat a Boehringei -Mannenheimtől szereztük be. Megközelítőleg
2, C pg mennyiségű P Syn 3 plazmidot tártunk fel, így a megközelítőleg 0,9 kb méretű SalL/BqlII restrikciós fragmentumból megközelítőleg 0,3 pg mennyiséget kaptunk. Megközelítőleg 0,6 pg mennyiségű pH DM 128 plazmidot tártunk fel, így a megközelítőleg 4,471 kb méretű SalL/BqlII restrikciós fragmentumból megközelítőleg 0,5 pg mennyiséget kaptunk. A fragmentumokat a 3A. példa eljárása szerint gélen izoláltuk; az ID. példa eljárása szerint ligáltuk; és a 8C. példa eljárása szerint elektrotranszformáltuk. A pHDM 131 plazmidot az 1G. példa eljárása szerint izoláltuk.
D. A kívánt pHDMISI plazmid létrehozása
A pHDM151 plazmidot a pHDM 131 plazmid megközelítőleg 0,573 kb méretű EcoRI/NcoI restrikciós fragmentumának (lásd a példa C. pontja), a pHDM 125 plazmid megközelítőleg 5,709 kb méretű EcoRI/NcoI restrikciós fragmentumával (mely B-18787 számon az alábbi helyről szerezhető be: Northern Régiónál Research Laboratory [NRRL]) való ligálásával hoztuk létre. A pHDM 125 plazmidot az 1. példa eljárása szerint hoztuk létre. A restrikciós endonukleázokat a New England Biolabstól szereztük be. A feltárási eljárás után az eladó fél utasításait követtük. A pHDM131 plazmidot feltártuk, így a kívánt, megközelítőleg 0,573 kb méretű EcoRI/NcoI fragmentumból 0,4 pg-t kaptunk. A restrikciós fragmentumot gélen izoláltuk; az ID. példa eljárása tzerint ligáltuk, és a 8C. példa eljárása szerint E. coli
HU 218 269 Β
DH5a sejtek elektrotranszformálására alkalmaztuk. A pHDMl 51 plazmid azonosságát restrikciós endonukleázos térképezéssel igazoltuk. A pHDM151 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét a 16. ábrán mutatjuk be.
12. példa
A pHDMl 52 plazmid létrehozása
A. Áttekintés
A pHDM152 plazmidot a pHDM131 plazmid megközelítőleg 0,114 kb méretű EcoRI/BqlII restrikciós fragmentumának a pHDM125 plazmid megközelítőleg 6,184 kb méretű EcoRI/BqlII restrikciós fragmentumával való ligálásával hoztuk létre.
B. A pHDMl 52plazmid létrehozása
A pHDM152 plazmidot EcoRI-gyel és BqlII-vel feltártuk, így a megközelítőleg 0,114 kb méretű EcoRI/BqlII fragmentumból megközelítőleg 0,25 pg-ot kaptunk. A pHDM125 plazmidot EcoRI-gyel és BqlIIvel feltártuk, így megközelítőleg 6,184 kb méretű EcoRI/BqlII fragmentumból megközelítőleg 4,6 pg-ot kaptunk. Az EcoRI-et és BqlII-at a Boehringer-Mannenheimtől szereztük be. A fragmentumokat gélen izoláltuk, és ligáltuk a 2. példa eljárása szerint; ezután a 8C. példa eljárása szerint E. coli DH5a sejtek elektrotranszformálására alkalmaztuk. A pHDM151 plazmid azonosságát restrikciós endonukleázos térképezéssel igazoltuk. A pHDMl 51 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét a 17. ábrán mutatjuk be.
A pHDM152 plazmidot az E. coli DH5a sejtekből az 1. példa eljárása szerint izoláltuk, és a 8C. példa eljárása szerint E. coli RV308 sejtek elektrotranszformálására alkalmaztuk.
13. példa
A pHDMl 53 plazmid létrehozása
A pHDMl 53 plazmid a pHPR97 plazmid megrövidített lambda-pL promoterét alkalmazza (lásd 4. példa, 2. ábra) a találmány szerinti transzlációs aktiválószekvenciát tartalmazó, és működőképesen egy MY-HPI kódolószekvenciához kapcsolt mRNS transzkripciója irányítására.
