JPH06113855A - プラスミドｐＨＫＹ３３４、ＥＫ−ＢＧＨのための発現ベクター及びそれにより形質転換された宿主細胞 - Google Patents
プラスミドｐＨＫＹ３３４、ＥＫ−ＢＧＨのための発現ベクター及びそれにより形質転換された宿主細胞Info
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−（Ａｓ
ｐ）4−Ｌｅｕ−ＢＧＨ（ＥＫ−ＢＧＨ）の発現ベクタ
ーであるプラスミドｐＨＫＹ３３４、該プラスミドを保
持する宿主細胞、及び該宿主細胞を培養することを特徴
とするＥＫ−ＢＧＨの生産方法を提供する。 【効果】 上記発現プラスミドはＥＫ−ＢＧＨ発現の誘
導時にその構造が安定であり、ＥＫ−ＢＧＨの高レベル
産生を可能にする。
ｐ）4−Ｌｅｕ−ＢＧＨ（ＥＫ−ＢＧＨ）の発現ベクタ
ーであるプラスミドｐＨＫＹ３３４、該プラスミドを保
持する宿主細胞、及び該宿主細胞を培養することを特徴
とするＥＫ−ＢＧＨの生産方法を提供する。 【効果】 上記発現プラスミドはＥＫ−ＢＧＨ発現の誘
導時にその構造が安定であり、ＥＫ−ＢＧＨの高レベル
産生を可能にする。
Description
【０００１】多くの原核生物及び真核生物の遺伝子が、
大腸菌のような原核生物において高いレベルで発現され
てきた。一般的な試みは、クローニングされた遺伝子の
転写及び翻訳のための有効なリボゾーム結合サイト及び
強力なプロモーターを備えた多コピークローニングベク
ターを使用することであった［Ｙ．マスイ、Ｊ．コール
マン、及びＭ．イノウエ（１９８３）、エクスペリメン
タル・マニピュレーション・オブ・ジーン・エクスプレ
ッション（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌ
ａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ）、Ｍ．イノウエ編（アカデミック、ニューヨーク）
１５−３２頁；Ｒ．クロール、Ｃ．シーマンズ、Ｐ．ロ
メディコ及びＳ．マクアンドリュー（１９８５）、ジー
ン（Ｇｅｎｅ）第３８巻３１−３８頁］。しかしながら
これらのベクターによる遺伝子の発現レベルは、異なっ
た真核生物遺伝子について広範に相違する。低レベルの
発現は、大腸菌プロテアーゼによる蛋白減成［Ａ．Ｗ．
エメリック、Ｂ．Ｌ．ベルトラニ、Ａ．ベンバサット、
Ｔ．Ｊ．ホワイト及びＭ．Ｗ．コンラッド（１９８
４）、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ）第２巻１６５−１６８頁］またはヘテロローガ
スな遺伝子配列を含むｍＲＮＡの非効率的翻訳開始
［Ｐ．Ｎ．レイ及びＭ．Ｌ．ピアソン（１９７４）、ジ
ャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．）第８５巻１６３−１７５頁；Ｐ．
Ｎ．レイ及びＭ．Ｌ．ピアソン（１９７５）、ネイチャ
ー（Ｎａｔｕｒｅ）（ロンドン）２５３、６４７−６５
０；Ｒ．Ｌ．ケリー及びＣ．ヤノフスキー（１９８
２）、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンシズＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）第７９巻３１２０−
３１２４頁；Ｋ．ナガイ及びＨ．Ｃ．トガーセン（１９
８４）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）（ロンドン）３０
９、８１０−８１２頁；Ｒ．バラダラジャン、Ａ．スザ
ーボ及びＳ．Ｇ．ボクサー（１９８５）、プロシーディ
ングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンシズＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ）第８２巻５６８１−５６８４頁］が原因
であるとされてきた。幾つかの研究は、翻訳開始の効率
は、シャイン−ダルガーノ（ＳＤ）配列及び１６Ｓ ｒ
ＲＮＡ間の相補性の程度、ＳＤ配列及び開始コドン間の
距離、並びにこの「ウインドウ」領域のヌクレオチド配
列に依存するということを示唆した［Ｊ．シャイン及び
Ｌ．ダルガーノ（１９７５）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒ
ｅ）（ロンドン）２５４、３４−３８頁；Ｌ．ゴール
ド、Ｄ．プリブノー、Ｔ．シュナイダー、Ｓ．シャイン
ディング、Ｂ．Ｓ．シンガー及びＧ．ストーモ（１９８
１）、アニュアル・レビュー・オブ・マイクロバイオロ
ジー（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）第３
５巻３６５−４０３頁；Ｇ．Ｄ．ストローモ、Ｔ．Ｄ．
シュナイダー及びＬ．Ｍ．ゴールド（１９８２）、ヌク
レイック・アシズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．）第１０巻２９７１−２９９６頁；Ｍ．
コザック（１９８３）、マイクロバイオロジカル・レビ
ューズ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．）第４７巻１−
４５頁；Ａ．ヒュイ、Ｊ．ヘイフリック、Ｋ．ディンケ
ルスピール及びＨ．Ａ．デボア（１９８４）、ＥＭＢＯ
ジャーナル）（ＥＭＢＯ Ｊ．）第３巻６２３−６２９
頁；Ｍ．Ｇ．シェパード、Ｅ．イェルバートン及びＤ．
Ｖ．ゲッデル（１９８２）、ＤＮＡ第１巻１２５−１３
１頁；Ｈ．Ａ．デボア、Ａ．ヒュイ、Ｌ．Ｊ．コムスト
ック、Ｅ．ワング及びＭ．バッサー（１９８３）、ＤＮ
Ａ第２巻２３１−２３５頁；Ｅ．Ａ．ホワイトホーン、
Ｋ．Ｊ．リバック及びＳ．Ｒ．ペットウェイ、ジュニア
（１９８５）、ジーン（Ｇｅｎｅ）第３６巻３７５−３
７９頁］。翻訳の効率は、ＳＤ配列及び蛋白コード化領
域の５'末端の外側のｍＲＮＡの５'非翻訳領域［Ｐ．ス
タンセンズ、Ｅ．ルモート及びＷ．フィアス（１９８
５）、ジーン（Ｇｅｎｅ）第３６巻２１１−２２３頁；
Ｔ．Ｍ．ロバーツ、Ｒ．カシッヒ及びＭ．プタシュヌ
（１９７９）、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンシズＵＳＡ（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）第７６巻７
６０−７６４頁；Ｌ．ゴールド、Ｇ．ストーモ及びＲ．
ソーンダーズ（１９８４）、プロシーディングズ・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズＵ
ＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ）第８１巻７０６１−７０６５頁］並びにｍＲＮＡの
３'非翻訳領域の配列にも依存しているという証拠があ
る。
大腸菌のような原核生物において高いレベルで発現され
てきた。一般的な試みは、クローニングされた遺伝子の
転写及び翻訳のための有効なリボゾーム結合サイト及び
強力なプロモーターを備えた多コピークローニングベク
ターを使用することであった［Ｙ．マスイ、Ｊ．コール
マン、及びＭ．イノウエ（１９８３）、エクスペリメン
タル・マニピュレーション・オブ・ジーン・エクスプレ
ッション（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌ
ａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ）、Ｍ．イノウエ編（アカデミック、ニューヨーク）
１５−３２頁；Ｒ．クロール、Ｃ．シーマンズ、Ｐ．ロ
メディコ及びＳ．マクアンドリュー（１９８５）、ジー
ン（Ｇｅｎｅ）第３８巻３１−３８頁］。しかしながら
これらのベクターによる遺伝子の発現レベルは、異なっ
た真核生物遺伝子について広範に相違する。低レベルの
発現は、大腸菌プロテアーゼによる蛋白減成［Ａ．Ｗ．
エメリック、Ｂ．Ｌ．ベルトラニ、Ａ．ベンバサット、
Ｔ．Ｊ．ホワイト及びＭ．Ｗ．コンラッド（１９８
４）、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ）第２巻１６５−１６８頁］またはヘテロローガ
スな遺伝子配列を含むｍＲＮＡの非効率的翻訳開始
［Ｐ．Ｎ．レイ及びＭ．Ｌ．ピアソン（１９７４）、ジ
ャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．）第８５巻１６３−１７５頁；Ｐ．
Ｎ．レイ及びＭ．Ｌ．ピアソン（１９７５）、ネイチャ
ー（Ｎａｔｕｒｅ）（ロンドン）２５３、６４７−６５
０；Ｒ．Ｌ．ケリー及びＣ．ヤノフスキー（１９８
２）、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンシズＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）第７９巻３１２０−
３１２４頁；Ｋ．ナガイ及びＨ．Ｃ．トガーセン（１９
８４）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）（ロンドン）３０
９、８１０−８１２頁；Ｒ．バラダラジャン、Ａ．スザ
ーボ及びＳ．Ｇ．ボクサー（１９８５）、プロシーディ
ングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンシズＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ）第８２巻５６８１−５６８４頁］が原因
であるとされてきた。幾つかの研究は、翻訳開始の効率
は、シャイン−ダルガーノ（ＳＤ）配列及び１６Ｓ ｒ
ＲＮＡ間の相補性の程度、ＳＤ配列及び開始コドン間の
距離、並びにこの「ウインドウ」領域のヌクレオチド配
列に依存するということを示唆した［Ｊ．シャイン及び
Ｌ．ダルガーノ（１９７５）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒ
ｅ）（ロンドン）２５４、３４−３８頁；Ｌ．ゴール
ド、Ｄ．プリブノー、Ｔ．シュナイダー、Ｓ．シャイン
ディング、Ｂ．Ｓ．シンガー及びＧ．ストーモ（１９８
１）、アニュアル・レビュー・オブ・マイクロバイオロ
ジー（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）第３
５巻３６５−４０３頁；Ｇ．Ｄ．ストローモ、Ｔ．Ｄ．
シュナイダー及びＬ．Ｍ．ゴールド（１９８２）、ヌク
レイック・アシズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．）第１０巻２９７１−２９９６頁；Ｍ．
コザック（１９８３）、マイクロバイオロジカル・レビ
ューズ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．）第４７巻１−
４５頁；Ａ．ヒュイ、Ｊ．ヘイフリック、Ｋ．ディンケ
ルスピール及びＨ．Ａ．デボア（１９８４）、ＥＭＢＯ
ジャーナル）（ＥＭＢＯ Ｊ．）第３巻６２３−６２９
頁；Ｍ．Ｇ．シェパード、Ｅ．イェルバートン及びＤ．
Ｖ．ゲッデル（１９８２）、ＤＮＡ第１巻１２５−１３
１頁；Ｈ．Ａ．デボア、Ａ．ヒュイ、Ｌ．Ｊ．コムスト
ック、Ｅ．ワング及びＭ．バッサー（１９８３）、ＤＮ
Ａ第２巻２３１−２３５頁；Ｅ．Ａ．ホワイトホーン、
Ｋ．Ｊ．リバック及びＳ．Ｒ．ペットウェイ、ジュニア
（１９８５）、ジーン（Ｇｅｎｅ）第３６巻３７５−３
７９頁］。翻訳の効率は、ＳＤ配列及び蛋白コード化領
域の５'末端の外側のｍＲＮＡの５'非翻訳領域［Ｐ．ス
タンセンズ、Ｅ．ルモート及びＷ．フィアス（１９８
