JP3837154B2 - 遺伝子発現用プロモーター - Google Patents
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Description
本発明の一態様によれば、細菌宿主内におけるタンパク質の発現に有用な新規組換えDNA構築体が提供される。この構築体は、タンパク質のコード領域と、それに操作可能(operably)に連結する。
5′-TTGACAACATAAAAAACTTTGTGTTATACT-3′
および
5′-TTGACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATACT-3′
から選択されるDNA配列を有するプロモーターを含む制御領域によって構成される。
本発明は、細菌宿主たとえば大腸菌内において、高度に効率的なDNAの発現を駆動させるのに有用なDNA配列を提供する。これらの配列からなる発現ベクターの使用は、同種および異種の両方の発現タンパク質の産生の増大を達成するために有用な手段を与える。本発明の一態様においては、細菌宿主内でのタンパク質の発現に有用な新規組換えDNA構築体が提供される。この構築体はタンパク質のコード領域と、このタンパク質に操作性に連結して宿主内におけるこのタンパク質の発現を可能にするプロモーターを含む制御領域を含み、この場合プロモーターは、
5′-TTGACAACATAAAAAACTTTGTGTTATACT-3′
および
5′-TTGACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATACT-3′
から選択されるDNA配列を有する。
5′-TTGACAACATAAAAAACTTTGTGTTATACT-3′
のプロモーターに対する発現制御下に操作性に連結しているDNA構築体を提供するものである。
pBR322およびpUC系のプラスミドが好ましい。適当なベクター中に導入されたならば、生成したプラスミドを宿主内で以下のクローニング作業に十分な量が得られるように増殖させる。選ばれたタンパク質をコードするDNAは、標準的なクローニング/ライゲーション法を用い、多重クローニング部位を有するプラスミドへの導入が便利なことは自明である。また、プラスミドにより当然、複製の起源が導入され、トランスフォームされた細胞の選択を可能にするためのマーカー、たとえばアンピシリンもしくはテトラサイクリン抵抗性遺伝子も導入されることがとくに望ましい。また3つのすべてのリーディングフレームでの翻訳停止コドンおよび正しく配置された転写停止領域が所望のタンパク質の満足できる発現に必要なことも自明の通りである。適当な転写ターミネーターには大腸菌trpA、thr、hisおよびphe遺伝子の転写ターミネーターが包含される。
その成熟型においてPTHは84−アミノ酸ペプチドであり、ヒトでは血中カルシウムを上昇させ、骨形成を調節する作用を有する。ヒトのPTHをコードするDNAは、確立された方法を用い、Hendyら(前出)によって発表されたアミノ酸配列に従って合成され、以下に記載する構築体内に、図1に示すように導入された。
以下に示す表1および図1に例示したプロモーター#1および#2を導入した好ましい組換えDNA構築体、ならびに対照プロモーター#3および#4を導入した構築体は、ホスホルアミダイト法によって合成された一本鎖オリゴヌクレオチドから製造した。XhoIからEcoRI制限部位までの配列からなるゲル精製鎖をついで初期PCR標的として使用し、示した初期オリゴヌクレオチド配列もしくはその相補性鎖いずれかの末端に特異的にハイブリダイズする相補性の一本鎖DNAオリゴヌクレオチドを用い二本鎖DNAフラグメントにPCR増幅した。すなわち構築体は、たとえばManiatisら(“Molecular Cloning”, Cold Spring Harbor Labo-ratories, 1982)ならびに Innisら(“PCR Protocols, A Guide toMethods and Applications”)に記載されている標準遺伝子合成法を用いて調製される。
この構築体をついで、アンピシリン抵抗性に代えテトラサイクリン抵抗性を付与するpUC18誘導プラスミドにクローン化した。次にJM101誘導大腸菌宿主株を確立された技術(Maniatisら, “Molecular Cloning”,Cold Spring Harbor Laboratory, 1982)に従ってトランスフェクトした。
PTHベクターを含有するトランスフォーマントを、0.5%グルコースおよびテトラサイクリンを含有する2YT培地中30℃において一夜培養し、同一組成の新鮮な培地中に接種し、中間対数期に達するまで30℃で培養を続けた。培養液をついで1時間の増殖間隔で誘導し(1mM IPTG)、培養液のアリコートを採取し、分画化して培養培地のサンプルを作成し、分泌されたPTH産物を標準Allegroアッセイを用いて同定した。結果は以下の表1に示す。
Claims (12)
- 細菌宿主細胞内でタンパク質を発現する組換えDNA構築体において、タンパク質のコード領域がそのタンパク質の宿主細胞内での発現を促進するプロモーターを含む制御領域に操作可能に連結してなり、そのプロモーターは
5′-TTGACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATACT-3′ (配列番号:2)
からなるDNA配列であることを特徴とする組換えDNA構築体。 - 細菌細胞が大腸菌細胞である請求項1に記載の組換えDNA構築体。
- 制御領域はさらにタンパク質の発現を調節するオペレーターを含む請求項1または2に記載の組換えDNA構築体。
- オペレーターがlacオペレーターである請求項3に記載の組換えDNA構築体。
- タンパク質がヒト副甲状腺ホルモンである請求項1〜4のいずれか一項に記載の組換えDNA構築体。
- 宿主細胞のペリプラスムへのタンパク質の分泌を促進する、コード領域とリーディングフレームの合致したOmpAシグナルペプチドをコードするDNAをさらに含む請求項1〜5のいずれか一項に記載の組換えDNA構築体。
- 制御領域が、DNA配列:
ATTAAAGAGGAGAAATTAAGC (配列番号:5)
をもつT5リボソーム結合部位を含む請求項1〜6のいずれか一項に記載の組換えDNA構築体。 - 制御領域が、DNA配列:
5′-CTCGAGGCCACCCGGGCCAAAATTTATCAAATTGACACTTTATGCTTCCG
GCTCGTATACTGTCGACAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGAATTC -3′ (配列番号:13)
を含む請求項1〜7のいずれか一項に記載の組換えDNA構築体。 - 請求項1〜8のいずれか一項に記載の組換えDNA構築体を含むベクター。
- 請求項9に記載のベクターでトランスフォームされた細菌宿主細胞。
- 大腸菌細胞である請求項10に記載の細菌宿主細胞。
- 請求項10または11に記載の宿主細胞をタンパク質が産生される条件下で培養し、次いでそのタンパク質を回収することからなる組換えタンパク質の製造方法。
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