A pHPR97 plazmidból 4 pg mennyiséget Sáli és BqlII alkalmazásával feltártunk. A kívánt, megközelítőleg 0,922 kb méretű Sall/BqlII fragmentumot gélen izoláltuk. A pHDM125 plazmidból (lásd 11. példa) 2 pg mennyiséget Sáli és BqlII alkalmazásával feltártunk. A kívánt, megközelítőleg 5,407 kb méretű Sall/BqlII fragmentumot gélen izoláltuk. A Sall-et és a BqlII-t a Boehringer-Mannenheimtől szereztük be. A pHDM125 és a pHPR97 plazmidok Sall/BqlII fragmentumát az 1. példa eljárása szerint ligáltuk, majd a 8C. példa eljárása szerint E. coli DH5a sejtek elektrotranszformálására alkalmaztuk. A pHPR97 plazmid megközelítőleg 0,922 kb méretű Sall/BqlII fragmentumának, és a pHDM125 plazmid megközelítőleg 5,407 kb méretű Sall/BqlII fragmentumának ligálása eredményeképpen a közbenső pHDM144 plazmidot kaptuk.
A pHDM144 plazmidot az IG. példa eljárása szerint kezeltük. A pHDM144 plazmid megközelítőleg pg mennyiségét BqlII-vel és Ncol-gyel feltártuk. A pHDM144 plazmid megközelítőleg 5,850 kb méretű BqlII/NcoI fragmentumát gélen izoláltuk. A pHDM128 plazmid megközelítőleg 4 pg mennyiségét BqlII-vel és Ncol-gyel feltártuk. A pHDM128 plazmid megközelítőleg 0,459 kb méretű BqlII/NcoI fragmentumát a 3A. példa eljárása szerint gélen izoláltuk. A BqlII-et és a Ncol-et a Boehringer-Mannenheimtől szereztük be. A pHDM144 plazmid megközelítőleg 5,850 kb méretű BqlII/NcoI fragmentumát és a pHDM128 plazmid megközelítőleg 0,459 kb méretű BqlII/NcoI fragmentumát ligáltuk a pHDM153 létrehozása céljából. Az E. coli DH5a sejtek elektrotranszformálását a 8C. példa eljárása szerint hajtottuk végre. A pHDM153 plazmidot izoláltuk, és restrikciós endonukleázos térképezésnek veteitük alá. Ezután a pHDM153 plazmidot alkalmaztuk az E. coli RV308 transzformálására. A pHDM1531 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét a 18. ábrán mutatjuk be.
14. példa
A oHDM154plazmid létrehozása
A. Áttekintés
A pHDM154 az MY-HPI előnyös expressziós vektora. A pHDM 154 plazmid egy módosított lambda-pL promotert alkalmaz (Pl06) a találmány szerinti transzlációs aktiválószekvenciát tartalmazó és működőképesen egy MY-HPI kódolószekvenciához kapcsolt mRNS transzkripciója irányítására.
B. A közbensőpHPRIOóplazmid létrehozása
A pHPRIOó plazmidot az 5. példa eljárása szerint hoztuk létre. Ugyanakkor az alábbi egyszálú DNS-ekből szintetikus transzkripciós aktiválószekvenciát hoztunk létre (P106):
SequenceID 29
5’-AATTCATACAGATAACCATCTGCGGTGATAAATTATCTCTGGCGGTGTTGACATAAATACCACTGGCGGTTATAATGAGCACATCA-3 ’ SequenceID 30 ’-GATCTGATGTGCTCATTATAACCGCCAGTGGTATTTATGTCAACACCGCCAGAGATATTTATCACCGCAGATGGTTATCTGTATG-3’
A pHPRIOó restrikciós helyét és funkciós térképét a 19. ábrán mutatjuk be.
C A közbensőpHDM146plazmid létrehozása
A pHDM146 plazmidot a pHPRIOó plazmid megközelítőleg 0,866 kb méretű SalII/BqlII fragmentumának a pHDM125 plazmid megközelítőleg 5,407 kb méretű SalII/BqlII fragmentumával való ligálásával hoztuk létre. A Salll-et és a BqlII-et a Boehringer-Mannenheimtől szereztük be. A pHPRIOó plazmidból megközelítőleg 4 pg mennyiséget és a pHDM125 plazmidból megközelítőleg 4 pg mennyiséget tártunk fel. A pHPRIOó plazmid megközelítőleg 0,866 kb méretű SalII/BqlII fragmentumából megközelítőleg 0,3 pg mennyiséget, és a pHDM125 plazmid megközelítőleg 5,407 kb méretű SalII/BqlII fragmentumából megközelíiőleg 0,6 pg mennyiséget kaptunk. A ligálás és a transzformálás eljárását az 1., illetve a 8C. példa eljárási szerint hajtottuk végre. A transzformáláshoz E. coli