５）、ジーン（Ｇｅｎｅ）第３６巻２１１−２２３頁；
Ｔ．Ｍ．ロバーツ、Ｒ．カシッヒ及びＭ．プタシュヌ
（１９７９）、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンシズＵＳＡ（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）第７６巻７
６０−７６４頁；Ｌ．ゴールド、Ｇ．ストーモ及びＲ．
ソーンダーズ（１９８４）、プロシーディングズ・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズＵ
ＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ）第８１巻７０６１−７０６５頁］並びにｍＲＮＡの
３'非翻訳領域の配列にも依存しているという証拠があ
る。
【０００２】これらの見解を調停するために、局所の二
次構造がＳＤ配列及び／またはＡＵＧ開始コドンを含む
領域と共に形作られ、その結果リボゾームが翻訳を開始
できなくなる場合に翻訳が阻害されるという事が提唱さ
れた［Ｄ．ゲイセン、Ｄ．イセレンタント、Ｃ．デロー
ム及びＷ．フィアス（１９８２）、ジーン（Ｇｅｎｅ）
第１７巻５５−６３頁；Ｄ．イセレンタント及びＷ．フ
ィアス（１９８０）、ジーン（Ｇｅｎｅ）第９巻１−１
２頁；Ｍ．シュワルツ、Ｍ．ロア及びＭ．ドゥバーブイ
ル（１９８１）、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンシズＵＳＡ（Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）第７８巻
２９３７−２９４１頁；Ｍ．Ｎ．ホール、Ｊ．ガーベ
イ、Ｍ．ドゥバーブイル及びＭ．シュワルツ（１９８
２）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）（ロンドン）２９
５、６１６−６１８頁；Ａ．ダス、Ｊ．アーバノフスキ
ー、Ｈ．ワイスバッハ、Ｊ．ネスター及びＣ．ヤノフス
キー（１９８３）、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズＵＳＡ（Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）第８０
巻２８７９−２８８３頁；Ｂ．バークホート及びＪ．バ
ン・デュイン（１９８５）、ヌクレイック・アシズ・リ
サーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）第１
３巻６９９５−６９６７頁］。このような二次構造の形
成は、メチオニル牛成長ホルモン（Ｍｅｔ−ｂＧＨ）が
その天然コドンにより高レベルで発現されないことを説
明し得る［Ｈ．Ｊ．ジョージ、Ｊ．Ｊ．ルイタリーエ
ン、Ｗ．Ｐ．ピラシンスキー、Ｄ．Ｌ．グラスマン及び
Ｒ．Ａ．クリツィチェク（１９８５）、ＤＮＡ第４巻２
７３−２８１頁；Ｐ．Ｈ．シーバーグ、Ｓ．シアス、
Ｊ．アーデルマン、Ｈ．Ａ．デボア、Ｊ．ヘイフリッ
ク、Ｐ．ジュラーニ、Ｄ．Ｖ．ゲッデル及びＨ．Ｌ．ヘ
イネッカー（１９８３）、ＤＮＡ第２巻３７−４５
頁］。この潜在的な問題を克服するため、シーバーグ等
は、牛成長ホルモン（ｂＧＨ）遺伝子の５'末端に幾つ
かの塩基の変化を導入し、高度に発現されるヒト成長ホ
ルモン（ｈＧＨ）遺伝子の５'末端に類似の配列を作り
出した。同様にジョージ等は、ｂＧＨ遺伝子の５'末端
において１３のコドンを変化させた後に高レベルの発現
（総細胞蛋白の１５％）が得られることを報告した。こ
れらの試みは、その蛋白のアミノ酸配列を保存する必要
性により制限を受ける。上記の制限を回避するためにポ
リシストロン発現系が組み立てられた。
次構造がＳＤ配列及び／またはＡＵＧ開始コドンを含む
領域と共に形作られ、その結果リボゾームが翻訳を開始
できなくなる場合に翻訳が阻害されるという事が提唱さ
れた［Ｄ．ゲイセン、Ｄ．イセレンタント、Ｃ．デロー
ム及びＷ．フィアス（１９８２）、ジーン（Ｇｅｎｅ）
第１７巻５５−６３頁；Ｄ．イセレンタント及びＷ．フ
ィアス（１９８０）、ジーン（Ｇｅｎｅ）第９巻１−１
２頁；Ｍ．シュワルツ、Ｍ．ロア及びＭ．ドゥバーブイ
ル（１９８１）、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンシズＵＳＡ（Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）第７８巻
２９３７−２９４１頁；Ｍ．Ｎ．ホール、Ｊ．ガーベ
イ、Ｍ．ドゥバーブイル及びＭ．シュワルツ（１９８
２）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）（ロンドン）２９
５、６１６−６１８頁；Ａ．ダス、Ｊ．アーバノフスキ
ー、Ｈ．ワイスバッハ、Ｊ．ネスター及びＣ．ヤノフス
キー（１９８３）、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズＵＳＡ（Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）第８０
巻２８７９−２８８３頁；Ｂ．バークホート及びＪ．バ
ン・デュイン（１９８５）、ヌクレイック・アシズ・リ
サーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）第１
３巻６９９５−６９６７頁］。このような二次構造の形
成は、メチオニル牛成長ホルモン（Ｍｅｔ−ｂＧＨ）が
その天然コドンにより高レベルで発現されないことを説
明し得る［Ｈ．Ｊ．ジョージ、Ｊ．Ｊ．ルイタリーエ
ン、Ｗ．Ｐ．ピラシンスキー、Ｄ．Ｌ．グラスマン及び
Ｒ．Ａ．クリツィチェク（１９８５）、ＤＮＡ第４巻２
７３−２８１頁；Ｐ．Ｈ．シーバーグ、Ｓ．シアス、
Ｊ．アーデルマン、Ｈ．Ａ．デボア、Ｊ．ヘイフリッ
ク、Ｐ．ジュラーニ、Ｄ．Ｖ．ゲッデル及びＨ．Ｌ．ヘ
イネッカー（１９８３）、ＤＮＡ第２巻３７−４５
頁］。この潜在的な問題を克服するため、シーバーグ等
は、牛成長ホルモン（ｂＧＨ）遺伝子の５'末端に幾つ
かの塩基の変化を導入し、高度に発現されるヒト成長ホ
ルモン（ｈＧＨ）遺伝子の５'末端に類似の配列を作り
出した。同様にジョージ等は、ｂＧＨ遺伝子の５'末端
において１３のコドンを変化させた後に高レベルの発現
（総細胞蛋白の１５％）が得られることを報告した。こ
れらの試みは、その蛋白のアミノ酸配列を保存する必要
性により制限を受ける。上記の制限を回避するためにポ
リシストロン発現系が組み立てられた。
【０００３】ポリシストロン発現系の共有する特徴は、
ポリシストロン性ｍＲＮＡの発現を駆動するプロモータ
ー、１またはそれ以上のリボゾーム結合サイト、各シス
トロンのための翻訳開始サイト、及び各シストロンのた
めの翻訳停止コドンを含む。先行文献は、目的とするポ
リペプチド産物の発現レベルは、プロモーターの強さ、
ポリシストロンの指令に関するリボゾーム結合サイトの
効率、及びリボゾーム結合サイトに相対的な翻訳開始サ
イトの適正な配置に関係することを教示している。
ポリシストロン性ｍＲＮＡの発現を駆動するプロモータ
ー、１またはそれ以上のリボゾーム結合サイト、各シス
トロンのための翻訳開始サイト、及び各シストロンのた
めの翻訳停止コドンを含む。先行文献は、目的とするポ
リペプチド産物の発現レベルは、プロモーターの強さ、
ポリシストロンの指令に関するリボゾーム結合サイトの
効率、及びリボゾーム結合サイトに相対的な翻訳開始サ
イトの適正な配置に関係することを教示している。
【０００４】ポリシストロン発現系の組み立てをもって
しても牛成長ホルモン及びＥＫ−ＢＧＨ（Ｍｅｔ−Ｐｈ
ｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−（Ａｓｐ）4−Ｌｅｕ−ＢＧＨ）
のようなその誘導体の両者の発現は依然として問題を含
んでいる。上記の問題を倍加させるのは、多くの発現ベ
クターの構造的不安定性である。組み替えＤＮＡ発現ベ
クターの構造的不安定性の結果、ベクターの構造を変え
るＤＮＡ欠失及び再配置が起こる。この事は、これらの
発現ベクターによりコードされるポリペプチドを産生す
るために増殖させる大規模培養においては重要な関心事
である。これらのベクターは、コードされているポリペ
プチドの発現を妨げるように変えられるかも知れない。
従って、培養がそのポリペプチドの発現をするよう誘導
される場合、ポリペプチド発現をしない方向への負の選
択圧の結果、しばしば変化した発現ベクターの蓄積が起
こる。
しても牛成長ホルモン及びＥＫ−ＢＧＨ（Ｍｅｔ−Ｐｈ
ｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−（Ａｓｐ）4−Ｌｅｕ−ＢＧＨ）
のようなその誘導体の両者の発現は依然として問題を含
んでいる。上記の問題を倍加させるのは、多くの発現ベ
クターの構造的不安定性である。組み替えＤＮＡ発現ベ
クターの構造的不安定性の結果、ベクターの構造を変え
るＤＮＡ欠失及び再配置が起こる。この事は、これらの
発現ベクターによりコードされるポリペプチドを産生す
るために増殖させる大規模培養においては重要な関心事
である。これらのベクターは、コードされているポリペ
プチドの発現を妨げるように変えられるかも知れない。
従って、培養がそのポリペプチドの発現をするよう誘導
される場合、ポリペプチド発現をしない方向への負の選
択圧の結果、しばしば変化した発現ベクターの蓄積が起
こる。
【０００５】上記の事を考慮して、食品医薬品局のよう
な調節機関は、医学的または獣医学的用途のポリペプチ
ド産物を生成するために利用されるいかなる組み替えＤ
ＮＡ発現ベクターに対しても完全な特性決定を要求して
いる。その組み替えＤＮＡ発現ベクターが発酵終了時に
元の接種物由来の発現ベクターと同一であることを立証
する証拠を提出せねばならない。証明書のデータは、そ
の発現ベクターの構造及び大きさの分析、並びに所望生
成物をコードしているヌクレオチド配列及びこのコード
化配列と並列する領域、特にプロモーターのような重要
な機能を実行する並列配列の立証を包含する。
な調節機関は、医学的または獣医学的用途のポリペプチ
ド産物を生成するために利用されるいかなる組み替えＤ
ＮＡ発現ベクターに対しても完全な特性決定を要求して
いる。その組み替えＤＮＡ発現ベクターが発酵終了時に
元の接種物由来の発現ベクターと同一であることを立証
する証拠を提出せねばならない。証明書のデータは、そ
の発現ベクターの構造及び大きさの分析、並びに所望生
成物をコードしているヌクレオチド配列及びこのコード
化配列と並列する領域、特にプロモーターのような重要
な機能を実行する並列配列の立証を包含する。
【０００６】操作可能に連結した遺伝子の転写を可能に
する大腸菌バクテリオファージラムダｐＬプロモーター
−オペレーター領域を利用する組み替えＤＮＡベクター
は、しばしば構造の不安定性にみまわれる。このような
ベクターを発酵工程終了時に調べると、このベクターの
構造はしばしば変化している。本発明の重要な側面は、
ＥＫ−ＢＧＨ転写物の調節可能な転写を提供しつつ安定
な発現ベクターを提供することである。
する大腸菌バクテリオファージラムダｐＬプロモーター
−オペレーター領域を利用する組み替えＤＮＡベクター
は、しばしば構造の不安定性にみまわれる。このような
ベクターを発酵工程終了時に調べると、このベクターの
構造はしばしば変化している。本発明の重要な側面は、
ＥＫ−ＢＧＨ転写物の調節可能な転写を提供しつつ安定
な発現ベクターを提供することである。
【０００７】本発明は、安定な厳重に調節されたＥＫ−
ＢＧＨの産生のための発現ベクターを提供し、高レベル
のＥＫ−ＢＧＨ産生を達成する。したがって本発明は、
ＥＫ−ＢＧＨ及び構造上関連するポリペプチドの産生の
領域における多大な且つ驚くべき進歩を提供するもので
ある。
ＢＧＨの産生のための発現ベクターを提供し、高レベル
のＥＫ−ＢＧＨ産生を達成する。したがって本発明は、
ＥＫ−ＢＧＨ及び構造上関連するポリペプチドの産生の
領域における多大な且つ驚くべき進歩を提供するもので
ある。
【０００８】本明細書に付随し下に説明する図面は一定
の拡大率で描かれてはいない。図１はプラスミドｐＣＺ
Ｒ１２５の制限サイト及び機能地図を示す図である。図
２はプラスミドｐＨＰＲ９１の制限サイト及び機能地図
を示す図である。図３はプラスミドｐＨＰＲ９７の制限
サイト及び機能地図を示す図である。図４はプラスミド
ｐＨＫＹ３３４の制限サイト及び機能地図を示す図であ
る。
の拡大率で描かれてはいない。図１はプラスミドｐＣＺ
Ｒ１２５の制限サイト及び機能地図を示す図である。図
２はプラスミドｐＨＰＲ９１の制限サイト及び機能地図
を示す図である。図３はプラスミドｐＨＰＲ９７の制限
サイト及び機能地図を示す図である。図４はプラスミド
ｐＨＫＹ３３４の制限サイト及び機能地図を示す図であ
る。
【０００９】本発明の組み替えＤＮＡ発現ベクターをプ
ラスミドｐＨＫＹ３３４と称する。プラスミドｐＨＫＹ
３３４の制限サイト及び機能地図は図４に示す。プラス
ミドｐＨＫＹ３３４は、ラムダｐＬプロモーターにより
駆動される二シストロン発現系、選択マーカーとして機
能するテトラサイクリン耐性遺伝子、プラスミドｐＢＲ
３２２から誘導された複製起点、及びｐＢＲ３２２由来
の複製起点を含むベクターにおいてプラスミドのコピー
数を制御するｒｏｐ遺伝子、からなる。
ラスミドｐＨＫＹ３３４と称する。プラスミドｐＨＫＹ
３３４の制限サイト及び機能地図は図４に示す。プラス
ミドｐＨＫＹ３３４は、ラムダｐＬプロモーターにより
駆動される二シストロン発現系、選択マーカーとして機
能するテトラサイクリン耐性遺伝子、プラスミドｐＢＲ
３２２から誘導された複製起点、及びｐＢＲ３２２由来
の複製起点を含むベクターにおいてプラスミドのコピー
数を制御するｒｏｐ遺伝子、からなる。
【００１０】プラスミドｐＨＫＹ３３４と１９８９年１
０月１７日登録の米国特許第４８７４７０３号に開示さ
れ特許請求されているプラスミドｐＬ１１０との比較は
幾つかの共通する構造上の特徴を明らかにする。プラス
ミドｐＬ１１０は、ＥＫ−ＢＧＨと呼ばれる牛成長ホル
モン類似体のための発現ベクターである。プラスミドｐ
ＣＺＲ１２５もまたＥＫ−ＢＧＨ発現ベクターである。
プラスミドｐＣＺＲ１２５の制限サイト及び機能地図は
図１に供する。プラスミドｐＣＺＲ１２５及びプラスミ
ドｐＨＫＹ３３４の間に共通する構造上の特徴にも拘ら
ず、構造的欠失を有し、故にＥＫ−ＢＧＨの発現を停止
させるプラスミドの蓄積を防ぐために、プラスミドｐＣ
ＺＲ１２５により形質転換された宿主細胞は、ＥＫ−Ｂ
ＧＨの発現を誘導する際、静菌的または殺菌的濃度の抗
生物質の存在下で培養する必要があった。ＥＫ−ＢＧＨ
産生の誘導される時点における静菌的または殺菌的濃度
の抗生物質の添加はプラスミドｐＣＺＲ１２５の構造上
の不安定性の故に必要であった。これとは対照的に、プ
ラスミドｐＨＫＹ３３４はＥＫ−ＢＧＨ発現の誘導時に
安定であり、したがってもはやＥＫ−ＢＧＨを産生しな
い欠失または異常型プラスミドの出現を排除するための
抗生物質の添加を必要としない。
０月１７日登録の米国特許第４８７４７０３号に開示さ
れ特許請求されているプラスミドｐＬ１１０との比較は
幾つかの共通する構造上の特徴を明らかにする。プラス
ミドｐＬ１１０は、ＥＫ−ＢＧＨと呼ばれる牛成長ホル
モン類似体のための発現ベクターである。プラスミドｐ
ＣＺＲ１２５もまたＥＫ−ＢＧＨ発現ベクターである。
プラスミドｐＣＺＲ１２５の制限サイト及び機能地図は
図１に供する。プラスミドｐＣＺＲ１２５及びプラスミ
ドｐＨＫＹ３３４の間に共通する構造上の特徴にも拘ら
ず、構造的欠失を有し、故にＥＫ−ＢＧＨの発現を停止
させるプラスミドの蓄積を防ぐために、プラスミドｐＣ
ＺＲ１２５により形質転換された宿主細胞は、ＥＫ−Ｂ
ＧＨの発現を誘導する際、静菌的または殺菌的濃度の抗
生物質の存在下で培養する必要があった。ＥＫ−ＢＧＨ
産生の誘導される時点における静菌的または殺菌的濃度
の抗生物質の添加はプラスミドｐＣＺＲ１２５の構造上
の不安定性の故に必要であった。これとは対照的に、プ
ラスミドｐＨＫＹ３３４はＥＫ−ＢＧＨ発現の誘導時に
安定であり、したがってもはやＥＫ−ＢＧＨを産生しな
い欠失または異常型プラスミドの出現を排除するための
抗生物質の添加を必要としない。
【００１１】プラスミドｐＨＫＹ３３４の安定性の増加
は、部分的には、ＥＫ−ＢＧＨの転写を駆動するために
使用されるファージラムダｐＬプロモーターに対してな
される修飾に帰することができる。ＥＫ−ＢＧＨの発現
を駆動するために使用されるラムダｐＬプロモーターは
実施例３のＢ部に教示されるように合成した。ラムダｐ
Ｌプロモーターの合成は、５'からラムダｐＬプロモー
ターに至る付随するＤＮＡ配列を除くために必要であっ
た。５'からラムダｐＬプロモーターに至る付随ＤＮＡ
配列の存在は、部分的にはプラスミドｐＬ１１０及びプ
ラスミドｐＣＺＲ１２５のようなプラスミドの不安定性
の一因となっていた。プラスミドｐＬ１１０及びｐＣＺ
Ｒ１２５には存在するがプラスミドｐＨＫＹ３３４から
は除去されている付随ＤＮＡは、元々プラスミドｐＢＲ
３２２からクローニングされた制限フラグメント上に存
在するテトラサイクリン耐性遺伝子の逆方向反復配列の
一部であった。このプロモーターは添付の図面中、ｐ９
７と表示する。
は、部分的には、ＥＫ−ＢＧＨの転写を駆動するために
使用されるファージラムダｐＬプロモーターに対してな
される修飾に帰することができる。ＥＫ−ＢＧＨの発現
を駆動するために使用されるラムダｐＬプロモーターは
実施例３のＢ部に教示されるように合成した。ラムダｐ
Ｌプロモーターの合成は、５'からラムダｐＬプロモー
ターに至る付随するＤＮＡ配列を除くために必要であっ
た。５'からラムダｐＬプロモーターに至る付随ＤＮＡ
配列の存在は、部分的にはプラスミドｐＬ１１０及びプ
ラスミドｐＣＺＲ１２５のようなプラスミドの不安定性
の一因となっていた。プラスミドｐＬ１１０及びｐＣＺ
Ｒ１２５には存在するがプラスミドｐＨＫＹ３３４から
は除去されている付随ＤＮＡは、元々プラスミドｐＢＲ
３２２からクローニングされた制限フラグメント上に存
在するテトラサイクリン耐性遺伝子の逆方向反復配列の
一部であった。このプロモーターは添付の図面中、ｐ９
７と表示する。
【００１２】プラスミドｐＨＫＹ３３４は、選択マーカ
ーとしてプラスミドｐＢＲ３２２から誘導されたテトラ
サイクリン耐性遺伝子を利用する。このテトラサイクリ
ン耐性遺伝子は添付の図面中ｔｅｔＲまたはｔｅｔと表
わす。プラスミドｐＨＫＹ３３４において利用する複製
起点もまたプラスミドｐＢＲ３２２から調製した。複製
起点は添付の図面中ｏｒｉまたはｏｒｉｇｉｎのいずれ
かで表示する。プラスミドｐＨＫＹ３３４は、プラスミ
ドｐＰＲ１２から調整され、１９８４年３月１３日登録
の米国特許第４４３６８１５号に開示されているｒｏｐ
遺伝子を含む。このｒｏｐ遺伝子は、ｐＢＲ３２２より
誘導された複製起点を含むプラスミドにおけるプラスミ
ドのコピー数を制御する。プラスミドｐＨＫＹ３３４
は、細胞当りおよそ１５ないし３０のコピー数で存在す
る。ｒｏｐ遺伝子は添付の図面中ｒｏｐと表示する。温
度感受性λｐＬリプレッサーｃＩ８５７は本明細書中に
開示される全てのベクターに使用され、これは図面中ｃ
Ｉ８５７と表示する。
ーとしてプラスミドｐＢＲ３２２から誘導されたテトラ
サイクリン耐性遺伝子を利用する。このテトラサイクリ
ン耐性遺伝子は添付の図面中ｔｅｔＲまたはｔｅｔと表
わす。プラスミドｐＨＫＹ３３４において利用する複製
起点もまたプラスミドｐＢＲ３２２から調製した。複製
起点は添付の図面中ｏｒｉまたはｏｒｉｇｉｎのいずれ
かで表示する。プラスミドｐＨＫＹ３３４は、プラスミ
ドｐＰＲ１２から調整され、１９８４年３月１３日登録
の米国特許第４４３６８１５号に開示されているｒｏｐ
遺伝子を含む。このｒｏｐ遺伝子は、ｐＢＲ３２２より
誘導された複製起点を含むプラスミドにおけるプラスミ
ドのコピー数を制御する。プラスミドｐＨＫＹ３３４
は、細胞当りおよそ１５ないし３０のコピー数で存在す
る。ｒｏｐ遺伝子は添付の図面中ｒｏｐと表示する。温
度感受性λｐＬリプレッサーｃＩ８５７は本明細書中に
開示される全てのベクターに使用され、これは図面中ｃ
Ｉ８５７と表示する。
【００１３】幾つかの宿主細胞がプラスミドｐＨＫＹ３
３４と共に使用するのに適している。大腸菌Ｋ１２ＲＶ
３０８細胞はｐＨＫＹ３３４に対して好ましい宿主細胞
である。大腸菌Ｋ１２ ＲＶ３０８細胞は、ノーザン・
リージョナル・リサーチ・ラボラトリー（ピオリア、イ
リノイ）から受理番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５６２４の下で
入手することができる。大腸菌ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３
１４４６）、Ｃ６００（ＡＴＣＣ３３５２５）としても
知られる大腸菌Ｃ６００ ＲＭ、及び大腸菌ＪＭ１０９
（ＡＴＣＣ５３３２３）もまた好適な宿主細胞である。
３４と共に使用するのに適している。大腸菌Ｋ１２ＲＶ
３０８細胞はｐＨＫＹ３３４に対して好ましい宿主細胞
である。大腸菌Ｋ１２ ＲＶ３０８細胞は、ノーザン・
リージョナル・リサーチ・ラボラトリー（ピオリア、イ
リノイ）から受理番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５６２４の下で
入手することができる。大腸菌ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３
１４４６）、Ｃ６００（ＡＴＣＣ３３５２５）としても
知られる大腸菌Ｃ６００ ＲＭ、及び大腸菌ＪＭ１０９
（ＡＴＣＣ５３３２３）もまた好適な宿主細胞である。
【００１４】以下の実施例に記載されるＤＮＡフラグメ
ントの操作に使用される制限エンドヌクレアーゼ及びＴ
４ＤＮＡリガーゼは、ベーリンガー・マンハイム・バイ
オケミカルズ（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ５０４１４、インディア
ナポリス、インディアナ４６２５０またはニュー・イン
グランド・バイオラブズ、３２トーザー・ロード、ビバ
リー、マサチューセッツ０１９１５−５５１０）のいず
れかより入手した。材料の供給先は簡便性の問題であ
る。別途記載の無い限り、ベーリンガー・マンハイムま
たはニュー・イングランド・バイオラブズから入手した
試薬は同等であり、本発明の実施の目的のために交換可
能である。
ントの操作に使用される制限エンドヌクレアーゼ及びＴ
４ＤＮＡリガーゼは、ベーリンガー・マンハイム・バイ
オケミカルズ（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ５０４１４、インディア
ナポリス、インディアナ４６２５０またはニュー・イン
グランド・バイオラブズ、３２トーザー・ロード、ビバ
リー、マサチューセッツ０１９１５−５５１０）のいず
れかより入手した。材料の供給先は簡便性の問題であ
る。別途記載の無い限り、ベーリンガー・マンハイムま
たはニュー・イングランド・バイオラブズから入手した
試薬は同等であり、本発明の実施の目的のために交換可
能である。
【００１５】以下の実施例は本発明をさらに例示するこ
とを意図しており、その妥当な範囲を限定する意図はな
い。
とを意図しており、その妥当な範囲を限定する意図はな