HU 218 269 Β
DH5a sejteket alkalmaztunk, és a transzformált E. coli DH5a sejteket alkalmaztuk a pHDM146 plazmidnak az 1. példa eljárása szerint történő létrehozására. A pHDM146 restrikciós helyét és funkciós térképét a 20. ábrán mutatjuk be.
D. A pHDM 154 plazmid létrehozása A pHDM154 plazmidot a pHDM146 plazmid megközelítőleg 5,794 kb méretű BqlII/NcoII fragmentumának körülbelül 1,8 pg mennyisége és a pHDM128 plazmid megközelítőleg 0,459 kb méretű BqlII/NcoII fragmentumának körülbelül 0,5 pg mennyisége ligálásával hoztuk létre. A BqlII-et és a NcoII-et a Boehringer-Mannenheimtől szereztük be. A gélről izolált fragmentumokat az 1. példa eljárása szerint E. coli DH5a sejtekbe transzformáltuk a 8C. példa eljárása szerint. A pHDM 154 plazmid azonosságát restrikciós endonukleázos térképezéssel hajtottuk végre. A pHDM154 plazmid azonosságának igazolása után a 8C. példa eljárása szerint E. coli RV3O8 sejteket transzformáltunk a pHDM154 plazmiddal. A pHDM154 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét a 21. ábrán mutatjuk be.
75. példa
A pHDM147plazmid létrehozása
A pHDM146 plazmid módosított lambda-pL promotert alkalmaz a találmány szerinti transzlációs aktiválószekvenciát tartalmazó mRNS transzkripciója irányítására. A pHDM146 plazmidot a pHDM125 plazmid megközelítőleg 5,706 kb méretű EcoRI/NcoI fragmentumának és a pHDM128 plazmid megközelítőleg 0,545 kb méretű EcoRI/NcoI fragmentumának ligálásával hoztuk létre. A pHDM146 plazmidból körülbelül 1,7 pg mennyiséget tártunk fel EcoRl-gyel és Ncol-gyel, így a kívánt 5,706 kb méretű fragmentumból megközelítőleg 1,4 pg mennyiséget kaptunk. A pHDM128 plazmidból körülbelül 4,0 pg mennyiséget tártunk fel EcoRI-gyel és Ncol-gyel, így a kívánt fragmentumból megközelítőleg 0,4 pg mennyiséget kaptunk. A restrikciós fragmentumokat az 1. példa eljárása szerint ligáltuk, majd E. coli DH5a sejtekbe transzformáltuk a 8C. példa eljárása szerint. Az E. coli DH5a/pHDM147 transzformánsokból a plazmidokat az 1. példa eljárása szerint izoláltuk, és restrikciós endonukleázos térképezésnek vetettük alá. A pHDM147 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét a 22. ábrán mutatjuk be.
16. példa
A pHDM148plazmid létrehozása
A pHDM148 plazmid a pHDM147 plazmidhoz hasonlít; az, hogy a pHDM 148 plazmid nem alkalmazza a találmány szerinti transzlációs aktiválószekvenciát, nem okoz különösebb eltérést. A pHDM148 plazmidot a pHDM125 plazmid megközelítőleg 5,706 kb méretű EcoRI/NcoI fragmentumának és a pHDM 133 plazmid megközelítőleg 0,565 kb méretű EcoRI/NcoI fragmentumának ligálásával hoztuk létre. így a pHDM148 plazmidot a 16. példa eljárása szerint hoztuk létre. A pHDM133 plazmid megközelítőleg 0,565 kb méretű EcoRI/NcoI fragmentumának a 15. példa szerinti pHDM128 plazmid megközelítőleg 0,545 kb méretű EcoRI/NcoI fragmentuma helyére történő beillesztésével a pHDM148 plazmidot kaptuk. A pHDM148 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét a 23. ábrán mutatjuk be.
77. példa
A pHDM167plazmid létrehozása
A. Áttekintés
A pHDM167 plazmid módosított lambda-pL promotert alkalmaz egy MY-HPI-t kódoló szekvenciához kapcsolt, a találmány szerinti transzlációs aktiválószekvenciát tartalmazó mRNS transzkripciója irányítására. A módosított lambda-pL promotert P159-cel jelöltük, ami azt jelenti, hogy azt a pHDM159-ből állítottuk elő. A pHDM159 plazmid (amit a példa B. fejezetében ismertettünk) módosított lambda-pL promoterét (Pl59) pHDM147 plazmid megközelítőleg 5,706 kb méretű EcoRI/NcoI fragmentumával (lásd 15. példa, 22. ábra) ligáltuk, így hoztuk létre a pHDM167 plazmidot.
B. A pHDM159plazmid létrehozása
A pHDM159 plazmidot a 4. példa eljárása szerint hoztuk létre. Ugyanakkor az alábbi egyszálú DNSekből szintetikus transzkripciós aktiválószekvenciát hoztunk létre (Pl59):
SequenceID 31 ’ - A ATTC AT AC AGAT A ACC ATCTGCGGTGATAAATTATCTCTGGCGGTGTTGACATAAATACCACTGGCGGTGGTACTGAGCACATCA-3’
SequenceID 32
5’-GATCTGATGTGCTCAGTACCACCGCCAGTGGTATTTATGTCAACACCGCCAGAGATAATTTATCACCGCAGATGGTTATCTGTATG-3’
A pHDM 159 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét a 24. ábrán mutatjuk be.
C. A pHDM 167plazmid létrehozása
A pHDM 159 plazmidból megközelítőleg 4,0 pg mennyiséget EcoRI-gyel és Ncol-gyel feltártunk, így a kívánt 0,545 kb méretű EcoRI/NcoI fragmentumból körülbelül 0,4 pg mennyiséget kaptunk. A pHDM 147 plazmidból megközelítőleg 1,7 pg mennyiséget EcoRI-gyel és Ncol-gyel feltártunk, így a kívánt 5,709 kb méretű EcoRI/NcoI, fragmentumból körülbelül 1,4 pg mennyiséget kaptunk. A fragmentumokat az 1. példa eljárása szerint gélen tisztítottuk, és ligáltuk, majd E. coli DH5a sejtekbe transzformáltuk a 8C. példa eljárása szerint. Az
E. coli DH5a/pHDM 167-ből a plazmidokat az 1. példa eljárása szerint izoláltuk, majd a pHDM 167 plazmid azonosítása céljából restrikciós endonukleázos térképezésnek vetettük alá. A pHDM 167 plazmiddal a 8C. példa eljáiása szerint E. coli RV3O8 sejteket transzformáltunk. A pHDM 167 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét a 25. ábrán mutatjuk be.
18. példa
A pHDM 168 plazmid létrehozása
A pHDM 168 plazmidot a pHDM 159 plazmid megközelítőleg 0,866 kb méretű Sall/BqlII fragmentumának (lásd 17B. példa, 24. ábra) és a pHDM 148 plazmid
HU 218 269 Β megközelítőleg 5,408 kb méretű Sall/BqlII fragmentumának (lásd 16, példa, 23. ábra) ligálásával hoztuk létre. A Sall-et és a BglII-t a NEW-től szereztük be. A pHDM 159 plazmid megközelítőleg 4,0 pg mennyiségéből a kívánt, körülbelül 0,866 kb méretű Sall/BqlII fragmentum megközelítőleg 0,3 pg menynyiségét kaptuk meg. A pHDM 148 plazmid megközelítőleg 2,0 pg mennyiségéből a kívánt, körülbelül 5,408 kb méretű Sall/BqlII fragmentum megközelítőleg 0,6 pg mennyiségét kaptuk meg. A fragmentumokat a 17. példában ismertetett eljárás szerint a gélről izoláltuk, ligáltuk, és E. coli DH5a sejtekbe transzformáltuk. A pHDM 168 plazmid azonosítását restrikciós endonukleázos térképezéssel hajtottuk végre. A pHDM 168 plazmid azonosságának igazolása után a 8C. példa eljárása szerint E. coli RV308 sejteket transzformáltunk az pHDM 168 plazmiddal. A pHDM 168 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét a 26. ábrán mutatjuk be.