い。
実施例１ ｐＣＺＲ１２５の組み立て Ａ．ｐＬ１１０の５．８ｋｂ ＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ制
限フラグメントの調製 プラスミドｐＬ１１０は１９８９年１０月１７日登録の
米国特許第４８７４７０３号に開示されている。米国特
許第４８７４７０３号の教示は引用して本明細書の一部
とする。
限フラグメントの調製 プラスミドｐＬ１１０は１９８９年１０月１７日登録の
米国特許第４８７４７０３号に開示されている。米国特
許第４８７４７０３号の教示は引用して本明細書の一部
とする。
【００１６】プラスミドｐＬ１１０ ２５μｇを、６０
ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ
2、１００ｍＭ ＮａＣｌ及び１ｍＭ β−メルカプト
エタノールを含む反応容量５００μｌ中で、１５μｌ
（１５０単位）のＸｂａＩにより完全に消化した。トリ
スはトリス［ヒドロキシメチル］アミノメタンである。
混合物を３７℃で１時間インキュベートした。消化した
ＤＮＡをフェノール及びクロロホルムの混合物（５０：
５０）で２回抽出し、水層を回収した。無水エタノール
２．５容及び３．０Ｍ酢酸ナトリウム０．１容の添加に
よりＤＮＡを水層から回収した。このＤＮＡを遠心によ
り集め、水５０μｌに再懸濁した。
ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ
2、１００ｍＭ ＮａＣｌ及び１ｍＭ β−メルカプト
エタノールを含む反応容量５００μｌ中で、１５μｌ
（１５０単位）のＸｂａＩにより完全に消化した。トリ
スはトリス［ヒドロキシメチル］アミノメタンである。
混合物を３７℃で１時間インキュベートした。消化した
ＤＮＡをフェノール及びクロロホルムの混合物（５０：
５０）で２回抽出し、水層を回収した。無水エタノール
２．５容及び３．０Ｍ酢酸ナトリウム０．１容の添加に
よりＤＮＡを水層から回収した。このＤＮＡを遠心によ
り集め、水５０μｌに再懸濁した。
【００１７】上のＤＮＡを以下のようにＢａｍＨＩで部
分的に消化した。ＸｂａＩ消化ＤＮＡ５０μｌを、１０
ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．８）、７ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、及び６ｍＭ β−メルカ
プトエタノールからなる反応液１５０μｌ容に入れたＢ
ａｍＨＩ０．２μｌ（２単位）と混合した。この混合物
を３７℃で５分間インキュベートした。試料を上記のよ
うに精製し回収して、ＴＥ（ＴＥは１０ｍＭトリスＨＣ
ｌ（ｐＨ７．４）及び１ｍＭエチレンジアミン四酢酸
（ＥＤＴＡ）である）５０μｌに再懸濁した。ローディ
ング緩衝液（２５％ｖ／ｖグリセロール、０．０５％ｗ
／ｖプロモフェノールブルー、及び０．５％ｗ／ｖキシ
レンシアノール）５μｌを試料に加え、消化されたＤＮ
Ａを、マニアティス等、１５０−１７２頁［マニアティ
ス等、１９８２、モレキュラー・クローニング：ア・ラ
ボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー、コールド・スプリング・ハーバー、Ｎ．Ｙ．］に記
載のようにゲル電気泳動により１％アガロースゲル上で
分画した。このアガロースゲルをエチジウムブロミドの
希釈溶液で染色し、〜５．８ｋｂ ＸｂａＩ−ＢａｍＨ
Ｉ制限フラグメントを３００ｎｍのＵＶ光の下で視覚化
した。この制限フラグメントを含むゲル部分を回収し
た。ＤＮＡを、ゲル切片を切り刻み、前記のようにこれ
をフェノール：クロロホルム（５０：５０）で２回抽出
し、ＤＮＡをエタノール沈澱させることにより精製し
た。
分的に消化した。ＸｂａＩ消化ＤＮＡ５０μｌを、１０
ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．８）、７ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、及び６ｍＭ β−メルカ
プトエタノールからなる反応液１５０μｌ容に入れたＢ
ａｍＨＩ０．２μｌ（２単位）と混合した。この混合物
を３７℃で５分間インキュベートした。試料を上記のよ
うに精製し回収して、ＴＥ（ＴＥは１０ｍＭトリスＨＣ
ｌ（ｐＨ７．４）及び１ｍＭエチレンジアミン四酢酸
（ＥＤＴＡ）である）５０μｌに再懸濁した。ローディ
ング緩衝液（２５％ｖ／ｖグリセロール、０．０５％ｗ
／ｖプロモフェノールブルー、及び０．５％ｗ／ｖキシ
レンシアノール）５μｌを試料に加え、消化されたＤＮ
Ａを、マニアティス等、１５０−１７２頁［マニアティ
ス等、１９８２、モレキュラー・クローニング：ア・ラ
ボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー、コールド・スプリング・ハーバー、Ｎ．Ｙ．］に記
載のようにゲル電気泳動により１％アガロースゲル上で
分画した。このアガロースゲルをエチジウムブロミドの
希釈溶液で染色し、〜５．８ｋｂ ＸｂａＩ−ＢａｍＨ
Ｉ制限フラグメントを３００ｎｍのＵＶ光の下で視覚化
した。この制限フラグメントを含むゲル部分を回収し
た。ＤＮＡを、ゲル切片を切り刻み、前記のようにこれ
をフェノール：クロロホルム（５０：５０）で２回抽出
し、ＤＮＡをエタノール沈澱させることにより精製し
た。
【００１８】 Ｂ．ＸｂａＩ−ＮｄｅＩリンカーの調製 以下の相補的ＤＮＡセグメントを自動ＤＮＡ合成機（ア
プライド・バイオシステムズ３８０Ｂ）によりβ−シア
ノエチルホスホアミダイト化学を用いて合成した：
プライド・バイオシステムズ３８０Ｂ）によりβ−シア
ノエチルホスホアミダイト化学を用いて合成した：
【化１】
【化２】
【００１９】これらの一本鎖ＤＮＡセグメントを常法に
より精製し水に再懸濁した。各々の一本鎖ＤＮＡセグメ
ント５μｇを混合し７０℃で５分間加熱した。この混合
物を３０分間室温に冷却してＤＮＡセグメントをアニー
リングさせた。アニーリングしたＤＮＡフラグメント
を、０．２ｍＭアデニン５'−トリホスファートを含有
する７０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．６）、０．１Ｍ
ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ ＤＴＴに入れ
た１μｌ（１０単位）のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ
（総容量２０μｌ）で処理した。この混合物を３７℃で
３０分間インキュベートした。次いで混合物を７０℃で
５分間インキュベートし、次に室温に冷却した。
より精製し水に再懸濁した。各々の一本鎖ＤＮＡセグメ
ント５μｇを混合し７０℃で５分間加熱した。この混合
物を３０分間室温に冷却してＤＮＡセグメントをアニー
リングさせた。アニーリングしたＤＮＡフラグメント
を、０．２ｍＭアデニン５'−トリホスファートを含有
する７０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．６）、０．１Ｍ
ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ ＤＴＴに入れ
た１μｌ（１０単位）のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ
（総容量２０μｌ）で処理した。この混合物を３７℃で
３０分間インキュベートした。次いで混合物を７０℃で
５分間インキュベートし、次に室温に冷却した。
【００２０】Ｃ．合成ＥＫ−ＢＧＨ遺伝子の調製 ＥＫ−ＢＧＨ遺伝子をコードしているＤＮＡフラグメン
トを、実施例１Ｂの方法と実質的に同様にして合成し
た。ＥＫ−ＢＧＨをコードしている遺伝子は、長さが７
１ないし８３ヌクレオチドの範囲の１６個の化学的に合
成された一本鎖ＤＮＡの断片から組み立てられ、これは
アニーリング時にＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ粘着末端を有
するＥＫ−ＢＧＨの両相補鎖を含む。合成ＥＫ−ＢＧＨ
遺伝子の配列は以下の通りである：
トを、実施例１Ｂの方法と実質的に同様にして合成し
た。ＥＫ−ＢＧＨをコードしている遺伝子は、長さが７
１ないし８３ヌクレオチドの範囲の１６個の化学的に合
成された一本鎖ＤＮＡの断片から組み立てられ、これは
アニーリング時にＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ粘着末端を有
するＥＫ−ＢＧＨの両相補鎖を含む。合成ＥＫ−ＢＧＨ
遺伝子の配列は以下の通りである：
【化３】 合成ＥＫ−ＢＧＨ遺伝子のコード化鎖と対応するアミノ
酸配列を以下の「化４」に、アミノ酸配列のみを以下の
「化５」に示す。
酸配列を以下の「化４」に、アミノ酸配列のみを以下の
「化５」に示す。
【００２１】
【化４】
【化５】 Ｄ．ＤＮＡライゲーション 実施例１Ａで製造されたｐＬ１１０制限フラグメント２
μｌ（０．２μｇ）、実施例１Ｂで製造されたＤＮＡフ
ラグメント２μｌ（８．７５ｐｍｏｌ）、及び実施例１
Ｃで製造されたＤＮＡフラグメント２μｌ（０．１μ
ｇ）を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１μｌ（１０単位）、５０
ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ
2、１ｍＭジチオトレイトール、１ｍＭアデノシン５'−
トリホスファート及び５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリ
コール−８０００（総容量１０μｌ）を含有する反応液
中でライゲーションしてプラスミドｐＣＺＲ１２５を組
み立てた。プラスミドｐＣＺＲ１２５の制限サイト及び
機能地図は図１に示す。この混合物を１６℃で１６時間
インキュベートした。この混合物の一部を使用して下記
のように大腸菌を形質転換した。
μｌ（０．２μｇ）、実施例１Ｂで製造されたＤＮＡフ
ラグメント２μｌ（８．７５ｐｍｏｌ）、及び実施例１
Ｃで製造されたＤＮＡフラグメント２μｌ（０．１μ
ｇ）を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１μｌ（１０単位）、５０
ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ
2、１ｍＭジチオトレイトール、１ｍＭアデノシン５'−
トリホスファート及び５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリ
コール−８０００（総容量１０μｌ）を含有する反応液
中でライゲーションしてプラスミドｐＣＺＲ１２５を組
み立てた。プラスミドｐＣＺＲ１２５の制限サイト及び
機能地図は図１に示す。この混合物を１６℃で１６時間
インキュベートした。この混合物の一部を使用して下記
のように大腸菌を形質転換した。
【００２２】Ｅ．形質転換の手順 大腸菌Ｋ１２ ＲＶ３０８細胞は、ノーザン・リージョ
ナル・リサーチ・ラボラトリー（ピオリア、イリノイ）
から受理番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５６２４の下に入手でき
る。大腸菌Ｋ１２ＲＶ３０８の培養５０ｍｌを、Ｏ．
Ｄ．590が０．５吸収単位となるまでＬ−ブロス（水１
ｌにつきトリプトン１０ｇ、ＮａＣｌ１０ｇ及び酵母抽
出物５ｇ）中で増殖させた。培養を氷上で１０分間冷却
し、次いで遠心により細胞を集めた。細胞ペレットを冷
５０ｍＭ ＣａＣｌ2：１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ
８．０）２５ｍｌに再懸濁し、氷上で１５分間インキュ
ベートした。細胞を遠心により集め、細胞ペレットを冷
５０ｍＭ ＣａＣｌ2：１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ
８．０）２．５ｍｌに再懸濁し、この試料を４℃で１６
時間維持した。
ナル・リサーチ・ラボラトリー（ピオリア、イリノイ）
から受理番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５６２４の下に入手でき
る。大腸菌Ｋ１２ＲＶ３０８の培養５０ｍｌを、Ｏ．
Ｄ．590が０．５吸収単位となるまでＬ−ブロス（水１
ｌにつきトリプトン１０ｇ、ＮａＣｌ１０ｇ及び酵母抽
出物５ｇ）中で増殖させた。培養を氷上で１０分間冷却
し、次いで遠心により細胞を集めた。細胞ペレットを冷
５０ｍＭ ＣａＣｌ2：１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ
８．０）２５ｍｌに再懸濁し、氷上で１５分間インキュ
ベートした。細胞を遠心により集め、細胞ペレットを冷
５０ｍＭ ＣａＣｌ2：１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ
８．０）２．５ｍｌに再懸濁し、この試料を４℃で１６
時間維持した。
【００２３】この細胞懸濁液２００μｌを上で調製した
ライゲーションされたＤＮＡ５０μｌと混合し、次に氷
上で６０分間インキュベートした。混合物を３２℃で４
５秒間インキュベートし、次いで２分間氷上に置いた。
ＴＹ培地（１％トリプトン、０．５％酵母抽出物及び１
％塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）５ｍｌをこの混合物に
加え、インキュベーションを３２℃で２時間継続した。
この培養１００μｌを、テトラサイクリン５μｇ／ｍｌ
を含有するＴＹ寒天平板（１％トリプトン、０．５％酵
母抽出物、１％塩化ナトリウム及び１．５％寒天、ｐＨ
７．４）上に塗布した。これらの平板を３２℃で１６時
間インキュベートした。テトラサイクリン耐性コロニー
を一つずつ取ってＴＹ培地２ｍｌへの接種に使用した。
この培養は通気しながら３７℃で１６時間インキュベー
トした。
ライゲーションされたＤＮＡ５０μｌと混合し、次に氷
上で６０分間インキュベートした。混合物を３２℃で４
５秒間インキュベートし、次いで２分間氷上に置いた。
ＴＹ培地（１％トリプトン、０．５％酵母抽出物及び１
％塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）５ｍｌをこの混合物に
加え、インキュベーションを３２℃で２時間継続した。
この培養１００μｌを、テトラサイクリン５μｇ／ｍｌ
を含有するＴＹ寒天平板（１％トリプトン、０．５％酵
母抽出物、１％塩化ナトリウム及び１．５％寒天、ｐＨ
７．４）上に塗布した。これらの平板を３２℃で１６時
間インキュベートした。テトラサイクリン耐性コロニー
を一つずつ取ってＴＹ培地２ｍｌへの接種に使用した。
この培養は通気しながら３７℃で１６時間インキュベー
トした。
【００２４】Ｆ．ＤＮＡ単離の手順 プラスミドＤＮＡを以下のように形質転換体の培養から
単離した。以下の操作は全て別途指示の無い限り周囲温
度で行なった。各培養１．５ｍｌをミクロ遠心管に移し
た。細胞を遠心により集めた。上清を先の尖ったアスピ
レーターで除去し、細胞ペレットを、５０ｍＭグルコー
ス、１０ｍＭ ＥＤＴＡ及び２５ｍＭトリスＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．０）を含有する溶液１００μｌに懸濁した。室温
で５分間インキュベートした後、アルカリ性ドデシル硫
酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液２００μｌ（０．２Ｎ Ｎ
ａＯＨ、１％ＳＤＳ）を加えた。管を穏やかに反転させ
て混合し、次いで氷上に５分間維持した。次に酢酸カリ
ウム溶液１５０μｌ（氷酢酸１１．５ｍｌ及び水２８．
５ｍｌを５Ｍ酢酸カリウム６０ｍｌに加えることにより
調製。得られた溶液はカリウムについて３Ｍ、酢酸につ
いて５Ｍである。）を加え、穏やかに攪拌することによ
り管の内容物を混合した。この試料を氷上に５分間維持
し次いで１０分間遠心した。上清を第二の遠心管に移し
た。等容量のフェノール（０．１Ｍトリス（ｐＨ８．
０）で飽和）を加えた。試料を混合し次いで５分間遠心
した。上清を集めフェノール抽出を繰り返した。氷冷無
水エタノール１ｍｌを上清に加えた。この試料を混合
し、極めて粘稠ではあるが完全に凍ってはいない状態と
なるまでドライアイス上に維持した。次いでＤＮＡを５
分間の遠心により集めた。上清を吸引により除去し、Ｄ
ＮＡペレットに７０％エタノール５００μｌを加えた。
試料を穏やかに攪拌してペレットを洗浄し、２分間遠心
した。上清を除去しＤＮＡペレットを減圧乾燥した。こ
のＤＮＡをＴＥ（１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）
及び１ｍＭ ＥＤＴＡ）５０μｌに溶解し、４℃で保存
した。
単離した。以下の操作は全て別途指示の無い限り周囲温
度で行なった。各培養１．５ｍｌをミクロ遠心管に移し
た。細胞を遠心により集めた。上清を先の尖ったアスピ
レーターで除去し、細胞ペレットを、５０ｍＭグルコー
ス、１０ｍＭ ＥＤＴＡ及び２５ｍＭトリスＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．０）を含有する溶液１００μｌに懸濁した。室温
で５分間インキュベートした後、アルカリ性ドデシル硫
酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液２００μｌ（０．２Ｎ Ｎ
ａＯＨ、１％ＳＤＳ）を加えた。管を穏やかに反転させ
て混合し、次いで氷上に５分間維持した。次に酢酸カリ
ウム溶液１５０μｌ（氷酢酸１１．５ｍｌ及び水２８．
５ｍｌを５Ｍ酢酸カリウム６０ｍｌに加えることにより
調製。得られた溶液はカリウムについて３Ｍ、酢酸につ
いて５Ｍである。）を加え、穏やかに攪拌することによ
り管の内容物を混合した。この試料を氷上に５分間維持
し次いで１０分間遠心した。上清を第二の遠心管に移し
た。等容量のフェノール（０．１Ｍトリス（ｐＨ８．
０）で飽和）を加えた。試料を混合し次いで５分間遠心
した。上清を集めフェノール抽出を繰り返した。氷冷無
水エタノール１ｍｌを上清に加えた。この試料を混合
し、極めて粘稠ではあるが完全に凍ってはいない状態と
なるまでドライアイス上に維持した。次いでＤＮＡを５
分間の遠心により集めた。上清を吸引により除去し、Ｄ
ＮＡペレットに７０％エタノール５００μｌを加えた。
試料を穏やかに攪拌してペレットを洗浄し、２分間遠心
した。上清を除去しＤＮＡペレットを減圧乾燥した。こ
のＤＮＡをＴＥ（１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）
及び１ｍＭ ＥＤＴＡ）５０μｌに溶解し、４℃で保存
した。
【００２５】Ｇ．大規模なＤＮＡの単離 大量のｐＣＺＲ１２５プラスミドＤＮＡを以下のように
単離した。テトラサイクリン５μｇ／ｍｌを含有するＬ
ブロス１ｌに大腸菌ＲＶ３０８／ｐＣＺＲ１２５のコロ
ニーを接種した。培養を３２℃で１６時間増殖させた。
この培養をＧＳＡローター（ソーバル）中６０００ｒｐ
ｍで５分間４℃で遠心した。得られた上清を捨て、細胞
ペレットをＴＥＳ緩衝液（１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ
７．５）、１０ｍＭＮａＣｌ、及び１ｍＭ ＥＤＴＡ）
４０ｍｌ中で洗浄し、次いで遠心により集めた。上清を
捨て、細胞ペレットをドライアイス／エタノール浴中で
凍結し、次いで融解した。融解した細胞ペレットを２５
％シュクロース及び５０ｍＭ ＥＤＴＡの溶液１０ｍｌ
に再懸濁した。５ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液１ｍｌ、
０．２５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）３ｍｌ、及び１０
ｍｇ／ｍｌの煮沸させたＲＮアーゼＡ（シグマ・ケミカ
ル・Ｃｏ．、Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ１４５０８、セントルイ
ス、Ｍｏ．より入手できる）１００μｌを溶液に加え、
次いでこれを氷上で１５分間インキュベートした。溶菌
溶液（１０％トリトンＸ−１００ ３ｍｌ、０．２５Ｍ
ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）７５ｍｌ、１ＭトリスＨＣｌ
（ｐＨ８．０）１５ｍｌ、及びＨ2Ｏ ７ｍｌの混合に
より調製）３ｍｌをリゾチーム処理細胞に加え、この溶
液を混合し、この後、得られた溶液を氷上でさらに１５
分間インキュベートした。溶菌した細胞をドライアイス
／エタノール浴中で凍結し、次いで融解した。
単離した。テトラサイクリン５μｇ／ｍｌを含有するＬ
ブロス１ｌに大腸菌ＲＶ３０８／ｐＣＺＲ１２５のコロ
ニーを接種した。培養を３２℃で１６時間増殖させた。
この培養をＧＳＡローター（ソーバル）中６０００ｒｐ
ｍで５分間４℃で遠心した。得られた上清を捨て、細胞
ペレットをＴＥＳ緩衝液（１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ
７．５）、１０ｍＭＮａＣｌ、及び１ｍＭ ＥＤＴＡ）
４０ｍｌ中で洗浄し、次いで遠心により集めた。上清を
捨て、細胞ペレットをドライアイス／エタノール浴中で
凍結し、次いで融解した。融解した細胞ペレットを２５
％シュクロース及び５０ｍＭ ＥＤＴＡの溶液１０ｍｌ
に再懸濁した。５ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液１ｍｌ、
０．２５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）３ｍｌ、及び１０
ｍｇ／ｍｌの煮沸させたＲＮアーゼＡ（シグマ・ケミカ
ル・Ｃｏ．、Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ１４５０８、セントルイ
ス、Ｍｏ．より入手できる）１００μｌを溶液に加え、
次いでこれを氷上で１５分間インキュベートした。溶菌
溶液（１０％トリトンＸ−１００ ３ｍｌ、０．２５Ｍ
ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）７５ｍｌ、１ＭトリスＨＣｌ
（ｐＨ８．０）１５ｍｌ、及びＨ2Ｏ ７ｍｌの混合に
より調製）３ｍｌをリゾチーム処理細胞に加え、この溶
液を混合し、この後、得られた溶液を氷上でさらに１５
分間インキュベートした。溶菌した細胞をドライアイス
／エタノール浴中で凍結し、次いで融解した。
【００２６】ＳＷ２８．１ローター（ベックマン、サイ
エンティフィック・インストルメント・ディビジョン、
キャンパス・ドライブ、ジャンボリー・ブールバード、
アービン、ＣＡ９２７１３）中２５０００ｒｐｍで４０
分間遠心し、そして緩衝化フェノールで抽出することに
より、細胞残片を溶液から除去した。ＣｓＣｌ約３０．
４４ｇ及び５ｍｇ／ｍｌエチジウムブロミド溶液〜１ｍ
ｌをこの細胞抽出物に加え、次に溶液の容量をＴＥＳ緩
衝液（１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ
ＮａＣｌ及び１ｍＭ ＥＤＴＡ）で４０ｍｌに調節し
た。溶液をＶＴｉ５０超遠心管（ベックマン）中に傾瀉
し、次いでこれを密封してＶＴｉ５０ローターで約１６
時間４２０００ｒｐｍで遠心した。紫外光で視覚化した
得られたプラスミドのバンドを単離し、次いでＴｉ７５
管及びローター（ベックマン）に入れ、５００００ｒｐ
ｍで１６時間遠心した。必要な容量の調節は全てＣｓＣ
ｌ０．７６１ｇ／ｍｌを含有するＴＥＳを用いて行なっ
た。プラスミドのバンドを再度単離し、塩で飽和させた
２−プロパノールで抽出してエチジウムブロミドを除
き、ＴＥＳ緩衝液で１：３に希釈した。次にこの溶液に
３Ｍ酢酸ナトリウム１容量及び無水エタノール２容量を
加え、次いで−２０℃で１６時間インキュベートした。
溶液をＳＳ３４ローター（ソーバル）中１００００ｒｐ
ｍで１５分間遠心することによりプラスミドＤＮＡをペ
レット化した。この方法によって得られたプラスミドＤ
ＮＡをＴＥ緩衝液に懸濁し、−２０℃で保存した。
エンティフィック・インストルメント・ディビジョン、
キャンパス・ドライブ、ジャンボリー・ブールバード、
アービン、ＣＡ９２７１３）中２５０００ｒｐｍで４０
分間遠心し、そして緩衝化フェノールで抽出することに
より、細胞残片を溶液から除去した。ＣｓＣｌ約３０．
４４ｇ及び５ｍｇ／ｍｌエチジウムブロミド溶液〜１ｍ
ｌをこの細胞抽出物に加え、次に溶液の容量をＴＥＳ緩
衝液（１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ
ＮａＣｌ及び１ｍＭ ＥＤＴＡ）で４０ｍｌに調節し
た。溶液をＶＴｉ５０超遠心管（ベックマン）中に傾瀉
し、次いでこれを密封してＶＴｉ５０ローターで約１６
時間４２０００ｒｐｍで遠心した。紫外光で視覚化した
得られたプラスミドのバンドを単離し、次いでＴｉ７５
管及びローター（ベックマン）に入れ、５００００ｒｐ
ｍで１６時間遠心した。必要な容量の調節は全てＣｓＣ
ｌ０．７６１ｇ／ｍｌを含有するＴＥＳを用いて行なっ
た。プラスミドのバンドを再度単離し、塩で飽和させた
２−プロパノールで抽出してエチジウムブロミドを除
き、ＴＥＳ緩衝液で１：３に希釈した。次にこの溶液に
３Ｍ酢酸ナトリウム１容量及び無水エタノール２容量を
加え、次いで−２０℃で１６時間インキュベートした。
溶液をＳＳ３４ローター（ソーバル）中１００００ｒｐ
ｍで１５分間遠心することによりプラスミドＤＮＡをペ
レット化した。この方法によって得られたプラスミドＤ
ＮＡをＴＥ緩衝液に懸濁し、−２０℃で保存した。
【００２７】実施例２ ｐＨＰＲ９１の組み立て Ａ．ｐＣＺＲ１２５の１８７６塩基対ＥｃｏＲＩ−Ｓｃ
ａＩ制限フラグメントの調製 プラスミドｐＣＺＲ１２５ １０μｇを、１００μｇ／
ｍｌＢＳＡ（牛血清アルブミン）、５０ｍＭトリスＨＣ
ｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、及び１００
ｍＭ ＮａＣｌを含有する反応液１００μｌ中のＥｃｏ
ＲＩ３０単位により３７℃で１時間完全に消化した。次
いでこの試料を７０℃で１０分間インキュベートしてＥ
ｃｏＲＩを不活性化した。
ａＩ制限フラグメントの調製 プラスミドｐＣＺＲ１２５ １０μｇを、１００μｇ／
ｍｌＢＳＡ（牛血清アルブミン）、５０ｍＭトリスＨＣ
ｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、及び１００
ｍＭ ＮａＣｌを含有する反応液１００μｌ中のＥｃｏ
ＲＩ３０単位により３７℃で１時間完全に消化した。次
いでこの試料を７０℃で１０分間インキュベートしてＥ
ｃｏＲＩを不活性化した。
【００２８】ＥｃｏＲＩ消化プラスミドｐＣＺＲ１２５
を以下のようにＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウフラグ
メント）を用いた処理により平滑末端とした。上記反応
物２５μｌを、ｄＡＴＰ（デオキシアデノシン５'−ト
リホスファート）２５０μＭ、ｄＣＴＰ（デオキシシト
シン５'−トリホスファート）２５０μＭ、ｄＧＴＰ
（デオキシグアナジン５'−トリホスファート）２５０
μＭ、ＴＴＰ（チミジン５'−トリホスファート）２５
０μＭ、トリスＨＣｌ（ｐＨ７．８）５０ｍＭ、ＭｇＣ
ｌ2１０ｍＭ、β−メルカプトエタノール１０ｍＭ、及
びＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）５単
位を含有する反応容量５０μｌに調節した。試料を３７
℃で３０分間インキュベートして、一本鎖制限フラグメ
ントの突出の相補的合成を完結させた。次いで反応混合
物を７０℃で１５分間インキュベートしてクレノウフラ
グメントを失活させた。
を以下のようにＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウフラグ
メント）を用いた処理により平滑末端とした。上記反応
物２５μｌを、ｄＡＴＰ（デオキシアデノシン５'−ト
リホスファート）２５０μＭ、ｄＣＴＰ（デオキシシト
シン５'−トリホスファート）２５０μＭ、ｄＧＴＰ
（デオキシグアナジン５'−トリホスファート）２５０
μＭ、ＴＴＰ（チミジン５'−トリホスファート）２５
０μＭ、トリスＨＣｌ（ｐＨ７．８）５０ｍＭ、ＭｇＣ
ｌ2１０ｍＭ、β−メルカプトエタノール１０ｍＭ、及
びＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）５単
位を含有する反応容量５０μｌに調節した。試料を３７
℃で３０分間インキュベートして、一本鎖制限フラグメ
ントの突出の相補的合成を完結させた。次いで反応混合
物を７０℃で１５分間インキュベートしてクレノウフラ
グメントを失活させた。
【００２９】次に、ＥｃｏＲＩで消化しクレノウ処理し
たｐＣＺＲ１２５プラスミドＤＮＡを、トリスＨＣｌ
（ｐＨ８．０）５０ｍＭ、ＭｇＣｌ2１０ｍＭ、ＮａＣ
ｌ１００ｍＭ、ＢＳＡ１００μｇ／ｍｌ、及びＳｃａＩ
１８単位を含有する反応容量１５０μｌ中、３７℃で１
時間インキュベートすることにより、ＳｃａＩで完全に
消化した。次いで試料を７０℃で１０分間インキュベー
トすることによりＳｃａＩを失活させた。
たｐＣＺＲ１２５プラスミドＤＮＡを、トリスＨＣｌ
（ｐＨ８．０）５０ｍＭ、ＭｇＣｌ2１０ｍＭ、ＮａＣ
ｌ１００ｍＭ、ＢＳＡ１００μｇ／ｍｌ、及びＳｃａＩ
１８単位を含有する反応容量１５０μｌ中、３７℃で１
時間インキュベートすることにより、ＳｃａＩで完全に
消化した。次いで試料を７０℃で１０分間インキュベー
トすることによりＳｃａＩを失活させた。
【００３０】Ｂ．ｐＰＲ１２の５０５１塩基対ＡｖａＩ
制限フラグメントの調製 プラスミドｐＰＲ１２の組み立ては、１９８４年３月１
３日登録の米国特許第４４３６８１５号に教示されてお
り、この教示を引用して本明細書の一部とする。
制限フラグメントの調製 プラスミドｐＰＲ１２の組み立ては、１９８４年３月１
３日登録の米国特許第４４３６８１５号に教示されてお
り、この教示を引用して本明細書の一部とする。
【００３１】１０μｇのｐＰＲ１２を、ＢＳＡ１００μ
ｇ／ｍｌ、トリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）５０ｍＭ、Ｍｇ
Ｃｌ2１０ｍＭ及びＮａＣｌ５０ｍＭを含有する反応容
量１００μｌ中で、ＡｖａＩ３０単位により３７℃で１
時間完全に消化した。次いでＡｖａＩを７０℃１５分間
のインキュベーションにより熱不活性化した。
ｇ／ｍｌ、トリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）５０ｍＭ、Ｍｇ
Ｃｌ2１０ｍＭ及びＮａＣｌ５０ｍＭを含有する反応容
量１００μｌ中で、ＡｖａＩ３０単位により３７℃で１
時間完全に消化した。次いでＡｖａＩを７０℃１５分間
のインキュベーションにより熱不活性化した。
【００３２】ＡｖａＩ消化プラスミドｐＰＲ１２の試料
を以下のように平滑末端とした。上記反応物２５μｌ
を、ｄＡＴＰ２５０μＭ、ｄＣＴＰ２５０μＭ、ｄＧＴ
Ｐ２５０μＭ、ＴＴＰ２５０μＭ、トリスＨＣｌ（ｐＨ
７．８）５０ｍＭ、ＭｇＣｌ2１０ｍＭ、β−メルカプ
トエタノール１０ｍＭ、及びＤＮＡポリメラーゼＩ（ク
レノウフラグメント）５単位を含有する反応容量５０μ
ｌに調節した。試料を３７℃で３０分間インキュベート
して、制限フラグメントの突出の一本鎖の相補的合成を
完結させ、次いで７０℃で１５分間インキュベートして
クレノウフラグメントを失活させた。
を以下のように平滑末端とした。上記反応物２５μｌ
を、ｄＡＴＰ２５０μＭ、ｄＣＴＰ２５０μＭ、ｄＧＴ
Ｐ２５０μＭ、ＴＴＰ２５０μＭ、トリスＨＣｌ（ｐＨ
７．８）５０ｍＭ、ＭｇＣｌ2１０ｍＭ、β−メルカプ
トエタノール１０ｍＭ、及びＤＮＡポリメラーゼＩ（ク
レノウフラグメント）５単位を含有する反応容量５０μ
ｌに調節した。試料を３７℃で３０分間インキュベート
して、制限フラグメントの突出の一本鎖の相補的合成を
完結させ、次いで７０℃で１５分間インキュベートして
クレノウフラグメントを失活させた。
【００３３】Ｃ．ｐＨＰＲ９１の最終的組み立て 実施例２Ａ及び２Ｂで調製されたＤＮＡ試料を実施例１
に記載のように精製しエタノール共沈させた。このＤＮ
Ａを遠心により回収し、乾燥し、水１０μｌに再懸濁し
た。次にトリスＨＣｌ（ｐＨ７．８）５０ｍＭ、ＭｇＣ
ｌ2１０ｍＭ、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）５ｍＭ、
５％グリセロール、アデノシン５'−トリホスファート
０．２ｍＭ及びＤＮＡリガーゼ４０単位を含有する反応
容量４０μｌ中、４℃で一夜インキュベートすることに
より、このＤＮＡフラグメントをライゲーションした。
に記載のように精製しエタノール共沈させた。このＤＮ
Ａを遠心により回収し、乾燥し、水１０μｌに再懸濁し
た。次にトリスＨＣｌ（ｐＨ７．８）５０ｍＭ、ＭｇＣ
ｌ2１０ｍＭ、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）５ｍＭ、
５％グリセロール、アデノシン５'−トリホスファート
０．２ｍＭ及びＤＮＡリガーゼ４０単位を含有する反応
容量４０μｌ中、４℃で一夜インキュベートすることに
より、このＤＮＡフラグメントをライゲーションした。
【００３４】ライゲーション混合物の一部を使用して、
実施例１Ｅの方法に従って大腸菌Ｋ１２ ＭＭ２９４細
胞を形質転換した。大腸菌Ｋ１２ ＭＭ２９４細胞は、
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ロッ
クビル、メリーランド２０８５２）から受理番号ＡＴＣ
Ｃ３１４４６の下に入手することができる。形質転換体
をテトラサイクリン１０μｇ／ｍｌを含有するＬ寒天上
で選択した。個々のコロニーを取り、テトラサイクリン
１０μｇ／ｍｌを含有するＬブロス中で増殖させた。所
望のプラスミドｐＨＰＲ９１を含むテトラサイクリン耐
性形質転換体を、制限酵素分析によるプラスミド精製に
従って同定した。プラスミドｐＨＰＲ９１のＰｖｕＩに
よる消化は１４５０塩基対フラグメントを与えた。プラ
スミドｐＨＰＲ９１の制限サイト及び機能地図を図２に
示す。
実施例１Ｅの方法に従って大腸菌Ｋ１２ ＭＭ２９４細
胞を形質転換した。大腸菌Ｋ１２ ＭＭ２９４細胞は、
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ロッ
クビル、メリーランド２０８５２）から受理番号ＡＴＣ
Ｃ３１４４６の下に入手することができる。形質転換体
をテトラサイクリン１０μｇ／ｍｌを含有するＬ寒天上
で選択した。個々のコロニーを取り、テトラサイクリン
１０μｇ／ｍｌを含有するＬブロス中で増殖させた。所
望のプラスミドｐＨＰＲ９１を含むテトラサイクリン耐
性形質転換体を、制限酵素分析によるプラスミド精製に
従って同定した。プラスミドｐＨＰＲ９１のＰｖｕＩに
よる消化は１４５０塩基対フラグメントを与えた。プラ
スミドｐＨＰＲ９１の制限サイト及び機能地図を図２に
示す。
【００３５】実施例３ ＰＨＰＲ９７の組み立て Ａ．ＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩ消化ｐＣＺＲ１２５の調製 ｐＣＺＲ１２５ＤＮＡ １０μｇを、トリスＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５）１０ｍＭ、ＮａＣｌ１００ｍＭ、ＭｇＣｌ2
１０ｍＭ、及びβ−メルカプトエタノール１０ｍＭを含
有する反応容量６０μｌ中のＥｃｏＲＩ ５μｌ（５５
単位）及びＢｇｌＩＩ ５μｌ（５５単位）で完全に消
化した。反応物を３７℃で２時間インキュベートした。
消化されたＤＮＡを精製し、６．０ｋｂフラグメントを
実施例１Ａに記載のように調製用アガロースゲル電気泳
動によって単離した。 Ｂ．転写活性化配列ＤＮＡの調製 転写活性化配列を以下の一本鎖ＤＮＡ配列を合成するこ
とにより調製した：
Ｈ７．５）１０ｍＭ、ＮａＣｌ１００ｍＭ、ＭｇＣｌ2
１０ｍＭ、及びβ−メルカプトエタノール１０ｍＭを含
有する反応容量６０μｌ中のＥｃｏＲＩ ５μｌ（５５
単位）及びＢｇｌＩＩ ５μｌ（５５単位）で完全に消
化した。反応物を３７℃で２時間インキュベートした。
消化されたＤＮＡを精製し、６．０ｋｂフラグメントを
実施例１Ａに記載のように調製用アガロースゲル電気泳
動によって単離した。 Ｂ．転写活性化配列ＤＮＡの調製 転写活性化配列を以下の一本鎖ＤＮＡ配列を合成するこ
とにより調製した：
【化６】
【化７】 これらの一本鎖ＤＮＡセグメントを自動ＤＮＡ合成機
（アプライド・バイオシステムズ３８０Ｂ）によりβ−
シアノエチルホスホアミダイト化学を用いて合成した。
合成ＤＮＡセグメントを精製し次いでＴＥ緩衝液中で０
℃で保存した。各一本鎖ＤＮＡセグメント１０μｌ（５
μｇ）を混合し７０℃で５分間加熱した。この混合物を
室温で３０分間冷却してＤＮＡセグメントをアニーリン
グさせた。アニーリングしたＤＮＡフラグメントを、
０．２ｍＭアデニン５'−トリホスファートを含有する
７０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．６）、０．１Ｍ ＫＣ
ｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ ＤＴＴに入れたＴ
４ポリヌクレオチドキナーゼ１μｌ（１０単位）（総容
量２０μｌ）で処理した。この混合物を３７℃で３０分
間インキュベートした。次に混合物を７０℃で５分間イ
ンキュベートし、次いで室温に冷却した。
（アプライド・バイオシステムズ３８０Ｂ）によりβ−
シアノエチルホスホアミダイト化学を用いて合成した。
合成ＤＮＡセグメントを精製し次いでＴＥ緩衝液中で０
℃で保存した。各一本鎖ＤＮＡセグメント１０μｌ（５
μｇ）を混合し７０℃で５分間加熱した。この混合物を
室温で３０分間冷却してＤＮＡセグメントをアニーリン
グさせた。アニーリングしたＤＮＡフラグメントを、
０．２ｍＭアデニン５'−トリホスファートを含有する
７０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．６）、０．１Ｍ ＫＣ
ｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ ＤＴＴに入れたＴ
４ポリヌクレオチドキナーゼ１μｌ（１０単位）（総容
量２０μｌ）で処理した。この混合物を３７℃で３０分
間インキュベートした。次に混合物を７０℃で５分間イ
ンキュベートし、次いで室温に冷却した。
【００３６】Ｃ．ｐＨＰＲ９７の最終的組み立て 混合物を室温で１時間インキュベートし、７０℃で５分
間加熱し次いで室温に冷却する外は実施例１Ｄの方法と
実質的に同様にして、実施例３Ａで調製された制限フラ
グメント２μｇ及び実施例３Ｂで調製されたキナーゼ処
理されたＤＮＡフラグメント１μｇをライゲーションし
た。このライゲーションされたＤＮＡの一部を用いて実
施例１Ｅの方法に従って大腸菌Ｋ１２ ＭＭ２９４細胞
を形質転換した。大腸菌Ｋ１２ ＭＭ２９４細胞は、ア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ロック
ビル、メリーランド２０８５２）から受理番号ＡＴＣＣ
３１４４６の下に入手することができる。テトラサイク
リン耐性形質転換体を選択し、それらのプラスミドＤＮ
Ａを実施例１Ｆに記載のアルカリ溶菌法に従って単離し
た。制限分析を実施してｐＨＰＲ９７の構造を確認し
た。ｐＨＰＲ９７の制限サイト及び機能地図を図３に示
す。
間加熱し次いで室温に冷却する外は実施例１Ｄの方法と
実質的に同様にして、実施例３Ａで調製された制限フラ
グメント２μｇ及び実施例３Ｂで調製されたキナーゼ処
理されたＤＮＡフラグメント１μｇをライゲーションし
た。このライゲーションされたＤＮＡの一部を用いて実
施例１Ｅの方法に従って大腸菌Ｋ１２ ＭＭ２９４細胞
を形質転換した。大腸菌Ｋ１２ ＭＭ２９４細胞は、ア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ロック
ビル、メリーランド２０８５２）から受理番号ＡＴＣＣ
３１４４６の下に入手することができる。テトラサイク
リン耐性形質転換体を選択し、それらのプラスミドＤＮ
Ａを実施例１Ｆに記載のアルカリ溶菌法に従って単離し
た。制限分析を実施してｐＨＰＲ９７の構造を確認し
た。ｐＨＰＲ９７の制限サイト及び機能地図を図３に示
す。
【００３７】実施例４ プラスミドｐＨＫＹ３３４の組
み立て Ａ．概観 プラスミドｐＨＫＹ３３４を、プラスミドｐＨＰＲ９１
の転写活性化配列をプラスミドｐＨＰＲ９７の転写活性
化配列に置き換えることによって組み立てた。図２（ｐ
ＨＰＲ９１）及び図３（ｐＨＰＲ９７）を参照すること
により、プラスミドｐＫＨＹ３３４の組み立ては、ｐＨ
ＰＲ９７及びＰＨＰＲ９１の両者を制限エンドヌクレア
ーゼＳａｌＩ及びＸｂａＩで二重消化し、次いでゲルを
単離し、プラスミドｐＨＰＲ９１の大きなフラグメント
及びプラスミドｐＨＰＲ９７の小さなフラグメントをラ
イゲーションすることを要するのみであることが説明さ
れる。
み立て Ａ．概観 プラスミドｐＨＫＹ３３４を、プラスミドｐＨＰＲ９１
の転写活性化配列をプラスミドｐＨＰＲ９７の転写活性
化配列に置き換えることによって組み立てた。図２（ｐ
ＨＰＲ９１）及び図３（ｐＨＰＲ９７）を参照すること
により、プラスミドｐＫＨＹ３３４の組み立ては、ｐＨ
ＰＲ９７及びＰＨＰＲ９１の両者を制限エンドヌクレア
ーゼＳａｌＩ及びＸｂａＩで二重消化し、次いでゲルを
単離し、プラスミドｐＨＰＲ９１の大きなフラグメント
及びプラスミドｐＨＰＲ９７の小さなフラグメントをラ
イゲーションすることを要するのみであることが説明さ
れる。
【００３８】Ｂ．プラスミドｐＨＰＲ９１の〜５．７１
８ｋｂ ＳａｌＩ／ＸｂａＩフラグメントの調製 およそ１０μｇのｐＨＰＲ９１を５０μｌ容のベーリン
ガー・マンハイムの緩衝液Ｈ（５０ｍＭトリスＨＣｌ、
１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ
ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、３７℃でｐＨ７．５、
及び１００μｇ牛血清アルブミン）中、ＸｂａＩ〜２０
Ｕ及びＳａｌＩ〜２０Ｕ（ベーリンガー・マンハイム）
で完全に消化した。消化物を３７℃で〜２時間インキュ
ベートした。プラスミドｐＨＰＲ９１の〜５．７１８ｋ
ｂ ＸｂａＩ／ＳａｌＩフラグメントをアガロースゲル
電気泳動により消化混合物から単離した。このゲルを希
エチジウムブロミド溶液で染色し、バンドを２６０ｎｍ
のＵＶ光の下で視覚化した。所望のバンドの「上」及び
「下」にスリットを設け、一片のＤＥＡＥ紙を切ってこ
のスリットにぴったり合うように入れた。ゲルを電気泳
動の容器に戻し、ＤＮＡをこの紙の中に電気泳動した。
この紙を新たな管に移し、５ｍｌの１．０ＭＮａＣｌ、
１０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８の添加により溶出した。
この懸濁液を０．４５ミクロンの滅菌用フィルターを付
けた１０ｍｌの注射筒（アクロディスク−ゲルマン・サ
イエンシズ、インコーポレイテッド、６００サウス・ワ
グナー・ロード、アン・アーバー、ミシガン４８１０
６）に詰めたシリコン処理グラスウールで濾過した。こ
の溶液に１００％エタノール１０ｍｌを加え、管を完全
に混合した。これを−２０℃で一夜保持した。ＤＮＡの
沈澱をＨＢ４ローター（デュポン・ソーバル）中１００
００ｒｐｍ（４℃）で２０分間遠心することにより回収
した。ＤＮＡペレットを風乾し次いでＴＥ緩衝液１００
μｌに再懸濁した。
８ｋｂ ＳａｌＩ／ＸｂａＩフラグメントの調製 およそ１０μｇのｐＨＰＲ９１を５０μｌ容のベーリン
ガー・マンハイムの緩衝液Ｈ（５０ｍＭトリスＨＣｌ、
１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ
ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、３７℃でｐＨ７．５、
及び１００μｇ牛血清アルブミン）中、ＸｂａＩ〜２０
Ｕ及びＳａｌＩ〜２０Ｕ（ベーリンガー・マンハイム）
で完全に消化した。消化物を３７℃で〜２時間インキュ
ベートした。プラスミドｐＨＰＲ９１の〜５．７１８ｋ
ｂ ＸｂａＩ／ＳａｌＩフラグメントをアガロースゲル
電気泳動により消化混合物から単離した。このゲルを希
エチジウムブロミド溶液で染色し、バンドを２６０ｎｍ
のＵＶ光の下で視覚化した。所望のバンドの「上」及び
「下」にスリットを設け、一片のＤＥＡＥ紙を切ってこ
のスリットにぴったり合うように入れた。ゲルを電気泳
動の容器に戻し、ＤＮＡをこの紙の中に電気泳動した。
この紙を新たな管に移し、５ｍｌの１．０ＭＮａＣｌ、
１０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８の添加により溶出した。
この懸濁液を０．４５ミクロンの滅菌用フィルターを付
けた１０ｍｌの注射筒（アクロディスク−ゲルマン・サ
イエンシズ、インコーポレイテッド、６００サウス・ワ
グナー・ロード、アン・アーバー、ミシガン４８１０
６）に詰めたシリコン処理グラスウールで濾過した。こ
の溶液に１００％エタノール１０ｍｌを加え、管を完全
に混合した。これを−２０℃で一夜保持した。ＤＮＡの
沈澱をＨＢ４ローター（デュポン・ソーバル）中１００
００ｒｐｍ（４℃）で２０分間遠心することにより回収
した。ＤＮＡペレットを風乾し次いでＴＥ緩衝液１００
μｌに再懸濁した。
【００３９】Ｃ．プラスミドｐＨＰＲ９７の０．９３８
ｋｂ ＳａｌＩ／ＸｂａＩフラグメントの調製 プラスミドｐＨＰＲ９７およそ１０μｇを実施例４Ｂの
方法と実質的に同様にしてＳａｌＩ及びＸｂａＩで消化
した。次にプラスミドｐＨＰＲ９７の０．９３８ｋｂ
ＳａｌＩ／ＸｂａＩフラグメントを実施例４Ｂに記載の
ようにゲル精製し、抽出しそして沈澱化した。
ｋｂ ＳａｌＩ／ＸｂａＩフラグメントの調製 プラスミドｐＨＰＲ９７およそ１０μｇを実施例４Ｂの
方法と実質的に同様にしてＳａｌＩ及びＸｂａＩで消化
した。次にプラスミドｐＨＰＲ９７の０．９３８ｋｂ
ＳａｌＩ／ＸｂａＩフラグメントを実施例４Ｂに記載の
ようにゲル精製し、抽出しそして沈澱化した。
【００４０】Ｄ．所望のプラスミドｐＨＫＲ３３４を生
成するための、プラスミドｐＨＰＲ９１の〜５．８１７
ｋｂ ＳａｌＩ／ＸｂａＩフラグメント（実施例４Ｂ）
とプラスミドｐＨＰＲ９７の〜０．９３８ｋｂ Ｓａｌ
Ｉ／ＸｂａＩフラグメント（実施例４Ｅ）とのライゲー
ション プラスミドｐＨＰＲ９１由来フラグメントおよそ〜０．
６μｇをプラスミドｐＨＰＲ９７由来フラグメント〜
０．３μｇにライゲーションした。このＤＮＡを共沈さ
せ、風乾し、１０μｌの３０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ
７．５）、０．５ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＤＴＴ、６
ｍＭ ＭｇＣｌ2、及びＴ４リガーゼ１Ｕ（ベーリンガ
ー・マンハイム）中に再懸濁した。ｐＨＫＹ３３４が上
記のｐＨＰＲ９１及びｐＨＰＲ９７フラグメントのライ
ゲーション時に生成した。
成するための、プラスミドｐＨＰＲ９１の〜５．８１７
ｋｂ ＳａｌＩ／ＸｂａＩフラグメント（実施例４Ｂ）
とプラスミドｐＨＰＲ９７の〜０．９３８ｋｂ Ｓａｌ
Ｉ／ＸｂａＩフラグメント（実施例４Ｅ）とのライゲー
ション プラスミドｐＨＰＲ９１由来フラグメントおよそ〜０．
６μｇをプラスミドｐＨＰＲ９７由来フラグメント〜
０．３μｇにライゲーションした。このＤＮＡを共沈さ
せ、風乾し、１０μｌの３０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ
７．５）、０．５ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＤＴＴ、６
ｍＭ ＭｇＣｌ2、及びＴ４リガーゼ１Ｕ（ベーリンガ
ー・マンハイム）中に再懸濁した。ｐＨＫＹ３３４が上
記のｐＨＰＲ９１及びｐＨＰＲ９７フラグメントのライ
ゲーション時に生成した。
【００４１】Ｅ．プラスミドｐＨＫＹ３３４による大腸
菌ＲＶ３０８の形質転換 形質転換の工程は実施例１Ｅの教示と実質的に同様にし
て進めた。形質転換体の個々のコロニーを取り、テトラ
サイクリン１０μｇ／ｍｌを含有するＬブロス中で増殖
させた。制限エンドヌクレアーゼ地図作成及びＤＮＡ配
列決定を使用してプラスミドｐＫＨＹ３３４の存在を確
認した。プラスミドｐＨＫＹ３３４の制限サイト及び機
能地図を図４に示す。
菌ＲＶ３０８の形質転換 形質転換の工程は実施例１Ｅの教示と実質的に同様にし
て進めた。形質転換体の個々のコロニーを取り、テトラ
サイクリン１０μｇ／ｍｌを含有するＬブロス中で増殖
させた。制限エンドヌクレアーゼ地図作成及びＤＮＡ配
列決定を使用してプラスミドｐＫＨＹ３３４の存在を確
認した。プラスミドｐＨＫＹ３３４の制限サイト及び機
能地図を図４に示す。
【図１】 プラスミドｐＣＺＲ１２５の制限サイト及び
機能地図を示す図である。
機能地図を示す図である。
【図２】 プラスミドｐＨＰＲ９１の制限サイト及び機
能地図を示す図である。
能地図を示す図である。
【図３】 プラスミドｐＨＰＲ９７の制限サイト及び機
能地図を示す図である。
能地図を示す図である。
【図４】 プラスミドｐＨＫＹ３３４の制限サイト及び
機能地図を示す図である。
機能地図を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ジェフリー・リン・ラーソン アメリカ合衆国46260インディアナ州イン ディアナポリス、フーバー・レイン8210番
Claims (8)
- 【請求項１】 プラスミドｐＨＫＹ３３４。
- 【請求項２】 請求項１のプラスミドにより形質転換さ
れた宿主細胞。 - 【請求項３】 Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＶ３０８／ｐＨＫＹ３
３４である請求項２の形質転換された宿主細胞。 - 【請求項４】 Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＭ２９４／ｐＨＫＹ３
３４である請求項２の形質転換された宿主細胞。 - 【請求項５】 Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ６００／ｐＨＫＹ３３
４である請求項２の形質転換された宿主細胞。 - 【請求項６】 Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＨＫＹ３
３４である請求項２の形質転換された宿主細胞。 - 【請求項７】 （ａ）増殖及びＥＫ−ＢＧＨの産生に適
当な条件下で請求項２−７の形質転換された宿主細胞の
いずれかを培養し、そして（ｂ）形質転換された宿主細
胞からＥＫ−ＢＧＨを回収することからなる、ＥＫ−Ｂ
ＧＨを産生する方法。 - 【請求項８】 形質転換された該宿主細胞がＥ．ｃｏｌ
ｉ ＲＶ３０８／ｐＨＫＹ３３４である請求項７の方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/801,164 US5395761A (en) | 1991-11-27 | 1991-11-27 | Plasmid pHKY334, an expression vector for EK-BGH and host cells transformed therewith |
| US801164 | 1991-11-27 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06113855A true JPH06113855A (ja) | 1994-04-26 |
Family
ID=25180366
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4318634A Withdrawn JPH06113855A (ja) | 1991-11-27 | 1992-11-27 | プラスミドｐＨＫＹ３３４、ＥＫ−ＢＧＨのための発現ベクター及びそれにより形質転換された宿主細胞 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5395761A (ja) |
| EP (1) | EP0544467A2 (ja) |
| JP (1) | JPH06113855A (ja) |
| AU (1) | AU2970692A (ja) |
| CA (1) | CA2083529A1 (ja) |
| HU (2) | HUT63461A (ja) |
| IL (1) | IL103848A0 (ja) |
| MX (1) | MX9206747A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0569604A1 (en) * | 1992-04-07 | 1993-11-18 | Societe Des Produits Nestle S.A. | Integrative gene-expression in Streptococcus salivarius ssp.thermophilus |
| FR2873411B1 (fr) * | 2004-07-21 | 2009-08-21 | Snecma Moteurs Sa | Turboreacteur avec des moyens de protection pour un dispositif d'injection de carburant, dispositif d'injection et tole de protection pour le turboreacteur |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BG49718A3 (en) * | 1983-07-15 | 1992-01-15 | Bio- Technology General Corp | Method for preparing of polypeptid with superoxiddismutasne activitty |
| US4710473A (en) * | 1983-08-10 | 1987-12-01 | Amgen, Inc. | DNA plasmids |
| US4874703A (en) * | 1985-08-26 | 1989-10-17 | Eli Lilly And Company | Expression vectors for use in E. coli |
| CA2019696A1 (en) * | 1989-06-26 | 1990-12-26 | William L. Muth | Control of aberrant expression vector accumulation during fermentation procedures |
| IL99100A0 (en) * | 1990-08-13 | 1992-07-15 | Lilly Co Eli | Improved bacteriophage lambda pl promoters |
| CA2057715A1 (en) * | 1990-12-19 | 1992-06-20 | Charles L. Hershberger | Method for enhancing the structural stability of recombinant dna expression vectors |
-
1991
- 1991-11-27 US US07/801,164 patent/US5395761A/en not_active Expired - Fee Related
-
1992
- 1992-11-20 EP EP92310617A patent/EP0544467A2/en not_active Ceased
- 1992-11-23 IL IL103848A patent/IL103848A0/xx unknown
- 1992-11-23 CA CA002083529A patent/CA2083529A1/en not_active Abandoned
- 1992-11-24 HU HU9203686A patent/HUT63461A/hu unknown
- 1992-11-24 MX MX9206747A patent/MX9206747A/es unknown
- 1992-11-24 HU HU9203686A patent/HU9203686D0/hu unknown
- 1992-11-27 JP JP4318634A patent/JPH06113855A/ja not_active Withdrawn
- 1992-11-27 AU AU29706/92A patent/AU2970692A/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HU9203686D0 (en) | 1993-03-29 |
| IL103848A0 (en) | 1993-04-04 |
| CA2083529A1 (en) | 1993-05-28 |
| MX9206747A (es) | 1993-05-01 |
| HUT63461A (en) | 1993-08-30 |
| US5395761A (en) | 1995-03-07 |
| EP0544467A3 (ja) | 1994-03-16 |
| EP0544467A2 (en) | 1993-06-02 |
| AU2970692A (en) | 1993-06-03 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Application deemed to be withdrawn because no request for examination was validly filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20000201 |