Claims (15)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Transzlációs aktiválószekvencia, azzal jellemezve, hogy a transzlációs aktiválószekvencia az alábbi oligonukleotidszekvenciával rendelkezik:
    ATCAGATCTATTAATAATG.
  2. 2. Rekombináns DNS-expressziós vektor, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti transzlációs aktiválószekvenciához működőképesen kapcsolt és egy polipeptidterméket kódoló DNS-szekvenciához működőképesen kapcsolt, transzkripciós aktiválószekvenciát tartalmaz.
  3. 3. A 2. igénypont szerinti rekombináns DNS-expressziós vektor, azzal jellemezve, hogy a transzlációs aktiválószekvencia működőképesen egy lambd-pL fág eredetű transzkripciós aktiválószekvenciához kapcsolódik.
  4. 4. A 3. igénypont szerinti rekombináns DNS-expressziós vektor, azzal jellemezve, hogy az említett polipeptidtermék egy humán inzulinprekurzor.
  5. 5. A 4. igénypont szerinti rekombináns DNS-expressziós vektor, azzal jellemezve, hogy az említett polipé ptidtermék Met-Phe humán proinzulin.
  6. 6. A 4. igénypont szerinti rekombináns DNS-expressziós vektor, azzal jellemezve, hogy az említett polipeptidtermék Met-Arg humán proinzulin.
  7. 7. A 4. igénypont szerinti rekombináns DNS-expressziós vektor, azzal jellemezve, hogy az említett polipeptidtermék Met-Tyr humán proinzulin.
  8. 8. Az 5. igénypont szerinti rekombináns DNS-expressziós vektor, azzal jellemezve, hogy az pHDM 174 plazmid.
  9. 9. A 6. igénypont szerinti rekombináns DNS-expressziós vektor, azzal jellemezve, hogy az pHDM181 plazmid.
  10. 10. A 7. igénypont szerinti rekombináns DNS-expressziós vektor, azzal jellemezve, hogy az pHDM 126 plazmid.
  11. 11. Eljárás egy polipeptidtermék előállítására, azzal jellemezve, hogy a 2. igénypont szerinti rekombináns DNS-expressziós vektorral transzformált gazdasejteket tenyésztünk olyan körülmények között, melyek alkalmasak a tenyésztésre és a polipeptidtermék termelésére.
  12. 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett polipeptidtermék humán inzulinprekurzor.
  13. 13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett humán inzulinprekurzor Met-Arg humán proinzulin.
  14. 14. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve. hogy az említett humán inzulinprekurzor Met-Phe humán proinzulin.
  15. 15. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett humán inzulinprekurzor Met-Tyr humán proinzulin.
HU9203981A 1991-12-18 1992-12-16 Új transzlációs aktiváló szekvencia HU218269B (hu)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US81104591A 1991-12-18 1991-12-18

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9203981D0 HU9203981D0 (en) 1993-04-28
HUT65816A HUT65816A (en) 1994-07-28
HU218269B true HU218269B (hu) 2000-06-28

Family

ID=25205390

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9203981A HU218269B (hu) 1991-12-18 1992-12-16 Új transzlációs aktiváló szekvencia

Country Status (12)

Country Link
EP (1) EP0547873B1 (hu)
JP (1) JPH05276950A (hu)
AT (1) ATE157122T1 (hu)
AU (1) AU663139B2 (hu)
CA (1) CA2085447A1 (hu)
DE (1) DE69221708T2 (hu)
DK (1) DK0547873T3 (hu)
ES (1) ES2104856T3 (hu)
GR (1) GR3024762T3 (hu)
HU (1) HU218269B (hu)
IL (1) IL104086A (hu)
MX (1) MX9207265A (hu)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2002232758A1 (en) 2000-12-26 2002-07-08 Monsanto Technology Llc Recombinant dna vectors for expression of somatotropins

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5126249A (en) * 1989-05-09 1992-06-30 Eli Lilly And Company Enzymatic removal of a protein amino-terminal sequence
IL99100A0 (en) * 1990-08-13 1992-07-15 Lilly Co Eli Improved bacteriophage lambda pl promoters

Also Published As

Publication number Publication date
HU9203981D0 (en) 1993-04-28
GR3024762T3 (en) 1997-12-31
MX9207265A (es) 1993-07-01
EP0547873B1 (en) 1997-08-20
DE69221708T2 (de) 1998-01-22
JPH05276950A (ja) 1993-10-26
HUT65816A (en) 1994-07-28
ATE157122T1 (de) 1997-09-15
DE69221708D1 (de) 1997-09-25
EP0547873A3 (hu) 1994-08-31
DK0547873T3 (da) 1997-09-15
ES2104856T3 (es) 1997-10-16
CA2085447A1 (en) 1993-06-19
AU663139B2 (en) 1995-09-28
IL104086A0 (en) 1993-05-13
IL104086A (en) 1998-03-10
EP0547873A2 (en) 1993-06-23
AU3019592A (en) 1993-06-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR900005776B1 (ko) 인터페론의 제조방법
EP0095361B1 (en) Cloning vectors for expression of exogenous protein
JP3837154B2 (ja) 遺伝子発現用プロモーター
NO177540B (no) Fremgangsmåte for fremstilling av heterologe proteiner i Bombyx mori samt plasmid og rekombinant Bombyx mori nukleært polyhedrosevirus (BmNPV)
US6316224B1 (en) Chlorella virus promoters
US6395965B1 (en) Plant containing a gene construct comprising a chlorella virus promoter and a lac operator
Tsurimoto et al. Bacteriophage lambda initiators: preparation from a strain that overproduces the O and P proteins
US4795706A (en) Novel expression control sequences
US5063158A (en) Recombinant DNA expression vector comprising both transcriptional and translational activating sequences
US7070989B2 (en) Escherichia coli strain secreting human granulocyte colony stimulating factor (G-CSF)
EP0146901B1 (en) A promotor and use thereof
EP0159123B1 (en) Vectors for expressing bovine growth hormone derivatives
HU218269B (hu) Új transzlációs aktiváló szekvencia
HU202587B (en) Process for producing recombinant dna expression vectors and for gene expression
Giza et al. A self-inducing runaway-replication plasmid expression system utilizing the Rop protein
EP0471514A2 (en) Improved bacteriophage lambda pL promoters
HUT63461A (en) Process for producing phky334 plasmid, its ek-bgh expression vector and host cells transformed by it
US5576190A (en) Bacteriophage Lambda pL promoters
EP0493926A1 (en) A method for enhancing the structural stability of recombinant DNA expression vectors
Nam et al. Design and cloning of the gene for a novel insulin analogue,(B 30-homoserine) human insulin
WO1987002384A1 (en) Expression systems for overproduction of desired proteins

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee